СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СИНДРОМА ХРОНИЧЕСКОЙ АНОВУЛЯЦИИ

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно - к патофизиологии репродуктивной системы, и может быть использовано для моделирования синдрома хронической ановуляции.

Ановуляция представляет собой изменение менструального цикла, характеризующееся отсутствием выхода яйцеклетки из яичника. Синдром хронической ановуляции - это результат «порочного круга», который может начинаться в любой из множества исходных точек - гипоталамо-гипофизарная область, яичники, надпочечники, щитовидная железа. Метаболические нарушения, такие как ожирение, инсулинорезистентность, ведут к единому проявлению функциональной дезорганизации - хронической ановуляции (Speroff L., Glass R.N., Kase N.G. Clinical gynecologic Endocrinology and infertility 5-th ed., Willians and Wilkkins. - 1994. - P.457-476; Lobo R.A. A disorder without identity: PCO // Fert. Ster. - 1995. - Vol.65. - №3. - P.1158-1167).

Одну из ведущих ролей в формировании овуляторных циклов у девочек-подростков играет пролактин (Коколина В.Ф. Детская и подростковая гинекология: руководство для врачей / В.Ф. Коколина. - М.: Медпрактика - М., 2006. - 640 с.). Секреция пролактина находится под тоническим ингибиторным контролем гипоталамуса, опосредованным дофамином (Wuttke W., Mansky Т., Honma К. Hypothalamic regulation of prolactin release // Endocrinol. Neuroendocrinol. Neuropeptid. Pt.II. Proc. 28^th Int. Congr. Physiol. Sci. Budapest, Oxford, 1981. - P.169-178). Известно, что дофамин оказывает угнетающее действие на секрецию пролактина (Labri F., Gagne В., Lefebre G. CRF stimulates adenylase cyclase activity in the intermediate lobe of pituitary gland // Mol. and Cell.Endocrinol. - 1983. - Vol.30. - №.3. - P.347-351). В результате развития синдрома хронической ановуляции на фоне изменения регуляции дофамина нарушается процесс фолликуло-генеза, что лежит в основе формирования бесплодия, новообразований яичников, фоновых и предраковых процессов эндометрия. Патогенез формирования синдрома хронической ановуляции в периоде полового созревания недостаточно изучен, что подтверждает актуальность данного изобретения.

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе не найдены способы моделирования синдрома хронической ановуляции, поэтому данное изобретение не имеет прототипа.

Задачей настоящего изобретения является создание модели синдрома хронической ановуляции, которая позволит более подробно изучить механизмы формирования нарушений менструального цикла с периода полового созревания на фоне повышенной дофаминергической регуляции.

Техническим результатом, проявляющимся при осуществлении данного способа, является развитие атрезии незрелых фолликулов, отсутствие желтых тел в яичниках и циклических изменений в эндометрии.

Технический результат достигается выполнением воздействия на экспериментальное животное. В качестве экспериментального животного используют неполовозрелую самку крыс линии Vistar в возрасте 30 дней, массой 30-35 г и физиологическим отсутствием регулярных эстральных четырехдневных циклов. Животному устанавливают питательный зонд. В течение месяца, ежедневно утром через питательный зонд животному вводят раствор, содержащий 2 капли препарата Циклодинон, разведенный в 1 мл дистиллированной воды.

Препарат Циклодинон, регистрационный номер: П №013429/02 от 07.05.2010, производства фирмы «БИОНОРИКА АГ» D-92308 Ноймаркт/Германия, средство растительного происхождения. Основным активным компонентом препарата является прутняк обыкновенный - Agnus castus, который обладает дофаминергическим эффектом и вызывает снижение продукции пролактина. Форма выпуска - капли для приема внутрь.

Подробное описание способа.

Для создания модели синдрома хронической ановуляции берут неполовозрелую самку крыс линии Vistar в возрасте 30 дней, массой 30-35 г и физиологическим отсутствием регулярных астральных четырехдневных циклов. Животное помещают в клетку со свободным доступом к пище и воде во время всего периода эксперимента. Пищевой рацион представлен специализированным кормом для грызунов, типа «Каппа», производство Польши. Берут питательный зонд: типа «Зонд питательный», рентгеноконтрастная линия, номер 4, производитель «Алексмед Интернэшнл», Амстердам, Нидерланды, укорачивают до длины 2 см. В течение одного месяца ежедневно утром устанавливают питательный зонд в ротоглотку и через зонд с помощью шприца вводят раствор. Раствор готовят следующим образом: берут пробирку, наливают 1 мл дистиллированной воды (ГОСТ 6709-72) и добавляют из флакона, оборудованного дозатором, 2 капли препарата Циклодинон. Раствор, содержащий 2 капли препарата Циклодинон, разведенный в 1 мл дистиллированной воды, вводят животному ежедневно утром, в течение одного месяца. После воздействия питательный зонд вынимают, промывают дистиллированной водой и хранят в сухом месте. В течение последующих двух месяцев воздействий на экспериментальное животное не проводят. Начиная с двухмесячного возраста ежедневно, в течение 60 дней у экспериментального животного проводят забор вагинальных выделений, готовят мазки и исследуют под микроскопом. По содержанию лейкоцитов, слизи, зернистых эпителиальных клеток и чешуек при микроскопическом исследовании вагинальных мазков определяют фазы эстрального цикла. При микроскопическом исследовании вагинальных мазков у экспериментальной крысы отсутствуют циклические изменения. В мазках присутствует значительное количество слизи, лейкоцитов и эпителиальных клеток с ядрами, что соответствует фазе покоя - диэструс. Постоянное наличие фазы покоя у экспериментального животного подтверждает отсутствие эстрального цикла и свидетельствует о развитии синдрома хронической ановуляции. По данным литературы (Серая крыса: Систематика, экология, регуляция численности / Под ред. В.Е. Соколова, Е.В. Карасевой. - М.: Наука, 1990. - 456 с.), половая зрелость определяется возрастом крысы 120 дней. По достижении крысы половой зрелости - возраста 120 дней проводят забой. Животное обезболивают и умерщвляют. Применявшиеся в данном эксперименте методы обезболивания и умерщвления животных соответствуют принципам Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Проводят забор яичников для изучения морфологических изменений. Гистологический препарат ткани яичника представлен множественными незрелыми фолликулами и отсутствием желтых тел, что подтверждает наличие у экспериментального животного синдрома хронической ановуляции.

Практическая реализуемость способа подтверждается примерами.

Пример 1. Брали неполовозрелую самку крыс линии Vistar в возрасте 30 дней, массой 30-35 г и физиологическим отсутствием регулярных эстральных четырехдневных циклов. На время проведения эксперимента животное помещали в клетку со свободным доступом к пище и воде. Кормили специализированным кормом для грызунов «Каппа», производство Польши. Брали питательный зонд: «Зонд питательный», рентгеноконтрастная линия, номер 4, производитель «Алексмед Интернэшнл», Амстердам, Нидерланды и укорачивали до длины 2 см. В течение одного месяца ежедневно утром устанавливали питательный зонд животному в ротоглотку и через зонд с помощью шприца вводили раствор. Раствор готовили следующим образом: брали пробирку, наливали 1 мл дистиллированной воды (ГОСТ 6709-72) и добавляли из флакона, оборудованного дозатором, 2 капли препарата Циклодинон. Раствор, содержащий 2 капли препарата Циклодинон, разведенный в 1 мл дистиллированной воды, вводили животному ежедневно утром, в течение одного месяца. После введения питательный зонд вынимали, промывали дистиллированной водой и хранили в сухом месте. В течение последующих двух месяцев воздействий на экспериментальное животное не проводили. Начиная с двухмесячного возраста ежедневно, в течение 60 дней у экспериментального животного проводили забор вагинальных выделений, готовили мазки и исследовали под микроскопом. При микроскопическом исследовании вагинальных мазков у экспериментальной крысы отсутствовали циклические изменения. В мазках присутствовало значительное количество слизи, множество лейкоцитов и эпителиальных клеток с ядрами, что соответствовало фазе покоя и свидетельствовало об отсутствии эстрального цикла и развитии синдрома хронической ановуляции. По достижению крысы половой зрелости проводили забой. Животное обезболивали и умерщвляли, в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Проводили забор яичников для изучения морфологических изменений. Гистологический препарат ткани яичника был представлен 7 незрелыми фолликулами и отсутствием желтых тел, что подтвердило наличие у экспериментального животного синдрома хронической ановуляции.

Пример 2. Брали неполовозрелую самку крыс линии Vistar в возрасте 35 дней, массой 30-35 г и физиологическим отсутствием регулярных эстральных четырехдневных циклов. На время проведения эксперимента животное помещали в клетку со свободным доступом к пище и воде. Кормили специализированным кормом для грызунов «Каппа», производство Польши. Брали питательный зонд: «Зонд питательный», рентгеноконтрастная линия, номер 4, производитель «Алексмед Интернэшнл», Амстердам, Нидерланды и укорачивали до длины 2 см. В течение одного месяца ежедневно утром устанавливали питательный зонд животному в ротоглотку и через зонд с помощью шприца вводили раствор. Раствор готовили следующим образом: брали пробирку, наливали 1 мл дистиллированной воды (ГОСТ 6709-72) и добавляли из флакона, оборудованного дозатором, 2 капли препарата Циклодинон. Раствор, содержащий 2 капли препарата Циклодинон, разведенный в 1 мл дистиллированной воды, вводили животному ежедневно утром, в течение одного месяца. После введения питательный зонд вынимали, промывали дистиллированной водой и хранили в сухом месте. В течение последующих двух месяцев воздействий на экспериментальное животное не проводили. Начиная с двухмесячного возраста ежедневно, в течение 60 дней у экспериментального животного проводили забор вагинальных выделений, готовили мазки и исследовали под микроскопом. При микроскопическом исследовании вагинальных мазков у экспериментальной крысы отсутствовали циклические изменения. В мазках присутствовало значительное количество слизи, множество лейкоцитов и эпителиальных клеток с ядрами, что соответствует фазе покоя и свидетельствует об отсутствии эстрального цикла и развитии синдрома хронической ановуляции. По достижении крысы половой зрелости проводили забой. Животное обезболивали и умерщвляли, в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Проводили забор яичников для изучения морфологических изменений. Гистологический препарат ткани яичника был представлен 22 незрелыми фолликулами и отсутствием желтых тел, что подтвердило наличие у экспериментального животного синдрома хронической ановуляции.

На кафедре патофизиологии РостГМУ был проведен эксперимент на 20 неполовозрелых самках крыс линии Vistar в возрасте 30 дней, массой 30-35 г и физиологическим отсутствием регулярных эстральных четырехдневных циклов. Все крысы были поделены на две группы: основную группу составили 15 крыс, контрольную группу - 5 крыс. Крысам основной группы проводили воздействие, согласно предлагаемому способу. Начиная с двухмесячного возраста ежедневно, в течение 60 дней у всех 20 животных проводили забор вагинальных выделений с последующим микроскопическим исследованием.

В контрольной группе при микроскопическом исследовании вагинальных мазков у всех 5 крыс, начиная с 87-95 дня после рождения, отмечался эстральный цикл, который возобновлялся примерно каждые 5 суток и состоял из четырех фаз. При микроскопическом исследовании вагинальных мазков крыс основной группы ни в одном из мазков не выявлено циклических изменений. В мазках - значительное количество слизи, множество лейкоцитов и эпителиальных клеток с ядрами, что соответствует фазе покоя - диэструс и отсутствию эстрального цикла.

По достижении всеми 20 крысами половой зрелости проводили забой, в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным, с последующим забором яичников для изучения морфологических изменений. При макроскопическом исследовании у 5 крыс контрольной группы яичники не увеличены, на разрезе большую часть яичника занимают полностью сформированные желтые тела и фолликулы различной стадии зрелости. У крыс основной группы макроскопически яичники не увеличены в размерах, плотные, на разрезе имеются множественные точечные кисты. Микрофотографии гистологических препаратов приведены на фиг.1 и фиг.2.

На фигуре 1 представлена микрофотография гистологического препарата яичника одной из крыс контрольной группы, где позиция 1 - фолликул, позиция 2 - зародышевый бугорок.

На фигуре 2 отображена микрофотография гистологического препарата яичника одной из крыс основной группы. Ткань яичника представлена множественными фолликулами (1), незрелыми, с явлениями атрезии. Желтые тела не обнаруживаются. Вокруг фолликулов (1) имеют место массивные соединительнотканные прослойки (3), которые свидетельствуют о перерождении нормальной ткани яичника.

Введение раствора, содержащего 2 капли препарата Циклодинон, разведенного в 1 мл дистиллированной воды, ежедневно утром, в течение одного месяца через питательный зонд неполовозрелым самкам крыс линии Vistar в возрасте 30 дней, массой 30-35 г и физиологическим отсутствием регулярных эстральных четырехдневных циклов вызвал у всех 15-100% крыс основной группы синдром хронической ановуляции, который характеризовался отсутствием астрального цикла, наличием постоянного диэструса - фазы покоя, о чем свидетельствовало проводимое в ходе эксперимента микроскопическое исследование вагинальных мазков, а в половозрелом возрасте - подтверждено отсутствием желтых тел в яичниках на фоне атрезии незрелых фолликулов при гистологическом исследовании.

Таким образом, реализованный, согласно заявленному способу, синдром хронической ановуляции был подтвержден результатами микроскопического исследования вагинальных мазков и гистологического анализа ткани яичников экспериментальных животных.