Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММА Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 У ДЕТЕЙ РОЖДЕННЫХ, ПУТЕМ КЕСАРЕВА СЕЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ШТАММ (ВАРИАНТЫ)

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к введению грудным детям, рожденным путем кесарева сечения, специфического пробиотического бактериального штамма, способного стимулировать развитие начальной бифидогенной микробиоты кишечника.

Уровень техники

Считается, что непосредственно перед родами желудочно-кишечный тракт ребенка является стерильным. В процессе естественных родов он контактирует с бактериями пищеварительного тракта, кожи матери и окружающей ее среды и начинает колонизироваться. В фекальной микробиоте здорового, вагинально-рожденного, вскармливаемого грудью ребенка в возрасте от 2 до 4 недель, которую можно принять за оптимальную микробиоту для указанной возрастной группы, доминируют виды бифидобактерий с некоторыми видами лактобацилл и намного меньшими количествами бактероидов, таких как Bacteriodes fragilis, за исключением потенциальных патогенов, таких как клостридии. По окончании периода отнятия от груди в возрасте примерно 2 лет устанавливается состав микробиоты кишечника, сходный с составом микробиоты кишечника взрослого человека.

Следует заметить, что у здорового, вагинально-рожденного, вскармливаемого грудью ребенка бифидобактерии составляют основу микробиоты, насчитывая от 60% до 90% общего количества бактерий в кишечнике грудного ребенка. Грудное вскармливание способствует также развитию защитного кишечного барьера, что в условиях доминирования бифидобактерий приводит к улучшению всасывания и, следовательно, утилизации потребляемого питания.

Grönlund et al. изучали фекальную микробиоту здоровых детей, рожденных путем кесарева сечения, и сравнивали ее с фекальной микробиотой группы вагинально-рожденных детей такого же возраста. Они пришли к выводу, что кишечная флора детей, рожденных путем кесарева сечения, может изменяться в течение до шести месяцев после родов. Они особо отметили, что скорость колонизации кишечника бифидобактериями и лактобациллами у группы детей, рожденных путем кесарева сечения, достигала скорости колонизации кишечника у группы вагинально-рожденных детей только спустя один месяц и 10 дней соответственно (Grönlund et al., "Fecal Microflora in Heathy Infants Born by Different Methods of Delivery: Permanent Changes in.Intestinal Flora After Cesarean Delivery", Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 28: 19-25).

Другие исследователи высказали предположение, что эта замедленная/аберрантная колонизация может иметь специфические последствия в рамках последующего развития грудного ребенка, и связывали эти последствия с различиями в кишечной флоре. Например, Laubereau et al. установил, что у детей, рожденных с помощью кесарева сечения, риск развития диареи выше, чем у вагинально-рожденных детей (Laubereau et al., Caesarean Section and gastrointestinal symptoms, atopic dermatitis and sensitisation during the first year of life", Arch. Dis. Child 2004, 89: 993-997). Negele et al. установили, что роды с помощью кесарева сечения могут быть дополнительным фактором риска появления тяжелого свистящего дыхания и повышенной чувствительности к аллергенам пищи в период до двух лет (Negele et al. "Mode of delivery and development of atopic disease during the first 2 years of life", Pediatr. Allergy Immunol. 2004, 15: 48-54). Высказывалось также предположение, что системное вялотекущее воспаление и субоптимальная кишечная микробиота могут быть причастны также к развитию ожирения (Fantuzzi G. "Adipose tissue, adipokines, and inflammation", J. Allergy Clin. Immunol. 2005, 115: 911-919; Backhed F., Ding H., Wang Т., et al. "The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004, 101: 15718-15723).

Вскармливание материнским молоком рекомендуется для всех грудных детей. Однако в некоторых случаях грудное вскармливание является недостаточным или безуспешным по медицинским показаниям либо сама мать отказывается кормить грудью. Для таких ситуаций разработаны смеси для детского питания.

В последнее время определенные штаммы бактерий стали вызывать повышенный интерес, объясняющийся тем, что при попадании в организм человека эти штаммы проявляют, как было установлено, ценные для его здоровья свойства. Установлено, в частности, что специфические штаммы рода Lactobacilli и рода Bifidobacteria способны колонизировать кишечник, снижать способность патогенных бактерий к прилипанию к кишечному эпителию, оказывать иммуномодулирующий эффект и облегчать поддержание хорошего самочувствия. Такие бактерии иногда называют пробиотиками, и уже предложено добавлять соответствующие пробиотические бактерии в смеси для грудных детей.

Проведены экстенсивные исследования по идентификации новых пробиотических штаммов. Например, в ЕР 0199535, ЕР 0768375, WO 97/00078, EP 0577903 и WO 00/53200 раскрываются специфические штаммы лактобацилл и бифидобактерий и их полезное для здоровья действие.

Однако совсем недавно была высказана некоторая озабоченность по поводу добавления пробиотических бактерий в смеси для детского питания, которые служат единственным источником питания для грудных детей в первые шесть месяцев жизни. Причины такой озабоченности с позиции медиков суммированы в докладе Комитета по питанию ESPGHAN (Европейское общество педиатрической гастроэнтерологии, гематологии и питания), озаглавленном "Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants" (Пробиотические бактерии в диетических продуктах для грудных детей) (Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 38: 365-374).

Кишечная микробиота играет важную роль в гидролизе трудно перевариваемых олигосахаридов и полисахаридов до легко всасываемых моносахаридов и в активации липопротеин-липазы путем прямого воздействия на ворсинчатый эпителий. Кроме того, недавно было доказано, что женское молоко содержит не только олигосахариды, но и бифидобактерии. В то же время исследования по изучению генома убедительно показали, что бифидобактерии, присутствующие в кишечнике вскармливаемых грудью детей, такие как Bifidobacterium longum, специально приспособлены к утилизации олигосахаридов женского молока в качестве нутриентов. Bifidobacterium longum адаптированы также к условиям в толстой кишке, где происходит накопление энергии из медленно всасывающихся углеводов.

Одним словом, все больше и больше появляется доказательств того, что становление необходимой кишечной микробиоты в ранние периоды жизни может быть существенным для последующего развития здорового организма. В то же время число случаев родоразрешения с помощью кесарева сечения продолжает расти, достигая в некоторых странах 70% общего числа родов. Отсюда ясно, что существует необходимость обеспечения средств для стимулирования быстрого становления необходимой кишечной микробиоты у грудных детей в тех случаях, когда это не может быть достигнуто естественным путем. Эта необходимость особенно назрела в настоящее время, когда согласно установившейся практике беременным женщинам, которым предстоят роды с обязательным кесаревым сечением, назначаются профилактические дозы антибиотиков.

Сущность изобретения

Как отмечалось выше, у здорового, вагинально-рожденного, вскармливаемого грудью ребенка бифидобактерии составляют основу микробиоты, насчитывая от 60% до 90% общего количества бактерий в кишечнике грудного ребенка. Виды бифидобактерий, которые превалируют, как было установлено, в микробиоте таких детей, включают Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium longum. Авторам настоящего изобретения удивительным образом было установлено, что введение грудным детям, рожденным путем кесарева сечения, специфического штамма разных видов бифидобактерий, а именно - Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, способствует развитию у них начальной бифидогенной кишечной микробиоты.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает применение Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 в производстве лекарственного средства или лечебной питательной композиции для стимуляции развития начальной бифидогенной кишечной микробиоты у грудных детей, рожденных путем кесарева сечения.

Изобретение далее обеспечивает применение Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 в производстве лекарственного средства или лечебной питательной композиции для снижения риска последующего развития аллергии у грудных детей, рожденных путем кесарева сечения.

В следующем аспекте изобретение обеспечивает применение Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 в производстве лекарственного средства или лечебной питательной композиции для предупреждения или лечения диареи у грудных детей, рожденных путем кесарева сечения.

Изобретение распространяется на способ стимуляции развития начальной бифидогенной кишечной микробиоты у грудных детей, рожденных путем кесарева сечения, который предусматривает введение терапевтической дозы Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 грудному ребенку, рожденному путем кесарева сечения и нуждающемуся в этом.

Изобретение распространяется также на способ снижения риска последующего развития аллергии у грудного ребенка, рожденного путем кесарева сечения, за счет введения терапевтической дозы Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 грудному ребенку, рожденному путем кесарева сечения и нуждающемуся в этом.

Изобретение распространяется также на способ предупреждения или лечения диареи у грудного ребенка, рожденного путем кесарева сечения, за счет введения терапевтической дозы Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 грудному ребенку, рожденному путем кесарева сечения и нуждающемуся в этом.

Не желая останавливаться на теории, авторы настоящего изобретения полагают, что получение Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 грудным ребенком, рожденным путем кесарева сечения, будет способствовать в некоторой степени, если не в полной мере, последующей колонизации желудочно-кишечного тракта такого ребенка теми видами бифидобактерий, которые обычно присутствуют в желудочно-кишечном тракте здоровых, вагинально-рожденных детей. Предполагается, что эта колонизация полезных бактерий поможет снизить риск частых случаев диареи, которым, как было показано, подвержены грудные дети, рожденные путем кесарева сечения. Предполагается также, что колонизация полезных бактерий поможет снизить риск последующего развития аллергии, проявляющейся, например, в форме тяжелого свистящего дыхания и/или повышенной чувствительности к пищевым аллергенам.

Следует отметить, что целью и эффектом такого лечения является стимулирование колонизации кишечника не только самим штаммом Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, но и стимулирование колонизации другими видами с тем, чтобы обеспечить становление начальной бифидогенной кишечной микробиоты, сравнимой с кишечной микробиотой здоровых, вскармливаемых грудью, вагинально-рожденных детей.

Краткое описание фигур

Фиг.1 показывает количество В. breve and В. longum в образцах фекалий и содержимого тощей кишки гнотобионтных (стерильных) мышей, которым принудительно вводилась микробиота грудного ребенка, на 14 день лечения.

Фиг.2 показывает количество С.perfringens в образцах содержимого тощей кишки и фекалий гнотобионтных мышей, которым принудительно вводилась микробиота грудного ребенка, на 14 день лечения.

Раскрытие изобретения

В настоящем описании нижеследующие термины имеют следующие значения:

"начальная бифидогенная кишечная микробиота" означает кишечную микробиоту грудного ребенка в возрасте до 12 месяцев, в которой доминируют бифидобактерии, такие как Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium longum, за исключением поддающихся оценке популяций таких видов, как клостридии и стрептококки, и которая в большинстве случаев сравнима с кишечной микробиотой вагинально-рожденного, вскармливаемого грудью ребенка такого же возраста;

"грудной ребенок" относится к ребенку в возрасте до 12 месяцев;

"пребиотик" означает неперевариваемый пищевой ингредиент, который благотворно влияет на хозяина, избирательно стимулируя рост и/или активность одного или ограниченного числа видов бактерий в толстой кишке и улучшая тем самым здоровье хозяина (Gibson and Roberfroid "Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics", J. Nutr. 125: 1401-1412);

"пробиотик" означает препараты микробных клеток или компоненты микробных клеток, оказывающие благотворное действие на здоровье или самочувствие хозяина (Salminen S., Ouwehand A., Bermo Y. et al. "Probiotics: how should they be defined". Trends Food Sci. Technol. 1999, 10: 107-110).

Все ссылки на процентное содержание означают содержание в масс.%, если не утверждается что-либо иное.

Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 реализуется на рынке inter alia (среди прочего) компанией Christian Hansen (Дания) под торговой маркой Bb12. Подходящая суточная доза составляет от 10⁵ до 10¹¹ КОЕ, более предпочтительно - от 10⁷ до 10¹⁰ КОЕ.

Предпочтительно Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 вводится вместе с пребиотиком. Пригодные для данной цели пребиотики включают некоторые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды (FOS) и галактоолигосахариды (GOS). Может использоваться комбинация пребиотиков, например комбинация из 90% GOS с 10% короткоцепочечных фруктоолигосахаридов, такая как продукт, реализуемый на рынке под торговой маркой Beneo® P95, или с 10% инулина, такая как продукт, реализуемый на рынке под торговой маркой Beneo® HP, ST или HSI.

Особенно предпочтительным пребиотиком является смесь олигосахаридов, которая содержит от 5% до 70 масс.%, по меньшей мере, одного N-ацетилированного олигосахарида, выбранного из группы, включающей Ga1NAcα1,3Ga1β1,4G1c и Ga1β1,6Ga1NAcα1,3Ga1β1,4G1c; от 20% до 90 масс.%, по меньшей мере, одного нейтрального олигосахарида, выбранного из группы, включающей Ga1p1,6Ga1,Ga1β1,6Ga1β1,4G1c Ga1β1,6Ga1β1,6G1c, Ga1p1,3Ga1p1,3G1c, Ga1β1,3Ga1β1,4G1c, Ga1β1,6Ga1β1,6Ga1β1,4G1c, Ga1β1,6Ga1β1,3Ga1β1,4G1c Ga1β1,3Ga1β1,6Ga1β1,4G1c и Ga1β1,3Ga1β1,3Ga1β1,4G1c, и от 5% до 50 масс.%, по меньшей мере, одного сиалилированного олигосахарида, выбранного из группы, включающей NeuAcα2,3Ga1β1,4G1c и NeuAcα2,6Ga1β1,4G1c. Такая смесь олигосахаридов более подробно описана в WO 2007/090894, содержание которой включено в перечень ссылок, принятых во внимание при составлении настоящей заявки; эта смесь олигосахаридов далее по тексту названа "вышеописанной смесью олигосахаридов".

Предпочтительно вышеописанная смесь олигосахаридов содержит от 10 до 70 масс.% уточненного выше N-ацетилированного олигосахарида(ов), от 20 до 80 масс.% уточненного выше нейтрального олигосахарида(ов) и от 10 до 50 масс.% уточненного выше сиалилированного олигосахарида(ов). Более предпочтительно смесь содержит от 15 до 40 масс.% N-ацетилированного олигосахарида(ов), от 40 до 60 масс.% другого нейтрального олигосахарида(ов) и от 15 до 30 масс.% сиалилированного олигосахарида(ов). Особенно предпочтительной смесью является смесь из 30 масс.% N-ацетилированного олигосахарида(ов), 50 масс.% нейтрального олигосахарида(ов) и 20 масс.% сиалилированного олигосахарида(ов).

Альтернативно вышеописанная смесь олигосахаридов может соответственно содержать от 5 до 20 масс.% уточненного выше N-ацетилированного олигосахарида(ов), от 60 до 90 масс.% уточненного выше нейтрального олигосахарида(ов) и от 5 до 30 масс.% уточненного выше сиалилированного олигосахарида(ов).

Вышеописанная смесь олигосахаридов может быть приготовлена из молока одного или более видов животных. Молоко может быть получено от любого млекопитающего, в частности от коров, коз, буйволиц, кобыл, слоних, верблюдиц или овец.

Альтернативно вышеописанная смесь олигосахаридов может быть приготовлена смешиванием отдельных компонентов, закупленных на рынке. Например, синтезированные галактоолигосахариды, такие как Ga1β1,6Ga1β1,4G1c Ga1β1,6Ga1β1,6G1c, Ga1β1,3Ga1β1,4G1c, Ga1β1,6Ga1β1,6Ga1β1,4G1c, Ga1β1,6Ga1β1,3Ga1β1,4G1c и Ga1β1,3Ga1β1,6Ga1β1,4G1c, и их смеси реализуются на рынке под товарными знаками Vivinal® и Elix'or®. Другими поставщиками олигосахаридов являются Dextra Laboratories, Sigma-Aldrich Chemie GmbH и Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Альтернативно для получения нейтральных олигосахаридов могут использоваться специфические гликозилтрансферазы, такие как галактозилтрансферазы.

N-ацетилированные олигосахариды могут быть получены действием глюкозаминидазы и/или галактозаминидазы на N-ацетил-глюкозу и/или N-ацетил-галактозу. Равным образом для этой цели могут использоваться N-ацетил-галактозилтрансферазы и/или N-ацетил-гликозилтрансферазы. N-ацетилированные олигосахариды могут быть получены также технологией ферментации с применением соответствующих ферментов (рекомбинантных или природных) и/или микробной ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои нативные ферменты и субстраты или могут рекомбинироваться с целью последующего продуцирования ими соответствующих субстратов и ферментов. Могут использоваться культуры одного вида микроорганизмов или смешанные культуры. Образование N-ацетилированного олигосахарида может инициироваться акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) - от DP=1 и выше. Другим методом является химическая конверсия кетогексоз (например, фруктозы), либо свободных, либо связанных с олигосахаридом (например, с лактулозой), в N-ацетилгексозамин или в содержащий олигосахарид N-ацетилгексозамин, как описано в Wrodnigg, T.M.; Stutz, A.E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38: 827-828.

Сиалилированные олигосахариды - 3'-сиалил-лактоза и 6'-сиалил-лактоза - могут быть выделены техникой хроматографии или фильтрации из природного источника, такого как молоко животных. Альтернативно они могут быть также получены биотехнологией с применением специфичных сиалилтрансфераз или технологией ферментации, основанной на действии ферментов (рекомбинантных или природных ферментов) либо микроорганизмов. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои нативные ферменты и субстраты или могут рекомбинироваться с целью последующего продуцирования ими соответствующих субстратов и ферментов. Могут использоваться культуры одного вида микроорганизмов или смешанные культуры. Образование сиалилированного олигосахарида может инициироваться акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) - от DP=1 и выше.

Вместе с Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 могут вводиться и другие пробиотические бактерии. Для этой цели могут использоваться любые молочнокислые бактерии или бифидобактерии с установленными пробиотическими характеристиками. Подходящие пробиотические молочнокислые бактерии включают Lactobacillus rhamnosus АТСС 53103 от (inter alia) Valio Oy (Финляндия) под торговой маркой LGG; Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus reuteri АТСС 55730 от Biogaia или Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116.

Подходящие другие пробиотические штаммы бифидобактерии включают штамм Bifidobacterium longum АТСС ВАА-999, реализуемый на рынке фирмой Morinaga Milk Industry Co. Ltd. (Япония) под торговой маркой ВВ536; штамм Bifidobacterium breve, реализуемый на рынке фирмой Danisco под торговой маркой Вb-03; штамм Bifidobacterium breve, реализуемый на рынке фирмой Morinaga под торговой маркой М-16V, и штамм Bifidobacterium breve, реализуемый на рынке Институтом Роселла (Institut Rosell, Германия) под торговой маркой R0070. Может также использоваться смесь молочнокислых бактерий с бифидобактериями.

Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, необязательно вместе с вышеописанной смесью олигосахаридов, предпочтительно вводится ребенку сразу после родов и в течение, по меньшей мере, первых двух месяцев жизни ребенка. Более предпочтительно указанное введение продолжается до достижения ребенком 6-месячного возраста.

Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 может даваться непосредственно ребенку, либо вскармливаемый грудью ребенок может получать указанный пробиотик с молоком матери. Если ребенок должен получать пробиотик с молоком матери, то в этом случае пробиотик может представлять собой добавку в форме, например, таблеток, капсул, пастилок, жевательной резинки или жидкости. Добавка может предпочтительно содержать также вышеописанную смесь олигосахаридов в количестве от 0,2 до 10 г/сутки. Добавка может содержать также защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы); связующие вещества; пленкообразующие агенты; инкапсулирующие агенты/материалы; материалы клеточных стенок/оболочек; матричные соединения; покрытия; эмульгаторы; поверхностно-активные вещества; солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и др.); адсорбенты; носители; наполнители; ко-соединения; диспергирующие агенты; увлажнители; вещества, облегчающие обработку (растворители); антислеживающие агенты; агенты, маскирующие вкус; агенты с высокой удельной плотностью; желирующие вещества; гелеобразующие вещества; антиокислители и противомикробные вещества. Добавка может содержать также традиционные фармацевтические добавки и адъюванты, вспомогательные вещества и разбавители, включая, но весь перечень не ограничивается только названными здесь, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонаты, тальк, сахара, крахмал, гуммиарабик, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферные агенты, смазывающие вещества, красители, увлажнители, наполнители и др. Во всех случаях эти дополнительные компоненты должны выбираться с учетом их пригодности для каждого конкретного реципиента.

Альтернативно Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 может даваться матери в форме лечебной питательной композиции. Композиция может представлять собой сбалансированную по питательным веществам смесь.

Сбалансированная по питательным веществам смесь, предназначенная согласно изобретению для приема кормящими матерями, может содержать источник белка. Может использоваться любой подходящий пищевой белок, например животные белки (такие как молочные белки, мясные белки и яичный белок); растительные белки (такие как соевый белок, пшеничный белок, рисовый белок и гороховый белок); смеси свободных аминокислот или комбинации перечисленного. Особенно предпочтительными являются молочные белки (такие как казеин и сывороточные белки) и соевые белки. Композиция может содержать также источник углеводов и источник жира.

Если композиция включает источник жира в дополнение к DHA (докозагексаеновая кислота), то этот источник жира предпочтительно обеспечивает от 5% до 40% энергии смеси, например от 20% до 30% энергии. Подходящий жировой профиль может обеспечиваться смесью из масла канолы, кукурузного масла и высокоолеинового подсолнечного масла.

В композицию может добавляться источник углеводов. Он предпочтительно обеспечивает от 40% до 80% энергии смеси. Может использоваться любой подходящий углевод, например сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, сухая кукурузная патока, мальтодекстрины и смеси перечисленного. При необходимости может добавляться также пищевое волокно. Пищевое волокно проходит через тонкий кишечник в непереваренном под действием ферментов виде и функционирует как природный агент, увеличивающий объем, и как умеренное слабительное средство. Пищевое волокно может быть растворимым или нерастворимым, и в большинстве случаев предпочитается использовать смесь этих двух видов волокна. Подходящие источники пищевого волокна включают сою, горох, овес, пектин, гуаровую камедь, частично гидролизованную гуаровую камедь, гуммиарабик, фруктоолигосахариды и галактоолигосахариды. Если пищевое волокно присутствует в композиции, то его содержание предпочтительно составляет от 2 до 40 г/л готовой к употреблению композиции, более предпочтительно - от 4 до 10 г/л. В дополнение к этому композиция предпочтительно содержит также вышеописанную смесь олигосахаридов в количестве от 0,2 до 5 г/л восстановленной композиции, более предпочтительно - от 1 до 2 г/л.

Композиция может содержать также минералы и микронутриенты, такие как микроэлементы и витамины, в соответствии с рекомендациями правительственных органов, например USRDA (рекомендуемые в США суточные нормы потребления). Например, композиция может содержать из расчета на одну суточную дозу один или более следующих микронутриентов в приведенных ниже диапазонах: от 300 до 500 мг кальция, от 50 до 100 мг магния, от 150 до 250 мг фосфора, от 5 до 20 мг железа, от 1 до 7 мг цинка, от 0,1 до 0,3 мг меди, от 50 до 200 мкг йода, от 5 до 15 мкг селена, от 1000 до 3000 мкг бета-каротина, от 10 до 80 мг витамина С, от 1 до 2 мг витамина В1, от 0,5 до 1,5 мг витамина В6, от 0,5 до 2 мг витамина В2, от 5 до 18 мг ниацина, от 0,5 до 2,0 мкг витамина В 12, от 100 до 800 мкг фолиевой кислоты, от 30 до 70 мкг биотина, от 1 до 5 мкг витамина D, от 3 до 10 ME витамина Е.

При необходимости в композицию могут вводиться один или более пищевых эмульгаторов, например сложные эфиры диацетилвинной кислоты и моно- и диглицеридов, лецитин и моно- и диглицериды. Равным образом в композицию могут добавляться подходящие соли и стабилизаторы.

Композиция предпочтительно предназначается для энтерального введения, например, в виде порошка, восстанавливаемого молоком или водой.

Альтернативно или в случае грудных детей, не находящихся на грудном вскармливании, Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 может скармливаться ребенку с помощью ложки в виде добавки, например, суточной дозы 10¹⁰ КОЕ, растворенной в воде.

Детям, не находящимся на грудном вскармливании, может быть удобным давать Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 в составе смеси для детского питания.

Смесь для детского питания в рамках применения согласно настоящему изобретению может содержать источник белка в количестве не более 2,0 г/100 ккал, предпочтительно - от 1,8 до 2,0 г/100 ккал. Вид белка не является критическим в настоящем изобретении при условии, что он отвечает минимальным требованиям к содержанию незаменимых аминокислот и обеспечивает удовлетворительный рост, хотя предпочитается, чтобы свыше 50 масс.% источника белка составляла молочная сыворотка. Так, могут применяться источники белка на основе сыворотки, казеина и их смесей, а также источники белка на основе сои. Что касается сывороточных белков, то источник белка может быть на основе кислой сыворотки или сладкой сыворотки либо их смесей и может включать альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в любых желательных пропорциях.

Белки могут быть нативными или гидролизованными либо смесью нативных и гидролизованных белков. Может быть желательным использование частично гидролизованных белков (степень гидролиза между 2% и 20%), например, для грудных детей с предполагаемым риском развития аллергии на коровье молоко. Если требуются гидролизованные белки, то процесс гидролиза может осуществляться любым желательным методом, известным из уровня техники. Например, сывороточно-белковый гидролизат может быть получен ферментативным гидролизом сывороточной фракции в одну или более стадий. Установлено, что, если в качестве исходного материала используется сывороточная фракция, не содержащая, в основном, лактозы, то лизин белка в этом случае будет блокироваться, как было установлено, в намного меньшей степени в процессе гидролиза. Это позволяет снизить степень блокирования лизина примерно с 15 масс.% общего лизина до менее 10 масс.% лизина, например, примерно до 7 масс.% лизина, что значительно повышает питательное качество источника белка.

Смесь для детского питания может содержать источник углеводов. Может использоваться любой источник углеводов, традиционно встречающийся в смесях для детского питания, такой как лактоза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси, хотя предпочтительным источником углеводов является лактоза. Предпочтительно источники углеводов обеспечивают от 35% до 65% общей энергии смеси.

Смесь для детского питания может содержать источник липидов. Источником липидов может быть любой липид или жир, которые подходят для использования в смесях для детского питания. Предпочтительные источники жира включают пальмовый олеин, высокоолеиновое подсолнечное масло и высокоолеиновое сафлоровое масло. Могут добавляться также незаменимые жирные кислоты - линолевая и а-линоленовая, равно как и небольшие количества масел с высоким содержанием предварительно сформированных арахидоновой и докозагексаеновой кислот, таких как рыбий жир или микробные масла. В целом содержание жира предпочтительно должно быть таким, чтобы за счет него обеспечивалось от 30% до 55% общей энергии смеси. Источник жира предпочтительно имеет отношение n-6 жирных кислот к n-3 жирным кислотам, равное примерно от 5:1 до 15:1, например, примерно от 8:1 до 10:1.

Смесь для детского питания может также содержать все витамины и минералы, которые считаются незаменимыми в ежедневном рационе, в питательно значимых количествах. Установлены минимальные потребности в некоторых витаминах и минералах. Примеры минералов, витаминов и других нутриентов, необязательно присутствующих в смеси для детского питания, включают витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозит, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлорид, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минералы обычно добавляются в форме солей. Присутствие и количество специфических минералов и других витаминов будут варьировать в зависимости от той популяции грудных детей, для которой они предназначены.

При необходимости смесь для детского питания может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соевый лецитин, лимоннокислые эфиры моно- и диглицеридов и др.

Предпочтительно смесь для детского питания содержит вышеописанную смесь олигосахаридов в количестве от 0,2 до 5 г/л восстановленной смеси, более предпочтительно - от 1 до 2 г/л.

Смесь для детского питания может необязательно содержать и другие вещества, способные оказывать благотворное воздействие, такие как лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.

И смесь для детского питания, и питательная композиция, описанная выше, могут приготавливаться любым подходящим способом. Например, они могут приготавливаться смешиванием белка, источника углеводов и источника жира в соответствующих пропорциях. На этой же стадии могут вводиться эмульгаторы, если таковые используются. Витамины и минералы также могут добавляться на этой стадии, но обычно они добавляются позднее во избежание их разложения при нагреве. Любые липофильные витамины, эмульгаторы и др. могут предварительно растворяться в источнике жира перед смешиванием. Затем может примешиваться вода, предпочтительно вода, обработанная обратным осмосом, для получения жидкой смеси. Подходящая температура воды для облегчения диспергирования ингредиентов составляет примерно от 50°С до 80°С. Для получения жидкой смеси могут использоваться имеющиеся на рынке разжижители. Затем жидкая смесь гомогенизируется, например, в две стадии.

Далее жидкая смесь с целью снижения ее бактериальной нагрузки может подвергаться тепловой обработке путем быстрого нагрева жидкой смеси, например, до температуры примерно от 80°С до 150°С в течение примерно от 5 секунд до 5 минут. Это может осуществляться путем инжекции пара, в автоклаве или теплообменнике, например, в пластинчатом теплообменнике.

После этого жидкая смесь может охлаждаться до температуры примерно от 60°С до 85°С, например, путем мгновенного охлаждения. Затем жидкая смесь может повторно гомогенизироваться, например, в две стадии при давлении примерно от 10 МПа до 30 МПа на первой стадии и примерно от 2 МПа до 10 МПа на второй стадии. Гомогенизированная смесь может далее охлаждаться до температуры добавления чувствительных к нагреву компонентов, таких как витамины и минералы. На этой стадии удобно регулировать величину рН и содержание сухих веществ в гомогенизированной смеси.

Гомогенизированная смесь переносится в подходящий сушильный аппарат, например в распылительную или сублимационную сушилку и превращается в порошок. Содержание влаги в порошке должно быть ниже примерно 5 масс.%.

Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 может культивироваться любым удобным методом и подвергаться обработке перед добавлением в питательную композицию или в смесь для детского питания, например сублимационной или распылительной сушке. Альтернативно Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 можно закупить у Christian Hansen под торговой маркой Bb12® в уже готовом виде, пригодном для добавления в пищевые продукты, такие как питательная композиция и смеси для детского питания. Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 может добавляться в смесь в количестве от 10 до 10 КОЕ/г порошка, более предпочтительно - от 10³ до 10¹² КОЕ/г порошка.

Ниже изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Пример состава смеси для детского питания, пригодной для применения в настоящем изобретении, дается ниже.

Пример 2

Настоящий пример сравнивает действие Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 с добавлением и без добавления олигосахаридного ингредиента, включающего N-ацетилированные олигосахариды, нейтральные олигосахариды и сиалилированные олигосахариды (далее по тексту CMOS-GOS), на становление начальной бифидогенной кишечной микробиоты у экспериментальной модели гнотобионтной мыши для изучения родов с помощью кесарева сечения с действием другого штамма бифидобактерий и контроля. Указанная модель является соответствующей животной моделью детей, рожденных путем кесарева сечения и имеющих субоптимальную кишечную микробиоту в рамках популяции бифидобактерий. В дополнение к наблюдению за размером популяции бифидобактерий указанная модель пригодна также для изучения положительного действия бифидобактерий в качестве барьера против потенциально патогенных бактерий типа Clostridium perfringens.

Материалы и методы

Безмикробные (стерильные) мыши СЗН - самки и самцы - были закуплены у Charles River Laboratories (Франция) и перевезены в транспортных изоляторах в Nestle Research Centre. По прибытии животные были пересажены в изоляторы для разведения после контроля их состояния стерильности. Для проведения настоящего исследования использовалось потомство от самок этой отобранной для разведения популяции. Животные-отъемыши произвольно распределялись по 4 экспериментальным группам: в группе А животные получали контрольный рацион и контрольное питье; в В - контрольный рацион и питье с пробиотиком В. lactis CNCM 1-3446; в С - рацион с пребиотиком CMOS-GOS и питье с пробиотиком В. lactis CNCM 1-3446; в D - контрольный рацион и питье с пробиотиком В. longum АТСС ВАА-999.

Животные содержались в разных изоляторах в клетках по 5 животных на каждую клетку. Группа А содержалась в одном изоляторе, группы В и С - во втором, а группа D - в третьем изоляторе. Состояние стерильности контролировалось еженедельно путем анализа свежесобранных фекалий от одного животного из каждой клетки. В течение этого периода животным скармливался основной рацион AIN-93 (см. ниже табл.1).

По достижении животными возраста от 7 до 8 недель проводился повторный контроль состояния стерильности на 2 животных из каждой клетки, после чего каждому животному принудительно вводилась через зонд единичная доза (200 мкл) смеси микробиоты грудного ребенка (HBF), описанной ниже в табл.2. После введения указанной смеси все животные содержались на основном рационе в течение 2 недель, необходимых для становления HBF в кишечнике. Затем твердый рацион был заменен смесью AIN (табл.1) (в группах А, В и D) или смесью AIN-CMOS-GOS (в группе С). Обычная питьевая вода была заменена солевым водным раствором, содержащим 0,5% (об./об.) MRS (питательная среда, названная по начальным буквам фамилий ее создателей: de Man-Rogosa-Sharpe) (в группе А), или солевым водным раствором, содержащим пробиотические бактерии и 0,5% (об./об.) MRS (в группах В, С и D). Конечные концентрации пробиотиков составили 2,5×10⁷ КОЕ/мл В. lactis CNCM 1-3446 (в группах В и С) and 2,2×10⁷ КОЕ/мл В. longum ATCC ВАА-999 (в группе D).

Bifidobacterium lactis CNCM 13446 был получен из коллекции культур Nestle. Если говорить кратко, то штамм реактивировался и выращивался в MRS среде примерно до 1,5×10⁹ КОЕ/мл. После этого штамм концентрировался центрифугированием в истощенной MRS среде и разбавлялся до 4,9×10⁹ КОЕ/мл свежеприготовленной MRS средой. Затем разделялся на 1 мл-е аликвоты, которые замораживались при - 80°С до последующего применения. Ежедневно одна свежеразмороженная 1 мл-я аликвота Bifidobacterium lactis CNCM 13446 в MRS среде (для групп В и С) или 1 мл MRS (для группы А) среды вводилась в изоляторы, растворялась в 200 мл солевого раствора и поровну распределялась по питьевым бутылочкам. При среднем потреблении 5 мл/сутки/мышь каждое животное из групп, в рацион которых входили В. lactis, получало около 10 КОЕ В. lactis/сутки.

Bifidobacterium longum ATCC ВАА-999 был получен из коллекции культур Nestle. Если говорить кратко, то штамм реактивировался и выращивался в MRS среде примерно до 1×10⁹ КОЕ/мл. После этого штамм концентрировался центрифугированием и разбавлялся до 4,4×10⁹ КОЕ/мл свежеприготовленной MRS средой. Затем разделялся на 1 мл-е аликвоты, которые замораживались при - 80°С до последующего применения. Ежедневно одна свежеразмороженная 1 мл-я аликвота Bifidobacterium longum ATCC ВАА999 в MRS среде (для группы D) вводилась в изоляторы, растворялась в 200 мл солевого раствора и поровну распределялась по питьевым бутылочкам. При среднем потреблении 5 мл/сутки/мышь каждое животное из группы, в рацион которой входили В. longum, получало около 10 КОЕ В. longum/сутки.

Олигосахаридный ингредиент CMOS-GOS приготовлялся из не содержащего белка, деминерализованного пермеата молочной сыворотки промышленного производства (Lactosérum France, Франция). Если говорить кратко, то полученный путем ультрафильтрации пермеат сыворотки коровьего молока подвергался деминерализации на промышленной линии деминерализации, оборудованной электродиализными модулями и анионо- и катионообменниками (Lactosérum France). Затем деминерализованный сывороточный пермеат подвергался 2 последовательным промышленным циклам кристаллизации лактозы и последующей распылительной сушке (Lactosérum France). Полученный порошок модифицированного маточного раствора гидратировался в атмосфере с повышенной относительной влажностью (~43%), установленной с помощью насыщенного раствора К₂СО₃, в закрытом контейнере. Это способствовало образованию кристаллической лактозы. К повторно гидратированному порошку добавлялась холодная вода (около 2-3 литров/кг регидратированного порошка), и смесь центрифугировалась при 10000 g в течение 20 минут. Супернатант собирался, а осадок суспендировался вновь в холодной воде и центрифугировался, как и ранее. Второй супернатант объединялся с первым и оба подвергались лиофилизации. Полученный олигосахаридный ингредиент коровьего молока с пониженным содержанием лактозы (CMOS) подвергался анализу в высокоэффективной системе для анионообменной хроматографии, оборудованной импульсным амперометрическим детектором (HPAEC-PAD; ICS3000, Dionex, Sunnyvale, СА), с применением аналитической колонки CarboPac PA200 (Dionex), оснащенной пред-колонкой-амино-ловушкой CarboPac (Dionex). Препарат CMOS содержал оригинальные олигосахариды и около 3% (масс./масс.) глюкозы, 46% (масс./масс.) лактозы, 0,84% (масс./масс.) сиалил-лактозы. Галактозилолигосахариды (Vivinal GOS 259) были закуплены у Friesland Foods DOMO. Ингредиент реализуется в виде сиропа с содержанием сухого вещества (DM) около 75%, из которых лактоза составляет 23% (в пересчете на DM), глюкоза - 22% (в пересчете на DM), галактозилолигосахариды - 59% (в пересчете на DM); он смешивался с препаратом CMOS с получением ингредиента CMOS-GOS, содержащего около 9% масс. N-ацетилированных олигосахаридов, примерно 82% масс. нейтральных олигосахаридов и около 9% масс.сиалилированных олигосахаридов.

Мышам скармливался исключительно полусинтетический рацион AIN-93 и его модификации (табл.1). Начиная с 15 дня после родоразрешения, им давался основной AIN-93 рацион. Вначале экспериментов мышиный молодняк по достижении возраста примерно 8 недель получал в течение 14 дней 'AIN-смесь' (группы А, В и D) или 'AIN-CMOS-GOS' (группа С).

Контроль за состоянием стерильности осуществлялся путем анализа свежесобранных фекалий от 1-2 мышей/в каждой клетке. Если говорить кратко, то одна частичка свежесобранных фекалий гомогенизировалась в 0,5 мл раствора Рингера (Oxoid, UK) с добавлением 0,05% (масс./об.) L-цистеина (НС1) и дважды высевалась по 100 мкл на 2 чашки TSS (агар с соей Trypcase с добавлением 5% овечьей крови; BioMerieux, France). Одна чашка инкубировалась в аэробных условиях в течение 24 ч при 37°С, вторая чашка - в анаэробных условиях в течение 48 ч при 37°С.

Образцы фекалий собирались и подвергались анализу, начиная с 14 дня. Если говорить кратко, то одна частичка фекалий каждой мыши гомогенизировалась в 0,5 мл раствора Рингера (Oxoid, UK) с добавлением 0,05% (масс./об.) L-цистеина (НС1), и в разных разбавлениях бактериального раствора высевалась на селективные и полуселективные среды для подсчета специфических микроорганизмов: бифидобактерий - на среде Eugom Tomato, лактобацилл - на MRS-среде с добавлением антибиотиков (фосфомицин, сульфаметоксазол и триметоприм), С.perfringens - на NN-агаровой среде, энтеробактерий - на среде Drigalski и бактероидов - на среде Shaedler Neo Vanco. Чашки инкубировались при 37°С в аэробных условиях в течение 24 ч для подсчета энтеробактерий и в анаэробных условиях в течение 48 ч для подсчета бифидобактерий, лактобацилл, бактероидов и С.perfringens.

На 14 сутки животные умерщвлялись. Если говорить кратко, то 2 клетки/изолятор одновременно вынимались из данного изолятора при одновременном поддержании изолятора в стерильном состоянии до удаления всех животных. Каждое животное взвешивалось. Сразу после взвешивания животное умерщвлялось путем обезглавливания и полного обескровливания. Кровь собиралась, а животные препарировались с целью получения образцов содержимого тощей кишки (примерно 6-7 см сразу после двенадцатиперстной кишки) для проведения анализа микробиоты.

Результаты

Фиг.1 показывает количество двух резидентов (постоянных обитателей) микробиоты грудного ребенка - бифидобактерий В. breve и В. longum в тощей кишке (jejunum) и фекалиях спустя две недели лечения. В группах В и С отмечено повышенное количество В. breve в тощей кишке. В фекалиях повышенное количество было обнаружено в группах В и D. Не установлено существенных различий в количестве В. longum между группами.

Количество С.perfringens в тощей кишке (jejunum) и фекалиях спустя две недели лечения показано на фиг.2. В тощей кишке пониженные уровни С.perfringens counts обнаружены в группах В и С, получавших В. lactis, но не в группах А и D, не получавших В. lactis. Этот эффект был даже более выраженным в образцах фекалий.

Уровни В. lactis, выше порогового (10⁵ КОЕ/г фекалий), были обнаружены примерно у 50% животных в группах В и С спустя 1 неделю и ни у одного из животных спустя 2 недели. Как можно видеть из табл.3 (ниже), несмотря на относительно высокую суточную дозу вводимых В. lactis, последние не конкурировали с резидентом микробиоты - бифидобактериями - и оставались минорным компонентом микробиоты.