Результат интеллектуальной деятельности: КРЕМНИЙЦИНКОСОДЕРЖАЩИЙ ГЛИЦЕРОГИДРОГЕЛЬ, ОБЛАДАЮЩИЙ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ, РЕГЕНЕРИРУЮЩИЙ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к фармацевтической химии и медицине, а именно, к новому биологически активному химическому веществу - кремнийцинксодержащему глицерогидрогелю, который может найти применение в качестве лекарственного средства, обладающего ранозаживляющей, регенерирующей и антибактериальной активностью.

Известен моноглицеролат цинка ZnC₃H₆O₃, обладающий фармакологической активностью, который используют, в основном, местно для лечения кожных заболеваний. Так, описана ранозаживляющая и регенерирующая активность моноглицеролата цинка при использовании его в виде порошка в составе крема/мази при лечении ожогов, язв, экзем, герпеса (Appl. WO 94/02133, МПК A61K 31/45, 1994 г., Appl. US 20060173073, МПК A61K 31/315, 2006 г.). Кроме того, моноглицеролат цинка проявляет антибактериальную активность в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (Pat. US 4876278, МПК A61K 31/045, 1989 г.).

Недостатком известного средства является невозможность его использования в удобной форме геля, поскольку отсутствуют сведения о возможности образования гидрогелей из моноглицеролата цинка.

Известен тетраглицеролат кремния, синтезированный в избытке глицерина, состав которого отвечает формуле Si(С₃Н₇О₃)₄·хС₃Н₈О₃, где 0,5≤х≤10, и глицерогидрогель на его основе, обладающий противовоспалительным, ранозаживляющим, регенерирующим действием (Пат. RU 2255939, C07F 7/04, A61K 47/30, 2005 г.). Глицерогидрогель был получен путем добавления воды, содержащей электролит (например, HCl), к тетраглицеролату кремния в избытке глицерина при температуре 80°С.

Однако известный глицерогидрогель не обладает антибактериальной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Таким образом, перед авторами стояла задача с целью расширения арсенала лекарственных средств получить новое средство, обладающее ранозаживляющей, регенерирующей и антибактериальной активностью, которое может быть использовано в форме геля. При этом средство должно быть нетоксичным, простым в получении и хорошо воспроизводимым в способе получения при использовании доступного сырья, стабильным при хранении, удобным для практического использования.

Поставленная задача решена путем получения кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля, обладающего ранозаживляющей, регенирирующей и антибактериальной активностью, состав которого отвечает формуле kSi(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·хС₃Н₈О₃·yH₂O, где 1≤k≤4, 7≤x≤26, 20≤y≤100, полученного взаимодействием тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·хС₃Н₈О₃, где 0,5≤x≤10, моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6С₃Н₈О₃ и воды при мольном соотношении Si(С₃Н₇О₃)₄:ZnC₃H₆O₃:С₃Н₈О₃:Н₂О равном (1÷4):1:(7÷26):(20÷100) при температуре 20-40°C и интенсивном перемешивании.

В настоящее время в патентной и научно-технической литературе не известен биологически активный кремнийцинксодержащий глицерогидрогель, обладающий ранозаживляющей, регенерирующей и антибактериальной активностью, нетоксичный, удобный в применении, который был бы получен предлагаемым способом и содержал заявляемые компоненты в указанных интервалах.

Кремнийцинксодержащий глицерогидрогель, состав которого отвечает формуле kSi(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·хС₃Н₈О₃·yH₂O, где 1≤k≤4, 7≤x≤26, 20≤y≤100, может быть получен следующим образом. Тетраглицеролат кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·хС₃Н₈О₃, где 0,5≤x≤10, полученный в виде прозрачной вязкой жидкости (Пат. RU 2255939, C07F 7/04, A61K 47/30, 2005 г.), и моноглицеролат цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6С₃Н₈О₃, полученный в виде коллоидной суспензии (Pat. US 4544761, МПК A61L 15/20, С07С 31/28, 1985 г.), смешивают при температуре 20-40°C с последующим добавлением воды при мольном соотношении Si(C₃H₇O₃)₄:ZnC₃H₆O₃:С₃Н₈О₃:Н₂О равном (1÷4):1:(7÷26):(20÷100) и перемешивании до потери в системе текучести с образованием однородного геля белого цвета. Продукт охарактеризован данными элементного анализа и ИК спектроскопии.

Образование кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля соответствует золь-гель процессу, включающему химические реакции гидролиза и конденсации исходных веществ (прекурсоров), тесно связанные с физическими явлениями коагуляции и сорбции. Полученный глицерогидрогель содержит в своей структуре одновременно химически связанные атомы кремния и цинка в биологически активной форме.

Авторами были проведены экспериментальные исследования по выбору мольного соотношения тетраглицеролата кремния, моноглицеролата цинка, глицерина и воды для получения в оптимальных условиях глицерогидрогеля, стабильного к синерезису. Так, содержание тетраглицеролата кремния и моноглицеролата цинка должно соответствовать оптимальному соотношению атомов кремния и цинка, позволяющему получить синергетический эффект в плане фармакологической активности глицерогидрогеля, устойчивости к явлению синерезиса, а также наиболее приемлемой консистенции для практического применения. Так, при мольном содержании тетраглицеролата кремния менее предлагаемого (k<1) образование глицерогидрогеля не происходит. В случае содержания тетраглицеролата кремния более предлагаемого (k>4) полученный продукт не обладает явно выраженной антибактериальной активностью. При мольном содержании глицерина и воды более предлагаемого (x>26 и y>100) глицерогидрогель подвергается синерезису, кроме того, из-за избытка глицерина приобретает «жирную» консистенцию; при содержании глицерина и воды менее предлагаемого (x<7 и y<20) образуется твердый, хрупкий, растрескивающийся при хранении и малоудобный в применении продукт.

Следующие примеры характеризуют способ получения и состав кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля, определение его антибактериальной активности (in vitro), острой токсичности, а также изучение ранозаживляющей и регенерирующей активности (на примере экспериментальных животных).

Пример 1. Получение кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля 2Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·7С₃Н₈О₃·20Н₂О.

45,08 г (0,103 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·0,5С₃Н₈О₃ и 36,39 г (0,051 моль) моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6С₃Н₈О₃ смешивают при температуре 20°C до получения однородной массы. Затем при температуре 40°C и интенсивном перемешивании добавляют 18,52 г (1,028 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(С₃Н₇О₃)₄:ZnC₃H₆O₃:С₃Н₈О₃:Н₂О=2:1:7:20) и продолжают перемешивать до получения однородного геля белого цвета.

Состав полученного продукта отвечает формуле 2Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·7С₃Н₈О₃·20Н₂О.

Найдено (%): С 29,57; Н 8,11; Si 2,95; Zn 3,30. C₄₈H₁₅₈O₆₈Si₂Zn.

Вычислено (%): С 29,64; Н 8,19; Si 2,89; Zn 3,36.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3282, 1647 (ОН); 2933, 2880 (С-Н); 1107, 1036, 989 (Si-O-C); 1107 (С-О-С), 647 (Zn-O).

Пример 2. Получение кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля 2Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·7С₃Н₈О₃·100Н₂О.

25,89 г (0,059 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·0,5С₃Н₈О₃ и 20,90 г (0,029 моль) моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6C₃H₈O₃ смешивают при температуре 20°C до получения однородной массы. Затем при температуре 40°C и интенсивном перемешивании добавляют 53,20 г (2,953 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(С₃Н₇О₃)₄:ZnC₃H₆O₃:С₃Н₈О₃:Н₂О=2:1:7:100) и продолжают перемешивать до получения однородного геля белого цвета.

Состав полученного продукта отвечает формуле 2Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃.7С₃Н₈О₃·100Н₂О.

Найдено (%): С 16,94; Н 9,42; Si 1,72; Zn 1,87. C₄₈H₃₁₈O₁₄₈Si₂Zn.

Вычислено (%): С 17,02; Н 9,47; Si 1,66; Zn 1,93.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3278, 1643 (ОН); 2945, 2885 (С-Н); 1115, 1037, 993 (Si-O-C); 1115 (С-О-С), 650 (Zn-O).

Пример 3. Получение кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля 2Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·26С₃Н₈О₃·20Н₂О.

71,09 г (0,054 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·10С₃Н₈О₃ и 19,16 г (0,027 моль) моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6C₃H₈O₃ смешивают при температуре 20°C до получения однородной массы. Затем при температуре 40°C и интенсивном перемешивании добавляют 9,75 г (0,541 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(С₃Н₇О₃)₄:ZnC₃H₆O₃:C₃H₈O₃:Н₂О=2:1:26:20) и продолжают перемешивать до получения однородного геля белого цвета.

Состав полученного продукта отвечает формуле 2Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·26С₃Н₈О₃·20Н₂О.

Найдено (%): С 33,92; Н 8,36; Si 1,60; Zn 1,67. C₁₀₅H₃₁₀O₁₂₅Si₂Zn.

Вычислено (%): С 34,13; Н 8,46; Si 1,52; Zn 1,77.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3285, 1652 (ОН); 2934, 2880 (С-Н); 1107, 1031, 990 (Si-O-C); 1107 (С-О-С), 643 (Zn-O).

Пример 4. Получение кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля 2Si(C₃H₇O₃)₄·ZnC₃H₆O₃·26С₃Н₈О₃·100Н₂О.

51,13 г (0,039 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·10С₃Н₈О₃ и 13,78 г (0,019 моль) моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6C₃H₈O₃ смешивают при температуре 20°C до получения однородной массы. Затем при температуре 40°C и интенсивном перемешивании добавляют 35,07 г (1,947 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(C₃H₇O₃)₄:ZnC₃H₆O₃:С₃Н₈О₃:Н₂О=2:1:26:100) и продолжают перемешивать до получения однородного геля белого цвета.

Состав полученного продукта отвечает формуле 2Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₂·ZnC₃H₈O₃·100Н₂О.

Найдено (%): С 24,49; Н 9,15; Si 1,11; Zn 1,17. C₁₀₅H₄₇₀O₂₀₅Si₂Zn.

Вычислено (%): С 24,55; Н 9,22; Si 1,09; Zn 1,27.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3271, 1646 (ОН); 2940, 2883 (С-Н); 1109, 1036, 992 (Si-O-C); 1109 (С-О-С), 650 (Zn-O).

Пример 5. Получение кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·12С₃Н₈О₃·56Н₂О.

35,50 г (0,038 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·6С₃Н₈О₃ и 26,60 г (0,038 моль) моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6C₃H₈O₃ смешивают при температуре 20°C до получения однородной массы. Затем при температуре 20°C и интенсивном перемешивании добавляют 37,90 г (2,104 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(С₃Н₇О₃)₄:ZnC₃H₆O₃:С₃Н₈О₃:Н₂О=1:1:12:56) и продолжают перемешивать до получения однородного геля белого цвета.

Состав полученного продукта отвечает формуле Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·12С₃Н₈О₃·56Н₂О.

Найдено (%): С 22,94; Н 9,10; Si 1,12; Zn 2,37. C₅₁H₂₄₂O₁₀₇SiZn.

Вычислено (%): С 23,01; Н 9,16; Si 1,06; Zn 2,46.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3292, 1645 (ОН); 2932, 2881 (С-Н); 1110, 1038, 992 (Si-O-C); 1110 (С-О-С), 647 (Zn-O).

Пример 6. Получение кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля 4Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·18С₃Н₈О₃·60Н₂О.

59,92 г (0,090 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·3С₃Н₈О₃ и 15,86 г (0,022 моль) моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6C₃H₈O₃ смешивают при температуре 20°C до получения однородной массы. Затем при температуре 40°C и интенсивном перемешивании добавляют 24,21 г (1,344 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(С₃Н₇О₃)₄:ZnC₃H₆O₃:С₃Н₈О₃:Н₂О=4:1:18:60) и продолжают перемешивать до получения однородного геля белого цвета.

Состав полученного продукта отвечает формуле 4Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·18С₃Н₈О₃·60Н₂О.

Найдено (%): С 28,18; Н 8,55; Si 2,58; Zn 1,36. C₁₀₅H₃₈₂O₁₆₅Zn.

Вычислено (%): С 28,25; Н 8,63; Si 2,52; Zn 1,46.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3294, 1646 (ОН); 2932, 2880 (С-Н); 1110, 1037, 990 (Si-O-C); 1111 (С-О-С), 650 (Zn-O).

Микробиологические исследования заявляемого средства in vitro выполнены в Центре военно-технических проблем биологической защиты НИИ Микробиологии МО РФ (г.Екатеринбург).

Проведена оценка антибактериальных свойств кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля, состав которого отвечает формуле Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·12С₃Н₈О₃·56Н₂О (пример 5), в отношении следующих штаммов тест-культур микроорганизмов: Staphylococcus aureus 906, Staphylococcus epidermidis 14990, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Pseudomonas aeruginosa 9027, Escherichia coli 25922.

Тест-культуры выращивали при температуре 37°С в течение 18-24 часов на скошенном мясопептонном агаре.

Для изучения антибактериальных свойств глицерогидрогеля использовали метод диффузии в агар. В стерильные чашки Петри (пластмассовые разового использования) разливали питательную агаризованную среду (с содержанием аминного азота 30 мг% и рН 7,0-7,2). Предварительно в расплавленную и охлажденную до 45-48°C среду вносили соответствующую тест-культуру в концентрации 1×10⁷ микробных клеток (по оптическому стандарту мутности) на 1 см среды. После застывания и подсушивания питательной среды в течение 60 мин на ее поверхность накладывали кольца из нержавеющей стали с внутренним диаметром кольца (6,0±0,1) мм и высотой (2,5±0,1) мм. В кольца помещали навески глицерогидрогеля, вазелина и линимента стрептоцида 5%-ного растворимого (в качестве контроля). Масса навесок, помещенных в кольца, составляла ~ 50 мг. По величине зоны ингибирования роста вокруг кольца (диаметру роста) после 20-часового инкубирования при температуре (36,0±1,0)°C судили об отсутствии или наличии и о степени выраженности антибактериального действия заявляемого глицерогидрогеля. Результаты представлены в таблице.

Как видно из данных таблицы, кремнийцинксодержащий глицерогидрогель обладает умеренной антибактериальной активностью, охватывая аэробные бактериальные формы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Среди исследованных штаммов более чувствительными являются тест-культуры грамотрицательных бактерий E.coli и P. aeruginosa.

Токсикологические исследования заявляемого средства in vivo

Исследования выполнены на кафедре фармакологии Уральской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения РФ (г.Екатеринбург).

Исследование острой токсичности кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля, состав которого соответствует формуле Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·12С₃Н₈О₃·56Н₂О (пример 5), проведено согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под редакцией А.Н. Миронова (ч.1. М.: Гриф и К, 2012 г., 944 с.) на белых беспородных мышах массой 30-40 г. Экспериментальные животные содержались в виварии при температуре 18-20°C в условиях естественного светового цикла на стандартной диете при свободном доступе к пище и воде.

Исследуемый гель вводили в желудок через зонд и внутрибрюшинно однократно в виде 50% -ной водной суспензии в количестве 0,5-1,0 мл (объем желудка).

После введения глицерогидрогеля ежечасно наблюдали за поведением животных в течение первых суток, а в последующие 13 дней - ежедневно. В процессе эксперимента регистрировали в зависимости от дозы общую двигательную активность животных, нервно-мышечную возбудимость, рефлексы (болевой, роговичный), вегетативные реакции (саливация, диурез, дефекация).

Установлено, что при внутрижелудочном и внутрибрюшинном применении заявляемого глицерогидрогеля экспериментальные животные оставались живыми, и признаков интоксикации не было выявлено в течение всего срока наблюдения. Все контролируемые показатели у животных подопытных групп существенно не отличались от аналогичных показателей контрольных групп.

Таким образом, исследуемое вещество (согласно ГОСТ 12.1.007-76) относится к малотоксичным соединениям (IV класс опасности).

Исследования ранозаживляющей и регенерирующей активности заявляемого средства in vivo

Исследование проводили на модели термической травмы слизистой оболочки нижней губы крыс популяции Wistar массой 280-330 г. Крысы были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой. Крысам 1-й (опытная) и 2-й (контрольная) групп под эфирным рауш-наркозом наносили термический ожог с помощью нагретого до 100°С металлического шпателя при 20-секундном контакте со слизистой оболочкой нижней губы; 3-я группа оставалась интактной, контрольная - лечения не получала.

Лечение животных опытной группы начинали через сутки после создания термического ожога и проводили открытым способом, нанося тонкий слой кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля, состав которого отвечает формуле Si(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·12С₃Н₈О₃·56Н₂О (пример 5) (-0,1 г), непосредственно на место поражения один раз в сутки в утренние часы до полного заживления ран.

На травмированных участках слизистой оболочки на фоне лечения заявляемым средством у всех опытных крыс эпителизация наступала ~ на 5-е сутки с тенденцией к более быстрому уменьшению гиперемии и отека слизистой. В контрольной группе полное заживление ран наблюдалось ~ на 7-е сутки.

Динамика изменения массы крыс опытных и контрольной групп свидетельствуют об уменьшении веса тела в среднем на ~5% на протяжении эксперимента. У интактных животных, напротив, наблюдалась прибавка в весе в среднем на ~5%. Изменение данного показателя объясняется затруднением приема пищи животными в результате выраженной болезненности области нижней губы.

До нанесения ожогов и в период лечения исследовали поведенческие реакции животных («открытое поле»). После курса лечения (5, 7, 10 и 14 суток) у животных проводили общие и биохимические анализы крови, а также морфологические исследования висцеральных органов и слизистой оболочки.

Гистологические препараты готовили после фиксации тканей (сердца, легких, печени, почек, надпочечников, селезенки, кожи) 10%-ным раствором формалина и заливали парафином. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизону. Исследуемые органы - без проявления структурных изменений.

В исследовании «открытое поле» оценивали вертикальную и горизонтальную активность животных по следующим показателям: время ухода с круга, количество пройденных квадратов, число вставаний, умываний и заглядываний в «норы». Наибольшее снижение активности по всем показателям наблюдалось в контрольной группе; в опытной группе активность приближалась к исходному уровню.

Гематологическое и биохимическое исследование крови животных опытной и контрольной групп выявило воспалительную реакцию в первые сутки после травмы. В процессе лечения в контрольной группе нейтрофильный лейкоцитоз сохранялся до 7 суток, в опытной - 5 суток, что свидетельствует о противовоспалительных свойствах заявляемого глицерогидрогеля.

Активность трансаминаз крови (АЛТ, ACT), содержание мочевины и гемоглобина существенно не различались у животных опытной и контрольной групп, что свидетельствует об отсутствии токсического воздействия заявляемого глицерогидрогеля.

В результате морфологических исследований выявлено, что в контрольной группе повреждение слизистой характеризуется большей глубиной и степенью дистрофических изменений эпителия. На фоне применения глицерогидрогеля наблюдалось полное восстановление эпителия на всем протяжении очага повреждения с признаками пролиферативной активности эпителиоцитов базального слоя.

Таким образом, авторами предложен кремнийцинксодержащий глицерогидрогель, который является физиологически активным веществом, проявляет антибактериальное, ранозаживляющее и регенерирующее действие, улучшает морфофункциональное состояние слизистой оболочки полости рта, является удобной формой для местного применения, расширяет арсенал лекарственных средств и может быть рекомендован для использования в медицинской практике.