УЛУЧШЕННЫЕ МОЛЕКУЛЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С NOGO-А И ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к улучшенным молекулам, связывающимися с Nogo-А, таким, например, как моноклональные антитела, их производные или Fab-фрагменты.

Предпосылки создания изобретения

Регенерация нейронов после травмы центральной нервной системы (ЦНС) взрослых носит ограниченный характер из-за присутствия ингибирующего миелинового слоя, который составляет оболочку аксонов, и образования рубцовой ткани. За последние пять лет достигнуты значительные успехи в исследовании молекулярных основ неспособности ЦНС к самопроизвольной регенерации после травмы. Главным препятствием на пути регенерации аксона, прежде всего непосредственно после травмы, является присутствие ингибиторов в миелине. В настоящее время установлено, что эффективными ингибиторами роста невритов являются Nogo-A, миелин-ассоциированный гликопротеин (МАГ) и миелин-олигодендтроцит-ассоциированный гликопротеин (ОМГП). Кроме того, в миелине присутствуют также другие ингибирующие компоненты, такие как хондроитинсульфатпротеогликаны. Nogo-A является членом семейства белков ретикулина и содержит по меньшей мере два биологически активных и фармакологически различных домена, обозначаемых амино-Nogo и Nogo-66. Хотя рецепторный участок первого домена пока неизвестен, установлено, что Nogo-66 подавляет рост нейронов in vitro и in vivo, воздействуя на нейронный рецептор NgR. Кроме Nogo-66 МАГ и ОМГП связываются также с NgR с высокой аффинностью и подавляют рост невритов.

Исследуются также новые подходы для усиления регенерации невритов, которые включают деградацию рубцовой ткани с использованием фермента хондроитиназы АВС, методики сшивания с использованием нейросенсорных (обонятельных) клеток и стволовых клеток, а также белковых ростовых факторов для стимулирования роста нейронов. Блокирующее действие на рост невритов создается благодаря модуляции внутриклеточных медиаторов передачи сигнала, таких как Rho, мембранная гуанозинтрифосфатаза (ГТФаза), которая является ключевым звеном в ингибировании роста аксонов. Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) может действовать в обход миелин-ассоциированного ингибирования in vitro и индуцировать регенерацию in vivo. Для индуцирования регенерации нейронов и функционального восстановления на модели крыс после повреждения спинного мозга можно использовать пептидный ингибитор рецептора NgR (NEP 1-40).

Наряду с использованием вышеописанных подходов много внимания уделяется также применению некоторых моноклональных антител для нейтрализации соединений, подавляющих рост невритов в центральной и периферической нервной системе, прежде всего нейтрализации ингибирующего действия Nogo-A на рост невритов. Таким образом, установлено, что моноклональные антитела IN-1 или Fab-фрагмент IN-1 индуцируют рост невритов in vitro и усиливают рост и регенерацию in vivo (Schwab M.E. и др., Physiol. Rev., 76, 319-370 (1996)). Альтернативные относительно IN-1 антитела описаны в WO 2004/052932 (11С7-Ab) и WO 2005/028508 (3А6-Ab). После анализа ингибирующего действия на рост невритов различных доменов Nogo-A было выявлено несколько ингибирующих доменов (Chen и др., Nature, 403, 434-439 (2000), GrandPre и др., Nature, 403, 439-444 (2000), Prinjha и др., Nature, 403, 383-384 (2000).

Природные иммуноглобулины или антитела обычно представляют собой Y-образная мультимерная молекула, содержащая антиген-связывающий участок в концевом фрагменте каждого верхнего ответвления. Остальная часть молекулы прежде всего стержень Y-образной структуры выполняет эффекторные функции иммуноглобулинов. Антитела содержат 2 тяжелых и 2 легких цепи. Тяжелая и легкая цепи включают вариабельный домен и консервативный участок. Антиген-связывающий участок состоит из вариабельного домена тяжелой цепи, ассоциированного с вариабельным доменом легкой цепи. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей характеризуются одинаковой общей структурой. Более конкретно, антиген-связывающие характеристики антител по существу определяются тремя конкретными областями в вариабельном домене тяжелой и легкой цепей, которые называются гипервариабельными участками комплементарности (CDR). Указанные три гипервариабельные области чередуются с четырьмя каркасными участками (FR), которые характеризуются относительно консервативной аминокислотной последовательностью и принимают косвенное участие в связывании с антигеном. CDR образуют петли и располагаются в непосредственной близости к каркасным участкам, которые в основном образуют конформацию β-складчатого листа. CDR тяжелой цепи вместе с CDR легкой цепи главным образом составляют антиген-связывающий участок молекул антител. Состав областей FR или CDR обычно определяют сравнением аминокислотных последовательностей ряда антител, продуцируемых в одном виде животного. Общее правило идентификации областей CDR и FR известно специалистам в данной области и описано в соответствующем вебучастке.

В общем случае, в настоящее время существует необходимость в новых и улучшенных способах индуцирования регенерации нервной ткани после повреждения центральной нервной системы (ЦНС) взрослых.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к новым моноклональным антителам человека, которые обладают более высокой эффективностью при модулировании активности Nogo-A в экспериментах in vitro и in vivo и оказывают положительное действие на регенерацию невритов при повреждении центральной нервной системы (ЦНС) взрослых. Следовательно, в изобретении предлагаются новые молекулы, связывающиеся с белком Nogo-A или его фрагментами.

В одном варианте изобретения предлагается молекула, содержащая по меньшей мере один антиген-связывающий участок, который специфично связывается с полипептидом Nogo-A человека (SEQ ID NO: 2) или NiG человека (SEQ ID NO: 3), причем указанный антиген-связывающий участок включает:

- гипервариабельные области CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), соответственно, и

- гипервариабельные области CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13), соответственно.

В другом варианте антиген-связывающий участок указанной молекулы по изобретению включает:

- гипервариабельные области CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), и

- гипервариабельные области CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13).

В еще одном варианте изобретения предлагаются связывающие молекулы, которые содержат

- по меньшей мере одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, который включает (1) вариабельный домен, включающий гипервариабельные области CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10) и (2) константный сегмент или фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и

- по меньшей мере одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, который включает (1) вариабельный домен, включающий гипервариабельные области CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13) и (2) константный сегмент или фрагмент легкой цепи иммуноглобулина человека.

В другом варианте связывающая молекула по изобретению характеризуется константой диссоциации K_D<1000 нМ.

В альтернативном варианте связывающей молекулы по изобретению константный сегмент или фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека представляет собой тип (γ4), а константный сегмент или фрагмент легкой цепи иммуноглобулина человека представляет собой тип (κ).

В другом варианте связывающая молекула по изобретению представляет собой моноклональные антитела человека или химерные или гуманизированные моноклональные антитела.

В еще одном варианте связывающая молекула по изобретению включает одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 4 (тяжелая цепь IgG1), SEQ ID NO: 5 (легкая цепь IgG1), SEQ ID NO: 24 (тяжелая цепь IgG4) и SEQ ID NO: 25 (легкая цепь IgG4).

Кроме того, в изобретении также предлагается изолированный полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую связывающую молекулу по изобретению.

В некоторых вариантах указанный изолированный полинуклеотид по изобретению включает:

- по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, или

- по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

В других предпочтительных вариантах указанный полинуклеотид по изобретению включает:

- полинуклеотидную последовательность, включающую SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, и

- полинуклеотидную последовательность, включающую SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

В еще одном предпочтительном варианте указанный полинуклеотид по изобретению включает:

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 и/или полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, или

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 26 и/или полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 28.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается вектор экспрессии, включающий полинуклеотид по изобретению, указанный выше.

Кроме того, в изобретении предлагается система экспрессии, включающая вектор экспрессии, указанный выше, причем указанная система экспрессии или часть ее способна продуцировать полипептид по изобретению, указанный выше, а указанная система экспрессии или часть ее присутствует в совместимой клетке хозяина.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается изолированная клетка хозяина, которая включает указанный выше вектор.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается изолированная композиция, содержащая связывающую молекулу по изобретению и носитель.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается изолированная композиция, содержащая полинуклеотид по изобретению и носитель.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается изолированная композиция, содержащая вектор экспрессии по изобретению или клетку хозяина по изобретению.

В изобретение также предлагается способ введения связывающей молекулы по изобретению субъекту, который нуждается в лечении, для лечения заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы.

В изобретении также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу по изобретению, полинуклеотид по изобретению, вектор экспрессии или систему экспрессии по изобретению, соответственно, или клетку хозяина по изобретению, в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. В одном из вариантов указанная фармацевтическая композиция является композицией с замедленным высвобождением.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ лечения заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы, заключающийся в том, что субъекту, который нуждается в таком лечении, вводят эффективное количество связывающей молекулы по изобретению, полинуклеотид по изобретению, вектор экспрессии или систему экспрессии по изобретению, соответственно, или клетку хозяина по изобретению. В предпочтительном варианте заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, включающей болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (БАС), патологическую деменцию Леви или другие виды деменции, заболевания после черепной, церебральной или спинномозговой травмы, инсульт и демиелинизирующее заболевание. В другом предпочтительным варианте демиелинизирующее заболевание выбирают из группы, включающей рассеянный склероз, монофазную демиелинизацию, энцефаломиелит, многоочаговую лейкодистрофию, панэнцефалит, болезнь Маркиафавы-Бигнами, демиелинизацию варолиева моста, адренолейкодистрофию, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спонгиозную дегенерацию, болезнь Александера, болезнь Канавана, метахроматическую лейкодистрофию и болезнь Краббе.

В другом варианте заболевание представляет собой дегенеративное глазное нарушение, которое может непосредственно или опосредованно включать дегенерацию клеток сетчатки или роговицы. В предпочтительном варианте дегенеративное глазное нарушение представляет собой заболевание, выбранное из группы, включающей ишемические ретинопатии, раннюю ишемическую глазную невропатию, глазной неврит, возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, кистозный отек желтого пятна (КОП), пигментозную дистрофию сетчатки, болезнь Штаргардта, желточную макулярную дистрофию (болезнь Беста), врожденный амавроз Лебера и другие виды наследственной дегенерации сетчатки, патологическую близорукость, ретролетальную фиброплазию и наследственную глазную невропатию Лебера, побочные действия после пересадки роговицы или хирургии хрусталика и герпетический кератит. В другом варианте заболевание представляет собой психиатрическое состояние. Предпочтительно указанное психиатрическое состояние выбирают группы, включающей шизофрению и депрессию.

В указанных выше способах лечения введение предпочтительно проводят интракраниально или интратекально.

Кроме того, в изобретении также предлагается способ получения связывающей молекулы по изобретению, который заключается в том, что проводят экспрессию полинуклеотида по изобретению в составе вектора экспрессии или в системе по изобретению с использованием технологии рекомбинантной ДНК или химического синтеза.

Кроме того, в изобретении предлагается способ введения фармацевтической композиции по изобретению местно в очаг повреждения.

Наконец, в изобретении предлагается способ введения одного или более следующих продуктов, выбранных из группы, включающей связывающую молекулу по изобретению, полинуклеотид по изобретению, вектор экспрессии или систему по изобретению, клетку хозяина по изобретению, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы.

В изобретении также предлагается способ получения связывающей молекулы по изобретению и полинуклеотида, вектора экспрессии молекулы с помощью технологии рекомбинантной ДНК или химического синтеза, кодирующего такую связывающую молекулу.

В настоящем изобретении также предлагается фармацевтическая композиция, включающая связывающую молекулу, полинуклеотид, вектор экспрессии или систему или клетку хозяина по настоящему изобретению в смеси по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Кроме того, предлагаются продукты, содержащие указанные связывающие молекулы, полинуклеотид, вектор экспрессии или систему или указанную клетку хозяина, или его фармакологически приемлемое производное, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ лечения заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы, заключающийся в том, что субъекту, который нуждается в таком лечении, вводят эффективное количество связывающей молекулы, полинуклеотида, вектора экспрессии или системы экспрессии или клетку хозяина.

В настоящем изобретении также приводятся примеры того, что фармакологические композиции и продукты можно использовать для замедленного высвобождения связывающих молекул и/или для местного депонирования связывающей молекулы в очаге поражения.

Краткое описание фигур

Фиг.1

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO 7) и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO 5) вариабельных областей легкой цепи антител 6A3-IgG1. Неподчернутый сегмент соответствует лидерному пептиду (SED ID NO 22) и кодирующей его нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO 23).

Фиг.2

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO 6) и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO 4) вариабельных областей тяжелой цепи антител 6A3-IgG1. Неподчернутый сегмент соответствует пептиду (SED ID NO 20) и кодирующей его нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO 21).

Фиг.3

Кодирующие области легкой (SEQ ID NO 28, выше) и тяжелой (SEQ ID NO 26, ниже) вариабельного сегмента 6A3-Ig4.

Фиг.4

Аминокислотные последовательности тяжелой (SEQ ID NO 24, ниже и легкой (SEQ ID NO 25, выше) цепи вариабельного и константного сегмента 6A3-Ig4. Лидерный пептид легкой (SEQ ID NO 31) и тяжелая (SEQ ID NO 30) цепи показан курсивом.

Фиг.5

Верхний ряд: аминокислотная последовательность легкой цепи антител 6A3-IgG1 (SEQ ID NO 5), включающая последовательности лидерного пептида (SEQ ID NO 22) и CDR-L1 (SEQ ID NO 11), CDR-L2 (SEQ ID NO 12) и CDR-L3 (SEQ ID NO 13).

Нижний ряд: аминокислотная последовательность тяжелой цепи антител 6A3-IgG1 (SEQ ID NO 4), включающая последовательности лидерного пептида (SEQ ID NO 20) и CDR-H1 (SEQ ID NO 8), CDR-H2 (SEQ ID NO 9) и CDR-H2 (SEQ ID NO 10).

Фиг.6

ОТ-ПЦР с использованием в качестве матрицы РНК клеток MO3.13 и специфичных праймеров Nogo-A, в результате которой получают определенный фрагмент ДНК, включающий приблизительно 200 по.

Фиг.7

Детектирование иммуноблота иммунопреицпитированного белка Nogo-A из липидной фракции клеток М03:13 с использованием антител 6А3.

После иммунопреципитации (ИП) лизатов клеток MO3.13 и иммунодетектирования антителами 6А3, специфичными в отношении Nogo-A, проявляется одна интенсивная полоса в ожидаемой области ММ (190 кДа) при проявлении антителами 6A3-IgG4 (трек 4) и антителами 11C7-IgG1 (трек 6).

Фиг.8

Fig 8a: Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток М03.13.

Fig 8б: Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток HOG.

Иммунофлуоресцентное окрашивание проницаемых клеток MO3.13 и HOG при обработке 6A3-IgG4 и меченых красителем Alexa-Fluor 488 вторичных антител, специфичных к антителам человека, приводит к интенсивному окрашиванию клеток (Фиг.8a и 8b, слева), в то время как при обработке только вторичными антителами окрашивание фактически отсутствует (справа).

Фиг.9

Концентрации в сыворотке антител 6А3, измеренная у 6 субъектов через 2 месяца.

Фиг.10

Концентрации в СМЖ антител 6А3, измеренная у 6 субъектов через 2 месяца.

Фиг.11

Лечение антителами 6А3 повреждения спинного мозга на модели обезьян улучшает скорость и степень функционального восстановления независимо от размеров повреждения.

Подробное описание изобретения

При разработке новых и улучшенных способов усиления регенерации нейронов после травмы в центральной нервной системе (ЦНС) взрослых в настоящее время неожиданно было установлено, что новые моноклональные антитела человека (6А3), которые продуцируются в HuMab-мышах™ (генетически созданные мыши, в которых гены мышиных иммуноглобулинов заменены на гены иммуноглобулинов человека, фирма Medarex Inc.), обладают высокой эффективностью при модулировании активности Nogo-A в экспериментах in vitro и in vivo. Антитела 6А3, которые вырабатываются против NiG человека, являются изотипом IgG и обладают более предпочтительными свойствами по сравнению с антителами, специфичными в отношении Nogo-A, описанными в области техники. Таким образом, появляется возможность конструирования альтернативных молекул, связывающихся с Nogo-A, содержащих гипервариабельные области, аналогичные указанным антителам 6А3, т.е. создания новых антител, обладающих предпочтительными свойствами антител 6А3. Производные антитела 6A3-Ab, 6A3-IgG4 и 6А3-Fab распознают NiG человека с высокой аффинностью 0,14 нМ и 1,1 нМ, соответственно. Кроме того, антитела по настоящему изобретению обладают высокой стабильностью и продолжительным периодом полураспада и удерживанием in vitro и in vivo. Наконец, связывающие молекулы и антитела по изобретению характеризуются замедленным высвобождением из участка введения, что обеспечивает местное отложение связывающей молекулы в очаге повреждения. При непрерывном вливании в спинномозговой жидкости (СМЖ) поврежденного спинного мозга животных и пациентов наблюдаются высокие концентрации антител 6А3. Указанное неожиданно высокое удерживание антител 6A3-Ab и время пребывания в спинномозговой жидкости (СМЖ) позволяет использовать струйные инъекции (например, 1-3 раза в неделю, даже целесообразно с более продолжительными интервалами один раз в 2, 3 или 4 недели) вместо непрерывного вливания антител в спинномозговую жидкость. Можно также использовать повторные интратекальные струйные инъекции. В предпочтительном варианте введение проводят интратекально, например, с использованием соответствующего катетера, связанного с портативным насосом. В другом предпочтительном варианте используют интратекальную струйную инъекцию. Преимущества связывающих молекул по изобретению также описаны в разделе Примеры.

Соответственно, в изобретении предлагаются связывающие молекулы, специфичные в отношении Nogo-A или NiG (далее по тексту "связывающие молекулы по изобретению" или просто "связывающие молекулы"). Предпочтительно связывающие молекулы по изобретению связываются с белком Nogo-A человека (SEQ ID NO: 2, кодируемая последовательностью SEQ ID NO: 1) или с белком NiG человека (который является фрагментом Nogo-A (аминокислоты 186-1004 Nogo-A человека, SEQ ID NO: 3), наиболее эффективно подавляющим разрастание невритов, при этом константа диссоциации K_D составляет <1000 нМ, или K_D составляет до и включительно 100 нМ, более предпочтительно <100 нМ, или K_D составляет до и включительно 100 нМ, наиболее предпочтительно <10 нМ, или K_D составляет до и включительно 10 нМ. Реакцию связывания детектируют стандартными методами (включающими качественные и количественные методы анализа), включающими, например, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и определение аффинности на биосенсоре (см. пример 4). Кроме того, связывание связывающих молекул по изобретению с Nogo-A человека и NiG человека и эффективность указанных связывающих молекул при функциональном анализе можно оценивать при анализе разрастания невритов, например, как описано ниже.

Таким образом, в другом предпочтительном варианте связывающая молекула по настоящему изобретению (в концентрации 100 мкг/мл, предпочтительно 10 мкг/мл, более предпочтительно 1,0 мкг/мл и наиболее предпочтительно 0,1 мкг/мл) повышают число невритов мозжечковых тучных клеток крысы на субстрате в виде белкового экстракта мозга обезьяны по меньшей мере на 20%, предпочтительно на 50%, наиболее предпочтительно на 80%, по сравнению с числом невритов мозжечковых тучных клеток крысы, обработанных контрольными антителами, которые не связываются с полипептидом Nogo-A человека или с полипептидом NiG человека (т.е. которые характеризуются константой диссоциации >1000 нМ).

В другом варианте изобретение относится к изолированной молекуле, включающей по меньшей мере один антиген-связывающий участок, который специфично связывается с полипептидом Nogo-A человека (SEQ ID NO: 2) или с полипептидом NiG человека (SEQ ID NO: 3), причем указанный антиген-связывающий участок включает:

- по меньшей мере одну из гипервариабельных областей CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), соответственно, и

- по меньшей мере одну из гипервариабельных областей CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-L1-6А3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) and CDR-L3-6А3 (SEQ ID NO: 13), соответственно.

Специфичное распознавание Nogo-А или NiG человека обеспечивается благодаря присутствию в составе связывающей молекулы по настоящему изобретению CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. Тем не менее для специалиста представляется очевидным, что присутствие в составе связывающей молекулы только одного CDR-домена может оказаться достаточным для специфичного связывания с распознаваемой молекулой. Положение "по меньшей мере одна из гипервариабельных областей" обозначает 1 или 2 или 3 гипервариабельные области. Положение "идентичность по меньшей мере на 90%" обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. Идентичность (в %) двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием компьютерной программы, которая анализирует относительную идентичность двух или более аминокислотных последовательностей, например, программы Basic Local Aliggnment Search Tool (BLAST, см. web site Национального института здоровья, Altschul и др., Nature Genetics, 6, 119-129 (1994), Altschul и др., J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990), Altschul и др., Nucleic Acids Research, 25, 1389-1402 (1997), Karlin и Altschul, PNAS, 87, 2264-2268 (1990), Karlin и Altschul, PNAS, 90, 5873-5868 (1993)).

Настоящее изобретение относится к изолированной молекуле, включающей по меньшей мере один антиген-связывающий участок, который специфично связывается с полипептидом Nogo-A человека (SEQ ID NO: 2) или с полипептидом NiG человека (SEQ ID NO: 3) с константой диссоциации <1000 нМ, причем указанный антиген-связывающий участок включает:

- по меньшей мере гипервариабельные области CDR-H1, CDR-H2, и CDR-H3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) and CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), соответственно, и

- по меньшей мере гипервариабельные области CDR-L1, CDR-L2, и CDR-L3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-L1-6А3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6А3 (SEQ ID NO: 13), соответственно.

Положение "антиген-связывающий участок, включающий гипервариабельные области" относится к антиген-связывающему участку, в котором гипервариабельные области не являются смежными (не располагаются близко друг к другу). Предпочтительно указанные области в составе антител чередуются с каркасными участками антител, или с последовательностями, которые не являются каркасными участками антител, предпочтительно с каркасными участками антител.

Согласно настоящему изобретению связывающая молекула может также включать по меньшей мере один антиген-связывающий участок, причем указанный антиген-связывающий участок включает:

- гипервариабельные области CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6А3 (SEQ ID NO: 10), или

- гипервариабельные области CDR-L1-6А3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6А3 (SEQ ID NO: 13), или

- их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Положение "идентичность по меньшей мере на 90%" обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

Согласно настоящему изобретению связывающая молекула также включает:

- первый антиген-связывающий участок, содержащий гипервариабельные области CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), и

- второй антиген-связывающий участок, содержащий гипервариабельные области CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13), или

- их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Идентичность по меньшей мере на 90% обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

Согласно настоящему изобретению связывающая молекула также включает:

- по меньшей мере одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, которая включает (1) вариабельный домен, включающий гипервариабельные области CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10) и (2) константный сегмент или его фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и

- по меньшей мере одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, который включает (1) вариабельный домен, включающий гипервариабельные области CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13) и (2) константный сегмент или его фрагмент легкой цепи иммуноглобулина человека, или

- их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Идентичность по меньшей мере на 90% обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

В связывающей молекуле по настоящему изобретению константный сегмент (или его фрагмент) тяжелой цепи иммуноглобулина человека может соответствовать типу (γ), предпочтительно типу (γ4), а константный сегмент (или его фрагмент) легкой цепи иммуноглобулина человека может соответствовать типу (λ) или предпочтительно типу (κ). Кроме того, связывающая молекула согласно настоящему изобретению может представлять собой моноклональные антитела человека, частично моноклональные антитела человека или химерные или гуманизированные моноклональные антитела.

Согласно настоящему изобретению связывающая молекула может включать одну или более полипептидных последовательностей, таких как SEQ ID NO: 4 (тяжелая цепь IgG1), SEQ ID NO: 5 (легкая цепь IgG1), SEQ ID NO: 24 (тяжелая цепь IgG4) и SEQ ID NO: 25 (легкая цепь IgG4).

В другом предпочтительном варианте связывающая молекула по настоящему изобретению включает по меньшей мере один антиген-связывающий участок, причем указанный антиген-связывающий участок включает гипервариабельные области CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 и CDR-H3-6А3, где CDR-H1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, CDR-H2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, a CDR-H3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Идентичность по меньшей мере на 90% обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

В другом варианте изобретения связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере:

а) первый домен, включающий гипервариабельные области CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 и CDR-H3-6A3, где CDR-H1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, CDR-H2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, а CDR-H3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и

б) второй домен, включающий гипервариабельные области CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 и CDR-L3-6A3, где CDR-L1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, CDR-L2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, а CDR-L3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, или

в) их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Идентичность по меньшей мере на 90% обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

Кроме того в изобретении также предлагается следующее связывающая молекула по изобретению, которая включает по меньшей мере один антиген-связывающий участок, содержащий:

а) вариабельную область тяжелой цепи антител 6А3 (SEQ ID NO: 4), или

б) вариабельную область легкой цепи антител 6А3 (SEQ ID NO: 5), или их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей.

Если антиген-связывающий участок включает первый и второй домены, то такие домены могут содержаться в составе одного полипептида или предпочтительно каждый домен может содержаться в отдельной цепи, т.е. первый домен является частью тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента, а второй домен является частью легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента.

Примеры связывающих молекул по изобретению включают антитела, такие как антитела, продуцируемые В-клетками или гибридомами, и антитела человека или химерные или гуманизированные антитела или их любые фрагменты, например, F(ab')2, и Fab фрагменты, а также одноцепные или монодоменные антитела, описанные в US 20070065440 A1.

"Монодоменные антитела" представляют собой вариабельный домен, который специфично связывается с эпитопом или антигеном или лигандом независимо от другого вариабельного домена, который связывается с указанным эпитопом, антигеном или лигандом. Монодоменные антитела могут присутствовать в виде гомо- или гетеромультимера вместе с другими VH или VL доменами, причем другие домены не являются необходимыми для связывания антигена с монодоменными антителами, т.е., монодоменные антитела связываются с антигеном независимо от дополнительных VH или VL доменов. В предпочтительном варианте монодоменные антитела включают отдельный VH домен или отдельный VL домен. Способы получения монодоменных антител, обладающих по меньшей мере некоторой специфичностью связывания, характерной для исходных интактных антител, известны в данной области техники. Например, в статье Ward и др. ("Binding Activities of a Repertoire of Single immunoglobulin Variable Domens Secreted from Escherichia coli", Nature, 341, 644-646) описан способ тестирования с целью получения вариабельной области тяжелой цепи антител (VH домена), обладающей достаточно высокой аффинностью в отношении эпитопа-мишени при связывании с эпитопом в изолированной форме.

Одноцепочечные антитела состоят из вариабельных доменов/областей тяжелой и легкой цепей антител, ковалентно связанных пептидным линкером, обычно содержащим от 10 до 30 аминокислот, предпочтительно от 15 до 25 аминокислот. Предпочтительные способы включают применение полипептидных линкеров, описанных, например, в связи с оцFv (Bird и др., Science, 242, 423-426 (1988)). Следовательно, такая структура не включает константный сегмент тяжелой и легкой цепей, и предполагается, что небольшой пептидный спейсер должен быть менее антигенным, чем полный константный сегмент. Термин "химерные антитела" обозначает антитела, в которых константные области тяжелой или легкой цепей антител или оба фрагмента получены из одного вида животного, а вариабельные области тяжелой и легкой цепей получены из другого вида животного. Предпочтительно "химерные антитела" представляют собой такие антитела, в которых константные области тяжелой и легкой цепей или оба фрагмента соответствуют иммуноглобулину человека, а вариабельные домены тяжелой и легкой цепей получены от другого вида (например, мыши, обезьяны, крысы, свиньи, цыпленка, птиц). Термин "гуманизированные антитела" обозначает антитела, в которых гипервариабельные области (CDR) получены от животных (например, мыши), а все или практически все остальные фрагменты молекулы иммуноглобулина, например, константные области и высококонсервативные участки вариабельных доменов, т.е. каркасные участки, соответствуют иммуноглобулину человека. Однако гуманизированные антитела могут содержать в сегментах каркасных участков, смежных гипервариабельными областями, несколько аминокислотных остатков из иммуноглобулина мыши.

Гипервариабельные области можно гибридизовать с каркасными участками иммуноглобулина любого вида, предпочтительно мыши или человека. Пригодные каркасные участки описаны в публикации "Sequences of Proteins of immunological interest", Kabat E.A. и др., US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health. Предпочтительно константный сегмент тяжелой цепи (иммуноглобулина человека) связывающей молекулы может представлять собой тип IgG, более предпочтительно тип IgG4, включая подтипы, предпочтительно константный сегмент легкой цепи (иммуноглобулина человека) обозначает тип (λ) или (κ), более предпочтительно тип (κ).

Моноклональные антитела, специфичные в отношении природного белка, присутствующего в организме человека, можно получать в системе любого животного, например, мыши. В результате ксеногенные антитела, полученные с использованием гибридом, при введении человеку вызывают нежелательный иммунный ответ, который преимущественно опосредуется константным сегментом ксеногенного иммуноглобулина. Это обстоятельство несомненно ограничивает применение таких антител, поскольку их нельзя вводить в течение продолжительного времени. Следовательно, прежде всего предпочтительно использовать одноцепочечные, монодоменные, химерные или гуманизированные антитела, которые вероятно не вызывают существенного аллогенного ответа при введении человеку.

В связи с вышеизложенным, связывающую молекулу по изобретению также выбирают из химерных антител, которые включают по меньшей мере:

а) одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, которая включает (1) вариабельный домен, содержащий гипервариабельные области CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 и CDR-H3-6A3 и (2) константный сегмент или его фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека, где CDR-H1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 9), а CDR-H3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 10), и

б) одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, которая включает (1) вариабельный домен, содержащий гипервариабельные области CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 и CDR-L3-6A3 и (2) константный сегмент легкой цепи иммуноглобулина человека или его фрагмент, где CDR-L1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 12), а CDR-L3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 13), или

их прямые эквиваленты, которые включают области, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей.

В другом варианте связывающую молекулу по изобретению выбирают из одноцепочечной связывающей молекулы, которая включает антиген-связывающий участок, содержащий:

а) первый домен, включающий гипервариабельные области CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 и CDR-H3-6A3, где CDR-H1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, CDR-H2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, а CDR-H3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и

б) второй домен, включающий гипервариабельные области CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 и CDR-L3-6A3, где CDR-L1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, CDR-L2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, а CDR-L3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, и

в) пептидный линкер, который присоединен к N-концевому фрагменту первого домена и к С-концевому фрагменту второго домена или к С-концевому фрагменту первого домена и к N-концевому фрагменту второго домена,

или их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей.

Как известно, незначительные изменения в аминокислотной последовательности, такие как удаление, добавление или замена одной или нескольких аминокислот может привести к образованию аллельной формы исходного белка, которая обладает практически идентичными свойствами. Таким образом, термин "их прямые эквиваленты" обозначает любую гипервариабельную область, любой антиген-связывающий участок, любую цепь антител или ее фрагмент или любой отдельный домен связывающей молекулы по изобретению (соединения 6А3),

(1) в котором каждая из гипервариабельных областей CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 связывающих молекул по меньшей мере на 90% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентична эквивалентным гипервариабельным областям CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), где CDR-H1 является эквивалентом CDR-H1-6А3, CDR-H2 является эквивалентом CDR-H2-6A3, CDR-H3 является эквивалентом CDR-H3-6A3, и

(2) которое способно связываться с Nogo-A человека или NiG человека, предпочтительно с константой диссоциации (K_D)<1000 нМ, более предпочтительно с K_D<100 нМ, наиболее предпочтительно с K_D<10 нМ, или

любая связывающая молекула по изобретению, содержащая по меньшей мере один, предпочтительно два домена в участке связывания (соединение 6А3),

(3) в котором каждая из гипервариабельных областей CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 по меньшей мере на 90% идентична, более предпочтительно по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентична эквивалентным гипервариабельным областям CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9), CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13), где CDR-H1 является эквивалентом CDR-H1-6А3, CDR-H2 является эквивалентом CDR-H2-6A3, CDR-H3 является эквивалентом CDR-H3-6A3, CDR-L1 является эквивалентом CDR-L1-6A3, CDR-L2 является эквивалентом CDR-L2-6A3, CDR-L3 является эквивалентом CDR-L3-6A3, и

(4) которое способно связываться с Nogo-A человека или NiG человека, предпочтительно с константой диссоциации (K_D)<1000 нМ, более предпочтительно с K_D<100 нМ, наиболее предпочтительно с K_D<10 нМ.

Таким образом, другим вариантом изобретения является, например, связывающая молекула, которая способна связываться с Nogo-A человека или NiG человека с константой диссоциации (K_D)<1000 нМ, и которая включает по меньшей мере один антиген-связывающий участок, содержащий:

- гипервариабельные области CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, причем каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентична гипервариабельным областям CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), соответственно, и/или

- гипервариабельные области CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, причем каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентична о гипервариабельным областям CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13), соответственно.

Кроме того, связывающая молекула, описанная в тексте заявки, способна связываться с Nogo-A человека или NiG человека с константой диссоциации (K_D)<1000 нМ, и которая включает:

- первый антиген-связывающий участок, содержащий гипервариабельные области CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, причем каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентична гипервариабельным областям CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), соответственно, и

- второй антиген-связывающий участок, содержащий гипервариабельные области CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, причем каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентична гипервариабельным областям CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13), соответственно.

Указанную константу диссоциации определяют с использованием различных способов анализа, включающих, например, определение аффинности с использованием биосенсора (BIAcore, см. выше). Кроме того, связывание и функциональное воздействие связывающих молекул можно продемонстрировать при биоанализе, например, описанном ниже.

Константный сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека относится к иммуноглобулину типа γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, δ или ε, предпочтительно типа γ, более предпочтительно типа γ4, а константный сегмент легкой цепи относится к иммуноглобулину типа λ или κ (которые включают подтипы λ1, λ2, λ3 и λ4), предпочтительно типа κ. Аминокислотные последовательности всех указанных константных сегментов приводятся в публикации Kabat и др. (выше).

В объем изобретения также включены конъюгаты связывающих молекул по изобретению, например, конъюгаты с ферментом или токсином или радиоизотопом. В другом варианте композицию, содержащую молекулу, связывающую Nogo-A или NiG, стабилизируют in vivo за счет связывания или ассоциации с (не-полипептидными) полимерами, например, за счет гликозилирования в условиях in vitro или in vivo. Примеры подобного способа стабилизации описаны, например, в заявках WO 99/64460 (Chapman и др.) и ЕР1,160255 (King и др.), каждая из которых включена в описание в качестве ссылки. Например, в указанных публикациях описано применение синтетических или природных полимеров, таких как полиалкилен, полиалкинилены, полиоксиалкилены или полисахариды, для повышения периода полураспада полипептидов иммуноглобулина in vivo. Типичным примером стабилизирующего полимера является полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полиалкилен. Способ связывания ПЭГ с полипептидом описан в указанных публикациях и обозначается термином "ПЭГилирование". Молекулу, связывающую Nogo-A или NiG, ПЭГилируют произвольно, например, ПЭГ присоединяют к остатку лизина или другой аминокислоты, экспонированной на поверхности полипептидной глобулы, или адресным образом, например, за счет присоединения ПЭГ к введенному в полипептид остатку цистеина на поверхности глобулы. В зависимости от свойств молекулы, связывающей Nogo-А или NiG, предпочтительно использовать адресный способ конденсации полимера с полипептидом, поскольку произвольное присоединение к антиген-связывающему участку или рядом с ним часто оказывает влияние на аффинность или специфичность полипептида в отношении антигена-мишени.

Предпочтительно, связывание с ПЭГ или другим полимером не должно оказывать влияния на антиген-связывающую аффинность или специфичность антител. Положение "не оказывает влияния на антиген-связывающую аффинность или специфичность" обозначает тот факт, что ПЭГ-полипептид, связывающий Nogo-A или NiG, характеризуется величиной IC₅₀ или ND₅₀, которая на <10% превышает IC₅₀ или ND₅₀, соответственно, не-ПЭГилированных молекул, связывающихся с Nogo-A или NiG, содержащих аналогичный вариабельный домен. В другом варианте положение "не оказывает влияния на антиген-связывающую аффинность или специфичность" обозначает тот факт, что ПЭГилированная форма молекулы, связывающейся с Nogo-A или NiG, сохраняет по меньшей мере 90% антиген-связывающей активности исходного полипептида.

ПЭГ или другой полимер, который можно использовать для повышения периода полураспада in vivo обычно характеризуется мол. массой приблизительно от 5000 до 50000 Да, например, приблизительно 5000 Да - 10000 Да, 5000 Да - 15000 Да, 5000 Да - 20000 Да, 5000-25000 Да, 5000-30000 Да, 5000 Да - 35000 Да, 5000 Да - 40000 Да, или приблизительно 5000 Да - 45000 Да. Выбор мол. массы полимера зависит от предполагаемого применения комплекса. Например, если необходимо, чтобы комплекс проникал в плотную ткань, например, в опухоль, предпочтительно следует использовать низкомолекулярный полимер или с мол. массой приблизительно 5000 Да. Если необходимо сохранять комплекс в кровотоке, можно использовать полимеры с мол. массой, например, от 25000 Да до 40000 Да или более.

Фармацевтические композиции по изобретению включают "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" молекулы, связывающейся с Nogo-A или Nig, по изобретению. Термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество, эффективное, в указанной дозе и в течение требуемого периода времени, для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество молекулы, связывающейся с Nogo-A или Nig, по изобретению может варьировать в зависимости от ряда факторов, таких как тяжесть заболевания, возраст, пол и масса тела пациента, и аффинность молекулы, связывающейся с Nogo-A или Nig, по изобретению, для достижения требуемой ответной реакции в организме пациента. Терапевтически эффективное количество также является таким, при котором терапевтически благоприятное действие молекулы по изобретению, связывающейся с Nogo-A или Nig, перевешивает любое токсичное или побочное действие. Термин "профилактически эффективное количество" обозначает количество, эффективное, в указанной дозе и в течение требуемого периода времени, для достижения требуемого профилактического результата.

Положение "специфично связывается", используемый в описании заявки, обозначает связывание молекулы по изобретению, связывающейся с Nogo-A или Nig, с антигеном с константой диссоциации (K_d) 1 мкМ или менее по данным измерения методом поверхностного плазменного резонанса с использованием, например, системы BIAcore(r) и оценки кинетики реакции по программе BIAcore(r).

Если не указано иное, термин "полипептид" обозначает любой пептид или белок, включающий аминокислоты, связанные пептидными связями, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, которая начинается с N-концевого фрагмента и заканчивается С-концевым фрагментом. Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению представляет собой моноклональные антитела, более предпочтительно химерные (называемыми также V-привитыми) или гуманизированные (называемыми также CDR-привитые) моноклональные антитела. Гуманизированные (CDR-привитые) моноклональные антитела могут включать или не включать дополнительные мутации в каркасных участках (FR) акцепторных антител.

Функциональное производное полипептида, описанное в тексте заявки, включает молекулу, обладающую биологической активностью, характерной для полипептида по настоящему изобретению, т.е. обладающее способностью связываться с Nogo-A или NiG человека. Функциональное производное включает фрагменты и аналоги полипептида по настоящему изобретению. Фрагменты включают области в составе аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, например, специфичную последовательность. Термин "производное" используется для обозначения аминокислотной последовательности вариантов и ковалентных модификаций полипептида по настоящему изобретению, например, специфичной аминокислотной последовательности. Функциональные производные полипептида по настоящему изобретению, например, конкретная последовательность, например, гипервариабельная область легкой и тяжелой цепи, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентична аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, например, конкретной последовательности, и практически сохраняет способность связываться с Nogo-A или NiG человека.

Термин "вариабельный домен", используемый в описании заявки, обозначает полипептид, характеризующийся последовательностью, полученной из V области иммуноглобулина зародышевой линии клеток млекопитающих. Последовательность "полученная из V области иммуноглобулина зародышевой линии клеток млекопитающих" обозначает последовательность, выделенную из иммуноглобулина человека, выделенную из другого животного, такого как грызуны, например мыши, причем в ответ на иммуноген организм животного вырабатываются иммуноглобулины человека, более предпочтительно в организме животного не вырабатываются эндогенные антитела, выделенную из библиотеки клонированных последовательностей гена антител человека (или библиотеки последовательностей V области антител человека), или клонированную последовательность V области антител зародышевой линии клеток человека используют для получения одной или более разнообразных последовательностей (за счет произвольного или направленного мутагенеза), которые затем отбирают по связыванию с требуемым антигеном-мишенью. Как минимум в вариабельном домене иммуноглобулина человека по меньшей мере 85% (например, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% или более) аминокислотной последовательности идентична последовательности вариабельного домена природного иммуноглобулина человека.

В другом или дополнительном варианте "вариабельный домен" представляет собой вариабельный домен иммуноглобулина, который включает четыре каркасных участка (FW1-FW4) вариабельного домена иммуноглобулина, предпочтительно иммуноглобулина человека (нумерация каркасных участков указана, как описано в статье Kabat и др. (1991)). Термин "каркасные участки вариабельного домена" обозначает а) аминокислотную последовательность каркасного участка, предпочтительно человека, и б) каркасный участок, содержащий по меньшей мере непрерывную последовательность из 8 аминокислотных остатков каркасного участка иммуноглобулина человека. Вариабельный домен антител может включать аминокислотные последовательности FW1-FW4, которые аналогичны аминокислотным последовательностям соответствующих каркасных участков, кодируемых сегментом гена антител зародышевой линии клеток, предпочтительно человека, или может также включать вариабельный домен, в котором все последовательности FW1-FW4 содержат до 10 различий в аминокислотной последовательности (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различий в аминокислотной последовательности) по сравнению с аминокислотными последовательностями соответствующих каркасных участков, кодируемых сегментом гена антител зародышевой линии клеток, предпочтительно человека.

Термин "универсальный каркасный участок", используемый в описании заявки, обозначает последовательность каркасного участка антител, соответствующую консервативным последовательностям, описанным в статье Kabat и др. (1991), или соответствующую мотиву иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека или структуре, описанной в статье Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196, 910-917 (1987). В изобретении предлагается применение отдельного каркасного участка, или набора таких каркасных участков, которые, как установлено, позволяют модифицировать практически любую специфичность связывания за счет изменения только в гипервариабельных областях. В одном варианте гипервариабельные области или CDR специфично связываются с Nogo-A и/или NiG.

Термин "ковалентная модификация" относится к модификациям полипептида по настоящему изобретению, например, конкретной последовательности, или его фрагмента, за счет взаимодействия с соответствующим агентом, за счет гибридизации с гетерологичным полипептидом или за счет пост-трансляционных модификаций. Ковалентно модифицированные полипептиды, например, с конкретной последовательностью, все еще обладают способностью связываться с Nogo-A или NiG человека при перекрестном связывании. Ковалентные модификации обычно проводят за счет взаимодействия определенных аминокислотных остатков с соответствующим агентом, который способен реагировать с конкретными аминокислотами или концевыми аминокислотными остатками, или за счет пост-трансляционной модификации в рекомбинантных клетках хозяина. Некоторые пост-трансляционные модификации являются результатом воздействия рекомбинантных клеток хозяина на экспрессированный полипептид. Остатки глутамина и аспарагина часто подвергаются деамидированию с образованием остатков глутаминовой и аспарагиновой кислоты, соответственно. В другом варианте указанные остатки деамидируются в слабокислотной среде. Другие пост-трансляционные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серина, тирозина или треонина, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина, см., например, монографию Т.Е.Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, c.c.79-86 (1983). Ковалентные модификации включают гибридные белки, содержащие полипептид по настоящему изобретению, например, конкретную последовательность и ее варианты, такие как иммуноадгезины, и N-концевые гибриды с гетерологичными сигнальными последовательностями.

Термин "идентичность" в связи с исходным полипептидом и его производным используется в описании заявки для указания доли аминокислотных остатков (в %) в производном полипептида, которые идентичны остаткам в соответствующем исходном полипептиде после формирования последовательностей и введения делеций (при необходимости) для достижения максимальной идентичности двух структур, и не относится к любым консервативным заменам. Подразумевается, что N- или С-концевые дополнения или вставки не понижают уровень идентичности. Способы и программы сопоставления структур известны в данной области, см. Altschul и др. (выше).

Термин "аминокислота (аминокислоты)" относится ко всем природным L-α-аминокислотам, например, и включает D-аминокислоты. Аминокислоты обозначают с использованием известного однобуквенного кода или трехбуквенного кода (три первые буквы в названии аминокислоты).

Термин "аминокислотная последовательность варианта" относится к соединениям, которые частично отличаются по аминокислотной последовательности от полипептида по настоящему изобретению, например, конкретной структуры. Варианты полипептида по настоящему изобретению, например, конкретной структуры, могут связываться с Nogo-A или NiG человека. Варианты, содержащие замены, обозначают модифицированные полипептиды по настоящему изобретению, например, обладающие конкретной структурой, в которых по меньшей мере одна аминокислота удалена и в то же положение введена другая аминокислота. Указанные замены являются единичными, когда заменяют только одну кислоту, или многократными, когда в той же структуре заменяют две или более аминокислоты. Варианты, содержащие вставки, обозначают модифицированные полипептиды по настоящему изобретению, например, обладающие конкретной последовательностью, в которых одна или более аминокислот введены вблизи конкретной аминокислоты. Непосредственно вблизи конкретной аминокислоты обозначает прямую связь с α-карбокси- или α-аминогруппой конкретной аминокислоты. Варианты, содержащие делеции, обозначают модифицированные полипептиды по настоящему изобретению, например, обладающие конкретной структурой, в которых удалены одна или более аминокислот. Обычно в таких вариантах удаляют одну или две аминокислоты в конкретной области полипептида.

Связывающую молекулу по изобретению можно получать методами рекомбинантной ДНК. В общем случае, молекулы нуклеиновой кислоты и векторные конструкты, необходимые для продуцирования по настоящему изобретению конструируют и обрабатывают по методикам, описанным в лабораторных руководствах, таких как Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1989). В связи с изложенным одну иди более молекул ДНК, кодирующей связывающую молекулу, конструируют, вводят соответствующие контрольные последовательности и переносят для экспрессии в пригодный организм хозяина.

В самом общем виде, в изобретении предлагаются:

(1) ДНК, кодирующие гипервариабельную область, антиген-связывающий участок, цепь антител или ее фрагмент, или отдельный домен связывающей молекулы по настоящему изобретению, и

(2) применение ряда ДНК по изобретению для получения связывающей молекулы по настоящему изобретению методами рекомбинантной ДНК.

Согласно настоящему состоянию уровня техники специалист в данной области может синтезировать ряд ДНК по изобретению с использованием информации, приведенной в описании изобретения, т.е. аминокислотных последовательностей гипервариабельных областей и последовательностей ДНК, кодирующих такие полипептиды. Способ конструирования гена вариабельного домена, например, описан в ЕР 239400, и в кратком виде включает следующие стадии: клонируют ген, кодирующий вариабельный домен моноклональных антител любой специфичности. Определяют сегменты ДНК, кодирующие каркасные участки и гипервариабельные области, удаляют сегменты ДНК, кодирующие гипервариабельные области, а сегменты ДНК, кодирующие каркасные участки, гибридизуют с пригодными сайтами рестрикции по местам контактов. Сайты рестрикции получают в соответствующих положениях мутагенезом ДНК по стандартным методикам. Двухцепочечные синтетические кассеты CDR получают синтезом ДНК, соответствующих последовательностям указанных выше CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3, CDR-H3-6A3, CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 и CDR-L3-6A3. Указанные кассеты содержат липкие концы, благодаря чему их можно лигировать по местам контактов с каркасным участком по стандартным протоколам с образованием ДНК, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина.

Кроме того, для получения конструкта ДНК, кодирующей моноклональные антитела по изобретению, необязательно располагать мРНК из линии гибридомных клеток. Таким образом, в WO 90/07861 приводятся подобные инструкции для получения моноклональных антител методами рекомбинантной ДНК, располагая лишь информацией по нуклеотидной последовательности гена.

Метод включает синтез ряда олигонуклеотидов, их амплификацию методом ПЦР и их сплайсинг с образованием требуемой последовательности ДНК.

Известно множество векторов, включающих бактериальные плазмиды, бактериофаги, искусственные хромосомы и эписомальные векторы. Известны векторы экспрессии, включающие один или более пригодных промоторов и/или генов, кодирующих тяжелую и легкую цепь константных областей. Векторы экспрессии обычно содержат промотор, который распознается организмом хозяина и оперативно связан с кодирующей последовательностью. Такой промотор является индуцибельным или конститутивным. Термин "оперативно связанный" относится к такому порядку связывания указанных выше компонентов, который обеспечивает их нормальное функционирование. Контрольную последовательность, "оперативно связанную" с кодирующей последовательностью, лигируют таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности происходит в условиях, приемлемых для контрольных последовательностей. Таким образом, полученную ДНК по изобретению можно легко перенести в соответствующий вектор экспрессии.

ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела, можно также получать стандартными методами, например, описанными в WO 88/1649.

В конкретном варианте изобретения рекомбинант предназначенный для получения некоторых связывающих молекул по изобретению, включает первый и второй конструкты ДНК, описанные ниже.

Первый нуклеотид может включать

- по меньшей мере одну из полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, или

- по меньшей мере одну из полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

Другой полинуклеотид по изобретению включает

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, и

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

В другом варианте полинуклеотид включает

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 и/или полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, или

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 26 и/или полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 28.

В еще одном варианте конструкт ДНК кодирует тяжелую цепь или ее фрагмент и включает

а) первый сегмент, который кодирует вариабельный домен, включающий поочередно каркасный участок и гипервариабельные области, причем указанные гипервариабельные области включают ДНК-CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 14), ДНК-CDR-Н2-6А3 (SEQ ID NO: 15) и ДНК-CDR-Н3-6А3 (SEQ ID NO: 16), при этом указанный первый сегмент начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и

б) второй сегмент, кодирующий константную область тяжелой цепи и или ее фрагмент, который начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной области тяжелой цепи, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной области тяжелой цепи или ее фрагмента, после которого следует нонсенс-кодон.

Предпочтительно второй сегмент кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, более предпочтительно константную область γ4 цепи. Указанный второй сегмент может представлять собой фрагмент ДНК генома (включающий интроны) или фрагмент кДНК (не содержащий интронов).

В другом вариант конструкт ДНК кодирует легкую цепь или ее фрагмент и включает:

а) первый сегмент, который кодирует вариабельный домен, включающий поочередно каркасный участок и гипервариабельные области, причем указанные гипервариабельные области включают ДНК-CDR-L1-6А3 (SEQ ID NO: 17), ДНК-CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 18) и ДНК-CDR-L3-6А3 (SEQ ID NO: 19), при этом первый сегмент начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и

б) второй сегмент, кодирующий константную область легкой цепи и/или ее фрагмент, который начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной области легкой цепи, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной области легкой цепи или ее фрагмента, после которого следует нонсенс-кодон.

Предпочтительно второй сегмент кодирует константную область легкой цепи иммуноглобулина человека, более предпочтительно константную область κ цепи.

Конструкты ДНК по настоящему изобретению предпочтительно дополнительно включают еще один сегмент, который расположен по цепи выше описанных сегментов и который кодирует лидерный пептид. Указанный лидерный пептид необходим для секреции цепей организмом хозяина, в котором они экспрессируются, причем указанный пептид затем удаляется в организме хозяина. Предпочтительно указанный сегмент конструкта ДНК кодирует лидерный пептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью, практически идентичной аминокислотной последовательности лидерной последовательности тяжелой цепи, например, SEQ ID NO: 20 (тяжелая цепь IgG1, которая начинается с аминокислоты 19 и оканчивается аминокислотой 1), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 (легкая цепь IgG1, которая начинается с аминокислоты 20 и оканчивается аминокислотой 1), содержащей аминокислотную последовательность, практически идентичную лидерной последовательности тяжелой цепи, например, SEQ ID NO: 30 (тяжелая цепь IgG4, которая начинается с аминокислоты 19 и оканчивается аминокислотой 1), или содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 (легкая цепь IgG4, которая начинается с аминокислоты 20 и оканчивается аминокислотой 1).

Каждый из конструктов ДНК находится под контролем контрольных последовательностей, прежде всего под контролем пригодного промотора. При этом можно использовать промотор любого типа, адаптированный к организму хозяина, в который предполагается переносить конструкты ДНК для последующей экспрессии. Однако, если экспрессию проводят в клетках млекопитающего, более предпочтительно использовать промотор гена иммуноглобулина.

Требуемые антитела получают в культуре клеток или в организме трансгенного животного. Пригодное трансгенное животное получают стандартными способами, которые включают микроинъекцию в яйцеклетки первого и второго конструкта ДНК под пригодными контрольными последовательностями, перенос полученных таким образом яйцеклеток в организм соответствующих ложнобеременных самок и отбор потомков, экспрессирующих требуемые антитела.

Если цепи антитела предполагается получать в клеточной культуре, конструкты ДНК сначала включают в один вектор экспрессии или в два совместимых вектора экспрессии, причем последний вариант является предпочтительным.

Соответственно, в изобретении также предлагается вектор экспрессии, способный воспроизводиться в линиях прокариотических или эукариотических клеток, который включает по меньшей мере один из вышеописанных конструктов ДНК.

Таким образом, в настоящем изобретении предлагается вектор экспрессия, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к системе экспрессии, причем указанная система экспрессии или часть ее способна продуцировать полипептид по настоящему изобретению и присутствует в приемлемой клетке хозяина. Изобретение также включает изолированную клетку хозяина, содержащую систему экспрессии по изобретению.

Таким образом, описание настоящей заявки включает способ получения связывающей молекулы, полинуклеотид, вектор экспрессии, с использованием техники рекомбинантной ДНК или химического синтеза.

Таким образом, каждый вектор экспрессии, содержащий конструкт ДНК, переносят в пригодный организм хозяина. Если конструкты ДНК отдельно включают в два вектора экспрессии, то их переносят в организм хозяина отдельно, т.е. вектор одного типа в одну клетку, или переносят совместно, причем последний вариант является предпочтительным. Пригодным организмом хозяина является бактерия, дрожжи или линия клеток млекопитающих, причем последний вариант является предпочтительным. Более предпочтительно линия клеток млекопитающих включает клетки лимфоидного происхождения, например, миеломы, гибридомы или нормальные иммобилизованные В-клетки, но не экспрессирующие тяжелую или легкую цепь любых эндогенных антител.

Кроме того, предпочтительно, чтобы организм хозяина содержал в клетке большое число копий векторов, включающих один или более конструктов ДНК. Если организм хозяина представляет собой линию клеток млекопитающих, то указанная цель достигается благодаря амплификации множества копий стандартными способами. Способы амплификации заключаются в отборе на повышенную устойчивость к лекарственному средству, причем указанная устойчивость кодируется вектором экспрессии.

В другом варианте изобретения предлагается способ получения мультицепочечной связывающей молекулы по изобретению, которая включает (1) культивирование организма, трансформированного по меньшей мере одним конструктом ДНК по изобретению и (2) выделение активной связывающей молекулы изобретения из культуральной жидкости.

В другом варианте тяжелую и легкую цепи, например, выделяют отдельно и реконструируют с образованием активной связывающей молекулы после ренатурации in vitro. Способы сборки известны в области техники, примеры способов сборки прежде всего описаны в ЕР 120674 или в ЕР 125023.

Следовательно способ также включает:

(1) культивирование первого организма, трансформированного первым конструктом ДНК, кодирующим связывающую молекулу изобретения, и выделение первой связывающей молекулы из культуральной жидкости, и

(2) культивирование второго организма, трансформированного вторым конструктом ДНК, кодирующим связывающую молекулу согласно изобретению, и выделение второй связывающей молекулы из культуральной жидкости, и

(3) сборку in vitro активной связывающей молекулы согласно изобретению из первой связывающей молекулы, полученной на стадии (1), и второй связывающей молекулы, полученной на стадии (2).

При необходимости для продуцирования и сборки более одной связывающей молекулы используется более одного организма или типов клеток, например, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь.

Аналогичным образом в изобретении предлагается способ получения одной цепи или одного домена связывающей молекулы, который включает:

(1) культивирование организма, трансформированного конструктом ДНК, кодирующим одну цепь или один домен связывающей молекулы согласно изобретению, соответственно, и

(2) выделение указанной молекулы из культуральной жидкости.

Молекула по изобретению, связывающая с Nogo-A и NiG, может обладать высокой активностью при регенерации нервной ткани, например, по результатам анализа на модели разрастания неврита тучной клетки, описанного ниже.

1. Анализ разрастания невритов тучных клеток (in vitro)

Ткань мозга (коры и ствола спинного мозга) извлекали и для каждого анализа на содержание белка экстракт обрабатывали, как описано ранее (Spillmann и др., Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220), J Biol Chem., 273(30), 19283-19293 (1998, 24 июля)). Образец замороженной ткани (например, массой 0,25 г) гомогенизировали в 3-4 объемах буферного раствора (60 мМ Chaps/20 мМ трис, рН 8,0/1 мМ ЭДТУ в присутствии ингибитора протеазы (10 мкг/мл апротинин/5 мкг/мл лейпептин/1 мкг/мл пепстатин/1 мМ ПМСФ) при 4°С. Гомогенат перемешивали при вращении при 4°С в течение 30 мин, а затем центрифугировали при 100000 g в течение 45 мин при 4°С (ультрацентрифуга Beckman TL-100, ротор TLA 100.3). В супернатанте определяли концентрацию белка спектрофотометрией.

Мозжечковые тучные клетки очищали от трипсинизированной мозжечковой ткани 5-7-дневных детенышей крысы, как описано ранее (Niederost и др., Bovine CNS myelin contains neurite growth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfate proteoglycans, J. Neurosci., 19(20), 8979-8989 (1999, 15 октября). Связывающая молекула по изобретению предварительно инкубировали в присутствии анализируемого субстрата в течение 30 мин и удаляли перед добавлением клеток. Затем добавляли мозжечковые тучные клетки и инкубировали в течение 24 ч. Реакцию останавливали при медленном добавлении в чашки Петри 2 мл 4% раствора формальдегида в буферном растворе. 4-Луночные культуральные чашки Грейнера (фирма Greiner, Nuertingen, Германия) покрывали экстрактом мембранного белка мозга обезьян, полученным, как описано выше, в течение ночи (15 мкг белка/см²). Перед добавлением нейронов чашки трижды промывали теплым раствором Хенка. Мозжечковые тучные клетки (5-7-дневных детенышей крысы) получали, как описано выше, и добавляли до концентрации 50000 клеток/см². Клетки культивировали в бессывороточной среде в течение 24 ч, фиксировали и окрашивали с использованием иммунномаркера невритов мА B1b (моноклональные антитела Chemicon, 1:200). Затем протопласты окрашивали с использованием красителя ДАФИ (дигидрохлорид 4',6-диамидино-2-фенилиндола, фирма Molecular Probes). Для анализа мА анти-Nogo-A или контрольный IgG предварительно инкубировали в чашках в течение 30 мин, а затем удаляли.

В каждой лунке произвольно отмечали четыре поля на определенном расстоянии от края лунки и с использованием 40-кратного объектива подсчитывали число всех пересечений невритов с линией, проходящей через центр поля наблюдения. При этом также подсчитывали все клетки, касающиеся линии, и рассчитывали соотношение невриты/клетки для каждой лунки, как описано ранее (Simonen и др., Neuron, 38, 201-211 (2003)). Все измерения проводили слепым методом в закодированных экспериментах и представляли в виде числа невритов на число клеток. Результаты представляли в виде среднего отношения невриты/клетки.

При этом можно наблюдать усиление разрастания невритов мозжечковых тучных клеток в непермиссивном окружении экстракта спинного мозга, полученного как указано выше, после предварительной инкубации со связывающей молекулой по изобретению.

Нейтрализующую активность молекул по изобретению можно также оценивать при измерении регенерации и разрастания невритов и функционального восстановления на модели травмы спинного мозга in vivo, как описано ниже.

2. Модели травмы спинного мозга у крыс и обезьян (in vivo)

Взрослым особям крыс Льюис наносили травму в виде микрохирургического рассечения задней половины спинного мозга билатерально на уровне 8 грудного позвонка. Ламинэктомия, анестезия и хирургия описаны в статье Schnell и Schwab, Eur. J. Neurosci., 5, 1156-1171 (1993)).

Нейроанатомический контроль

Моторный и сенсорный корково-спинномозговой путь анализировали с использованием инъекции антероградного индикатора биотинилированного декстранамина (БДА) в мозжечок со стороны, противоположной насосу или имплантату. БДА переносился в спинной мозг в течение 10-14 дней, после чего его визуализировали с использованием диаминобензидина (ДАБ) в качестве субстрата, как описано в статье Brösamle и др., J. Neurosci., 20, 8061-8068 (2000)).

Через две недели после повреждения спинного мозга наблюдалось разрушение приблизительно 40% сегмента спинного мозга Т8, главным образом в задней половине, включая оба главных цервикальных разреза спинного мозга (ЦРСМ). Наблюдение за ЦРСМ у контрольных животных свидетельствует об умеренной степени реактивного разрастания пути. Указанный феномен соответствует спонтанному разрастанию в ответ на травму, описанному в литературе. У травмированных крыс, получавших лечение связывающей молекулой по изобретению, или у крыс, которым вводили связывающую молекулу с использованием насоса, наблюдался повышенный рост в очаге повреждения и регенерация поврежденных аксонов за счет разрастания поврежденных невритов. Более того у животных наблюдалось восстановление сенсорно-моторных функций. Такие функциональные испытания описаны в литературе (Merkler и др., J. Neuroscience, 21, 3665-3673 (2001)).

3. Тканевое распределение антител в ЦНС взрослых обезьян

Связывающие молекулы по изобретению очищали в виде IgG и концентрировали в ФСБ до концентрации 3 мг/мл. В качестве контроля использовали IgG, выделенный из сыворотки мыши (фирма Chemicon Int., Temecula/CA, США) или мА против ауксина пшеницы (фирма AMS Biotechnology, Oxon/Великобритания). В испытании для интратекального вливания использовали двух взрослых самцов макак (Масаса fascicularis).

Хирургические методики

Анестезию вызывали внутримышечной инъекцией кетамина (фирма Ketalar(r), Parke-Davis, 5 мг/кг, внутримышечно). Для снижения уровня бронхиальной секреции вводили внутримышечной инъекцией атропин (0,05 мг/кг). В бедренную вену помещали катетер для непрерывного вливания смеси 1% раствора пропофола (фирма Fresenius(r)) и 4% раствора глюкозы (1:2, об./об.), что вызывало более глубокую анестезию. Затем животное помещали в стереотаксический фиксатор. В стерильных условиях делали вертикальный разрез кожи по средней линии от С2 до Th1. Фасцию (мышцу) разрезали и извлекали спинальные отростки от С2 до Th1. Паравертебральные мышцы отводили назад и рассекали тонкие пластинки С6, С7 и Th1. Затем проводили полную ламинэктомию С6 и гемиламинэктомию верхнего С7. Твердую мозговую оболочку извлекали и рассекали продольно над цервикальными спинальными сегментами 7 и 8, соответствующими ростральной зоне спинальной части, покрытой 6 цервикальным слоем. Для доставки антител hNogo-A полиэтиленовый шланг (длиной 10 см), соединенный с осмотическим насосом (фирма Alzet(r), 2ML1, скорость потока: 50 мкг/ч), вводили под мозговую оболочку, продвигали на несколько мм рострально и фиксировали на оболочке швом. Затем устанавливали осмотический насос и закрепляли в полости, вырезанной в массе спинных мышц на несколько сантиметров ниже ламинэкстомии, на левой стороне. Шланг закрепляли в мышечной ткани вдоль его траектории швом. Мышцы и кожу зашивали, и животное выводили из состояния анестезии обычно через 15-30 мин после завершения внутривенного вливания пропофола. После операции животному вводили антибиотик (10% ампициллин, 30 мг/кг, подкожно). Дополнительные дозы карпрофена вводили ежедневно в течение одной недели.

Животных умерщвляли через 8 дней после имплантации осмотического насоса. Сначала вызывали анестезию введением кетамина, как указано выше, а затем проводили глубокую анестезию внутрибрюшинной инъекцией летальной дозы пентобарбитала (90 мг/кг). Животным проводили перфузию транскардиально 0,4 л 0,9% солевым раствором, затем 4 л фиксатора (4% раствор параформальдегида в 0,1 М фосфатном буферном растворе, рН 7,6). Перфузию продолжали с использованием 3 растворов сахарозы с возрастающей концентрацией (10% в фиксаторе, 20 и 30% в фосфатном буферном растворе).

Гистологические методы анализа, иммунофлуоресценция и - иммуногистохимия

Головной и спинной мозг животных осторожно расслаивали, замораживали в криопротекторе (30% сахароза) и получали срезы толщиной 40 мкм в криостате. Для детектирования введенных мА использовали вторичные антитела, специфичные к антителам человека (фирма Jackson Laboratories). В качестве двойной метки использовали следующие антитела: кроличьи антитела AS472 (очищенные на аффинном сорбенте), специфичные в отношении эндогенного Nogo-A (Chen, 2000), кроличьи антитела, специфичные в отношении ГФКБ астроцитов и кроличьи антитела против катепсина D (фирма DAKO) для локализации в лизосомах. Все антисыворотки визуализировали с использованием соответствующих ТРИТЦ- или ФИТЦ-меченых вторичных антител, или с использованием системы АСС/ДАБ (фирма Vector). Срезы анализировали эпифлуресценцией на флуориметре Zeiss Axiophot или конфокальной микроскопией (ZEISS LSM 410).

Срезы спинного мозга анализировали в месте вливания и на расстоянии 6 см ниже. Высокий уровень связывающей молекулы по изобретению наблюдался в месте вливания. В более низкой части спинного мозга, высокий уровень метки наблюдался в центральном канале и на поверхности мозга, тогда как в сером и белом веществе наблюдался более равномерный уровень метки, который однако специфично и явно превышал фон. Аналогичная ситуация наблюдалась в переднем мозге, т.е. высокий уровень метки на поверхности мозга и в желудочках и значительно содержание антител к Nogo-A в паренхиму.

Указанные эксперименты свидетельствуют о том, что спинальное интратекальное вливание антител, специфичных к поверхностному антигена клеток ЦНС, приводит к эффективному распределению связывающей молекулы и антител по изобретению благодаря циркуляции СПЖ во внутренней (желудочки, центральный канал) и внешней жидкой среде. Антитела IgG эффективно проникают в ткань головного и спинного мозга. В то время как в отрицательном контроле антитела IgG вымываются достаточно быстро, антитела против Nogo-A удерживаются в ткани головного и спинного мозга.

4. Испытания на восстановление нерва и функциональное улучшение при повреждении спинного мозга у обезьян

Анестезию вызывали внутримышечной инъекцией кетамина (фирма Ketalar(r), Parke-Davis, 5 мг/кг, внутримышечно). Для снижения уровня бронхиальной секреции вводили внутримышечной инъекцией атропин (0,05 мг/кг). В бедренную вену помещали катетер для непрерывного вливания смеси 1% раствора пропофола (фирма Fresenius(r)) и 4% раствора глюкозы (1:2, об./об.), что вызывало более глубокую анестезию. Затем животное помещали в стереотаксический фиксатор. В стерильных условиях делали вертикальный разрез кожи по средней линии от С2 до Th1. Фасцию (мышцу) разрезали и извлекали спинальные отростки от С2 до Th1. Паравертебральные мышцы отводили назад и рассекали тонкие пластинки С6, С7 и Th1. Затем проводили полную ламинэктомию С6 и гемиламинэктомию верхнего С7. Для доставки молекул вблизи повреждения свободный конец полиэтиленового шланга, соединенного с осмотическим насосом, фиксировали под мозговой оболочкой в нескольких мм рострально к очагу повреждения.

Поведенческие испытания на выявление мануальной ловкости можно проводить по опубликованной методике.

Мануальную ловкость тренировали, помещая обезьян в кресло для приматов перед "доской Бринкмана" (10 см × 20 см, модификация Perspex), содержащей 50 отверстий, распределенных произвольно, 25 отверстий, ориентированных горизонтально, и 25 отверстий, ориентированных вертикально (Liu, 1999 15428 /id, Rouiller, 1998 13239 /id). 2.7. Регенерацию и разрастание волокон можно оценивать, как описано выше. В качестве антероградного индикатора, инъецированного в правую полусферу, использовали биотинилированный декстранамин (БДА, фирма Molecular Probe(r), 10% раствор в солевом растворе). В левую полусферу вводили флуоресцентный антероградный индикатор флуоресцеиндекстран (фирма Molecular Probe(r), 10% раствор в солевом растворе). Гистологический процессинг для визуализации индикаторов можно проводить, как подробно описано ранее (Rouiller, 1994 8322 /id).

Следовательно в изобретении также предлагается:

(1) применение молекул по изобретению, связывающихся с Nogo и NiG, при регенерации нерва нервной системы млекопитающего, прежде всего нервной системы человека,

(2) способ регенерации нерва нервной системы млекопитающего, прежде всего нервной системы человека, который заключается в том, что пациенту, который нуждается в таком лечении, вводят эффективное количество молекул по изобретению, связывающихся с Nogo и NiG, или

(3) фармацевтическая композиция, предназначенная для регенерации нерва нервной системы млекопитающего, прежде всего нервной системы человека, которая включает связывающие молекулы по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Следовательно, в настоящем изобретении предлагается связывающая молекула, полинуклеотид, вектор или система экспрессии, и клетка хозяина по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Прежде всего, указанная связывающая молекула, полинуклеотид, вектор или систему экспрессии, или клетку хозяина можно использовать при лечении заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы или для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы.

В настоящем изобретении также предлагается фармацевтическая композиция, включающая связывающую молекулу, полинуклеотид, вектор или систему экспрессии, или клетку хозяина по настоящему изобретению в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Кроме того, предлагаются изделия, содержащие указанную связывающую молекулу, полинуклеотид, вектор или систему экспрессии, или клетку хозяина или их фармакологически приемлемое производное, в качестве комбинированного препарата, предназначенного для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы.

Настоящее изобретение также включает способ лечения заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы, который заключается в том, что субъекту, который нуждается в таком лечении, вводят эффективное количество связывающей молекулы, полинуклеотида, вектора или системы экспрессии, или клетки хозяина.

Кроме того, в настоящем изобретении в разделе Примеры показано, что фармакологические композиции и изделия можно использовать для замедленного высвобождения связывающей молекулы и/или для местного депонирования связывающей молекулы в очаге повреждения.

Термин "замедленное высвобождение" или эквивалентные термины "контролируемое высвобождение" или "пролонгированное высвобождение", используемые в описании заявки, относятся к препаратам лекарственного средства, которые высвобождают активное лекарственное средство, такое как полипептид, включая молекулу по изобретению, связывающийся с Nogo-A или NiG, такой как антитела, специфичные в отношении Nogo-A или NiG, в течение определенного периода времени после введения пациенту. Пролонгированное высвобождение полипептидных лекарственных средств, которое происходит через определенные промежутки времени, например, минуты, часы, дни, недели или более, в зависимости от состава лекарственного средства, отличается от стандартных препаратов, при введении которых практически вся стандартная доза подвергается немедленной адсорбции или немедленному распределению через кровоток. Предпочтительные препараты с пролонгированным высвобождением приводят к уровню циркулирующего лекарственного средства при однократном введении, который сохраняется, например, в течение 8 ч или более, 12 ч или более, 24 ч или более, 36 ч или более, 48 ч или более, 60 ч или более, 72 ч или более 84 ч или более, 96 ч или более, или даже, например, в течение 1 недели или 2 недель или более, например, в течение 1 месяца или более. Препараты с пролонгированным высвобождением подробно описаны в области техники и их можно выбирать в соответствии с предпочтительным профилем высвобождения антител. Пригодными полимерами являются биодеградируемые и недеградируемые материалы, такие как полимолочная/полигликолевая кислота (ПМПГ).

Термин "эпитоп", используемый в описании заявки, обозначает фрагмент структуры, обычно связываемый парой VH/VL иммуноглобулина. Эпитопы представляют собой минимальный связывающий участок, узнаваемый антителом, и следовательно является мишенью специфичного антитела. В случае монодоменных антител эпитоп представляет собой фрагмент структуры, распознаваемый одним изолированным вариабельным доменом.

Термин "нейтрализующий", используемый в описании заявки в связи с молекулой, связывающейся с Nogo-A или NiG, обозначает, что связывающая молекула препятствует измеряемой активности или функции Nogo-A или NiG. Молекула, связывающаяся с Nogo-A или NiG, является "нейтрализующим" полипептидом, если оно снижает измеряемую активность или функцию антигена-мишени, например, Nogo-A или NiG, по меньшей мере на 50%, и предпочтительно по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более, до и включая 100%. Указанное снижение измеряемой активности или функции антигена-мишени может оценить специалист в данной области с использованием стандартных методов измерения одного или более показателей такой активности или функции. Например, если мишенью является Nogo-A или NiG, нейтрализующую активность можно оценивать с использованием анализа роста невритов, описанного ниже.

Связывающую молекулу по изобретению, прежде всего, можно использовать для регенерации аксонов и повышенного разрастания после повреждения нервного волокна. Таким образом, молекулы по изобретению могут найти широкое применение прежде всего для лечении человека. Например, связывающую молекулу по изобретению можно использовать при лечении многих заболеваний периферической (ПНС) и центральной (ЦНС) нервной системы, т.е. более предпочтительно нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (БАС), патологическая деменция Леви или другие виды деменции, заболевания после черепной, церебральной или спинномозговой травмы, инсульт и демиелинизирующее заболевание. Такие демиелинизирующие заболевания включают, но не ограничиваясь только ими, рассеянный склероз, монофазную демиелинизацию, энцефаломиелит, многоочаговую лейкодистрофию, панэнцефалит, болезнь Маркиафавы-Бигнами, демиелинизацию варолиева моста, адренолейкодистрофию, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спонгиозную дегенерацию, болезнь Александера, болезнь Канавана, метахроматическую лейкодистрофию и болезнь Краббе. В одном примере введение связывающих молекул по изобретению можно использовать для лечения демиелинизирующего заболевания, ассоциированного с белком Nogo-A.

В другом примере клетки, которые экспрессируют связывающие молекулы по изобретению, можно трансплантировать в очаг поражения спинного мозга для облегчения роста аксона через поврежденный участок. Такие трансплантированные клетки можно использовать в качестве средства для восстановления функции спинного мозга после повреждения или травмы. Такие клетки могут включать нейросенсорные (обонятельные) клетки и стволовые клетки различных поколений эмбрионального нерва или тканевых трансплантатов.

Кроме того, связывающие молекулы по изобретению можно использовать для лечения дегенеративных глазных нарушений, которые могут непосредственно или опосредованно включать дегенерацию клеток сетчатки или роговицы, включающих ишемические ретинопатии, раннюю ишемическую глазную невропатию, все формы глазного неврита, возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, кистозный отек желтого пятна (КОП), пигментозную дистрофию сетчатки, болезнь Штаргардта, желточную макулярную дистрофию (болезнь Беста), врожденный амавроз Лебера и другие виды наследственной дегенерации сетчатки, патологическую близорукость, ретролетальную фиброплазию и наследственную глазную невропатию Лебера, побочные действия после пересадки роговицы или хирургии хрусталика и герпетический кератит.

Кроме того, связывающие молекулы по изобретению можно использовать для лечения психиатрических состояний, прежде всего шизофрении и депрессии.

Для указанных показаний соответствующая доза может изменяться в зависимости, например, от конкретной молекулы по изобретению, способа введения и природы и тяжести состояния, подлежащего лечению. В общем случае доза предпочтительно составляет от 1 мкг/кг/день до 1 мг/кг/день.

Связывающие молекулы по изобретению обычно вводят насосом или инъецируют в очаг поражения, например, молекулы можно вводить непосредственно в ЦНС интракраниально или в спинной мозг интратекально в пораженный участок. СМЖ заполняет пространство вокруг спинного мозга, которое называется субарахноидальным или интратекальным пространством. Поток спинномозговой жидкости (СМЖ) через эту область омывает и защищает головной мозг и спинной мозг. Интратекальный насос для доставки лекарственного средства является более эффективным по сравнению с пероральным введением, поскольку обеспечивает доставку лекарственного средства непосредственно в СМЖ, минуя тот путь, который проходит в организме пероральное лекарственное средство. Следовательно, в предпочтительном варианте препарат вводят интратекально, например, с использованием соответствующего катетера, связанного с портативным насосом. В другом предпочтительном варианте используют интратекальную струйную инъекцию. Пригодные средства и методы интратекального введения лекарственных средств известны специалисту в данной области. Примерами насосов являются, но не ограничиваясь только ими, насос Alzet^® и Medtronic SynchroMed^® или системы вливания Isomed^®. Связывающие молекулы можно вводить непрерывным вливанием или предпочтительно в виде фиксированных доз через конкретные интервалы времени, составляющие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 или 30 дней, например, прямой болюсной инъекцией в спинномозговую жидкость.

Связывающие молекулы по изобретению можно вводить отдельно или в комбинации, или при последовательной комбинации с другими агентами. Например, связывающие молекулы по изобретению можно вводить в комбинации с противовоспалительными агентами, такими как, но не ограничиваясь только ими, кортикостероиды, после инсульта или травмы спинного мозга, в качестве средств, блокирующих дальнейшее повреждение нейронов и ингибирование регенерации аксонов, нейротрофическими факторами, такими как фактор роста нервов (ФРН), нейротропный фактор мозга (НФМ), или другими лекарственными средствами, предназначенными для лечения нейродегенративных заболеваний, такими как экзелон(tm) (ривастигмин) или леводопа (L-ДОФА (3,4-дигидрокси-L-фенилаланин)). Другими пригодными партнерами комбинации, предназначенной для лечения инсульта, являются алтеплаз и десмотеплаз (DSPA, например, описанный в WO 90/09438). В одном варианте настоящего изобретения предлагается комбинация, включающая связывающую молекулу по изобретению и десмотепаз, прежде всего для лечения инсульта, а также фармацевтические композиции, включающие указанную комбинацию. Подразумевается, что используемые в описании заявки два агента вводятся в комбинации в том случае, если оба агента вводят одновременно или вводят независимо таким образом, что агенты действуют одновременно.

Структуры активных ингредиентов, идентифицированных кодовыми номерами, общими названиями или товарными знаками, приводятся в последнем издании стандартного справочника "The Merck Index" или в базах данных, например, Patents IntePHKtional (например, IMS World Publications) или в других базах данных, предлагаемых IMS Health. Соответствующее содержание указанных публикаций включено в описание заявки в виде ссылки. На основании указанных документов любой специалист в данной области может идентифицировать активные агенты, а также получить их и испытать фармацевтические критерии и свойства на стандартных моделях in vitro и in vivo.

Фармацевтические композиции по изобретению получают стандартными методами. Например, композицию по изобретению, включающую молекулу по изобретению, предпочтительно получают в лиофилизованной форме. Для немедленного введения композицию растворяют в пригодном водном носителе, например, в стерильной воде для инъекций или в стерильном физиологическом солевом буферном растворе.

Для получения пригодных композиций связывающие молекулы по изобретению и необязательно второе лекарственное средство, усиливающее действие связывающей молекулы по изобретению, помещают раздельно в одном контейнере вместе с инструкциями для смешанного или попеременного введения. Варианты необязательного второго агента приведены выше.

Синергетическое действие комбинации связывающей молекулы по изобретения и ростовых факторов, таких как ФРН, можно продемонстрировать in vivo на моделях травмы спинного мозга.

Настоящее изобретение также относится к применению фармацевтической композиции по изобретению для получения препарата с замедленным высвобождением связывающей молекулы по изобретению.

Настоящее изобретение относится также к применению фармацевтической композиции по изобретению для получения препарата, предназначенного для местного депонирования связывающей молекулы по изобретению в очаге повреждения.

Настоящее изобретение также относится к лекарственным формам по изобретению, предназначенным для замедленного высвобождения связывающей молекулы по изобретению и для местного депонирования связывающей молекулы по изобретению в очаге повреждения.

Настоящее изобретение также относится к способу замедленного высвобождения связывающей молекулы по изобретению и для местного депонирования связывающей молекулы по изобретению.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем.

В описании примеров температура указана в градусах Цельсия (°С).

Упомянутые в Примерах моноклональные антитела являются связывающими молекулами по настоящему изобретению, включающими вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 5) и вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 4, 6A3-IgG1), или включающими вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 25) и вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 24, 6A3-IgG4).

Подразумевается, что в вышеуказанных параграфах термин "включающий" соответствует термину "состоящий из".

В описании заявки используются следующие сокращения:

Примеры

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем.

Пример 1

Последовательность моноклональных антител Medarex 6A3, специфичных в отношении Nogo-A человека

Отбирали моноклональные антитела IgG1 человека, обладающие высокой аффинностью в отношении NiG-фрагмента Nogo-A человека. Первоначальные моноклональные антитела секретировались клонами мышиных гибридов, которые получали стандартными методами гибридомной технологии с использованием "мышей Medarex", рекомбинантно реконструированных мышей, содержащих гены иммуноглобулина человека (фирма Medarex Inc., Annandale, NJ). Генерация мышей Medarex, иммунизированных NiG человека, и получение гибридом известны в данной области техники, а условия аналогичны описанным в WO 2005/028508. Большинство гибридом продуцируют антитела на очень низком уровне, следовательно для конструирования специализированных векторов экспрессии, предназначенных для продуцирования полноразмерных антител или Fab-фрагмента в клеточной линии использовали метод рекомбинантной ДНК. Получение очищенных антител и их Fab фрагментов известно и подробно описано, например, в WO 2005/028508. Аналогичные стадии использовали для получения очищенных антител 6А3-мА и 6А3-Fab.

кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител 6А3-IgG1, амплифицировали методом ПЦР (полимеразной цепной реакции) из гибридомной мРНК, клонировали и характеризовали последовательностью (Фиг.1 и 2, SEQ ID NO 7 и 6).

Пример 2

Получение Fab и IgG4

мА 6А3 относятся к изотипу IgG1. Антитела изотипа IgG1 человека обладают высокой аффинностью в отношении клеточных рецепторов Fc и могут индуцировать антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКОЦ) и комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ) (Jerries и др., 2002, Hezareh и др., 2001). Более того, установлено, что мА IgG быстро вымываются из головного мозга кровью через гематоэнцефалический барьер по механизму обратного трансцитоза, опосредованного Fc рецептором (Zhang и др., 2001). С целью исключения возможных взаимодействий мА 6А3 IgG1 с Fc рецептором указанный изотип рекомбинантно переключали на изотип IgG4 и также получали рекомбинантными методами моновалентный Fab фрагмент, предназначенный для высокоэффективной экспрессии в клетках SP2/0 и Е.coli.

Последовательность вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей указанных антител анти-Nogo-A человека позволяет рекомбинантно продуцировать 6А3-Fab фрагмент и антитела изотипа 6А3-IgG4 в высокопродуктивных линиях клеток-продуцентов.

Для экспрессии Fab фрагмента в Е.coli обе кДНК (SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 6) клонировали в вектор pASK116. Плазмиду использовали для клонирования кДНК, продуцирующих гены константного домена мышиного IgG1/κ (Skerra, 1994). Две полипептидных цепи фрагмента антител кодируются опероном под транскрипционным контролем промотора тетрациклина. Первый цистрон кодирует тяжелую цепь Fab фрагмента. Домен VH гибридизовали с сигнальным пептидом OmpA по N-концевому фрагменту и доменом СН1 мышиного IgG1 по С-концевому фрагменту. Второй цистрон кодирует легкую цепь, содержащую домен VL, гибридизованный с лидерным пептидом PhoA и мышиным доменом СН1. После индукции экспрессии две цепи Fab фрагмента одновременно секретируются в периплазму Е.coli, где происходит укладка белка, образование дисульфидных связей и сборка упорядоченной структуры цепей. Для экспрессии Fab в E.coli плазмиды трансфектировали в BMP для препаративного продуцирования.

Для клонирования легкой и тяжелой цепи вариабельной области антител 6А3 с целью экспрессии антител IgG4 в клетках SP2/0 соответствующие кДНК клонировали в плазмиду LCvec-AAL160 и hcMCPfin. Для экспрессии полноразмерных антител IgG4 плазмиды линеаризовали с NotI для получения конструкта легкой цепи и с PvuI для получения конструкта тяжелой цепи и трансфектировали в клетки SP2/0.

Затем получали и очищали моновалентный фрагмент 6А3 IgG4 и 6А3 Fab, содержащий метку his-tag. Рекомбинантные антитела проявляли высокую аффинность в отношении фрагмента Nogo-A, hNiG, в экспериментах с использованием анализа BIAcore (см. ниже). Соответствующие значения K_D 0,14 нМ и 1,1 нМ, подтверждают успешное клонирование и рекомбинантную экспрессию мА, сохраняющих высокую активность в отношении фрагмента Nogo-A, hNiG.

Кодирующие области и аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи 6A3-Ig4 приводятся на Фиг.3 и 4 (SEQ ID NO 24, 25, 28 и 28).

Пример 3

Определение участков комплементарности антител 6А3

Участки комплементарности вариабельной тяжелой и легкой цепи антител 6А3 определяли с использованием базы данных Kabat, URL. Определение по Kabat основано на вариабельности последовательности и является общепринятым способом определения CDR вариабельных областей антител (Wu Т.Т., Kabat Е.А., 1970).

Значения всех 6 CDR хорошо коррелируют с экспериментально установленными аминокислотными последовательностями за исключением CDR-H2, где типичными остатками перед CDR должны быть LEWIG, а найдены LEWVA (Фиг.5). Однако возможно существование вариантов CDR-H2.

Пример 4

Измерение аффинности мышиных 6A3-IgG1, 6A3-IgG4 и 6А3 Fab на биосенсорном чипе, содержащем NiG

Аффинность мышиных мА 6A3-IgG1, мА 6A3-IgG4 и 6А3 Fab измеряют поверхностным плазменным резонансом (ППР) с использованием оптического биосенсора BIAcore 2000 (фирма Biacore, Uppsala, Швеция) согласно инструкциям фирмы-производителя. Рекомбинантный NIG человека ковалентно иммобилизовали на проточном сенсорном чипе СМ5 с использованием конденсации по аминогруппе. Матричный носитель на основе карбоксиметилированного декстрана активировали инъекцией 35 мкл раствора, содержащего 0,025 М N-оксисукцинимид и 0,1 М EDC. Для иммобилизации на сенсорном чипе рекомбинантный NIG человека растворяли в 0,01 М цитратном буферном растворе при рН 4 и инъецировали со скоростью потока 5 мкл/мин до достижения уровня конденсации, достаточного для измерения аффинности. Инактивацию избыточных N-оксиимидиловых эфирных групп проводили инъекцией 35 мкл 1 М раствора гидрохлорида этаноламина (рН 8,5). Поверхность сенсорного чипа регенерировали инъекцией 5 мкл 0,1 М HCl. Для измерения аффинности антитела инъецировали при различных концентрациях в интервале от 0,50 нМ до 100 нМ при скорости потока 200 мкл/мин. После каждой инъекции поверхность сенсорного чипа регенерировали инъекцией 10 мкл 0,1 М HCl при сохранении связывающей активности на поверхности чипа. Константы кинетики связывания к_a и к_D и константы аффинности K_a и K_D рассчитывали с использованием программы BIAevaluations 3.0, представленной производителем.

Измерение аффинности методом BIAcore

Константы кинетики и аффинность связывания мышиных мА 6A3-IgG1 и 6A3-IgG4 и моновалентного Fab фрагмента 6А3 с рекомбинантным Nogo-A человека измеряли в режиме реального времени с использованием поверхностного плазменного резонанса (ППР) (фирма Biacore). Для проведения указанного анализа рекомбинантный NIG человека конденсировали на поверхности сенсорного чипа и инъецировали антитела при различных концентрациях. Кинетические параметры связывания определяли по сенсограммам на основе нелинейного графика. Константы аффинности при нейтрализации NIG человека антителами находились в интервале K_D от 0,13 нМ до 2,5 нМ для мА 6A3-IgG4, 6А3-IgG1 и 6А3 Fab.

Пример 5

Связывание антител анти-Nogo-A NVP-6A3-Ab-NX-1 и NVP-IIC7-NX-1 с эндогенным Nogo-A человека

В этом примере демонстрируется связывание антител с эндогенным Nogo-A человека. Для этого исследовали две линии клеток человека, которые, как установлено ранее, характеризуются экспрессией олигодендритно-специфичного гена Nogo-A, и следовательно, специфичным связыванием с антителами. Для характеризации двух антител анти-Nogo-A NVP-6A3-Ab-NX-1 (6А3-Ab) и NVP-IIC7Ab-NX-1 (IIC7-Ab) в связи с их связыванием с эндогенным Nogo-A использовали линии клеток олигодендроглии человека MO3.13 и HOG. Кроме того, клетки можно использовать для разработки методов биоанализа, предназначенных для характеризации различных партий антител для клинических испытаний. Связывание 6А3-Ab с эндогенным Nogo-A человека в таких клетках анализировали и детектировали по двум независимым схемам.

На первой стадии клетки MO3:13 анализировали на присутствие мРНК Nogo-A методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных для Nogo-А человека. На второй стадии исследовали связывание обоих антител с эндогенным Nogo-A иммунопреципитацией и иммунодетектированием лизатов клеток MO3.13. Наконец, результаты иммунопреципитации подтверждали специфичным иммунофлуоресцентным окрашиванием клеток MO3.13 и HOG антителами 6А3-Ab.

Таким образом было установлено, что антитела 6А3-АВ и 11C7-Ab способны специфично связываться с эндогенным Nogo-A человека.

Методы

Клеточные линии: клетки MO3.13 предоставлены др. N.Cashman, Университет Торонто. Клетки получали слиянием 6-тиогуанин-резистентного мутанта рабдомиосаркомы (РД) человека с олигодендроцитами взрослого человека, культивированных из хирургического образца. Клетки HOG представлены др. G.Dawson, Университет Чикаго. Указанную линию клеток получали из хирургически удаленной олигодендроглиомы. Все клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дальбекко, с высоким содержанием глюкозы (фирма Gibco), содержащей препарат Glutamax, 10% ЭТС и пенициллин/стрептомицин.

ОТ-ПЦР: суммарную РНК получали из 5×10⁵ клеток MO3.13 с использованием реагента Tripure (фирма Roche Diagnostics). После обработки ДНКазой 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции в общем объеме 20 мкл с использованием Omniscript RT (фирма Qiagen) и олиго dT-праймера. Праймеры, используемые для ПЦР, которые являются специфичными для Nogo-А, амплифицируют фрагмент (194 по), который начинается с положения 1197 в полноразмерном Nogo-A человека (5'-TGAGGGAAGTAGGGATGTGC-3' (SEQ ID NO: 32), 5'-CAGGTGATGTACGCTCTGGA-3' (SEQ ID NO: 33)). Реакцию проводили с использованием 2 мкл кДНК (или 0,1 мкг РНК-ОТ), 5 мкл 10× буферного раствора, 3 мкл dNTP (5 мМ каждого), 2,5 мкл 5' праймера (10 мкМ), 2,5 мкл 3' праймера (10 мкМ), 0,5 мкл HotStar Taq-полимеразы (фирма Qiagen) и 34,5 мкл H₂O. При этом использовали следующие циклы ПЦР: 95°С 15 мин, (94°С 30 с, 55°С 30 с., 72°С 15 с)×35, 72°С 10 мин → 4°С. После завершения ПЦР аликвотные части (10 мкл) анализировали в агарозном геле при проявлении 2% этидий бромидом.

Иммунопреципитация и иммунодетектирование: для получения каждого иммунопреципитата клетки MO3.13, которые культивировали в одной культуральной чашке (диаметром 10 см) до конфлюэнтности, промывали ФСБ и клетки лизировали в 500 мкл реагента для экстракции белков млекопитающих (M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent, фирма Pierce), содержащего полную смесь ингибиторов протеаз (фирма Roche Diagnostics). Растворимую фракцию лизата подвергали предварительной очистке при обработке сорбентом белок G/сефароза (фирма Sigma) в течение 15 мин при КТ. В предварительно очищенный супернатант добавляли свежую порцию сорбента белок G/сефароза и соответствующие антитела (при конечной концентрации 50 нМ) и инкубировали при 4°С в течение 4 ч на ротационной качалке. Антитела представляли собой 6А3 IgG4, 11C7 IgG1 или анти-СЕА IgG4, специфичные в отношении белка другого типа (карциноэмбриональный антиген), который использовали в качестве отрицательного контроля. Для анализа несвязанной фракции отбирали аликвотную часть каждого супернатанта, сефарозу промывали (4×) буферным раствором TNS (10 мМ трис/HCl, рН 7,8, 1% (мас./об.) N-лаурилсаркозин, 100 мМ NaCl), однократно ФСБ, и фракцию, связанную на сефарозе, элюировали 20 мкл буферного раствора нанесения в ДСН/ПААГ (фирма Invitrogen). Образцы нагревали при 95°С в течение 5 мин и каждую аликвотную часть (10 мкл) анализировали электрофорезом (NuPage, 4-12% гель, фирма Invitrogen) в MES буферном растворе. Белки переносили на целлюлозную мембрану в течение 4 ч при 30 В и анализировали на полноту переноса при окрашивании красителем Ponceau. После переноса мембрану блокировали в течение ночи при 4°С в реагенте для вестерн-блоттинга (фирма Roche Diagnostics) в ФСБ/Т. Для иммунодетектирования мембрану инкубировали в присутствии антител 6А3-IgG4 (1 нМ) в течение 2 ч при КТ, а затем в присутствии конъюгата вторичных антител (против иммуноглобулина человека) с пероксидазой хрена в течение 1 ч при КТ. Сигналы регистрировали в системе ECL-Advance (фирма Amersham) и снимали на пленку в течение 1 мин.

Иммунофлуоресценция: клетки MO3.13 и HOG высевали на 8-луночные предметные стекла, покрытые поли-D-лизином (фирма Becton Dickinson), и культивировали до 80% конфлюэнтности. Затем клетки промывали ФСБ и фиксировали в 4% ПФА в течение 30 мин при КТ. Неспецифичное связывание блокировали при обработке 10% ЭКС, 0,1% тритон Х-100 в течение 20 мин. Клетки инкубировали в 1% ЭТС, 0,1% тритоне Х-100 в течение 1 ч в присутствии 5 нМ 6A3-IgG4 или только буферного раствора в качестве отрицательного контроля. После инкубации в присутствии антител клетки трижды промывали ФСБ и инкубировали в присутствии антител IgG человека, меченых красителем Alexa Fluor 488 (фирма Molecular Probes) при разведении 1:200 в ФСБ в течение 1 ч.

Результаты

ОТ-ПЦР: ОТ-ПЦР проводили с использованием в качестве матрицы РНК клеток MO3.13, при этом получали определенный фрагмент ДНК размером приблизительно 200 по (Фиг.6). В отрицательных контролях (РНК в отсутствии обратной транскрипции и Н₂О) не наблюдалось образования каких-либо продуктов. Фрагмент ПЦР характеризовался ожидаемым размером 194 по, в контрольных образцах (РНК обработанная ДНКазой и Н₂О) амплификации продуктов не наблюдалось.

Иммунопреципитация: После иммунопреципитации (ИП) лизатов клеток MO3.13 и иммунодетектирования анти-Nogo-A антителами 6А3 (Фиг.7) наблюдали одну интенсивную полосу продукта с ожидаемой ММ (190 кДа) при проявлении антителами 6A3-IgG4 (трек 4) и 11C7-IgG1 (трек 6). Сигнал не наблюдается после ИП антителами анти-КЭА против белка другого типа (карциноэмрионального антигена, трек 1) и никакого сигнала не наблюдалось в несвязанных фракциях (треки 5 и 7). До проведения ИП полоса с низкой интенсивностью наблюдается в неочищенном лизате клеток MO3.13 (трек 2). Слабый неспецифичный сигнал в области более низкой ММ наблюдается в нерастворимой фракции клеточного лизата (трек 3).

Иммунофлуоресценция: Иммунофлуоресцентное окрашивание проницаемых клеток MO3.13 и клеток HOG антителами 6A3-IgG4 и вторичными антителами против иммуноглобулина человека, мечеными красителем Alexa-Fluor 488, приводит к чрезвычайно интенсивному окрашиванию клеток (Фиг.8а и 8б, слева), в то время как никакого сигнала не наблюдается при проявлении одними вторичными антителами (справа).

Обсуждение результатов

ОТ-ПЦР анализ клеток MO3.13 с использованием Nogo-A специфичных праймеров для ПЦР позволяет получить фрагмент ДНК ожидаемых размеров (194 по), в то время как никакого продукта ПЦР не детектируется при применении образца РНК, полученной прямой транкскрипцией, или воды в качестве контроля. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что клетки экспрессируют эндогенный Nogo-A.

После иммунопреципитации лизатов клеток MO3.13 и иммунодетектирования антителами 6А3 анти-Nogo-A наблюдается одна интенсивная полоса Nogo-A, соответствующая ожидаемой ММ (190 кДа). Напротив, при проявлении контрольными антителами анти-КЭА (IgG4) полоса белка соответствующей ММ не наблюдается. Различие в интенсивности полос, полученных при иммунопреципитации антителами 6А3 и 11С7, наиболее вероятно обусловлено различной аффинностью изотипов антител к белку G/сефарозе (аффиность 6А3 > аффинности 11С7). Результаты внутриклеточного иммунофлуоресцентного окрашивания клеток MO3.13 и HOG свидетельствуют о том, что 6A3-IgG4 связываются с эндогенным Nogo-A.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что две клеточных линии эндогенно экспрессируют Nogo-A, а оба типа антител 6А3 IgG4 (6A3-Ab) и 11С7 IgG1 (11С7-Ab) специфично связываются с эндогенным Nogo-A человека. Указанные данные свидетельствуют о том, что клетки линии MO3.13 можно использовать для разработки анализа связывания Nogo-A с целью, например, идентификации антител.

Пример 6

Воздействие 6А3 на функциональное восстановление у макак с повреждениями головного мозга

В следующем эксперименте подопытным обезьянам (макакам) наносили повреждение, как описано ранее, и лечили интратекальным вливанием (4 раза в неделю) антител 6А3 или контрольного IgG, начиная с момента нанесения повреждения. Мануальную ловкость пораженной левой лапы оценивали с использованием модифицированного теста на «доске Бринкманна» в условиях, описанных выше. Лечение антителами 6А3 повышало скорость и степень функционального восстановления по сравнению с контрольным лечением IgG. По результатам определения размера повреждения при завершении эксперимента было установлено, что функциональное восстановление обезьян, которых лечили контрольным IgG, приблизительно обратно пропорционально размеру повреждения, например, составляет от 90% (при 50% повреждения) до 53% (при 90% повреждения). Напротив, число животных, которых лечили мА анти-Nogo-A, практически не зависело от размера повреждения, у животных, которых лечили 6А3, наблюдалось почти полное восстановление до исходного состояния даже в том случае, если размер повреждения составлял 85%.

Пример 7

Удерживание в СМЖ и период полураспада антител 6А3 в организме человека

Удерживание в СМЖ и период полураспада антител 6А3 в организме человека оценивали после вливаний в СМЖ в течение 14 дней (при суточной дозе 15 мг/день) и определения индивидуальные концентрации в сыворотке и в СМЖ (фиг.9 и 10).

Концентрация в СМЖ не изменялась или снижалась незначительно, в двух случаях в день 34 и 56, т.е. приблизительно через 20 и 42 сут после завершения вливания, по сравнению с уровнем, измеренным во время вливания, что свидетельствует о неожиданно продолжительном удерживании и/или периоде полураспада 6А3 в СМЖ. Указанные фармакокинетические свойства позволяют использовать различные способы введения и курсы лечения с более продолжительными интервалами. Целесообразно использовать струйную инъекцию в СМЖ с интервалами 2 или более дней или недель. Антитела 6А3 можно использовать для получения препаратов с контролируемым высвобождением, таких как состав в биодеградируемых или небиодеградируемых полимерах или имплантатах.

Пример 8

Эффективность при испытании на модели повреждения спинного мозга у макак

У 3 обезьян проводили одностороннее рассечение спинного мозга на границе С7/С8, т.е. наносили повреждение, которое как известно снижает управление точными тонкими движениями пальцев, и имплантировали осмотический насос Alzet^®, который интратекально доставляет в очаг поражения мышиные антитела IgG контрольному животному или антитела 6А3 подопытным животным в течение 4 недель в дозе 1 мг/день (фиг.11 и Freund и др., Nat. Med., 12, №7, 90-92, (2006)). Мануальную ловкость оценивали по поиску кормовых гранул в вертикальных и горизонтальных прорезях при испытании на модифицированной доске Бринкмана. Другие поведенческие задачи включали поиск кормовых гранул в выдвижном ящике, баллистические движения лапами, моторную способность лап при захвате корма и поведенческие реакции на боль и дискомфорт. Испытания проводили за 60 дней до нанесения повреждения в течение до 120 дней после нанесения повреждения с регулярными интервалами.

У обезьян проводили одностороннее рассечение спинного мозга и вводили интратекально мышиные контрольные антитела IgG (n=2, т.е. контроль 1, 50% повреждения, и контроль 2, 90% повреждения) или 6А3 (n=2, т.е. ATI1, 85% повреждения, и ATI2, 80% повреждения) в дозе 1 мг/день в течение 4 недель (масса обезьян: контроль 1, 5,1 кг, контроль 2, 4,1 кг, ATI 1, 5,0 кг, ATI 2, 4,5 кг). Результаты приводили в виде общего числа гранул во время курса испытаний в конкретные дни. Величины рассчитывали с использованием индивидуальных поведенческих оценок в баллах до повреждения и после повреждения, когда уровень активности остается стабильным.

Лечение обезьян антителами 6А3 приводит к постепенному улучшению поиска кормовых гранул с использованием пораженной левой лапы в горизонтальных и вертикальных прорезях по сравнению с контрольными животными, которым вводили IgG. У контрольных животных наблюдался общий стойкий дефицит гранул, извлекаемых из горизонтальных прорезей, т.е. дефицит движения, для которого требуется более высокая мануальная ловкость по сравнению с поиском в вертикальных прорезях.

После выздоровления достигался максимальный уровень при испытании на доске Бринкмана, причем обезьяны проходили испытания на способность хватать ручку выдвижного ящика пораженной левой лапой с целью выдвинуть его и извлечь кормовые гранулы из лунки в ящике.

Обезьяны с повреждением 90% (контроль 2), которых лечили контрольным IgG, вообще не могли хватать ручку и открывать выдвижной ящик. Движение лапы замедлялось по сравнению с нормой, а движение лапы отличалось от нормы. Такие движения показаны двойной линией со стрелкой, свидетельствующей о явном различии между активностью до повреждения и активностью после повреждения и лечения контрольными антителами IgG, что в свою очередь свидетельствует только о частичном выздоровлении. У животных с 85% (ATI-1) или 80% (ATI-2) поражения, которых лечили антителами 6А3, наблюдалось восстановление способности выполнять задачу быстро и эффективно независимо от размеров поражения. При этом не наблюдалось существенного различия в активности до и после повреждения, которое лечили антителами 6А3, что указывает на полное выздоровление в результате лечения антителами 6А3. Таким образом, при введении антител 6А3 наблюдается явное лечебное действие, т.е. восстановление после индуцированных повреждений головного мозга у макак, по сравнению с лечением контрольными антителами IgG.

Пример 9

Клинические испытания

Пригодные клинические испытания проводили по следующему протоколу.

Испытания включали три фазы: массовое обследование (включая фон), фазу лечения с открытой этикеткой и по меньшей мере заключительную фазу в течение 22 недель. Испытания проводили под контролем независимого отдела по контролю за безопасностью лекарственных средств (DSMB).

22 пациента разделяли на 4 частично перекрывающиеся последовательные группы, которым непрерывно вливали антитела 6А3. Все пациенты после вливания проходили заключительную фазу в течение 22 недель для последующей оценки безопасности лекарственного средства.

В испытаниях использовали следующее распределение пациентов по группам, дозам и продолжительность лечения:

Группа 1: трем пациентам с параплегией вводили дозу 5 мг (в 2,5 мл) в течение 24 ч,

Группа 2: трем пациентам с параплегией вводили дозу 30 мг (в 2,5 мл) в течение 24 ч,

Группа 3: шести пациентам с параплегией вводили дозу 30 мг/день (2,5 мл/день) в течение 14 дней,

Группа 4: десяти пациентам с пара- и тетраплегией вводили дозу 30 мг/день (2,5 мл/день) в течение 28 дней,

Состояние пациентов строго регистрировали в течение по меньшей мере шести месяцев после начала вливания. Состояние пациентов строго контролировали, при этом оценивали основные показатели состояния пациента, результаты ЭКГ (расшифровка в центральном медицинском учреждении) и лабораторные анализы основных показателей крови, мочи и СМЖ. Неврологические исследования с использованием шкалы ASIA (Applicable Standard Neurological Classification of Spinal Cord Injury by the American Spinal Injury Association, Ditunno, и др., American Spinal Cord Injury Association, Paraplegia, 32(2), 7080 (1994)) проводили квалифицированные клиницисты для оценки эффективности, а также для оценки возможного обострения повреждения спинного мозга. Для каждого пациента проводили всего четыре анализа спинного и головного мозга методом ядерно-магнитной томографии. У каждого пациента трижды отбирали образцы СМЖ (до введения дозы, во время лечения и на заключительной фазе) для оценки фармакокинетических (ФК) параметров. Для тех же целей во время лечения и на заключительной фазе отбирали также образцы крови. Полученные данные контролировались в независимом отделе по контролю за безопасностью лекарственных средств (DSMB) согласно протоколу.