Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ПОВЫШЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано в фармакологических целях для повышения неспецифической резистентности организма у молодняка сельскохозяйственных животных.

При современном уровне физического, химического и биологического загрязнения окружающей природной среды сельскохозяйственные животные страдают от вторично индуцированного иммунодефицита - разбалансировки нормального функционирования иммунной системы. Это приводит к существенному снижению общей сопротивляемости организма животного к различным заболеваниям вирусной и бактериальной природы. При вторичном иммунодефиците животные с большим трудом переносят любые стрессы, начиная от транспортировки, смены кормовых рационов, стрижек, прививок и кончая применением сильных антибиотиков в качестве лекарственных препаратов.

Новорожденный молодняк в отличие от взрослых животных имеет недоразвитую иммунологическую и физиологическую систему защиты от воздействия окружающей микрофлоры. Способность иммунной системы отвечать на антигенную стимуляцию полностью развивается у животных лишь спустя определенное время после рождения. Для защиты молодого организма в период созревания иммунной системы ему передаются материнские антитела (иммуноглобулины), которые создают пассивный иммунитет. При недостатке иммуноглобулинов у животных в ранний постнатальный период создается предрасположенность к желудочно-кишечным и респираторным болезням, вызываемым, условно-патогенной микрофлорой.

Инфекционные заболевания, вызываемые вирусами, бактериями и их ассоциациями, поражают более 60% молодняка. Особенно остро это отражается на животных, рожденных с малой массой тела, поскольку такой молодняк плохо набирает вес и более подвержен инфекционным заболеваниям. Среди патогенных возбудителей в возникновении диареи преимущественную роль играют коронавирусы, ротавирусы, эшерихия коли, сальмонеллы, протеи. Наиболее часто респираторную патологию молодняка вызывают вирусы инфекционного ринотрахеита, парагриппа 3, вирусной диареи-болезни слизистых, из бактериальных - пастереллы, хламидии и микоплазмы. Любая патология животного является причиной или следствием иммунологических нарушений, которые способствуют переходу основного заболевания в хроническое и его осложнениям. Для профилактики, терапии и борьбы с этими болезнями проводят общие ветеринарно-санитарные и противоэпизоотические мероприятия. Вместе с этим применяют препараты специфической профилактики (гипериммунные сыворотки крови, вакцины и т.п.), средства химио- и антибиотикотерапии и профилактики.

В последнее время значительно возрос интерес к биоактивным препаратам как средствам повышения неспецифической и специфической резистентности животных к инфекционным агентам и их токсинам. Быстрота действия некоторых иммуностимуляторов, их высокая эффективность позволяют надеяться на перспективность этого направления исследований в ветеринарии с целью профилактики инфекционных заболеваний.

В этом плане особый интерес для ветеринарных врачей представляет отечественный иммуномодулятор Гликопин. Это высокоэффективный и безопасный иммуномодулирующий препарат, действующим началом которого является синтезированный из природных компонентов глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) - универсальный структурный фрагмент оболочки бактериальных клеток, взаимодействующий с иммунной системой животного организма (Применение иммуномодулятора гликопина для профилактики и лечения заболеваний животных // Методические рекомендации, http://www.peptek.ru/productions/glicopin/recomendations.php).

Известно средство для стимуляции обменных процессов животных и повышения общей работоспособности организма, содержащее экстракт плаценты для инъекций, нуклеинат натрия и в качестве источника витаминов и аминокислот - питательную среду для культивирования клеток 199 (патент РФ №2203073, 20.10.2002). Данное средство эффективно в отношении повышения работоспособности животных, однако при его применении существует опасность аллергических реакций на вводимые в составе препарата чужеродные для организма животного компоненты плаценты.

Известен комплексный препарат «Пуриветин» для стимуляции роста и повышения резистентности сельскохозяйственных, домашних животных (патент РФ №2195838, 10.01.2003), содержащий азотистые основания, активатор гликолиза (фруктозо-1,6-дифосфат кальция) и витамины В₁₂ и С. Где в качестве азотистых оснований используется - рибоксин и метилурацил, которые широко применяются в медицине в качестве активаторов энергообмена. Его использование нормализует обменные процессы в организме, влияет на изменение живой массы поросят, т.е. является перспективным биостимулятором в кормлении сельскохозяйственных животных, однако не позволяет добиться образования адекватного и стойкого ответа на бактериальные и вирусные агенты, необходимого для профилактики инфекционных заболеваний и снижения падежа.

Известно также биологическое средство на основе зародышевой ткани, обладающее иммуномодулирующим свойством, восстанавливающее физиологическое состояние организма (FR 2413912 (А1), 1979-08 - 03.08.1979).

Указанное средство выполнено на основе измельченной и гомогенизированной животной ткани, выделенной из зародыша в смеси с физиологической сывороткой. Его использование обеспечивает в том числе и повышение продуктивности животных на 5-15% по сравнению с контрольной группой. Однако эффективность известного указанного вещества недостаточна вследствие того, что наряду с иммуномодулирующими факторами оно содержит в своем составе иммунодепрессанты, которые по сути препятствуют полному проявлению иммуномодулирующего эффекта.

Наиболее близким аналогом является биологически активное средство для нормализации физиологического состояния организма человека и животных, предусматривающее введение в организм этого средства (RU 2041717 С1, 20.08.1995). Это биологически активное средство, обладающее иммуномодулирующим свойством, выполнено на основе органических соединений компонентов клеточных мембран гомогенизированной животной ткани, содержит в своем составе термостабильные, низкомолекулярные модифицированные компоненты клеточных мембран с антигенной структурой, модифицированной при процессах эмбриогенеза, или пролиферации, или дифференцировки клеток, или репарации ткани. Однако недостатком данного средства является то, что в его основе лежит использование только компонентов клеточных мембран, что сужает спектр биологической активности препарата.

В состав заявленного изобретения входит комплекс из клеточного лизата, а также культуральной средой, обогащенной клеточными метаболитами, цитокинами, факторами роста и другими, секретируемыми веществами культивируемыми клетками.

Основной задачей изобретения является создание средства для ветеринарии, повышающего продуктивность сельскохозяйственных животных на основе белково-пептидного комплекса из лизата лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток животных и кондиционированной среды их культивирования.

Технический результат заявленного изобретения заключается в получении средства, обладающего эффективной индукцией неспецифической резистентности организма, улучшении клинического состояния и снижении заболеваемости сельскохозяйственных животных, содержащего: белково-пептидный комплекс, полученный из лизата культивированных стволовых и/или прогениторных клеток и лейкоцитов периферической крови животных; кондиционированную среду, полученную при совместном культивировании стволовых и/или прогениторных клеток и лейкоцитов периферической крови животных, где указанный комплекс имеет молекулярную массу от 1 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу от 5 до 120 кДа, характеризующийся наличием пиков при длине волны 270-290 нм и 200-225 нм в УФ-области спектра, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

лизат лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток - 0,01-10;

кондиционированная среда - 90,0-99,9.

Технический результат состоит также в индукции иммунного ответа за счет регулирования пролиферации иммунных клеток, их дифференцировки, и определения спектра синтезируемых цитокинов. Использование данного средства позволяет не только обеспечить иммунный эффект и стимуляцию роста сельскохозяйственных животных, но и избежать многокомпонентности состава и снизить количество вспомогательных веществ.

I. Получение средства на основе белково-пептидного комплекса осуществляли следующим образом.

1) Получение стволовых и прогениторных клеток для культивирования

Стволовые клетки и прогениторные клетки получали от интактного животного. Костный мозг забирали у животного, находящегося под общим эфирным наркозом, из бедренной кости, пунктируя кость и промывая ее раствором Хенкса. Из аспирата костномозговой взвеси удаляют эритроциты. Для удаления эритроцитов можно использовать градиентное центрифугирование, лизис эритроцитов лизирующим раствором или комбинацию этих методов с другими, в результате чего наступает разделение эритроцитов и ядросодержащих клеток. Данные ядросодержащие клетки содержат как стволовые клетки, так и прогениторные.

2) Получение лейкоцитов периферической крови

Проводят забор периферической крови любым известным способом, после чего осуществляют получение лейкоцитарной суспензии: для этого 2 мл гепаринизированной крови смешивают с 1 мл подогретого до 37°С 3% раствора желатина и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 мин. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отбирают в пластиковые пробирки и отмывали 10-кратным объемом фосфатно-солевого буфера (рН 7,4). Затем лейкоциты после центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин ресуспендируют в растворе Хенкса без Са²⁺ и Mg²⁺. После подсчета числа лейкоцитов концентрацию клеток доводят до 10⁶ клеток.

3) Культивирование клеток

Полученные клетки, а именно лейкоциты периферической крови и стволовые и/или прогениторные клетки животных, ресуспендируют в культуральной ростовой среде. Клетки культивируют совместно при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂ и при 95% влажности, в течение 1-60 суток.

Эти клетки могут быть культивированы любым известным способом, например в монослое, на гранулах или в трехмерном слое и любым другим способом (т.е. в чашках для культивирования, в роллер-флаконах, в системах с непрерывным потоком и т.п.). Методы культивирования клеток и тканей хорошо известны специалистам и описаны (Freshney. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 1987).

В другом варианте клетки культивируются в культуральной среде в CO₂-инкубаторе при содержании CO₂ от 4 до 6%, кислорода от 2% до 22% при 37°С (CO₂-инкубатор «Thermo Scientific серии WJ» с контролем содержания O₂). При изменении содержания кислорода происходит изменение спектра синтезируемых белков (в частности HIF (гипоксия индуцированный фактор)), что вызывает повышение-активности препарата (Antonina Lavrentieva, Ingrida Majore, Cornelia Kasper, Ralf Hass // Effects of hypoxic culture conditions on umbilical cord-derived human mesenchymal stem cells// Cell Commun Signal., 2010; 8: 18).

Кроме того, культуральная среда может быть подвергнута 10-20-кратному концентрированию с использованием концентрирующего устройства, работающего при избыточном давлении и имеющего фильтр с отсечкой 100000 мол. масс. («Amicon», «Beverly»).

4) Получение средства

После культивирования клетки вместе с культуральной средой переносят в пробирки, в которых клетки подвергаются разрушению с использованием физических (ультразвук, замораживание-оттаивание, электрический импульс и др.), и/или химических (ферменты, химические реагенты и др.), и/или механических (растирание и др.) методов или их комбинации, приводящих к нарушению клеточных структур.

Полученный раствор пропускают через систему ультрафильтрации Pellicon 2 (фирмы «Millipor» с фильтрами «Biomax») для удаления белков выше 120 кДа.

После ультрафильтрации полученный раствор замораживали до - 80С и помещали в лиофильную сушку «Thermo Scientific P16000» для лиофилизации.

Для индентификации белково-пептидного комплекса в заявленном средстве использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии. Наличие пиков отмечается при длине волны 270-290 нм и 200-225 нм в УФ-области спектра. Молекулярную массу белков, входящих в композицию, определяют методом электофореза в полиакриламидном геле («SDS-Page»). В состав средства входят белки с молекулярной массой от 1 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу от 5 до 120 кДа.

Полученное средство подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.

В одном варианте осуществления изобретения средство содержало белково-пептидный комплекс, полученный из лизата культивированных стволовых клеток и лейкоцитов периферической крови животных; кондиционированную среду, полученную при совместном культивировании стволовых клеток и лейкоцитов периферической крови животных, где указанный комплекс имеет молекулярную массу от 1 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу от 5 до 120 кДа, характеризующийся наличием пиков при длине волны 270-290 нм и 200-225 нм в УФ-области спектра, при следующем соотношении компонентов, мас.%: лизат культивированных стволовых клеток и лейкоцитов периферической крови - 2,5; кондиционированная среда - 97,5.

II. Способ стимуляции роста и повышения резистентности организма сельскохозяйственных животных проводили следующим образом: на базе двух животноводческих хозяйств Московской области - ОАО «Куйбышево» (телята, n=20) и АОЗТ «Кострово» (поросята, n=20). Стимулирующее влияние заявленного средства определяли на клинически здоровых телятах и поросятах. Подобранных по принципу аналогов животных распределяли на две группы - опытную и контрольную. Препарат вводят внутримышечно в дозе по 1 мг/кг веса животного на одну инъекцию. Курс лечения - 10 инъекций, по одной инъекции один раз в три дня, внутримышечно. Общая продолжительность курса - 30 дней. Животным контрольных групп препаратов не назначали.

Средство по изобретению может также вводиться с использованием любого подходящего пути введения: пероральный, парентеральный, подкожный, интраназальный.

Дополнительно с заявленным средством можно вводить антибиотик, противовоспалительный агент, противовирусеый агент, противогрибковый агент, гормон, анальгетик, анестезирующее средство или любую их комбинацию.

Бактериологическое исследование носовой слизи проводили общепринятыми методами. Идентификацию выделенных культур проводили в соответствии с классификационной системой «Bergy's manual., 1984-1989». Биохимические свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гиса, СИБ (Н. Новгородский НИИ экспериментальной микробиологии) и множественной тест-системы «Enterotube II» («Becton Dickinson GmbH BD Diagnostics»). Гемолитическую активность качественно оценивали путем посева штрихом суточной агаровой культуры на МПА с содержанием 5%-ной стерильной крови барана. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам изучали методом диффузии в агар.

Комплексное гематологическое исследование включало определение: концентрации гемоглобина, общего числа лейкоцитов, формулы крови, биохимический анализ крови (общий белок, альбумин, активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, креатининкиназы, глюкозы, мочевины, калия, фосфора, кальция, железа, кетона). Данные исследования проводили по общепринятым методикам.

Для определения влияния заявленной композиции на факторы общей неспецифической резистентности проводили оценку фагоцитарной звена, а также поглотительной и оксидазной активности нейтрофилов.

Фагоцитарную активность нейтрофилов крови определяли по фагоцитозу убитой взвеси Staph.aureus, подсчитывая фагоцитарный индекс и фагоцитарное число. В окрашенных мазках подсчитывали число фагоцитирующих клеток на 100 нейтрофилов (фагоцитарный индекс, ФИ, %), количество микробных тел, поглощенных в среднем одним нейтрофилом (фагоцитарное число, ФЧ, микробных тел).

Оксидазную и бактерицидную функцию нейтрофилов оценивали в НСТ-тесте спектрофотометрически при длине волны 650 нм.

Статистическая обработка результатов проводилась методом вариационной статистики. При нормальном распределении количественных признаков подсчитывали средние значения (М), ошибки средней (ш) и среднеквадратические отклонения (5). В качестве статистических тестов при нормальном распределении количественных признаков с равными выборочными дисперсиями использовали t-критерий Стьюдента.

Пример 1. Опыт применения белково-пептидного препарата на телятах 2-х месячного возраста в хозяйстве «Куйбышево» Московской области

Показатели привеса молодняка в опытной группе на 45 сутки с начала проведения эксперимента по сравнению с контролем составили 50% (600 г в сутки в опытной и 400 г в сутки в контрольной группе).

В опытной группе наблюдалось снижение заболеваемости (одно заболевшее животное в опытной группе и 5 в контрольной) и сроков лечения и заживления ран по сравнению с контролем (2 дня в опытной и 7-15 дней в контрольной соответственно). В отличие от контрольной группы, применение антибиотиков у животных, получавших биоактивный препарат, не потребовалось, что определило разницу в количестве расходов на лечение (100 руб. - опытная группа и 1000 руб. - контрольная) (табл.1).

При проведении бактериологического исследования в опытной группе наблюдалось резкое снижение содержания гемолитических микроорганизмов (показатели гемолитической активности до применения препарата выявлены у 15% штаммов, после - не наблюдалось), синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus), грамотрицательной условно-патогенной палочки Kluyvera ascorbata и грибов рода Aspergillus. Так, в опытной группе до введения препарата наблюдалось 7 штаммов с гемолитической активностью, тогда как после их отмечено не было; 1 штамм Staphylococcus aureus - до введения препарата, 0 - после; 6 штаммов гемолитически активной Kluyvera ascorbata - до введения препарата, 1 - после; Pseudomonas aeruginosa - 1 штамм до введения препарата, после - не наблюдалось. В контрольной группе соответственно до введения препарата 2 штамма с гемолитической активностью, 3 штамма - Kluyvera ascorbata, Staphylococcus aureus - 0; после введения препарата - 3 штамма с гемолитической активностью, Kluyvera ascorbata - 1 штамм, Staphylococcus aureus - 1 (табл.2).

При определении спектра чувствительности бактерий к антибиотикам установлено, что штаммы были чувствительными к антибиотикам группы фторхинолонов (пефлоксацин, офлоксацин, ломефлоксацин, ципрофлоксацин); группы аминогликозидов (тобрамицин, гентамицин, амикацин); группы цефалоспоринов (цефатоксим, цефтриаксон); карбопенемам (меропенем). Устойчивость наблюдалась к (3-лактамным антибиотикам группы пенициллинов (бензилпенициллин, ампициллин, оксациллин); тетрациклинов (тетрациклин, окситетрациклин); группы макролидов (эритромицин, олеандомицин).

При морфологическом исследовании крови у животных опытной группы после применения препарата отмечена нормализация изначально повышенных показателей воспалительного процесса - содержание лейкоцитов и моноцитов в периферической крови (содержание лейкоцитов до применения препарата - 14,75±4,46; после применения - 9,44±1,27). На последнее также указывает снижение в крови животных опытной группы содержания незрелых палочкоядерных форм нейтрофилов (сдвиг формулы вправо) по сравнению с уровнем этого показателя до применения препарата (до применения - 4,5±1,0; после - 1,9±0,94). В контрольной группе высокие уровни содержания этих клеток в крови характеризуют непрекращающийся воспалительный процесс (табл.3).

В биохимическом анализе крови в опытной группе наблюдалось снижение показателей щелочной фосфатазы (ЩФ) в 2,5 раза, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в 1,43 раза, креатининкиназы (КК) в 1,3 раза. В контрольной группе показатели лактатдегидрогеназы и креатининкиназы снизились в 1,03 и 1,2 раза соответственно, а показатели щелочной фосфатазы увеличились в 1,7 раз (табл.4).

Снижение белка, наблюдаемое как в контрольной (в 1,3 раза), так и в опытной группах (в 1,2 раза), связано с нарушением кормовой базы. Хотя в последнее время некоторые хозяйства приобретают широко рекламируемые различные белково-витаминно-минеральные добавки (БВМД), но основной недостаток этих добавок в том, что они разработаны и выпускаются для всех регионов страны без учета кормов местного производства, их использование в отдельных случаях, еще более усугубляет избыток или дефицит элементов питания.

При исследовании иммунологических показателей в опытной группе по сравнению с контрольной наблюдаются положительные изменения в фагоцитарном звене, ответственном за общую неспецифическую резистентность.

В частности, показатели фагоцитарного индекса в опытной группе увеличились на 7,7%, тогда как в контрольной на 3,1%. Фагоцитарное число в опытной группе увеличилось в 1,63 раза, тогда как в опытной группе наблюдалось снижение этого показателя. Оксидазная функция нейтрофилов в НСТ-тесте характеризовалась снижением индекса стимуляции как в опытной группе, так и в контрольной (табл.5).

Пример 2. Опыт применения белково-пептидного препарата на поросятах 1,5-х месячного возраста в хозяйстве «Кострово» московской области

Показатели привеса молодняка в опытной группе на 45 сутки с начала проведения эксперимента по сравнению с контролем превысили 30% (400 г в сутки в опытной группе и 300 г в сутки в контрольной).

В опытной группе наблюдалось снижение заболеваемости по сравнению с контролем (1 заболевшее животное - заболевание ЖКТ, в опытной группе и 3 заболевших животных в контрольной группе) (табл.6).

При морфологическом исследовании крови у поросят, так же как и у молодняка КРС, отмечается нормализация повышенных показателей содержания лейкоцитов в периферической крови (в два раза) у животных опытной группы. В контрольной группе лейкоцитоз обнаруживается не у всех животных, однако динамика среднего показателя (увеличение до верхней границы нормы и существенное превышение нормальных показателей у отдельных животных) указывает на развитие воспаления. Содержание лейкоцитов в опытной группе составило 14,78±4,46×10⁹л до применения препарата и 7,88±1,22×10⁹л, в контрольной - 9,29±2,23×10⁹л и 10,44±3,31×10⁹л соответственно. Показатели гемоглобина характеризовались повышением (в опытной группе с 112,8±5,7 до 117,2±3,5 г/л, в контрольной с 110,6±5,1 до 112,2±4,6112,2±4,6 г/л) (табл.7).

В условиях промышленного свиноводства у животных, как правило, регистрируют низкий иммунный статус и, соответственно, восприимчивость к заболеваниям, в том числе бактериальной природы. Одной из актуальных проблем промышленного свиноводства является разработка средств, методов и технологий, обеспечивающих высокую резистентность свиней и, соответственно, устойчивость к болезням, в том числе инфекционной природы. Одним из ведущих механизмов элиминации внеклеточных патогенов является активность фагоцитирующих клеток, активность которых снижают токсины бактерий. В результате проведенных исследований иммунологических показателей установлено, что у поросят в опытной группе по сравнению с контрольной также наблюдаются положительные изменения в фагоцитарном звене. В частности, показатели фагоцитарного индекса в опытной группе увеличились на 6,8%, тогда как в контрольной на 2,8%. Показатели фагоцитарного числа в опытной группе увеличились в 1,5 раз, тогда как в опытной группе наблюдалось снижение. Оксидазная функция нейтрофилов в НСТ-тесте характеризовалась снижением индекса стимуляции в опытной группе, и повышением в контрольной (табл.8).

Таким образом, проведенные исследования подтверждают положительное действие заявленного средства на организм телят и поросят. При этом препарат показал положительное влияние на прирост поросят и телят, животные из опытных групп по приросту живой массы превосходили контрольных. Гематологические показатели крови у получавших препарат телят и поросят (в 60- и 45-суточном возрасте соответственно), представленные в описании, демонстрируют тенденцию улучшения этих показателей. Полученные данные свидетельствуют о хорошей биодоступности заявленного средства. Применение этого препарата приводит к снижению заболеваемости и падежа животных. Также целесообразно применение заявленного средства как дополнительного препарата в сочетании с антибактериальной и прочей терапией в целях уменьшения сроков течения болезни и расходов на лечение животных. Введение препарата позволило обеспечить и несколько большую сохранность животных, что можно объяснить улучшением общего физиологического и клинического состояния животных.

Таким образом, на основании клинических, гематологических, биохимических, бактериологических и иммунологических исследований установлено, что применение заявленного средства способствует повышению параметров неспецифической резистентности иммунитета организма животных и обладает профилактической эффективностью.