Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЗАЩИТЫ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В РЕЗУЛЬТАТЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к разработке способов защиты клеток дрожжей от окислительного стресса в результате воздействия пероксида водорода, и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности.

Известен способ защиты клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса с помощью трегалозы, маннитола и галактозы. Способ включает добавление одного из углеводов в концентрации 500 мМ в среду культивирования, инкубирование дрожжей в течение 1 ч, воздействие смесью перекиси водорода в концентрации 2 мМ и треххлористого железа в концентрации 1 мМ в течение 1 ч с последующим определением числа выживших клеток [Benaroudj N., Do Нее Lee, Goldberg A.L. Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals. // The Journal Of Biological Chemistry. 2001, vol. 276, No. 26, pp.24261-24267]. При использовании данного способа защиты дрожжей достигается 20-кратное увеличение доли выживших клеток по сравнению с контролем (культурой без добавления углевода). Недостатком данного способа является использование в качестве тест-культуры мутантного в отношении синтеза трегалозы штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вследствие чего данный способ не отражает защитного действия углеводов на не мутированные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от стрессорных воздействий различной природы (действие окислителей, γ-радиации, фотоокисление) с использованием в качестве защитных агентов алкилоксибензолов [Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Лойко Н.Г., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Регулирующее действие микробных АОБ различной структуры на стрессовый ответ дрожжей. // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44, №5, с.571-575]. Способ включает выращивание культуры дрожжей в стандартных условиях до конца логарифмической или начала стационарной фазы роста, добавление алкилоксибензолов в концентрации от 0,13 до 1,9 г/л, инкубирование культуры с алкилоксибензолами в течение 2 ч, воздействие различными стрессорными агентами с последующим определением числа выживших клеток. В условиях окислительного стресса (H₂O₂, 100 мМ, 30 мин) показано, что С7-АОБ в концентрациях 0,25-0,64 г/л повышает устойчивость клеток дрожжей к перекиси водорода в 2-5 раз. В следующей серии экспериментов стресс индуцировали γ-облучением дозой 50 крад: при концентрациях алкилоксибензола 1,40-1,65 г/л число жизнеспособных клеток увеличивалось в 1,2-1,3 раза (по сравнению с контролем без внесения алкилоксибензола).

Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, обладает рядом недостатков, главным из которых является относительно низкая степень защиты дрожжевых клеток (увеличение выживаемости в 1,2-1,3 раза) при воздействии на культуру облучением, а также то, что при использовании более высоких, по сравнению с оптимальными, концентраций алкилоксибензола (более 0,65 г/л) защитное действие пропадает и даже может проявляться угнетающее действие на рост дрожжей. Кроме того, в прототипе используется относительно низкая концентрация перекиси водорода (100 мМ) и не описан защитный эффект алкилоксибензолов при более высоких концентрациях стрессорного агента, хотя в условиях процессов использования и культивирования дрожжевых штаммов могут иметь место более высокие концентрации пероксида водорода и более жесткие воздействия стрессоров.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от факторов окислительного стресса на примере перекиси водорода и жесткого ультрафиолетового облучения, позволяющего достигнуть высокой степени защиты дрожжевых клеток при отсутствии угнетающего действия на дрожжевые клетки.

Поставленная задача решается тем, что предлагается способ защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от стрессорных агентов, включающий выращивание культуры дрожжей в стандартных условиях до конца логарифмической или начала стационарной фазы роста, инкубацию с защитным агентом в течение 5-6 часов, воздействие различными стрессорными агентами (на примере перекиси водорода и жесткого ультрафиолетового облучения) с последующим определением числа выживших клеток, причем в качестве защитных агентов используют соевые ингибиторы протеаз в концентрации от 0,1 до 2,0 г/л.

В отличие от прототипа, в данном способе используется значительно более высокая концентрация пероксида водорода (700-750 мМ, что в 7,0-7,5 раз выше по сравнению с прототипом), но достигаемый защитный эффект при этом находится на том же уровне. При использовании в качестве стрессорного агента жесткого ультрафиолетового излучения эффект от внесения ингибиторов протеаз превышает эффект от внесения алкилоксибензола.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae выращивали при температуре 28°С в конической колбе общим объемом 250 мл при инкубировании на лабораторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью 120 об./мин. Количество питательной среды составляло 50 мл. Пробу культуры отбирали в логарифмической или в начале стационарной фазы роста, к ней добавляли алкилоксибензол в концентрации 0,25 г/л и инкубировали в течение 2 ч. Устойчивость к окислительному стрессу проверялась после 30 минут инкубации пробы с перекисью водорода в концентрации 100 мМ. Пробу культуры, подвергнутой окислительному стрессу, с помощью метода последовательных разведении рассевали на чашки Петри с агаризованной средой и осуществляли подсчет колоний. Было показано, что в данных условиях внесение алкилоксибензола повышает устойчивость клеток дрожжей в 2 раза.

Пример 2. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae выращивали при температуре 28°С в конической колбе общим объемом 250 мл при инкубировании на лабораторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью 150 об./мин. Количество питательной среды составляло 50 мл. Пробу культуры отбирали в логарифмической или в начале стационарной фазы роста, препарат ингибитора Кунитца в концентрации 0,10 г/л и инкубировали в течение 6 ч. Устойчивость к окислительному стрессу проверялась после 30 минут инкубации пробы с перекисью водорода в концентрации 740 мМ. Определение доли выживших клеток проводили с помощью микроскопирования с красителем метиленовым синим. Установлено, что при внесении ингибитора Кунитца в концентрации 0,10 г/л в условиях окислительного стресса (Н₂О₂, 740 мМ, 30 мин) доля выживших клеток увеличивается в 2,1 раза.

Пример 3. Культуру дрожжей выращивали в тех же условиях, которые описаны в Примере 2. К пробе добавляли ингибитор Кунитца в концентрации 1,00 г/л и инкубировали в течение 6 ч. После инкубации пробу переносили на чашку Петри, которую помещали под бактерицидную лампу, и проводили облучение дрожжевой суспензии жестким ультрафиолетовым излучением в течение 30 секунд. После окончания облучения в пробе подсчитывали количество живых и мертвых клеток по описанному в Примере 2 способу. При внесении ингибитора Кунитца в концентрации 1,00 г/л при облучении культуры жестким ультрафиолетовым облучением в течение 30 секунд доля выживших клеток увеличивается в 2,8 раз.

Пример 4. Культуру выращивали в условиях, описанных в Примере 2. К пробе добавляли ингибитор Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л, инкубировали с пероксидом водорода и проводили подсчет живых и мертвых клеток аналогично Примеру 2. При внесении ингибитора Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л в условиях окислительного стресса (H₂O₂, 740 мМ, 30 мин) доля выживших клеток увеличивается в 2,5 раза.

Пример 5. Культуру дрожжей выращивали в условиях, описанных в Примере 2. Затем к пробе добавляли ингибитор Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л и осуществляли с культурой операции, описанные в Примере 3. После облучения и подсчета живых и мертвых клеток было обнаружено, что при внесении ингибитора Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л при облучении культуры жестким ультрафиолетовым облучением в течение 30 секунд доля выживших клеток увеличивается в 4,7 раз.

Пример 6. Культуру выращивали в условиях, описанных в Примере 2. К пробе добавляли ингибитор Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л, инкубировали с пероксидом водорода и проводили подсчет живых и мертвых клеток аналогично Примеру 2. При внесении ингибитора Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л в условиях окислительного стресса (H₂O₂, 700 мМ, 30 мин) доля выживших клеток увеличивается в 2,4 раза.

Пример 7. Культуру выращивали в условиях, описанных в Примере 2. К пробе добавляли ингибитор Кунитца в концентрации 1,00 г/л и инкубировали с пероксидом водорода и проводили подсчет живых и мертвых клеток аналогично Примеру 2. При внесении ингибитора Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л в условиях окислительного стресса (H₂O₂, 750 мМ, 30 мин) доля выживших клеток увеличивается в 2,9 раза.

Как видно из приведенных примеров, при осуществлении данного способа защиты клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae достигается более высокая по сравнению с прототипом эффективность защиты от облучения (в 1,2-5,4 раза). Кроме того, во всем исследованном диапазоне концентраций вносимых ингибиторов не отмечалось угнетение роста культуры. Также, несмотря на увеличение концентрации пероксида водорода до концентрации 700-750 мМ, что в 7,0-7,5 раз выше по сравнению с прототипом, эффект от введения соевых ингибиторов протеаз находится на уровне аналога. В условиях окислительного стресса (H₂O₂, 700-750 мМ, 30 мин) показано, что ингибитор Кунитца увеличивает долю выживших клеток в 1,5-3 раза по сравнению с контролем, ингибитор Баумана-Бирк - в 1,5-2,5 раза. В следующей серии экспериментов стресс индуцировали облучением жестким ультрафиолетом при аналогичных условиях обработки ингибиторами в тех же концентрациях. В этом в случае ингибитор Кунитца увеличивает долю выживших клеток в 1,2-2,7 раз по сравнению с контролем, ингибитор Баумана-Бирк - в 2,3-4,7 раза. Выживаемость дрожжевых клеток при облучении выше по сравнению с прототипом, а доля живых клеток, обработанных перекисью водорода, находится на уровне прототипа несмотря на увеличение концентрации перекиси до концентрации 700-750 мМ (в 7,0-7,5 раз выше по сравнению с прототипом), что свидетельствует о более высокой антиоксид антной активности ингибиторов протеаз. Кроме того, в отличие от прототипа не наблюдается угнетения культуры во всем исследованном диапазоне концентраций ингибиторов протеаз.