ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОСАХАРИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ N-АЦЕТИЛЛАКТОЗАМИН, ДЛЯ РАЗВИТИЯ ИММУННЫХ ОТВЕТОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к развитию иммунных ответов новорожденных младенцев путем обучения иммунной системы для избежания несоответствующих иммунных ответов.

Предшествующий уровень техники изобретения

Непосредственно после рождения желудочно-кишечный тракт ребенка считается стерильным. В течение нормального процесса рождения он сталкивается с бактериями пищеварительного тракта, кожи и окружения матери и начинает колонизироваться. В фекальной микрофлоре здорового младенца на грудном вскармливании в возрасте от 2 до 4 недель, которая может быть принята как оптимальная микрофлора для этой возрастной группы, преобладают виды Bifidobacteria с несколькими видами Lactobacillus и меньшими количествами Bacteroides, такими как виды Bacteroides fragilis за исключением потенциальных патогенов, таких как Clostridia. После завершения грудного вскармливания в возрасте около 2 лет устанавливается состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта, который соответствует составу взрослого.

Ранние стадии колонизации представляют собой критическую фазу адаптации к новому окружению желудочно-кишечного тракта, которое обеспечивает большинство идентифицированных врожденных лигандов иммунных рецепторов, таких как липополисахариды, в высоких концентрациях. Следовательно, иммунное распознавание желудочно-кишечного тракта должно четко регулироваться и обучаться в течение этого периода во избежание несоответствующей стимуляции.

У мышей эпителиальные клетки кишечника отвечают в течение нескольких часов после рождения на экзогенные бактериальные соединения, такие как эндотоксины, для приобретения устойчивости toll-подобного рецептора для облегчения последующей микробной колонизации и развития стабильного кишечного гомеостаза организма-хозяина - микроорганизма (Lotz et al., 2006). Предполагают, что сходные постнатальные процессы также происходят у человеческих младенцев. Дисфункция подавления провоспалительных реакций, необходимая для возможности формирования колонизации, может приводить к развитию воспаления кишечника и расстройств процесса колонизации. Это, в свою очередь, может приводить к длительной борьбе между организмом-хозяином и микроорганизмами с отрицательными последствиями для состояния здоровья и в ранние, и вероятно также в отдаленные периоды как местно в желудочно-кишечном тракте, так и даже системно.

Уже было предположено, что такая отложенная или несоответствующая колонизация может иметь специфические последствия в отношении последующего развития младенца. Например, Fantuzzi et al. предположили, что слабо выраженное системное воспаление и субоптимальная микрофлора желудочно-кишечного тракта могут быть вовлечены в последующее развитие ожирения (Fantuzzi G. “Adipose tissue, adipokines and inflammation” J. Allergy Clin Immunol. 2005; 115:911-919).

Коротко, появляется все больше и больше свидетельств, которые предполагают, что установление соответствующей кишечной микрофлоры в раннем периоде жизни может быть существенным фактором в последующем здоровом развитии. Более того, вероятно, несоответствующая кишечная микрофлора сопровождается местным воспалением в желудочно-кишечном тракте и слабо выраженным системным воспалением, которые обладают своими собственными нежелательными последствиями для общего состояния здоровья.

Материнское молоко рекомендовано всем младенцам. Известно, что человеческое молоко в добавление к макроэлементам содержит множество биоактивных питательных веществ, например соединений, которые могут быть в широком смысле классифицированы как белки, углеводы или жиры, но которые обладают специфическим действием в дополнение к их калорийности. Одним большим классом таких биоактивных питательных веществ являются олигосахариды человеческого молока, группа более 100 олигосахаридов, которые обнаруживают в варьирующихся количествах в человеческом молоке, но, например, не в таком же количестве или разнообразии в коровьем молоке. Количество и функция таких различных олигосахаридов все еще изучаются, хотя определенные из них уже были ассоциированы с, например, снижением способности патогенов прилипать к эпителиальным клеткам организма-хозяина.

Однако в некоторых случаях грудное вскармливание является неадекватным или невозможным по медицинским причинам или мать выбирает не кормить грудью. Для таких ситуаций были разработаны молочные смеси. Большое множество молочных смесей основаны на коровьем молоке, которое, как отмечено выше, не настолько богато функциональными углеводами, как в отношении разнообразия, так и содержания, как человеческое молоко.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что введение олигосахаридов с лактозосвязанной моно-, ди- и/или поливалентной N-ацетиллактозамиовой структурой новорожденным младенцам является особенно эффективным в обучении иммунной системы, обеспечивая подавление несоответствующих провоспалительных ответов во время установления кишечной микрофлоры в периоде новорожденности с результатом, что несоответствующие иммунные ответы могут аналогично подавляться.

Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение олигосахарида, выбираемого из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы в получении лекарственного средства для младенцев или терапевтической питательной композиции для младенцев для развития иммунных ответов у новорожденного младенца.

Во втором аспекте изобретение обеспечивает применение олигосахарида, выбираемого из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы в получении лекарственного средства для младенцев или терапевтической питательной композиции для младенцев для модуляции иммунной системы новорожденного младенца для обеспечения развития в первые несколько недель жизни младенца полезной кишечной микрофлоры, сравнимой с таковой, обнаруживаемой у младенцев на грудном вскармливании.

В третьем аспекте изобретение обеспечивает применение олигосахарида, выбираемого из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы в получении лекарственного средства или терапевтической питательной композиции для введения новорожденным младенцам для снижения риска последующего развития аллергии у младенца.

Изобретение распространяется на способ обеспечения развития иммунных ответов у новорожденного младенца путем введения новорожденному младенцу, нуждающемуся в этом, терапевтического количества олигосахарида, выбираемого из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы.

Изобретение дополнительно распространяется на способ, обеспечивающий развитие в течение первых несколько недель жизни младенца полезной кишечной микрофлоры, сравнимой с таковой, обнаруживаемой у младенцев на грудном вскармливании, путем введения новорожденному младенцу, нуждающемуся в этом, терапевтического количества олигосахарида, выбираемого из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы.

Наконец, изобретение распространяется на способ снижения риска последующего развития аллергии у младенца путем введения новорожденному младенцу, нуждающемуся в этом, терапевтического количества олигосахарида, выбираемого из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы.

Не желая быть связанными с теорией, авторы настоящего изобретения считают, что олигосахариды с лактозосвязанными моно-, ди- или поливалентными N-ацетиллактозаминовыми структурами в просвете кишечника могут действовать как «ловушка» для провоспалительных факторов, предотвращая их связывание с их естественными лигандами и, таким образом, облегчая провоспалительные ответы. Специфически, галектин-3 представляет собой β-галактозидсвязывающий белок, вовлеченный в различные провоспалительные реакции, такие как активация нейтрофилов (например, IL8). Нейтрофилы участвуют во врожденном иммунном ответе как основные фагоцитарные лейкоциты, привлекаемые в место инфекции. Галектин-3 может быть выделен из эпителия желудочно-кишечного тракта для активации иммунной системы.

Исследования с мышами, у которых отсутствовал галектин-3 (gal-/-), показали регуляторную роль галектина-3 в регуляции и врожденных и адаптивных иммунных ответов на патогены (Bernardes et al., 2006). Со сходной патогенной нагрузкой мыши gal-/- показали гораздо более низкий иммунный ответ, меньшую инфильтрацию лейкоцитов в собственную пластинку желудочно-кишечного тракта и отсутствие некроза желудочно-кишечного тракта по сравнению с контролем дикого типа. Следовательно, может быть сделано заключение, что отсутствие галектина-3 приводит к более мягкому иммунному ответу.

Гликаны, заканчивающиеся галактозой β-1,4 N-ацетилглюкозамином, такие как лакто-N-неотетраоза, связывают галектин-3. Как показано ранее для галектина-9, свободные галектинсвязывающие гликаны могут препятствовать связыванию галектина с целевыми лигандами, таким образом изменяя поведение целевого лиганда (Ohtsubo et al., 2005). Чем больше N-ацетиллактозаминовых единиц полимеризуются, тем выше сродство к галектину-3 и сильнее функция ловушки.

Более того, у мышей gal3-/- показан более высокий Th1 ответ, проявляющийся более высокой продукцией IL12 и IFNγ дендритными клетками (Bernardes et al., 2006). Клетки Т хелперы играют центральную роль в адаптивном иммунитете. Клетки Th1 являются жизненно важными для клеточного иммунного ответа и клетки Th2 обеспечивают гуморальный иммунитет. Ответы Th1 и Th2 являются контррегуляторными, то есть цитокины, продуцируемые клетками Th1, ингибируют функцию Th2 и наоборот. Было показано, что Th2-искаженный иммунный ответ является ключевым для поддержания успешной беременности и также превалирует при рождении и в течение первых месяцев жизни. Постнатальное воздействие микробных антигенов вызывает предпочтительно Th1 ответ, который предположительно уравновешивает Th2-поляризованную продукцию цитокинов у новорожденных. В случае недостаточно ранних Th1 ответов, продукция цитокинов Th2-типа (IL4, IL-5 и IL-13) дополнительно увеличивается, приводя к продукции IgE и впоследствии к аллергическим заболеваниям. Следует, что активность ловушки, указанная выше, также помогает склонить иммунную систему в направлении Th1 ответа, таким образом обучая иммунную систему и снижая риск развития аллергии в раннем периоде жизни.

Подробное описание изобретения

В настоящей спецификации следующие термины имеют следующие значения:

«полезная кишечная микрофлора, сравнимая с таковой, обнаруживаемой у младенцев на грудном вскармливании» обозначает кишечную микрофлору с преобладанием приемлемых популяций видов Bifidobacterium и Lactobacillus с исключением существенных популяций таких видов, как Bacteroides, Clostridia и Streptococci;

«новорожденный младенец» обозначает младенца в первые два месяца жизни.

Все ссылки на проценты представляют собой процентные отношения по массе, если не указано иначе.

Изобретение относится к применению олигосахарида, выбираемого из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы. Предпочтительные олигосахариды представляют собой лакто-N-тетраозу (LNT) и лакто-N-неотетраозу (LNnT). LNT и LNnT могут быть синтезированы химически ферментативным переносом сахаридных единиц с донорских компонентов на акцепторные компоненты с использованием гликозилтрансфераз, как описано, например, в патенте США № 5288637. Альтернативно LNT и LNnT могут быть получены химическим преобразованием кето-гексоз (например, фруктозы) или свободных или связанных с олигосахаридом (например, лактулозой) в N-ацетилгексозамин- или N-ацетилгексозаминсодержащий олигосахарид, как описано в Wrodnigg T.M.; Stutz A.E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38:827-828. N-ацетиллактозамин, полученный таким образом, затем может быть перенесен на лактозу в качестве акцепторного компонента.

Терапевтическая питательная композиция предпочтительно представляет собой молочную смесь, которая содержит олигосахарид, выбираемый из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы в количестве от 0,1 до 3 г/100 г композиции на основании сухой массы.

Молочная смесь для использования в соответствии с настоящим изобретением может содержать источник белка в количестве не более чем 2,0 г/100 ккал, предпочтительно от 1,8 до 2,0 г/100 ккал. Считают, что тип белка не является критичным для настоящего изобретения с условием, что удовлетворяются минимальные требования к содержанию необходимых аминокислот и обеспечивается удовлетворительный рост, хотя предпочтительно, чтобы более 50 мас.% источника белка представляла сыворотка. Следовательно, могут быть использованы источники белка на основании сыворотки, казеина и их смеси, а также источники белка на основе сои. Поскольку подразумевают белки сыворотки, источник белка может быть основан на кислой сыворотке или сладкой сыворотке или их смеси и может включать альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в любых желаемых пропорциях.

Белки могут быть интактными или гидролизованными или смесью интактных и гидролизованных белков. Может быть желательно вводить частично гидролизованные белки (степень гидролиза между 2 и 20%), например, для младенцев с предположительным риском развития аллергии на коровье молоко. Если требуются гидролизованные белки, процесс гидролиза может проводиться как желательно и известно в области техники. Например, гидролизат белка сыворотки может быть получен ферментативным гидролизом фракции сыворотки в одну или более стадий. Если фракция сыворотки, используемая в качестве исходного материала, является по существу свободной от лактозы, обнаруживают, что белок имеет существенно меньше блокады лизина в течение процесса гидролиза. Это позволяет снизить степень блокады лизина с около 15 мас.% всего лизина до менее чем около 10 мас.% лизина; например около 7 мас.% лизина, что существенно улучшает питательное качество источника белка.

Молочная смесь может содержать источник углеводов. Любой источник углеводов, обычно обнаруживаемый в молочной смеси, такой как лактоза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси, может быть использован, хотя предпочтительным источником углеводов является лактоза. Предпочтительно источники углеводов определяют между 35 и 65% общей энергетической ценности смеси.

Молочная смесь может содержать источник липидов. Источник липидов может быть любым липидом или жиром, который подходит для использования в молочных смесях. Предпочтительные источники жиров включают пальмовое масло, высокомасличное подсолнечное масло и высокомасличное сафлоровое масло. Незаменимые жирные кислоты линолевая и α-линоленовая кислота также могут быть добавлены, как и небольшие количества масел, содержащих высокое количество заранее образованной арахидоновой кислоты и докозагексаноевой кислоты, такие как рыбий жир или микробные масла. В общем, содержание жира предпочтительно является таковым, чтобы определять между 30 и 55% общей энергетической ценности смеси. Источник жира предпочтительно имеет соотношение n-6 к n-3 жирным кислотам от около 5:1 до около 15:1, например от около 8:1 до около 10:1.

Молочная смесь также может содержать все витамины и минералы как необходимые в ежедневном рационе и в достаточных питательных количествах. Минимальные требования были установлены для определенных витаминов и минералов. Примеры минералов, витаминов и других питательных веществ, необязательно присутствующих в молочной смеси, включают, витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозитол, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлорид, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минералы обычно добавляют в форме соли. Присутствие и количества специфических минералов и других витаминов варьируются в зависимости от предназначенной популяции младенцев.

Если необходимо, молочная смесь может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соевый лецитин, сложные эфиры лимонной кислоты и моно- и диглицеридов и подобные.

Молочная смесь предпочтительно дополнительно содержит, по меньшей мере, один пребиотик в количестве 0,2-10%. Пребиотик представляет собой неперевариваемый пищевой ингредиент, который полезным образом влияет на организм-хозяин путем селективной стимуляции роста и/или активности одной или ограниченного количества бактерий в толстой кишке и таким образом улучшает состояние здоровья организма-хозяина. Такие ингредиенты являются неперевариваемыми в том смысле, что они не разрушаются и не абсорбируются в желудке и тонком кишечнике и, следовательно, проходят интактными в толстую кишку, где они селективно ферментируются полезными бактериями. Примеры пребиотиков включают определенные олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды (FOS) и галактоолигосахариды (GOS). Комбинация пребиотиков может быть использована, например 90% GOS с 10% короткоцепочечных фруктоолигосахаридов, такая как продукт, продаваемый под торговым наименованием Raftilose®, или 10% инулина, такая как продукт, продаваемый под торговым наименованием Raftiline®. Особенно предпочтительной комбинацией пребиотиков является 70% короткоцепочечных фруктоолигосахаридов и 30% инулина.

Молочная смесь также может включать, по меньшей мере, один пробиотический бактериальный штамм. Пробиотик представляет собой средство микробных клеток или компоненты микробных клеток с полезным эффектом на состояние здоровья или самочувствие организма-хозяина. Подходящие пробиотические бактериальные штаммы включают Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, получаемый от Valio Oy Finland под торговым наименованием LGG, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116, штамм Lactobacillus reuteri, продаваемый BioGaia A.B. под торговым наименованием Reuteri, Streptococcus salivarius DSM 13084, продаваемый BLIS Technologies Limited of New Zealand под обозначением K12, Bifidobacterium lactis CNCM I-3446, продаваемый между прочим компанией Christian Hansen of Denmark под торговым наименованием Bb12, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, продаваемый Morinaga Milk Industry Co. Ltd of Japan под торговым наименованием ВВ536, штамм Bifidobacterium breve, продаваемый Danisco под торговым наименованием Bb-01, штамм Bifidobacterium breve, продаваемый Morinaga под торговым наименованием M-16V, штамм Bifidobacterium infantis, продаваемый Procter & Gamble Co под торговым наименованием Bifantis, и штамм Bifidobacterium breve, продаваемый Institut Rosell (Lallemand) под торговым наименованием R0070 в количестве между 10е3 и 10е12 КОЕ/г порошка, более предпочтительно между 10е17 и 10е12 КОЕ/г порошка.

Молочная смесь может необязательно содержать другие вещества, которые могут обладать полезным эффектом, такие как лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и подобные.

Молочная смесь может быть получена любым подходящим образом. Например, она может быть получена смешиванием вместе белка, источника углеводов и источника жира в соответствующих пропорциях. При использовании в этот момент могут быть включены эмульгаторы. Витамины и минералы могут быть добавлены в этот момент, но их обычно добавляют позже во избежание термического разрушения. Любые липофильные витамины, эмульгаторы и подобные могут быть растворены в источнике жира перед смешиванием. Вода, предпочтительно вода, которую подвергли обратному осмосу, затем может быть примешана для получения жидкой смеси. Температура воды обычно составляет от около 50°С до около 80°С для помощи дисперсии ингредиентов. Коммерчески доступные разжижители могут быть использованы для получения жидкой смеси. N-ацетиллактозамин и/или олигосахарид, содержащий N-ацетиллактозамин, добавляют на этой стадии, если конечный продукт будет в жидкой форме. Если конечный продукт будет порошком, олигосахариды могут иным образом быть добавлены на этой стадии, если желательно. Затем жидкую смесь гомогенизируют, например, в две стадии.

Затем жидкая смесь может быть термически обработана для снижения бактериальной нагрузки путем быстрого нагревания жидкой смеси до температуры в диапазоне от около 80°С до около 150°С в течение от около 5 секунд до около 5 минут, например. Это может проводиться вдуванием пара, автоклавированием или посредством теплообменника, например планшетного теплообменника.

Затем жидкая смесь может быть охлаждена от около 60°С до около 85°С, например, мгновенным охлаждением. Затем жидкая смесь может быть снова гомогенизирована, например, в две стадии при от около 10 МПа до около 30 МПа на первой стадии и от около 2 МПа до около 10 МПа на второй стадии. Гомогенизированная смесь может затем быть дополнительно охлаждена для добавления любых чувствительных к нагреванию компонентов, таких как витамины и минералы. рН и содержание твердых веществ гомогенизированной смеси удобно корректировать в этот момент.

Гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, такой как распылительная сушилка или лиофильная сушилка, и преобразуют в порошок. Порошок должен иметь содержание влаги менее чем около 5 мас.%. При использовании олигосахарид может быть добавлен на этой стадии путем сухого смешивания вместе с пробиотическими бактериальными штаммами(ом).

Если предпочтительным является жидкий продукт, гомогенизированная смесь может быть стерилизована, затем асептически заполнена в подходящие контейнеры или может быть сначала заполнена в контейнеры и затем стерилизована.

В другом варианте осуществления изобретения композиция может быть добавкой, включающей олигосахарид, выбираемый из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, лакто-N-октаозы, лакто-N-неооктаозы, изо-лакто-N-октаозы, пара-лакто-N-октаозы и лакто-N-декаозы в количестве, достаточном для достижения желаемого эффекта. Предпочтительно суточная доза олигосахарида составляет между 0,1 и 3 г. Количество олигосахарида для включения в добавку будет выбираться соответственно в зависимости от того, как добавка будет вводиться. Например, если добавка должна вводиться два раза в сутки, каждая добавка может содержать от 0,05 до 1,5 г. Добавки должны находиться в форме, подходящей для введения новорожденным младенцам, и содержать только добавки и вспомогательные вещества, подходящие для такой возрастной группы.

Далее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано со ссылкой на следующий пример.

Пример 1

Пример композиции подходящей молочной смеси для использования в настоящем изобретении дан ниже.