Результат интеллектуальной деятельности: Метод диагностики вирусов и вирусных инфекций

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, а именно к методам определения вирусных инфекций в вирусологии для выявления и количественного определения вирусов. Кроме того, изобретение относится к способам и наборам для получения, внесения метки и применения радиодиагностических реагентов и пептидов для количественного анализа.

Методика внесения радиоактивных меток ранее применялась для пептидов при диагностике различных онкологий (аденокарциномы человека, рака груди, нейробластом, рака желудка, меланомы, опухолевых клеточных линий) (RU 2171117 С2, A61K 51/08, 2001), позволяя определять опухолевые клетки in vivo путем радиоотображения. Известны следующие радионуклиды, пригодные для радиоотображения: ¹⁴С, ³²Р, ⁶⁷Ga, ^99mTc, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹⁶⁹Yb, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re.

В радиосцинтиграфии используется метод радиойодирования, а для более качественного отображения достаточно широко применяют технеций (RU 2122431, A61K 47/48, 1998; US N5225180, A61K 51/08, 1993). Так, радиоактивный метод с применением ¹²⁵I использовали в генной инженерии при определении антител класса IgM к корантигену вируса гепатита В (SU 1642399, G01N 33/53, 1991). Однако методы получения радиойодированных пептидов в промышленных масштабах имеют свои недостатки, среди которых дороговизна и ограниченность запасов.

Хотя ^99mTc является предпочтительным радионуклидом для сцинтиграфического радиоотображения по сравнению с радиойодированием, тем не менее данный метод не использовался широко, поскольку не подходит для мечения белков, имеющих размер молекулы менее, чем 10 тыс. дальтонов (Lamberts SW, Bakker WH, Reubi JC, et al. Receptors on tumors studied with radionuclide scintigraphy. J Nucl Med. 1991; 32: 1189-1191). Из недостатков также можно отметить, что ни одно из приведенных описаний не раскрывает информации, как именно были получены меченные технецием белки - раскрывается только информация о «вазоактивном кишечном пептиде, ковалентно связанном с хелатирующей составляющей технеция или рения» (¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re).

Радиоактивный фосфор (³²Р) предлагается к выявлению фрагментов генома вируса инфекционного некроза поджелудочной железы. Недостатком данного способа авторы отмечают возможность ложноположительных результатов и высокую специфичность, нарастающую в случае измененного генотипа (RU 2508547, G01N 33/50, 2013).

Недостатком вышеописанных способов регистрации биологических объектов с помощью метки является необходимость использования опасных для здоровья человека доз радионуклидов для достоверной регистрации меченых соединений методом радиоотображения или сцинтиллятором. Более того, данные радионуклиды, введенные в живые организмы, нельзя рассматривать как нейтральные для организмов ввиду высокой радиоактивности.

В связи с этим авторами предлагается использование сверхчувствительного метода регистрации радионуклидов, в частности радиоуглерода, - ускорительной масс-спектрометрии, имеющей непревзойденную чувствительность: регистрируется один атом ¹⁴С среди 10¹⁵ атомов ¹²С. Способ регистрации изотопа методом УМС - поштучный подсчет ядер ¹⁴С - позволяет уменьшить вносимую дозу радиоактивного препарата до нейтральной для биологического объекта и не оказывать существенного воздействия на его жизнедеятельность.

Радиоуглерод (¹⁴С) описан в использовании для определения заражения желудочно-кишечного тракта Helicobacter pylori. Пациенту дают выпить препарат мочевины “Уреакапс, ¹⁴С", содержащий радиоактивный нуклид ¹⁴С. У инфицированных Helicobacter pylori под воздействием бактериального фермента уреазы происходит превращение мочевины в аммиак с высвобождением радиоактивномеченого углекислого газа, впоследствии регистрируемом в выдохе пациента (Balon H.R., Roff Е., Freitas J.E., Gates V., Dworkin H.J. Society of Nuclear Medicine Procedure Guideline for C-14 Urea Breath Test. J Nucl Med. 1998 Nov; 39(11): 2012-2014). Данный метод прост в применении и тестировании пациентов, но в последнее время редко применим в виду радиофобии и заменен на тест со ¹³С, который не связан с радиационными рисками. Однако в данном случае радиоуглеродная метка не вносится в микроорганизм, а находится в веществе, которое входит в цикл его жизнедеятельности, то есть данный метод не является прямым способом определения концентрации бактерий в желудке.

Обогащение изотопом ¹⁴С вируссодержащей жидкости (ВСЖ), предложенное нами, применяется впервые. Как и другие методы использования радиоактивной метки применение ¹⁴С требует соблюдения специальных мер безопасности и лицензирования лаборатории. Однако сильной стороной данного метода диагностики является возможность проведения подсчета сверхнизкого количества вирионов в ВСЖ, а также определение числа проникших вирусных частиц в любые ткани, инфицированных мечеными вирусами. Благодаря данному методу становится возможным углубленное изучение вирус-клеточного взаимодействия in vitro и in vivo, что особенно важно при низких концентрациях вирусов, а также исследование механизма развития высоколетальной инфекции. Разработка нового метода диагностики с использованием ускорительной масс-спектрометрии проведена на примере вирус-клеточного взаимодействия вируса гриппа А с введенной меткой радиоуглерода ¹⁴С.

Предлагается метод диагностики вирусных инфекций с применением ускорительной масс-спектрометрии, при котором количественный подсчет вируса проводится по количеству радиоуглеродной метки на оболочке вирусов, причем метка вносится без разрушения вирионов.

В качестве модельной системы использовали вирус гриппа А. Меченые вирусные частицы титровали в клетках собачьей почки Madin-Darby (MDCK) и проводили реакцию гемагглютинации (РГА). Результаты показали, что титр вируса до и после внесения метки ¹⁴С остался неизменным. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) выявила структурную целостность мембран вирионов. Таким образом, данный метод может быть применен в медицинской биотехнологии, а именно как метод определения вирусных инфекций в вирусологии, например, для выявления и идентификации вируса гриппа А, определения специфичности онколитических вирусов и др. Изучение вирус-клеточного взаимодействия на примере обогащенного изотопом ¹⁴С вируса гриппа позволяет определить сверхнизкие количества проникших вирусных частиц, способных вызвать заболевание в органах экспериментально инфицированных млекопитающих. Кроме того, данный метод применим при анализе других вирусов и пептидов, содержащих на своей поверхности белки с СООН-группами в исследованиях in vitro и in vivo.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Для внесения радиоактивной метки на поверхность вируса гриппа необходима активация карбоксильной группы белка, для чего был использован водорастворимый кросс-линкер - карбодиимид (англ. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC, EDAC или EDCI).

Связывание аминогруппы меченной ¹⁴С мочевины с карбоксильными группами белков на поверхности вируса гриппа в водной среде проводили по механизму, представленному на Фиг. 1.

Связывание углерода карбоксильной группы, расположенной на поверхностном белке вируса гриппа, с азотом первичного амина (на примере мочевины, меченной ¹⁴С, радиоуглерод обозначен как С*) протекает через активацию карбоксильной группы белка кросс-линкером EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide). Результатом реакции белковых групп и мочевины в присутствии EDC является амидная связь между белком и мочевиной и образование побочного продукта из EDC в виде изомочевины.

До внесения ¹⁴С предварительно было определено количество присутствующих на поверхности вируса гриппа A (H1N1)pdm09 (штамм A/Tomsk/273MA3/2010(H1N1pdm09) (Пат. РФ 2605317) (MA-CD1) карбоксильных групп и рассчитана концентрация вирусных частиц в пробе. Расчет количества карбоксильных групп, содержащихся на всех вирусных частицах в объеме 1 мл штамма MA-CD1 выполнили на основании общепринятых данных из литературы (Фридман Э.А., Коликов В.М. Некоторые биологические и физико-химические принципы получения убитых гриппозных вакцин // В кн.: Убитая гриппозная вакцина. Л., 1976 г. Т. 47. С. 49-53) и вычисления значения гемагглютинирующей единицы (ГАЕ):

1) на поверхности одного гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H1 может быть расположено до 10³ аминокислотных остатков, содержащих карбоксильные группы, в антигенных сайтах (наиболее вариабельные эпитопы, взаимодействующие с антителами);

2) на поверхности одной нейраминидазы вируса гриппа А субтипа H1 имеется до 25 эпитопов;

3) на вирионах сферической структуры располагается примерно 500 шипов НА и 100 шипов NA;

4) 1000 ГАЕ/мл обеспечивается (2-4) × 10¹⁰ шт/мл вирусных частиц;

5) для штамма MA-CD1 это значение составило 640 ГАЕ/мл, значит, физический титр вируса гриппа равен

и дает значение в диапазоне (128-256)×10⁸ шт/мл.

6) Из расчета 128×10⁸ шт/мл активных вирусных частиц определено число карбоксильных групп по нижней границе:

128×10⁸ шт/мл × (500 гемагглютининов на поверхности 1 шт вирусной частицы × 10³ аминокислоты на поверхности 1 шт НА + 100 нейраминидаз на поверхности 1 шт вирусной частицы × 25 аминокислот на поверхности 1 шт NA) = 6912×10¹¹ ед.

7) И из расчета 256×10⁸ шт/мл активных вирусных частиц определено число карбоксильных групп по верхней границе:

256×10⁸ шт/мл × (500 гемагглютининов на поверхности 1 шт вирусной частицы × 10³ аминокислоты на поверхности 1 шт НА + 100 нейраминидаз на поверхности 1 шт вирусной частицы × 25 аминокислот на поверхности 1 шт NA)=13824×10¹¹ ед.

Таким образом, определен диапазон концентрации карбоксильных групп на эпитопах вирусных частиц: от 6912×10¹¹ ед. до 13824×10¹¹ ед. в 1 мл ВСЖ при 640 ГАЕ/мл.

Для проведения работ по определению концентрации вируса в ВСЖ был наработан вирусный пул. Для этого использовали вируссодержащий биологический материал штамма MA-CD1. Готовили его десятикратные разведения (1-10) на стерильном физиологическом растворе. Затем каждое разведение оценивали по продукции гемагглютинина в реакции гемагглютинации (РГА) и 50% инфекционному титру на MDCK. Отобранный образец с наибольшими показателями использовали для наработки пулов на 3-х культуральных флаконах по 30 мл объема каждый. Общий пул получали путем объединения ВСЖ из трех культуральных флаконов, зараженных одинаковым разведением вируса. Вируссодержащий раствор хранили при -70°C.

Перед нанесением радиоактивной метки на вирионы требовалось очищение ВСЖ от остатков культуры клеток MDCK и других биомолекул, которые могут содержать карбоксильные группы. Для этого мы использовали простой и быстрый вариант очистки, разработанный для бактериофагов. Супернатант ВСЖ последовательно 3 раза подвергли стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры Millipor с диаметром пор 0,22 мкм. Полистирольные тубусы объемом на 15 мл (Greiner Bio-One International, Австралия) заполняли суспензией (14 мл на пробирку) и центрифугировали при 38000 g при 4°C в течение 1 ч на ультрацентрифуге Beckman Scientific Inc TL-100 Benchtop. Для удаления побочных белков всю надосадочную жидкость сливали и добавляли к осажденному вирусу 14 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ, рН 7,4). Затем энергично перемешивали и снова центрифугировали с той же скоростью и продолжительностью, что и выше. Данная процедура была повторена два раза. После второй стадии центрифугирования надосадочную жидкость сливали и добавляли к осажденному вирусу 2 мл ФСБ (рН 7,4), суспендировали и фасовали по 1 мл на пробирку, замораживали на -70°C для хранения. Этот метод обеспечивает высококачественную очистку вируса гриппа, но приводит к снижению его титра (с 640 ГАЕ/мл до 320 ГАЕ/мл в нашем образце), поскольку некоторые вирионы могут остаться на поверхности мембранных фильтров Millipor. Таким образом, после процедуры ультрацентрифугирования количество вирионов в ВСЖ составило 320 ГАЕ/мл, что соответствует (64-128) × 10⁸ шт/мл вирионов, содержащих 10¹⁴ - 10¹⁵ шт - СООН групп на эпитопах.

Затем к 1 мл ВСЖ добавили 0,5 мг/мл EDC и выдержали при комнатной температуре в течение 1 ч. После в раствор добавили препарат «Уреакапс ¹⁴С», содержащий меченую мочевину с радиоактивностью 37 кБк и вспомогательное вещество натрия пирофосфат, и инкубировали при 4°C в течение 16 ч. Затем применяли двойное ультрацентрифугирование (60 мин, 38000 g, 4°C), раствор слили, к осадку добавили 1 мл ФСБ и получили ВСЖ*.

Для анализа содержания радиоуглерода в вирусах методом ускорительной масс-спектрометрии (УМС) приготовили пробы следующим образом: 10 мкл раствора ВСЖ*, предварительно разбавленного в 100 раз (10 мкл ВСЖ* + 990 мкл ФСБ), прикапали к навескам мелкозернистого плотного графита (МПГ), не содержащего радиоактивного ¹⁴С (Таблица 1). Затем пробы подвергли процедуре зауглероживания, которую проводили на абсорбционно-каталитической установке, включающей стадии сжигания, сорбции углекислого газа на селективном сорбенте, десорбции и каталитического восстановления CO₂ водородом (РФ 2638820, G01N 33/60, 2017). После завершения процесса зауглероживания порошок, содержащий 1 мг углерода, прессовали в таблетки и направляли на УМС-анализ. Процедуре графитизации, помимо исследовательских образцов, подвергали также стандартные образцы: щавелевой кислоты (OxI) и сахарозы (ANU). Относительное содержание радиоуглерода ¹⁴С/¹³С в исследовательских образцах нормировали на содержание ¹⁴С/¹³С в стандартах, получая отношения ¹⁴С обр./¹⁴С фон. Определение содержания радиоуглерода проводили на Уникальной научной установке «Ускорительный масс-спектрометр ИЯФ СО РАН» (УНУ «УМС ИЯФ СО РАН»).

УМС-анализ показал, что в 10 мкл ВСЖ* 1,6*10¹⁰ NC*ONH₂-групп, значит, в 1 мл ВСЖ* количество меченых NC*ONH₂-групп составляет 1,6*10¹² шт.

Если в 1 мл содержится (1,28-2,56)*10¹⁰ штук вирусов и (6,9-14)*10¹⁴ штук карбоксильных групп, то метка вносится на (0,1-0,3)% групп.

На Фиг. 2 представлен снимок просвечивающей электронной микроскопии вирус содержащей жидкости, меченной радиоуглеродом.

Пример 2.

Все работы с животными одобрены Комитетом по биомедицинской этике при ФИЦ ФТМ.

Мышей линии BALB/c 6-8-недельных (масса тела 18-20 г) (питомник ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») анестезировали диэтиловым эфиром (2-4% во вдыхаемой смеси) и инфицировали интраназально 10⁴ TCID₅₀ (50% tissue culture infective dose) вируса MA-CD1, меченным ¹⁴C, в 50 мкл ФСБ.

Ежедневно в течение 8 суток проводили наблюдение за инфицированными мышами, оценивали поведение (активность, наличие аппетита), внешний вид животного, качество шерстного покрова, упитанность, наличие специфических клинических проявлений болезни (конъюнктивиты, выраженная дыхательная недостаточность, нервные проявления (парезы, параличи).

При отсутствии летальности среди экспериментально инфицированных лабораторных мышей определяли патологическое влияние вируса гриппа MA-CD1, меченного ¹⁴С, на организм экспериментальных животных по изменению массы и температуре тела животных опытных групп. Для этого получали данные о массе тела каждого животного ежедневно в течение всего срока наблюдения. Показатель изменения массы тела вычисляли как среднее арифметическое массы тела всех мышей в группе. Измерение температуры тела производили в ушном канале при помощи инфракрасного электронного термометра «DIGITAL VETERINARY THERMOMETER AccuVet.» (Mesure technology Co., LTD.) и выражали в градусах Цельсия (°C).

На 1-е, 2-е и 3-й сутки после инфицирования по три мыши умерщвляли путем декапитации. Для вирусологического и УМС анализов брали легкие, трахею, сердце, печень, головной мозг, почку, тонкую кишку, толстую кишку. Инфекционные титры вируса гриппа определяли титрованием 10%-го гомогената в культуре клеток MDCK, а также с помощью определения гемагглютинирующей единицы (ГАЕ) в 1 мл ВСЖ в реакции гемагглютинации (РГА) (Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. WHO Global Influenza Surveillance Network, 2011. 153p). Для УМС-анализа образцы биологических тканей сушили и подвергали зауглероживанию по Примеру 1.

ВСЖ*, меченную ¹⁴С, также анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

В результате инфицирования мышей линии BALB/c вирусом гриппа A/H1N1pdm09, меченным ¹⁴С, отмечались признаки гриппозного заболевания в виде снижения массы тела и гипотермии (Фиг. 3, 4).

Результаты определения инфекционного титра вируса, гемагглютинирующей активности, а также физического титра методом УМС, в органах лабораторных мышей представлены в Таблице 2.

Методом УМС меченые вирусы обнаруживаются во всех исследованных органах, наибольшая концентрация наблюдается в легких и трахее. Стоит отметить, что во всех органах, за исключением легких, наблюдается увеличение концентрации меченых вирусов на вторые сутки после инфицирования, после чего концентрация падает.

Физический титр с помощью просвечивающей электронной микроскопии измерить не удалось, т.к. количество вирусных частиц было ниже детектируемого уровня, что, в свою очередь, подчеркивает высокую точность анализа с помощью УМС.

Пример 3.

Внесение радиоуглерода на оболочку вируса гриппа A/H1N1pdm09 проводили по Примеру 1. После чего провели определение титра вируса по Примеру 1 (1,5⋅10¹² шт/мл) и определили концентрацию радиоуглерода в ВСЖ*. Из результатов УМС-анализа следует, что в 10 мкл ВСЖ* находится 1,5*10¹⁰ NC*ONH₂-групп, что соответствует содержанию радиоуглеродной метки в (0,2-0,4)% карбоксильных групп, или 100-200 меченых карбоксильных групп на один вирион. Затем провели аэрозольные эксперименты по осаждению вируса из ВСЖ* на фрагмент полиэтиленовой пленки площадью 1 см². Для этого тестируемый образец был помещен в герметичную камеру, в которую поступал аэрозоль, идущий затем на счетчик частиц. Аэрозоль генерировали пропусканием потока очищенного воздуха со скоростью 28.3 л/мин через форсунку, содержащую раствор меченого вируса. Приблизительно 10 мл меченого вируса гриппа А было распылено с помощью пневматического распылителя в течение 60 мин. Определялся средний размер частиц аэрозоля и концентрация аэрозоля в потоке, идущем через камеру с образцами. С помощью счетчика частиц было определено, что средний размер изучаемых частиц аэрозоля составил 180 нм в связи с наличием в буферном растворе солей, а концентрация аэрозоля в потоке, идущем через камеру с образцами - около 10⁵ см^-3. Через 50 дней после аэрозольных испытаний и хранения в закрытом флаконе на воздухе при комнатной температуре фрагмент полиэтилена был отправлен на зауглероживание с последующим определением содержания радиоуглерода методом ускорительной масс-спектрометрии (УМС). Зауглероживание образцов осуществляли на абсорбционно-каталитической установке по Примеру 1.

Для оценки содержания ¹⁴С на пленке полиэтилена на УМС был отправлен фрагмент пленки, не подвергшийся аэрозольной экспозиции, а также фрагмент пленки после 60-минутных аэрозольных испытаний в камере (Таблица 3).

Таким образом, по данным УМС-анализа на образце полиэтилена площадью 1 см² через 50 дней находилось 7⋅10⁶ меченых NC*ONH₂-групп, что соответствует около 35-70 тысячам вирионов.

Фиг. 1. Схема связывания углерода карбоксильной группы, расположенной на поверхностном белке вируса гриппа, с азотом первичного амина (на примере мочевины, меченной ¹⁴С, радиоуглерод обозначен как С*) через активацию карбоксильной группы белка кросс-линкером EDC.

Фиг. 2. Снимок ПЭМ вируса гриппа A (H1N1)pdm09 (штамм A/Tomsk/273MA3/2010(H1N1pdm09), меченного радиоуглеродом.

Фиг. 3. Снижение массы тела у экспериментальных животных, инфицированных вирусом гриппа A/H1N1pdm09, меченным ¹⁴С.

Фиг. 4. Изменение температуры тела у экспериментальных животных, после инфицирования вирусом гриппа A/H1N1pdm09, меченным ¹⁴С.