Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения предрасположенности к развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин, реализуемой избыточной контаминацией гексаном

Изобретение относится к области медицины, а именно к терапии и медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования токсического действия гексана на развитие вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин. Изобретение предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия гексана на здоровье мужчин, подвергающихся неблагоприятным внешним и производственным факторам.

Предлагаемое изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ наблюдения и профилактики, в зависимости от степени проявлений признаков заболевания, а, кроме того, могут быть использованы при организации санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности, гексана, обуславливающего риск формирования указанного заболевания.

Вегетососудистая дистония по гипертоническому типу подразумевает скачки систолического артериального давления (в среднем до 140 мм ртутного столба), при этом нормализация уровня давления самостоятельно приходит в норму в краткие сроки без приема сопутствующих медикаментов. Больному достаточно прилечь и расслабиться. Этот синдром опасен возникновением гипертонической болезни. При вегетососудистых нарушениях повышается мышечный тонус артерий, что является основной причиной развития гипертонии. Основными причинами возникновения заболевания являются: частые стрессы; повышенные физические нагрузки; сбои сна; гормональные сбои при беременности или климаксе; пониженный иммунитет; наличие в организме инфекций (герпес, цитомегаловирус и другие); защемление нервных волокон (происходит из-за проблем с позвоночником или черепно-мозговых травм); наследственность.

Вегетососудистая дистония (ВСД) по гипертоническому типу включает в себя ряд проявлений, возникающих в результате изменений в сосудах и их работе. Из-за появления такой ситуации внутренние органы перестают получать достаточное питание и функционируют не в полную силу. Чаще всего ВСД гипертензивного вида возникает у зрелых людей. Этот тип ВСД возникает из-за постоянного стрессового воздействия на нервную систему, которое вызывает дисфункции вегетативной части ЦНС и сердечную гипертензию.

Заболевания нервной системы, формирующиеся под воздействием средовых факторов, как правило, относятся к мультифакториальным, где экзо- и эндогенные факторы выступают как спусковой механизм для реализации генетической предрасположенности. К таким факторам можно отнести предельные ароматические углеводороды, в частности, гексан, выступающие как вредные факторы производства.

Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье, ранней диагностики прогнозирования нарушений здоровья, а также для выбора эффективной профилактики и лечения, актуальным является выделение диагностических показателей конкретных заболеваний или их предвестников у человека под воздействием гексана, которые могут использовать в качестве индикаторов нарушения ВСД по гипертоническому типу и в качестве дополнительных маркерных критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.

Из патента РФ №2299003 известен способ дифференциальной диагностики синдрома вегетативной дистонии (СВД) от воздействия комплекса токсических веществ исиндрома вегетативной дистонии (СВД) нетоксической природы. Для этого проводят тест СМИЛ или определение содержания неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) и активности пероксидазы крови. Затем рассчитывают диагностический коэффициент по одной из следующих формул: F_смил=6,11+0,1603⋅а₁-0,1193⋅а₂-0,08⋅а₃, F_пол=7,28+0,00248⋅a₄-0,02588⋅a₅, где а₁ - показатель 1 шкалы по СМИЛ, а₂ - показатель шкалы К по СМИЛ, а₃ - показатель шкалы L по СМИЛ, a₄ - содержание НЭЖК в крови, a₅ - активность пероксидазы крови, 6,11, 7,28 - константы. При значении F> константы диагностируют СВД токсической этиологии, а при значении F< константы - СВД нетоксического генеза. Проведение такой диагностики позволяет при использовании минимального числа исследований повысить точность дифференциальной диагностики.

Из патента РФ №2299004 тех же авторов известен способ диагностики синдрома вегетативной дистонии токсического генеза от воздействия комплекса химических веществ. При реализации способа проводят тесты СМИЛ и Силбергера-Ханина, или определяют содержание в крови адренокортикотропного гормона (АКТГ) и тироксина (Т₄), или проводят энцефалографию. Затем рассчитывают диагностический коэффициент по одной из следующих формул: F_смил=20,38-0,2014⋅а₁+0,1714⋅a₂+0,1039⋅a₃, F_горм=0,32-0,0303⋅a₄+0,0138⋅a₅, F_ээг=0,2+0,327⋅a₆-0,257⋅а₇-0,219⋅а₈+0,233⋅а₉, где а₁ - показатель 1 шкалы по СМИЛ, а₂ - уровень личностной тревожности по методике Спилбергера-Ханина, а₃ - показатель 3 шкалы по СМИЛ, a₄ - концентрация АКТГ, a₅ - концентрация Т4 a₆ - мощность β₂ волн в отведении Fz на ЭЭГ, а₇ - мощность β₂ волн в отведении Cz на ЭЭГ, а₈ - мощность β₁ волн в отведении Ρz на ЭЭГ, а₉ - мощность β₁ волн в отведении Fz на ЭЭГ; 20,38, 0,32 и 0,2 - константы. При значении F> константы диагностируют СВД токсической этиологии.

Однако эти два известных способа недостаточно точны из-за использования субъективных показателей, а кроме того, неприменимы для диагностики ВСД по гипертоническому типу.

Из патента РФ №2439575 известен способ дифференциальной диагностики артериальной гипертензии и нейроциркуляторной дистонии по гипертоническому типу у подростков. Сущность способа заключается в том, что у подростков исследуют венозную кровь, в эритроцитах которой определяют активность фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (А) в микромолях на 1 грамм гемоглобина (мкМ/г Hb). При выполнении условия А≤1042 диагностируют артериальную гипертензию. При выполнении условия 1042<А≤1410 диагностируют нейроциркуляторную дистонию по гипертоническому типу. Способ позволяет с высокой степенью достоверности осуществлять дифференциальную диагностику артериальной гипертензии и нейроциркуляторной дистонии по гипертоническому типу у лиц подросткового возраста.

Из уровня техники известно, что в настоящее время наиболее прогрессивные способы диагностики проявления и предрасположенности к различным заболеваниям, ассоциированных с воздействием внешнесредовых токсикантов, основаны на использовании в качестве маркеров генетических критериев.

Из патента РФ №2687731 известен способ диагностики у детей астено-вегетативного синдрома в условиях экспозиции алюминием. Согласно известному способу в пробе мочи ребенка определяют содержание алюминия. Выделяют ДНК из пробы буккального эпителия. Затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма генов ионотропного рецептора глутамата GRIA1 (rs545098) и гена глиального глутаматного транспортера SLC2A1 (rs841839). При одновременном выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена GRIA1 (rs545098) и гена SLC2A1 (rs841839), при условии одновременного обнаружения у пациента превышения содержания алюминия в моче более чем в 1,3 раза по сравнению с референтным диагностируют у ребенка наличие астено-вегетативного синдрома в условиях экспозиции алюминием. Однако указанный способ не применим для установления риска развития ВСД по гипертоническому типу у мужчин, реализуемая избыточной контаминацией ароматическими соединениями, в частности, гексаном.

Из уровня техники известна диссертационная работа «Состояние эфферентного отдела нервной системы, психологического статуса и конституционально-генетические особенности у больных с вегетативными кризами (ВК)», автор: Закирова Д.Д., Казань, 2011 г. (Медицинские Диссертации http://medical-diss.com/medicina/sostoyanie-efferentnogo-otdela-nervnoy-sistemy-psihologicheskogo-statusa-i-konstitutsionalno-geneticheskie-osobennosti-u-#ixzz5BIkC5WjL), в которой указано, что при синдроме вегетативной дисфункции возникают сочетанные изменения в эфферентном звене анимальной нервной системы и психологическом статусе, проявляющиеся в ускорении процессов эфферентации и особом (демонстративном) типе акцентуации личности. Изучался полиморфизм генов: 1) G603A гена транспортера глутамата ЕААТ; 2) rs545098 G/A гена ионотропного рецептора глутамата GLUR 1 (GRIA1); 3) rs9307959 С/Т гена ионотропного рецептора глутамата GLUR 2 (GRIA2); 4) G49S гена бета-адренорецептора ADRB1. Была выявлена достоверная связь генотипов ADRB1 GG, Glur1 GG, Glur2 СТ, Glur2 СС, ЕААТ AG, ЕААТ АА, ADRB1 SG с нарушениями вегетативного гомеостаза, влияние генотипов Glur2 и ЕААТ на тяжесть, длительность заболевания и клинические проявления. В группе с гипервентиляционными вегетативными кризами прослежена связь «неблагоприятного» вегетативного гомеостаза с генотипом ADRB1 GG, GLUR2 СС. Полученные данные свидетельствуют о наличии предрасположенности к вегетативными кризам у лиц с определенным генотипом.

Недостатком указанного способа является то, что способ позволяет характеризовать исключительно предрасположенность к развитию вегетативных кризов и связанных с ними нарушений в нервной системе, за которые ответственен ген ADRB1, при этом не оценивается предрасположенность к нарушениям вегетативной регуляции состояния тонуса сосудов, ассоциированных с модификацией гена ADRB2, реализуемая в условиях воздействия токсичных химических веществ (гексана).

Также из уровня техники известны технические решения по диагностике, использующие в качестве генетических критериев такие гены, как: С825Т гена GNB3 (патент РФ №2376372), rs5443 гена GNB3 (патент РФ №2502474). Однако все эти известные способы применимы только генетической диагностики подверженности к сердечнососудистым заболеваниям и не связаны с токсическим воздействием на организм каких-либо химических веществ.

Также известны (патент РФ №2524659) следующие генетические маркеры развития такого заболевания, как гипертензия: rs1042713 гена ADRB2 (аллель риска G); rs 4961 гена ADD1 (аллель риска Т). Однако из уровня техники неизвестна связь этих маркеров с диагностикой у мужчин ВСД по гипертоническому типу, ассоциированная с воздействием токсикантов.

Также известно, что в развитии эссенциальной артериальной гипертензии (АГ) ведущую роль отводят полиморфизму следующих генов: REN (ген ренина), АСЕ (ген ангиотензинпревращающего фермента), AGT (ген ангиотензиногена), AGTR1 (ген рецептора 1-го типа к ангиотензину II), AGTR2 (ген рецептора 2-го типа к ангиотензину II), BKR2 (ген брадикининового рецептора 2 типа), ADRB1 (ген β1-адренорецептора), ADRB2 (ген β2-адренорецептора), MTHFR (ген 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы), NOS3 (ген NO-синтазы 3 типа). Продукты этих генов обеспечивают различные этапы одной метаболической цепи. (О.В. Шевченко Генетические основы патогенеза эссенциальной артериальной гипертензии (обзор) / О.В. Шевченко, А.А. свистунов, В.Б. Бородулин, А.В. Рута, Е.Н. Бычков // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2011. - Том 7 - №1. - С. 83-87).

Известно, например, что полиморфизм гена адренергических рецепторов ADRB2 характерен для больных с аллергическими заболеваниями (см., например, Е.Я. Гречанина и др. Иммуногенетические характеристики бронхиальной астмы. 2011; 3:23-26; Ю.В. Останкова и др. Ассоциация полиморфизма промоторной области гена ФНОα с развитием атопической бронхиальной астмы. Экологическая генетика. 2005; т. III; 3:33-37).

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы установления предрасположенности к развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин в условиях избыточной контаминации гексаном, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности оценки влияния гексана на возможное развитие у мужчин вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу, за счет использования в качестве информативного критерия совокупности маркеров, в том числе генетических, а именно: уровня контаминации гексаном и наличия генетического полиморфизма в отношении совокупности генотипов GG гена ADRB2 Arg16Gly (rs1042713) и гена ADD1 Gly460Trp (rs4961).

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом определения предрасположенности к развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин, реализуемой избыточной контаминацией гексаном, характеризующаяся тем, что производят отбор пробы мочи и крови, определяют в моче содержание гексана, а в крови - содержание иммуноглобулина G (IgG) к гексану, также у указанного лица отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена ADRB2, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена ADRB2 Arg16Gly (rs1042713), устанавливая при этом для указанного гена одно из следующих его состояний: гомозиготный вариантный GG, или гомозиготный дикий АА, или гетерозиготный GA, а также проводят генотипирование полиморфизма гена ADD1, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), устанавливая при этом для указанного гена одно из следующих его состояний: гомозиготный дикий GG, или гомозиготный вариантный ТТ, или гетерозиготный GT, и при одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие генотипа GG гена ADRB2 Arg16Gly (rs1042713), наличие генотипа GG гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), при условии превышения содержания гексана в моче в 10 и более раз по сравнению с фоновым уровнем, равным 0,01 мкг/см³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану в 2 и более раз, диагностируют генетическую предрасположенность к развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин в условиях избыточной контаминации гексаном.

Приведенный технический результат обеспечивается за счет следующего.

В основу предлагаемого способа положена генодиагностика предрасположенности к вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу, реализуемая предельными ароматическими углеводородами (гексаном), когда сочетаются генотипы кандидатных генов: вариантный генотип GG гена бета-адренорецептора ADRB2 Arg16Gly rs1042713, а также типичный генотип GG гена аддуцина ADD1 Gly460Trp rs4961. При этом последний через "молчание" натриевого-калиевого насоса опосредует начало процесса апоптоза (образование комплекса "(Na+, K+)-АТФазы - фосфатидилсерин") и дальнейшей коллагенизации с формированием атеросклероза, а измененный генотип адренорецептора ADRB2 приводит к избыточной контаминации одноименного лиганда (адреналина), к симпатикоэргии и повышению тонуса сосудов (дистония по гипертоническому типу). Условия дополнительной контаминации предельными углеводородами усиливают экспрессию катехоламинов, усугубляя гипертонус сосудов.

Ген ADRB2 кодирует бета-2-адренергический рецептор - ионный белковый канал, встроенный в цитоплазматическую мембрану клетки, имеющий высокую степень сродства к адреналину и обеспечивающий повышение или понижение активности иннервируемой ткани или органа (https://helix.ru/kb/item/18-043). Участок ДНК в кодирующей белок области гена ADRB2, в которой происходит замена гуанина (G) на аденин (А), называется генетическим маркером G46A. Если в данной позиции находится гуанин (G), такой вариант гена обозначается как G-аллель, а если аденин (А) - А-аллель. В результате данной замены в аминокислотной последовательности белка ADRB2 в позиции 16 аргинин заменяется на глицин (Arg16Gly). Возможные генотипы: GG - гомозиготный вариантный; GA - гетерозиготный; АА - гомозиготный дикий.

Известна ассоциация этого гена с заболеваниями: бронхиальная астма, метаболический синдром, гипертоническая болезнь.

Ген ADD1 кодирует альфа-субъединицу белка аддуцина (adducin) (https://helix.ru/kb/item/1358). Аддуцин - гетеродимерный белок цитоскелета клетки, состоящий из а- и b-субъединиц. Название adducin происходит от латинского adducere и означает "объединять". Он способствует прикреплению белка спектрина к актину, связывается с кальмодулином, является субстратом для протеинкиназ С и А, а также регулирует активность (Na+, K+)-АТФазы (натрий-калиевой аденозинтрифосфатазы), участвующей в переносе ионов натрия и калия через мембрану эпителия почек, тем самым поддерживается баланс натрия. Нарушение ее работы может быть причиной гипертонии.

Заболевания нервной системы (далее - ЦНС), формирующиеся под воздействием средовых факторов, как правило, относятся к мультифакториальным, где экзо- и эндогенные факторы выступают как спусковой механизм для реализации генетической предрасположенности. К таким факторам можно отнести и предельные углеводороды, например, гексан, выступающие как вредные факторы производства, воздействуя на здоровье работников. Предельные углеводороды в качестве вредных производственных факторов оказывают негативное действие на ЦНС, что связанно с их высокой липофильностью и способностью оказывать наркотическое действие, приводя к тошноте, головной боли, головокружению, а хроническое действие приводит к полиневропатии с онемением конечностей, мышечной слабостью и помутнением рассудка [U.S. Department of Health and Human Services. Hazardous Substances Data Bank (HSDB, online database). National Toxicology Information Program, National Library of Medicine, Bethesda, MD. 1993]; [U.S. Environmental Protection Agency. Integrated Risk Information System (IRIS) on n-Hexane. National Center for Environmental Assessment, Office of Research and Development, Washington, DC. 1999], а также прямое воздействие на эндотелий сосудов, приводя к формированию атеросклероза и дальнейшей гипертонизации, так и опосредованное регуляторное через вегетативную нервную систему приводя к симпатико-парасимпатической дисрегуляции.

Что касается нозологии, то, учитывая характер поражений вегетативной системы, наиболее целесообразным видится отнесение надсегментарных расстройств к рубрикам классификации болезней МКБ-10, как кода G90 (расстройства вегетативной нервной системы: G90.8 - другие расстройства вегетативной нервной системы, G90.9 - расстройства вегетативной нервной системы неуточненное), F3 - (аффективные расстройства) и F4 (невротические, связанные со стрессом и соматоформные расстройства). В ряде случаев ВСД шифруется в рубриках F45.0 - F45.9: соматизированные нарушения; не дифференцированные соматоформные нарушения, ипохондрические нарушения, соматоформная вегетативная дисфункция; хронические соматоформные болевые нарушения; другие соматоформные нарушения.

Сегодня ВСД или ее варианты нейроциркуляторная дистония (НЦД) (в последнем варианте подчеркивается преимущественное нарушение функций сердечно-сосудистой системы) рассматривается в рамках более широкого круга патологий - психосоматических расстройств и соматических нарушений. Патогенез психосоматических заболеваний отличается сложностью и многогранностью. В нем оказываются задействованными такие важные структуры центральной нервной системы, как гипоталамо-гипофизарная и лимбическая системы, регуляторные центры коры больших полушарий, надпочечные железы и т.д.

Заболевания нервной системы относятся к одним из наиболее распространенных проявлений производственно обусловленной патологии, частота встречаемости которых варьирует в зависимости от стажа и вредности условий труда. Полиморфность генов кандидатов также оказывает существенный вклад в их реализацию, являясь, в том числе, неотъемлемой частью диагностики оценки риска ранних развитий вегетососудистой дистонии.

По результатам анализа полиморфизма генов кандидатов между исследуемыми группами наблюдения и сравнения, где в роли действующего фактора выступают предельные углеводороды (гексан), были установлены значимые различия между частотами генотипов и аллелей: увеличение гомозиготного вариантного GG генотипа гена ADRB2 Arg16Gly rs1042713, кодирующего адренергический рецептор бета, на 75% (р<0,05), увеличение частоты GG генотипа гена ADD1 Gly460Trp rs4961, кодирующего белок аддуцин, на 40% (р<0,05), что в условиях избыточной экспозиции биосред человека предельными углеводородами может формировать риск возникновения патологии сосудистой системы, в основе которой лежит нарушение симпатической регуляции.

Для оценки уровня контаминации мочи рабочих-мужчин, занятых на предприятии по переработке калиевой руды, где в качестве детергента используются предельные углеводороды (гексан), проводили исследования проб мочи работников.

Полиморфизм генов кандидатов определялся методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с аллельной дискриминацией на приборе BioRad CFX96 (Сингапур) с использованием комплекта реагентов компании ЗАО «Синтол» (Москва).

Оценка равновесия распределения частот генотипов в исследуемых группах по всем кандидатным генам показала соответствие закону распределения Харди-Вайнберга, что позволило использовать модели наследования для оценки вклада генотипов и/или аллелей в развитие нарушений, ассоциированных с регуляцией тонуса сосудов.

Результаты химического анализа проб мочи на содержание предельных углеводородов (гексан) работающих мужчин с патологией вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу и без указанной патологии, в зависимости от стажа работы, приведены в таблице 1.

Анализ полученных результатов (таблица 1) показал, что с увеличением стажа работы на предприятии по переработке калиевой руды у работающих с ВСД по гипертоническому типу увеличивается содержание предельных углеводородов в моче относительно нестажевых работников и работников без патологии (в 1,5-2 раза).

Выявление и оценка параметров линейной зависимости «изменения концентрации гексана в моче работающих - в зависимости от стажа работы на предприятии, позволили получить адекватные модели зависимости (F - критерий Фишера ≥195, р≤0,05) между концентрацией гексана (r - коэффициент корреляции = 0,63) в моче работающих группы наблюдения в зависимости от стажа работы.

По результатам анализа полиморфизма генов кандидатов между исследуемыми группами мужчин (с ВСД по гипертоническому типу и без), где в роли действующего фактора выступает гексан, были установлены значимые различия между частотами генотипов и аллелей: увеличение генотипа GG гена ADRB2 Arg16Gly rs1042713 на 75%; увеличение частоты GG генотипа гена ADD1 Gly460Trp rs4961 на 40%; (р<0,05).

Верифицировано в условиях моделирования, что предрасполагающими факторами возникновения нарушений регуляции тонуса сосудов выступают аллели и генотипы генов: генотип GG гена ADRB2 Arg16Gly rs1042713, наследуемый по рецессивному типу (р<0,05), согласно общей модели (OR - отношение шансов = 2,22; CI - доверительный интервал: 1,02-4,82; р<0,05) наследования; G аллель и GG генотип гена ADD1 Gly460Trp rs4961, наследуемый по доминантному типу (р<0,005) согласно мультипликативной (OR=2,94; CI: 1,46-5,94; р<0,005) и общей (OR=3,14; CI: 1,44-6,86; р<0,005) моделям.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб буккального эпителия, крови и мочи, а также стандартных методик изучения иммунологических и генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта - гексана, именно в моче обусловлено тем, что моча является средой преимущественной элиминации из организма данного элемента, имеющего реферируемые уровни в данной биологической среде.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции проведения генотипирования полиморфизма указанных генов ADRB2 и ADD1.

Таким образом, при оценке влияния гексана на возможность развития вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин в предлагаемом способе рекомендуется использовать совокупность следующих критериев: наличие генотипа GG гена ADRB2 Argl6Gly (rsl 042713), наличие генотипа GG гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), при условии превышения содержания гексана в моче в 10 и более раз по сравнению с фоновым уровнем, равным 0,01 мкг/см³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану в 2 и более раз.

Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфными вариантами указанных генов, тропных к вегетативной нервной системе и к артериальной гипертензии, и одновременно с количеством химического токсиканта - гексана в моче, при превышении IgG к гексану в 2 и более раз и уровня содержания адреналина - маркера вегетативных нарушений - выше диапазона нормы, равной 10-100 пг/мл, и будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния гексана на риск развития вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Выбирают производственное предприятие, характеризующееся наличием химического токсиканта - гексана. Исследования были проведены на мужском контингенте рабочих, занятых на предприятии по переработке калиевой руды, на территории Пермского края, работающих в условиях содержания в воздухе рабочей зоны гексана на границе уровня ПДКр.з.

2. На указанном предприятии производят отбор работников-мужчин одной этнической популяции. Затем производят отбор пробы крови в специальные пробирки для выделения сыворотки и определения содержания уровня адреналина и IgG к гексану.

Содержание гексана в моче определяют методом анализа равновесной паровой фазы на газовом хроматографе «Кристалл-5000» согласно МУК 4.1.764-99. В качестве фонового значения содержания гексана в моче был принят показатель равный 0,01 мкг/см³.

Содержание адреналина в крови определяют по методике, изложенной в инструкции Adrenaline FAST ELISA («ДРГ Техсистемс», Германия, EIA4306) (иммуноферментный анализ для количественного определения in vitro адреналина (эпинефрина) в моче, плазме крови). В качестве физиологического диапазона содержания адреналина был принят диапазон, равный 10-100 пг/мл (Н. Тиц, 2003).

3. Также у рабочих отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки), причем забор осуществляют сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации после предварительного полоскания полости рта водой. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК генов: ADRB2 Arg16Gly (rs1042713) и ADD1 Gly460Trp (rs4961).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранного гена (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма генов ADRB2 Arg16Gly (rs1042713) и ADD1 Gly460Trp (rs4961) ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты, необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена ADRB2 в исследуемом участке ДНК Argl6Gly (rsl042713) и гена ADD1 в исследуемом участке ДНК Gly460Trp (rs4961) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или дикое гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние генов ADRB2 Argl6Gly (rsl042713) и ADD1 Gly460Trp (rs4961).

4. И при одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие генотипа GG гена ADRB2 Argl6Gly (rs 1042713), наличие генотипа GG гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), при условии превышения содержания гексана в моче в 10 и более раз по сравнению с фоновым уровнем, равным 0,01 мкг/см, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану в 2 и более раз и уровня содержания адреналина - маркера вегетативных нарушений - выше диапазона нормы, равной 10-100 пг/мл, диагностируют генетическую предрасположенность к развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин в условиях избыточной контаминации гексаном.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено обследование 115 работников-мужчин предприятия по добыче калийных удобрений в возрасте 42,19±3,46 лет, подверженных воздействию предельных углеводородов (гексан), используемых на производстве калийных удобрений.

Группу наблюдения составили 67 мужчин в возрасте 43,3±4,6 лет, имеющие диагноз вегетососудистая дистония по гипертоническому типу (тахикардия, бледность кожи, эпизоды повышения артериального давления, ослаблении сокращений стенок кишечника (перистальтика), озноб, ощущение тревоги).

Группа сравнения включала 48 мужчин в возрасте 46,3±3,2 года лет, без заболеваний нервной системы.

Для оценки контаминации биосред гаптенами, было выполнено химико-аналитическое исследование, которое включало определение в моче работников предельных углеводородов (гексан) методом анализа равновесной паровой фазы на газовом хроматографе «Кристалл-5000» согласно МУК 4.1.764-99.

Определялся уровень адреналина, методом иммуноферментного анализа.

Полиморфизм генов диагностических маркеров: ADRB2 Arg16Gly (rs1042713) и ADD1 Gly460Trp (rs4961) у обследуемых мужчин, определялся методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием комплекта реагентов компании ЗАО «Синтол» на приборе «BioRAD CFX96».

Статистическая обработка данных осуществлялась в программе Statistica 10.0, с определением:

- для иммунологических показателей: N - число, Х - среднее, SE - стандартная ошибка, t - критерий Стьюдента, U - критерий Манна-Уитни, Н - Краскела-Уолиса, р - уровень значимости;

- для генетических показателей: мультипликативная и общая модели наследования с оценкой - HWE - равновесие Харди-Вайнберга, F - критерий Фишера, r - коэффициент корреляции, доминантная и рецессивная модели наследования, OR - оценка шансов, СГ 95% доверительный интервал, р - уровень значимости.

Установлено что в 100% образцов мочи группы наблюдения выявлено присутствие предельных углеводородов (гексан) в 10 и более раз превышающую норму. В группе сравнения наличие гексана в моче или не выявлено или результаты были на уровне или менее 0,01 мкг/мл.

В качестве маркера, доказывающего, что у рабочего возникло развитие вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу под влиянием гексана, использовали уровень адреналина в пробе крови.

Адреналин представляет собой гормон, который синтезируется мозговым веществом надпочечников. Вырабатывается организмом из тирозина - аминокислоты, поступающей с пищей. Адреналин также образуется при возбуждении вегетативной нервной системы. По химическому строению адреналин относится к катехоламинам. Адреналин является одним из основных регуляторов вегетативной нервной системы, вызывает сужение сосудов органов брюшной полости, кожи и слизистых оболочек; в меньшей степени сужает сосуды скелетной мускулатуры, но расширяет сосуды головного мозга, повышает артериальное давление.

По результатам иммуноферментного анализа установлены различия между группами по содержанию адреналина (р<0,05), избыточный уровень которого сопровождал нарушения вегетативной нервной системы в виде вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин.

У мужчин производства по добыче калийных солей, имеющих патологию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу и избыточность контаминации предельными углеводородами (гексаном) (группа наблюдения), оказывающими негативное воздействие, были выявлены значимые различия в уровне адреналина.

В таблице 2 приведены данные по результатам обследования мужчин из группы наблюдения и группы сравнения.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что при сочетании избыточного содержания гексана в моче, превышающего фоновый в 10 и более раз, (фоновый 0,01 мкг/мл), при наличии вариантного генотипа GG гена ADRB2 Argl6Gly (rs 1042713), при наличии дикого генотипа GG гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), а также при наличии специфических антител к гексану (IgG) на уровне, превышающем в 2 и более раз его норму (норма 0,1 у.е.), и уровня содержания адреналина - маркера вегетативных нарушений - выше диапазона нормы, равной 10-100 пг/мл, оцениваем развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу, реализуемую при избыточной контаминации гексаном (пациенты 1-4), что подтверждает клинически верифицированный диагноз «вегетососудистая дистония по гипертоническому типу», и на что указывает высокий уровень адреналина в крови, выше верхней границы физиологической нормы.

Однако даже при высоком содержании гексана в моче и высоком уровне IgG, но при другом генотипе ТТ гена ADD1 Gly460Trp (rs4961) (пациент 10), уровень адреналина не превышает верхнюю границу нормы и у пациента отсутствует предрасположенность к проявлению ВСД по гипертоническому типу.

У пациентов 5-9, 11 хотя и присутствует повышенное содержание гексана в моче, но отсутствуют все указанные диагностические критерии в комплексе, точно также как и при отсутствии гексана в моче (пациенты 12-14), риск развития возникновения ВСД по гипертоническому типу невысок, на что указывает показатель уровня адреналина в крови, который находится в пределах физиологической нормы. Адреналин относится к катехоламинам - это группа сходных гормонов, вырабатываемых мозговым веществом надпочечников. Адреналин также образуется при возбуждении вегетативной нервной системы (в синапсах нервных волокон). Содержание адреналина значительно возрастает на короткое время только при стрессах и его экспрессия сопровождается спазмом сосудов и повышением артериального давления, что позволяет отнести его повышение к маркерам ВСД по гипертоническому типу.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых диагностических критериев обеспечивается его назначение.

Пример 1. Пациент, 42 года, русский, диагноз - ВСД по гипертоническому типу. Установлено наличие вариантного генотипа GG гена ADRB2 Arg16Gly (rs1042713), наличие дикого генотипа GG гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), а также избыточный уровень содержания гексана в моче 0,17 мкг/см³ (при норме <0,01 мкг/см³). Содержание IgG к гексану в крови - маркера избыточного воздействия гексана, был выше нормальных значений - 0,26 у.е. (при норме 0-0,1 у.е.). Уровень содержания адреналина в крови маркера вегетативных нарушений 117,9 пг/мл, т.е. выше диапазона нормы (10-100 пг/мл). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к гексану в крови и избыточное содержание в крови адреналина, чрезмерный уровень которого сопровождает нарушения вегетативной регуляции тонуса сосудов в виде вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу, что на фоне вариантного генотипа GG гена ADRB2 Arg16Gly (rs1042713), кодирующего экспрессию адреналового рецептора, а также дикого генотипа GG гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), сохраняющего рецептор ((Na+, K+)-АТФаза) в покое и клетка при взаимодействии рецептора фермента (Na+, K+)-АТФазы с фосфатидилсерином уходит в апоптоз, заменяясь на соединительнотканную, с дальнейшим формированием атеросклероза и повышения АД, что в совокупности формирует избыточный спазм сосудов, вызывая вегетативную дисфукцию в условиях дополнительной стимуляции предельными углеводородами (гексаном) у данного пациента. Диагноз ВСД по гипертоническому типу был подтвержден проведенной кардиоинтервалографией (КИТ).

Это говорит о том, что, согласно предлагаемому способу, у данного пациента состояние оценивается, как реализация генетического риска развития у мужчин вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу, ассоциированной избыточной контаминацией гексаном.

Пример 2. Пациент, 31 год, русский, ВСД по гипертоническому типу отсутствует. Установлено наличие гетерозиготного генотипа AG гена ADRB2 Arg16Gly (rs1042713), наличие гетерозиготного генотипа GT гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), а также превышение фонового уровня содержания гексана в моче 0,019 мкг/см³ (при норме <0,01 мкг/см³), менее чем в 10 раз. Содержание IgG к гексану в крови - маркера избыточного воздействия гексана - 0,12 у.е. (при норме 0-0,1 у.е.), т.е. близко к нормальным значениям. Уровень содержания адреналина в крови - маркера вегетативных нарушений 55,9 пг/мл, т.е. в диапазоне нормы (10-100 пг/мл). Таким образом, на фоне гетерозиготных генотипов AG гена ADRB2 Arg16Gly (rs1042713) и GT гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), установлено значение уровня IgG к гексану в крови не превышающее нормальный уровень более чем в 2 раза, а также физиологическое содержание адреналина в крови, что сопровождается отсутствием клинических проявлений в виде ВСД по гипертоническому типу у данного пациента.

Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить предвестники возникновения предрасположенности к развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин, ассоциированные с влиянием гексана, по заявляемым генетическим критериям, содержанию гексана в моче и по уровню IgG к гексану, и начать заблаговременно профилактические мероприятия.