Результат интеллектуальной деятельности: НОВЫЕ ФЕРМЕНТЫ И СИСТЕМЫ CRISPR

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ И ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ

[001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявке на патент США № 62/181663, поданной 18 июня 2015 года и 62/245264, поданной 22 октября 2015 года.

[002] Все документы, цитируемые или упоминаемые в процитированных в настоящей заявке документах, вместе с любыми инструкциями производителей, описаниями, характеристиками и технологической картой продукта, для любого из продуктов, упомянутых в настоящем описании или в любом документе, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, включены в настоящее описание в качестве ссылки и могут быть использованы при осуществлении изобретения. Более конкретно, все упоминаемые документы включены в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждый отдельный документ был конкретно и индивидуально указан как включенный в качестве ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ О ФЕДЕРАЛЬНОМ СПОНСИРОВАНИИ ИССЛЕДОВАНИЯ

[003] Настоящее изобретение было сделано при поддержке правительственных грантов под номерами MH100706, MH110049, DK097768, GM10407, присужденными Национальным Институтом Здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на изобретение.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[004] Настоящее изобретение относится к системам, способам и композициям, применяющимся для контроля экспрессии генов, включая нацеливание на последовательности, такое как изменение транскрипции генов или редактирование нуклеиновых кислот, в котором могут использоваться векторные системы, относящиеся к коротким палиндромным повторам, регулярно расположенным кластерами (CRISPR), и их компонентам.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[005] Последние достижения в способах секвенирования генома и анализа получаемых последовательностей существенно увеличили скорость каталогизации и картирования генетических факторов, ассоциированных с широким спектром биологических функций и заболеваний. Технологии направленного внесения изменений в геном необходимы для систематического поиска генетических вариаций, являющихся причинами заболеваний, а также для развития синтетической биологии, применений в биотехнологии и медицине. Несмотря на существование различных техник редактирования генома, таких как сконструированные цинковые пальцы, подобные активатору транскрипции эффекторы (TALE), хоминг-мегануклеазы, остается потребность в новых технологиях инженерии генома, в которых используются новейшие стратегии и молекулярные механизмы, и которые являются доступными, легко устанавливаемыми, масштабируемыми и способными к нацеливанию на множественно положений в пределах эукариотического генома. Это может обеспечить основной ресурс для новых подходов в генной инженерии и биотехнологии.

[006] Системы адаптивного иммунитета бактерий и архей CRISPR-Cas демонстрируют огромное разнообразие белкового состава и архитектуры геномных локусов. Локусы системы CRISPR-Cas включают более 50 семейств генов, и не существует строго универсальных генов, что указывает на быструю эволюцию и чрезвычайное разнообразие архитектуры локусов. На данный момент с использованием комплексного подхода примерно 395 профилей 93 Cas-белков были исчерпывающе идентифицированы как гены cas. Для классификации систем CRISPR-Cas используют профили генов и характерные особенности архитектуры локусов. В последней предложенной классификации системы CRISPR-Cas в самом общем виде разделены на два класса: системы 1 класса состоят из многосубъединичных эффекторных комплексов, а в системах 2 класса эффекторный модуль состоит из одного белка, например, белка Cas9 (фиг.1A и 1B). Новые эффекторные белки, ассоциированные с системами CRISPR-Cas 2 класса, могут служить мощными инструментами для геномной инженерии и прогнозирование предполагаемых новых эффекторных белков и их конструирование и оптимизация представляются важными.

[007] Цитирование или указание на какой-либо документ в настоящей заявке не является признанием того, что такой документ доступен в качестве уровня техники для настоящего изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[008] Существует острая необходимость разработки альтернативных и надежных систем и техник для нацеливания на нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды (например, ДНК или РНК, а также любые их гибриды и производные) с широким спектром практических применений. Настоящее изобретение направлено на решение этой задачи и имеет ряд связанных с этим преимуществ. Обогащение существующего репертуара технологий нацеливания на представляющую интерес последовательность ДНК или РНК (таргетинга) в геноме и эпигеноме новыми системами, представленными в настоящем описании, может привести к преобразованиям не только в изучении, но и в изменении или редактировании определенных участков-мишеней путем прямого обнаружения, анализа и модификации. Чтобы эффективно использовать рассматриваемые в данной заявке системы геномного или эпигеномного нацеливания на ДНК или РНК без неблагоприятных последствий, важно понимать основные принципы инженерии и оптимизации этих инструментов нацеливния на ДНК или РНК.

[009] Настоящее изобретение относится к способу модификации последовательностей, ассоциированных с локусом-мишенью или находящихся непосредственно в нем, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей эффекторный белок локусов системы CRISPR-Cas типа V и один или более компонентов-нуклеиновых кислот, где эффекторный белок формирует комплекс с одним или более компонентами-нуклеиновыми кислотами и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию последовательностей, ассоциированных с представляющим интерес локусом или находящихся непосредственно в нем. В предпочтительном варианте осуществления модификация представляет собой внесение разрыва цепи. В предпочтительном варианте осуществления последовательности в локусе-мишени, ассоциированные с ним или находящиеся непосредственно в нем, включают ДНК и эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-A, или локусами CRISPR-Cas подтипа V-B, или локусами CRISPR-Cas подтипа V-C.

[0010] Будет понятно, что термины "фермент Cas", "фермент CRISPR", "белок CRISPR", "белок Cas" и "CRISPR Cas" используются обычно взаимозаменяемо и в каждом случае, когда они упоминаются в настоящем описании, обозначают новые эффекторные белки CRISPR, описанные далее в настоящем описании, если иное не следует из контекста, в частности при конкретном упоминании Cas9. Эффекторные белки CRISPR, описанные в настоящем описании, предпочтительно являются эффекторными белками C2c1 или C2c3.

[0011] Изобретение относится к способу модификации последовательностей, ассоциированных с или находящихся в представляющем интерес локусе-мишени, причем способ включает доставку в указанные последовательности, ассоциированные с или находящиеся в локусе не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов C2c1 или C2c3 и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок C2c1 или C2c3 образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию последовательностей, ассоциированных с или находящихся в представляющем интерес локусе-мишени. В предпочтительном варианте осуществления модификация представляет собой внесение разрыва цепи. В предпочтительном варианте осуществления эффекторный белок C2c1 или C2c3 образует комплекс с одним компонентом, являющимся -нуклеиновой кислотой, преимущественно сконструированным способами инженерии или не встречающимся в природе компонентом, являющимся нуклеиновой кислотой. Индукция модификации последовательностей, ассоциированных с или находящихся в представляющем интерес локусе-мишени, может направляться комплексом эффекторный белок C2c1 или C2c3-нуклеиновая кислота. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным компонентом, являющимся нуклеиновой кислотой, является РНК CRISPR (cr-RNA). В предпочтительном варианте осуществления компонентом, являющимся нуклеиновой кислотой, является зрелая cr-РНК или направляющая РНК, где зрелая cr-РНК или направляющая РНК содержит спейсерную последовательность (или направляющую последовательность) и содержащую прямые повторы последовательность либо ее производные. В предпочтительном варианте осуществления спейсерная последовательность или ее производное включает последовательность-затравку, причем последовательность-затравка имеет критическое значение для распознавания и/или гибридизации с последовательностью локуса-мишени. В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности, ассоциированные с или находящиеся в целевом представляющем интерес локусе, содержат линейную или суперспиральную ДНК.

[0012] Аспекты изобретения связаны с образованными эффекторным белком C2c1 или C2c3 комплексами, включающими один или более компонентов, являющихся не встречающимися в природе, или сконструированными способами инженерии, или модифицированными, или оптимизированными нуклеиновыми кислотами. В предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент, являющийся нуклеиновой кислотой, комплекса может содержать направляющую последовательность, связанную с содержащей прямые повторы последовательностью, где содержащая прямые повторы последовательность содержит одну или более шпилечных структур или оптимизированные вторичные структуры. В определенных вариантах осуществления изобретения прямые повторы имеют длину минимум 16 нуклеотидов, а также одну шпилечную структуру. В следующих вариантах осуществления изобретения прямые повторы могут иметь длину более 16 нуклеотидов, предпочтительно 17 нуклеотидов, а также одну или более шпилечных структур или оптимизированных вторичных структур. В предпочтительном варианте осуществления изобретения прямой повтор может быть модифицирован таким образом, чтобы он содержал один или более связывающих белки РНК-аптамеров. В предпочтительном варианте осуществления изобретения один или более аптамеров могут быть включены в качестве части оптимизированной вторичной структуры. Такие аптамеры могут быть способны к связыванию белка оболочки бактериофага. Белок оболочки бактериофага может быть выбран из группы, включающей Qβ, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ϕСb5, ϕСb8r, ϕСb12r, ϕСb23r, 7s и PRR1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используется белок оболочки бактериофага MS2. Изобретение также относится к компонентам вышеназванных комплексов, являющимся нуклеиновыми кислотами длиной 30 или более, 40 или более, а также 50 или более нуклеотидов.

[0013] Изобретение относится к способам редактирования генома, причем способ включает два или более этапа нацеливания на эффекторный белок C2c1 или C2c3 и расщепления. В определенных вариантах осуществления изобретения первый этап включает расщепление эффекторным белком C2c1 или C2c3 последовательностей, ассоциированных с локусом-мишенью, находящимся на большом расстоянии от последовательности-затравки, в то время как второй этап включает расщепление эффекторным белком C2c1 или C2c3 последовательностей в локусе-мишени. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения первый этап нацеливания эффекторного белка C2c1 или C2c3 приводит к инсерции-делеции, в то время как второй этап нацеливания эффекторного белка C2c1 или C2c3 может реаприроваться посредством направляемой гомологией репарацией (HDR). В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения один или более этапов нацеливания эффекторного белка C2c1 или C2c3 приводит к образованию разрыва с липкими концами, который может быть репарирован вставкой матрицы репарации.

[0014] Изобретение относится к способам редактирования или модификации генома, ассоциированных с представляющим интерес локусом-мишенью или проводимых непосредственно в нем, где способ подразумевает введение комплекса эффекторного белка C2c1 или C2c3 в любой желательный тип клеток, прокариотических или эукариотических клеток, в результате чего комплекс эффекторного белка C2c1 или C2c3 эффективно функционирует, встраивая ДНК-вставку в геном эукариотической или прокариотической клетки. В предпочтительных вариантах осуществления клетка представляет собой эукариотическую клетку, а геном представляет собой геном млекопитающих. В предпочтительных вариантах осуществления встраивание ДНК-вставки облегчается с помощью механизмов вставки гена, основанных на негомологичном соединении концов (НСК- NHEJ). В предпочтительных вариантах осуществления ДНК-вставка представляет собой экзогенно введенную ДНК-матрицу или матрицу репарации. В одном предпочтительном варианте осуществления экзогенно введенную ДНК-матрицу или матрицу репарации доставляют с комплексом эффекторного белка C2c1 или C2c3 или одним компонентом или полинуклеотидным вектором для экспрессии любого компонента комплекса. В еще более предпочтительном варианте эукариотическая клетка представляет собой не делящуюся клетку (например, не делящуюся клетку, в которой редактирование генома посредством гомологичной репарации (HDR) является особенно сложным). В предпочтительных спочсобах редактирования генома в клетках человека эффекторные белки C2c1 или C2c3 могут включать, но не ограничиваются ими, конкретные типы эффекторных белков C2c1 или C2c3, описанных в настоящем описании.

[0015] Изобретение также относится к способу модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов С2с1 и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок С2с1 образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновой кислотой, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В предпочитаемом варианте осуществления изобретения такой модификацией является разрыв цепи.

[0016] Изобретение также относится к способу модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов С2с3 и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок С2с3 образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновой кислотой, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В предпочитаемом варианте осуществления изобретения такой модификацией является разрыв цепи.

[0017] В таких способах представляющий интерес локус-мишень может являться частью молекулы ДНК. В таких способах представляющий интерес локус-мишень может быть частью молекулы ДНК in vitro.

[0018] В таких способах представляющий интерес локус-мишень может быть частью молекулы ДНК в клетке. Такая клетка может быть как прокариотической, так и эукариотической. Такая клетка может быть клеткой млекопитающего. Такая клетка млекопитающего может быть клеткой отличного от человека примата, клеткой коровы, свиньи, грызуна или мыши. Такая клетка может быть клеткой домашней птицы, рыбы или креветки. Такая клетка может быть растительной клеткой, полученной из таких растений как маниок, кукуруза, сорго, пшеница или рис. Такая клетка растения может также быть клеткой водоросли, дерева или овоща. Модификации, внесенные в такую клетку в соответствии с настоящим изобретением, могут быть выполнены таким образом, что такая клетка и ее потомки будут изменены с целью улучшить производство биологических продуктов, таких как антитела, крахмал, спирт или другой желаемый продукт клетки. Такие внесенные в клетку модификации в соответствии с настоящим изобретением могут быть способны приводить к тому, что клетка или ее дочерние клетки будут иметь свойство производить измененный продуцируемый биологический продукт.

[0019] Клетка млекопитающего может быть клеткой отличного от человека млекопитающего, например, клеткой примата, коровы, овцы, свиньи, собаки, грызуна, представителя семейства Leporidae, клеткой такого млекопитающего как обезьяна, клеткой коровы, овцы, свиньи, собаки, кролика, крысы или мыши. Клетка может быть эукариотической клеткой не являющегося млекопитающим животного, такого как домашняя птица (например, курицы), позвоночной рыбы (например, лосося) или беспозвоночного (например, устрицы, двустворчатого моллюска, лобстера, креветки). Такая клетка может быть также клеткой растения. Такая растительная клетка может быть получена из однодольного растения или двудольного растения, а также сельскохозяйственного растения или злака, такого как маниок, кукуруза, сорго, соя, пшеница, овес или рис. Такая растительная клетка может быть также быть клеткой водоросли, дерева или растения-продуцента, фрукта или овоща (например, дерева такого как цитрусовые деревья, например, апельсина, грейпфрута или лимона; персика или нектарина; яблони и груши; орехоносного дерева, такого как миндаль, грецкий орех или фисташка; пасленового растения; растения рода Brassica; растения рода Lactuca; растения рода Spinacia; растения рода Capsicum; хлопка, табака, спаржи, моркови, капусты, брокколи, цветной капусты, томата, баклажана, перца, латука, шпината, клубники, черники, малины, ежевики, винограда, кофе, какао и т.д.).

[0020] Изобретение также относится к сконструированному способами инженерии белку CRISPR, комплексу, композиции, системе, вектору, клетке или клеточной линии по изобретению для использования в модификации представляющего интерес локуса в клетке. Указанная модификация предпочтительно включает приведение клетки в контакт с любой из вышеописанных композиций или любой из вышеописанных систем. Также изобретение относится к применению сконструированного способами инженерии белка CRISPR, комплекса, композиции, системы, вектора, клетки или клеточной линии по изобретению для изготовления лекарственного средства для модификации представляющего интерес локуса в клетке.

[0021] Также изобретение относится к сконструированному способами инженерии белку CRISPR, комплексу, композиции, системе, вектору, клетке или клеточной линии по изобретению для применения в модификации представляющего интерес локуса в клетке. Также изобретение относится к применению сконструированного способами инженерии белка CRISPR, комплекса, композиции, системы, вектора, клетки или клеточной линии по изобретению при получении лекарственного средства для модификации представляющего интерес локуса в клетке. Указанная модификация предпочтительно включает приведение клетки в контакт с любой из вышеописанных композиций или любой из вышеописанных систем.

[0022] Изобретение относится к способу модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа IV и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, причем после связывания указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В предпочитаемом варианте осуществления изобретения такой модификацией является разрыв цепи.

[0023] В предпочтительном варианте осуществления представляющий интерес локус-мишень представляет собой ДНК.

[0024] В таких способах представляющий интерес локус-мишень может являться частью молекулы ДНК или молекулы РНК. В предпочитаемом варианте осуществления изобретения представляющий интерес локус-мишень представляет собой РНК.

[0025] В таких методах представляющий интерес локус-мишень, может находиться в молекуле ДНК внутри клетки. Клетка может быть прокариотической или эукариотической клеткой. Клетка может быть клеткой млекопитающего. Такая клетка млекопитающего может быть клеткой отличного от человека млекопитающего, например, клеткой примата, коровы, овцы, свиньи, собаки, грызуна, представителя семейства Leporidae, клеткой такого млекопитающего как обезьяна, клеткой коровы, овцы, свиньи, собаки, кролика, крысы или мыши. Такая клетка может быть эукариотической клеткой не являющегося млекопитающим животного, такого как домашняя птица (например, курица), позвоночная рыба (например, лосось) или беспозвоночное (например, устрица, двустворчатый моллюск, лобстер, креветка). Такая клетка может быть также клеткой растения. Такая растительная клетка может быть получена из однодольного растения или двудольного растения, а также сельскохозяйственного растения или злака, такого как маниок, кукуруза, сорго, соя, пшеница, овес или рис. Такая растительная клетка может быть также клеткой водоросли, дерева или растения-продуцента, фрукта или овоща (например, дерева, такого как цитрусовые деревья, например, апельсин, грейпфрут или лимон; персик или нектарин; яблоня или груша; орехоносное дерево, такое как миндаль, грецкий орех или фисташка; пасленового растения; растения рода Brassica; растения рода Lactuca; растения рода Spinacia; растения рода Capsicum; хлопка, табака, спаржи, моркови, капусты, брокколи, цветной капусты, томата, баклажана, перца, латука, шпината, клубники, черники, малины, ежевики, винограда, кофе, какао и т.д.)

[0026] В любом из описанных способов представляющий интерес локус-мишень может представлять собой геномный или эпигеномный локус. В любом из описанных способов указанный комплекс может доставляться несколькими направляющими молекулами для мультиплексного применения. В любом из описанных способов может быть использовано более одного белка(ов).

[0027] В предпочтительных вариантах осуществления изобретения биохимическое или in vitro или in vivo расщепление последовательностей, связанных с или непосредственно находящихся в представляющем интерес локусе-мишени, происходит без предполагаемой трансактивирующей последовательности cr-РНК (tracr РНК), например, посредством расщепления при помощи эффекторного белка C2c1 или C2c3. В других вариантах осуществления изобретения расщепление может происходить при помощи предполагаемой трансактивирующей последовательности cr-РНК (tracr РНК), например, посредством расщепления другими эффекторными белками семейства CRISPR.

[0028] В любом из описанных способов эффекторный белок (например, C2c1 или C2c3) и компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут быть предоставлены посредством одной или более полинуклеотидных молекул, кодирующих белок и/или компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, причем одна или более полинуклеотидных молекул функционально приспособлены для экспрессии белка и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой. Одна или более полинуклеотидных молекул могут содержать один или более регуляторных элементов, функционально приспособленных для экспрессии белка и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой. Одна или более полинуклеотидных молекул может находиться в одном или более векторах. Изобретение охватывает такие полинуклеотидные молекулы, например, полинуклеотидные молекулы, функционально приспособленные для экспрессии белка и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой, а также указанного вектора (ов).

[0029] Изобретение также относится к сконструированному способами инженерии белку CRISPR, комплексу, композиции, системе, вектору, клетке или клеточной линии по изобретению для применения для модификации представляющего интерес локуса-мишени в клетке. Указанная модификация предпочтительно включает приведение клетки в контакт с любой из вышеописанных композиций или любой из вышеописанных систем. Изобретение также относится к применению сконструированного белка CRISPR, комплекса, композиции, системы, вектора, клетки или клеточной линии по изобретению для получения лекарственного средства для модификации локуса-мишени в клетке.

[0030] Также изобретение относится к сконструированному способами инженерии белку CRISPR, комплексу, композиции, системе, вектору, клетке или клеточной линии по изобретению для применения для модификации представляющего интерес локуса-мишени в клетке. Изобретение также относится к применению сконструированного белка CRISPR, комплекса, композиции, системы, вектора, клетки или клеточной линии по изобретению для получения лекарственного средства для модификации представляющего интерес локуса-мишени. Указанная модификация предпочтительно включает приведение клетки в контакт с любой из вышеописанных композиций или любой из вышеописанных систем.

[0031] Также изобретение относится к способу модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем указанный способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок C2c2 локуса и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок C2c2 образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок осуществляет модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В предпочтительном варианте осуществления модификация представляет собой внесение одноцепочечного разрыва.

[0032] В таких способах интересующий целевой локус может содержаться в молекуле ДНК in vitro. В таких методах интересующий целевой локус может содержаться в молекуле ДНК внутри клетки. Предпочтительно, в таких способах представляющий интерес локус-мишень может быть включен в молекулу РНК in vitro. Также предпочтительно, чтобы в таких способах представляющий интерес локус-мишень мог быть включен в молекулу РНК внутри клетки. Клетка может быть прокариотической или эукариотической клеткой. Клетка может быть клеткой млекопитающего. Клетка может быть клеткой грызуна. клетка может быть клеткой мыши.

[0033] Изобретение также относится к сконструированному белку CRISPR, комплексу, композиции, системе, вектору, клетке или клеточной линии по изобретению для применения для модификации представляющего интерес локуса в клетке. Указанная модификация предпочтительно включает приведение клетки в контакт с любой из вышеописанных композиций или любой из вышеописанных систем. Изобретение также обеспечивает использование сконструированного способами инженерии белка CRISPR, комплекса, композиции, системы, вектора, клетки или клеточной линии в соответствии с изобретением при получении лекарственного средства для модификации представляющего интерес локуса в клетке.

[0034] Также изобретение относится к сконструированному белку CRISPR, комплексу, композиции, системе, вектору, клетке или клеточной линии для применения для модификации представляющего интерес локуса в клетке согласно изобретению. Изобретение также относится к применению сконструированного способами инженерии белка CRISPR, комплекса, композиции, системы, вектора, клетки или клеточной линии при получении лекарственного средства по изобретению для модификации интересующего локуса в клетке. Указанная модификация предпочтительно включает приведение клетки в контакт с любой из вышеописанных композиций или любой из вышеописанных систем.

[0035] В любом из описанных способов представляющий интерес локус-мишень может быть геномным или эпигеномным представляющим интерес локусом. В любом из описанных способов комплекс может быть доставлен с использованием множественных направляющих молекул для мультиплексного применения. В любом из описываемых способов может быть использовано более одного белка(ов).

[0036] В других аспектах изобретения компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут содержать предполагаемую последовательность РНК CRISPR (crRNA) и/или предполагаемую трансактивирующую последовательность cr-РНК (tracr-РНК). В некоторых вариантах осуществления расщепление, такое как биохимическое или in vitro расщепление, или расщепление в клетках, может происходить без предполагаемой трансактивирующей последовательности cr-РНК (tracr РНК). В других вариантах осуществления расщепление, такое как биохимическое или in vitro расщепление, или расщепление в клетках, может происходить с предполагаемой трансактивирующей последовательностью cr-РНК (tracr-РНК);

[0037] В некоторых вариантах осуществления, где эффекторный белок представляет собой эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V, такой как эффекторный белок C2c1 локусов CRISPR-Cas или эффекторный белок C2c3 локусов CRISPR-Cas, предпочтительно эффекторный белок C2c1 локусов CRISPR-Cas, компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут содержать предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и предполагаемую транс-активирующую последовательность cr-РНК (tracr РНК).

[0038] В дальнейших аспектах изобретения компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут содержать предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и не включать какую-либо предполагаемую транс-активирующую последовательность cr-РНК (tracr-РНК). В качестве неограничивающего примера, заявители предполагают, что в таких случаях пре-cr-РНК может содержать вторичную структуру, достаточную для процессинга, чтобы получить зрелую cr-РНК, а также для нагрузки эффекторного белка посредством cr-РНК. В качестве неограничивающего примера, такая вторичная структура может содержать, по существу состоять из или состоять из шпильки внутри пре-cr-РНК, более конкретно, в пределах прямого повтора.

[0039] В некоторых вариантах осуществления, где эффекторный белок представляет собой эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа VI, такой как эффекторный белок C2c2, компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут содержать предполагаемую последовательность типа CRISPR (cr-РНК) и не включать какую-либо предполагаемую транс-активирующую последовательность cr-РНК (tracr РНК).

[0040] В любом из описанных способов эффекторный белок и компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут быть доставлены посредством одной или более полинуклеотидных молекул, кодирующих белок и/или компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, и где одна или более полинуклеотидных молекул функционально организованы для экспрессии белка и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой. Одна или более полинуклеотидных молекул могут содержать один или более регуляторных элементов, функционально организованных для экспрессии белка и/или компонента, являющегося нуклеиновой кислотой. Одна или более полинуклеотидных молекул могут быть включены в один или более векторов. В любом из описанных способов представляющий интерес локус-мишень может являться геномным или эпигеномным локусом. В любом из описанных способов комплекс может доставляться посредством нескольких направляющих молекул для мультиплексного применения. В любом из описанных способов может быть использовано более одного белка(ов).

[0041] В любом из описанных способов разрыв цепи может быть одноцепочечным или двухцепочечным разрывом.

[0042] Регуляторные элементы могут включать индуцибельные промоторы. Полинуклеотиды и/или векторные системы могут включать индуцибельные системы.

[0043] В любом из описанных способов одна или более полинуклеотидных молекул могут быть включены в систему доставки, или один или более векторов могут быть включены в систему доставки.

[0044] В любом из описанных способов такую не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию можно доставлять при помощи липосом и частиц, включая наночастицы, экзосом, микровезикул, генных пушек или одного или более вирусных векторов, например, при помощи молекулы нуклеиновой кислоты или вирусного вектора.

[0045] Также изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, имеющую характеристики, описанные в настоящем описании или определенные в любом из описанных в настоящем описании способов.

[0046] Также изобретение относится к сконструированному способами инженерии белку CRISPR, комплексу, композиции, системе, вектору, клетке или клеточной линии по изобретению для использования в терапии.

[0047] В определенных вариантах осуществления изобретение, таким образом, относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, такой как, в частности, композиция, способная к или приспособленная для модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем указанная композиция содержит эффекторный белок локуса CRISPR-Cas типа V и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок вызывает модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может кодироваться подтипом V-A локусов CRISPR-Cas или подтипом V-B локусов CRISPR-Cas или подтипом V-C локусов CRISPR-Cas. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может представлять собой эффекторный белок C2c1 или эффекторный белок C2c3.

[0048] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, в частности, композиции, способной или приспособленной для модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем указанная композиция включает эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа VI и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, причем такой эффекторный белок формирует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом такой эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В определенных вариантах осуществления изобретения такой эффекторный белок может быть эффекторным белком локусов С2с2.

[0049] Также в следующем аспекте настоящее изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, в частности, композиции, способной или приспособленной для модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем указанная композиция включает: (a) молекулу направляющей РНК (или комбинацию молекул направляющих РНК, например, первую молекулу направляющей РНК-гида или вторую молекулу направляющей РНК) или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу направляющей РНК (или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию молекул направляющих РНК); (b) эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V или нуклеиновую кислоту, кодирующую эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может кодироваться подтипом V-A локусов CRISPR-Cas или подтипом V-B локусов CRISPR-Cas или подтипом V-C локусов CRISPR-Cas. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может представлять собой эффекторный белок C2c1 локусов CRISPR Cas или эффекторный белок C2c3 локусов CRISPR Cas.

[0050] Еще один аспект изобретения также относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, такой как, в частности, композиция, способная к или приспособленная для модификации представляющнего интерес локуса-мишени, причем указанная композиция содержит: (a) молекулу направляющей РНК (или комбинацию молекул направляющей РНК, например, первую молекулу направляющей РНК и вторую молекулу направляющей РНК) или нуклеиновую кислоту, кодирующую комбинацию молекул направляющих РНК; (b) эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа VI или нуклеиновую кислоту, кодирующую эффекторный белок локусов CRISPR Cas типа VI. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок может представлять собой эффекторный белок C2c2.

[0051] В следующем аспекте изобретение также относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей: (I) одну или более полинуклеотидных последовательностей системы CRISPR-Cas, содержащих (а) направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в полинуклеотидном локусе, (b) последовательность-партнер tracr, (c) последовательность tracr-РНК и (II) вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V, где при транскрипции последовательность-партнер tracr гибридизуется с последовательностью tracr-РНК и направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью и где комплекс CRISPR содержит эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V в комплексе с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с последовательностью-мишенью, и (2) последовательностью-партнером tracr, которая гибридизируется с последовательностью tracr-РНК. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может кодироваться подтипом V-A локусов CRISPR-Cas или подтипом V-B локусов CRISPR-Cas или подтипом V-C локусов CRISPR-Cas. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может представлять собой эффекторный белок C2c1 локусов CRISPR-Cas или эффекторный белок C2c3 локусов CRISPR-Cas.

[0052] В следующем аспекте изобретение также относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей: (I) одну или более полинуклеотидных последовательностей системы CRISPR-Cas, содержащих (а) направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в полинуклеотидном локусе, (b) последовательность-партнер tracr, (c) последовательность tracr-РНК и (ii) вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую эффекторный белок локусов CRISPR Cas типа VI, где при транскрипции последовательность-спутник tracr гибридизуется c последовательностью tracr-РНК и направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью и где комплекс CRISPR содержит эффекторный белок локусов CRISPR Cas типа VI в комплексе с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с последовательностью-мишенью, и (2) последовательностью-партнером tracr, которая гибридизируется с последовательностью tracr-РНК. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может кодироваться подтипом V-A локусов CRISPR-Cas или подтипом V-B локусов CRISPR-Cas или подтипом V-C локусов CRISPR-Cas. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок может представлять собой эффекторный белок C2c2 локусов CRISPR-Cas.

[0053] В определенных вариантах осуществления tracr-РНК может не требоваться. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретение также относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей: (I) одну или более полинуклеотидных последовательностей системы CRISPR-Cas, содержащих (а) направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в полинуклеотидном локусе, и (b) последовательность прямого повтора, и (II) вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V или типа VI, где при транскрипции направляющая последовательность управляет специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью, и где комплекс CRISPR включает эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V или типа VI в комплексе с (I) направляющей последовательностью, которая гибридизована с последовательностью-мишенью, и (2) последовательностью прямого повтора. В определенных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок типа V может кодироваться подтипами V-A локусов CRISPR-Cas, или подтипами V-B локусов CRISPR-Cas, или подтипами V-C локусов CRISPR-Cas. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может представлять собой эффекторный белок C2c1 локусов CRISPR-Cas или эффекторный белок C2c3 локусов CRISPR-Cas. Предпочтительно, чтобы эффекторный белок представлял собой эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа VI. Более предпочтительно, чтобы эффекторный белок был эффекторным белком C2c2 локусов CRISPR-Cas. Без наложения ограничений, заявители предполагают, что в таких случаях последовательность прямого повтора может содержать вторичную структуру, достаточную для загрузки эффекторного белка посредством cr-РНК. В качестве неограничивающего примера, такая вторичная структура может включать, по существу состоять или состоять из шпильки внутри прямого повтора.

[0054] Также изобретение относится к векторной системе, включающей один или более векторов, причем один или более векторов содержат одну или более полинуклеотидных молекул, кодирующих компоненты не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, обладающую характеристиками, которые определены в любом из описанных в настоящем описании способов.

[0055] Также изобретение относится к системе доставки, содержащей один или более векторов или одну или более полинуклеотидных молекул, причем один или более векторов или полинуклеотидных молекул включают одну или более полинуклеотидных молекул, кодирующих компоненты не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, имеющую характеристики, описанные в настоящем описании или определенными в любом из описанных способов.

[0056] Также изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, или одному или более полинуклеотидам, кодирующим компоненты указанной композиции, или к вектору либо системе доставки, содержащим один или более полинуклеотидов, кодирующих компоненты указанной композиции, для использования в терапевтическом способе лечения. Такой терапевтический способ лечения может включать генное или геномное редактирование или генную терапию.

[0057] Изобретение также относится к сконструированному белку CRISPR, комплексу, композиции, системе, вектору, клетке или клеточной линии по изобретению для использования в терапии заболеваний, нарушений или инфекционных заболеваний у индивидуума, нуждающегося в этом. Заболевание, расстройство или инфекция могут включать вирусную инфекцию. Вирусная инфекция может представлять собой гепатит В (HBV). Изобретение также относится к использованию сконструированного белка CRISPR, комплекса, композиции, системы, вектора, клетки или клеточной линии по изобретению для получения лекарственного средства для лечения заболевания, расстройства или инфекции у индивидуума, нуждающегося в этом. Болезнь, расстройство или инфекция могут включать вирусную инфекцию.

[0058] Также изобретение относится к вычислительным (биоинформатическим) способам и алгоритмам прогнозирования новых систем CRISPR-Cas 2 класса и идентификации их компонентов.

[0059] Также изобретение относится к способам и композициям, в которых один и несколько аминокислотных остатков эффекторного белка могут быть модифицированы, например, в сконструированном способами инженерии или не встречающемся в природе эффекторном белке, или C2c1 или C2c3. В одном из вариантов осуществления изобретения модификация может включать мутацию одного или более аминокислотных остатков эффекторного белка. Одна или более мутаций могут быть локализованы в одном или более каталитических доменах эффекторного белка. Нуклеазная активность такого эффекторного белка может быть снижена или отсутствовать по сравнению с эффекторным белком, не имеющим указанную одну или более мутаций. Такой эффекторный белок может быть не способен направлять расщепление цепи ДНК или РНК в представляющем интерес локусе-мишени. Предпочтительный вариант осуществления включает две таких мутаций. В предпочтительном варианте осуществления изобретения такие один или более аминокислотных остатков модифицированы в эффекторном белке C2c1 или C2c3, например, в сконструированном способами инженерии или не встречающемся в природе эффекторном белке, или C2c1 или C2c3.

[0060] Также изобретение относится к одной или более мутациям или к двум или более мутациям в каталитически активном домене эффекторного белка, содержащего домен RuvC. В некоторых вариантах осуществления изобретения такой домен RuvC может являться одним из доменов RuvCI, RuvCII или RuvCIII, либо каталитически активным доменом, гомологичным доменам RuvCI, RuvCII и RuvCIII и т. д. или любому соответствующему домену, как описано в любом из описанных в настоящем описании способов. В некоторых вариантах осуществления такие одна или более мутаций могут быть локализованы в каталитически активном домене эффекторного белка, являющемся доменом HEPN, или каталитически активном домене, гомологичном домену HEPN. Такой эффекторный белок может иметь один или более доменов, являющихся сигналом ядерной локализации (NLS). Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут содержать по меньшей мере два или более доменов NLS. Такие один или более доменов NLS могут быть расположены в конце или вблизи конца последовательности эффекторного белка (например, C2c1 или C2c3), а в случае двух и более NLS каждый из этих двух может быть расположен вблизи конца эффекторного белка (например, C2c1 или C2c3). Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут являться одним или более доменами активации транскрипции. В предпочтительном варианте осуществления домен активации транскрипции может включать VP64. Такие один или более функциональных доменов могут являться одним или более доменами репрессии транскрипции. В предпочтительном варианте осуществления такой домен репрессии транскрипции является доменом KRAB или доменом SID (например, SID4X). Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут являться одним или более нуклеазными доменами. В предпочтительном варианте осуществления нуклеазный домен является доменом Fok1.

[0061] Также изобретение относится к одному или более гетерологичным функциональным доменам следующих типов активности: метилазная активность, деметилазная активность, активация транскрипции, репрессия транскрипции, активность фактора терминации транскрипции, модификация гистонов, нуклеазная активность, расщепление одноцепочечной РНК, расщепление двухцепочечной РНК, расщепление одноцепочечной ДНК, расщепление двухцепочечной ДНК и связывание нуклеиновых кислот. По меньшей мере один или более гетерологичных функциональных доменов могут находиться в N-конце эффекторного белка или вблизи него, при этом также по меньшей мере один или более гетерологичных функциональных доменов могут находиться в C-конце эффекторного белка или вблизи него. Такой один или более гетерологичных функциональных доменов могут быть слиты с таким эффекторным белком. Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут быть присоединены к такому эффекторному белку. Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут быть соединены с таким эффекторным белком посредством связующей группы.

[0062] Также изобретение относится к эффекторному белку, включающему эффекторный белок из организма, относящегося к одному из следующих родов: Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium или Acidaminococcus. Такой эффекторный белок может представлять собой химерный эффекторный белок, первый фрагмент которого получен из первого ортолога эффекторного белка, а второй фрагмент - из второго ортолога эффекторного белка, причем первый и второй ортологи эффекторного белка различаются. По меньшей мере один из первого и второго ортологов эффекторного белка может представлять собой эффекторный белок одного из следующих организмов: Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium,Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Methylobacterium или Acidaminococcus.

[0063] В некоторых вариантах осуществления изобретения такой эффекторный белок, в частности, эффекторный белок локусов типа V, а более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности C2c1p, может происходить из, быть получен из или являться производным метаболизма бактерий, относящегося к таким таксонам как Bacilli, Verrucomicrobia, альфа-протеобактерии или дельта-протеобактерии. В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок, в частности, эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов V-B типа, в частности C2c1p, может происходить из, быть выделен из или являться производным метаболизма бактерий, относящихся к одному из следующих родов: Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Desulfatirhabdium, Citrobacter, и Methylobacterium. В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок, в частности, эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности C2c1p, может происходить из, быть выделен из или являться производным метаболизма следующих бактерий: Alicyclobacillus acidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacillu scontaminans (например, DSM 17975), Desulfovibr ioinopinatus (например, DSM 10711), Desulfonatronum thiodismutans (например, штамм MLF-1), бактерии Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (например, DSM 17572), Bacillus thermoamylovorans (например, штамм B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (например, DSM 18734), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM 13609), Citrobacter freundii (например, ATCC 8090), Brevibacillus agri (например, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (например, ORS 2060). В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок, в частности, эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности C2c1p, может происходить из, быть выделен из являться производным метаболизма бактерий из перечня, приведенного в таблице на фиг.41A-B.

[0064] В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок, а именно белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности C2c1p, может содержать, по существу состоять или состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, включающего аминокислотные последовательности, представленные на множественном выравнивании последовательностей на фиг.13D-H.

[0065] В некоторых вариантах осуществления локус типа V-B, как подразумевается в настоящем описании, может кодировать слитую конструкцию Cas1-Cas4, Cas2 и эффекторный белок С2с1p. В некоторых вариантах осуществления локус типа V-B, как подразумевается в настоящем описании, может примыкать к последовательности CRISPR. Характерная организация локусов типа V-B проиллюстрирована на фиг.9 и фиг.41A-B.

[0066] В некоторых вариантах осуществления белок Cas1, кодируемый локусом типа V-B, как подразумевается в настоящем описании, может группироваться с системой типа I-U. На фиг.10A и 10B и 10C-V проиллюстрировано дерево Cas1, включая Cas1, кодируемый репрезентативными локусами типа V-B.

[0067] В определенных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, а частности - C2c1p, например, природный C2c1p, может иметь длину от приблизительно 1100 до приблизительно 1500 аминокислот, например, от приблизительно 1100 до приблизительно 1200, или от приблизительно 1200 до приблизительно 1300 аминокислот, или от приблизительно 1300 до приблизительно 1400 аминокислот, или от приблизительно 1400 до приблизительно 1500 аминокислот, например, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400, или приблизительно 1500 аминокислот.

[0068] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности - C2c1p, и предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, содержит три каталитических мотива RuvC-подобной нуклеазы (т.е. RuvCI, RuvCII и RuvCIII). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок и предпочтительно С-концевая часть указанного эффекторного белка может далее содержать область, соответствующую мостиковой спирали (также известной как богатый аргинином кластер), которая в белке Cas9 участвует в связывании cr-РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок и предпочтительно C-концевая часть указанного белка может далее включать домен, содержащий цинковый палец, который может быть неактивным (т.е. который не связывает цинк, например, в котором Zn-связывающие остатки цистеина отсутствуют). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок и предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка может содержать три каталитических мотива RuvC-подобной нуклеазы (т.е. RuvCI, RuvCII и RuvCIII), область, соответствующую мостиковой спирали, домен, содержащий цинковый палец, предпочтительно в следующем порядке, от N- к C-концу: RuvCI-мостиковая спираль-RuvCII-цинковый палец-RuvCIII См. Фиг.11, фиг.12 и фиг.13A и 13C для иллюстрации доменной архитектуры представителей эффекторных белков типа V-B.

[0069] В некоторых вариантах осуществления изобретения локусы типа V-B, как описано в настоящем описании, могут содержать CRISPR-повторы длиной от 30 до 40 п.н., более типично от 34 до 38 п.н., еще более типично - от 36 до 37 п.н., например, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 п.н.

[0070] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно - эффекторный белок локусов типа V-C, в частности - C2c3p может происходить, быть изолирован или получен из бактериального метагенома, выбранного из бактериальных метагеномов, перечисленных в таблице на фиг.43 A-B.

[0071] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локуcов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-C, в частности - C2c3p, может включать, состоять в основном из или состоять только из аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных на множественном выравнивании последовательностей на фиг.131.

[0072] В некоторых вариантах осуществления изобретения локус типа V-C, как описано в настоящем описнаии, может кодировать эффекторный белок Cas1 и C2c3p. См. Фиг.14 и фиг.43A-B для иллюстрации организации характерных локусов типа V-С.

[0073] В некоторых вариантах осуществления изобретения белок Cas1, кодируемый локусом типа V-С, как описано в настоящем описании, может образовывать кластеры с системой типа I-B. См. Фиг.10A и 10B и фиг.10C-W, иллюстрирующие дерево Cas-белков, включающее белок Cas1, кодируемый характерными локусами типа V-С.

[0074] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-С, еще более конкретно - C2c3p, в частности C2c3p, может иметь длину от приблизительно 1100 до приблизительно 1500 аминокислот, например, от приблизительно 1100 до приблизительно 1200 аминокислот, или от приблизительно 1200 до приблизительно 1300 аминокислот, или от приблизительно 1300 до приблизительно 1400 аминокислот, или от приблизительно 1400 до приблизительно 1500 аминокислот, например, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400 или приблизительно 1500 аминокислот, или как минимум приблизительно 1100, как минимум приблизительно 1200, как минимум приблизительно 1300, как минимум приблизительно 1400 или как минимум приблизительно 1500 аминокислот.

[0075] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-С, в частности - C2c3p, предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, включает три каталитических мотива RuvC-подобной нуклеазы (т.е., RuvCI, RuvCII и RuvCIII). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок, предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, может содержать область, соответствующую мостиковой спирали (также известной как богатый аргинином кластер), которая в белке Cas9 участвует в связывании cr-РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок, предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, может далее включать домен цинкового пальца. Предпочтительно сохранение Zn-связывающих остатков цистеина в C2c3p. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок, предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, может включать три каталитических мотива RuvC-подобной нуклеазы (т.е., RuvCI, RuvCII и RuvCIII), область, соответствующую мостиковой спирали, и домен цинкового пальца, предпочтительно в следующем порядке с N к C концу: RuvCI-мостиковая спираль-RuvCII-цинковый палец-RuvCIII. См. Фиг.13A и 13C для иллюстрации характерной доменной архитектуры эффекторных белков типа V-С.

[0076] В некоторых вариантах осуществления изобретения локусы типа V-С, как предполагается в настоящем описании, могут содержать CRISPR-повторы длиной от 20 до 30 п.н., более типично от 22 до 27 п.н. длиной, и еще более типично 25 п.н. длиной, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, или 30 п.н.

[0077] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа VI, в частности C2c2p, может происходить, быть выделенными или полученным из бактерий, принадлежащих к таксонам альфа-протеобактерии, Bacilli, Clostridia, Fusobacteria и Bacteroidetes. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретнее эффекторный белок локусов типа VI, в частности - C2c2p, может происходить, быть выделенным или полученным из бактерий, принадлежащих к одному из следующих родов: Lachnospiraceae, Clostridium, Carnobacterium, Paludibacter, Listeria, Leptotrichia и Rhodobacter. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа VI, в частности C2c2p, может происходить, быть выделенным или полученным из следующих видов бактерий: Lachnospiraceaebacterium MA2020, Lachnospiraceaebacterium NK4A179, Clostridiumaminophilum (например, DSM 10710), Lachnospiraceaebacterium NK4A144, Carnobacteriumgallinarum (например, DSM 4847 штамм MT44), Paludibacterpropionicigenes (например, WB4), Listeriaseeligeri (например, серовар ½b штамм SLCC3954), Listeriaweihenstephanensis (например, FSL R9-0317 c4), Listerianewyorkensis (например, штамм FSL M6-0635), Leptotrichiawadei (например, F0279), Leptotrichiabuccalis (например, DSM 1135), Leptotrichiasp. Oraltaxon 225 (например, str. F0581), Leptotrichiasp. Oraltaxon 879 (например, штамм F0557), Leptotrichiashahii (например, DSM.19757), Rhodobactercapsulatus (например, SB 1003, R121, или DE442). В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок, более конкретно эффекторный белок локусов типа V, еще более конкретно - C2c2p может происходить, быть выделенным или полученным из видов бактерий, перечисленных в таблице в фиг.42А-В.

[0078] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно, эффекторный белок локусов типа VI, в частности - C2c2p, может содержать, состоять только из или включать аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, показанных на множественном выравнивании на фиг.13J-N.

[0079] В некоторых вариантах осуществления изобретения локус типа VI, как предполагается в рамках настоящего изобретения, может кодировать эффекторные белки Cas1, Cas2 и C2c2p. В некоторых вариантах осуществления изобретения локус типа V-С, как предполагается в рамках настоящего изобретения, может содержать последовательность CRISPR. В некоторых вариантах осуществления изобретения локус типа V-С, как предполагается в рамках настоящего изобретения, может содержать ген c2c2 и последовательность CRISPR, и не содержать гены cas1 и cas2. См. Фиг.15 и фиг.42A-В для иллюстрации характерной организации локусов типа VI.

[0080] В некоторых вариантах осуществления изобретения белок Cas1, кодируемый локусом типа VI, как предполагается в рамках настоящего изобретения, может образовывать кластеры с поддеревом типа II, включая небольшую ветвь типа III-A, или внутри системы типа III-A. См. Фиг.10A и 10B и фиг.10C-W, на которых изображено дерево Cas1, включающее белок Cas1, кодируемый типичными локусами типа VI.

[0081] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа VI, в частности C2c2p, например природный C2c2p, может быть от приблизительно 1000 до приблизительно 1500 аминокислотных остатков длиной, таким как от приблизительно 1100 до приблизительно 1400 аминокислот длиной, например, от приблизительно 1000 до приблизительно 1100 аминокислот длиной, от приблизительно 1100 до приблизительно 1200 аминокислот длиной, или от приблизительно 1200 до приблизительно 1300 аминокислот длиной, или от приблизительно 1300 до приблизительно 1400 аминокислот длиной, или от приблизительно 1400 до приблизительно 1500 аминокислот длиной, например, приблизительно 1000, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400 или приблизительно 1500 аминокислот длиной.

[0082] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа VI, а частности C2c2p, содержит как минимум один или предпочтительно как минимум два, наиболее предпочтительно ровно два, консервативных мотива RxxxxH. Каталитические RxxxxH-мотивы характерны для HEPN-доменов (домен, связывающийся с ДНК, присутствующий у эукариот и прокариот). Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа VI, в частности - C2c2p, содержит как минимум один или предпочтительно как минимум два, наиболее предпочтительно ровно два, HEPN-домена. См. Фиг.11 и фиг.13B для иллюстрации характерной доменной архитектуры эффекторных белков типа VI. В некоторых вариантах осуществления изобретения HEPN-домены могут обладать РНК-азной активностью. В других вариантах осуществления изобретения HEPN-домены могут обладать ДНК-азной активностью.

[0083] В некоторых вариантах осуществления изобретения локусы типа VI, как предполагается в рамках настоящего изобретения, могут содержать CRISPR-повторы длиной от 30 до 40 п.н., более типично длиной от 35 до 39 п.н., например, длиной 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 п.н.

[0084] В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность, прилегающая к протоспейсеру (PAM), или PAM-подобный мотив управляет связыванием эффекторного белкового комплекса с представляющим интерес локусом-мишенью, как описано настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения, PAM может представлять собой 5'-PAM (т.е. быть расположенным выше 5'-конца протоспейсера). В других вариантах осуществления изобретения PAM может представлять собой 3'-PAM (т.е. быть расположенным ниже 5'-конца протоспейсера).

[0085] В предпочтительном варианте осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типa V-B, еще более конкретно - C2c1p, может распознавать 5'-PAM. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно - эффекторный белок локусов типа V-B, еще более конкретно - C2c1p, может распознавать 5'-PAM, который является 5'-TTN- или 5'-ATTN-последовательностью, где N - это A, C, G или T. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может быть белком C2c1p бактерии Alicyclobacillus acidoterrestris, более предпочтительно - белком ATCC 49025 C2c1p бактерии Alicyclobacillus acidoterrestris, в котором 5'-PAM представлен 5'-последовательностью TTN, где N - это A, C, G или T, более предпочтительно где N - это A, G или T. В других наилучших вариантах осуществления изобретения эффекторный белок является белком C2c1p бактерии Bacillus thermoamylovorans, более предпочтительно - белком C2c1p штамма B4166 бактерии Bacillusthermo amylovorans, в котором 5'-PAM представлен 5'-последовательностью ATTN, где N - это A, C, G или T.

[0086] В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR сконструирован способами инженерии и может содержать одну и несколько мутаций, которые уменьшают или полностью устраняют нуклеазную активность.

[0087] Мутации также могут быть внесены в соседние остатки, например, в аминокислоты, близкие к указанным выше, которые участвуют в нуклеазной активности. В некоторых вариантах осуществления инактивируется только домен RuvC, а в других вариантах осуществления инактивируется другой предполагаемый нуклеазный домен, при этом эффекторный белковый комплекс функционирует как никаза и расщепляет только одну цепь ДНК. В некоторых вариантах осуществления два варианта C2c1 или C2c3 (каждый из которых представляет собой другую никазу) используются для увеличения специфичности, два варианта никазы используется для расщепления ДНК на мишени (где обе никазы расщепляют цепочку ДНК, минимизируя или полностью устраняя нецелевые модификации, где только одна цепь ДНК расщепляется и затем подвергается репарации). В предпочтительных вариантах осуществления эффекторный белок C2c1 или C2c3 расщепляет последовательности, ассоциированные с или непосредственно находящиеся в представляющем интерес локусе-мишени, в качестве гомодимера, содержащего две молекулы эффекторного белка C2c1 или C2c3. В предпочтительном варианте осуществления гомодимер может содержать две молекулы эффекторного белка C2c1 или две молекулы эффекторного белка C2c3 или смесь C2c1 и C2c3, содержащую различные мутации в соответствующих доменах RuvC.

[0088] Изобретение относится к способам использования двух или более никаз, в частности, к способу, предполагающему использование двойной или сдвоенной никазы. В некоторых аспектах и вариантах осуществления может быть доставлен один тип никазы C2c1 или C2c3, например, модифицированная C2c1 или C2c3 или модифицированная никаза C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании. Это приводит к тому, что ДНК-мишень связывается двумя C2c1 или двумя C2c3-никазами или смесью C2c1 и C2c3-никаз. Кроме того, также предусматривается, что могут быть применены различные ортологи, например, никаза C2c1 или C2c3 на одной цепи (например, кодирующей цепи) ДНК и ортолог на некодирующей или противоположной цепи ДНК. Ортолог может быть, но не ограничивается, никазой Cas9, такой как никаза SaCas9 или никаза SpCas9. Может быть предпочтительно использовать два разных ортолога, которые требуют разных PAM, а также могут иметь разные требования к направляющим последовательностям, что позволит обеспечить более высокую степень контроля при использовании изобретения. В некоторых вариантах осуществления расщепление ДНК будет включать по меньшей мере четыре типа никаз, причем каждый тип будет направляться в иную нуклеотидною последовательность ДНК-мишени, причем каждая пара никаз вносит первый разрыв цепи в одну цепь ДНК, а вторая вносит разрыв цепи во вторую цепь ДНК. При таких способах по меньшей мере две пары одноцепочечных разрывов вносятся в ДНК-мишень, где при внесении первой и второй пары одноцепочечных разрывов в спирали вырезаются последовательности-мишнени между первой и второй парой однонитевых разрывов. В некоторых вариантах осуществления один или оба ортолога являются контролируемыми, т.е. индуцируемыми.

[0089] В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая РНК или зрелая cr-РНК содержит, состоит в основном из или состоит только из прямой повторяющейся последовательности и направляющей последовательности или спейсера. В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая РНК или зрелая cr-РНК состоит из частичного прямого повтора размером 19 нуклеотидов с последующей направляющей последовательностью или спейсером размером 23-25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок представлен эффекторным белком C2c1 или C2c3 и требует направляющей последовательности длиной как минимум 16 нуклеотидов для достижения поддающегося обнаружению расщепления ДНК и направляющей последовательности размером минимум 17 нуклеотидов для достижения эффективного расщепления ДНК in vitro. В некоторых вариантах осуществления прямая повторяющаяся последовательность расположена выше (т.е. на 5'-конце) направляющей последовательности или спейсера. В предпочтительном варианте осуществления последовательность затравки (т.е. последовательность, необходимая для распознавания и/или гибридизации с последовательностью локуса-мишени) направляющей РНК C2c1 или C2c3 находится примерно в пределах первых 5 нуклеотидов на 5'-конце направляющей последовательности или спейсера.

[0090] В предпочтительных вариантах осуществления изобретения зрелая cr-РНК содержит шпилечную структуру или оптимизированную шпилечную структуру или любую оптимизированную вторичную структуру. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения зрелая cr-РНК содержит шпилечную структуру или оптимизированную шпилечную структуру в прямой повторяющейся последовательности, где шпилечная структура или оптимизированная шпилечная структура важна для расщепления. В некоторых вариантах осуществления изобретения зрелая cr-РНК предпочтительно включает единичную шпилечную структуру. В некоторых вариантах осуществления изобретения прямая повторяющаяся последовательность предпочтительно включает единичную шпилечную структуру. В некоторых вариантах осуществления изобретения активность расщепления комплекса эффекторного белка может быть модифицирована путем внесения мутаций, которые влияют на структуру дуплекса РНК шпилечной структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения могут быть внесены мутации, поддерживающие структуру дуплекса РНК шпилечной структуры, благодаря которым будет сохранятся ферментативная активность, осуществляемая комплексом эффекторного белка. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения мутации, нарушающие структуру дуплекса РНК шпилечной структуры, могут быть внесены для полного удаления ферментативной активности, осуществляемой комплексом эффекторного белка.

[0091] Также изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей эффекторный белок, являющейся кодон-оптимизированной для экспрессии в эукариотическом организме или эукариотической клетке посредством любого из описанных в настоящем описании способов или композиций. В одном варианте осуществления изобретения кодон-оптимизированный эффекторный белок представляет собой любой C2c1 или C2c3, обсуждаемый в настоящем описании, и подвергнута оптимизации кодонов для удобства использования в эукариотической клетке или организме, например, такой клетке или организме, как описано в настоящем описании в иных местах, например, но не ограничиваясь этим, в клетке дрожжей, или клетке или организме млекопитающего, включая клетку мыши, клетку крысы, и клетку человека или не являющегося человеком эукариотического организма, например, растения.

[0092] В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один сигнал ядерной локализации (NLS) присоединен к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим эффекторные белки C2c1 или C2c3. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна или более C-концевых или N-концевых последовательностей NLS присоединены (следовательно, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эффекторный белок C2c1 или C2c3, могут включать код для последовательностей NLS, чтобы экспрессируемый продукт имел присоединенную или связанную последовательность NLS). В предпочтительном варианте осуществления изобретения C-концевые NLS присоединены для оптимальной экспрессии и нацеливания в ядро эукариотических клеток, предпочтительно клеток человека. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кодон-оптимизированным эффекторным белком является C2c1 или C2c3 и длина спейсера направляющей РНК составляет от 15 до 35 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина спейсера направляющей РНК - по меньшей мере 16 нуклеотидов, такая как по меньшей мере 17 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина спейсера составляет от 15 до 17 нуклеотидов, от 17 до 20 нуклеотидов, от 20 до 24 нуклеотидов, например, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, от 23 до 25 нуклеотидов, например, 23, 24 или 25 нуклеотидов, от 24 до 27 нуклеотидов, 27-30 нуклеотидов, 30-35 нуклеотидов или 35 нуклеотидов или длиннее. В некоторых вариантах осуществления изобретения кодон-оптимизированным эффекторным белком является C2c1 или C2c3, и длина прямого повтора направляющей РНК составляет по меньшей мере 16 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения кодон-оптимизированным эффекторным белком является C2c1 или C2c3, и длина прямого повтора направляющей РНК составляет от 16 до 20 нуклеотидов, например, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения длина прямого повтора направляющей РНК равна 19 нуклеотидам.

[0093] Настоящее изобретение также охватывает способы для доставки множественных компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где каждый компонент, являющийся нуклеиновой кислотой, специфичен к различным представляющим интерес локусам-мишеням для изменения множественных представляющих интерес локусов-мишеней. Компонент, являющийся нуклеиновой кислотой, комплекса может включать один или более связывающих белок РНК-аптамеров. Один или более аптамеров могут быть способны к связыванию с белком оболочки бактериофага. Белок оболочки бактериофага может быть выбран из группы, включающей: Qβ, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, М11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ϕСb5, ϕСb8r, ϕCb12r, ϕСb23r, 7s и PRR1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения белок оболочки бактериофага представлен белком MS2. Изобретение также предусматривает, что компонент, являющийся нуклеиновой кислотой, комплекса имеет длину 30 или больше, 40 или больше или 50 или больше нуклеотидов.

[0094] Изобретение также относится к клеткам, компонентам и/или системам по настоящему изобретению, содержащим незначительное количество катионов, присутствующих в клетках, компонентах и/или системах. В основном таким катионом является магний, такой как Mg²⁺. Катион может присутствовать в следовом количестве. Предпочтительный диапазон концентрации для катиона Mg²⁺ составляет приблизительно от 1 мМ до 15 мМ. Предпочтительная концентрация может составлять около 1 мМ для клеток, компонентов и/или систем на основе человека и примерно от 10 мМ до 15 мМ для клеток, компонентов и/или систем на основе бактерий. См., например, статью Gasiunas et al., PNAS, опубликованную через интернет 4 сентября 2012 года, www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas. 1208507109.

[0095] Соответственно, задачей изобретения не является охватить в своих рамках какой-либо ранее известный продукт, процесс получения продукта или способ применения, таким образом, заявители сохраняют за собой право и настоящим подтверждают отказ от какого-либо ранее известного продукта, процесса или способа. Далее отмечено, что изобретение не намеревается охватить в своих рамках какой-либо продукт, процесс получения или способ применения продукта, которые не соответствует письменному описанию и разрешающим условиям USPTO (35 Свод Законов США 112, параграф первый) или EPO (Статья 83 EPC), так что Заявители сохраняют за собой право и настоящим подтверждают отказ от каого-либо ранее описанного продукта, процесса получения или способа применения продукта. В практике изобретения следует руководствоваться Статьей 53 (c) EPC и Правилом 28 (b) и (c) EPC. Ничто в настоящем описании не может быть истолковано как обещание.

[0096] Отмечено, что в настоящей заявке и особенно в формуле изобретения и/или параграфах термины, такие как "содержать", "содержавшийся", "содержащий" и т.п., могут иметь значение, приписанное им в американском Патентном Законе; например, они могут означать "включает", "включенный", "включающий", и т.п.; термины, такие как "по существу состоящий из" и "по существу состоит из" имеют значение, приписанное им в американском Патентном праве, например, они включают элементы, не указанные явно, но исключают элементы, которые учтены в предшествующих заявках или которые влияют на основные или новые характеристики изобретения.

[0097] В следующем аспекте изобретение относится к эукариотической клетке, включающей модифицированный представляющий интерес локус-мишень, где представляющий интерес локус-мишень модифицирован согласно любому из способов, описанных в настоящем описании. Еще один аспект изобретения относится к созданию клеточной линии указанной клетки. Следующий аспект изобретения предусматривает создание многоклеточного организма, включающего одну или более указанных клеток.

[0098] В некоторых вариантах осуществления изобретения модификация представляющего интерес локуса-мишени может приводить к появлению эукариотической клетки с измененной экспрессией продукта по меньшей мере одного гена; эукариотической клетки с измененной экспрессией продукта по меньшей мере одного гена, причем экспрессия этого продукта увеличена; эукариотической клетки с измененной экспрессией продукта по меньшей мере одного гена, причем экспрессия этого продукта уменьшена; или эукариотической клетки, содержащей отредактированный геном.

[0099] В некоторых вариантах осуществления изобретения эукариотическая клетка может быть клеткой млекопитающего или человека.

[00100] В дальнейших вариантах осуществления изобретения не встречающиеся в природе или сконструированные способами инженерии композиции, векторные системы или системы доставки, как описано в настоящем описании, могут использоваться для сайт-специфического нокаута генов; сайт-специфического редактирования генома; специфической интерференции последовательности ДНК; или мультиплексной инженерии генома.

[00101] Также изобретение относится к получению генного продукта из клетки, клеточной линии или организма, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество экспрессированного генного продукта может быть больше или меньше, чем количество генного продукта в клетке без измененной экспрессии или отредактированного генома. В некоторых вариантах осуществления изобретения генный продукт может быть изменен по сравнению с генным продуктом из клетки без измененной экспрессии или отредактированного генома.

[00102] Эти и другие варианты осуществления изобретения раскрыты в, очевидны из или охвачены следующим Подробным Описанием.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[00103] Новые признаки изобретения подробно сформулированы в приложенной формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ данного изобретения будет достигнуто при ознакомлении со следующим подробным описанием, которое включает материалы, иллюстрирующие принципы изобретения, и сопроводительные Фиг.к ним:

[00104] На фиг.1A и 1B изображена новая классификация систем CRISPR-Cas. Класс 1 включает многосубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cascade), и Класс 2 включает односубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cas9-подобные). На фиг.1B приведено другое описание новой классификации систем CRISPR-Cas.

[00105] На фиг.2 изображена молекулярная организация систем CRISPR-Cas.

[00106] На фиг.3 изображены структуры эффекторных комплексов типов I и III: общая архитектура/общее происхождение прослеживается несмотря на обширную дивергенцию последовательностей.

[00107] На фиг.4 изображена CRISPR-Cas как система, основанная на мотивах распознавания РНК (RRM).

[00108] На фиг.5 изображена филогению Cas1, где показан главный аспект эволюции системы CRISPR-Cas - рекомбинация эффекторных модулей cr-РНК в целях адаптации.

[00109] На фиг.6 представлен перечень систем CRISPR-Cas, а именно распространение типов/подтипов систем CRISPR-Cas среди архей и бактерий.

[00110] На фиг.7 изображен алгоритм для идентификации Cas-кандидатов.

[00111] На фиг.8A и 8B изображена организация полных локусов систем CRISPR-Cas 2 класса. Обозначены три подтипа типа II и подтипы V-A, V-B и V-C и тип VI. Подсемейства на основе филогении Cas1 также обозначены. Схема включает только общие гены, представленные в каждом подтипе; дополнительные гены, присутствующие в некоторых вариантах, опущены. Красным прямоугольником обозначен вырожденный повтор. Серые стрелки показывают направление транскрипции последовательности CRISPR. PreFran, Prevotella-Francisella. На фиг.8B приведено другое описание организации полных локусов нескольких систем CRISPR-Cas класса 2.

[00112] На фиг.9 изображены окрестности C2c1, т.е. геномная архитектура локусов CRISPR-Cas C2c1. Обозначено количество повторов в последовательностях CRISPR. Для каждого геномного контига обозначен числовой ID Genebank и координаты локуса.

[00113] На Фиг.10A и 10B изображены представления о дереве последовательностей белка Cas1. Дерево на фиг.10B было построено на основе множественного выравнивания 1498 последовательностей Cas1, которые содержали 304 филогенетически информативных позиции. Ветви, соответствующие системам класса 2 подчеркнуты: голубым - тип II; оранжевым - подтип V-A; красным - подтип V-B; коричневым - подтип V-C; фиолетовым - тип VI. Вставки показывают расширенные ветви новых (под)типов. Значения поддержки бутстрэпа приведены в процентах и показаны только для некоторых соответствующих ветвей.

[00114] На рисунках 10C-10W показано полное дерево Cas1, которое схематично показано на фиг.10B в формате Newick с видовыми названиями и значениями поддержки бутстрэпа. Дерево было построено с помощью программы FastTree (опции "-gamma -wag"). Множественное выравнивание последовательностей Cas1 было отфильтровано с порогом однородности 0,1 и порогом возникновения промежутка 0,5 до реконструкции дерева.

[00115] На фиг.11 изображена доменная организация семейств класса 2.

[00116] На фиг.12 изображены участки гомологии TnpB белков класса 2.

[00117] На Фиг.13A-13N представлено другое изображение доменной архитектуры и консервативных мотивов эффекторных белков класса 2. Фиг.13A иллюстрирует типы II и V: нуклеазы-производные TnpB. Верхний ряд на рисунке демонстрирует нуклеазы RuvC из Thermos thermophilus (PDB ID: 4EP5) с обозначением каталитических аминокислотных остатков. Ниже показана архитектура каждого домена, приведено выравнивание консервативных мотивов для отдельных представителей соответствующих семейств белков (единственная последовательность для RuvC). Каталитические остатки показаны белыми буквами на черном фоне, консервативные гидрофобные остатки выделены желтым; консервативные остатки малых аминокислот выделены зеленым; в выравнивании спирального мостика положительно заряженные остатки выделены красным. Предсказанная вторичная структура показана ниже выровненных последовательностей: H обозначает α-спирали, Е обозначает выпрямленную конформацию (β-структура). Малоконсервативные последовательности спейсеров между блоками выравнивания обозначены числами. Фиг.13B иллюстрирует тип VI: белки содержат 2 HEPN-домена, которые могут демонстрировать РНК-азную активность. Верхние блоки выравнивания содержат отдельные описанные ранее домены HEPN, нижние блоки содержат каталитические мотивы из эффекторных белков типа VI. Обозначения как на фиг.13 A. Фиг.13C иллюстрирует ближайшие гомологи новых эффекторных белков типа V из числа кодируемых транспозонами белков: непересекающиеся наборы гомологов. Фиг.13D-H иллюстрирует множественное выравнивание семейства белка C2c1. Данное выравнивание выполнено с использованием программы MUSCLE и изменено вручную на основе локальных попарных выравниваний, полученных с помощью PSI-BLAST. Для каждой последовательности приведен номер-идентификатор GenBank (GI) и систематическое название организма. Вторичная структура предсказана с помощью Jpred и показана ниже последовательности, использованной в качестве последовательности-запроса (обозначения: H - альфа-спираль, E - бета-структура). CONSENSUS рассчитан для каждого столбца выравнивания путем сравнения суммы парных весов каждого столбца для гомогенных столбцов (совпадающий остаток во всех выровненных последовательностях) и случайного столбца с порогом гомогенности 0,8. Мотивы активного сайта RuvC-подобного домена показаны ниже выравнивания. На фиг.13I представлено множественное выравнивание для семейства белка C2c3. Данное выравнивание выполнено с использованием программы MUSCLE. Для каждой последовательности обозначены внутренний приписанный ей номер и номер-идентификатор GenBank (GI) метагеномного контига, кодирующего соответствующий белок С2с3. Вторичная структура предсказана с помощью Jpred и показана ниже выравнивания (обозначения: H - альфа-спираль, E - бета-структура). CONSENSUS рассчитан для каждого столбца выравнивания путем сравнения суммы парных весов каждого столбца для гомогенных столбцов (совпадающие остатки во всех выровненных последовательностях) и случайного столбца с порогом гомогенности 0,8. Мотивы активного сайта RuvC-подобного домена показаны ниже выравнивания С-концевого домена. Фиг.13J-N иллюстрирует множественное выравнивание семейства белка C2c2. Выравнивание выполнено с использованием программы MUSCLE и изменено вручную на основе локальных выравниваний с помощью PSI-BLAST. Для каждой последовательности обозначен номер-идентификатор GenBank (GI) и систематическое название организма. Вторичная структура предсказана с помощью Jpred и показана ниже последовательности, использованной в качестве последовательности-запроса (обозначения: H - альфа-спираль, E - бета-структура). CONSENSUS рассчитан для каждого столбца выравнивания путем сравнения суммы парных весов каждого столбца для гомогенных столбцов (совпадающие остатки во всех выровненных последовательностях) и случайного столбца с порогом гомогенности 0,8. Мотивы активных сайтов домена HEPN показаны ниже выравнивания.

[00118] На фиг.14 изображены окрестности C2c3, т.е. геномная архитектура C2c3-локусов системы CRISPR-Cas. Указано количество повторов в последовательностях CRISPR. Для каждого геномного контига обозначены номер-идентификатор GenBank и координаты локуса.

[00119] На фиг.15 изображены окрестности C2c2, т.е. геномная архитектура C2c2-локусов системы CRISPR-Cas. Указано количество повторов в последовательностях CRISPR. Для каждого геномного контига обозначены номер-идентификатор GenBank и координаты локуса.

[00120] На фиг.16 изображен мотив RxxxxH домена HEPN семейства C2c2.

[00121] На фиг.17 изображен C2C1: 1. Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025.

[00122] На фиг.18 изображен C2C1: 4. Desulfonatronum thiodismutans штамма MLF-1.

[00123] На фиг.19 изображен C2C1: 5. бактерии Opitutaceae TAV5.

[00124] На фиг.20 изображен C2C1: 7. Bacillus thermoamylovorans штамма B4166.

[00125] На фиг.21 изображен C2C1: 9. Bacillussp. NSP2.1.

[00126] На фиг.22 изображен C2C2: 1. бактерии Lachnospiraceae MA2020.

[00127] На фиг.23 изображен C2C2: бактерии 2. Lachnospiraceae NK4A179.

[00128] На фиг.24 изображен C2C2: 3. [Clostridium] aminophilum DSM 10710.

[00129] На фиг.25 изображен C2C2: 4. бактерии Lachnospiraceae NK4A144.

[00130] На фиг.26 изображен C2C2: 5. Carnobacterium gallinarum DSM 4847.

[00131] На фиг.27 изображен C2C2: 6. Carnobacterium gallinarum DSM 4847

[00132] На фиг.28 изображен C2C2: 7. Paludibacter propionicigenes WB4.

[00133] На фиг.29 изображен C2C2: 8. Listeria seeligeri серовара 1/2b.

[00134] На фиг.30 изображен C2C2: 9. Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317.

[00135] На фиг.31 изображен C2C2: 10. Listeria bacterium FSL M6-0635.

[00136] На фиг.32 изображен C2C2: 11. Leptotrichia wadei F0279.

[00137] На фиг.33 изображен C2C2: 12. Leptotrichia wadei F0279.

[00138] На фиг.34 изображен C2C2: 14. Leptotrichia shahii DSM 19757.

[00139] На фиг.35 изображен C2C2: 15. Rhodobacter capsulatus SB 1003.

[00140] На фиг.36 изображен C2C2: 16. Rhodobacter capsulatus R121.

[00141] На фиг.37 изображен C2C2: 17. Rhodobacter capsulatus DE442.

[00142] На фиг.38 изображено дерево DR-последовательностей.

[00143] На фиг.39 изображено дерево белков C2c2.

[00144] Фиг.40A-40D содержит таблицу, включающую описания 63 больших кодирующих белки генов вблизи генов cas1, идентифицированных с помощью описанного в настоящем описании вычислительного способа. Описанные в настоящем описании представители новых подтипов (V-B, V-C, VI) выделены цветом. Последовательности белков для представителей типа V-B и типа IV, кодирующих AUXO014641567.1, AUXO011689375.1, AUXO011689375.1, AIJXO011277409.1, AUXO014986615.1 не проанализированы, т.к. для этих последовательностей не может быть установлена видовая принадлежность.

[00145] Фиг.41A-41M содержат таблицу, демонстрирующую результаты анализа локусов V- B типа (кодирующих белок C2c1). * cas1cas4 - ген, содержащий домены cas4 и cas1; CRISPR - CRISPR-повторы; SOS - гены SOS-ответа; unk - гипотетический белок; > - направление кодирующей последовательности гена; [D] - вырожденный повтор (определены, где возможно); [T] - tracr-РНК. Фиг.41C-J иллюстрирует анализ CRISPR-последовательностей для локусов V-B типа (кодирующих белки C2c1), как описано в настоящем описании (раздел CRISPR является частью базового результата работы pilercr (см. описание результата работы на сайте pilercr: http://www.drive5.com/pHercr/); фолдинг повторов выполнен с помощью mfold (см. описание результата работы на сайте mfold: http://mfold.ma.albany.edu/?q=mfQld/DNA-Folding-FGrm); результаты фолдинга повторов и анализа CRISPR-последовательностей помещены после детального описания каждого случая; расположение CRISPR см. по ссылке в таблице на фиг.41 A-В. Фиг.41K иллюстрирует классификацию CRISPRmap CRISPR-повторов локусов типа V-B (кодирующих белок C2c1) как описано в настоящем описании с помощью CRISPRmap (детали см. http://rna.informatik.uni-freiburg.de/CRISPRmap/Input.jsp). Фиг.41L иллюстрирует вырожденные повторы локусов V-B типа (кодирующие белок C2c1) обнаруженные, как описано в настоящем описании, с помощью алгоритма поиска CRISPR-последовательностей (http://crispr.u-psud.fr/Server/). Столбец нормальных повторов содержит нормальный повтор, столбец спейсеров - последний спейсер, столбец downstream - область низлежащих последовательностей, начиная с вырожденного повтора (250 п.н.); номер последовательности соответствует номеру последовательности CRISPR в соответствующем локусе (см. Таблицу на фиг.41 A-В); выделенная желтым область имеет полное совпадение между нормальным повтором и вырожденным повтором (при несовпадении с другой частью вырожденного повтора). Фиг.41M иллюстрирует предсказанные структуры tracr-РНК, образующие пары оснований с этими повторами. Tracr-РНК для Alicyclobacillus acidoterrestric был идентифицирован с помощью секвенирования РНК. Для остальных локусов предполагаемые tracr-РНК идентифицированы на основе присутствия последовательности антипрямого повтора (DR) (Anti-DR). Последовательности антипрямых повторов были идентифицированы с помощью Geneious (www.geneious.com) путем поиска последовательностей внутри каждого соответствующего локуса CRISPR с высокой гомологией к DR. 5'- и 3'-концы каждой предполагаемой tracr-РНК были определены с помощью вычислительного прогнозирования сайтов старта бактериальной транскрипции и терминации с помощью соответственно BPROM (www.softberry.com) и ARNOLD (rna.ig-mors.u-psud.fr/toolbox/amold/). Предсказания кофолдинга получены с помощью Geneious, 5'-концы выделены синим, 3'-концы выделены оранжевым.

[00146] Фиг.42A-42N содержит таблицу, демонстрирующую результаты анализа локусов типа VI (кодирующих белок C2c2). *CRISPR - CRISPR повторы; unk - гипотетический белок; > - направление кодирующей последовательности гена; [D] - вырожденный повтор (определены, где возможно); [T] - tracr-РНК, фиг.42C-I демонстрируют результаты анализа CRISPR-последовательностей локусов типа VI (кодирующих белок C2c2) как описано в настоящем описании (раздел CRISPR является частью базового результата работы pilercr (см. описание результата работы на сайте pilercr: http://www.drive5.com/pilercr/); фолдинг повторов выполнен с помощью mfold (см. описание результата работы на сайте mfold: http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfQld/DNA-Folding-Form); результаты фолдинга повторов и анализа CRISPR-последовательностей помещены после детального описания каждого случая; см. расположение CRISPR по ссылке в таблице на фиг.42 A-В. Фиг.42J иллюстрирует классификацию CRISPRmap CRISPR повторов локусов типа VI (кодирующих белок C2c2) с помощью, как описано в настоящем описании CRISPRmap (детали см. http://rna.informatik.uni-freiburg.de/CRISPRmap/Input.jsp). Фиг.42K-L иллюстрирует вырожденные повторы локусов типа VI (кодирующие белок C2c2) как описано в настоящем описании, обнаруженные с помощью алгоритма по поиску CRISPR-последовательностей (http://crispr.u-psud.fr/Server/). Столбец нормальных повторов содержит нормальный повтор, столбец спейсеров - последний спейсер, столбец downstream - область низлежащих последовательностей, начиная с вырожденного повтора (250 п.н.); номер последовательности соответствует числовому значению CRISPR-последовательности в соответствующем локусе (см. таблицу на фиг.42 A-В); выделенная желтым область имеет полное совпадение между нормальным повтором и вырожденным повтором (при несовпадении с другой частью вырожденного повтора). Фиг.42M-N иллюстрирует предсказанные структуры tracr-РНК, образующие пары оснований с этими повторами. Предполагаемые tracr-РНК были идентифицированы на основе присутствия последовательности антипрямого повтора (DR) (Anti-DR). Последовательности антипрямых повторов были идентифицированы с помощью Geneious (www.geneious.com) путем поиска последовательностей внутри каждого соответствующего локуса CRISPR с высокой гомологией с DR. 5'- и 3'-концы каждой предполагаемой tracr-РНК были определены с помощью вычислительного прогнозирования сайтов старта бактериальной транскрипции и терминации с помощью BPROM (www.softberry.com) и ARNOLD (rna.ig-mors.u-psud.fr/toolbox/amold/) соответственно. Предсказания кофолдинга получены с помощью Geneious, 5'-концы выделены синим, 3'-концы выделены оранжевым.

[00147] Фиг.43A-43F содержит таблицу, демонстрирующую результаты анализа локусов типа V-С (кодирующих белок C2c3). *CRISPR - CRISPR-повторы; unk - гипотетический белок; > - направление кодирующей последовательности гена; [D] - вырожденный повтор (определены, где возможно). Фиг.43C - демонстрируют результаты анализа CRISPR-последовательностей локусов типа V-С (кодирующих белок C2c3) как описано в настоящем описании (раздел CRISPR является частью базового результата работы pilercr (см. описание результата работы на сайте pilercr: http://www.drive5.com/pilercr/); фолдинг повторов выполнен с помощью mfold (см. описание результата работы на сайте mfold: http://mfold.ma.albany.edu/?q=mfQld/DNA-Folding-Form); результаты фолдинга повторов и анализа CRISPR-последовательностей помещены после детального описания каждого случая; см. расположение CRISPR по ссылке в таблице на фиг.43 A-В. Показаны статистически значимые совпадения BLAST для спейсера с прокариотами и их вирусами. Фиг.43E иллюстрирует классификацию CRISPRmap CRISPR повторов локусов типа V-С (кодирующих белок C2c3) как описано в настоящем описании с помощью CRISPRmap (детали см. http://rna.informatik.uni-freiburg.de/CRISPRmap/Input.jsp). Фиг.43F иллюстрирует вырожденные повторы локусов типа V-С (кодирующие белок C2c3) как описано в настоящем описании, обнаруженные с помощью алгоритма по поиску CRISPR-последовательностей (http://crispr.u-psud.fr/Server/). Столбец нормальных повторов содержит нормальный повтор, столбец спейсера - последний спейсер, столбец downstream - область низлежащих последовательностей, начиная с вырожденного повтора (250 п.н.); номер последовательности соответствует номеру CRISPR-последовательности в соответствующем локусе (см. таблицу на фиг.43 A-В); выделенная желтым область имеет полное совпадение между нормальным повтором и вырожденным повтором (при несовпадении с другой частью вырожденного повтора).

[00148] На фиг.44A-44E приведен полный список локусов CRISPR-Cas в геномах, где были обнаружены белки C2с1 или C2c2. Гены белков C2c1 и C2c2 выделены желтым.

[00149] На фиг.45A-45C проиллюстрировано выравнивание локусов Listeria, кодирующих предполагаемую систему CRISPR-Cas типа VI. Выровненный синтетический участок, соответствующий контигу AODJ01000004.1 Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317 с координатами 42281-46274 и контигу JNFB01000012.1 Listeria newyorkensis, штамм FSL M6-0635, с координатами 169489-173541. Обозначения: ген C2c2 выделен голубым, повторы CRISPR - пурпурным, вырожденные повторы - пурпурным, спейсеры - жирным.

[00150] На фиг.46A-46D представлено функциональное подтверждение локуса C2c1 Alicyclobacillus acideoterrestris. Фиг.46A: секвенирование РНК демонстрирует высокую экспрессию локуса C2c1 Alicyclobacillus acideoterrestris при помощи процессированной cr-РНК, включающей прямой повтор длиной 14 нуклеотидов на 5'-конце и спейсер длиной 20 нуклеотидов. Предполагаемая tracr-РНК длиной 79 нуклеотидов стабильно экспрессируется в том же направлении, что и кластер генов cas. Фиг.46B: Анализ с использованием нозерн-блоттинга РНК, экспрессируемой с эндогенного локуса (М), и минимальной последовательности первого спейсера (S) показывают процессированные cr-РНК с прямым повтором на 5'-конце и наличие небольшой предполагаемой tracr-РНК. Стрелки указывают положения зондов и их направление. Фиг.46C: Совместный фолдинг прямого повтора cr-РНК и предполагаемой tracr-РНК in silico показывает стабильную вторичную структуру и комплементарность между двумя РНК. 5'-основания окрашены в синий цвет, а 3'-основания окрашены в оранжевый цвет. Фиг.46D: Гетерологичная экспрессия локуса Alicyclobacillus acideoterrestris C2c1 в pACYC-184, трансформированном в E. coli, дает идентичные результаты с экспрессией, наблюдаемой в эндогенном штамме (фиг.46А). Процессированные cr-РНК имеют прямой повтор DR длиной 14 нуклеотидов на 5'-конце и спейсер длиной 20 нуклеотидов, и предполагаемая tracr-РНК длиной 79 нуклеотидов экспрессируется стабильно.

[00151] На фиг.47A-47C представлена идентификация соседнего с протоспейсером мотива (PAM) для фермента C2c1 из Alicyclobacillus acideoterrestris. Фиг.47A: Схема скрининга для определения PAM. Фиг.47B: Истощение на левом 5'-конце библиотеки PAM показывает наличие TTM PAM на 5'-конце. Истощение определяется как логарифм по основанию 2, причем количество PAM выше порога 3,5 используются для расчета оценки энтропии для каждой позиции. Фиг.47C: Подтверждение PAM для C2c1 из Alicycclobacillus acideoterrestris путем измерения интерференции с восемью различными PAM. PAM, соответствующие мотиву TTN, демонстрируют наличие истощения, измеренное при помощи метода колониеобразующих единиц (КОЭ).

[00152] На фиг.48A-F представлена охарактеризация условия, в которых C2c1 из Alicyclobacillus acideoterrestris производит расщепление in vitro. Фиг.48А: расщепление in vitro мишени EMX1 лизатом клеток человека, экспрессирующим C2c1 из Alicyclobacillus acideoterrestris, показывает, что нацеливание C2c1 Alicyclobacillus acideoterrestris in vitro надежно и зависит от tracr-РНК. Ненацеливающая cr-РНК. (cr-РНК 2) не может расщеплять мишень EMX1, тогда как cr-РНК 1, нацеливающая на EMX1, обеспечивает сильное расщепление в присутствии Mg⁺⁺ и слабое расщепление в отсутствие Mg⁺⁺. Фиг.48B: расщепление мишени EMX1 in vitro в присутствии tracr-РНК различной длины идентифицирует типы длиной 78 нуклеотидов в качестве минимальной длины tracr-РНК, также отмечается повышение эффективности расщепления для формы длиной 91 нуклеотидов. Фиг.48C: Анализ температурной зависимости расщепления мишени EMX1 in vitro показывает, что оптимальный температурный диапазон расщепления AacC2c1 составляет от 40 до 55°C. Фиг.48D: Подтверждение in vitro требований к PAM белка AacC2c1 с четырьмя различными PAM. Те PAM, которые были комплементарны мотиву TTN, расщеплялись эффективно. Фиг.48E: При фолдинге in silico химерной sg-РНК AacC2c1 наблюдается формирование стабильной структуры с прямым повтором: обратное соединение сегментов, происходящих из tracr-РНК (отмечено красным) и cr-РНК (отмечено черным). Фиг.48F: Сравнение расщепления мишеней in vitro в присутствии cr-РНК-tracr-РНК AacC2c1 и sg-РНК показывает сходную эффективность расщепления.

[00153] На фиг.49A-49C представлено функциональное подтверждение локуса C2c1 Bacillus thermoamylovorans. Фиг.49A: Гетерологичная экспрессия локуса C2c1 Bacillus thermoamylovorans в E. coli. Предполагаемая tracr-РНК экспрессируется в значительной степени и процессируется до 91 нуклеотидов. Процессированные cr-РНК также присутствуют и имеют прямой повтор длиной 14 нуклеотидов и спейсер длиной 19 нуклеотидов на 5'-конце. Фиг. 49B: при кофолдинге in silico прямого повтора cr-РНК и предполагаемой tracr-РНК показано образование стабильной вторичной структуры и наличие комплементарности между двумя РНК. 5'-концы окрашены в синий цвет, а 3'-концы окрашены в оранжевый цвет. Фиг.49C: тстощение на 5' конце левой PAM библиотеки показывает наличие ATTN PAM на 5'-конце. Истощение измеряется как логарифм по основанию 2, и количество PAM выше порога 3,5 используется для расчета оценки энтропии для каждой позиции.

[00154] На фиг.50 представлены все результаты считывания для локуса C2C1Bacillus sp.

[00155] На фиг.51 представлены отфильтрованные результаты считывания от 0 до 55 пар оснований в локусе C2C1 Bacillus sp.

[00156] На фиг.52 представлен кофолдинг последовательности прямого повтора и tracr-РНК, соответствующих локусу C2C1 B. sp.

[00157] На фиг.53 проиллюстрирован эволюционный сценарий для систем CRISPR-Cas. Предполагается, что белок Cas8 возник путем инактивации Cas10 (обозначен белым X), что сопровождалось значительным ускорением эволюции. Сокращения: TR, концевые повторы; TS, концевые последовательности, HD, семейство эндонуклеаз HD; HNH, семейство эндонуклеаз HNH, RuvC, семейство эндонуклеаз RuvC; HEPN, предполагаемая эндорибонуклеаза суперсемейства HEPN. Показанные серым области генов и белков обозначают последовательности, которые были закодированы в соответствующих мобильных элементах, но были утрачены в ходе эволюции систем CRISPR-Cas.

[00158] Чертежи приведены в настоящем описании исключительно в иллюстративных целях и не обязательно выполнены с соблюдением масштаба.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00159] Прежде чем будут описаны способы по настоящему изобретению, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается отдельными описанными в настоящем описании способами, компонентами, продуктами или их комбинациями, в силу того, что такие способы, продукты и комбинации, безусловно, могут, бесспорно, варьироваться. Необходимо понимать и что используемая в настоящем описании терминология не ставит своей целью наложение ограничений, поскольку рамки настоящего изобретения ограничиваются только прилагаемой формулой изобретения.

[00160] В целом, понятие "система CRISPR-Cas или CRISPR", используемое также в предшествующих документах, таких как W0 2014/093622 (PCT/US2013/074667), используется для совместного обозначения транскриптов и других компонентов, участвующих в экспрессии или управлении активностью CRISPR-ассоциированных ("Cas") генов, включая последовательности, кодирующие ген Cas, последовательность tracr (трансактивирующая CRISPR) (например, tracr-РНК или активная частичная tracr-РНК), последовательность tracr-помощника (включащая "прямой повтор" и процессируемый tracr-РНК частичный прямой повтор в составе эндогенной системы CRISPR), направляющую последовательность (также называемую "спейсером" в составе эндогенной системы CRISPR) или "молекулу(ы) РНК", как этот термин использован в настоящем описании (например, молекулу(ы) РНК, направляющую Cas, такие как Cas9, например, CRISPR-РНК и трансактивирующую (tracr) РНК или одиночную направляющую РНК (sgRNA) (химерная РНК)) или другие последовательности и транскрипты локуса CRISPR. В целом, система CRISPR характеризуется компонентами, которые способствуют формированию комплекса CRISPR на участке последовательности-мишени (в составе эндогенной системы CRISPR также называемый протоспейсером). В контексте формирования комплекса CRISPR, "последовательность-мишень" означает последовательность, для которой целенаправленно разработана комплементарная направляющая последовательность, причем гибридизация между последовательностью-мишенью и направляющей последовательностью способствует образованию комплекса CRISPR. Последовательность-мишень может включать любой полинуклеотид, в том числе полинуклеотиды РНК или ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень расположена в ядре или цитоплазме клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения прямые повторения могут быть идентифицированы in silico путем поиска повторяющихся мотивов, которые удовлетворяют любому или всем из следующих критериев: 1. обнаружены в пределах области геномной последовательности размером 2 т.п.н., фланкирующей локусы CRISPR II типа; 2. длина от 20 до 50 п.н.; и 3. разделяющие их промежутки длиной 20-50 п.н. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут быть использованы любые 2 из этих критериев, например, 1 и 2, 2 и 3 или 1 и 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут быть использованы все 3 критерия.

[00161] В вариантах осуществления изобретения такие понятия как зрелая cr-РНК, единственная направляющая РНК, направляющая последовательность и направляющая РНК, т.е. РНК, способная направлять Cas к целевому локуса генома, используются взаимозаменяемо в предшествующих цитируемых документах, таких как W0 2014/093622 (PCT/US2013/074667). В целом, направляющей последовательностью является любая полинуклеотидная последовательность, имеющая комплементарность к полинуклеотиду-мишени, достаточную для гибридизации с последовательностью-мишенью и направления последовательности на прямое специфическое связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень комплементарности между направляющей последовательностью и соответствующей ей последовательностью-мишенью при условии оптимального выравнивания с использованием надлежащего алгоритма выравнивания близок или превосходит значения 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или выше. Оптимальное выравнивание может быть определено с использованием любого надлежащего алгоритма для выравнивания последовательностей включая, но не ограничиваясь следующими: алгоритм Смита-Ватермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза-Уилера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAST, Novoalign (Novocraft Technologies; доступен на www.novocraft.com), ELAND (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), SOAP (доступен на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступен на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность имеет длину, примерно равную или превышающую 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность имеет длину, меньшую 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов. Предпочтительная длина направляющей последовательности составляет 10-30 нуклеотидов. Способность направляющей последовательности направлять специфически определяемое последовательностью связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью может быть оценена любой подходящей методикой. Например, компоненты системы CRISPR, достаточные для формирования комплекса CRISPR, включая проверяемую направляющую последовательность, могут быть доставлены в клетку-хозяина, содержащую соответствующую последовательность-мишень, в том числе путем трансфекции с использованием векторов, кодирующих компоненты последовательности CRISPR с последующей количественной оценкой локализации предпочтительного расщепления последовательности-мишени, в частности, с использование анализа, как описано в настоящем описании. Сходным образом расщепление последовательности нуклеотида-мишени может быть оценено in vitro при использовании последовательности-мишени, компонентов комплекса CRISPR, включая проверяемую направляющую последовательность и направляющую последовательность-контроль, отличную от тестируемой направляющей последовательности при сравнении уровня или скорости расщепления последовательности-мишени между реакциями с участием тестируемой и контрольной направляющих последовательностей. Другие способы анализа также допустимы и могут быть выбраны специалистом в данной области.

[00162] В классических системах CRISPR-Cas уровень комплементарности между последовательностью направляющей молекулы и соответствующей ей последовательностью-мишенью может быть примерно равен или превышать 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или 100%; направляющая молекула или РНК или sg-РНК могут быть иметь длину, примерно равную или превышающую 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов; либо направляющая молекула или РНК или sg-РНК могут иметь длину, меньшую чем приблизительно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов; и преимущественно tracr-РНК имеет длину 30 или 50 нуклеотидов. Однако в одном из своих аспектов изобретение призвано уменьшить нецелевые взаимодействия, например, уменьшить взаимодействие направляющей молекулы с молекулой-мишенью с низкой комплементраностью. Действительно, в примерах показано, что в изобретение вовлекает мутации, делающие систему CRISPR-Cas способной различать последовательности-мишени и последовательности, не являющиеся мишенями, с комплементарностью более 80% до примерно 95%, например, с комплементарностью 83%-84%, 88-89% или 94-95% (к примеру, различая молекулу-мишень, имеющую 18 нуклеотидов молекулы, не являющейся мишенью, длиной в 18 нуклеотидов с 1, 2 или 3 нарушениями комплементарности). В соответствии с этим, в контексте настоящего изобретения уровень комплементарности между направляющей последовательностью и соответствующей ей молекулой-мишенью превышает 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100%. Для молекулы, не являющейся мишенью, он составляет менее 100%, 99,9%, 99,5%, 99%, 99%, 98,5%, 98%, 97,5%, 97%, 96,5%, 96%, 95,5%, 95%, 94,5%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% или 80% комплементарности между ее последовательностью и направляющей молекулой, причем предпочтительно, чтобы не являющаяся мишенью молекула имела комплементарность последовательности 100%, 99,9%, 99,5%, 99%, 99%, 98,5%, 98%, 97,5%, 97%, 96,5%, 96%, 95,5%, 95% или 94,5% с направляющей молекулой.

[00163] В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения направляющая РНК (способная направлять Cas к локусу-мишени) может включать (1) направляющую последовательность, способную к гибридизации с геномным локусом-мишенью в эукариотической клетке; (2) последовательность tracr; и (3) последовательность-партнер tracr. Компоненты (1)-(3) могут находится на одной РНК, т.е. sg-РНК (расположенной в направлении от 5' к 3'-концу), либо tracr-РНК может являться РНК, отличной от РНК, содержащей направляющую последовательность и последовательность tracr. Tracr гибридизуется с последовательностью-партнером tracr и направляет комплекс CRISPR/Cas к последовательности-мишени.

[00164] Аспекты изобретения касаются идентификации и конструирования способами инженерии новых эффекторных белков, связанных с системами CRISPR-Cas класса 2. В предпочтительном варианте осуществления эффекторный белок включает односубъединичный эффекторный модуль. В будущем варианте осуществления изобретения эффекторный белок является функциональным в прокариотических или эукариотических клетках для применения in vitro, in vivo или ex vivo. Один аспект изобретения охватывает вычислительные способы и алгоритмы для прогнозирования новых систем CRISPR-Cas класса 2 и определения составляющих их компонентов.

[00165] В одном из вариантов осуществления вычислительный способ идентификации новых локусов системы CRISPR-Cas класса 2 включает следующие шаги: обнаружение всех контигов, кодирующих белок Cas1; идентификация всех предсказанных генов, кодирующих белки, в пределах 20 т.п.н. от гена cas1; сравнение идентифицированных генов со специфическими профилями белков Cas и предсказание последовательностей CRISPR путем отбора неклассифицированных возможных локусов CRISPR-Cas, содержащих белки с последовательностями длиной более 500 аминокислот (>500 а.к.); анализ отобранных кандидатов с использованием анализов PSI-BLAST и HHPred для выделения и идентификации новых локусов CRISPR-Cas класса 2. В дополнение к вышеупомянутым шагам возможные кандидаты могут быть дополнительно проанализированы путем поиска гомологов по метагеномным базам данных.

[00166] Одним из аспектов обнаружения всех контигов, кодирующих белок Cas1, является использование программы GenemarkS для предсказания генов, как более подробно описано в статье "GeneMarkS: a self-training method for prediction of gene starts in microbial genomes. Implications for finding sequence motifs in regulatory regions," John Besemer, Alexandre Lomsadze and Mark Borodovsky, Nucleic Acids Research (2001) 29, pp 2607-2618, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[00167] В одном аспекте проводится идентификация всех предсказанных генов, кодирующих белки, с помощью сравнения идентифицированных генов со специфическими профилями белков Cas и их аннотирования согласно Базе Данных Консервативных Доменов NCBI (CDD), которая состоит из коллекции хорошо аннотированных многочисленных моделей выравнивания последовательностей для древних доменов и полноразмерных белков. Они доступны в виде позиционных весовых матриц (PSSM) для быстрой идентификации консервативных доменов в последовательностях белков посредством анализа RPS-BLAST. CDD включает домены, курируемые NCBI, которые используют информацию о 3D-структуре, чтобы точно определить границы доменов и обеспечить понимание взаимоотношений между последовательностью/структурой/функцией, а также модели домена, импортированные из многих внешних баз данных (Pfam, SMART, COG, PRK, TIGRFAM). В следующем аспекте для предсказания последовательностей CRISPR использовалась программы PILER-CR, которая является общедоступным программным обеспечением для поиска CRISPR-повторов, как описано в статье "PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats", Edgar, R.C., BMC Bioinformatics, Jan 20:8:18(2007), включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[00168] В следующем аспекте проводят индивидуальный анализ каждого случая с использованием PSI-BLAST (Средство поиска основного локального выравнивания с учетом позиции). Анализ PSI-BLAST использует позиционную весовую матрицу (PSSM) или профиль множественного выравнивания последовательностей, обнаруженных выше заданного весового порога при белок-белковом анализе BLAST. Данная матрица PSSM используется, чтобы далее искать новые совпадения в базе данных и обновляется для последующих итераций с этими недавно обнаруженными последовательностями. Таким образом, PSI-BLAST является способом обнаружения отдаленных отношений между белками.

[00169] В другом аспекте индивидуальный анализ каждого случая предполагает использование HHpred, способа поиска по базам данных последовательностей и предсказания структуры, столь же простого в использовании, как BLAST или PSI-BLAST, и в то же время намного более чувствительного при нахождении отдаленных гомологов. Фактически, чувствительность способа HHpred конкурентоспособна по отношению к самым мощным серверам для предсказания структуры, доступным в настоящее время. HHpred является первым сервером, основанным на попарном сравнении профилей скрытых марковских моделей (СММ). В то время как большинство обычных способов поиска последовательностей выполняют поиск по базам данных последовательностей, таким как UniProt или NR, HHpred выполняет поиск по базам данных выравнивания, таким как Pfam или SMART. Это значительно упрощает получение списка совпадений со многим семействами последовательностей вместо разрозненных единичных последовательностей. Все основные общедоступные базы данных профилей и выравниваний доступны через HHpred. HHpred использует в качестве единичного поискового запроса последовательность или множественное выравнивание. В течение всего нескольких минут HHpred представляет результаты поиска в легком для чтения формате, подобном формату PSI-BLAST. Параметры поиска включают локальное или глобальное выравнивание и весовое сходство вторичной структуры. HHpred может произвести попарные выравнивания последовательностей поискового запроса и шаблона, объединенное множественное выравнивание поискового запроса и шаблона (например, для транзитивного поиска), а также модели 3D-структуры, вычисленные программным обеспечением MODELLER на основе выравниваний HHpred.

[00170] Термин "система нацеливания на нуклеиновые кислоты", где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК, и в некоторых аспектах может также относится к гибридам РНК-ДНК или их производным, относится собирательно к транскриптам и другим элементам, участвующим в экспрессии или направлении активности нацеливания на ДНК или РНК генов, ассоциированных с системой CRISPR ("Cas"), которые могут содержать последовательности, кодирующие белки Cas, нацеленные ДНК или РНК, и направляющую РНК, нацеленную ДНК или РНК, включая последовательность cr-РНК (cr-РНК) и (в системе CRISPR-Cas9, но не всех системах) последовательность РНК, транс-активирующей систему CRISPR/Cas (tracr-РНК), или другие последовательности и транскрипты локуса CRISPR, нацеленные на ДНК или РНК. В целом система нацеливания на РНК характеризуется элементами, способствующими формированию нацеленного на РНК комплекса на участке последовательности РНК, являющейся мишенью. В контексте образования нацеленного на ДНК или РНК комплекса, термин "последовательность-мишень" относится к последовательности ДНК или РНК, которой комплементарна направляющая РНК, нацеливающая на ДНК или РНК, где гибридизация между последовательностью-мишенью и направляющей РНК, нацеливающей на РНК, способствует образованию нацеливающего на РНК комплекса. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень расположена в ядре или цитоплазме клетки.

[00171] В одном из вариантов осуществления изобретения новые нацеленные на ДНК системы, также называемые нацеленными на ДНК CRISPR-Cas или CRISPR-Cas-нацеленными на ДНК системами в контексте настоящей заявки, основаны на идентифицированных белках Cas типа V (например, подтип V-A и подтип V-B), не требующих получения специализированных белков для специфических последовательностей РНК, а содержащих всего один эффекторный белок или фермент, который может быть запрограммирован молекулой РНК для распознавания определенной ДНК-мишени; иными словами, белок может быть привлечен к определенной ДНК-мишени с помощью указанной молекулы РНК. Аспекты изобретения относятся, в частности, к нацеленным на ДНК РНК-направляемым системам CRISPR C2c1 или C2c3.

[00172] В одном аспекте изобретения новые системы нацеливания на РНК, также называемые РНК- или РНК-нацеленные CRISPR/Cas или система нацеливания на РНК с помощью системы CRISPR-Cas, описанные в настоящем описании, основаны на идентифицированных белках Cas типа VI, не требующих создания индивидуальных белков для нацеливания на определенные последовательности РНК, кроме единственного фермента, который может быть запрограммирован молекулой РНК для узнавания конкретной ДНК-мишени, иными словами, фермент может быть предназначен для работы с конкретной ДНК-мишенью с помощью указанной молекулы РНК.

[00173] Как используют в настоящем описании, белок Cas или фермент CRISPR относится к любым белкам, представленным в новой классификации систем CRISPR-Cas. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к эффекторным белкам, идентифицированным в локусах CRISPR-Cas типа V, например, к кодирующим Cpf1 локусам, обозначаемым как подтип V-A. В настоящее время локусы подтипа V-A включают cas1, cas2, отдельный ген, обозначенный как cpf1 и кассету CRISPR. Cpf1 (ассоциированный с CRISPR белок Cpf1, подтип PREFRAN) - крупный белок (примерно 1300 аминокислот), содержащий подобный RuvC нуклеазный домен, гомологичный соответствующему домену Cas9, наряду с соответствующим богатому аргинином кластеру Cas9. Однако Cpf1 не имеет нуклеазного домена HNH, присутствующего во всех белках Cas9, а подобный RuvC домен является непрерывным в последовательности Cpf1, в противоположность Cas9, где он содержит длинные вставки, включая домен HNH. В соответствии с этим, в отдельных вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR-Cas включает только подобный RuvC нуклеазный домен.

[00174] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и системам, содержащим эффекторные белки, идентифицированные в локусах C2c1, обозначаемые как подтип V-B. В настоящем описании C2c1 относится к 1 кандидату 2 класса. Все локусы C2c1 кодируют слитую конструкцию Cas1-Cas4, Cas2, и крупного белка, который заявители обозначили как C2c1p, и обычно она прилегает к кассете CRISPR.

[00175] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к эффекторному белку, идентифицированному в локусах CRISPR-Cas типа VI, например, локусах C2c2. В настоящем описании C2c2 означает 2 кандидата 2 класса. Локусы C2c2 включают гены cas1 и cas2, наряду с крупным белком, обозначенным Заявителями как C2c2p и кассету CRISPR; однако, в отличие от C2c1p, C2c2p часто кодирует следующую за кассетой CRISPR последовательность, но не cas1-cas2.

[00176] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и системам, содержащим эффекторные белки, идентифицированные в локусах С2с3, обозначенные как подтип V-C. Все локусы C2c3 кодируют слитую конструкцию Cas1-Cas4, Cas2 и крупного белка, обозначенного Заявителями как C2c3p.

[00177] Аспекты настоящего изобретения также включают спосбы и применение композиций и систем, описанных в настоящем описании, для геномной инженерии, например, для изменения или управления экспрессией одного или более генов или одного или более генных продуктов в прокариотических или эукариотических клетках in vitro, in vivo или ex vivo.

[00178] Системы нацеливания на нуклеиновые кислоты, векторные системы, векторы и композиции, описанные в настоящем описании, могут использоваться в практике нацеливания на нуклеиновые кислоты, изменения или модификация синтеза генных продуктов, таких как белки, расщепления нуклеиновых кислот, редактирования нуклеиновых кислот, сплайсинга нуклеиновых кислот, переноса нуклеиновых кислот-мишеней, отслеживания нуклеиновых кислот-мишеней, выделения нуклеиновых кислот-мишеней, визуализации нуклеиновых кислот-мишеней и т.д.

[00179] Аспекты изобретения также охватывают способы и применения композиций и систем, описанных в настоящем описании, в генной инженерии, например, для изменения или манипулирования экспрессией одного или более генов или одного или более генных продуктов, в прокариотических или эукариотических клетках, in vitro, in vivo или ex vivo.

[00180] Способы по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, подразумевают внесение одной или более мутаций в эукариотическую клетку (in vitro, т.е. в выделенную эукариотическую клетку), как описано в настоящем описании, включая доставку в клетку вектора, как описано в настоящем описании. Мутации могут включать инсерцию, делецию или замену одного или более нуклеотидов в каждой последовательности-мишени клетки/клеток с помощью направляющей/их РНК или молекулы/молекул sg-РНК. Мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 1-75 нуклеотидов в каждой/ых указанной/ых клетке/ах с помощью направляющей/их РНК или молекулы/молекул sg-РНК. Мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1/, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или 75 нуклеотидов в каждой/ых указанной/ых клетке/ах с помощью направляющей/их РНК или молекулы/молекул sg-РНК. Мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, Ж 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или 75 нуклеотидов в каждой/ых указанной/ых клетке/ах с помощью направляющей/их РНК или молекулы/молекул sg-РНК. Мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или 75 нуклеотидов в каждой/ых указанной/ых клетке/ах с помощью направляющей/их РНК или молекулы/молекул sg-РНК. Мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 или 500 нуклеотидов в каждой/ых указанной/ых клетке/ах с помощью направляющей/их РНК или молекулы/молекул sg-РНК.

[00181] Для минимизации токсичности и снижения возможности проявления нецелевых эффектов является важным контроль концентрации доставляемой мРНК Cas и направляющей РНК. Оптимальные концентрации мРНК Cas и направляющей РНК могут быть определены путем тестирования различных концентраций в клеточных или отличных от человеческих эукариотических моделях на животных и с применением способов глубокого секвенирования для анализа степени модификации в потенциальных нецелевых геномных локусах. Другим альтернативным способом минимизации уровня токсичности и нецелевых эффектов, возможна доставка мРНК никазы Cas (например, Cas9 S. pyogenes с мутацией D10A) с двумя направляющими РНК, нацеленными на участок-мишень. Направляющие последовательности и стратегии минимизации токсичности и нецелевых эффектов могут использоваться, как описано в WO 2014/093622 (PCT/US 2013/074667) или при помощи мутации, как описано в настоящем описании.

[00182] Обычно в контексте эндогенной системы CRISPR образование комплекса CRISPR (включающего направляющую последовательность, гибридизованную с последовательностью-мишенью, находящейся в комплексе с одним или более белками Cas) приводит к расщеплению одной или обеих цепей вблизи последовательности-мишени (например, на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований от нее) или в ней самой. Без связи с теорией, последовательность tracr, которая может содержать или состоять из части последовательности tracr дикого типа (например, примерно или более чем 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 или более нуклеотидов последовательности tracr дикого типа), может также образовывать часть комплекса CRISPR, в частности, путем гибридизации по меньшей мере части последовательности tracr с полной последовательностью-партнером tracr или ее частью, функционально связанной с направляющей последовательностью.

[00183] Предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Cas, представляла сбой кодон-оптимизированную последовательность кодонам Cas. Примером оптимизированной по кодонам последовательности в данном случае является последовательность, оптимизированная для экспрессии в эукариоте, например, человеке (т.е. являющаяся оптимизированной для экспрессии в человеке) или другом эукариоте, животном или млекопитающем, как обсуждается в настоящем описании; см, например, кодон-оптимизированную для человека последовательность SaCas9 в WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667). Хотя это является предпочтительным, понятно, что возможны другие примеры и известная оптимизация кодонов для хозяина вида, отличного от человека, или оптимизация кодонов для конкретных органов. В некоторых вариантах осуществления, кодирующая фермент последовательность кодирует Cas и кодон-оптимизирована для экспрессии в конкретных клетках, например, эукариотических клетках. Такие эукариотические клетки могут принадлежать или быть выделены из конкретного организма, в частности млекопитающего, включая, но не ограничиваясь этим: человека, отличного от человека эукариота, животного или млекопитающего, как описано в настоящем описании, например, мыши, крысы, кролика, собаки, домашнего скота или отличного от человека млекопитающего или примата. В некоторых вариантах осуществления, способы модификации генетической принадлежности зародышевой линии человека и/или способы модификации генетической принадлежности животных, которые с большой долей вероятности могут причинить им страдания без получения существенной медицинской пользы для человека или животных, а также получаемые в результате таких способов животные, могут быть исключены. В целом под оптимизацией кодонов понимается процесс изменения последовательности с целью усиления экспрессии в клетках заданного организма путем замены по меньшей мере одного кодона (например, примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или большего количества кодонов) нативной последовательности на кодоны, которые более часто или наиболее часто используются в генах таковой клеток целевого организма при сохранении исходной аминокислотной последовательности. Различные виды демонстрируют конкретное смещение в частоте встречаемости отдельных кодонов для отдельных аминокислот. Смещение частоты кодонов (различие в использовании кодонов между различными организмами) зачастую коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая в свою очередь считается зависящей, в числе прочего, от свойств транслируемых кодонов и доступности отдельных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание конкретных тРНК в клетке обычно соответствует тем кодонам, которые используются наиболее часто при синтезе пептидов. В соответствии с этим, гены могут быть разработаны с учетом оптимизации кодонов, делающей экспрессию генов оптимальной в некотором организме. Таблицы используемых кодонов доступны, к примеру, в "Codon Usage Database", доступной по ссылке www.kazusa.orjp/codon/, причем такие таблицы могут быть адаптированы рядом способов. См. Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Также доступны компьютерные алгоритмы оптимизации кодонов для конкретной последовательности и экспрессии в конкретной клетке-хозяине, такие как Gene Forge (Aptagen; Джакобус, Пенсильвания, США). В некоторых вариантах осуществления один или более кодонов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более, либо все кодоны) в последовательности, кодирующей Cas, соответствуют наиболее часто используемым кодонам для определенной аминокислоты.

[00184] В определенных вариантах осуществления изобретения способы, как описано в настоящем описании, могут включать предоставление трансгенной по Cas клетки, в которой одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более молекул направляющих РНК, предоставлены или введены, функционально связанными в клетке с регуляторным элементом, содержащим промотор одного или более представляющих интерес генов. Термин "трансгенная по Cas клетка", как используют в настоящем описании, относится к клетке, в частности, эукариотической клетке, в геном которой встроен ген Cas. Природа, тип или происхождение такой клетки не ограничивается особым образом, согласно данному изобретению. Также способ введения трансгена Cas в клетку может различаться и являться любым из способов, доступных в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения трансгенная клетка Cas получена путем введения трансгена Cas в выделенную клетку. В некоторых других вариантах осуществления изобретения трансгенная клетка Cas может быть получена путем выделения клеток из трансгенного организма Cas. В качестве не ограничивающего примера, трансгенная клетка Cas, как используют в настоящем описании, может быть получена из трансгенного по Cas эукариотического организма, такого как эукориотический организм с встроенным Cas. См. WO 2014/093622 (PCT/US13/74667), включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Способы согласно патенту США № 8771985, выданному Sangamo BioSciences, Inc. и Sigma-Aldrich Co. LLC, и публикации патента США № 20110265198, закрепленной за Sangamo BioSciences, Inc., направленные на нацеливание на локус Rosa, могут быть изменены для использования системы CRISPR Cas данного изобретения. Способы публикации патента США № 20130236946, закрепленных за Cellectis, направленные на нацеливание на локус Rosa, могут также быть изменены для использования системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. В качестве следующего примера приводится ссылка на статью Platt et. al. (Cell; 159(2):440-455 (2014)) с описанием мыши со вставкой Cas9 мыши, включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Трансген Cas, кроме того, может включать кассету Lox-Stop-polyA-Lox(LSL), что делает экспрессию Cas управляемой с помощью рекомбиназы Cre. Альтернативно, клетка с трансгенным Cas может быть получена путем введения трансгена Cas в выделенную клетку. Системы доставки трансгенов хорошо известны в данной области. Примером может служить доставка трансгена Cas, например, в эукариотическую клетку посредством вектора (например, AAV, аденовируса, лентивируса) и/или частицы и/или наночастицы, как также описано в другой части настоящего описания.

[00185] Для квалифицированного специалиста будет понятно, что клетка, такая как трансгенная по Cas клетка в используемом в настоящем описании значении, может содержать дальнейшие изменения генома помимо наличия встроенного гена Cas или мутаций, являющихся результатом последовательность-специфического действия Cas, в комплексе с РНК, способной направлять Cas к локусу-мишени, например, такие как одна или более онкогенных мутаций, как в качестве неограничивающего примера описано в Platt et al. (2014), Chen et al., (2014), или Kumar et al. (2009).

[00186] В некоторых вариантах осуществления последовательность Cas является слитой с одной или более последовательностями сигнала ядерной локализации (NLS), в частности примерно с или более чем примерно с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах осуществления Cas содержит примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на N-конце или вблизи него, примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на C-конце или их комбинацию (например, ноль или по меньшей мере один или более NLS на N-конце и ноль или по меньшей мере один или более NLS на С-конце). В случае присутствия более одного NLS каждый из них может быть выбран независимо от других, в частности, отдельный NLS может быть представлен более чем одной копией и/или в комбинации с другим одним или более NLS, представленного одной или более копиями. В предпочитаемом варианте осуществления Cas содержит не более 6 NLS. В некоторых вариантах осуществления NLS считается N- или C-концевым, если ближайшая к концу аминокислота NLS находится на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или более аминокислот полипептидной цепи от N- или C-конца. Неограничивающие примеры NLS включают последовательности NLS, полученные на основе: NLS большого T-антигена вируса SV40, имеющего аминокислотную последовательность PKKKRKV (SEQ ID NO: X); NLS из нуклеоплазмина (например, состоящая из двух частей NLS нуклеоплазмана с последовательностью KRPAATKKAGQAKKKK) (SEQ ID NO: X); NLS c-myc, имеющего аминокислотную последовательность PAAKRVKLD (SEQ ID NO: X) или RQRRNELKRSP(SEQ ID NO: X); NLS hRNPA1 M9, имеющего последовательность NQ S SNFGPMKGGNFGGRS SGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: X); последовательности RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: X) из домена импортина-альфа; последовательности VSRKRPRP (SEQ ID NO: X) и PPKKARED (SEQ ID NO: X) T-белка миомы; последовательности POPKKKPL (SEQ ID NO: X) p53 человека; последовательности SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: X) c-abi IV мыши, последовательности DRLRR (SEQ ID NO: X) и PKQKKRK (SEQ ID NO: X) вируса гриппа NS1; последовательности RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: X) антигена дельта вируса гепатита; последовательности REKKKFLKRR (SEQ ID NO: X) белка Mx1 мыши; последовательности KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO: X) поли(АДФ-рибоза) полимеразы человека и последовательности RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: X) рецепторов глюкокортикоидных стероидных гормонов (человека). В целом, такая одна или более NLS имеют достаточную силу для того, чтобы вызвать накопление Cas в заметных количествах в ядре эукариотической клетки. В целом сила активности ядерной локализации может определяться рядом NLS в белках Cas, конкретным(и) использованным(и) NLS или комбинацией этих факторов. Например, поддающаяся обнаружению метка может быть связана с Cas таким образом, чтобы визуализировать локализацию в клетке, в частности, за счет сочетания способов определения локализации ядра (например, специфичный ядерный краситель, такой как DAPI). Клеточные ядра могут быть также выделены из клеток, содержимое которых может затем быть проанализировано с помощью любого подходящего способы обнаружения белков, такого как иммуногистохимия, вестерн-блоттинг или анализ активности ферментов. Накопление в ядре может быть определено косвенно, в частности, с помощью анализа эффекта образования комплексов CRISPR (например, анализ расщепления ДНК или мутаций в последовательности-мишени, или анализ изменения экспрессии генов вследствие образования комплексов CRISPR и/или активности ферментов Cas), в сравнении с контролем, не подвергнутым воздействию Cas или комплекса или подвергнутым действию Cas, лишенного одной или более NLS.

[00187] В некоторых аспектах изобретение включает такие векторы, например, для доставки или введения в клетку Cas и/или РНК, способной направлять Cas к локусу-мишени (т.е. направляющей РНК), а также для воспроизведения этих компонентов (например, в прокариотических клетках). Как используют в настоящем описании, "вектор" представляет собой инструмент, позволяющий или облегчающий перенос некоторого объекта из одного окружения в другое. Он представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, в который может быть вставлен другой участок ДНК таким образом, чтобы добиться репликации вставленного участка. В целом вектор способен к репликации при условии ассоциации с надлежащими элементами контроля. В целом понятие "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Неограничивающими примерами векторов являются молекулы нуклеиновых кислот, являющихся одноцепочечными, двухцепочечными или частично двухцепочечными; молекулы нуклеиновых кислот, имеющие один или более свободных концов, не имеющие свободных концов (например, кольцевые); молекулы нуклеиновых кислот, включающие ДНК, РНК или одновременно и ДНК и РНК и другие известные в данной области разновидности полинуклеотиды. Одним из типов векторов является "плазмида", представляющая собой кольцевую двухцепочечную петлю ДНК, в которую могут быть вставлены дополнительные участки ДНК, в том числе с использованием стандартных способов клонирования. Другим типом вектора является вирусный вектор, содержащий полученную из вирусной ДНК или РНК последовательность, необходимую для упаковки в вирус (например, ретровирусы, дефективные в отношении репликации ретровирусы, аденовирусы, аденовирусы, ретровирусы и аденоасоциированные вирусы (AAV, AAV) с нарушенной репликацией). Вирусные векторы также включают полинуклеотиду, помещенную в вирус с целью трансфекции в клетку-хозяина. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, векторы млекопитающих, отличные от эписомных) интегрируются в геном клетки хозяина при введении в клетку хозяина и вследствие этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они непосредственно связаны. Такие векторы называются в настоящем описании "экспрессирующими векторами". Векторы, которые приводят к экспрессии в эукариотической клетке, могут быть называться в настоящем описании "эукариотическми экспрессирующими векторами". Распространенной формой экспрессирующих векторов в способах рекомбинантных ДНК часто являются плазмиды.

[00188] Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут включать нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные экспрессирующие векторы включают один или более регуляторных элементов, которые могут быть подобраны на основе клеток-хозяев, которые будут использоваться для экспрессии, т.е. функционально связаны с последовательностью нуклеиновых кислот, которая будет экспрессирована. В рекомбинантном векторе экспрессии "функционально связанный" должно означать, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторным элементом(элементами) таким образом, что обеспечивает экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяина). Относительно рекомбинации и способов клонирования, упоминается заявка на патент США № 10/815730, опубликованная 2 сентября 2004 года как US 2004-0171156 A1, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[00189] Вектор(ы) может включать регуляторный элемент(ы), например, промотор(ы). Вектор(ы) может включать последовательности, кодирующие белки Cas и/или единственную направляющую последовательность РНК, однако возможно также по меньшей мере 3, или 8, или 16, или 32, или 48, или 50 последовательностей, кодирующих направляющие последовательности РНК (например, sg-РНК), например 1-2, 1-3, 1-4 1-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-8, 3-16, 3-30, 3-32, 3-48, 3-50 РНК (например, sg-РНК). В отдельном векторе может содержаться промотор для каждой РНК (например, sg-РНК), предпочтительно до 16 молекул РНК (sg-РНК) и в случае если отдельный вектор обеспечивает более чем 16 РНК (например, sg-РНК), один или более промоторов могут обеспечить экспрессию более одной РНК (например, sg-РНК), например, в присутствии 32 РНК (например, sg-РНК), каждый промотор может обеспечить экспрессию двух РНК (например, sg-РНК) и в присутствии 48 РНК (например, sg-РНК), каждый промотор может обеспечить экспрессию трех РНК (например, sg-РНК). На основе простой арифметики и хорошо утвердившихся протоколов клонирования, а также концепций данного изобретения квалифицированный в данной области специалист может с легкостью применить данное изобретение к молекуле(ам) РНК (например, sg-РНК) для подходящего часто используемого вектора, такого как AAV, и подходящего промотора, в частности, промотора U6, например, U6 - sg-РНК. Например, максимальный возможный объем упаковки в AAV составляет ~4,7 т.п.н. Длина отдельно U6-sg-РНК (включая сайты рестрикции для клонирования) составляет 361 п.н. Следовательно, квалифицированный специалист может легко поместить примерно 12-16, например, 13 кассет U6-sg-РНК в один вектор. Он может быть собран с помощью любых подходящих методов, в частности, "стратегии золотых ворот" для сборки TALE (http://www.genome-engineering.org/taleffectors/). Квалифицированный специалист может также использовать стратегию тандемного гида для увеличения количества U6-sg-РНК примерно в 1,5 раза, например, для увеличения с 12-16, например 13, до 18-24, например, примерно 19 U6-sg-РНК. Следовательно, квалифицированный в данной области специалист может легко получить примерно 18-24, например, примерно 19 конструкций промотор-РНК, например, U6-sg-РНК в одном векторе, например, вектора AAV. Другие средства увеличения количества промоторов и РНК приведены в WO 2016/205749 PCT/US2016/038238, например, молекула(ы) sg-РНК в векторе для использования одного промотора (например, U6) для экспрессии последовательностей РНК, например, sg-РНК, разделенных способными к расщеплению последовательностей. Дальнейшие способы увеличения количества конструкций промотор-РНК, например sg-РНК в векторе, состоят в экспрессии последовательности промотор-РНК, например, sg-РНК в векторе, разделенных способными к расщеплению последовательностями в составе интрона кодирующей последовательности или гена; в этом случае предпочтительно использование промотора полимеразы II, который может усилить экспрессию и сделать возможной транскрипцию длинной РНК специфично к типу ткани (см., например, http://nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short, http://www.nature.com/mt/journal/vl6/n 9/abs/mt20081 44a. html). В предпочтительном варианте осуществления изобретения в вектор AAV может быть упакован тандем U6-sg-РНК, нацеленный приблизительно на вплоть до 50 генов. Соответственно, исходя из знаний в данной области и руководства в настоящей заявке, квалифицированный специалист может создавать и использовать вектор(ы), например, единичный вектор, экспрессирующий множественные РНК или другие направляющие молекулы под контролем, оперативно или функционально связанный с одним или более промоторами, особенно для числа РНК или других направляющих молекул, обсуждаемого в настоящем описании, без какого-либо излишнего экспериментирования.

[00190] Последовательности, кодирующие направляющие РНК, например sg-РНК, и/или последовательности, кодирующие белки Cas, могут быть функционально или непосредственно связаны с регуляторным элементом(элементами) и, следовательно, регуляторный элемент(элементы) управляет их экспрессией. Промотор(промоторы) может быть конститутивным промотором (промоторами) и/или временным промотором(промоторами), и/или индуцируемым промотором(промоторами), и/или тканеспецифическим промотором(промоторами). Промотор может быть выбран из группы, состоящей из РНК-полимераз: pol I, pol II, pol III, T7, U6, H1, ретровирусного LTR-промотора (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV), промотора цитомегаловируса (CMV), промотора вируса SV40, промотора дигидрофолатредуктазы, промотора β-актина, промотора фосфоглицераткиназы (PGK) и промотора EF1α. Предпочтительным промотором является промотор U6.

[00191] В целом система CRISPR-Cas9 является такой, как используется в вышеприведенных документах, таких как WO 2014/093622(PCT/US2013/074667) и относится в совокупности к транскриптам и других элементов, участвующих в экспрессии или направляющих активность ассоциированного с CRISPR ("Cas") фермента, например, Cas9, включая последовательности, кодирующие фермент Cas (нацеленный на ДНК и/или РНК) или участвующие в его доставке, последовательность tracr (трансактивирующая CRISPR) (например, tracr РНК или активную частичную tracr РНК), последовательность-партнер tracr (включающую "прямой повтор" и tracr-РНК-процессированный частичный прямой повтор в контексте эндогенной системы CRISPR), направляющую последовательность (также называемую "спейсером" в контексте эндогенной системы CRISPR), или "молекулу(ы) РНК" в используемом в настоящем описании значении (например, молекула(ы) РНК, направляющая Cas9, как, например, CRISPR РНК (cr-РНК) и трансактивирующая cr-РНК (tracr РНК) или единая направляющая РНК (sg-РНК) (химерная РНК) или другие последовательности и транскрипты локуса CRISPR. В целом, система CRISPR характеризуется наличием элементов, стимулирующих образование комплекса CRISPR в участке последовательности-мишени (также называемых протоспейсерами в контексте эндогенной системы CRISPR). В контексте образования комплекса CRISPR, "последовательность-мишень" означает последовательность, для нацеливания на которую разработана направляющая последовательность, в частности, имеющая комплементарность, причем гибридизация между последовательностью-мишенью и направляющей последовательностью стимулирует образование комплекса CRISPR. Определенный участок направляющей последовательности, опосредующий значимость комплементарности к последовательности-мишени для активности по расщеплению, обозначен в настоящем описании как последовательность-затравка (seed-sequence). Последовательность-мишень может включать любой полинуклеотид, такой как полинуклеотиды ДНК или РНК, и находиться в составе представляющего интерес локуса-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень локализована в ядре или цитоплазме клетки. Описанное в настоящем описании изобретение охватывает новые эффекторные белки 2 класса систем CRISPR-Cas, среди которых Cas 9 является иллюстративным эффекторным белком и, следовательно, понятия, используемые в настоящей заявке при описании новых эффекторных белков, могут коррелировать с понятиями, используемыми для описания систем CRISPR-Cas9.

[00192] Локусы системы CRISPR-Cas насчитывают более 50 семейств генов и не имеют строго универсальных генов. Следовательно, для локусов системы CRISPR-Cas ни одно эволюционное дерево не будет единственно верным, и для идентификации новых семейств генов необходим многоплановый подход. На данный момент для 395 профилей 93 белков Cas исчерпывающе идентифицированы гены cas. Для классификации систем CRISPR-Cas используют профили генов и характерные особенности архитектуры локусов. Новая классификация систем CRISPR-Cas предложена на фиг.1A и 1B. 1 класс включает многосубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cascade), и 2 класс включает односубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cas9-подобные). На фиг.2 изображена молекулярная организация систем CRISPR-Cas. На фиг.3 изображена структура эффекторных комплексов типов I и III: общая архитектура/общее происхождение прослеживается несмотря на обширную дивергенцию последовательностей. На фиг.4 CRISPR-Cas изображена как систему, основанную на мотивах распознавания РНК (RRM). На фиг.5 изображена филогения белка Cas1, показан главный аспект эволюции системы CRISPR-Cas - рекомбинация эффекторных модулей cr-РНК в целях адаптации. На фиг.6 представлен перечень систем CRISPR-Cas, а именно распространение типов/подтипов систем CRISPR-Cas среди архей и бактерий.

[00193] Действие системы CRISPR-Cas обычно делится на три этапа: (1) адаптация или интеграция спейсера, (2) процессинг первичного транскрипта локуса CRISPR (пре-cr-РНК) и созревание cr-РНК, которая включает спейсер и вариабельные регионы, соответствующие фрагментам CRISPR-повторов на 5'- и 3'-концах, и (3) РНК- или ДНК-интерференция. Два белка, Cas1 и Cas2, которые присутствуют в подавляющем большинстве известных систем CRISPR-Cas, достаточны для вставки спейсеров в кассеты CRISPR. Эти два белка формируют комплекс, который необходим для процесса адаптации; деятельность эндонуклеазы Cas1 необходима для интеграции спейсера, тогда как Cas2 выполняет неферментативную функцию. Комплекс Cas1-Cas2 представляет собой высококонсервативный модуль "обработки информации" системой CRISPR-Cas, который квазиавтономен от остальной системы. (См. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Makarova KS, Koonin EV. Methods Mol Biol. 2015;1311:47-75).

[00194] Ранее описанные системы 2 класса, а именно, типа II и предполагаемого типа V, состояли только из трех или четырех генов в Cas-опероне, а именно, генов cas1 и cas2, составляющих модуль адаптации (пара генов cas1-cas2 не участвует в интерференции), а также единственного многодоменного эффекторного белка, ответственного за интерференцию, но также способствующего процессингу пре-cr-РНК и адаптации, и часто четвертого гена с неохарактеризованными функциями, который необязателен, по меньшей мере, в некоторых системах типа II (и в некоторых случаях четвертый ген - cas4 (данные биохимических или in silico экспериментов показывают, что cas4 принадлежит к суперсемейству нуклеаз PD-(DE)xK с кластером из трех остатков цистеина на C-конце; обладает 5'-экзонуклеазной активностью для оцДНК), или csn2, который кодирует инактивированную АТФ-азу). В большинстве случаев последовательность CRISPR и ген определенной разновидности РНК, известной как tracr-РНК, транс-закодированная небольшая cr-РНК, прилегают к Cas-оперонам класса 2. tracr-РНК частично гомологична повторам в соответствующей последовательности CRISPR и необходима для процессинга пре-cr-РНК, который катализируется РНК-азой III, широко распространенным бактериальным ферментом, не связанным с локусами системы CRISPR-Cas.

[00195] Cas1 является самым консервативным белком, который присутствует в большинстве систем CRISPR-Cas и эволюционирует медленнее, чем другие белки Cas. Соответственно, филогения Cas1 использовалась для классификации систем CRISPR-Cas. Результаты биохимических экспериментов или экспериментов in silico показывают, что Cas1 представляет собой металл-зависимую дезоксирибонуклеазу. Делеции в гене Cas1 в геноме E. coli приводят к увеличению чувствительности к повреждению ДНК и ослаблению расхождения хромосом, как описано в "A dual function of the CRISPR-Cassystem in bacterial antivirus immunity and DNA repair," Babu M et al. Mol Microbiol 79:484-502 (2011). Результаты биохимических экспериментов или in silico экспериментов показывают, что Cas2 является РНК-азой, характерной для регионов, насыщенных U, и является двухцепочечной ДНК-азой.

[00196] Аспекты изобретения касаются идентификации и конструирования способами инженерии новых эффекторных белков, связанных с системами CRISPR-Cas класса 2. В предпочтительном варианте осуществления эффекторный белок включает односубъединичный эффекторный модуль. В будущем варианте осуществления изобретения эффекторный белок является функциональным в прокариотических или эукариотических клетках для применения in vitro, in vivo или ex vivo. Один аспект изобретения охватывает вычислительные способы и алгоритмы для прогнозирования новых систем CRISPR-Cas класса 2 и определения составляющих их компонентов.

[00197] В одном из вариантов осуществления вычислительный способ идентификации новых локусов системы CRISPR-Cas класса 2 включает следующие шаги: обнаружение всех контигов, кодирующих белок Cas1; идентификация всех предсказанных генов, кодирующих белки, в пределах 20 т.п.н. от гена cas1, более конкретно, в пределах 20 т.п.н. от начала гена cas1 и 20 т.п.н. от конца гена cas1; сравнение идентифицированных генов со специфическими профилями белков Cas и предсказание последовательностей CRISPR путем отбора частичных и/или неклассифицированных возможных локусов CRISPR-Cas, содержащих белки с последовательностями длиной более 500 аминокислот (>500 а.к.); анализ отобранных кандидатов с использованием анализов PSI-BLAST и HHPred для выделения и идентификации новых локусов CRISPR-Cas класса 2. В дополнение к вышеупомянутым шагам возможные кандидаты могут быть дополнительно проанализированы путем поиска гомологов по метагеномным базам данных.

[00198] Одним из аспектов обнаружения всех контигов, кодирующих белок Cas1, является использование программы GenemarkS для предсказания генов, как более подробно описано в статье "GeneMarkS: a self-training method for prediction of gene starts in microbial genomes. Implications for finding sequence motifs in regulatory regions," John Besemer, Alexandre Lomsadze and Mark Borodovsky, Nucleic Acids Research (2001) 29, pp 2607-2618, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[00199] В одном аспекте проводится идентификация всех предсказанных генов, кодирующих белки, с помощью сравнения идентифицированных генов со специфическими профилями белков Cas и их аннотирования согласно Базе Данных Консервативных Доменов NCBI (CDD), которая состоит из коллекции хорошо аннотированных многочисленных моделей выравнивания последовательностей для древних доменов и полноразмерных белков. Они доступны в виде позиционных весовых матриц (PSSM) для быстрой идентификации консервативных доменов в последовательностях белков посредством анализа RPS-BLAST. CDD включает домены, курируемые NCBI, которые используют информацию о 3D-структуре, чтобы точно определить границы доменов и обеспечить понимание взаимоотношений между последовательностью/структурой/функцией, а также модели домена, импортированные из многих внешних баз данных (Pfam, SMART, COG, PRK, TIGRFAM). В следующем аспекте для предсказания последовательностей CRISPR использовалась программы PILER-CR, которая является общедоступным программным обеспечением для поиска CRISPR-повторов, как описано в статье "PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats", Edgar, R.C., BMC Bioinformatics, Jan 20:8:18(2007), включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[00200] В следующем аспекте проводят индивидуальный анализ каждого случая с использованием PSI-BLAST (Средство поиска основного локального выравнивания с учетом позиции). Анализ PSI-BLAST использует позиционную весовую матрицу (PSSM) или профиль множественного выравнивания последовательностей, обнаруженных выше заданного весового порога при белок-белковом анализе BLAST. Данная матрица PSSM используется, чтобы далее искать новые совпадения в базе данных и обновляется для последующих итераций с этими недавно обнаруженными последовательностями. Таким образом, PSI-BLAST является способом обнаружения отдаленных отношений между белками.

[00201] В другом аспекте индивидуальный анализ каждого случая предполагает использование HHpred, способа поиска по базам данных последовательностей и предсказания структуры, столь же простого в использовании, как BLAST или PSI-BLAST, и в то же время намного более чувствительного при нахождении отдаленных гомологов. Фактически, чувствительность способа HHpred конкурентоспособна по отношению к самым мощным серверам для предсказания структуры, доступным в настоящее время. HHpred является первым сервером, основанным на попарном сравнении профилей скрытых марковских моделей (СММ). В то время как большинство обычных способов поиска последовательностей выполняют поиск по базам данных последовательностей, таким как UniProt или NR, HHpred выполняет поиск по базам данных выравнивания, таким как Pfam или SMART. Это значительно упрощает получение списка совпадений со многим семействами последовательностей вместо разрозненных единичных последовательностей. Все основные общедоступные базы данных профилей и выравниваний доступны через HHpred. HHpred использует в качестве единичного поискового запроса последовательность или множественное выравнивание. В течение всего нескольких минут HHpred представляет результаты поиска в легком для чтения формате, подобном формату PSI-BLAST. Параметры поиска включают локальное или глобальное выравнивание и весовое сходство вторичной структуры. HHpred может произвести попарные выравнивания последовательностей поискового запроса и шаблона, объединенное множественное выравнивание поискового запроса и шаблона (например, для транзитивного поиска), а также модели 3D-структуры, вычисленные программным обеспечением MODELLER на основе выравниваний HHpred.

[00202] Термин "система нацеливания на нуклеиновые кислоты", где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК, и в некоторых аспектах может также относится к гибридам РНК-ДНК или их производным, относится собирательно к транскриптам и другим элементам, участвующим в экспрессии или направлении активности нацеливания на ДНК или РНК генов, ассоциированных с системой CRISPR ("Cas"), которые могут содержать последовательности, кодирующие белки Cas, нацеленные ДНК или РНК, и направляющую РНК, нацеленную ДНК или РНК, включая последовательность cr-РНК (cr-РНК) и (в некоторых, но не всех системах) последовательность РНК, транс-активирующей систему CRISPR/Cas (tracr-РНК), или другие последовательности и транскрипты локуса CRISPR, нацеленные на ДНК или РНК. В целом система нацеливания на РНК характеризуется элементами, способствующими формированию нацеленного на ДНК или РНК комплекса на участке последовательности ДНК или РНК, являющейся мишенью. В контексте образования нацеленного на ДНК или РНК комплекса, термин "последовательность-мишень" относится к последовательности ДНК или РНК, которой комплементарна направляющая РНК, нацеливающая на ДНК или РНК, где гибридизация между последовательностью-мишенью и направляющей РНК, нацеливающей на РНК, способствует образованию нацеливающего на РНК комплекса. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень расположена в ядре или цитоплазме клетки.

[00203] В одном аспекте изобретения новые системы нацеливания на ДНК, также называемые ДНК- или ДНК-нацеленными CRISPR/Cas или системой нацеливания на ДНК с помощью системы CRISPR-Cas, описанные в настоящем описании, основаны на идентифицированных белках Cas типа V (например, подтипа V-A, подтипа V-B и подтипа V-C), не требующих создания индивидуальных белков для нацеливания на конкретные последовательности ДНК, а вместо этого единственный эффекторный белок или фермент может быть запрограммирован молекулой РНК для узнавания конкретной ДНК-мишени, иными словами, фермент может быть привлечен к конкретной ДНК-мишени с использованием указанной молекулы РНК. Аспекты изобретения, в частности, относятся к нацеленным на ДНК направляемым РНК системам CRISPR C2c1 или C2c3.

[00204] В одном аспекте изобретения новые системы нацеливания на РНК, также называемые РНК- или РНК-нацеленные CRISPR/Cas или система нацеливания на РНК с помощью системы CRISPR-Cas, описанные в настоящем описании, основаны на идентифицированных белках Cas типа VI, не требующих создания индивидуальных белков для нацеливания на определенные последовательности РНК, кроме единственного фермента, который может быть запрограммирован молекулой РНК для узнавания конкретной ДНК-мишени, иными словами, фермент может быть предназначен для работы с конкретной ДНК-мишенью с помощью указанной молекулы РНК.

[00205] Системы нацеливания на нуклеиновые кислоты, векторные системы, векторы и композиции, описанные в настоящем описании, могут использоваться в практике нацеливания на нуклеиновые кислоты, изменения или модификация синтеза генных продуктов, таких как белки, расщепления нуклеиновых кислот, редактирования нуклеиновых кислот, сплайсинга нуклеиновых кислот, переноса нуклеиновых кислот-мишеней, отслеживания нуклеиновых кислот-мишеней, выделения нуклеиновых кислот-мишеней, визуализации нуклеиновых кислот-мишеней и т.д.

[00206] Как используют в настоящем описании, белок Cas или фермент CRISPR обозначают любые белки, представленные в новой классификации систем CRISPR-Cas. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает эффекторные белки, идентифицированные в локусах CRISPR-Cas типа V, при этом следует отметить, что Cpf1 кодирует локусы, обозначаемые как подтип V-A. В настоящее время локусы подтипа V-A включают cas1, cas2, отдельный ген, обозначенный как cpf1 и кассету CRISPR. Cpf1 (ассоциированный с CRISPR белок Cpf1, подтип PREFRAN) представляет собой крупный белок (примерно 1300 аминокислот), содержащий подобный RuvC нуклеазный домен, гомологичный соответствующему домену Cas9, наряду с аналогом характерного богатого аргинином кластера Cas9. При этом Cpf1 лишен нуклеазного домена HNH, имеющегося у всех белков Cas9, и подобный RuvC домен является непрерывным, в противоположность Cas9, где он содержит длинные вставки, содержащие домен HNH. C2c1 и C2c3 сходны с Cpf1 в том отношении, что также кодируют локусы CRIPSR типа II класса V. В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR-Cas содержит только подобный RuvC нуклеазный домен. Ген Cpf1 обнаружен в нескольких различающихся бактериальных геномах, в основном в одном и том же локусе, содержащем гены cas1, cas2, cas4 и кассету CRISPR (например, FNFX1_1431-FNFX1_1428 из Francisella cf. novicida Fx1). Таким образом, структурная организация Cpf1 представляется схожей с типом II-B. Более того, сходным с Cas9 образом, белок Cpf1 содержит легко идентифицируемый C-концевой участок, гомологичный транспозону ORF-B и включающий активную подобную RuvC нуклеазу, богатый аргинином участок и цинковый палец (отсутствующий у Cas9). Однако, в отличие от Cas9, Cpf1 представлен также в нескольких геномах, не содержащих CRISPR-Cas и его сравнительно высокое сходство с ORF-B предполагает, что он может являться компонентом транспозона. Было предложено, что если эта система CRISPR-Cas является истинной и Cpf1 является функциональным аналогом Cas9, то таким образом ее можно отнести к новому типу CRISPR-Cas, а именно, типу V (см. Annotation and Classification ofCRISPR-Cas Systems. Makarova KS, Koonin EV. Methods Mol Biol. 2015;1311:47-75). Однако, как описано в настоящем описании, Cpf1 относят к подтипу V-A для того, чтобы отличать его от C2c1p и C2c3p, не имеющих идентичную доменную структуру и, следовательно, относящихся соответственно к подтипам V-B и V-C.

[00207] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и системам, включающим эффекторные белки, идентифицированные в локусах C2c1, выделенных в подтип V-B. В данном случае C2c1 относится к 1 кандидату из 2 класса. Все локусы C2c1 кодируют слитый белок Cas1-Cas4, Cas2 и крупный белок, обозначенный заявителями как C2c1p, обычно располагающийся вблизи кассеты CRISPR.

[00208] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и системам, включающим эффекторные белки, идентифицированные в локусах C2c3, выделенных в подтип V-C. В данном случае C2c3 относится к 3 кандидату из 2 класса. Локусы C2c3 кодируют Cas1 и крупный белок, обозначенный как C2c3p.

[00209] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает эффекторные белки, относящиеся к типу VI локусов системы CRISPR-Cas, например, локусам C2c2. В настоящем описании C2c2 относится к кандидату 2 класса 2. Локусы C2c2 включают гены cas1 и cas2 наряду с крупным белком, который заявители обозначают как C2c2p, и последовательности CRISPR; однако, в отличие от C2c1p, C2c2p часто кодируется вблизи последовательностей CRISPR, но не генами cas1-cas2 (для сравнения фиг.9 и фиг.15).

[00210] Аспекты изобретения также охватывают способы и применение описанных в настоящем описании композиций и систем в геномной инженерии, например, для изменения или управления экспрессией одного или более генов или одного или более продуктов генов в прокариотических или эукариотических клетках in vitro, in vivo или ex vivo.

[00211] В вариантах осуществления изобретения понятия "направляющая последовательность" и "направляющая РНК" используются взаимозаменяемо, как и в упоминаемых выше документах, таких как WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667). В широком смысле, направляющая последовательность представляет собой любую нуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность с полинуклеотидной последовательностью-мишенью для гибридизации с последовательностью-мишенью и обеспечения специфичного к последовательности связывания комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью. В некоторым вариантах осуществления, уровень комплементаности между направляющей последовательностью и соответствующей последовательностью-мишенью при условии оптимального выравнивания с использованием надлежащего алгоритма выравнивания составляет примерно или превышает 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. Оптимальное выравнивание может быть определено с использованием любого подходящего алгоритма для выравнивания последовательностей, не ограничивающими примерами которого являются алгоритм Смита-Ватермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза-Виллера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; доступен на www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (доступен на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступен на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность имеет длину примерно или более 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления, направляющая последовательность имеет длину менее чем примерно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы направляющая последовательность имела длину 10-30 нуклеотидов. Способность направляющей последовательности направлять специфичное к последовательности связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью может быть количественно оценена любым подходящим способом анализа. Например, компоненты системы CRISPR, достаточные для образования комплекса CRISPR, включая тестируемую направляющую последовательность, могут быть доставлены в клетку, содержащую соответствующую последовательность-мишень, например, путем трансфекции векторами, кодирующими компоненты последовательности CRISPR, с последующей количественной оценкой сайтов преимущественного расщепления последовательности-мишени, в частности, анализом Surveyor, как описано в настоящем описании. Сходным образом, расщепление полинуклеотидной последовательности-мишени может быть оценено в пробирке, содержащей последовательность-мишень, компоненты комплекса CRISPR, включая тестируемую направляющую последовательность и контрольную направляющую последовательность, при сравнении связывания или скорости расщепления последовательности-мишени для реакций с тестовой и контрольной направляющими последовательностями. Другие способы анализа также возможны и будут понятны квалифицированному специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень является последовательностью в геноме клетки. Иллюстративные последовательности-мишени включают те, которые являются уникальными в геноме-мишени.

[00212] В целом и в описании настоящего изобретения понятие "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Векторы включают, но не ограничиваются ими, молекулы нуклеиновых кислот, являющиеся одноцепочечными, двухцепочечными или частично двухцепочечными; нуклеиновые кислоты, которые включают один или более свободных концов, не имеют свободных концов (например, кольцевые); нуклеиновые кислоты, которые представляют собой ДНК, РНК или ту и другую и другие разновидности полинуклеотидов, известных в данной области. Один из типов векторов называется "плазмидой", что означает кольцевую двухцепочечную ДНК-петлю, в которую могут быть внесены дополнительные участки ДНК, в том числе стандартными способами молекулярного клонирования. Другим типом векторов является вирусный вектор, в котором находятся последовательности, полученные из вирусных ДНК или РНК в векторе для упаковки в вирус (например, ретровирусы, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы, дефектные по репликации аденовирусы и аденоассоциированные вирусы). Вирусные векторы также включают полинуклеотиды, переносимые вирусом для трансфекции клетки хозяина. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и векторы эписом млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) встраиваются в геном клетки-хозяина при введении в клетку хозяина и благодаря этому реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они непосредственно связаны. Такие векторы называются в настоящем описании "экспрессирующими векторами". Векторы для экспрессии и обеспечивающие экспрессию в эукариотической клетке могут называться в настоящем описании "эукариотическими экспрессирующими векторами". Часто используемыми векторами в способах рекомбинантных ДНК являются плазмиды.

[00213] Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут включать нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии такой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что такие рекомбинантные экспрессирующие векторы содержат один или более регуляторных элементов, которые могут быть выбраны в соответствии с используемыми для экспрессии клетками хозяина и которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована. В рекомбинантном векторе экспрессии "функционально связанный" должно означать, что нуклеотидная последовательность-мишень связана с регуляторным(и) элементом(ами) таким образом, что экспрессия такой нуклеотидной последовательности является возможной (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке хозяина при введении вектора в клетку хозяина).

[00214] Термин "регуляторный элемент" используется для обозначения промоторов, энхансеров, участков внутренней посадки рибосомы (IRES) и других элементов контроля экспрессии (например, сигналы терминации транскрипции, такие как сигналы полиаденилирования и поли(U)-последовательности). Такие регуляторные элементы описаны, например, в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Регуляторные элементы включают те, что обеспечивают конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности в различных типах клеток, и те, что обеспечивают экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Тканеспецифический промотор может обеспечивать экспрессию преимущественно в желаемой целевой ткани, такой как мышца, нейрон, кость, кожа, кровь, конкретных органах (например, печень, поджелудочная железа) или конкретных типах клеток (например, лимфоцитах). Регуляторные элементы могут также управлять экспрессией в зависимости от времени, например в зависимости от стадии клеточного цикла или стадии развития, и при этом могут быть также специфичными к тканям или типу клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор включает один или более промоторов РНК-полимеразы III (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов РНК-полимеразы III), один или более промоторов РНК-полимеразы II (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов РНК-полимеразы II), один или более промоторов РНК-полимеразы I (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов РНК-полимеразы I) или их комбинацию. Примеры промоторов РНК-полимеразы III включают, но не ограничиваются ими, промоторы U6 и H1. Примеры промоторов РНК-полимеразы II включают, но не ограничиваются ими, промоторы вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), промотор цитомегаловируса (CMV), (необязательно с энхансером CMV) [см., например, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы, промотор p-актина, промотор фосфоглицеролкиназы (PGK) и промотор EF1a. Термин "регуляторный элемент" относится и к элементам-энхансерам, таким как WPRE; энхансеры CMV; R-U5'-сегмент в LTR HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988); энхансер SV40 и последовательность интрона между 2 и 3 экзонами P-глобина кролика (Proc. Natl, Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981). Квалифицированный специалист в данной области оценит, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов как выбранная клетка-хозяин, трансфекция которой будет производиться, желаемый уровень экспрессии и т.д. Вектор может быть введен в клетки таким образом, чтобы получались транскрипты, белки или пептиды, включая слитые белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано в настоящем описании (например, транскрипты системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR), их белки, ферменты, мутантные формы, слитые белки и т.д.)

[00215] Преимущественные векторы включают лентивирусы и аденоассоциированные вирусы, и типы таких векторов могут также быть выбраны для нацеливания на конкретные типы клеток.

[00216] Как используют в настоящем описании, термин "cr-РНК" или "направляющая РНК" или "единственная направляющая РНК" или "sg-РНК" или "один или более компонентов нуклеиновых кислот" эффекторного белка локуса типа V или типа VI системы CRISPR Cas включает любую полинуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени для гибридизации с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени и прямого, специфичного к последовательности связывания комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения степень комплементарности при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания приблизительно равна 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. Оптимальное выравнивание может быть проведено с использованием любого подходящего алгоритма выравнивания последовательностей, примеры которого включают, но не ограничиваются ими алгоритм Смита-Ватермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза - Уилера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAST, Novoalign (Novocraft Technologies; доступен на www.novocraft.com), ELAND (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), SOAP (доступен на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступен на maq.sourceforge.net). Способность направляющей последовательности (в пределах направляющей РНК, нацеливающей на нуклеиновые кислоты) управлять прямым специфичным к последовательности связыванием комплекса, нацеленного на нуклеиновые кислоты, может быть оценена с помощью любого подходящего способа анализа. Например, компоненты системы CRISPR, нацеленной на нуклеиновые кислоты, достаточные для формирования комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, могут быть предоставлены клетке-хозяину, имеющей соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, например, путем трансфекции векторами, кодирующими компоненты комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, с последующей оценкой предпочтительного нацеливания (например, расщепления) в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, например, в анализе Survey, описанном в настоящем описании. Аналогично расщепление последовательности нуклеиновой кислоты-мишени может быть оценено в пробирке путем представления клетке последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, компонентов комплекса, нацеленного на нуклеиновые кислоты, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, и контрольную направляющую последовательность, отличающаяся от тестируемой направляющей последовательности, и сравнения связывания или уровня расщепления последовательности-мишени между реакциями тестовой и контрольной направляющими последовательностями. Другие способы анализа возможны и понятны специалисту в данной области. Направляющая последовательность, и, следовательно, направляющая РНК, нацеливающая на нуклеиновые кислоты, могут быть выбраны для нацеливания на любую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени. Последовательность-мишень может быть представлена ДНК. Последовательность-мишень может быть представлена любой последовательностью РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень может представлять собой последовательность в молекуле РНК, выбранной из группы, состоящей из матричной РНК (мРНК), пре-мРНК, рибосомной РНК (рРНК), транспортной РНК (тРНК), микроРНК, малой интерферирующей РНК (миРНК), малой ядерной РНК (мяРНК), малой ядрышковой РНК (мякРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), некодирующей РНК (нкРНК), длинной некодирующей РНК (днкРНК) и малой цитоплазматической РНК (мцРНК). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень может представлять собой последовательность в молекуле РНК, выбранную из группы, состоящей из мРНК, пре-мРНК и рРНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень может представлять собой последовательность в молекуле РНК, выбранную из группы, состоящей из нкРНК и днкРНК. В некоторых более предпочтительных вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень может представлять собой последовательность в молекуле мРНК или молекуле пре-мРНК.

[00217] В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая РНК, нацеленная на нуклеиновые кислоты, выбрана таким образом, чтобы вторичная структура направляющей РНК, нацеленной на РНК, была более компактной. В некоторых вариантах осуществления изобретения приблизительно или меньше чем приблизительно 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, или менее нуклеотидов направляющей РНК, нацеленной на нуклеиновую кислоту, участвует в самокомплементарном спаривании оснований при оптимальном фолдинге. Оптимальный фолдинг может быть определен любым подходящим алгоритмом выявления фолдинга полинуклеотида. Некоторые программы основаны на вычислении минимальной свободной энергии Гиббса. Примером одного такого алгоритма является mFold, описанный Zuker и Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). В качестве примера другого алгоритма фолдинга можно привести онлайн вебсервер RNAfold, разработанный в Институте Теоретической Химии в Венском университете, который используют центроидный алгоритм предсказания структуры (см., например, A.R. Gruber et al, 2008, Cell 106(1): 23-24; и PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).

[00218] В определенных вариантах осуществления изобретения направляющая РНК или cr-РНК может включать, по существу состоять из или состоять из последовательности прямого повтора (DR) и последовательности направляющей молекулы или последовательности спейсера. В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая РНК или cr-РНК может включать, по существу состоять из или состоять из последовательности прямого повтора (DR), слитой или связанной с последовательностью направляющей молекулы или последовательностью спейсера. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность прямого повтора (DR) может быть расположена в восходящем направлении (т.е. 5') от последовательности направляющей молекулы или последовательности спейсера. В других вариантах осуществления изобретения последовательность прямого повтора может быть расположена в нисходящем направлении (т.е. 3') от последовательности направляющей молекулы или последовательности спейсера.

[00219] В определенных вариантах осуществления изобретения cr-РНК включает шпилечную структуру, предпочтительно единственную шпилечную структуру. В некоторых вариантах осуществления изобретения шпилечная структура, предпочтительно единственная шпилечная структура, формирует последовательность прямого повтора.

[00220] В определенных вариантах осуществления изобретения длина спейсера направляющей РНК составляет от 15 до 35 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления изобретения длина спейсера направляющей РНК составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина спейсера составляет от 15 до 17 нуклеотидов, например, 15, 16 или 17 нуклеотидов, от 17 до 20 нуклеотидов, например, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, от 20 до 24 нуклеотидов, например, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, от 23 до 25 нуклеотидов, например, 23, 24 или 25 нуклеотидов, от 24 до 27 нуклеотидов, например, 24, 25, 26 или 27 нуклеотидов, от 27-30 нуклеотидов, например, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, 30-35 нуклеотидов, например, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 нуклеотидов или 35 нуклеотидов или более.

[00221] Термин "последовательность tracr-РНК" или аналогичный термин включает любой полинуклеотид, который имеет достаточную комплементарность к cr-РНК для последующей гибридизации. В целом, степень комплементарности относится к оптимальному выравниванию последовательности sca и последовательности tracr по длине наиболее короткой из двух последовательностей. Оптимальное выравнивание может быть определено любым подходящим алгоритмом выравнивания и, кроме того, оно может учитывать вторичную структуру, например, самокомплементарность в пределах последовательности sca или последовательности trascr. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между последовательностью tracr и последовательностью sca по длине более короткой из двух при оптимальном выравнивании составляет около или около 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или выше. В некоторых вариантах осуществления tracr-РНК может не потребоваться.

[00222] Заявители также провели пробный эксперимент для проверки способности белков типа V, таких как C2c1 или C2c3, к нацеливанию и расщеплению ДНК. Этот эксперимент во многом повторяет подобную работу для гетерологичной экспрессии StCas9 в E. coli (Sapranauskas, R. et al. Nucleic Acids Res 39, 9275-9282 (2011)). Заявители ввели плазмиду, содержащую одновременно PAM и ген устойчивости к антибиотикам, в гетерологичный штамм E. coli, и затем поместили на среду, содержащую соответствующий антибиотик. В случае расщепления ДНК плазмиды заявители не наблюдали жизнеспособных колоний.

[00223] Более подробно анализ ДНК-мишени может быть проведен следующим образом. В анализе используются два штамма E.coli. Один из штаммов имеет плазмиду, которая кодирует локус эндогенного эффекторного белка бактериального штамма. Другой штамм имеет пустую плазмиду (например, pACYC184, контрольный штамм). Все возможные PAM длиной 7 или 8 п.н. представлены на плазмиде устойчивости к антибиотикам (pUC19 с геном устойчивости к ампициллину). PAM расположена рядом с последовательностью протоспейсера 1 (ДНК-мишень для первого спейсера в локусе эндогенного эффекторного белка). Были клонированы две библиотеки PAM. Одна библиотека содержит последовательности 5'-конца протоспейсера, состоящие из 8 случайных п.н. (например, всего 65 536 различных PAM=комплексность). Другая библиотека содержит последовательности 3'-конца протоспейсера, состоящие из 7 случайных п.н. (например, полная комплексность - 16 384 различных PAM). Обе библиотеки были клонированы, чтобы иметь в среднем 500 плазмид, содержащих каждый возможный PAM. Тестовый и контрольный штаммы были трансформированы библиотеками 5'-PAM и 3'-PAM в ходе отдельных трансформаций, трансформированные клетки были помещены в культуру на среду, содержавшую ампициллин. Распознавание и последующее разрезание/интерференция посредством плазмиды делают клетку неустойчивой к ампициллину и прекращают ее рост. Приблизительно через 12 ч после трансформации все колонии, образованных тестовым и контрольным штаммами, были собраны и из них была выделена плазмидная ДНК. Плазмидная ДНК использовалась в качестве матрицы для ПЦР-амплификации и последующего глубокого секвенирования. Представленность всех PAM в нетрансформированных библиотеках показала ожидаемую представленность PAM в трансформированных клетках. Представленность всех PAM, найденных в штаммах контроля, показала фактическую представленность. Представленность всех PAM в тестовом штамме показала, какие PAM не распознаются ферментом. Сравнение с контрольным штаммом позволяет извлекать последовательности с обедненным PAM.

[00224] В некоторых вариантах осуществления изобретения CRISPR-Cas9, уровень комплементарности между последовательностями tracr-РНК и cr-РНК присутствует по длине наиболее короткой из них при наиболее оптимальном выравнивании. Как описано в настоящем описании, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения tracr-РНК не требуется. В некоторых вариантах ранее описанных систем CRISPR-Cas (например, систем CRISPR-Cas9) схемы сконструированных химерных направляющих РНК (sgRNA) могут включать по меньшей мере 12 п.н. дуплексной структуры между cr-РНК и tracr-РНК, однако в описанных в настоящем описании системах CRISPR Cpf1 такие химерные РНК (chi-РНК) невозможны, поскольку система не использует tracrRNA.

[00225] В определенных вариантах осуществления изобретения зрелые cr-РНК включают элемент последовательности, происходящий из последовательности повтора a (5'-метка) локуса CRISP, которая является важной для фукнции. См. Marraffini et al., 28-Jan-2010, Nature Letters 463 (568-572), которая включена в качестве ссылки.

[00226] В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между последовательностью tracr-РНК и последовательностью cr-РНК по длине более короткой из них при оптимальном выравнивании составляет приблизительно или больше около 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или выше. В некоторых вариантах осуществления последовательность tracr составляет приблизительно или больше, чем приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, II, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления последовательность tracr и последовательность cr-РНК содержатся в одном транскрипте, так что гибридизация между ними создает транскрипт, имеющий вторичную структуру, такую как шпилька. В одном из вариантов осуществления изобретения транскрипт или транскрибируемая полинуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере две или более шпилек. В предпочтительных вариантах осуществления транскрипт имеет две, три, четыре или пять шпилек. В следующем варианте осуществления изобретения транскрипт имеет не более пяти шпилек. В структуре шпильки часть последовательности с 5'-стороны от конечного "N" и выше петли соответствует последовательности tracr, а часть последовательности с 3'-стороны петли соответствует последовательности tracr. В некоторых вариантах осуществления tracr-РНК может не потребоваться.

[00227] В некоторых вариантах осуществления ранее описанных систем CRISPR-Cas (например, CRISPR-Cas9) конструкции сконструированных химерных направляющих РНК (sgRNA) могут включать по меньшей мере 12 п.н. дуплексной структуры crRNA и tracrRNA, однако в системах CRISPR Cpf1 такие химерные РНК (chi-РНК) невозможны, поскольку система не использует tracr-РНК.

[00228] Для минимизации токсичности и неспецифических эффектов важно управлять концентрацией доставленной направляющей РНК. Оптимальные концентрации направляющей РНК, нацеленной на нуклеиновую кислоту, могут быть определены путем тестирования различных концентраций в клеточных моделях или эукариотических моделях животных, не являющихся человеком, глубокое секвенирование может быть использовано для анализа степени модификации в потенциальных геномных локусах, не являющихся мишенями. Концентрация для доставки in vivo должна быть подобрана так, чтобы обеспечивать наибольший уровень целевой модификации мишени при минимальном уровне нецелевой модификации. Предпочтительным является получение системы нацеливания на нуклеиновые кислоты из системы CRISPR типа V/типа VI. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более элементов системы нацеливания на нуклеиновые кислоты получены из конкретного организма, включающего эндогенную систему нацеливания на РНК. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения система нацеливания на РНК представляет собой систему CRISPR типа V. В конкретных вариантах осуществления изобретения фермент Cas типа V, нацеленный на РНК, представляет собой C2c1 или C2c3. Примеры белков Cas включают, но не ограничиваются ими, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (также известный как Csn1 и Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, их гомологи или модифицированные версии. В вариантах осуществления изобретения белок типа V, такой как C2c1 или C2c3, упомянутый в настоящем описании, также включает гомологи или ортологи белков типа V, таких как C2c1 или C2c3. Термины "ортолог" (также обозначаемый в настоящем описании как "ortologue") и "гомолог" (также обозначаемый в настоящем описании как "homologue") хорошо известны в данной области. Посредством дальнейшего руководства "гомолог" белка как используют в настоящем описании, представляет собой белок того же самого вида, который выполняет ту же самую или подобную функцию, что и белок, гомологом которого он является. Гомологичные белки могут иметь сходную или частично сходную структуру, но это не обязательно. "Ортолог" белка, как используют в настоящем описании, является белком другого вида, который выполняет ту же самую или подобную функцию, что и белок, ортологом которого он является. Ортологичные белки могут иметь сходную или частично сходную структуру, но это не обязательно. В конкретных вариантах осуществления изобретения гомологи или ортологи белков типа V, таких как C2c1 или C2c3, упомянутый в настоящем описании, имеют гомологию или идентичность последовательностей по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% с белками типа V, такими как C2c1 или C2c3. В следующих вариантах осуществления изобретения гомологи или ортологи белков типа V, таких как C2c1 или C2c3, упомянутый в настоящем описании, имеют идентичность последовательности по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% с белками типа V дикого типа, такими как C2c1 или C2c3.

[00229] В варианте осуществления изобретения белки Cas типа V, нацеленные на РНК, могут быть ортологами C2c1 или C2c3 организмов из родов, которые включают, но не ограничены следующими: Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma и Campylobacter. Вид организма, принадлежащего к данным родам, может быть обсужден в данной заявке иным образом.

[00230] Некоторые способы идентификации ортологов ферментов системы CRISPR-Cas могут включать идентификацию tracr-последовательности в геномах-мишенях. Идентификация tracr-последовательностей может быть связана со следующими шагами: поиск прямых повторов или последовательности tracr-помощника в базе данных, чтобы идентифицировать область CRISPR, включающую фермент CRISPR; поиск гомологичных последовательностей в области CRISPR, фланкирующем фермент CRISPR в смысловом и антисмысловом направлениях; поиск терминаторов транскрипции и вторичных структур; идентификация любой последовательности, которая не является прямым повтором или последовательностью tracr-помощника, но имеет больше чем 50% идентичность с прямым повтором или последовательностью tracr-помощника как потенциальная tracr-последовательность; поиск последовательностей терминатора транскрипции, ассоциированных с потенциальной tracr-последовательностью.

[00231] Следует принимать во внимание, что любой из функциональных видов активности, описанных в настоящем описании, может быть встроена способами инженерии в ферменты CRISPR из других ортологов, включая химерные ферменты, включающие фрагменты многих ортологов. Примеры таких ортологов описаны в настоящем описании. Таким образом, химерные ферменты могут включать фрагменты ортологов фермента CRISPR организма, который включает, но не ограничен следующими: Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma и Campylobacter. Химерный фермент может включать первый фрагмент и второй фрагмент, фрагменты могут происходить из ортологов фермента CRISPR организмов, принадлежащих к родам, упомянутым в настоящем описании, или видам, упомянутым в настоящем описании; предпочтительно фрагменты происходят из ортологов фермента CRISPR различных видов.

[00232] В вариантах осуществления изобретения, эффекторный белок типа V/типа VI, нацеленный на РНК, в частности, белок C2c2 C2c1/C2c3, упоминаемый в настоящем описании, также охватывает функциональный вариант C2c1/C2c3 или его гомолог, или ортолог. "Функциональный вариант" белка, как используют в настоящем описании, относится к варианту такого белка, который сохраняет, по меньшей мере частично, активность этого белка. Функциональные варианты могут включать мутанты (которые могут иметь инсерции, делеции или замены), включая полиморфы, и т.д. Также в функциональные варианты включены продукты слияния такого белка с другим, обычно неродственным, белком, нуклеиновой кислотой, полипептидом или пептидом. Функциональные варианты могут быть естественными или искусственными. Предпочтительные варианты осуществления изобретения могут включать не встречающийся в природе или сконструированный способами инженерии эффекторный белок типа V/типа VI, нацеленный на РНК, например, C2c1/C2c3, или его ортолог или гомолог.

[00233] В варианте осуществления изобретения кодон молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей эффекторный белок типа V/типа VI, нацеленный на РНК, например, C2c1/C2c3, или его ортолог или гомолог, может быть оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке. Эукариотический организм может быть таким, как описано в настоящем описании. Молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты может быть сконструирована способами инженерии или не встречаться в природе.

[00234] В варианте осуществления изобретения эффекторный белок типа V/типа VI, нацеленный на РНК, например, C2c1/C2c3 (или его ортолог или гомолог), может включать одну или более мутаций (следовательно, молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты, кодирующая этот белок, имеет ту же самую мутацию (мутации)). Мутации могут быть внесены искусственно и могут включать, но не ограничиваться ими, одну или более мутациий в каталитическом домене. Примеры каталитических доменов в отношении фермента Cas9 могут включать, но не ограничиваться ими, домены RuvC I, RuvC II, RuvC III и HNH.

[00235] В варианте осуществления изобретения белок типа V/типа VI, например, C2c1 или C2c3, или его ортолог или гомолог, может включать одну или более мутаций. Мутации могут быть внсены искусственно и могут включать, но не ограничиваться ими, одну или более мутаций в каталитическом домене. Примеры каталитических доменов в отношении фермента Cas могут включать, но не ограничиваться ими, домены RuvC I, RuvC II, RuvC III, HNH и домены HEPN.

[00236] В одном варианте осуществления изобретения белок типа V/типа VI, например, C2c1 или C2c3, или его ортолог или гомолог, может использоваться в качестве универсального белка, связывающего нуклеиновые кислоты, в слиянии или будучи функционально связанным с функциональным доменом. Иллюстративные функциональные домены могут включать, но не ограничиваются ими, инициатор трансляции, активатор трансляции, репрессор трансляции, нуклеазы, в частности, рибонуклеазы, сплайсосомы, магнитные гранулы, индуцируемый/контролируемый светом домен или химически индуцируемый/контролируемый домен.

[00237] В некоторых вариантах осуществления изобретения ферментативная активность неизмененного эффекторного белка, нацеленного на нуклеиновые кислоты, заключается в расщеплении. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок нацеливания на РНК может направлять расщепление одной или обеих нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) цепи в местоположении около последовательности-мишени, таком как в пределах последовательности-мишени и/или в пределах последовательности, комплементарной последовательности-мишени, или в последовательностях, ассоциированных с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок Cas, нацеленный на нуклеиновую кислоту, может направлять расщепление одной или обеих цепей ДНК или РНК в пределах приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 или более пар оснований от первого или последнего нуклеотида последовательности-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепление может быть тупым, т.е. производить тупые концы. В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепление может быть ступенчатым, т.е. производить липкие концы. В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепление может быть ступенчатым с 5'-выступающими концами, например, 5'-выступающими концами длиной 1-5 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепление может быть ступенчатым с 3'-выступающими концами, например, 3'-выступающими концами длиной 1-5 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор кодирует белок Cas, нацеленный на нуклеиновые кислоты, который может быть мутантным по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа, таким образом, что мутантный белок Cas, нацеленный на нуклеиновую кислоту, имеет пониженную способность расщеплять одну или обе цепи ДНК или РНК полинуклеотида-мишени, содержащего последовательность-мишень. В качестве еще одного примера, мутации могут быть внесены в два или более каталитических домена белка Cas (RuvC I, RuvC II и RuvC III или домен HNH или домен HEPN), чтобы мутантный белок Cas практически утратил активность расщепления РНК. Как описано в настоящем описании, мутации могут быть внесены в соответствующие каталитические домены эффекторного белка C2c1 или C2c3, чтобы активность расщепления ДНК мутантного эффекторного белка C2c1 или C2c3 была недостаточной или существенно уменьшенной. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислотe, считается имеющий существенный недостаток активности расщепления РНК, когда активность расщепления РНК мутантного фермента составляет не больше чем 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% или менее активности расщепления нуклеиновой кислоты немутантной формы фермента; например, когда активность расщепления нуклеиновой кислоты мутантной формы равна нулю или незначительна по сравнению с немутантной формой. Эффекторный белок может быть идентифицирован в отношении общего класса ферментов, которые являются гомологичными самой большой нуклеазе со множественными нуклеазными доменами системы CRISPR типа V/типа VI. Наиболее предпочтительно использование эффекторного белка типа V/типа VI, такого как C2c1/C2c3. Под "происходящим" заявители подразумевают, что происходящий фермент в значительной степени основан, в смысле наличия высокой степени гомологии последовательности, на ферменте дикого типа, но что он некоторым образом мутирован (модифицирован), как известно в данной области или как описано в настоящем описании.

[00238] Снова, следует принимать во внимание, что термины "Cas и фермент CRISPR", "белок CRISPR" и "белок Cas" обычно используются взаимозаменяемо и во всех случаях упоминания в настоящем описании относится относятся по аналогии к новым эффекторным белкам CRISPR, далее описанными в настоящем описании, если иное не очевидно, например, при конкретной отсылке к Cas9. Как упомянуто выше, многие нумерации остатков, используемые в настоящем описании, относятся к эффекторному белку локуса CRISPR типа V/типа VI. Однако следует принимать во внимание, что это изобретение включает еще множество эффекторных белков из других видов микроорганизмов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, Cas может конститутивно присутствовать, или индуцируемо присутствовать, или кондиционально присутствовать, или быть введенным, или быть доставленным. Оптимизация Cas может использоваться для усиления функций или разработки новых функций, могут быть получены химерные белки Cas. Cas может использоваться в качестве универсального белка, связывающего нуклеиновые кислоты.

[00239] Как правило, в контексте эндогенной системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, образование комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту (включающего направляющую РНК, гибридизованную с последовательностью-мишенью, и образующую комплекс с одним или более нацеленными на нуклеиновую кислоту эффекторными белками) приводит к расщеплению одной или обеих цепей ДНК или РНК в пределах или рядом (например, в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, или более пар оснований от) с последовательностью-мишенью. Как используют в настоящем описании, термин "последовательность (последовательности), ассоциированная с локусом-мишень", относится к последовательностям вблизи последовательности-мишени (например, в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований от последовательности-мишени, где последовательность-мишень находится в локусе-мишени).

[00240] Примером кодон-оптимизированной последовательности в данном случае является последовательность, оптимизированная для экспрессии в эукариотическом организме, например, в человеке (т.е. являющаяся оптимизированной для экспрессии в человеке) или другом эукариотическом организме, животном или млекопитающем, как описано в настоящем описании; см., например, кодон-оптимизированную для человека последовательность SaCas9 в WO 2014/093622 (PCT/US2G13/074667) в качестве примера кодон-оптимизированной последовательности (как это известно из уровня техники и настоящего описания, кодон оптимизированная кодирующая молекула(ы) нуклеиновой(ых) кислот(ы), особенно в случае эффекторного белка (например, C2c2), входит в компетенцию квалифицированного специалиста). В то время как именно представленное выше описание является предпочтительным, будет также понятно, что другие примеры являются возможными и известна оптимизация кодонов для видов хозяев, отличных от человека, или оптимизация кодонов для определенных органов. В некоторых вариантах осуществления кодирующая фермент последовательность, в которой закодирован нацеленный на ДНК/РНК белок Cas, является кодон-оптимизированной для экспрессии в определенных клетках, в частности, эукариотических клетках. Такие эукариотические клетки конкретного организма, или могут происходить из него, который может быть млекопитающим, включая, но не ограничиваясь этим человека, отличного от человека эукариотического организма, животного или млекопитающего, как описано в настоящем описании, например, мышь, крысу, кролика, собаку, домашний скот или отличного от человека млекопитающего или примата. В некоторых вариантах осуществления процессы модификации генетической принадлежности эмбриональной линии клеток человеческих индивидов и/или процессы модификации генетической принадлежности эмбриональной линии клеток животных, которые с большой долей вероятности могут принести им страдания без получения существенной пользы для медицинских приложений для человека или животных, а также получаемые при этих процессах животные, могут быть исключены. В целом, под оптимизацией кодонов понимается процесс изменения последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках-мишенях хозяина путем замены по меньшей мере одного кодона (например, примерно или более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более кодонов) нативной последовательности кодонами, которые более часто или наиболее часто используются в генах этой клетки-хозяина при сохранении нативной аминокислотной последовательности. Различные виды демонстрируют определенное предпочтение для определенных кодонов конкретных аминокислот. Предпочтение кодонов (различия в использовании кодонов между организмами) часто коррелирует с эффективностью трансляции матричных РНК (мРНК), что в свою очередь считается зависящим от, в числе прочего, от свойств транслируемых кодонов или доступности молекул определенной транспортной РНК (тРНК). Преобладание определенных тРНК обычно отражает наиболее часто используемые при синтезе пептидов кодоны. В соответствии с этим, гены могут быть адаптированы для оптимальной экспрессии генов в конкретном организме на основе оптимизации кодонов. Таблицы частот использования кодонов свободно доступны, например, в базе "Codon Usage Database", доступной на www.kazusa.oijp/codon/, причем такие таблицы могут быть адаптированы различными способами. См. Nakamura, Y. et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res, 28:292 (2000). Также доступны компьютерные алгоритмы для оптимизации кодонов для конкретной последовательности для экспрессии в определенной клетке-хозяине, в частности, такие как Gene Forge (Aptagen; Джакобус, Пенсильвания, США). В некоторых вариантах осуществления один или более кодонов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, более или все кодоны) в последовательности, кодирующей нацеленный на ДНК/РНК белок Cas соответствуют наиболее часто используемым кодонам для конкретной аминокислоты. Что касается использования кодонов в дрожжах, приводится ссылка на онлайн-базу данных Yeast Genome, доступную на http:.Avww.yaastyeoome.org/eommuniyvcodon_rsage.shtml, или Codon selection in yeast, Bennetzen and Hall, J. Biol Chem. 1982 Mar 25;257(6):3026-31. Что касается использования кодонов в растениях, включая водоросли, прилагается ссылка на Codon usage in higher plants, green algae, and cyanobacteria, Campbell and Gowri, Plant Physiol. 1990 Jan; 92(1): 1-11. а также на Codon usage in plant genes, Murray et al, Nucleic Acids Res. 1989 Jan 25;17(2):477-98 или Selection on the codon bias of chloroplast and cyanelle genes in different plant and algal lineages, Morton BR, J. Mol. Evol. 1998 Apr;46(4):449-59.

[00241] В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок, такой как нацеленный на РНК эффекторный белок типа V, в частности C2c2, либо ортолог или гомолог такового, содержащий одну или более последовательностей сигнала ядерной локализации (NLS), к примеру примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах осуществления такой нацеленный на РНК эффекторный белок содержит примерно или более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на N-конце или вблизи него, примерно или более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на C-конце или вблизи него или их сочетание (например, ноль или по меньшей мере один или более NLS на N-конце или более NLS на C-конце). В случае наличия более одной NLS, каждая из них может быть отобрана независимо от других, в частности, отдельная NLS может присутствовать в виде более чем одной копии и/или в сочетании с одной или более NLS, представленной одной или более копией. В некоторых вариантах осуществления NLS считается находящейся вблизи N- или C- конца, когда ближайшая аминокислота NLS находится на расстоянии менее примерно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или более аминокислот полипептидной цепи от N-конца или C-конца. Неограничивающие примеры NLS включают последовательности NLS, полученные из: NLS большого T-антигена вируса SV40, имеющий аминкоислотную последовательность PKKKRKV; NLS нуклеоплазмина (например, двухкомпонентная NLS, имеющий последовательностью KRPAATKKAGQAKKKK); NLS c-myc, имеющий аминокислотную последовательность PAAKRVKLD или RQRRNELКRSP; NLS hRNPA1 M9, имеющий аминокислотную последовательность NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; последовательность RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV домена IBB импортина-альфа; последовательности VSRKRPRP и PPKKARED T-белка миомы; последовательность РОРKKKPL p53 человека; последовательность SALIKKKKKMAP c-ab1 IV мыши; последовательности DRLRR и PKQKKRK вируса гриппа NS1; последовательность RKLKKKIKKL дельта-антигена вируса гепатита; последовательность REKKKFLKRR белка Mx1 мыши; последовательность KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK поли(АДФ-рибоза)-полимеразы и последовательность RKCLQAGMNLEARKTKK глюкокортикоида рецепторов стероидных гормонов. В целом, одна или более NLS являются достаточными, чтобы вызвать накопление нацеленного на ДНК/РНК белка Cas в поддающихся обнаружению количествах в ядре эукариотической клетки. В целом, выраженность активности ядерной локализации может быть результатом деятельности ряда NLS в нацеленном на нуклеиновые кислоты эффекторном белке, использования определенных NLS или сочетания этих факторов. Отслеживание накопления в ядре может быть выполнено с помощью любого подходящего способа. Например, отслеживаемый маркер может быть слит с нацеленным на нуклеиновую кислоту белком, так что его расположение в клетке может быть визуализировано, в частности, в комбинации со способами определения расположения ядра (например, с помощью специфичного для ядра красителя, такого как DAPI). Ядра клеток могут также быть выделены из клеток, содержимое которых может затем быть проанализировано с использованием любого подходящего способа отслеживания белка, такого как иммунногистохимия, вестерн-блоттинг или анализ активности белка. Накопление в ядре может быть определено и косвенными способами, например, путем анализа эффекта образования нацеленного на нуклеиновые кислоты комплекса (например, изменения активности экспрессии при образовании нацеленного на ДНК или РНК комплекса и/или активности белка Cas по нацеливанию на РНК), при сравнении с контролем, не подвергнутым воздействию нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas или нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, или подвергнутым действию нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas, лишенного одного или более NLS. В предпочитаемом варианте описываемые в настоящем описании комплексы и системы эффекторного белка C2c1 или C2c3 и комплексы и системы эффекторного белка C2c1 или C2c3 включают NLS, присоединенный к C-концу белка.

[00242] В некоторых вариантах осуществления один или более векторов, управляющих экспрессией одного или более систем нацеливания на нуклеиновые кислоты вводят в клетку таким образом, что экспрессия элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту управляет образованием нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса на одном или более участках-мишенях. Например, нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок и нацеливающая на нуклеиновую кислоту направляющая РНК могут быть функционально связаны с отдельными регуляторными элементами в отдельных векторах. Молекула(ы) системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, может быть доставлена к трансгенныму эффекторному белку, нацеленному на нуклеиновую кислоту, являющемуся белком животного или млекопитающего, конститутивно, индуцибельно или кондиционально экспрессирующего эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, или животного или млекопитающего, экспрессирующего эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту иным образом, или имеющего клетки, содержащие эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, находящийся там вследствие предшествующего введения вектора или векторов, кодирующих и экспрессирующих in vivo эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту. Альтернативно этому, два или более элементов, экспрессированных при участии одного или различных регуляторных элементов, могут быть введены в единый вектор, с одним или более дополнительных векторов, обеспечивающих какие-либо компоненты системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, не включенных в первый вектор. Компоненты системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, объединенные в единый вектор, могут быть собраны в любой подходящей ориентации, например, в которой один элемент расположен в восходящем направлении относительно 5'-конца или в нисходящем направлении относительно 3'-конца второго элемента. Кодирующая последовательность одного элемента может быть расположена на той же или противоположной цепи кодирующей последовательности второго элемента и иметь одну и ту же или противоположную ориентацию. В некоторых вариантах осуществления один и тот же промотор контролирует экспрессию транскриптов, кодирующих эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, и направляющую РНК, нацеленную на нуклеиновую кислоту, встроенных в одну или более последовательностей интронов (например, каждая в отдельном интроне, две или более по меньшей мере в одном интроне или все в одном и том же интроне). В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, и нацеливающая на нуклеиновую кислоту направляющая РНК могут быть функционально связаны с или экспрессироваться с одного и того же промотора. Средства доставки, векторы, частицы, наночастицы, составы и их компоненты для экспрессии одного или более элементов системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, используются в вышеупомянутых документах, в частности, в WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667). В некоторых вариантах осуществления вектор содержит одну или более участков вставок, таких как последовательности узнавания эндонуклеаз рестрикции (также называемые "сайтом клонирования"). В некоторых вариантах осуществления один или более участков вставок (например, примерно или более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более участков вставок) расположены в восходящем и/или нисходящем направлении относительно одной или более элементов последовательностей одного или более векторов. В некоторых вариантах осуществления вектор, содержащий участок-вставку в восходящем направлении последовательности-партнера tracr, и необязательно в нисходящем направлении от регуляторного элемента, функционально связанного с последовательностью-партнером tracr, таким образом, что после внесения направляющей (гидовой) последовательности в участок-вставку при экспрессии направляющей последовательности, направляет специфичное к последовательности связывание нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса с последовательностью-мишенью в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления вектор включает два или более участков вставок, что делает возможным введение в качестве вставок направляющих последовательностей в каждый участок. При такой организации две или более направляющих последовательностей могут включать две или более копий единичной направляющей последовательности, две или более различных направляющих последовательностей или их комбинацию. При использовании множества различных направляющих последовательностей единственная конструкция экспрессии может быть использована для нацеливания активности связывания нуклеиновых кислот на множественно различных соответствующих последовательностей-мишеней в клетке. К примеру, единственный вектор может включать примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более направляющих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления, может быть предоставлено примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более таких содержащих направляющую последовательность векторов, и необязательно они также могут быть доставлены в клетку. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью. Эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту или направляющая РНК или направляющие РНК, нацеливающие на нуклеиновую кислоту, могут быть доставлены независимо; предпочтительно, чтобы по меньшей мере один(одна) из них был(а) доставлен(а) посредством комплекса частиц или наночастиц. мРНК эффекторного белка, нацеленного на нуклеиновую кислоту, может быть доставлена прежде направляющей РНК, нацеливающей на нуклеиновую кислоту, для того, чтобы обеспечить время для экспрессии эффекторного белка, нацеленного на нуклеиновую кислоту. мРНК эффекторного белка, нацеленного на нуклеиновую кислоту, может быть введена на 1-12 часов (предпочтительно примерно 2-6 часов) раньше введения направляющей РНК, нацеливающей на нуклеиновую кислоту. Альтернативно этому, мРНК нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка и направляющая РНК, нацеливающая на нуклеиновую кислоту, могут быть введены одновременно. Предпочтительно, когда вторая усиливающая доза направляющей РНК вводится на протяжении 1-12 часов (предпочтительно примерно 2-6 часов) после начального введения мРНК нацеленного нуклеиновую кислоту эффекторного белка+направляющей РНК. Дополнительные введения нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка могут оказаться полезными, чтобы достичь наиболее эффективных уровней модификации генома.

[00243] В одном аспекте изобретение относится к способам использования одного или более компонентов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту. Такой нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс по изобретению обеспечивает эффективный инструмент модификации ДНК- или РНК-мишени, являющейся одно- или двухцепочечной, линейной или суперспирализованной. Такой нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс по изобретению имеет разнообразные преимущества, включая модификацию (например, удаление, вставка, перемещение, инактивация, активация) ДНК- или РНК-мишени в множестве типов клеток. Как таковой нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс по изобретению имеет широкий спектр применений, например, в генной терапии, фармакологическом скрининге, диагностике заболеваний и их прогнозировании. Иллюстративный нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс включает нацеленный на ДНК или РНК эффекторный белок в комплексе с направляющей РНК, гибридизованной с последовательностью-мишенью в представляющем интерес локусе-мишени.

[00244] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу расщепления РНК-мишени. Данный способ может включать модификацию РНК-мишени с использованием нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, который связывает РНК-мишень и осуществляет расщепление указанной РНК-мишени. В одном из вариантов осуществления нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс по изобретению при введении в клетку может вносить разрыв (например, одноцепочечный или двухцепочечный разрыв) в последовательность РНК. Например, такой способ может быть использован для расщепления связанной с заболеванием РНК в клетке. Например, экзогенная РНК-матрица, включающая последовательность, которую необходимо встроить, фланкированная вышележащей последовательностью и нижележащей последовательностью, может быть введена в клетку. Такие вышележащие и нижележащие последовательности характеризуются сходством последовательности с обоими концами участка встраивания в РНК. При желании, донорная РНК может представлять собой мРНК. Экзогенная РНК-матрица содержит последовательность, которую необходимо встроить (например, мутированную РНК). Последовательность для встраивания может представлять собой последовательность, эндогенную или экзогенную для клетки. Примерами последовательностей для встраивания являются кодирующая белок РНК или некодирующая РНК (например, микроРНК). Таким образом, последовательность для встраивания может быть функционально связана с надлежащей последовательностью или последовательностями контроля. Альтернативно, встраиваемая последовательность может выполнять регуляторную функцию. Вышележащие и нижележащие последовательности в экзогенной РНК выбирают так, чтобы стимулировать рекомбинацию между РНК-мишенью и донорной РНК. Вышележащая последовательность является последовательностью РНК, имеющей сходство последовательности с последовательностью РНК в восходящем направлении от целевого участка интеграции. Сходным образом, нижележащая последовательность является последовательностью РНК, имеющей сходство последовательности с последовательностью РНК в нисходящем направлении от целевого участка интеграции. Вышележащая и нижележащая последовательности в экзогенной РНК-матрице могут иметь 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичность последовательности с последовательностью РНК-мишени. Предпочтительно, чтобы вышележащая и нижележащая последовательности в экзогенной РНК-матрице имели примерно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с последовательностью РНК-мишени. В некоторых способах вышележащая и нижележащая последовательности экзогенной РНК-матрицы имеют 99% или 100% идентичность последовательности с последовательности РНК-мишени. Вышележащие или нижележащие последовательности могут содержать от примерно 20 п.н. до примерно 2500 п.н., например, примерно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 или 2500 п.н. В некоторых способах иллюстративная вышележащая или нижележащая последовательность имеет от примерно 200 п.н. до примерно 2000 п.н., от примерно 600 п.н. до примерно 1000 п.н. или более конкретно от примерно 700 п.н. до примерно 1000 п.н. В некоторых способах экзогенная РНК-матрица может дополнительно содержать маркер. Такой маркер может облегчить скрининг целевых встраиваний. Примеры подходящих маркеров включают участки рестрикции, флуоресцентные белки или метки, по которым возможен отбор. Экзогенная РНК-матрица по изобретению может быть получена с помощью рекомбинантных способов (см., например, Sambrook et al., 2001 и Ausubel et al., 1996). Согласно способу модификации РНК-мишени путем встраивания экзогенной РНК-мишени разрыв (например, двухцепочечный или одноцепочечный разрыва в одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК) вносится в последовательность ДНК или РНК нацеленным на нуклеиновую кислоту комплексом, причем такой разрыв репарируется за счет гомологичной рекомбинации с экзогенной РНК-матрицы таким образом, что матрица оказывается встроенной в РНК-мишень. Присутствие двухцепочечного разрыва облегчает встраивание матрицы. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу модификации экспрессии РНК в эукариотической клетке. Такой способ включает увеличение или уменьшение экспрессии полинуклеотида-мишени путем использования нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, связывающего ДНК или РНК (например, мРНК или пре-мРНК). В некоторых способах РНК-мишень может быть инактивирована для того, чтобы влиять на модификацию экспрессии в клетке. Например, при связывании нацеленного на РНК комплекса с последовательностью-мишенью в клетке РНК-мишень инактивируется так, что такая последовательность не транслируется, кодируемый ей белок не образуется или такая последовательность не функционирует так, как последовательность дикого типа. Например, белок, или транскрипты микроРНК или пре-микроРНК не образуются. РНК-мишень нацеленного на РНК комплекса может представлять собой любую РНК, эндогенную или экзогенную для данной эукариотической клетки. Например, РНК-мишень может представлять собой РНК, находящуюся в ядре эукариотической клетки. РНК-мишень может представлять собой последовательность (например, мРНК или пре-мРНК), кодирующую генный продукт (например, белок) или некодирующую последовательность (например, нкРНК, lnc-РНК, тРНК или рРНК). Примеры РНК-мишени включают последовательность, ассоциированную с сигнальными биохимическими путями, например, ассоциированную с сигнальными биохимическими путями РНК. Примеры РНК-мишени включают РНК, ассоциированные с заболеваниями. "Ассоциированные с заболеваниями" РНК обозначает любые РНК, используемые для синтеза продуктов трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетках, полученных из затронутых заболеванием тканей в сравнении с тканями или клетками не затронутого заболеванием контроля. Это может быть РНК, транскрибированная с гена, которая экспрессируется на аномально высоком уровне; это может быть РНК, транскрибированная с гена, который экспрессируется на аномально низком уровне, причем измененная экспрессия коррелирует с появлением и/или прогрессированием заболевания. Ассоциированные с заболеванием РНК также упоминают как РНК, транскрибированные с гена, несущего мутацию(и) или генетическую вариацию, которые напрямую ответственны или связаны с неравновесностью сцепления с геном(ами), который(ые) вовлечен в этиологию заболевания. Продукт трансляции может быть известен или не известен и его количество может иметь нормальный или аномальный уровень. РНК-мишень нацеленного на РНК комплекса может представлять собой любую РНК, эндогенную или экзогенную для такой эукариотической клетки. Например, РНК-мишень нацеленного на РНК комплекса может представлять собой РНК, находящуюся в ядре эукариотической клетки. Такая РНК-мишень может быть последовательностью (например, мРНК или пре-мРНК), кодирующей продукт гена (например, белок) или некодирующей последовательностью (например, нкРНК, lnc-РНК, тРНК или рРНК).

[00245] В некоторых вариантах осуществления изобретения способ может позволять нацеленному на нуклеиновую кислоту комплексу связываться с ДНК- или РНК-мишенью, чтобы произвести расщепление указанной ДНК- или РНК-мишени, таким образом, изменяя ДНК- или РНК-мишень, где нацеленный на нуклеиновые кислоты комплекс включает нацеленный на нуклеиновые кислоты эффекторный белок в комплексе с направляющей РНК, гибридизованной с последовательностью-мишенью в указанной ДНК- или РНК-мишени. В одном аспекте изобретение относится к способу модификации экспрессии ДНК или РНК в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ позволяет нацеленному на нуклеиновые кислоты комплексу связываться с ДНК или РНК, таким образом, что указанное связывание приводит к увеличению или уменьшению экспрессии указанной ДНК или РНК; где нацеленный на нуклеиновые кислоты комплекс включает нацеленный на нуклеиновые кислоты эффекторный белок в комплексе с направляющей РНК. Применимы соображения и условия, сходные с теми, что указаны выше для способов модификации ДНК- или РНК-мишени. В действительности, варианты взятия образцов, культивирования и повторного введения применяются во многих аспектах настоящего изобретения. В одном аспекте изобретение относится к способам модификации ДНК- или РНК-мишени в эукариотической клетке, которая может происходить in vivo, ex vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает взятие клетки или популяции клеток у человека или животного, не являющегося человеком, и модификацию этой клетки или клеток. Культивирование ex vivo может происходить на любой стадии. Клетка или клетки могут быть повторно введены в животное, не являющееся человеком, или растение. Для повторно введенных клеток особо предпочтительно, чтобы эти клетки являлись стволовыми клетками.

[00246] Действительно, в любом аспекте изобретения нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс может включать нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок в комплексе с направляющей РНК, которая гибридизованной с последовательностью-мишенью.

[00247] Изобретение относится к инженерии и оптимизации систем, способов и композиций, используемых для контроля экспрессии генов, включающим нацеливание на последовательности ДНК и РНК, которые связаны с нацеленной на нуклеиновые кислоты системой и ее компонентами. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения эффекторным белком (ферментом) является белок типа V, такой как C2c1 или C2c3. Преимущество способов по настоящему изобретению состоит в том, что система CRISPR минимизирует или избегает неспецифического связывания и его побочных эффектов. Эта система достигается с использованием систем, организованных так, что они имеют высокую степень специфичности к ДНК- или РНК-мишени.

[00248] Что касается нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса или системы, предпочтительно, чтобы tracr-последовательность имела одну или более шпилек и составляла 30 или более нуклеотидов в длину, 40 или более нуклеотидов в длину или 50 или более нуклеотидов в длину; длина последовательности cr-РНК варьировалась между 10 и 30 нуклеотидами, а нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок принадлежал к эффекторным белкам типа V.

[00249] В некоторых модификациях изобретения эффекторный белок может представлять собой C2c1p из Alicyclobacillus sp., предпочтительно, C2c1p из Alicyclobacillus acidoterrestris, более предпочтительно C2c1p Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025, и последовательность cr-РНК может иметь длину 34 нуклеотида и содержать 5'-концевой прямой повтор (DR) длиной 14 нуклеотидов и спейсер длиной 20 нуклеотидов.

[00250] В некоторых модификациях изобретения эффекторный белок может представлять собой C2c1p из Bacillus sp., предпочтительно, C2c1p из Bacillus thermoamylovorans, более предпочтительно C2c1p Bacillus thermoamylovorans strain B4166, и последовательность cr-РНК может иметь длину 33 нуклеотида и содержать 5'-концевой прямой повтор (DR) длиной 14 нуклеотидов и спейсер длиной 29 нуклеотидов.

[00251] В некоторых модификациях эффекторный белок может быть эффекторным белком локусов типа V-B, более конкретно C2c1p, и последовательность cr-РНК может иметь длину от 27 до 40 нуклеотидов, предпочтительно от 29 до 38 нуклеотидов или от 30 до 37 нуклеотидов, более предпочтительно от 31 до 36 нуклеотидов или от 32 до 35 нуклеотидов, наиболее предпочтительно 33 или 34 нуклеотидов. например, cr-РНК может включать, состоять по большей части или состоять только из прямого повтора (DR), предпочтительно 5'-концевого DR длиной от 12 до 16 нуклеотидов, предпочтительно от 13 до 15 нуклеотидов, еще более предпочтительно 14 нуклеотидов, а также спейсер длиной от 15 до 24 нуклеотидов, предпочтительно от 16 до 23 нуклеотидов, более предпочтительно от 17 до 22 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 18 до 21 нуклеотидов и наиболее предпочтительно 19 или 20 нуклеотидов.

[00252] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может представлять собой C2c2p Listeria sp., предпочтительно C2c2p Listeria seeligeria, более предпочтительно C2c2p Listeria seeligeria серовара 1/2b штамма SLCC3954, и последовательность cr-РНК может составлять 44-47 нуклеотидов в длину с прямыми повторами (DR) на 5'-конце длиной 29 нуклеотидов и спейсером длиной от 15 нуклеотидов до 18 нуклеотидов.

[00253] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может представлять собой C2c2p Leptotrichia sp., предпочтительно C2c2p Leptotrichia shahii, более предпочтительно C2c2p Leptotrichia shahii DSM 19757, и последовательность cr-РНК может составлять 42-58 нуклеотидов в длину с прямым повтором на 5'-конце длиной 28 нуклеотидов и спейсер длиной от 14 нуклеотидов до 28 нуклеотидов.

[00254] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может относиться к эффекторным белкам локусов типа VI, более конкретно C2c2p, последовательность cr-РНК может иметь длину 36-63 нуклеотидов, предпочтительно от 37 нуклеотидов до 62 нуклеотидов или от 38 нуклеотидов до 61 нуклеотидов или от 39 нуклеотидов до 60 нуклеотидов, более предпочтительно от 40 нуклеотидов до 59 нуклеотидов или от 41 нуклеотидов до 58 нуклеотидов, наиболее предпочтительно от 42 нуклеотидов до 57 нуклеотидов. Например, cr-РНК может включать, по существу состоять из или состоять из прямого повтора (DR), предпочтительно на 5'-конце длиной от 26 нуклеотидов до 31 нуклеотидов, предпочтительно от 27 нуклеотидов до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно 28 нуклеотидов или 29 нуклеотидов в длину, и спейсера длиной от 10 нуклеотидов до 32 нуклеотидов, предпочтительно от 11 нуклеотидов до 31 нуклеотидов, более предпочтительно от 12 нуклеотидов до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 13 нуклеотидов до 29 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно от 14 нуклеотидов до 28 нуклеотидов.

[00255] В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок может представлять собой белок C2c1p из Alicyclobacillus sp., предпочтительно C2c1p из Alicyclobacillus acidoterrestris, более предпочтительно C2c1p из Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025 и последовательность cr-РНК может иметь длину по меньшей мере 78, например, может иметь длину 79 нуклеотидов или длину более 79 нуклеотидов, например, может иметь длину по меньшей мере 80 нуклеотидов, по меньшей мере 90 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 110 нуклеотидов, по меньшей мере 120 нуклеотидов, по меньшей мере 130 нуклеотидов, по меньшей мере 140 нуклеотидов, по меньшей мере 1500 нуклеотидов или более.

[00256] В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок может представлять собой белок C2c1p из Bacillus sp., предпочтительно C2c1p из Bacillus thermoamylovorans, более предпочтительно C2c1p из Bacillus thermoamylovorans, штамм strain B4166 и последовательность tracr-РНК может иметь длину примерно 91 нуклеотид, например, 91 нуклеотид в длину.

[00257] В некоторых вариантах эффекторный белок может являться эффекторным белком локусов типа V-B, более конкретно C2c1p, и последовательность tracr-РНК может иметь длину по меньшей мере 60 нуклеотидов, в частности, по меньшей мере 65 нуклеотидов в длину, или по меньшей мере 70 нуклеотидов в длину, в частности от 60 до 70 нуклеотидов в длину, или от 60 до 70 нуклеотидов в длину, от 70 до 80 нуклеотидов в длину, от 80 до 90 нуклеотидов в длину, от 90 до 100 нуклеотидов в длину, от 100 до 110 нуклеотидов в длину, от 110 до 120 нуклеотидов в длину, от 120 до 130 нуклеотидов в длину, от 130 до 140 нуклеотидов в длину, от 140 до 150 нуклеотидов в длину или более 150 нуклеотидов в длину. См. иллюстрирующие примеры на фиг.17-21.

[00258] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может относиться к эффекторным белкам локусов типа VI, более конкретно C2c2p, и последовательность tracr-РНК может иметь длину по меньшей мере 60 нуклеотидов, такую как по меньшей мере 65 нуклеотидов или по меньшей мере 70 нуклеотидов, такую как от 60 нуклеотидов до 70 нуклеотидов, или от 60 нуклеотидов до 70 нуклеотидов, или от 70 нуклеотидов до 80 нуклеотидов, или от 80 нуклеотидов до 90 нуклеотидов, или от 90 нуклеотидов до 100 нуклеотидов, или от 100 нуклеотидов до 110 нуклеотидов, или от 110 нуклеотидов до 120 нуклеотидов, или от 120 нуклеотидов до 130 нуклеотидов, или от 130 нуклеотидов до 140 нуклеотидов, или от 140 нуклеотидов до 150 нуклеотидов, или больше, чем 150 нуклеотидов. См. иллюстративные примеры на фиг.22-37.

[00259] В определенных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может относиться к эффекторным белкам локусов типа VI, более конкретно C2c2p, поэтому tracr-РНК для расщепления может не требоваться.

[00260] Использование двух различных аптамеров (каждый ассоциирован с отдельной нацеливающей на нуклеиновую кислоту направляющей РНК) позволяет использование слитых слитой конструкции активатор-адаптерный белок и слитых конструкций репрессор-адаптерный белок с различными нацеливающими на нуклеиновые кислоты направляющими РНК, для активации экспрессии только одной ДНК или РНК, подавляя другую. Их, наряду с их различными направляющими РНК можно вводить совместно, или по существу совместно, в мультиплексном подходе. Большое количество таких модифицированных нацеленных на нуклеиновые кислоты направляющих РНК может использоваться одновременно, например 10 или 20 или 30 и т.д., в то время как только одна (или по меньшей мере минимальное число) молекула эффекторного белка должна быть доставлена, так как сравнительно небольшое количество молекул эффекторного белка может использоваться с большим количеством модифицированных направляющих молекул. Адаптерный белок может быть ассоциирован (предпочтительно связан или слит с) одним или более активаторами или одним или более репрессорами. Например, адаптерный белок может быть ассоциирован с первым и вторым активаторами. Первый и второй активаторы могут быть одинаковыми, но предпочтительно они являются различными активаторами. Можно использовать три и более или даже четыре и более активатора (или репрессора), однако допустимый размер упаковки ограничивает их число 5 различными функциональными доменами. Использование линкеров является предпочтительным над прямым слиянием с адаптерным белком, где два или больше функциональных домена ассоциированы с адаптерным белком. Подходящие линкеры могут включать линкер GlySer.

[00261] Также предусматривается, что нацеленный на нуклеиновые кислоты комплекс эффекторного белка и направляющей РНК в целом может быть ассоциирован с двумя или более функциональными доменами. Например, может быть два или более функциональных домена, связанных с нацеленным на нуклеиновые кислоты эффекторным белком, или может быть два или более функциональных домена, связанных с направляющей РНК (через один или более адаптерных белков), или может быть один или более функциональных доменов, связанных с нацеленным на нуклеиновые кислоты эффекторным белком, и один или более функциональных доменов, связанных с направляющей РНК (посредством одного или более адаптерных белков).

[00262] Слитая конструкция адаптерного белка и активатора или репрессора может включать линкер. Например, могут использоваться линкеры GlySer GGGS. Они могут использоваться в повторах по 3 ((GGGGS)₃) или 6, 9 или даже 12 или более, чтобы обеспечить подходящие длину, как требуется. Линкеры могут использоваться между направляющими РНК и функциональным доменом (активатор или репрессор), или между нацеленным на нуклеиновые кислоты эффекторным белком и функциональным доменом (активатор или репрессор). Линкеры используют для придания белку необходимой "механической гибкости". Изобретение охватывает нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс, включающий нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок и направляющую РНК, где нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок включает по меньшей мере одну мутацию, такую, что у нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas есть не более 5% активности нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas, не имеющего по меньшей мере одной мутации и необязательно по меньшей мере одну или более последовательностей ядерной локализации; направляющая РНК включает последовательность направляющей молекулы, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в представляющей интерес РНК в клетке; и где нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок ассоциирован с двумя или более функциональными доменами, или по меньшей мере одна шпилечная структура направляющей РНК изменена вставкой отдельной последовательности (последовательностей) РНК, которая связана с одним или более адаптерными белками, и где адаптерный белок связан с двумя или более функциональными доменами; или нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок ассоциирован с одним или более функциональными доменами, и по меньшей мере одна шпилечная структура направляющей РНК изменена вставкой отдельной последовательности (последовательностей) РНК, которая связана с одним или более адаптерными белками, и где адаптерный белок связан с одним или более функциональными доменами.

Мутации ферментов, уменьшающие нецелевые эффекты

[00263] В одном аспекте изобретение относится к не встречающемуся в природе или сконструированному способами инженерии ферменту CRISPR, предпочтительно ферменту CRISPR 2 класса, предпочтительно ферменту CRISPR типа V или VI, как описано в настоящем описании, в частности, предпочтительно, но не ограничиваясь этим, к C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, имеющим одну или более мутаций, приводящих к уменьшению нецелевых эффектов, т.е. к улучшенным ферментам CRISPR для использования с целью вызвать модификации локусов-мишеней, но снижающих или устраняющих нецелевую активность, в частности, в комплексе с направляющими РНК, к усовершенствованным ферментам CRISPR для повышения активности ферментов CRISPR, в частности, в комплексе с направляющими РНК. Следует понимать, что мутантные ферменты, описанные ниже, могут быть использованы в любом из способов по изобретению, как описано в настоящем описании. Любые из этих способов, продуктов, композиций и способов применения, описанных в настоящем описании, в равной степени применимы совместно с мутантными ферментами CRISPR, как это более подробно описано ниже. Следует понимать, что в аспектах и вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, при упоминании или описании C2c1 или C2c3 в качестве фермента CRISPR предпочтительно, чтобы восстановление функциональной системы CRISPR-Cas не требовало или не было зависимо от последовательности tracr и/или прямой повтор находился в 5'(восходящем)-направлении от направляющей последовательности (мишени или спейсера).

[00264] В качестве дальнейшего руководства приводятся следующие конкретные аспекты и варианты осуществления.

[00265] Авторы изобретения неожиданно установили, что возможны модификации ферментов CRISPR, сообщающие им сниженную нецелевую активность по сравнению с немодифицированными ферментами и/или увеличенную целевую активность по сравнению с немодифицированными ферментами CRISPR. Таким образом, в определенных аспектах изобретения в рамках настоящего изобретения предусматриваются улучшенные ферменты CRISPR, которые могут использоваться для широкого круга применений по модификации генов. Также в рамках настоящего изобретения предусмтриваются комплексы CRISPR, композиции и системы, а также способы и способы применения, все из которых включают описанные в настоящем описании модифицированные ферменты CRISPR.

[00266] В настоящем описании термин "Cas" может означать "C2c1", "C2c3" или фермент CRISPR. Термины "C2c1p" и "C2c1" используются взаимозаменяемо и термины "C2c3p" и "C2c3" используются взаимозаменяемо. Буква p в C2c1p и C2c3p служит обозначением белка. В контексте этого аспекта изобретения C2c1, C2c3 или фермент CRISPR является мутантным или модифицированным, "согласно чему фермент комплекса CRISPR имеет сниженную способность модифицировать один или более не являющийся мишенью локус по сравнению с немодифицированным ферментом" (или сходные утверждения); и при прочтении настоящего описания термины "C2c1", "C2c3","Cas" или "фермент CRISPR" и т.п. призваны включать мутантные или модифицированные C2c1, C2c3, Cas или фермент CRISPR по изобретению, т.е. "в связи с чем фермент комплекса CRISPR имеет сниженную способность модифицировать один или более нецелевых локусов по сравнению с немодифицированным ферментом" (или сходные утверждения).

[00267] В одном аспекте предусматриваются сконструированные способами инженерии белки C2c1 или C2c3 согласно приведенному в настоящем описании определению, в частности, C2c1 или C2c3, где белки в комплексе с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей РНК, для образования комплекса CRISPR, причем в случае пребывания в составе комплекса CRISPR молекула нуклеиновой кислот нацеливает на один или более полинуклеотидных локусов-мишеней и белок содержит по меньшей мере одну модификацию по сравнению с немодифицированным белком C2c1 или немодифицированным белком C2c3, причем комплекс CRISPR, содержащий модифицированный белок, имеет измененную активность по сравнению с таковой комплекса, содержащего немодифицированный белок C2c1 или немодифицированный белок C2c3. Следует понимать, что при упоминании в настоящем описании "белка" CRISPR предпочтительно, чтобы белок C2c1 или белок C2c3 являлись модифицированным ферментом CRISPR (например, имели увеличенную или сниженную (или отсутствующую) ферментативную активность) в частности включая, но не ограничиваясь ими, C2c1 или C2c3. Термин "белок CRISPR" может использоваться взаимозаменяемо с термином "фермент CRISPR" независимо от наличия в белке внесенных изменений, в частности, увеличенной или сниженной (или отсутствующей) ферментативной активности по сравнению с белком CRISPR дикого типа.

[00268] В одном аспекте измененная активность сконструированного белка CRISPR включает измененные свойства связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, включающей РНК или локусы полинуклеотида-мишени, измененную кинетику связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, включающей РНК или локусы полинуклеотида-мишени или измененную специфичность связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, включающей РНК или локусы полинуклеотида-мишени по сравнению локусами полинуклеотида, не являющегося мишенью.

[00269] В некоторых вариантах осуществления немодифицированный Cas имеет активность расщепления ДНК, такую как активность C2c1 или C2c3. В некоторый вариантах осуществления Cas обеспечивает расщепление одной или обеих цепей в участке последовательности-мишени, в частности, внутри последовательности-мишени и/или в участке, комплементарном последовательности-мишени. В некоторых модификациях изобретения Cas обеспечивает расщепление одной или обеих цепей на расстоянии до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 или более нуклеотидов от первого или последнего нуклеотида последовательности-мишени. В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует Cas, являющийся мутантным по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа таким образом, что мутированный Cas лишен способности расщеплять одну или обе цепи полинуклеотида-мишени, содержащего последовательность-мишень. В некоторых вариантах осуществления Cas считается по существу лишенным какой-либо активности расщепления ДНК в случае, если активность мутантного фермента в отношении расщепления составляет не более чем приблизительно 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% или менее относительно активности расщепления ДНК немутантной формы фермента; к примеру, активность расщепления ДНК у мутантной формы отсутствует или пренебрежимо мала в сравнении с немутантной формой. Таким образом, Cas может включать одну или более мутаций и может быть использован как общий ДНК-связывающий белок со слиянием с функциональным доменом или без него. Такие мутации могут быть внесены искусственно или являться мутациями с приобретением или потерей функции. В одном из аспектов изобретения фермент Cas может быть слит с другим белком, например, TAG и/или индуцибельным/контролируемым доменом, в частности, химически индуцибельным/контролируемым доменом. Cas по настоящему изобретению могут представлять собой химерные белки Cas; например, Cas, имеющий усиленную функцию за счет того, что является химерным. Химерные белки Cas могут быть новыми Cas, содержащими фрагменты из более чем одного встречающегося в природе Cas. Они могут включать химерные белки, содержащие N-концевой фрагмент(ы) одного из гомологов Cas9 с C-концевым фрагментом(ами) другого гомолога Cas. Такой Cas может быть доставлен в клетку в форме мРНК. Экспрессия Cas может происходить под контролем индуцибельного промотора. Безусловной целью настоящего изобретения является избежание использование известных мутаций. В действительности, утверждение "согласно которому фермент комплекса CRISPR имеет сниженную способность модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенями, в сравнении с немодифицированным ферментом и/или в связи с чем фермент комплекса CRISPR имеет увеличенную способность модифицировать один или более локусов-мишеней в сравнении с немодифицированным ферментом" (или подобные утверждения) не имеет целью описание мутаций, единственным результатом которых являются никаза, "мертвый" Cas или известные мутации Cas9. Однако не подразумевается, что модификация(и) или мутация(и) по настоящему изобретению, "в результате чего фермент комплекса CRISPR имеет сниженную способность модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенями, по сравнению с немодифицированным ферментом и/или в результате чего фермент комплекса CRISPR имеет увеличенную способность модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом" (или подобные утверждения) не могут сочетаться с мутациями, приводящими к тому, что фермент является никазой или нефункциональным ("убитым") ферментом. Такой "мертвый" фермент может иметь увеличенную способность к связыванию нуклеиновой кислот. Такая никаза может являться улучшенной никазой. Например, замена нейтральной аминокислот(ы) в и/или рядом с бороздой и/или других заряженных остатков в других участках Cas, расположенных в непосредственной близости к нуклеиновой кислоте (например, ДНК, кДНК, РНК, gРНК) на положительно заряженные аминокислоты может привести к тому, что "в связи с этим фермент комплекса CRISPR будет иметь сниженную способность к модификации одного или более локусов, не являющихся мишенями, по сравнению с немодифицированным ферментом", например, более активному расщеплению. Поскольку в связи с этим могут усилиться как целевое, так и нецелевое расщепление (сверхрасщепление C2c1 или C2c3), возможно использование этой методики вместе с тем, что в данной области называется tru-направляющей или tru-sg-РНК (см., например, Fu et at., "Improving CRISPR - Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs," Nature Biotechnology 32, (2014) doi: 10,1038/nbt.2808, Received 17 November 2013, Accepted 06 January 7 2014, Published online 26 January 2014, Corrected online 29 January 2014) для усиления целевой активности без усиления нецелевого расщепления для получения сверхрасщепляющих никаз или в сочетании с мутацией, делающей Cas "убитым" для молекулы со сверхсвязыванием.

[00270] В определенных вариантах осуществления измененная активность сконструированных белков C2c1 или C2c3 включает увеличенную эффективность нацеливания или уменьшенное нецелевое связывание. В определенных вариантах осуществления измененная активность сконструированных белков C2c1 или C2c3 включает модифицированную активность расщепления.

[00271] В определенных вариантах осуществления измененная активность включает измененные свойства связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей РНК или локусы полинуклеотида-мишени, измененную кинетику связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей РНК или локусы полинуклеотида-мишени или измененную специфичность связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, включающей РНК или локусы полинуклеотида-мишени или измененную специфичность связывания в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей РНК или локусы полинуклеотида-мишени в сравнении с локусами полинуклеотида, не являющегося мишенью.

[00272] В определенных вариантах осуществления измененная активность включает увеличение эффективности нацеливания или уменьшение нецелевого связывания. В некоторых вариантах осуществления измененная активность включает усиление активности расщепления в отношении локусов полинуклеотида-мишени. В некоторых модификациях изменение активности включает уменьшение активности расщеплениz в отношении локусов полинуклеотида-мишени. В некоторых вариантах осуществления измененная активность включает усиление активности расщепления локусов полинуклеотида, не являющегося мишенью.

[00273] В соответствии с этим в определенных вариантах осуществления существует увеличенная специфичность в отношении локусов полинуклеотида-мишени по сравнению локусами полинуклеотида, не являющегося мишенью. В других вариантах осуществления специфичность в отношении локусов полинуклеотида-мишени в сравнении с локусами полинуклеотида, не являющегося мишенью, уменьшена.

[00274] В одном из аспектов изобретения измененная активность сконструированного способами инженерии белка C2c1 или C2c3 включает измененную кинетику хеликазной активности.

[00275] В одном из аспектов изобретения сконструированные способами инженерии белки C2c1 или C2c3 включают модификацию, которая изменяет связывание белка с нуклеиновой кислотой, включающей РНК, или цепью локусов полинуклеотида-мишени или цепью локусов полинуклеотида, не являющегося мишенью. В одном из аспектов изобретения сконструированные способами инженерии белки C2c1 или C2c3 включают модификацию, изменяющую образование комплекса CRISPR.

[00276] В некоторых вариантах осуществления модифицированные белки C2c1 или C2c3 включают модификацию, изменяющую нацеливание молекулы нуклеиновой кислоты на локусы полинуклеотида. В определенных вариантах изобретения модификация включает мутацию в участке белка, который задействован в связывании с молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления такая модификация включает мутацию в участке белка, который задействован в связывании с цепью локусов полинуклеотида-мишени. В некоторых вариантах осуществления такая модификация включает мутацию в участке белка, который задействован в связывании с цепью локусов полинуклеотида, не являющегося мишенью. В некоторых вариантах осуществления модификация или мутация включает уменьшение отрицательного заряда в участке белка, который участвует в связывании молекулы нуклеиновой кислоты, включающей РНК, цепи локусов полинуклеотида-мишени или цепи локусов полинуклеотида, не являющегося мишенью. В некоторых вариантах осуществления модификация или мутация включает уменьшение отрицательного заряда в участке белка, который задействован с связывании молекулы нуклеиновой кислоты, включающей РНК, цепи локусов полинуклеотида-мишени или цепи локусов полинуклеотида, не являющегося мишенью. В некоторых вариантах осуществления модификация или мутация включает увеличенный положительный заряд в участке белка, который задействован в связывании с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей РНК, цепи локусов полинуклеотида-мишени или цепи локусов полинуклеотида, не являющегося мишенью. В некоторых вариантах осуществления модификация или мутация включает увеличенный отрицательный заряд в участке белка, который задействован в связывании молекулы нуклеиновой кислоты, включающей РНК, цепи локусов полинуклеотида-мишени или цепи локусов полинуклеотида, не являющегося мишенью. В некоторых вариантах осуществления модификация или мутация увеличивает пространственные затруднения взаимодействия между белком и молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей РНК, цепью локусов целевого полинуклеотида или цепью локусов нецелевого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления модификация или мутация включает замену Lys, His, Arg, Glu, Asp, Ser, Gly или Thr. В некоторых вариантах осуществления модификация или мутация включает замену на Gly, Ala, He, Glu или Asp. В некоторых случаях модификация или мутация заключается в замене аминокислоты в борозде связывания.

[00277] В одном аспекте настоящее изобретение относится к не встречающемуся в природе ферменту CRISPR, как определено в настоящем описании, такому как C2c1 или C2c3, где фермент образует комплекс с направляющей РНК с образованием комплекса CRISPR, направляющая РНК, когда она в составе комплекса CRISPR, нацеливает на одного или более локусов полинуклеотида-мишени и фермент вносит изменения в локусы этого полинуклеотида и фермент имеет по меньшей мере одну модификацию, в соответствии с чем фермент в составе комплекса CRISPR имеет сниженную способность модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенью, по сравнению с немодифицированным белком, и в соответствии с чем фермент в составе комплекса CRISPR имеет увеличенную способность модифицировать один или более локусов-мишеней в сравнении с немодифицированным ферментом.

[00278] В любом из таких не встречающихся в природе ферментов CRISPR модификация может включать модификацию одного или более аминокислотных остатков фермента.

[00279] В любом из таких не встречающихся в природе ферментов CRISPR модификация может включать модификацию одного или более аминокислотных остатков, локализованных в участке, содержащем остатки, являющиеся положительно заряженными в немодифицированном ферменте.

[00280] В любом из таких не встречающихся в природе ферментов CRISPR модификация может включать модификацию одного или более аминокислотных остатков, являющихся положительно заряженными в немодифицированном ферменте.

[00281] В любом из таких не встречающихся в природе ферментов CRISPR модификация может включать модификацию одного или более остатков аминокислот, не являющихся положительно заряженными в немодифицированном ферменте.

[00282] Модификация может включать модификацию одной или более аминокислот, не имеющих заряда в немодифицированном белке.

[00283] Модификация может включать модификацию одной или более аминокислот, имеющих отрицательный заряд в немодифицированном белке.

[00284] Модификация может включать модификацию одной или более аминокислот, являющихся гидрофобными в немодифицированном белке.

[00285] Модификация может включать модификацию одной или более аминокислот, являющихся полярными в немодифицированном белке.

[00286] В некоторых описанных выше не встречающихся в природе ферментах CRISPR модификация может включать модификацию одного или более остатков, расположенных в борозде связывания.

[00287] В некоторых описанных выше не встречающихся в природе ферментах CRISPR модификация может включать модификацию одного или более остатков, расположенных вне борозды связывания.

[00288] В некоторых описанных выше не встречающихся в природе ферментах CRISPR модификация может включать модификацию одного или более остатков, где такие один или более остатков могут являться аргинином, гистидином или лизином.

[00289] В любом из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR такой фермент может быть модифицирован мутацией указанных одного или более остатков.

[00290] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком аланина.

[00291] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком глутаминовой кислоты.

[00292] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком серина, треонина, аспарагина или глутамина.

[00293] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком аланина, глицина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, тирозина или валина.

[00294] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком полярной аминокислоты.

[00295] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком, не являющимся остатком полярной аминокислоты.

[00296] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком отрицательно заряженной аминокислоты.

[00297] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком, не являющимся остатком отрицательно заряженной аминокислоты.

[00298] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком не несущей заряд аминокислоты.

[00299] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация представляет собой замену остатка немодифицированного фермента остатком, не являющимся остатком не несущей заряд аминокислоты.

[00300] В некоторых из описанных выше не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более указанных остатков, где мутация включает замену остатка немодифицированного фермента остатком гидрофобной аминокислоты.

[00301] В случае некоторых из вышеописанных не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент модифицирован мутацией одного или более упомянутых остатков, где мутация может являться заменой остатка немодифицированного фермента аминокислотным остатком, который не является гидрофобным аминокислотным остатком.

[00302] В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может являться белком C2c1p Alicyclobacillus sp., или, более предпочтительно, C2c1p Alicyclobacillus acidoterrestris, или, еще более предпочтительно, C2c1p Alicyclobacillus acidoterrestris, ATCC 49025. В определенных вариантах осуществления эффекторный белок может быть белком C2с1p Bacillus sp., или, более предпочтительно, C2e1p Bacillus thermoamylovorans, или, еще более предпочтительно, C2c1p Bacillus thermoamylovorans штамма B4I66. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок может быть эффекторным белком локусов типа V-B, в частности, C2c1p.

[00303] В некоторых вариантах осуществления белок C2c1 или C2c3 содержат один или более доменов с сигналом ядерной локализации (NLS). В некоторых вариантах осуществления белок C2c1 или C2c3 содержит не менее двух NLS.

[00304] В некоторых вариантах осуществления изобретения белок C2c1 или C2c3 представляет собой химерный белок CRISPR, состоящий из первого фрагмента из первого ортолога CRISPR, и второго фрагмента из второго ортолога CRISPR, причем первый и второй ортологи CRISPR различаются.

[00305] В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент модифицирован или содержит модификации, например, содержит, по существу состоит или состоит из модификаций, полученных посредством мутаций любого из перечисленных в настоящем описании остатков или соответствующего остатка в соответствующем ортологе: либо фермент содержит или по существу состоит или состоит из модификаций любого (одиночная модификация), двух (двойная), трех (тройная), четырех (четырехкратная) положений или большего числа положений, в соответствии с описанием настоящего изобретения в настоящей заявке, или соответствующих остатков или положений в ортологе фермента CRISPR; например, фермент содержит или по существу состоит или состоит из модификации любых перечисленных в настоящем описании остатков C2c1 или C2c3 или соответствующего остатка или позиции в ортологе фермента CRISPR. В таком ферменте каждый остаток может быть модифицирован заменой на остаток аланина.

[00306] Заявители недавно описали способ получения ортологов Cas9 с повышенной специфичностью (Slaymaker и др. 2015 "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity"). Эта стратегия может быть использована для повышения специфичности ортологов C2c1 или C2c3. Приоритетными остатками для мутагенеза предпочтительно являются все положительно заряженные остатки в пределах RuvC-домена. Дополнительными остатками являются положительно заряженные остатки, являющиеся консервативными в различных ортологах.

[00307] В некоторых вариантах осуществления специфичность C2c1 или C2c3 может быть повышена за счет мутаций остатков, которые стабилизируют цепь ДНК, не являющейся мишенью.

[00308] В любом из не встречающихся в природе ферментов CRISPR:

(a) может существовать одно неспаренное основание между последовательностью-мишенью и соответствующей последовательностью в одном или более не являющихся мишенью локусах; и/или

(b) могут существовать два, три, четыре или более неспаренных оснований между последовательностью-мишенью и соответствующей последовательностью в одном или более не являющихся мишенью локусах; и/или

(c) указанные в (b) два, три, четыре или более неспаренных оснований являются смежными.

[00309] В случае любого из встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент в комплексе CRISPR может обладать сниженной способностью к модификации одного или более не являющихся мишенью локусов по сравнению с немодифицированным ферментом, при этом фермент в комплексе CRISPR обладает повышенной способностью к модификации указанных локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом.

[00310] В случае любого из встречающихся в природе ферментов CRISPR относительная разница между способностью фермента в комплексе CRISPR к модификации локуса-мишени и способностью к модификации по меньшей мере одного не являющегося мишенью локуса может быть увеличена по сравнению с немодифицированным ферментом.

[00311] В случае любого из не встречающихся в природе ферментов CRISPR CRISPR-фермент может содержать одну или более дополнительных мутаций, при этом одна или более дополнительных мутаций находятся в одном или более каталитически активных доменах.

[00312] В случае таких не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент CRISPR может обладать сниженной нуклеазной активностью, по сравнению с ферментом, в котором отсутствуют указанные одна или более дополнительные мутации, или может не обладать ей.

[00313] В случае некоторых таких не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент CRISPR не осуществляет расщепление одной или другой цепи ДНК в участке последовательности-мишени.

[00314] В случае, когда фермент CRISPR содержит одну или более дополнительных мутаций в одном или более каталитически активных доменах одна или более дополнительных мутаций могут находиться в каталитически активном домене фермента CRISPR, включая домены RuvCI, RuvCII и RuvCIII.

[00315] Не ограничиваясь теорией, в одном аспекте изобретения описанные способы и мутации предусматривают увеличение конформационных перестроек доменов ферментов CRISPR (например, доменов C2c1 и C2c3) в конформационные состояния, которые приводят к расщеплению в участках-мишенях и снижение вероятности этих конформационных состояний в участках, не являющихся мишенями. Расщепление ДНК-мишени ферментом CRISPR происходит в виде серии последовательных скоординированных стадий. Вначале PAM-связывающий домен узнает последовательность PAM с 5'-стороны от ДНК-мишени. После связывания с PAM первые 10-12 нуклеотидов последовательности-мишени (последовательность-затравка) проверяются на комплементарность комплекса направляющей РНК (гРНК) с ДНК, и этот процесс зависит от разделения цепей ДНК. Если нуклеотиды затравочной последовательности комплементарны гРНК, оставшаяся ДНК оказывается неспаренной и гРНК гибридизуется с цепью ДНК-мишени по всей длине. Бороздки, не являющиеся мишенью, могут стабилизировать цепь ДНК-мишени и способствовать расплетанию за счет неспецифических взаимодействий с положительно заряженным фосфатным остовом ДНК. Взаимодействия РНК с комплементарной ДНК и фермента CRISPR с некомплементарной ДНК способствуют тому, что ДНК расплетается, конкурируя с обратной гибридизацией комплементарной и некомплементарной цепей ДНК. Другие домены ферментов CRISPR также могут влиять на конформацию нуклеазных доменов, например, линкеры, соединяющие различные домены. Соответственно, приведенные методы и мутации затрагивают без ограничений RuvCI, RuvCIll, RuvCIII, а также линкеры. Конформационные изменения, например, C2c1 или C2c3, обусловленные связыванием с ДНК-мишенью, включая связывание с последовательностью-затравкой и взаимодействия с цепями ДНК, являющимися и не являющимися мишенью, определяют, будут ли домены расположены так, чтобы инициировать нуклеазную активность. Таким образом, приведенные в настоящем описании способы и мутации демонстрируют и обеспечивают возможность модификаций, выходящих за пределы узнавания PAM и спаривания оснований РНК и ДНК.

[00316] В одном из аспектов изобретение относится к нуклеазам CRISPR, как определено в настоящем описании, например, C2c1 или C2c3, обладающим улучшенным равновесием, смещенным в сторону образования конформаций, стимулирующих расщепление при целевых взаимодействиях, и/или равновесием, смещенным в сторону снижения вероятности образования конформаций, связанных с расщеплением при нецелевых взаимодействиях. В одном аспекте изобретение относится к нуклеазе Cas (например, C2c1 или C2c3) с улучшенной редактирующей активностью, т.е. нуклеазе Cas (например, C2c1 и C2c3), которая принимают конформацию, способствующую нуклеазной активности при нахождении на участке-мишени и снижающую ее вероятность при нахождении на участке, не являющемся мишенью. Авторы статьи (Sternberg et al., Nature 327(7576): 110-3, doi: 10.1038/naturel3344, опубликованной через интернет 28 октября 2013 года. Epub 2013 Oct 28) использовали способ FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии), чтобы определить относительную ориентацию каталитических доменов Cas9 при ассоциации с ДНК, являющейся и не являющейся мишенью, и эти эксперименты могут быть экстраполированы на ферменты CRISPR по настоящему изобретению (например, C2c1 или C2c3).

[00317] Настоящее изобретение относится к способам и мутациям для модулирования нуклеазной активности и/или специфичности с использованием модифицированных направляющих РНК. Как описано, нецелевая нуклеазная активность может быть повышена или снижена. Кроме того, можно повышать или снижать специфичность - соотношение целевой активности к нецелевой. Модифицированные направляющие РНК включают, но не ограничиваются ими, укороченные направляющие РНК, нефункциональные направляющие РНК, химически модифицированные направляющие РНК, соединенные с функциональными доменами направляющие РНК, модифицированные направляющие РНК, содержащие функциональные домены, содержащие аптамеры направляющие РНК, содержащие адаптерные белки направляющие РНК, направляющие РНК, содержащие добавленные или модифицированные петли. В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов ассоциирован с мертвыми направляющими РНК (dРНК). В некоторых вариантах осуществления комплекс dРНК с ферментом CRISPR осуществляет регуляцию генов с помощью функционального домена в пределах генного локуса, в то время как направляющая РНК направляет расщепление ДНК ферментом CRISPR в другом локусе. В некоторых вариантах осуществления dРНК выбирают для максимизации селективности регуляции представляющего интерес генного локуса по сравнению с нецелевой регуляцией. В некоторых вариантах осуществления dРНК выбираются так, чтобы максимально повысить уровень регуляции генов и минимизировать расщепление ДНК-мишени.

[00318] С целью дальнейшего обсуждения, указание на функциональный домен означает в настоящем описании функциональный домен, связанный с ферментом CRISPR, или функциональный домен, связанный с адаптерным белком.

[00319] При применении настоящего изобретения на практике, петли гРНК могут быть удлинены без взаимодействия с белком Cas9 (например, C2c1 или C2c3) за счет вставки отдельной петли(петель) РНК или отдельной последовательности(ей), которые могут привлекать адаптерные белки, способные связываться с отдельной петлей(петлями) РНК или отдельной последовательностю(ями). Адаптерные белки могут включать, но не ограничиваются ими, комбинации ортогональные РНК-связывающие белки/аптамеры, которые существуют в многообразии белков оболочки бактериофагов. Список таких белков оболочки бактериофагов включает, но не ограничивается ими, следующие: Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, М11, MX1, TW18, VK, SP, F1, ID2, NL95, TW19, AP205, ϕСb5, ϕСb8г, ϕСb12r, ϕСb2Зr, 7s и PRR1. Адаптерные белки или ортогональные РНК-связывающие белки могут дальше привлекать эффекторные белки или слитые белки, которые состоят из одного или более функциональных доменов. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен может быть выбран из группы, включающий: транспозазный домен, интегразный домен, рекомбиназный домен, резольвазный домен, инвертазный домен, протеазный домен, ДНК-метилтрансферазный домен, домен ДНК-гидроксиметилазы, домен ДНК-деметилазы, гистонацетилазный домен, домен гистоновой деацетилазы, нуклеазный домена, репрессорный домен, активационный домен, домен, содержащий сигнал ядерной локализации, домен белков, осуществляющих транскрипционную регуляцию или рекрутирующих транскрипционный комплекс, домен, ассоциированный с поглощением веществ клеткой, домен, связывающий нуклеиновые кислоты, антигенпрезентирующий домен, гистон-модифицирующий домен, привлекающий модифицирующие гистоны белки: ингибитор гистонмодифицирующих ферментов, гистоновую метилтрансферазу, гистоновую деметилазу, гистоновую киназу, гистоновую фосфатазу, гистоновую рибозилазу, гистоновую дерибозилазу, гистоновую убиквитиназу, гистоновую деубиквитиназу, гистоновую биотиназу, протеазу гистоновых хвостов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления функциональный домен может являться трансактивационным доменом, таким как, но не ограничиваясь ими, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9 или гистонацетилтрансферазный домен. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен может представлять собой транскрипционно репрессорным доменом, предпочтительно KRAB. В некоторых вариантах осуществления транскрипционно репрессорным доменом могут являться SID или конкатемеры SID (например SID4X). В некоторых вариантах осуществления функциональным доменом может являться домен, осуществляющий эпигенетические модификации, так что предусматривается фермент, осуществляющий эпигенетические модификации. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен может быть активационным доменом, который может являться активационным доменом P65. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен может быть деаминазой, такой как цитидиндеаминаза. Цитидиндеаминаза может быть направлена на нуклеиновую кислотe-мишень, где она осуществляет преобразование цитидина в уридин, что приводит к замене C (цитозина) на Т (тимин) (и G (гуанина) на А (аденин) в комплементарной цепи). В таком варианте осуществления нуклеотидная замена может быть осуществлена без расщепления ДНК.

[00320] В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способам и мутациям для модулирования связывающей активности (например, C2c1 или C2c3) и/или специфичности связывания Cas. В некоторых вариантах осуществления используются белки Cas (например, C2c1 или C2c3), у которых отсутствует нуклеазная активность и/или специфичность связывания. В некоторых вариантах осуществления используются модифицированные направляющие РНК, которые способствуют связыванию, но не стимулируют нуклеазную активность нуклеазы Cas (например, C2c1 или C2c3). В некоторых вариантах осуществления уровень целевого связывания может быть повышен или снижен. Также в некоторых вариантах осуществления уровень нецелевого связывания может быть повышен или снижен. Более того, может быть повышенная или сниженная специфичность, определяемая отношением целевого связывания к нецелевому.

[00321] В некоторых вариантах осуществления снижение уровня нецелевого расщепления обеспечивается дестабилизацией разделения цепей, в частности, внесением мутаций в ферменты C2c1 или C2c3, снижающих положительный заряд в областях, взаимодействущих с ДНК (как описано здесь и далее на примере Cas9 в статье Slaymaker et al. 2016 (Science, 1;351(6268):84-8). В дальнейших вариантах осуществления снижение нецелевого расщепления обеспечивается внесением мутаций в ферменты C2c1 или C2c3, которые влияют на взаимодействие между цепью-мишенью и последовательностью направляющей РНК, в частности, разрушая взаимодействие между C2c1 или C2c3 с фосфатным остовом цепи ДНК-мишени таким образом, чтобы оставалась целевая специфичная активность, но снижалась нецелевая активность (как описано для Cas9 в статье Kleinstiver et al. 2016, Nature, 28;529(7587):490-5). В некоторых вариантах осуществления изобретения нецелевая активность снижена за счет модификации C2c1 (или модифицикации C2c3), при этом изменяется взаимодействие как цепи-мишени, так и цепи, не являющейся мишенью, по сравнению с C2c1 дикого типа (или C2c3 дикого типа).

[00322] Способы и мутации, которые могут быть использованы в различных комбинациях, чтобы повысить или снизить активность и/или специфичность целевой активности по отношению к нецелевой, или повысить или снизить связывание и/или специфичность целевого связывания по отношению к нецелевому, могут быть использованы для компенсации или усиления эффекта мутаций или модификаций, внесенных для усиления других эффектов. Такие мутации или модификации, внесенные для усиления других эффектов, включают мутации и модификации Cas (например, C2c1 или C2c3) и/или мутации или модификации, внесенные в направляющие РНК. В определенных вариантах осуществления способы и мутации используются в отношении химически модифицированной направляющей РНК. Примеры химических модификаций направляющей РНК включают, но не ограничиваются ими, включение 2'-O-метила (M), 2'-O-метил-3'-фосфоротиоата (MIS) или 2'-O-метил-3'-тио-PACE (MSP) в один или более концевых нуклеотидов. Такие химически модифицированные направляющие РНК могут быть более стабильными и активными по сравнению с немодифицированными направляющими РНК, хотя соотношение целевой и нецелевой специфичности предсказать нельзя. (См. Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nfot.3290., опубликованную через интернет 29 июня 2015 года). Химически модифицированные направляющие РНК включают, но не ограничиваются ими, РНК с фосфоротиоатными связями и нуклеотиды закрытых нуклеиновых кислот (LNA), содержащие метиленовый мостик между 2'-4'-атомами углерода рибозного кольца. Способы и мутации согласно изобретению используются для модуляции активности нуклеазы (например, C2c1 или C2c3) Cas (или C2c3) и или связывания с химически модифицированными направляющими РНК.

[00323] В одном аспекте изобретение относится к способам и мутациям для модулирования связывания и/или специфичности связывания белков Cas (например, C2c1 или C2c3) по изобретению, как определено в настоящем описании, включая функциональные домены, такие как нуклеазы, активаторы транскрипции, репрессоры транскрипции и т.п. Например, белок Cas (например, C2c1 или C2c3) может быть создан так, чтобы у него отсутствовала нуклеазная активность или нуклеазная активность была изменена или снижена за счет внесения мутаций, таких как мутации C2c1 или C2c3. Белки Cas (например, C2c1 или C2c3) без нуклеазной активности могут быть полезны для доставки функциональных доменов, направляемой РНК и специфической для последовательности ДНК. Изобретение относится к способам и мутациям для модулирования связывания белков Cas (например, C2c1 или C2c3). В одном из вариантов осуществления функциональный домен содержит VP64, обеспечивая направляемый РНК фактор транскрипции. В другом варианте осуществления функциональный домен содержит FokI, что обеспечивает опосредованную РНК нуклеазную активность. Это упомянуто в публикации патента США 2014/0356959, публикации патента США 2014/0342456, публикации патента США 2015/0031132 и Mali, P. et al., 2013, Science 339(6121):823-6, doi: 10.1126/science. 1.232033, опубликованной через интернет 3 января 2013 года, и за счет изложенных в настоящем описании идей изобретение охватывает способы и материалы этих документов, применяемых в привязке к изложенным в настоящем описании идеям. В некоторых вариантах осуществления целевое связывание увеличено. В некоторых вариантах осуществления нецелевое связывание уменьшено. В некоторых вариантах осуществления уровень целевого связывания снижен. В некоторых вариантах осуществления уровень нецелевого связывания повышен. Соответственно, изобретение также обеспечивает увеличение или снижение специфичности целевого связывания по отношению к нецелевому у функционализованных Cas-связывающих белков (например, C2c1 или C2c3).

[00324] Использование Cas (например, C2c1 или C2c3) в качестве направляемого РНК связывающего белка не ограничивается использованием Cas (например, C2c1 или C2c3) без нуклеазной активности. Ферменты Cas (например, C2c1 или C2c3) с присутствующей нуклеазной активностью могут также функционировать как направляемые РНК связывающие белки при использовании с конкретными направляющими РНК. Например, короткие направляющие РНК и направляющие РНК, содержащие нуклеотиды, не соответствующие мишени, могут стимулировать направляемое РНК связывание Cas (например, C2c1 или C2c3) с последовательностью-мишенью при низком уровне расщепления или в его отсутствие (см., например, Dahlman, 2015, Nat Biotechnol. 33(11):1159-1161, doi: 10,1038/nbt.3390, опубликовано через интернет 05 октября 2015). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам и мутациям для модулирования связывания белков Cas (например, C2c1 или C2c3), обладающих нуклеазной активностью. В некоторых вариантах осуществления уровень целевого связывания повышен. В некоторых вариантах осуществления уровень нецелевого связывания снижен. В некоторых вариантах осуществления уровень целевого связывания снижен. В некоторых вариантах осуществления уровень нецелевого связывания повышен. В некоторых вариантах осуществления увеличена или уменьшена специфичность целевого связывания по отношению к нецелевому связыванию. В некоторых вариантах осуществления нуклеазная активность фермента, включающего направляющую РНК и Cas (например, C2c1 или C2c3), также модулируется.

[00325] Образование гетеродуплекса РНК-ДНК важно для наличия активности и специфичности расщепления по всей области-мишени, а не только области затравочной последовательности, наиболее близкой по расположению к PAM. Таким образом, у укороченных направляющих РНК снижен уровень активности и уровень специфичности расщепления. В одном аспекте изобретение относится к способу и мутациям для увеличения активности и специфичности расщепления с использованием измененных направляющих РНК.

[00326] Изобретение также демонстрирует, что модификации нуклеазной специфичности Cas (например, C2c1 или C2c3) могут быть осуществлены одновременно с изменениями области-мишени. Мутанты Cas (например, C2c1 или C2c3) могут быть созданы так, чтобы они обладали как увеличенной целевой специфичностью, так и адаптивными изменениями в узнавании PAM, например, при выборе мутаций, которые изменяют специфичность PAM и комбинировании этих мутаций с мутациями бороздки, не являющей мишенью, которые могут увеличивать (или, при желании, снижать) специфичность к последовательностям-мишеням по отношению к не являющимся мишенями последовательностям. В одном таком варианте осуществления остаток PI-домена мутирован так, чтобы улучшить узнавание представляющей интерес последовательности PAM, в то время как одна или более аминокислот бороздки, не являющейся мишенью, мутированы так, чтобы изменить целевую специфичность. Способы и модификации Cas (например, C2c1 или C2c3), описанные в настоящем описании, могут быть использованы для того, чтобы предотвратить потерю специфичности, возникающую при изменении узнавания PAM, повысить увеличенный уровень специфичности, возникающий при изменении узнавания PAM, предотвратить увеличение уровня специфичности, возникающее при изменении узнавания PAM, или способствовать потере специфичности, возникающей при изменении узнавания PAM.

[00327] Эти способы и мутации могут быть использованы для любых ферментов Cas (например, C2c1 или C2c3) с измененным узнаванием PAM. Неограничивающие примеры включенных PAM являются такими, как описано в настоящем описании.

[00328] В следующих вариантах осуществления изобретения в способах и мутациях используются модифицированные белки.

[00329] В случае любого из не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент CRISPR может содержать один или более гетерологичных функциональных доменов.

[00330] Один или более гетерологичных функциональных доменов могут включать один или более доменов с сигналом ядерной локализации (NLS). Один или более гетерологичных функциональных доменов могут включать по меньшей мере два или более NLS.

[00331] Один или более гетерологичных функциональных доменов могут включать один или более трансактивационных доменов. Трансактивационным доменом может являться VP64.

[00332] Один или более гетерологичных функциональных доменов могут содержать один или доменов репрессии транскрипции. Домен репрессии транскрипции может включать домен KRAB или домен SID.

[00333] Один или более гетерологичных функциональных доменов могут включать один или более нуклеазных доменов. Одним или более нуклеазными доменами могут являться FokI.

[00334] Один или более гетерологичных функциональных доменов могут обладать только одной или более из следующих функций: метилазная активность, деметилазная активность, трансактивационная активность, активность репрессии транскрипции, активность в отношении высвобождения транскрипционных факторов, активностью модификации гистонов, нуклеазной активностью, активностью расщепления одноцепочечной РНК, активностью расщепления двуцепочечной РНК, активностью расщепления одноцепочечной ДНК, активностью расщепления двуцепочечной ДНК и активностью связывания нуклеиновых кислот.

[00335] По меньшей мере один или более гетерологичных функциональных доменов могут находиться рядом или на N-конце фермента и/или рядом или на С-конце фермента.

[00336] Один или более гетерологичных функциональных доменов могут быть слиты с ферментом CRISPR или связаны с ферментом CRISPR или соединены с ферментом CRISPR через линкерную часть.

[00337] В любом из не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент CRISPR может включать фермент CRISPR из организмов рода, такого как: Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Desulfatirhabdium, Citrobacter и Methylobacterium.

[00338] В случае любого из не встречающихся в природе ферментов CRISPR фермент CRISPR может включать химерный фермент Cas (например, C2c1 или C2c3), содержащий первый фрагмент первого ортолога Cas (например, C2c1 или C2c3) и второй фрагмент второго ортолога Cas (например, C2c1 или C2c3), причем первый и второй ортологи Cas (например, C2c1 или C2c3) различаются. По меньшей мере один из ортологов (первый и/или второй) Cas (например, C2c1 или C2c3) могут представлять собой Cas (например, C2c1 или C2c3) таких видов как: Alicyclobacillus acidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacillus contaminans (например, DSM 17975), Desulfovihrio inopinatus (например, DSM 10711), Desulfonatronum thiodismutans (например, штамм MLF-1), бактерии Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (например, DSM 17572), Bacillus thermoamylovorans (например, штамм B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (например, DSM 18734), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM 13609), Citrobacter freundii (например, ATCC 8090), Brevibacillus agri (например, BAB-2500) и Methylobacterium nodulans (например, ORS 2060).

[00339] В любом из не встречающихся в природе ферментов CRISPR нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, может быть кодон-оптимизированной для экспрессии в эукариотах.

[00340] В любом из не встречающихся в природе ферментов CRISPR клетка может быть эукариотической клеткой или прокариотической клеткой, причем комплекс CRISPR функционален в клетке, и при этом фермент комплекса CRISPR обладает сниженной способностью к модификации одного или более локусов клетки, не являющихся мишенью, по сравнению с немодифицированным ферментом, и/или фермент в комплексе CRISPR обладает повышенной способностью к модификации одного или более локусов клетки, не являющихся мишенью, по сравнению с немодифицированным ферментом.

[00341] Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к эукариотической клетке, содержащей искусственный белок или систему CRISPR, как определено в настоящем описании.

[00342] В определенных вариантах осуществления изобретения способы, как описано в настоящем описании, могут включать доставку Cas (например, C2c1 или C2c3) в трансгенную клетку, в которой одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более молекул направляющих РНК, доставленных или непосредственно введенных, связаны в клетке с регуляторным элементом, содержащим промотор одного или более генов-мишеней. Термин "трансгенная по Cas клетка", как используют в настоящем описании, относится к клетке, в частности, эукариотической клетке, в геном которой встроен ген Cas. Природа, тип или происхождение такой клетки не ограничивается особым образом, согласно данному изобретению. Также способ введения трансгена Cas в клетку может различаться и являться любым из способов, доступных в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения трансгенная клетка Cas получена путем введения трансгена Cas в выделенную клетку. В некоторых других вариантах осуществления изобретения трансгенная клетка Cas может быть получена путем выделения клеток из трансгенного организма Cas. В качестве не ограничивающего примера, трансгенная клетка Cas, как используют в настоящем описании, может быть получена из трансгенного по Cas эукариотического организма, такого как эукориотический организм с встроенным Cas. См. WO 2014/093622 (PCT/US13/74667), включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Способы публикации патентов США № 20120017290 и 20110265198, закрепленных за Sangamo BioSciences, Inc., направленные на нацеливание на локус Rosa, могут быть изменены для использования системы CRISPR Cas данного изобретения. Способы публикации патента США № 20130236946, закрепленных за Cellectis, направленные на нацеливание на локус Rosa, могут также быть изменены для использования системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. В качестве следующего примера приводится ссылка на статью Platt et. al. (Cell; 159(2):440-455 (2014)) с описанием мыши со вставкой Cas9 мыши, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки и которая может быть экстраполирована на охарактеризованные в настоящем описании ферменты CRISPR по настоящему изобретению. Трансген Cas, кроме того, может включать кассету Lox-Stop-polyA-Lox(LSL), что делает экспрессию Cas управляемой с помощью рекомбиназы Cre. Альтернативно, клетка с трансгенным Cas может быть получена путем введения трансгена Cas в выделенную клетку. Системы доставки трансгенов хорошо известны в данной области. Примером может служить доставка трансгена Cas, напримр, в эукариотическую клетку посредством вектора (например, AAV, аденовируса, лентивируса) и/или частицы и/или наночастицы, как также описано в другой части настоящего описания.

[00343] Для квалифицированного специалиста будет понятно, что клетка, такая как трансгенная по Cas клетка в используемом в настоящем описании значении, может содержать дальнейшие изменения генома помимо наличия встроенного гена Cas или мутаций, являющихся результатом последовательность-специфического действия Cas, в комплексе с РНК, способной направлять Cas к локусу-мишени, например, такие как одна или более онкогенных мутаций, как в качестве неограничивающего примера описано в Platt et al. (2014), Chen et al., (2014), или Kumar et al. (2009).

[00344] Также изобретение относится к композиции, содержащей сконструированный способами инженерии белок CRISPR, описанный в настоящем описании, как описано в данном разделе.

[00345] Изобретение также относится к не встречающейся в природе сконструированной способами инженерии композиции, содержащей комплекс CRISPR-Cas, содержащий любой из не встречающихся в природе ферментов CRISPR, описанных выше.

[00346] В одном из аспектов изобретение относится к векторной системе, включающей один или более векторов, причем один или более векторов содержат:

а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с одной или более нуклеотидными последовательностями, кодирующими сконструированный способам инженерии белок CRISPR, как определено в настоящем описании, и необязательно

b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с одной или более нуклеотидными последовательностями, кодирующими одну или более нуклеиновых кислот, включая направляющую РНК, содержащую направляющую последовательность, последовательность прямого повтора, и необязательно где компоненты (а) и (b) расположены в одном векторе или разных векторах.

[00347] Изобретение также относится к не встречающейся в природе композиции, включающей:

систему доставки, функционально оптимизированную для доставки в клетку компонентов комплекса CRISPR-Cas или одной или более полинуклеотидных последовательности, содержащих или кодирующих указанные компоненты, при этом указанный комплекс CRISPR-Cas должен быть функционален внутри клетки.

компоненты комплекса CRISPR-Cas или одна или более полинуклеотидных последовательностей, кодирующих для транскрипции и/или трансляции в клетке компоненты комплекса CRISPR-Cas, включающие:

не встречающиеся в природе ферменты CRISPR (например, сконструированные способами инженерии C2c1 или C2c3), описанные в настоящем описании;

направляющую РНК CRISPR-Cas, содержащую направляющую последовательность, последовательность прямого повтора, при этом фермент в комплексе CRISPR обладает сниженной способностью модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенью, по сравнению с немодифицированным ферментом, и/или фермент в комплексе CRISPR обладает увеличенной способностью модифицировать один или более локусов-мишеней, по сравнению с немодифицированным ферментом.

[00348] В одном аспекте изобретение также относится к системе, содержащей указанный сконструированный способами инженерии белок CRISPR, такой как описан в этом разделе.

[00349] В любой из таких композиций система доставки может включать: дрожжевую систему, систему липофекции, систему микроинъекций, генную пушку, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, поликатионы, конъюгаты нуклеиновых кислот с липидами или искусственные вирионы, охарактеризованные в настоящем описании и в других источниках.

[00350] В любой из таких композиций система доставки может включать векторную систему, содержащую один или более векторов, причем компонент (II) содержит первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, которая содержит направляющую последовательность и последовательность прямого повтора, и необязательно компонент (I) содержит второй регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующий фермент CRISPR.

[00351] В любой из таких композиций система доставки может включать векторную систему, содержащую один или более векторов, причем компонент (II) содержит первый регуляторный элемент, функционально связанный с последовательностью и последовательностью прямого повтора, а компонент (I) содержит второй регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующий фермент CRISPR.

[00352] В любой из таких композиций, композиция может включать более одной направляющей РНК, и каждая направляющая РНК имеет отличающуюся мишень, обеспечивая мультиплексный подход.

[00353] В любой из таких композиций полинуклеотидная последовательность(и) может находиться на одном векторе.

[00354] Изобретение также относится к не встречающейся в природе векторной системе коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами CRISPR-Cas ((CRISPR-CRISPR-ассоциированный белок (Cas) (CRISPR-Cas)), включающей один или более векторов, которые содержат:

а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей не встречающийся в природе фермент CRISPR любой из конструкций по изобретению, описанных в настоящем описании;

b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей одну или более направляющих РНК, и эта направляющая РНК содержит направляющую последовательность, последовательность прямого повтора, где: компоненты (а) и (b) расположены в одном или разных векторах, образуется комплекс CRISPR, направляющие РНК нацелены на полинуклеотидные локусы-мишени, и фермент действует в отношении полинуклеотидных локусов-мишеней, и фермент в комплексе CRISPR обладает сниженной способностью модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенью, по сравнению с немодифицированным ферментом, и/или этот фермент в комплексе CRISPR обладает повышенной способностью модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом.

[00355] В такой системе компонент (II) может содержать первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, которая содержит направляющую последовательность, последовательность прямого повтора, и где компонент (II) может содержать второй регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей фермент CRISPR. В такой системе, когда это возможно, направляющая РНК может включать химерную РНК.

[00356] В такой системе компонент (I) может содержать первый регуляторный элемент, функционально связанный с направляющей последовательностью и последовательностью прямого повтора, тогда как компонент (II) может содержать второй регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей не встречающийся в природе фермент CRISPR. Такая система может включать более одной направляющей РНК и каждая направляющая РНК может нацеливать на различные мишени, таким образом обеспечивая мультиплексный подход. Компоненты (a) и (b) могут быть расположены на одном и том же векторе.

[00357] В любой из таких систем, включающих векторы, один или более векторов могут содержать один или более вирусных векторов, таких как ретровирусный, лентивирусный, аденовирусный, аденоассоциированный вирус или вирус простого герпеса.

[00358] В любой из таких систем, содержащих регуляторные элементы, по меньшей мере один из указанных регуляторных элементов может содержать тканеспецифический промотор. Тканеспецифический промотор может направлять экспрессию в клетке крови млекопитающего, клетке печени млекопитающего или глаза млекопитающего.

[00359] В любой из описанных выше смесей или систем последовательность прямого повтора может содержать один или более связывающих белки РНК-аптамеров. Один или более аптамеров могут находиться в тетрапетле. Один или более аптамеров могут обладать способностью связывать белок оболочки бактериофага MS2.

[00360] В любых из описанных выше составов или систем клетка может являться эукариотической клеткой или прокариотической клеткой: где комплекс CRISPR функционален в клетке и фермент комплекса CRISPR обладает сниженной способностью модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенями, по сравнению с немодифицированным ферментом, и/или этот фермент в комплексе CRISPR обладает увеличенной способностью модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом.

[00361] Изобретение также относится к комплексу CRISPR любой из описанных выше композиций или любой из описанных выше систем.

[00362] Изобретение также относится к способу модификации представляющего интерес локуса в клетке, включающему приведение в контакт клетки с любым из описанных в настоящем описании сконструированных способами инженерии ферментов CRISPR (например, сконструированные способами инженерии C2c1 или C2c3), композициями или любыми описанными в настоящем описании системами или векторными системами, либо клетка содержит любой из описанных в настоящем описании комплексов CRISPR. В случае таких методов клетка может являться эукариотической клеткой или прокариотической клеткой. В случае таких способов клетка может представлять собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку, предпочтительно эукариотическую клетку. В таких способах организм может содержать клетку. В таких способах организм может не быть человеком или другим животным.

[00363] Любой из таких способов может быть реализован ex vivo или in vitro.

[00364] В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одно из упомянутой направляющей РНК или белка Cas, функционально связана в клетке с регуляторным элементом, содержащим промотор представляющего интерес гена, причем экспрессия по меньшей мере одного компонента системы CRISPR-Cas индуцируется промотором представляющего интерес гена. "Функционально связанный" означает, что нуклеотидная последовательность, кодирующая направляющую РНК и/или белок Cas, связана с регуляторным элементом(ами) таким образом, что происходит экспрессия нуклеотидной последовательности, как также упоминается в настоящем описании. Термин "регуляторный элемент" также описан в настоящем описании. Согласно изобретению, регуляторный элемент содержит промотор представляющего интерес гена, предпочтительно такой как промотор эндогенного представляющего интерес гена. В некоторых вариантах осуществления промотор находится в его эндогенном геномном положении. В таких вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая CRISPR и/или Cas, находится в условиях транскрипционной регуляции промотором представляющего интерес гена в его природном геномном положении. В других конкретных вариантах осуществления промотор предоставляется на (отдельной) молекуле нуклеиновой кислоты, такой как вектор или плазмида, или другой внехромосомной нуклеиновой кислоте, т.е. промотор не присутствует в его природном геномном положении. В некоторых вариантах осуществления промотор интегрирован в геном не в его природном геномном положении.

[00365] В любом из подобных способов, указанные модификации включают модулирование экспрессии генов. Упомянутое модулирование экспрессии генов может включать активацию экспрессии генов и/или репрессию экспрессии генов. Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к способу модулирования экспрессии генов, где способ включает введение в клетку сконструированного способами инженерии белка или системы CRISPR, как описано в настоящем описании.

[00366] Также изобретение относится к способу лечения заболевания, расстройства или инфекции в индивидуума, нуждающемуся в этом, включающему введение эффективного количества любого из сконструированных способами инженерии ферментов CRISPR (например, C2c1 или C2c3), композиций, систем или комплексов CRISPR, описываемых в настоящем описании. Заболевания, расстройства или инфекции могут включать вирусную инфекцию. Вирусная инфекция может являться вирусом гепатита В (HBV).

[00367] Изобретение также относится к использованию одного из сконструированных способами инженерии ферментов CRISPR (например, C2c1 или C2c3), композиций, систем или комплексов CRISPR, описанных выше, для генной или геномной инженерии.

[00368] Изобретение также относится к способу изменения экспрессии представляющего интерес геномного локуса в клетке млекопитающего, включая взаимодействие клетки со сконструированными способами инженерии ферментами CRISPR (например, C2c1 или C2c3), смесями, системами или комплексами CRISPR, описанными в настоящем описании, и тем самым доставку CRISPR-Cas (вектор) и обеспечения возможности образоваться комплексу CRISPR-Cas и связаться с мишенью, и определение, изменяется ли экспрессия изменяемого геномного локуса, например, происходит ли увеличение или снижение экспрессии или модификация продукта гена.

[00369] Изобретение также относится к любому сконструированному способами инженерии ферменту CRISPR (например, C2c1 или C2c3), композиции, системе или комплексу CRISPR, описанным выше, для терапевтического применения. Терапевтическое применение может быть предназначено для редактирования гена или генома или для генной терапии.

[00370] В некоторых вариантах осуществления активность искусственных ферментов CRISPR (например, C2c1 или C2c3), описанных в настоящем описании, включает расщепление геномной ДНК, необязательно приводящее к снижению транскрипции гена.

[00371] В одном аспекте изобретение относится к выделенной клетке с измененной экспрессией генного локуса способом, описанным в настоящем описании, где экспрессия изменяется по сравнению с клеткой, не подвергнутой изменению экспрессии генного локуса этим способом. В родственном аспекте изобретение относится к клеточной линии, полученной из такой клетки.

[00372] В одном аспекте изобретение относится к способу модификации организма или не являющегося человеком организма путем манипуляции с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе, например, гемопоэтической стволовой клетки (HSC), в частности, в которой представляющий интерес геномный локус ассоциирован с мутацией, связанной с аберрантной экспрессией белка или с заболеванием или состоянием, включающему:

доставку в HSC, например, за счет приведения HSC в контакт с частицей, содержащей не встречающуюся в природе композицию, включающую в себя:

полинуклеотидную последовательность направляющей РНК системы CRISPR-Cas, содержащую:

а) направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в HSC;

б) прямой повтор; и

фермент CRISPR, необязательно содержащий по меньшей мере одну или более последовательностей ядерной локализации;

где направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью, и

где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR в комплексе с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью, и

указанный способ необязательно может включать доставку матрицы для HDR, например, посредством частицы, контактирующей с HSC, содержащей матрицу для HDR, или посредством контакта HSC с другой частицей, содержащей матрицу HDR, причем матрица для HDR обеспечивает экспрессию нормальной или менее аберрантной формы белка; где "нормальная форма" представляет собой белок дикого типа и "аберрантная форма" представляет собой белок, вызывающий развитие заболевания или состояния, и

необязательно способ может включать выделение или получение HSC из организма или не являющегося человеком организма, необязательно увеличение популяции HSC, приведения частиц(ы) в контакт с HSC для получения популяции модифицированных HSC, необязательно увеличение популяции модифицированных HSC и необязательно введение модифицированных HSC в организм или не являющийся человеком организм.

[00373] Одним из аспектов изобретения является способ модификации организма или не являющегося человеком организма путем манипуляции с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе и, в частности, в HSC, например, в случае, когда представляющий интерес геномный локус ассоциирован с мутацией, связанной с аберрантной экспрессией белка или заболеванием или состоянием, включая доставку к HSC, в частности, путем связывания с HSC частиц, содержащих не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию, которая содержит:

I.(а) направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в HSC, и

(b) по меньшей мере один или более прямых повторов, и

II. фермент CRISPR, необязательно содержащий один или более NLS, причем направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR, включающего фермент CRISPR в комплексе с направляющей последовательностью, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью, и

указанный способ необязательно может включать доставку матрицы для HDR, например, посредством частицы, контактирующей с HSC, содержащей матрицу для HDR, или посредством контакта HSC с другой частицей, содержащей матрицу HDR, причем матрица для HDR обеспечивает экспрессию нормальной или менее аберрантной формы белка; где "нормальная форма" представляет собой белок дикого типа и "аберрантная форма" представляет собой белок, вызывающий развитие заболевания или состояния, и

необязательно способ может включать выделение или получение HSC из организма или не являющегося человеком организма, необязательно увеличение популяции HSC, приведения частиц(ы) в контакт с HSC для получения популяции модифицированных HSC, необязательно увеличение популяции модифицированных HSC и необязательно введение модифицированных HSC в организм или не являющийся человеком организм.

[00374] Доставляться может один или более полинуклеотидов, кодирующих любой один или более или все из комплексов CRISPR, предпочтительно связанных с одним или более регуляторными элементами для экспрессии in vivo, например, посредством частиц, содержащих вектор, содержащий полинуклеотид(ы), функционально связанный с регуляторным элементом(и). Любая из этих полинуклеотидных последовательностей, кодирующая фермент CRISPR, направляющую последовательность, прямой повтор, может представлять собой РНК. Понятно, что если упомянут полинуклеотид, являющийся РНК, про который указано, что он включает признак, такой как прямой повтор, то РНК также включает этот признак. Если полинуклеотид представляет собой ДНК и про него указано, что он включает признак, такой как последовательность прямого повтора, то последовательность ДНК транскрибируется или может быть транскрибирована в РНК, включающую этот признак, о которой идет речь. Когда признак представляет собой белок, такой как фермент CRISPR, упоминаемая последовательность ДНК или РНК является или может быть транслированной (и в случае ДНК - сначала транскрибированной)

[00375] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу модификации организма, в частности, млекопитающего, включая млекопитающее или организм, являющиеся или не являющиеся человеком, с помощью манипуляции с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе и, в частности, в HSC, например, в случае, когда представляющий интерес геномный локус ассоциирован с мутацией, связанной с аберрантной экспрессией белка или заболеванием или состоянием, включая доставку в HSC, в частности, путем приведения HSC в контакт с не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая содержит одну или более частиц, содержащих вирусный вектор (вирусные векторы), плазмидный вектор (плазмидные векторы) или вектор(ы) с молекулой нуклеиновой кислоты (например, РНК), функционально кодирующие указанную композицию, для ее экспрессии, при этом композиция включает:

(А) I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью РНК системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит

(а) направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в эукариотической клетке,

(b) последовательность прямого повтора, и

II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере один или более сигналов ядерной локализации (или необязательно по меньшей мере один или более сигналов ядерной локализации (NLS), поскольку некоторые варианты осуществления могут не включать NLS)

причем (а), (b) и (в) расположены в ориентации от 5' к 3'-концу, причем компоненты I и II расположены на одной или разных векторах системах, при этом транскрибированная направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью, причем комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR в комплексе с направляющей РНК, гибридизованной с последовательностью-мишенью, или

(B) не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию, содержащую векторную систему, включающую один или более векторов, содержащих:

I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с

(а) направляющей последовательностью, способной гибридизоваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке,

(b) по меньшей мере одну или более последовательностей прямого повтора, и

II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей CRISPR-фермент, и необязательно, если применимо,

где компоненты I и II расположены на одном или разных векторах системы, при этом транскрибированная направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью, причем комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR в комплексе с направляющей последовательностью, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью; способ необязательно может включать доставку матрицы для HDR, например, посредством частицы, контактирующей с HSC, содержащей матрицу для HDR, или посредством контакта HSC с другой частицей, содержащей матрицу HDR, причем матрица для HDR обеспечивает экспрессию нормальной или менее аберрантной формы белка; где "нормальная форма" представляет собой белок дикого типа и "аберрантная форма" представляет собой белок, вызывающий развитие заболевания или состояния, и необязательно способ может включать выделение или получение HSC из организма или не являющегося человеком организма, необязательно увеличение популяции HSC, приведения частиц(ы) в контакт с HSC для получения популяции модифицированных HSC, необязательно увеличение популяции модифицированных HSC и необязательно введение модифицированных HSC в организм или не являющийся человеком организм. В некоторых вариантах осуществления компоненты I, II и III расположены на одном векторе. В некоторых вариантах осуществления компоненты I и II расположены на одном векторе, в то время как компонент III расположен на другом векторе. В некоторых вариантах осуществления компоненты I и III расположены на одном векторе, в то время как компонент II расположен на другом векторе. В некоторых вариантах осуществления компоненты II и III расположены на одном векторе, в то время как компонент I расположен на другом векторе. В некоторых вариантах осуществления компоненты I, II и III расположены на разных векторах. Изобретение также относится к вирусной или плазмидной векторной системе, описанную в настоящем описании.

[00376] Под манипуляциями с последовательностью-мишень заявители также подразумевают эпигенетические манипуляции с последовательностью-мишенью. Это может быть манипуляция с состоянием хроматина последовательности-мишени, такая как модификация состояния метилирования последовательности-мишени (т.е. внесение или устранение метилирования или паттерна метилирования или CpG-островков), модификация гистонов, повышение или снижение доступности последовательности-мишени или облегчение сворачивания в трехмерную структуру. Понятно, что если упоминается способ модификации организма или млекопитающего, включая организм человека или организм млекопитающего, не являющегося человеком, с помощью манипуляций с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе, подразумевается, что это может относиться к организму (или млекопитающему) в целом или только к одной клетке или популяции клеток из этого организма (если организм многоклеточный). В случае человека, к примеру, заявители предусматривают, среди прочего, единственную клетку или популяцию клеток, и они могут быть предпочтительно модифицированы ex vivo и затем введены обратно. В этом случае может быть необходима биопсия или другая ткань или биологическая жидкость. Стволовые клетки также предпочтительны в этом отношении. Но, разумеется, также предусматриваются варианты осуществления in vivo. Это изобретение в особенности обладает преимуществами в случае HSC.

[00377] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу модификации организма или не являющегося человеческим организма с помощью манипуляции с первой и второй последовательностями-мишенями на противоположных цепях дуплекса ДНК в представляющем интерес геномном локусе HSC, в частности, в частности, где представляющий интерес геномный локус ассоциирован с мутацией, связанной с аберрантной белковой экспрессией или с заболеванием или синдромом, включающему доставку, например, посредством приведения HSC в контакт с частицей(ами), содержащей не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию, содержащую:

I. полинуклеотидную последовательность направляющей РНК первой системы CRISPR-Cas (например, C2c1 или C2c3), причем первая полинуклеотидная последовательность содержит:

(a) первую направляющую последовательность, способную гибридизоваться с первой последовательностью-мишеью,

(b) первую последовательность прямого повтора, и

II. полинуклеотидную последовательность направляющей РНК второй системы CRISPR-Cas (например, C2c1 или C2c3), причем вторая полинуклеотидная последовательность содержит:

(a) вторую направляющую последовательность, способную гибридизоваться со второй последовательностью-мишенью,

(b) вторую последовательность прямого повтора, и

III. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере один или более сигналов ядерной локализации и содержащий одну или более мутаций, причем (а), (b) и (c) расположены в порядке от 5' к 3'-концу; или

IV. продукт(ы) экспрессии одного или более компонентов от I до III, например, первую и вторую последовательность прямого повтора, фермент CRISPR;

при этом при транскрипции первая и вторая направляющая последовательности направляют специфическое для последовательности связывание первого и второго комплекса CRISPR с первой и второй последовательностью-мишенью, соответственно, причем первый комплекс CRISPR включает фермент CRISPR в комплексе с (1) первой направляющей последовательностью, которая гибридизуется с первой последовательностью-мишенью, и второй комплекс CRISPR включает фермент CRISPR в комплексе со (1) второй направляющей последовательностью, которая гибидизуется со второй последовательностью-мишенью, причем полинуклеотидная последовательность, кодирующая CRISPR-фермент, может являться ДНК или РНК, при этом первая направляющая последовательность направляет расщепление одной цепи дуплекса ДНК вблизи первой целевой последовательности, а вторая направляющая последовательность направляет расщепление другой цепи дуплекса ДНК вблизи второй целевой последовательности, вызывая образование двуцепочечного разрыва, таким образом, модифицируя организм или организм, не принадлежащий человеку; метод может необязательно включать доставку матрицы для репарации путем гомологичной рекомбинации, в частности, посредством частиц, связывающихся с HSC или связывающихся с HSC посредством другой частицы и содержащих матрицу для репарации путем гомологичной рекомбинации, причем матрица для репарации путем гомологичной рекомбинации обеспечивает экспрессию нормальной или менее аберрантной формы белка; при этом «нормальная форма» - это белок дикого типа, и «аберрантная форма» - это белок, вызывающий развитие болезни или синдрома; также необязательно метод может включать выделение или получение HSC из организма или организма, не являющегося человеком, необязательно - размножение популяции HSC, проведение связывания частиц(ы) с HSC для получения популяции модифицированных HSC, необязательно - размножение популяции модифицированных HSC, необязательно - введение модифицированных HSC в организм или организм, не являющийся человеком. В некоторых методах изобретения любой или все полинуклеотидные последовательности кодируют CRISPR-фермент, первую и вторую направляющая последовательности, первый и второй прямые повторы. В дальнейших реализациях изобретения полинуклеотиды, кодирующие последовательность, кодирующую CRISPR-фермент, первую и вторую направляющая последовательности, первый и второй прямые повторы, являются РНК и будут доставляться посредством липосом, наночастиц, экзосом, микровезикул или генной пушки, но обладает наибольшими преимуществами доставка посредством частиц. В конкретных реализациях изобретения последовательности первого и второго повторов обладают 100% уровнем идентичности. В некоторых реализациях изобретения полинуклеотиды могут содержаться в векторной системе, включающей один или более векторов. В предпочтительных вариантах реализации первый CRISPR-фермент содержит одну или более мутации, такие что фермент является никазой комплементарной цепи, и второй CRISPR-фермент содержит одну или более мутации, такие что фермент является никазой некомплементарной цепи. Альтернативно, первый CRISPR-фермент содержит одну или более мутации, такие что фермент является никазой некомплементарной цепи, и второй CRISPR-фермент содержит одну или более мутации, такие что фермент является никазой комплементарной цепи. В предпочтительных методах изобретения первая направляющая последовательность, направляющая расщепление одной цепи дуплекса ДНК вблизи первой целевой последовательности, и вторая направляющая последовательность, направляющая расщепление одной цепи дуплекса ДНК вблизи второй целевой последовательности, приводят к образованию липких концов с 5'- выступающими нуклеотидами (оверхэнгов). В реализациях изобретения липкий конец с 5'- выступающими нуклеотидами составляет почти 200 пар оснований, предпочтительно, не более 100 пар оснований или, еще более предпочтительно, не более 50 пар оснований. В реализациях изобретения липкий конец с 5'- выступающими нуклеотидами (оверхэнг) составляет не менее 26 пар оснований, предпочтительно, не менее 30 пар оснований и, наиболее предпочтительно, 34-50 пар оснований.

[00378] Данное изобретение в некоторых вариантах осуществления предусматривает способ модификации организма или организма, не являющегося человеческим, с помощью манипуляции с первой и второй целевыми последовательностями на противоположных цепях дуплекса ДНК в представляющем интерес геномном локусе HSC, в частности, в частности, в которой интересующий геномный локус ассоциирован с мутацией, связанной с аберрантной белковой экспрессией или с заболеванием или синдромом, включая достаку, например, за счет связывания HSC с частицей (частицами), содержащими не встречающуюся в природе или искусственную композицию, включающей:

I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с

(а) первой направляющей последовательностью, способной гибридизоваться с первой целевой последовательностью в эукариотической клетке,

(b) по меньшей мере одну или более последовательность прямого повтора, и

II. второй регуляторный элемент, функционально связанный со

(а) второй направляющей последовательностью, способной гибридизоваться со второй целевой последовательностью в эукариотической клетке,

(b) по меньшей мере одну или более последовательность прямого повтора, и

III. третий регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей CRISPR-фермент (например, C2el или C2c3),

IV. продукт экспрессии одного или более компонентов от I до IV, в частности, первый и второй прямые повторы, CRISPR-фермент;

при этом компоненты I, II, III и IV расположены на одном или разных векторах системы, где при транскрипции первая и вторая направляющая последовательности направляют специифичное для последовательности связывание первого и второго CRISPR-комплексов к первой и второй целевым последовательностям, соответственно, причем первый CRISPR-комплекс включает CRISPR-фермент в комплексе с первой направляющей последовательностью, гибридизованной с первой целевой последовательностью, и второй CRISPR-комплекс включает CRISPR-фермент в комплексе со второй направляющей последовательностью, гибридизованной со второй целевой последовательностью, причем полинуклеотидная последовательность, кодирующая CRISPR-фермент, может являться ДНК или РНК, при этом первая направляющая последовательность направляет расщепление одной цепи дуплекса ДНК вблизи первой целевой последовательности, а вторая направляющая последовательность направляет расщепление другой цепи дуплекса ДНК вблизи второй целевой последовательности, вызывая образование двуцепочечного разрыва, таким образом, модифицируя организм или организм, не принадлежащий человеку; метод может необязательно включать доставку матрицы для репарации путем гомологичной рекомбинации, в частности, посредством частиц, связывающихся с HSC или связывающихся с HSC посредством другой частицы и содержащих матрицу для репарации путем гомологичной рекомбинации, причем матрица для репарации путем гомологичной рекомбинации обеспечивает экспрессию нормальной или менее аберрантной формы белка; при этом «нормальная форма» - это белок дикого типа, и «аберрантная форма» - это белок, вызывающий развитие болезни или синдрома; также необязательно метод может включать выделение или получение HSC из организма или организма, не являющегося человеком, необязательно - размножение популяции HSC, проведение связывания частиц(ы) с HSC для получения популяции модифицированных HSC, необязательно - размножение популяции модифицированных HSC, необязательно - введение модифицированных HSC в организм или организм, не являющийся человеком.

[00379] Изобретение также предоставляет векторную систему, описанную здесь. Система может включать один, два, три или четыре различных вектора, со всеми комбинациями локализации предусмотренных компонентов, например, компоненты I, II, III и IV могут находиться в одном векторе; компоненты I, II, III и IV могут находиться на разных векторах; компоненты I, II, III и IV могут находиться на двух или трех разных векторах, в любых возможных комбинациях. В некоторых методах изобретения любая или все полинуклеотидные последовательности, кодирующие CRISPR-фермент, первая и вторая направляющая последовательности, первый и второй прямые повторы - это РНК. В дальнейших реализациях изобретения последовательности первого и второго повторов обладают 100% уровнем идентичности. В предпочтительных вариантах реализации, первый CRISPR-фермент содержит одну или более мутации, при которых (которой) фермент является никазой комплементарной цепи, и второй CRISPR-фермент содержит одну или более мутации, при которых (которой) фермент является никазой некомплементарной цепи. Альтернативно, первый фермент может быть никазой некомплементарной цепи, и второй фермент может быть никазой некомплементарной цепи. В дальнейших реализациях изобретения, один или более вирусных векторов будут доставляться посредством липосом, наночастиц, экзосом, микровезикул или генной пушки; но доставка частицами обладает наибольшими преимуществами.

[00380] В предпочтительных способах данного изобретения первая направляющая последовательность, направляющая расщепление одной цепи дуплекса ДНК вблизи первой целевой последовательности, и вторая направляющая последовательность, направляющая расщепление одной цепи дуплекса ДНК вблизи второй целевой последовательности, приводят к образованию липкого конца с 5'- выступающими нуклеотидами (оверхэнга). В реализациях изобретения липкий конец с 5'- выступающими нуклеотидами (оверхэнг) составляет почти 200 пар оснований, предпочтительно, не более 100 пар оснований или, еще более предпочтительно, не более 50 пар оснований. В реализациях изобретения липкий конец с 5'- выступающими нуклеотидами (овехэнг) составляет не менее 26 пар оснований, предпочтительно, не менее 30 пар оснований и, наиболее предпочтительно, 34-50 пар оснований.

[00381] Изобретение в некоторых вариантах осуществления предусматривает способ модификации интересующего геномного локуса, в частности, HSC, например, тогда, когда интересующий геномный локус ассоциирован с мутацией, связанной с аберрантной экспрессией белка или заболеванием или синдромом, включая доставку к HSC частицей (частицами), содержащей белок Cas, содержащий одну или более мутации и две гРНК, мишенями которых являются первая и вторая цепи молекулы ДНК в HSC, соответственно, причем гРНК нацеливает на молекулу ДНК, и белок Cas вносит ник-разрывы в каждую (первую и вторую) цепь молекулы ДНК, причем мишень в HSC изменяется; и при этом белок Cas и две направляющие РНК не встречаются в природе вместе, и метод может необязательно включать доставку матрицы для репарации путем гомологичной рекомбинации, например, посредством частиц, связывающихся с HSC или связывающихся с HSC посредством другой частицы и содержащих матрицу для репарации путем гомологичной рекомбинации, причем матрица для репарации путем гомологичной рекомбинации обеспечивает экспрессию нормальной или менее аберрантной формы белка; при этом «нормальная форма» - это белок дикого типа, и «аберрантная форма» - это белок, вызывающий развитие болезни или синдрома, и необязательно: способ может включать выделение или получение HSC из организма или организма, не являющегося человеком, необязательно - размножение популяции HSC, проведение связывания частиц(ы) с HSC для получения популяции модифицированных HSC, необязательно - размножение популяции модифицированных HSC, необязательно - введение модифицированных HSC в организм или организм, не являющийся человеком. В предпочтительных методах изобретения никазная активность белка Cas в отношении каждой (первой и второй) цепей молекулы ДНК приводит к образованию липкого конца с 5'- выступающими нуклеотидами (оверхэнга). В реализациях изобретения липкий конец с 5'- выступающими нуклеотидами (оверхэнг) составляет не менее 26 пар оснований, предпочтительно, не менее 30 пар оснований и, наиболее предпочтительно, 34-50 пар оснований. В аспекте изобретения кодонный состав белка Cas оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке, предпочтительно в клетке млекопитающего или человеческой клетке. Аспекты изобретения связаны со снижением экспрессии продукта гена или дальнейшим введением матричного полинуклеотида в молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, или точным вырезанием прерывающей последовательности, позволяющим отжечься друг на друга двум 5'-оверхенгам с последующим лигированием, или изменением активности или функции продукта гена или увеличением экспрессии продукта гена. При реализации изобретения продукт гена является белком.

[00382] В некоторых вариантах осуществления изобретение предусматривает метод модификации интересующего геномного локуса, например, в HSC, в частности, в которой интересующий геномный локус ассоциирован с мутацией, связанной с аберрантной белковой экспрессией или с заболеванием или синдромом, включая доставку, например, за счет связывания HSC с частицей (частицами), включающей:

а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с каждой из двух направляющих РНК CRISPR-Cas систем которые нацелены, соответственно, на первую и вторую цепи двуцепочечной молекулы ДНК в HSC, и

b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с белком Cas (например, C2c1 или C2c3), или

в) продукт(ы) экспрессии a) или b),

причем компоненты (а) и (b) расположены на одном или разных векторах системы, мишенью гРНК является молекула ДНК HSC, и белок Cas вносит ник-разрывы в каждую (первую и вторую) цепь молекулы ДНК HSC; белок Cas и две гРНК не встречаются в природе вместе; способ может дополнительно включать доставку матрицы для репарации путем гомологичной рекомбинации, например, посредством частиц, связывающихся с HSC или связывающихся с HSC посредством другой частицы и содержащих матрицу для репарации путем гомологичной рекомбинации, причем матрица для репарации путем гомологичной рекомбинации обеспечивает экспрессию нормальной или менее аберрантной формы белка; при этом «нормальная форма» - это белок дикого типа, и «аберрантная форма» - это белок, вызывающий развитие болезни или синдрома, и необязательно: способ может включать выделение или получение HSC из организма или организма, не являющегося человеком, необязательно - размножение популяции HSC, проведение связывания частиц(ы) с HSC для получения популяции модифицированных HSC, необязательно - размножение популяции модифицированных HSC, необязательно - введение модифицированных HSC в организм или организм, не являющийся человеком. В аспекте изобретения направляющие РНК могут содержать направляющие последовательности, слитые с последовательностями прямых повторов. Аспекты изобретения связаны со снижением экспрессии продукта гена или дальнейшим введением матричного полинуклеотида в молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, или точным вырезанием прерывающей последовательности, позволяющим отжечься друг на друга двум 5'-оверхенгам с последующим лигированием, или изменением активности или функции продукта гена или увеличением экспрессии продукта гена. В реализации изобретения продукт гена является белком. В предпочтительных вариантах осуществления вектора системы являются вирусными векторами. В дальнейших реализациях изобретения полинуклеотиды, кодирующие последовательность, кодирующую CRISPR-фермент, первую и вторую направляющая последовательности, первый и второй прямые повторы, являются РНК и будут доставляться посредством липосом, наночастиц, экзосом, микровезикул или генной пушки, но обладает преимуществами доставка посредством частиц. В одном аспекте относится к способу модификации целевого полинуклеотида в HSC. В некоторых вариантах осуществления метод позволяет CRISPR-комплексу связываться с целевым полинуклеотидом, чтобы обеспечить расщепление целевого полинуклеотида, таким образом, модифицируя целевый полинуклеотид, причем CRISPR-комплекс содержит CRISPR-фермент в комплексе с направляющей последовательностью, способной гибридизоваться с целевой последовательностью в составе указанного целевого полинуклеотида; при этом указанная направляющая последовательность соединена с последовательностью прямого повтора. В некоторых вариантах осуществления упомянутое расщепление включает расщепление одной или двух цепей в месте локализации целевой последовательности упомянутым CRISPR-ферментом. В некоторых вариантах осуществления упомянутое расщепление приводит к снижению уровня транскрипции целевого гена. В некоторых вариантах осуществления способ далее включает репарацию упомянутого расщепленного целевого полинуклеотида за счет гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, причем упомянутая репарация приводит к мутации, включающей вставку, делецию или замену одного или более нуклеотидов в упомянутом целевом полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления указанная мутация приводит к одной или более аминокислотным заменам в образующемся белке при экспрессии гена, содержащего целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления метод включает введение одного или более векторов или последующая экспрессия продукта (продуктов) в HSC, в частности, посредством частиц(ы), причем один или более векторов индуцируют экспрессию одного или более компонентов из списка: CRISPR-фермента, направляющую последовательность, соединенную с последовательностью прямого повтора. В некоторых вариантах осуществления упомянутые векторы доставляются, в частности, к HSC субъекта. В некоторых вариантах осуществления реализуются указанные модификации HSC в клеточной культуре. В некоторых вариантах осуществления метод далее включает выделение упомянутых HSC из субъекта перед упомянутыми модификациями. В некоторых вариантах осуществления метод далее включает введение упомянутых HSC и/или клеток, полученных из них, обратно упомянутому субъекту.

[00383] В одном из вариантов относится к способу получения, в частности, HSC, содержащих мутантный ген, ассоциированный с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления такой ген, ассоциированный с заболеванием, может быть ассоциирован с риском возникновения или развития заболевания. В некоторых вариантах осуществления метод включает (а) введение одного или более векторов или последующая экспрессия продукта (продуктов), в частности, посредством частиц, в HSC, причем один или более векторов индуцируют экспрессию одного или более компонентов из списка: CRISPR-фермента, направляющую последовательность, соединенную с последовательностью прямого повтора; и (b) обеспечение связывания CRISPR-комплекса с целевым полинуклеотидом, способствующим расщепление целевого полинуклеотида внутри упомянутого гена, асоциированного с заболеванием, причем CRISPR-комплекс включает CRISPR-фермент в комплексе с направляющей последовательностью, способной гибридизоваться с целевой последовательностью в составе указанного целевого полинуклеотида, и, необязательно, если это применимо, таким образом, приводя к получению HSC, содержащих мутантный ген, ассоциированный с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления упомянутое расщепление включает расщепление одной или двух цепей в месте локализации целевой последовательности упомянутым CRISPR-ферментом. В некоторых вариантах осуществления упомянутое расщепление приводит к снижению уровня транскрипции целевого гена. В некоторых вариантах осуществления способ далее включает репарацию упомянутого расщепленного целевого полинуклеотида за счет гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, причем упомянутая репарация приводит к мутации, включающей вставку, делецию или замену одного или более нуклеотидов в упомянутом целевом полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления упомянутая мутация приводит к одной или более аминокислотным заменам в образующемся белке при экспрессии гена, содержащего целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления модифицированные HSC вводятся в животное, что, таким образом, приводит к получению модельного организма.

[00384] В одном из аспектов относится к способу модифицикации целевого полинуклеотида в, к примеру, HSC. В некоторых вариантах осуществления метод позволяет CRISPR-комплексу связываться с целевым полинуклеотидом, чтобы обеспечить расщепление целевого полинуклеотида, таким образом, модифицируя целевый полинуклеотид, причем CRISPR-комплекс содержит CRISPR-фермент в комплексе с направляющей последовательностью, способной гибридизоваться с целевой последовательностью в составе указанного целевого полинуклеотида, при этом указанная направляющая последовательность соединена с последовательностью прямого повтора. В других вариантах реализации изобретение предоставляет модификацию экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке, котопая происходит, например, от HSC. Способ изобретения включает увеличение или снижение экспрессии целевого полинуклеотида с использованием CRISPR-комплекса, который связывается с полинуклеотидом в HSC; обладает наибольшими преимуществами доставка CRISPR-комплекса частицей (частицами).

[00385] В некоторых способах целевый полинуклеотид может быть инактивирован, чтобы действовать на экспрессию в, например, гемапоэтических стволовых клетках. Например, при связывании CRISPR-комплекса с целевой последовательностью в клетке целевый полинуклеотид инактивируется, так что последовательность не траскрибируется, кодируемый белок не вырабатывается или последовательность не функционирует таким образом, как функционирует последовательность дикого типа.

[00386] В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанная РНК CRISPR-Cas-системы, например, гРНК может быть модифицирована; например, включать аптамеры и функциональный домен. Аптамер - это синтетический нуклеотид, который связывается со специфической молекулой-мишенью; например, молекула нуклеиновой кислоты, которая была создана путем повторных раундов селекции in vitro, или методом SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением), чтобы связывать различные молекулярные мишени, такие как малые молекулы, белки, нуклеиновые кислоты и даже клетки, ткани и организмы. Аптамеры удобны для использования, поскольку характеристики узнавания ими молекул сравнимы с таковыми у антител. В дополнение к их способности к тонкому распознаванию, преимущества аптамеров перед антителами включают низкую или отсутствующую иммуногенность при терапевтическом применении. Соответственно, при применении изобретения, фермент и/или РНК могут включать функциональный домен.

[00387] В некоторых вариантах осуществления функциональный домен представляет собой трансактивационный домен, предпочтительно VP64. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный домен представляет собой домен репрессии транскрипции, предпочтительно KRAB. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен репрессии транскрипции представляет собой SID или конкатемеры SID (например, SID4X). В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный домен является эпигенетическим доменом модификации, обеспечивающим работу эпигенетического фермента модификации. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный домен представляет собой доме активации, который может быть доменом активации P65. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен может обладать нуклеазной активностью. В одном из вариантов осуществления функциональный домен включает Fok1.

[00388] Изобретение также относится к клетке in vitro или ex vivo, содержащей любой из модифицированных ферментов CRISPR, композиций или комплексов, описанных выше, полученные любыми из вышеописанных способов. Клетка может быть как эукариотической, так и прокариотической. Изобретение также относится к потомству таких клеток. Изобретение также относится к продукту любой клетки или любого такого потомства, где продукт является продуктом указанного одного или более локусов-мишеней, модифицированных ферментом CRISPR или комплексом CRISPR. Продукт может представлять собой пептид, полипептид или белок. Некоторые из этих продуктов могут быть модифицированы модифицированным ферментом CRISPR или комплексом CRISPR. В случае некоторых таких модифицированных продуктов продукт локуса-мишени физически отличается от продукта указанного локуса-мишени, который не был модифицирован модифицированным ферментом CRISPR или комплексом CRISPR.

[00389] Изобретение также относится к полинуклеотидной молекуле, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую любой из не встречающихся в природе ферментов CRISPR, описанных выше.

[00390] Любой такой полинуклеотид может далее содержать один или более регуляторных элементов, которые функционально связаны с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей ферменты CRISPR, не встречающиеся в природе.

[00391] В любом таком полинуклеотиде, который содержит один или более регуляторных элементов, один или более регуляторных элементов могут быть функционально организован для экспрессии не встречающегося в природе фермента CRISPR в эукариотической клетке. Эукариотическая клетка может быть клеткой человека. Эукариотическая клетка может клеткой грызуна, возможно, клеткой мыши. Эукариотическая клетка может представлять собой дрожжевую клетку. Эукариотическая клетка может быть клеткой яичника китайского хомячка (CHO). Эукариотическая клетка может быть клеткой насекомого.

[00392] В любом такой полинуклеотиде, который содержит один или более регуляторных элементов, один или более регуляторных элементов могут быть функционально оптимизированы для экспрессии не встречающихся в природе ферментов CRISPR в прокариотической клетке.

[00393] В любом таком полинуклеотиде, который содержит один или более регуляторных элементов, один или более регуляторных элементов могут быть функционально оптимизированы для экспрессии в системе in vitro.

[00394] Изобретение также относится к экспрессирующему вектору, содержащему одну из описанных выше полинуклеотидных молекул. Изобретение также относится к такой полинуклеотидной молекуле(молекулам), например, полинуклеотидным молекулам, функционально организованным для экспрессии компонента(ов), являющегося белом и/или нуклеиновой кислотой, а также к такому вектору(векторам).

[00395] Кроме того, изобретение относится к способу внесения мутаций в Cas (например, C2c1 или C2c3) или мутантный или модифицированный Cas (например, C2c1 или C2c3), который является ортологом ферментов CRISPR, по изобретению, описанному в настоящем описании, включающему определение аминокислоты (аминокислот) в этом ортологе, которая может находиться вблизи или соприкасаться с молекулой нуклеиновой кислоты, например, ДНК, РНК, гРНК и т.д., и/или аминокислоты(аминокислот), аналогичных или соответствующих охарактеризованной в настоящем описании аминокислоте(аминокислотам) в ферментах CRISPR по изобретению, описанным в настоящем описании, для мутаций и/или модификаций, или синтез, или получение, или экспрессию ортолога(ортологов), состоящие или по существу состоящие из модификации(модификаций) и/или мутации(й), или внесение мутации, как описано в настоящем описании, например, модификацию, например, замену или мутацию нейтральной аминокислоты на заряженную, в частности, положительно заряженную аминокислоту, например, аланин. Модифицированный таким образом ортолог может быть использован в системе CRISPR-Cas; и молекула(ы) нуклеиновой кислоты, экспрессирующая его, может быть использована в векторе или других системах доставки, которые доставляют молекулы или кодируют компоненты систем CRISPR-Cas, описанных в настоящем описании.

[00396] В одном из аспектов изобретение обеспечивает эффективную целевую активность и минимизированную нецелевую активность. В одном аспекте изобретение обеспечивает эффективное целевое расщепление белком CRISPR и минимизированное нецелевое расщепление белком CRISPR. В одном аспекте изобретение обеспечивает специфическое для направляющей РНК связывание белка CRISPR в локусе гена без расщепления ДНК. В одном аспекте изобретение обеспечивает эффективное направляемое направляющей РНК целевое связывание белка CRISPR в локусе гена и минимизированное нецелевое связывание белка CRISPR. Соответственно, в этом аспекте изобретение обеспечивает специфическую регуляцию гена-мишени. В одном аспекте изобретение относится к специфическому для направляющей РНК связыванию фермента CRISPR в генном локусе в отсутствие расщепления ДНК. Соответственно, в одном аспекте изобретение обеспечивает расщепление в одном генном локусе и генную регуляцию в другом генном локусе с использованием единственного фермента CRISPR. В одном аспекте изобретение обеспечивает ортогональную активацию и/или ингибирование и/или расщепление множественных мишеней с использованием одного или более белков и/или ферментов CRISPR.

[00397] В другом варианте настоящее изобретение относится к способу функционального скрининга генома в совокупности клеток ex vivo или in vivo, включая введение или экспрессию библиотеки, содержащей множество направляющих РНК (гРНК) системы CRISPR-Cas, и при этом скрининг далее включает использование фермента CRISPR, причем комплекс CRISPR модифицирован так, чтобы содержать гетерологичный функциональный домен. В одном аспекте изобретение относится к способу скринига генома, включающему введение в хозяина или экспрессию в организме-хозяине библиотеки in vivo. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор вносится в организм хозяина или экспрессируется в организме хозяина. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор связан с белком CRISPR. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор связан с N-концом или C-концом белка CRISPR. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор связан с петлей в направляющей РНК. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, включающий репрессор, который вносится в организм хозяина или экспрессируется в организме хозяина. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором скрининг включает изменение и обнаружение активации гена, ингибирования гена или расщепления в локусе.

[00398] В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором организм-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором организм-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором организм-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, не являющуюся клеткой человека. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором эукариотическая клетка, не являющаяся человеческой, представляет собой клетку млекопитающего, не являющегося человеком. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором клетка млекопитающего, не являющегося человеком, может включать, но не ограничиваться ими, клетки приматов, быков, птиц, свиней, собак, грызунов, зайцевых, таких как клетки обезьян, коров, овец, свиньи, собаки, кролика, крысы или мыши. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором клетка может быть клеткой эукариотического организма, не являющегося млекопитающим, такого как домашняя птица (например, цыпленок), позвоночная рыба (например, лосось) или моллюск (например, устрица, лобстер, креветка). В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, где эукариотическая клетка, не являющаяся человеческой, может представлять собой растительную клетку. Растительная клетка может принадлежать однодольному или двудольному растению или культурному или зерновому растению, такому как маниока, кукуруза, сорго, соя, пшеница, овес или рис. Растительная клетка также может принадлежать водоросли, дереву или продовольственному растению, фрукту или овощу (например, деревья, такие как цитрусовые деревья, в частности, апельсиновые, грейпфрутовые или лимонные; персиковые или нектариновые деревья, яблони или груши; орехи, такие как миндаль, фундук или фисташка; паслен; растения рода Brassiccr, растения рода Lactuca, растения рода Spinada, растения рода Capsicum, хлопок, табак, спаржа, морковь, капуста, брокколи, цветная капуста, томат, баклажан, перец, салат, шпинат, малина, клубника, голубика, черника, виноград, кофе, какао и т.д.).

[00399] В одном из аспектов изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, включающему доставку комплексов CRISPR-Cas или их компонента(компонентов) или молекул(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующей их, где указанная нуклеиновая кислота функционально связана с регуляторными последовательностями и экспрессируется in vivo. В этом аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором экспрессия in vivo происходит посредством лентивируса, аденовируса или аденоассоциированного вируса. В этом варианте изобретение относится к способу, как описано в настоящем описании, в котором доставка происходит через частицу, наночастицу, липид или проникающий в клетку пептид (CPP).

[00400] В конкретных вариантах осуществления может быть интересно направить комплекс CRISPR-Cas в хлоропласт. Во многих случаях это нацеливание может быть осуществлено в присутствии N-концевого удлинения, называемого транзитным пептидом хлоропластов (CTP) или транзитным пептидом пластид. Хромосомные трансгены из бактериальных источников должны иметь последовательность, кодирующую последовательность CTP, слитую с последовательностью, кодирующей экспрессируемый полипептид, если экспрессируемый полипептид должен быть направлен в растительную пластиду (т.е. хлоропласт). Соответственно, локализация экзогенного полипептида в хлоропласте часто достигается за счет функционального связывания полинуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность CTP, с 5'-областью полинуклеотида, кодирующего экзогенный пептид. Однако аминокислотная последовательность CTP и близлежащих к N-концу пептида последовательностей может влиять на эффективность процессинга. Другие варианты нацеливания в хлоропласт, которые описаны, представляют собой сигнальную последовательность cab-m7 кукурузы (патент США 7022896, WO 97/41228), сигнальную последовательность глутатион-редуктазы гороха (WO 97/41228) и CTP, описанный в US2009029861.

[00401] В одном аспекте изобретение относится к паре комплексов CRISPR-Cas, каждый из которых содержит направляющую РНК (гРНК), включающую направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе клетки, где по меньшей мере одна петля каждой одиночной направляющей последовательности (sg-РНК) модифицирована вставками отдельной последовательности(последовательностей) РНК, которые связываются с одним или более адаптерными белками, причем адаптерный белок ассоциирован с одним или более функциональными доменами, при этом каждая гРНК каждого комплекса CRISPR-Cas содержит функциональный домен, обладающей активностью расщепления ДНК. В одном аспекте изобретение относится к парным комплексам CRISPR-Cas, таким как описано в настоящем описании, где активность расщепления ДНК обеспечивается нуклеазой Fok1.

[00402] В этом аспекте изобретение относится к способу расщепления последовательности-мишени в представляющем интерес геномном локусе, включающему доставку комплексов CRISPR-Cas или их компонентов(компонента) или молекул(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующей их, причем указанная нуклеиновая кислота функционально связана с регуляторной последовательностью и экспрессируется in vivo. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором доставка происходит за счет лентивируса, аденовируса или аденоассоциированного вируса. В этом аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, или к парным комплексам CRISPR-Cas, описанным в настоящем описании, в которых последовательность-мишень для первого комплекса пары находится на первой цепи двуцепочечной ДНК, и последовательность-мишень для второго комплекса пары находится на второй цепи двуцепочечной ДНК. В этом аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, или парным комплексам CRISPR-Cas, описанным в настоящем описании, в котором последовательности-мишени для первого и второго комплекса находятся вблизи друг друга таким образом, что ДНК разрезается так, чтобы обеспечивать гомологичную репарацию. В одном аспекте этот способ или эти парные комплексы CRISPR-Cas могут включать такие комплексы CRISPR-Cas, каждый из которого содержит фермент CRISPR, в который внесены мутации таким образом, что он обладает не более чем 5% нуклеазной активности немутантного фермента CRISPR.

[00403] В одном аспекте изобретение относится к библиотеке, способу или комплексу, как описано в настоящем описании, где гРНК модифицирована так, что она имеет по меньшей мере одну некодирующую функциональную петлю, например, где по меньшей мере одна некодирующая функциональная петля является репрессирующей; например, где по меньшей мере одна некодирующая функциональная петля содержит Alu.

[00404] В одном аспекте изобретение относится к способу изменения или модификации экспрессии продуктов генов. Упомянутый способ может включать внесение в клетку, содержащую или экспрессирующую молекулу ДНК, кодирующий продукт гена, не встречающейся в природе системы CRISPR-Cas, содержащей белок Cas и направляющую РНК, мишенью которой является молекула ДНК, где направляющая РНК нацелена на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, и белок Cas расщепляет молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, причем экспрессия продукта гена изменяется; и при этом белок Cas и направляющая РНК вместе не встречаются в природе. Изобретение далее включает белок Cas, являющийся кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, и в еще более предпочитаемом варианте осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку человека. В следующем варианте осуществления изобретения экспрессия генного продукта снижена.

[00405] В одном аспекте изобретение относится к измененным клеткам и потомству этих клеток, а также к продуктам этих клеток. Белки и системы CRISPR-Cas (например, C2c1) и по настоящему изобретению могут быть использованы для получения клеток, содержащих модифицированный локус-мишень. В некоторых вариантах осуществления способ обеспечивает связывание комплекса, мишенью которого является нуклеиновая кислота, с ДНК-мишенью или РНК-мишенью, для расщепления упомянутой ДНК-мишени или РНК-мишени, таким образом, модифицируя упомянутую ДНК-мишень или РНК-мишень, где комплекс, мишенью которого является нуклеиновая кислота, включает эффекторный белок, мишенью которого является нуклеиновая кислота, в комплексе с направляющей РНК, гибридизованной с последовательностью-мишенью, в рамках упомянутой ДНК-мишени или РНК-мишени. В одном аспекте изобретение относится к способу репарации генного локуса в клетке. В другом аспекте относится к способу изменения экспрессии ДНК или РНК в генном локусе клетки. В некоторых вариантах осуществления способ обеспечивает связывание комплекса, мишенью которого является нуклеиновая кислота, с ДНК-мишенью или РНК-мишенью, так что упомянутое связывание приводит к увеличению или снижению уровня экспрессии указанной ДНК или РНК, причем комплекс, мишенью которого является нуклеиновая кислота, включает эффекторный белок, мишенью которого является нуклеиновая кислота, в комплексе с направляющей РНК. Для модификации ДНК-мишени или РНК-мишени применимы соображения и условия, сходные с теми, что описаны выше. Фактически, эти условия отбора, культивирования и обратного введения применимы в разных аспектах настоящего изобретения. В одном аспекте изобретение относится к способу модификации ДНК или РНК в эукариотической клетке, который может быть осуществлен in vivo, ex vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления способ включает отбор клетки или популяции клеток из организма человека или организма, не являющегося человеческим, и модификацию клетки или клеток. Культивирование может происходить на любой стадии ex vivo. Такие клетки могут быть, без любых ограничений, растительной клеткой, животной клеткой, конкретным типом клетки любого организма, включая стволовые клетки, иммунные клетки, Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки, клетки сердечно-сосудистой системы, эпителиальные клетки и т.п. Клетки могут быть модифицированы согласно изобретению для получения продуктов генов, например, в контролируемых количествах, которые могут быь увеличены или снижены в зависимости от цели использования, или мутированы. В определенных вариантах осуществления генетический локус клетки репарируется. Клетка или клетки даже могут быть повторно введены в организм, не являющийся человеческим, или растение. В случае повторно введенных клеток может быть предпочтительным использование стволовых клеток.

[00406] В однои из аспектов изобретение относится к клеткам, которые временно содержат системы CRISPR или их компоненты. Например, белки или ферменты CRISPR и нуклеиновые кислоты временно вводят в клетки, и генетический локус изменяется, после чего следует снижение количества одного из компонентов системы CRISPR. Затем, клетки, потомство клеток и организмы, содержащие клетки, получившие генетические изменения с помошью CRISPR, содержат меньшее количество одного или более компонентов системы CRISPR или более не содержат ни одного из компонентов системы CRISPR. Одним неограничивающим примером является самоинактивирующася cистема CRISPR-Cas, как описано в настоящем описании. Таким образом, изобретение относится к клеткам, предшественникам клеток и организмам, содержащим клетки, которые содержат один или более генетических локусов, измененных посредством системы CRISPR, но в которых по существу отсутствует один или более компонентов системы CRISPR. В некоторых вариантах осуществления компоненты системы CRISPR отсутствуют. Такие клетки, ткани и организмы преимущественно содержат желаемое или выбранное генетическое изменение, но утратили компоненты CRISPR-Cas или их остатки, которые потенциально могут неспецифически действовать и вести к возникновению проблем безопасноти или препятствовать одобрению регулирующим учреждением. Также изобретение относится к продуктам деятельности клеток, организмов, предшественников клеток и организмов.

Индуцибельные системы CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 ("разделенный C2c1" или "разделенный C2c3")

[00407] В одном из аспектов изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, включающей:

первую слитую конструкцию C2c1 или C2c3, связанную с первой половиной индуцибельного димера, и вторую слитую конструкцию C2c1 или C2c3, связанную со второй половиной индуцибельного димера;

при этом первая слитая конструкция C2c1 или C2c3 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации;

при этом вторая слитая конструкция C2c1 или C2c3 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации;

при этом контакт с индуцирующим источником энергии сводит первую и вторую половины индуцибельного димера вместе;

при этом сведение первой и второй половин индуцибельного димера вместе позволяет первой и второй слитым конструкциям C2c1 составлять функциональную систему CRISPR-Cas C2c1, или первой и второй слитым конструкциям C2c3 составлять функциональную систему CRISPR-Cas C2c3;

при этом система CRISPR-Cas C2c1 или система CRISPR-Cas C2c3 включают направляющую РНК (гРНК), включающую направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе клетки; и

при этом функциональная система CRISPR-Cas C2c1 или система CRISPR-Cas C2c3 связывается с последовательностью-мишенью и необязательно редактирует геномный локус для изменения экспрессии гена.

[00408] В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 индуцибельный димер является, или содержит, или по существу состоит или состоит из индуцибельного гетеродимера. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 первая половина или первая часть или первый фрагмент индуцибельного гетеродимера является, содержит, по существу состоит или состоит из белка FKBP, необязательно FKBP12. В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 вторая половина или вторая часть или второй фрагмент индуцибельного гетеродимера является, содержит, по существу состоит или состоит из белка FRB. В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 структура первой слитой конструкции C2c1 является, содержит, по существу состоит или состоит из NES-N-концевой области C2c1-FRB-NES. В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 структура второй слитой конструкции C2c1 является, содержит, по существу состоит или состоит из NLS-C-концевой области C2c1-FRB-NLS. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 может присутствовать линкер, отделяющий часть C2c1 от половины, части или фрагмента индуцибельного димера. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 источник индукции является, содержит, по существу состоит или состоит из рапамицина. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 индуцибельный димер является индуцибельным гомодимером. В одном из возможных аспектов в C2c1 индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 представляет собой AacC2c1. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 один или более функциональных доменов ассоциированы с одной или обеими частями C2c1, в частности, функциональные домены могут необязательно включать транскрипционный активатор, транскрипционный репрессор или нуклеазу, такую как нуклеаза Fok1. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 функциональная система CRISPR-Cas C2c1 связывается с последовательностью-мишенью, и фермент является мертвым C2c1, необязательно имеющим нуклеазную активность, сниженную по меньшей мере на 97% или на 100% (соответственно, имеющим не более 3% нуклеазной активности или преимущественно 0% нуклеазной активности), по сравнению с C2c1, не содержащим ни одну мутацию. Кроме того, изобретение относится и один из возможных аспектов изобретения предоставляет собой полинуклеотид, кодирующий индуцибельную систему CRISPR-Cas C2c1, описанную в настоящем описании.

[00409] В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 индуцибельный димер является, или содержит, или по существу состоит или состоит из индуцибельного гетеродимера. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 первая половина или первая часть или первый фрагмент индуцибельного гетеродимера является, или содержит, или по существу состоит или состоит из белка FKBP, необязательно FKBP12. В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 вторая половина или вторая часть или второй фрагмент индуцибельного гетеродимера является, или содержит, или по существу состоит или состоит из белка FRB. В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 структура первой слитой конструкции C2c3 является, или содержит, или по существу состоит или состоит из NES-N-концевой области C2c3-FRB-NES. В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 структура второго слитой конструкции C2c3 является, или содержит, или по существу состоит или состоит из NLS-C-концевой области C2c3-FRB-NLS. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 может присутствовать линкер, отделяющий часть C2c3 от половины, части или фрагмента индуцибельного димера. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 источник индукции является, или содержит, или по существу состоит или состоит из рапамицина. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 индуцибельный димер является индуцибельным гомодимером. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 один или более функциональных доменов ассоциированы с одной или обеими частями C2c3, в частности, функциональные домены могут необязательно включать транскрипционный активатор, транскрипционный репрессор или нуклеазу, такую как нуклеаза Fok1. В одном из возможных аспектов в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 функциональная система CRISPR-Cas C2c3 связывается с последовательностью-мишенью и фермент является мертвым C2c3, необязательно имеющим нуклеазную активность, сниженную по меньшей мере на 97% или на 100% (соответственно, имеющим не более 3% нуклеазной активности или преимущественно 0% нуклеазной активности), по сравнению с C2c3, не содержащим ни одну мутацию. Кроме того, изобретение относится и один из возможных аспектов изобретения предоставляет собой полинуклеотид, кодирующий индуцибельную систему CRISPR-Cas C2c3, описанную в настоящем описании.

[00410] В одном из возможных аспектов изобретения изобретение относится к вектору для доставки первой слитой конструкции C2c1, связанной с первой половиной или частью или фрагментом индуцибельного димера и функционально связанной с одним или более сигналами ядерной локализации, как описано в настоящем описании. В одном из возможных аспектов изобретение относится к вектору для доставки второй слитой конструкции C2c1, связанной со второй половиной или частью или фрагментом индуцибельного димера и функционально связанной с одним или более сигналами ядерного экспорта.

[00411] В одном из возможных аспектов изобретения изобретение относится к вектору для доставки первой слитой конструкции C2c3, связанной с первой половиной или частью или фрагментом индуцибельного димера и функционально связанной с одним или более сигналами ядерной локализации, как описано в настоящем описании. В одном из возможных аспектов изобретение относится к вектору для доставки второй слитой конструкции C2c3, связанной со второй половиной или частью или фрагментом индуцибельного димера и функционально связанной с одним или более сигналами ядерного экспорта

[00412] В одном из возможных аспектов изобретения изобретение относится к вектору для доставки как первой слитой конструкции C2c1, слитой с первой половиной или частью или фрагментом индуцибельного димера и функционально связанной с одним или более сигналами ядерной локализации, так и второй слитой конструкции C2c1, связанной со второй половиной или частью или фрагментом индуцибельного димера и функционально связанного с одним или более сигналами ядерного экспорта, как описано в настоящем описании.

[00413] В одном из возможных аспектов изобретения изобретение относится к вектору для доставки как первой слитой конструкции C2c3, слитой с первой половиной или частью или фрагментом индуцибельного димера и функционально связанной с одним или более сигналами ядерной локализации, так и второй слитой конструкции C2c3, связанной со второй половиной или частью или фрагментом индуцибельного димера и функционально связанного с одним или более сигналами ядерного экспорта, как описано в настоящем описании.

[00414] В одном из возможных аспектов вектор может быть единственной плазмидой или экспрессирующей кассетой.

[00415] В одном из возможных аспектов изобретение относится к эукариотической клетке-хозяину или клеточной линии, трансформированным любым из векторов, описанных в настоящем описании, или экспрессирующим индуцибельную систему CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанную в настоящем описании.

[00416] В одном из возможных аспектов изобретение относится к трансгенному организму, трансформированному одним из векторов, описанных в настоящем описании, или экспрессирующему индуцибельную систему CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанную в настоящем описании, или к потомкам этого организма. В одном из возможных аспектов изобретение относится к модельному организму, который конститутивно экспрессирует индуцибельную систему CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанную в настоящем описании.

[00417] В одном из возможных аспектов изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии системе CRISPR-Cas C2c1, включающей: первую слитую конструкцию C2c1 конструкт, связанную с первой половиной индуцибельного гетеродимера, и вторую слитую конструкцию C2c1, связанную со второй половиной индуцибельного гетеродимера, причем первая слитая конструкция C2c1 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации, причем вторая слитая конструкция C2c1 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации NES, причем при взаимодействии с источником индукции первая и вторая половины индуцибельного гетеродимера объединяются, причем объединение первой и второй половин индуцибельного гетеродимера позволяет первой и второй слитым конструкциям C2c1 составить функциональную систему CRISPR-Cas C2c1, причем система CRISPR-Cas C2c1 включает направляющую РНК (гРНК), содержащую направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе клетки, и причем функциональная система CRISPR-Cas C2c1 редактирует геномный локус, изменяя экспрессию гена.

[00418] В одном из возможных аспектов изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии системе CRISPR-Cas C2c3, включающей: первую слитую конструкцию C2c3 конструкт, связанную с первой половиной индуцибельного гетеродимера, и вторую слитую конструкцию C2c3, связанную со второй половиной индуцибельного гетеродимера, причем первая слитая конструкция C2c3 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации, причем вторая слитая конструкция C2c3 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации NES, причем при взаимодействии с источником индукции первая и вторая половины индуцибельного гетеродимера объединяются, причем объединение первой и второй половин индуцибельного гетеродимера позволяет первой и второй слитым конструкциям C2c3 составить функциональную систему CRISPR-Cas C2c3, причем система CRISPR-Cas C2c3 включает направляющую РНК (гРНК), содержащую направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе клетки, и причем функциональная система CRISPR-Cas C2c3 редактирует геномный локус, изменяя экспрессию гена.

[00419] В одном из возможных аспектов изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в этом, включающему индукцию редактирования гена путем трансформации индивидуума полинуклеотидом, описанным в настоящем описании, или любым из векторов, описанных в настоящем описании, и введение индивидууму источника индукции. Изобретение относится к использованию такого полинуклеотида или вектора в производстве лекарственных средств, например, такого как лекарственное средство для лечения индивидуума или для такого способа лечения индивидуума. Изобретение относится к полинуклеотиду, описанному в настоящем описании, или любому из векторов, описанных в настоящем описании, для использования в способе лечения индивидуума, нуждающегося в этом, включающем индукцию редактирования гена путем трансформации индивидуума полинуклеотидом, описанным в настоящем описании или любым векторов, описанных в настоящем описании, и введение индивидууму источника индукции. В одном из возможных аспектов способа предоставляется матрица репарации, например, доставляемая вектором, содержащим указанную матрицу репарации.

[00420] В одном из возможных аспектов изобретение относится к способу лечения индивидуума, нуждающегося в этом, включающему индукцию активации или репрессии транскрипции гена путем трансформации индивидуума полинуклеотидом, описанным в настоящем описании, или любым из векторов, описанных в настоящем описании, где полинуклеотид или вектор кодирует или содержит каталитически неактивный белок C2c1 или неактивный белок C2c3 и один или более ассоциированных с ним функциональных доменов, описанных в настоящем описании; кроме того, способ включает введение индивидууму источника индукции. Изобретение относится к использованию такого полинуклеотида или вектора в производстве лекарственного средства, например, такого как лекарственное средство для лечения индивидуума или для такого способа лечения индивидуума. Изобретение относится к полинуклеотиду, описанному в настоящем описании, или любому из векторов, описанных в настоящем описании, для использования в способе лечения индивидуума, нуждающегося в этом, включающем индукцию активации или репрессии транскрипции гена путем трансформации индивидуума полинуклеотидом, описанным в настоящем описании, или любым из векторов, описанных в настоящем описании, и введение индивидууму источника индукции.

[00421] Соответственно, изобретение, среди прочего, охватывает гомодимеры, а также также гетеродимеры, мертвый C2c1 или C2c1, по существу не обладающий нуклеазной активностью, в частности, за счет мутаций, системы или комплексы, в которых присутствует один или более NLS и/или один или более NES; функциональный(-ые) домен(ы), соединенные с разделенным C2c1; способы, включая способы лечения, и применение.

[00422] Соответственно, изобретение, среди прочего, охватывает гомодимеры, а также также гетеродимеры, мертвый C2c3 или C2c3, по существу не обладающий нуклеазной активностью, в частности, за счет мутаций, системы или комплексы, в которых присутствует один или более NLS и/или один или более NES; функциональный(-ые) домен(ы), соединенные с разделенным C2c3; способы, включая способы лечения, и применение.

[00423] Понятно, что, когда в настоящем описании упоминается C2c1, белок C2c1 или фермент C2c1, это включает разделенный C2c1 по настоящему изобретению. В одном из аспектов изобретение относится к способу изменения или модификации экспрессии продукта гена. Указанный способ может включать введение в клетку, содержащую или экспрессирующую молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, сконструированной не встречающейся в природе системы CRISPR-Cas C2c1, содержащей белок C2c1 и направляющую РНК, мишенью которой является молекула ДНК, где направляющая РНК нацелена на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, и белок C2c1 расщепляет молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, за счет чего изменяется экспрессия продукта гена; причем белок C2c1 и направляющая РНК не встречаются вместе в природе. Изобретение относится к направляющей РНК, содержащей направляющую последовательность, соединенную с последовательностью DR. Кроме того, изобретение предусматривает оптимизацию кодонного состава белка C2c1 для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, и в более предпочтительном варианте осуществления клетка млекопитающего является клеткой человека. В следующем варианте осуществления изобретения экспрессия продукта гена снижается.

[00424] Понятно, что, когда в настоящем описании упоминается C2c3, белок C2c3 или фермент C2c3, это включает разделенный C2c3 по настоящему изобретению. В одном из аспектов изобретение относится к способу изменения или модификации экспрессии продукта гена. Указанный способ может включать введение в клетку, содержащую или экспрессирующую молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, сконструированной не встречающейся в природе системы CRISPR-Cas C2c3, содержащей белок C2c3 и направляющую РНК, мишенью которой является молекула ДНК, где направляющая РНК нацелена на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, и белок C2c3 расщепляет молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, за счет чего изменяется экспрессия продукта гена; причем белок C2c3 и направляющая РНК не встречаются вместе в природе. Изобретение относится к направляющей РНК, содержащей направляющую последовательность, соединенную с последовательностью DR. Кроме того, изобретение предусматривает оптимизацию кодонного состава белка C2c3 для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, и в более предпочтительном варианте осуществления клетка млекопитающего является клеткой человека. В следующем варианте осуществления изобретения экспрессия продукта гена снижается.

[00425] В одном аспекте изобретение относится к сконструированной способами инженерии не встречающейся в природе системе CRISPR-Cas C2c1, содержащей белок C2c1 и направляющую РНК, мишенью которой является молекула ДНК, кодирующая продукт гена в клетке, причем направляющая РНК нацелена на молекулу ДНКа, кодирующую продукт гена, и белок C2c1 расщепляет молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, за счет чего изменяется экспрессия продукта гена; причем белок C2c1 и направляющая РНК не встречаются вместе в природе; и причем система включает разделенный C2c1 по настоящему изобретению. Изобретение относится к направляющей РНК, содержащей направляющую последовательность, соединенную с последовательностью DR. Кроме того, изобретение предусматривает оптимизацию кодонного состава белка C2c1 для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, и в более предпочтительном варианте осуществления клетка млекопитающего является клеткой человека. В следующем варианте осуществления изобретения экспрессия продукта гена снижается.

[00426] В одном аспекте изобретение относится к сконструированной способами инженерии не встречающейся в природе системе CRISPR-Cas C2c3, содержащей белок C2c3 и направляющую РНК, мишенью которой является молекула ДНК, кодирующая продукт гена в клетке, причем направляющая РНК нацелена на молекулу ДНКа, кодирующую продукт гена, и белок C2c3 расщепляет молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, за счет чего изменяется экспрессия продукта гена; причем белок C2c3 и направляющая РНК не встречаются вместе в природе; и причем система включает разделенный C2c3 по настоящему изобретению. Изобретение относится к направляющей РНК, содержащей направляющую последовательность, соединенную с последовательностью DR. Кроме того, изобретение предусматривает оптимизацию кодонного состава белка C2c3 для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, и в более предпочтительном варианте осуществления клетка млекопитающего является клеткой человека. В следующем варианте осуществления изобретения экспрессия продукта гена снижается.

[00427] В другом аспекте изобретение относится к сконструированной не встречающейся в природе системе, содержащей один или более векторов, содержащих первый регуляторный элемент, функционально связанный с направляющей РНК системы CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, мишенью которой является молекула ДНК, кодирующая продукт гена, и второй регуляторный элемент, функционально связанный с белком C2c1 или белком C2c3; включая разделенный C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению. Компоненты (а) и (b) могут быть находиться в одном или разных векторах системы. Направляющая РНК осуществляет нацеливание на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена в клетке, и белок C2c1 или белок C2c3 расщепляет молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, за счет чего экспрессия продукта гена изменяется; и причем белок C2c3 или белок C2c1 и направляющая РНК не встречаются вместе в природе. Изобретение относится к направляющей РНК, содержащей направляющую последовательность, соединенную с последовательностью DR. Кроме того, изобретение относится к белку C2c1 или белку C2c3, кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, и в более предпочтительном варианте осуществления клетка млекопитающего является клеткой человека. В следующем варианте осуществления изобретения экспрессия продукта гена снижается.

[00428] В одном аспекте изобретение относится к системе векторов, содержащей один или более векторов. В некоторых вариантах осуществления система включает: а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с последовательностью DR и одним или более участками вставки для вставки одной или более направляющих последовательностей ниже последовательности DR, причем при экспрессии направляющая последовательность обеспечивает специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR-Cas C2c1 или комплекса CRISPR-Cas C2c3 с последовательностью-мишенью в эукариотической клетке, причем комплекс CRISPR-Cas C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 содержит C2c1 или C2c3 в комплексе с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизована с последовательностью-мишенью, и (2) последовательностью DR; и (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей упомянутый фермент C2c1 или C2c3, содержащий последовательность ядерной локализации; причем компоненты (а) и (b) расположены в одном и нескольких векторах системы; включая разделенные C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) далее включает две или более направляющих последовательностей, функционально связанных с первым регуляторным элементом, причем при экспрессии две или более направляющих последовательности обеспечивают специфическое для последовательности связывание C2c1 или C2c3 с различными последовательностями-мишенями в эукариотической клетке.

[00429] В некоторых вариантах осуществления комплекс CRISPR-Cas C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 содержит одну или более последовательностей ядерной локализации достаточной силы для индукции накопления упомянутого комплекса CRISPR-Cas C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 в количествах, позволяющих его обнаружить в ядре эукариотической клетки. Без связи с теорией полагают, что последовательность ядерной локализации не является необходимой для активности комплекса CRISPR-Cas C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 в эукариотических организмах, но что включение таких последовательностей повышает активность системы, особенно в отношении направления молекул нуклеиновых кислот в ядро.

[00430] В некоторых вариантах осуществления фермент C2c1 представляет собой C2c1 видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из: Alicyclobacillus acidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacillus contaminans (например, DSM I7975), Desulfovibrio inopinatus (например, DSM I07II), Desulfonatronum thiodismutans (например, штамм MLF-1), бактерия Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (например, DSM I7572), Bacillus thermoamylovorans (например, штамм B4I66), Brevibacillus sp. CFII2, Bacillus sp. NSP2.I, Desulfatirhabdium butyrativorans (например, DSM I8734), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM I3609), Citrobacter freundii (например, ATCC 8090), Brevibacillus agri (например, BAB-2500) и Methylobacterium nodulans (например, ORS 2060). Фермент может быть гомологом или ортологом C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления белки C2c1 или C2c3 являются кодон-оптимизированными для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления C2c1 или C2c3 направляет расщепление одной или двух цепей в участке последовательности-мишени. В предпочтительном варианте осуществления разрыв цепи представляет собой ступенчатое разрезание с 5'-выступающими нуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления первый регуляторный элемент представляет собой промотор полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления второй регуляторный элемент представляет собой промотор полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления минимальная длина прямого повтора составляет 16 нуклеотидов, и он содержит единственную шпильку. В дальнейших вариантах осуществления длина прямого повтора превышает 16 нуклеотидов, предпочтительно превышает 17 нуклеотидов, и он содержит более одной шпильки или обладает оптимизированной вторичной структурой.

[00431] В одном аспекте изобретение относится к эукариотической клетке-хозяину, содержащей а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с последовательностью прямого повтора и одним или более участками вставки для вставки одной или более направляющих последовательностей ниже последовательности DR, причем при экспрессии направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR-Cas C2c1 или комплекса CRISPR-Cas C2c3 с последовательностью-мишенью в эукариотической клетке, причем комплекс CRISPR-Cas C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 содержит C2c1 или C2c3 в комплексе с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизована с последовательностью-мишенью, и (2) последовательностью DR; и (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей упомянутый фермент C2c1 или C2c3, содержащий последовательность ядерной локализации. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит компоненты (а) и (b); включая разделенные C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) или (b) или компоненты (а) и (b) стабильно встраиваются в геном эукариотической клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) далее содержит две или более направляющих последовательностей, функционально связанных с первым регуляторным элементом, причем при экспрессии две или более направляющие последовательности направляют специфическое для последовательности связывание C2c1 или C2c3 с различными последовательностями-мишенями в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления белки C2c1 или C2c3 являются кодон-оптимизированными для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления C2c1 или C2c3 направляет расщепление одной или двух цепей в участке последовательности-мишени. В предпочтительном варианте осуществления разрыв цепи представляет собой ступенчатое разрезание с 5'-выступающими нуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления первый регуляторный элемент представляет собой промотор полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления второй регуляторный элемент представляет собой промотор полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления минимальная длина прямого повтора составляет 16 нуклеотидов, и он содержит единственную шпильку. В дальнейших вариантах осуществления длина прямого повтора превышает 16 нуклеотидов, предпочтительно превышает 17 нуклеотидов, и он содержит более одной шпильки или обладает оптимизированной вторичной структурой. В одном аспекте изобретение относится к эукариотическому организму, не являющемуся человеческим, предпочтительно многоклеточному эукариотическому организму, включающему эукариотическую клетку-хозяина согласно описанным вариантам осуществления. В других аспектах изобретение относится к эукариотическому организму, предпочтительно многоклеточному эукариотическому организму, включающему эукариотическую клетку-хозяина, согласно описанным вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления этих аспектов организм может быть животным, например, млекопитающим. Также организм может быть членистоногим, в частности, насекомым. Организм также может быть растением. Кроме того, организм может представлять собой гриб.

[00432] В одном аспекте изобретение относится к набору, содержащему один или более компонентов, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления набор включает систему векторов и инструкцию по применению набора. В некоторых вариантах осуществления система включает а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с последовательностью прямого повтора и одним или более участками вставки для вставки одной или более направляющих последовательностей ниже последовательности DR, причем при экспрессии направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR-Cas C2c1 или комплекса CRISPR-Cas C2c3 с последовательностью-мишенью в эукариотической клетке, причем комплекс CRISPR-Cas C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 содержит C2c1 или C2c3 в комплексе с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизована с последовательностью-мишенью, и (2) последовательностью DR; и (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей упомянутый фермент C2c1 или C2c3, содержащий последовательность ядерной локализации; преимущественно включая разделенный C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления набор содержит компоненты (а) и (b), расположенные на одном или более векторах системы. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) далее содержит две или более направляющих последовательностей, функционально связанных с первым регуляторным элементом, причем при экспрессии две или более направляющих последовательностей направляют специфическое для последовательности связывание C2c1 или C2c3 с различными последовательностями-мишенями в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления C2c1 или C2c3 содержит одну или более последовательностей ядерной локализаци достаточной силы, чтобы индуцировать накопление упомянутого C2c1 или C2c3 в поддающихся обнаружению количествах в ядре эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления фермент C2c1 представляет собой C2c1 видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из: Alicyclobacillus acidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacillus contaminans (например, DSM I7975), Desulfovibrio inopinatus (например, DSM I07II), Desulfonatronum thiodismutans (например, штамм MLF-1), бактерия Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (например, DSM I7572), Bacillus thermoamylovorans (например, штамм B4I66), Brevibacillus sp. CFII2, Bacillus sp. NSP2.I, Desulfatirhabdium butyrativorans (например, DSM I8734), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM I3609), Citrobacter freundii (например, ATCC 8090), Brevibacillus agri (например, BAB-2500) и Methylobacterium nodulans (например, ORS 2060). Фермент может быть гомологом или ортологом C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления белки C2c1 или C2c3 являются кодон-оптимизированными для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления C2c1 или C2c3 направляет расщепление одной или двух цепей в участке последовательности-мишени. В предпочтительном варианте осуществления разрыв цепи представляет собой ступенчатое разрезание с 5'-выступающими нуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления первый регуляторный элемент представляет собой промотор полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления второй регуляторный элемент представляет собой промотор полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления минимальная длина прямого повтора составляет 16 нуклеотидов, и он содержит единственную шпильку. В дальнейших вариантах осуществления длина прямого повтора превышает 16 нуклеотидов, предпочтительно превышает 17 нуклеотидов, и он содержит более одной шпильки или обладает оптимизированной вторичной структурой.

[00433] В одном из возможных аспектов изобретение относится к модификациям полинуклеотида-мишени в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает позволение комплексу CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 связаться с полинуклеотидом-мишенью, чтобы обеспечить расщепление упомянутого полинуклеотида-мишени, тем самым модифицируя полинуклеотид-мишень, при этом комплекс CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 содержит C2c1 или C2c3 в комплексе с направляющей последовательностью, гибридизованной с последовательностью-мишенью в пределах упомянутого полиуклеотида-мишени, причем указанный полиуклеотид-мишень соединен с последовательностью прямого повтора. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление включает расщепление одной или двух цепей в участке указанной последовательности-мишени указанным C2c1 или C2c3; включая разделенный C2c1 или разделенный C2c3 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления упомянутое расщепление приводит к снижению уровня транскрипции гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления способ далее включает репарацию упомянутого расщепленного полинуклеотида-мишени за счет гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, причем упомянутая репарация приводит к мутации, включающей вставку, делецию или замену одного или более нуклеотидов в упомянутом полинуклеотиде-мишени. В некоторых вариантах осуществления указанная мутация приводит к одной или более аминокислотным заменам в белке, образующемся при экспрессии гена, содержащего последовательность-мишень. В некоторых вариантах осуществления способ далее включает доставку одного или более векторов в упомянутую эукариотическую клетку, причем один или более векторов индуцируют экспрессию одного или более из C2c1 или C2c3 и направляющей последовательности, связанной с последовательностью DR. В некоторых вариантах осуществления упомянутые векторы доставляются в эукариотическую клетку, находящуюся в индивидууме. В некоторых вариантах осуществления упомянутая модификация происходит в указанной эукариотической клетке в клеточной культуре. В некоторых вариантах осуществления способ далее включает выделение указанной эукариотической клетки из индивидуума перед упомянутой модификацией. В некоторых вариантах осуществления способ далее включает обратное введение указанной эукариотической клетки и/или клеток, полученных из нее впоследствии, упомянутому субъекту.

[00434] В одном аспекте изобретение относится к способу модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает позволение комплексу CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 связаться с полинуклеотидом, так чтобы указанное связывание приводило к увеличению или снижению экспрессии упомянутого полинуклеотида, причем комплекс CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 содержит C2c1 или C2c3 в комплексе с направляющей последовательностью, способной гибридизоваться с последовательностью-мишенью в пределах упомянутого полиуклеотида-мишени, причем указанный полинуклеотид-мишень соединен с последовательностью прямого повтора; это включает разделенный C2c1 или разделенный C2c3 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления способ далее включает доставку с помощью одного или более векторов в упомянутую эукариотическую клетку, причем один или более векторов индуцируют экспрессию одного или более из C2c1 или C2c3 и направляющей последовательности, соединенной с последовательностью DR.

[00435] В одном аспекте изобретение относится к способу получения модельной эукариотической клетки, содержащей мутантный ген, ассоциированный с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления такой ген, ассоциированный с заболеванием, может быть ассоциирован с риском возникновения или развития заболевания. В некоторых вариантах осуществления способ включает (а) введение одного или более векторов в эукариотическую клетку, где один или более векторов запускают экспрессию одного или более из C2c1 или C2c3 и направляющей последовательности, соединенной с последовательностью прямого повтора; и (b) позволение комплексу CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 связаться с полинуклеотидом-мишенью, обеспечивая расщепления полинуклеотида-мишени внутри упомянутого гена, ассоциированного с заболеванием, причем CRISPR-комплекс C2c1 или C2c3 включает C2c1 или C2c3 в комплексе с (1) направляющей последовательностью, гибридизованной с последовательностью-мишенью в пределах указанного полинуклеотида-мишени, и (2) последовательностью DR, таким образом, приводя к получению модельной эукариотической клетки, содержащей мутантный ген, ассоциированный с заболеванием, это включает разделенный C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления C2c1 или C2c3 обеспечивает расщепление одной или двух цепей в участке последовательности-мишени. В предпочтительном варианте осуществления разрыв цепи представляет собой ступенчатое разрезание с 5'-выступающими нуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления упомянутое расщепление приводит к снижению транскрипции гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления способ далее включает репарацию упомянутого расщепленного целевого полинуклеотида за счет гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, причем упомянутая репарация приводит к мутации, включающей вставку, делецию или замену одного или более нуклеотидов в упомянутом полинуклеотиде-мишени. В некоторых вариантах осуществления упомянутая мутация приводит к одной или более аминокислотным заменам в образующемся белке при экспрессии гена, содержащего последовательность-мишень.

[00436] В одном из возможных аспектов изобретение относится к способу разработки биологически активного агента, который модулирует события передачи сигнала в клетке, ассоциированные с геном, связанным с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления такой ген, связанный с заболеванием, может быть ассоциирован с риском возникновения или развития заболевания. В некоторых вариантах осуществления способ включает а) приведение исследуемого соединения в контакт с модельной клеткой согласно любому из описанных вариантов осуществления; и b) определение изменения данных, указывающего на снижение или увеличение числа событий передачи сигнала в клетке, связанное с упомянутой мутацией в упомянутом гене, ассоциированном с заболеванием, тем самым разрабатывая биологически активный агент, который модулирует события передачи сигнала в клетке, ассоциированные с геном, связанным с заболеванием.

[00437] В одном из возможных аспектов изобретение относится к рекомбинантному полинуклеотиду, содержащему направляющую последовательность ниже последовательности прямого повтора, причем при экспрессии направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание комплекса CRISPR-Cas C2c1 или комплекса CRISPR-Cas C2c3 с соответствующей последовательностью-мишенью в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень является протоонкогеном или онкогеном.

[00438] В одном из возможных аспектов изобретение относится к способу селекции одной или более клетки(ок), причем способ включает: введение одного или более векторов в клетку(и), причем один или более векторов индуцируют экспрессию одного или более из C2c1 или C2c3, направляющей последовательности, связанной с последовательностью прямого повтора, и редактирующей матрицы; причем редактирующая матрица содержит одну или более мутаций, которые предотвращают расщепление белком C2c1 или C2c3, что позволяет осуществить гомологичную рекомбинацию редактирующей матрицы с помощью полинуклеотида-мишени в клетке, подлежащей селекции; это позволяет комплексу CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 связываться с полинуклеотидом-мишенью так, чтобы осуществить расщепление упомянутого полинуклеотида-мишени, при этом комплекс CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 содержит C2c1 или C2c3 в комплексе с (1) направляющей последовательностью, гибридизованной с последовательностью-мишенью в пределах упомянутого полиуклеотида-мишени, и (2) последовательностью прямого повтора, причем связывание комплекса CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 с полинуклеотидом-мишенью индуцирует клеточную гибель, таким образом, обеспечивая селекцию одной или более клеток, в которые внесена мутация; это включает разделенный C2c1 или разделенный C2c3 по настоящему изобретению. В другом предпочтительном варианте осуществления клетка, которая подвергается селекции, является эукариотической клеткой. Аспекты изобретения позволяют выбрать конкретные клетки без применения селективного маркера или двухступенчатого процесса, который может включать систему контрселекции.

[00439] В настоящей заявке встречается фраза "этот включает разделенный C2c1 или разделенный C2c3 по настоящему изобретению" или сходный текст для того, чтобы указать на то, что C2c1 в вариантах осуществления настоящего изобретения может представлять собой разделенный C2c1 и C2c3 может представлять собой разделенный C2c3, как описано в настоящем описании.

[00440] В одном из возможных аспектов изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии системе CRISPR-Cas C2c1, включающей первую слитую конструкцию C2c1, связанную с первой половиной индуцибельного гетеродимера, и вторую слитую конструкцию C2c1, связанную со второй половиной индуцибельного гетеродимера, причем первая слитая конструкция C2c1 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации, причем вторая слитая конструкция C2c1 функционально связана с одним или более сигналами ядерного экспорта, причем при взаимодействии с источником индукции первая и вторая половины индуцибельного гетеродимера объединяются, причем объединение первой и второй половин индуцибельного гетеродимера позволяет первой и второй слитым конструкциям C2c1 составить функциональную систему CRISPR-Cas C2c1, причем система CRISPR-Cas C2c1 включает направляющую РНК (гРНК), содержащую направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе клетки, и причем функциональная система CRISPR-Cas C2c1 редактирует геномный локус, изменяя экспрессию гена. В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 первая половина индуцибельного гетеродимера является FKBP12 и вторая половина индуцибельного гетеродимера является FRB. В другом варианте осуществления источником энергии индукции является рапамицин.

[00441] В одном из возможных аспектов изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии системе CRISPR-Cas C2c3, включающей первую слитую конструкцию C2c3, связанную с первой половиной индуцибельного гетеродимера, и вторую слитую конструкцию C2c3, связанную со второй половиной индуцибельного гетеродимера, причем первая слитая конструкция C2c3 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации, причем вторая слитая конструкция C2c3 функционально связана с одним или более сигналами ядерного экспорта, причем при взаимодействии с источником индукции первая и вторая половины индуцибельного гетеродимера объединяются, причем объединение первой и второй половин индуцибельного гетеродимера позволяет первой и второй слитым конструкциям C2c3 составить функциональную систему CRISPR-Cas C2c3, причем система CRISPR-Cas C2c3 включает направляющую РНК (гРНК), содержащую направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе клетки, и причем функциональная система CRISPR-Cas C2c3 редактирует геномный локус, изменяя экспрессию гена. В одном из возможных аспектов изобретения в индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c3 первая половина индуцибельного гетеродимера является FKBP12 и вторая половина индуцибельного гетеродимера является FRB. В другом варианте осуществления источником энергии индукции является рапамицин.

[00442] Источником энергии индукции может считаться простой индуктор или димеризующий агент. Термин "источник энергии индукции" для согласованности используется на протяжении всего настоящего описания. Источник энергии индукции (или индуктор) восстанавливает C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления источник энергии индукции объединяет две части C2c1 или C2c3 за счет действия двух половин индуцибельного димера. Следовательно, две половины индуцибельного димера объединяются в присутствии источника энергии индукции. Две половины димера не димеризуются (не образуют димер) без источника энергии индукции.

[00443] Таким образом, две половины индуцибельного димера кооперируют с источником энергии индукции для димеризации димера. Это, в свою очередь, восстанавливает C2c1 или C2c3 объединением первой и второй частей C2c1 или C2c3.

[00444] Каждая слитая конструкция фермента CRISPR, включает часть разделенного C2c1 или разделенного C2c3. Они являются слитыми, предпочтительно через линкер, такой как Gly-Ser, описанный в настоящем описании, с одной из двух половин димера. Две половины димера могут быть по существу одинаковыми мономерами, которые вместе образуют гомодимер, или могут быть разными мономерами, которые вместе образуют гетеродимер. В таком случае два мономера можно считать половиной полного димера.

[00445] C2c1 или C2c3 разделены том смысле, что две части фермента C2c1 или C2c3 по существу составляют функциональный C2c1 или C2c3. Этот C2c1 или C2c3 может функционировать как фермент, модифицирующий геном (при формировании комплекса с ДНК-мишенью и направляющей нуклеиновой кислотой), такой как никаза или нуклеаза (разрезающая обе цепи ДНК), или это может быть мертвый C2c1 или мертвый C2c3, который по существу является ДНК-связывающим белком с очень низкой или отсутствующей каталитической активностью, обычно за счет мутации(й) в каталитическом домене.

[00446] Две части разделенного C2c1 или разделенного C2c3 могут считаться N-концевой частью и С-концевой частью разделенного C2c1 или разделенного C2c3. Слияние обычно происходит в точке разделения C2c1 или C2c3. Другими словами, и С-конец N-концевой части разделенного C2c1 или разделенного C2c3 слит с одной из половин димера, в то время как N-конец С-концевой части слит с другой половиной димера.

[00447] C2c1 или C2c3 не должны быть разделены в том смысле, что разрыв создается вновь. Точка разделения обычно конструируется in silico и клонируется в конструкты. Вместе две части конструкции разделенного C2c1 или разделенного C2c3, N-концевая часть и С-концевая часть, образуются целый C2c1 или C2c3, включающий предпочтительно по меньшей мере 70% или более аминокислот дикого типа (или нуклеотидов, кодирующих их), предпочтительно по меньшей мере 80% или более, предпочтительно по меньшей мере 90% или более, предпочтительно по меньшей мере 95% или более, предпочтительно по меньшей мере 99% или более аминокислот дикого типа (или нуклеотидов, кодирующих их). Являются возможными укорочения и предусматриваются мутанты. Нефункциональные домены могут быть полностью удалены. Важным является то, что две части могут быть объединены и что желаемая функция C2c1 или C2c3 восстановлена.

[00448] Димер может быть гомодимером или гетеродимером.

[00449] Один или более, предпочтительно два, NLS можно использовать в качестве функционально связанных с первой конструкцией C2c1. Один или более, предпочтительно два, NES можно использовать в качестве функционально связанных с первой конструкцией C2c1. NLS и/или NES предпочтительно фланкируют слитую конструкцию разделенный C2c1-димер (т.е. половина димера), т.е. NLS может располагаться на N-конце первой конструкции C2c1, и NLS может располагаться на С-конце первой конструкции C2c1. Аналогично, NES может располагаться на N-конце второй конструкции C2c1, и NES может располагаться на С-конце второй конструкции C2c1. Будет понятно, что, когда упоминается N'- или C'-конец, это соответствует 5'- и 3'-концам соответствующей нуклеотидной последовательности.

[00450] Один или более, предпочтительно два, NLS можно использовать в качестве функционально связанных с первой конструкцией C2c3. Один или более, предпочтительно два, NES можно использовать в качестве функционально связанных с первой конструкцией C2c3. NLS и/или NES предпочтительно фланкируют слитую конструкцию разделенный C2c3-димер (т.е. половина димера), т.е. NLS может располагаться на N-конце первой конструкции C2c3, и NLS может располагаться на С-конце первой конструкции C2c3. Аналогично, NES может располагаться на N-конце второй конструкции C2c3, и NES может располагаться на С-конце второй конструкции C2c3. Будет понятно, что, когда упоминается N'- или C''-конец, это соответствует 5'- и 3'-концам соответствующей нуклеотидной последовательности.

[00451] Предпочтительной является следующая организация первой конструкции C2c1: 5'-NLS-(N-концевая часть C2c1)-линкер-(первая половина димера)-NLS-3' или следующая организация конструкции C2c3: 5'-NLS-(N-концевая часть C2c3)-линкер-(первая половина димера)-NLS-3'. Предпочтительной является следующая организация второй конструкции C2c1: 5'-NES-(С-концевая часть C2c1)-линкер-(вторая половина димера)-NES-3' или следующая организация второй конструкции C2c3: 5'-NES-(С-концевая часть C2c3)-линкер-(вторая половина димера)-NES-3'.

[00452] В некоторых вариантах осуществления один или более NES, функциональной связанный со второй конструкцией C2c1, могут быть заменены на NLS. Однако обычно это не является предпочтительным, и в других вариантах осуществления сигнал локализации, функционально связанный со вторым C2c1, представляет собой NES. В некоторых вариантах осуществления один или более NES, функционально связанных со второй конструкцией C2c3, может быть заменен на NLS. Однако обычно это не является предпочтительным, и в других вариантах осуществления сигнал локализации, функционально связанный со вторым C2c3, представляет собой NES.

[00453] Было бы желательно, чтобы NES был функционально связан с N-концевым фрагментом разделенного C2c1 или разделенного C2c3 и чтобы NLS был функционально связан с C-концевым фрагментом разделенного C2c1 или разделенного C2c3. Однако может быть предпочтительной организация, когда NLS функционально связан с N-концевым фрагментом разделенного C2c1 или разделенного C2c3 и NES функционально связан с C-концевым фрагментом разделенного C2c1 или разделенного C2c3.

[00454] NES обеспечивает локализацию второй слитой конструкции C2c1 или C2c3 вне ядра по меньшей мере до тех пор, пока присутствует источник энергии индукции (например, по меньшей мере до тех пор, пока энергетический источник предоставлен индуктору для выполнения его функции). Присутствие индуктора стимулирует димеризацию двух слитых конструкций C2c1 или C2c3 в цитоплазме и делает термодинамически выгодной ядерную локализацию димеризованных первого и второго слитых белков C2c1 или C2c3. Без связи с теорией, заявители полагают, что NES ограничивает вторую слитую конструкцию C2c1 или C2c3 цитоплазмой (т.е. выводит из ядра). NLS на первой слитой конструкции C2c1 или C2c3 способствует его ядерной локализации. В обоих случаях заявители используют NES или NLS, чтобы сдвинуть равновение (равновесие ядерного транспорта) в желаемую сторону. Димеризация обычно происходит вне ядра (очень малая доля ее может произойти в ядре), и NLS на димеризованном комплексе сдвигает равновесие ядерного транспорта в сторону ядерной локализации, так что димеризованный и, таким образом, восстановленный белок C2c1 или C2c3 входит в ядро.

[00455] Способность заявителей восстановить функцию разделенного C2c1 или разделенного C2c3 является преимущественной. Для доказательства концепции используется временная трансфекция и в присутствии источника энергии индукции димеризация происходит на фоновом уровне. Активность не обнаруживается при раздельных фрагментах C2c1 или C2c3. Затем используется стабильная экспрессия посредством лентивирусной доставки используется для разработки и демонстрации того, что подход разделенного C2c1 или C2c3 может быть использован.

[00456] Этот предоставленный подход разделенного C2c1 или разделенного C2c3 обладает преимуществами, поскольку он обеспечивает индуцибельный характер активности C2c1 или C2c3, таким образом, обеспечивая контроль во времени. Более того, могут быть использованы различные последовательности локализации (т.е. предпочтительные NES и NLS), чтобы снизить уровень фоновой активности самособирающихся комплексов. Также могут быть использованы тканеспецифические промоторы, к примеру, один промотор для каждой из слитых конструкций C2c1 или C2c3, для тканеспецифического нацеливания, таким образом, обеспечивая пространственный контроль. Два различных тканеспецифических промотора могут быть использованы, если требуется более тонкая регуляция. Такой же подход может быть использован в отношении промоторов, специфичных к определенной стадии развития, или может быть использована комбинация тканеспецифических промоторов и промоторов, специфичных к определенной стадии развития. Причем одна пара слитых конструкций C2c1 или C2c3 (первая и вторая) находится под контролем (т.е. функционально связана или включает) тканеспецифического промотора, в то время как другие первая и вторая конструкции C2c1 или C2c3 находятся под контролем (т.е. функционально связана или включает) промотора, специфичного к определенной стадии развития.

[00457] Индуцибельная система CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 включает одну или более последовательностей ядерной локализации (NLS), как описано в настоящем описании, например, функционально связанных с первой слитой конструкцией C2c1 или C2c3. Эти последовательности ядерной локализации в идеальном случае обладают достаточной силой, чтобы индуцировать накопление указанной слитой конструкции C2c1 или C2c3 в ядре эукариотической клетки в поддающихся обнаружению количествах. Без связи с теорией, полагают, что последовательность ядерной локализации не является необходимой для активности комплекса CRISPR-Cas C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 в эукариотах, но также что включение таких последовательностей повышает активность системы, особенно посредством направления молекул нуклеиновой кислоты в ядро, и способствует функционированию представленной двухкомпонентной системы.

[00458] Аналогично, вторая слитая конструкция C2c1 или C2c3 функционально связана с последовательностью ядерного экспорта. Действительно, она может быть связана с одной или более NES. Другими словами, число используемых NES в случае второй слитой конструкции C2c1 или C2c3 предпочтительно составляет 1, 2 или 3. Обычно являются предпочтительными 2 NES, но в некоторых вариантах осуществления достаточно и, таким образом, является предпочтительным 1. Подходящие примеры NLS и NES известны в данной области. Например, предпочтительный сигнал ядерного экспорта (NES) принадлежит белку тирозинкиназе 2 человека. Предпочтительные сигналы являются видоспецифическими.

[00459] В системе, в которой используются FRB и FKBP, предпочтительно, чтобы FKBP был фланкирован последовательностями ядерной локализации (NLS). В системе, в которой используются FRB и FKBP, предпочтительным расположением является: N-концевой C2c1-FRB-NES:C-концевой C2c1-FKBP-NLS или N-концевой C2c3-FRB-NES:C-концевой C2c3-FKBP-NLS. Таким образом, первая слитая конструкция C2c1 или C2c3 содержит С-концевую часть C2c1 или C2c3 и вторая слитая конструкция C2c1 или C2c3 содержит N-концевую часть C2c1 или C2c3.

[00460] Другим преимущественным аспектом настоящего изобретения является то, что оно может быть быстро запущено, т.е. обладает быстрым ответом. Без связи с теорией полагают, что активность C2c1 или C2c3 может быть индуцирована путем димеризации существующей (уже присутствующей) слитой конструкции (за счет контакта с источником энергии индукции) быстрее, чем путем экспрессии (особенно трансляции) новой слитой конструкции. Как таковые, первая и вторая слитые конструкции C2c1 или C2c3 конструкты могут экспрессироваться в клетке-мишени заранее, т.е. до того, как активность C2c1 или C2c3 необходима. Активность C2c1 или C2c3 может контролироваться во времени и затем запускаться добавлением источника энергии индукции, который в идеальном случае действует быстрее (димеризуя гетеродимер и, таким образом, обеспечения активность C2c1 или C2c3), чем посредством экспрессии (включая индукцию транскрипции) C2c1 или C2c3, доставляемого, например, с помощью вектора.

[00461] Термины "C2c1", или "фермент C2c1", или "фермент CRISPR" используются в настоящем описании взаимозаменяемо, если не очевидно обратное. Термины "C2c3", или "фермент C2c3", или "фермент CRISPR" используются в настоящем описании взаимозаменяемо, если не очевидно обратное.

[00462] Заявители демонстрируют, что C2c1 или C2c3 могут быть разделены на два компонента, которые восстанавливают функциональную нуклеазу, будучи объединенными. Используя чувствительные к рапамицину димеризационные домены, заявители создают химически индуцируемый C2c1 или C2c3 для контроля во времени C2c1-зависимого редактирования генома или C2c3-зависимого редактирования генома или модулирования транскрипции. Другими словами, заявители демонстрируют, что C2c1 или C2c3 могут становиться химически индуцируемыми, будучи разделенными на два фрагмента, причем для контроля сборки C2c1 или C2c3 могут быть использованы чувствительные к рапамицину димеризационные домены. Заявители показывают, что объединенные C2c1 или C2c3 могут быть использованы для того, чтобы опосредовать редактирование генома (за счет нуклеазной/никазной активности), как и для модулирования транскрипции (за счет ДНК-связывающего домена - так называемого "мертвого C2c1" или "мертвого C2c3").

[00463] Как таковое, использование димеризационных доменов, чувствительных к рапамицину, является предпочтительным. Обратная сборка может быть определена с помощью восстановления связывающей активности. Когда C2c1 или C2c3 функционирует как никаза или образует двуцепочечный разрыв, в настоящем описании представлены подходящие проценты для сравнения с диким типом.

[00464] Обработка рапамицином может длиться 12 суток. Доза может составлять 200 нМ. Эта временная и/или молярная дозировка может являться примером подходящей дозы для линии эмбриональных клеток почки человека 293FT (HEK293FT) и может быть использована для других клеточных линий. Это число может быть изменено для терапевтического использования in vivo, будучи выраженным, например, в мг/кг. Однако, также предусматривается, что может быть использована также стандартная доза приема рапамицина индивидуумом. Под стандартной дозировкой подразумевается нормальная терапевтическая доза рапамицина или доза, используемая при основном назначении (т.е. доза, используемая, когда рапамицин принимается для предотвращения отторжения органов).

[00465] Следует заметить, что предпочтительная организация частей C2c1-FRB/FKBP или C2c3-FRB/FKBP такова, что части находятся по отдельности и неактивны до тех пор, пока индуцированная рапамицином димеризации FRB и FKBP не приводит к сборке функциональной полноразмерной нуклеазы C2c1 или C2c3. Таким образом, предпочтительно, чтобы слитая конструкция C2c1 или C2c3 была связана с первой половиной индуцибельного гетеродимера.

[00466] Чтобы ограничить фрагмент C2c1(N)-FRB или C2c3(N)-FRB цитоплазмой, где меньше вероятность димеризации с локализованным в ядре фрагментом C2c1(C)-FKBP или C2c3(C)-FKBP, предпочтительно использовать для C2c1(N)-FRB один NES из белка тирозинкиназы 2 человека (C2c1(N)-FRB-NES) или для C2c3(N)-FRB один NES из белка тирозинкиназы 2 человека (C2c3(N)-FRB-NES). В присутствии рапамицина C2c1(N)-FRB-NES димеризуется с C2c1(C)-FKBP-2xNLS или C2c3(N)-FRB-NES димеризуется с C2c3(C)-FKBP-2xNLS, восстанавливая полноразмерный белок C2c1 или C2c3, который смещает баланс ядерного транспорта в сторону импорта в ядро и позволяет нацеливание на ДНК.

[00467] Высокая дозировка C2c1 или C2c3 может увеличить частоту инсерций-делеций в последовательностях, не являющихся мишенями, которые имеют немного несоответствующих направляющей цепи оснований. Такие последовательности являются особенно чувствительными, если несоответствующие основания не последовательны и/или находятся снаружи от последовательности-затравки направляющей нуклеиновой кислоты. Соответственно, временной контроль активности C2c1 или C2c3 может быть использован для снижения дозировки в длительных экспериментах по экспрессии и, следовательно, может обеспечить уменьшение нецелевых инсерций-делеций по сравнению с конститутивно активным C2c1 или C2c3.

[00468] Предпочтительной является вирусная доставка. В частности, предусмотрена доставка с помощью лентивирусного вектора или вектора аденоассоциированного вируса. Заявители создают разделенный C2c1 или разделенный C2c3 лентивирусный конструкт, подобный плазмиде lentiCRISPR. Эти разделенные части должны быть достаточно малы, чтобы соответствовать ограничениям в размере, накладываемым аденоассоциированным вектором длиной приблизительно 4.7 т.п.о.

[00469] Заявители показывают, что стабильная низкокопийная экспрессия разделенного C2c1 или разделенного C2c3 может быть использована для индукции значительных инсерций-делеций в локусе-мишени без значительных мутаций в участках, не являющихся мишенями. Заявители клонируют фрагменты C2c1 (2 части на основе разделенной системы 5, описанной в настоящем описании) или фрагменты C2c3.

[00470] Также можно использовать мертвый C2c1 или C2c3, включающий трансактивационный домен VP64, например, добавляемый к C2c1(C)-FKBP-2xNLS (убитый-C2c1(C)-FKBP-2xNLS-VP64) или C2c3(C)-FKBP-2xNLS (убитый-C2c3(C)-FKBP-2xNLS-VP64). Активация транскрипции индуцируется посредством VP64 в присутствии рапамицина, индуцируя димеризацию слитой конструкции C2c1(C)-FKBP и слитой конструкции C2c1(N)-FRB или слитой конструкции C2c3(C)-FKBP и слитой конструкции C2c3(N)-FRB. Другими словами, заявители проверяют возможность индукции разделенного белка мертвый C2c1-VP64 или разделенного белка мертвый C2c3-VP64 и демонстрируют, что активация транскрипции индуцируется разделенным белком мертвый C2c1-VP64 или разеделнным белком мертвый C2c3-VP64 в присутствии рапамицина. Как таковой, предоставленный индуцибельный C2c1 или C2c3 может быть связан с одним или более функциональными доменами, таким как транскрипционный активатор или репрессор, или нуклеаза (такая как FokI). Функциональный домен может быть связан или слит с одной частью разделенного C2c1 или разделенного C2c3.

[00471] Предпочтительная организация является следующей: первая конструкция организована следующим образом: 5'-1-й сигнал локализации-(N-концевая часть C2c1)-линкер-(1-я часть димера)- 1-й сигнал локализации-3' или первая конструкция C2c3 организована следующим образом: 5'-1-й сигнал локализации-(N-концевая часть C2c3)-линкер-(1-я часть димера)-1-й сигнал локализации-3', и вторая конструкция C2c1 организована следующим образом: 5'-2-й сигнал локализации-(2-я половина димера)-линкер-(С-концевая часть C2c1)-2-й сигнал локализации-функциональный домен-3' или вторая конструкция C2c3 организована следующим образом: 5'-2-й сигнал локализации-(2-я половина димера)-линкер-(С-концевая часть C2c3)-2-й сигнал локализации-функциональный домен-3'. Здесь функциональный домен размещен на 3'-конце второй конструкции C2c1 или C2c3. В качестве альтернативы функциональный домен может быть размещен на 5'-конце первой конструкции C2c1 или C2c3. Один или более функциональных доменов могут быть размещены на 3'-конце или 5'-конце, или на обоих концах. Подходящий промотор предпочтительно находится в конструкциях выше этих последовательностей. Сигналы локализации могут представлять собой NLS или NES, но разные сигналы не могут находиться на одной конструкции.

[00472] В одном из возможных аспектов изобретение относится к индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, в которой C2c1 или C2c3 обладает сниженной по меньшей мере на 97% или 100% нуклеазной активностью, по сравнению с C2c1 или C2c3, не содержащим по меньшей мере одну мутацию.

[00473] Соответственно, также предпочтительно, чтобы C2c1 или C2c3 был мертвым C2c1 или мертвым C2c3. В идеальном случае, разделение должно быть таким, чтобы не затрагивался каталитический домен(ы). В случае мертвого C2c1 или мертвого C2c3 предполагается, что связывание с ДНК происходит, но расщепление или никазная активность отсутствует.

[00474] В одном из возможных аспектов изобретение относится к индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, в которой один или более функциональных доменов связаны с C2c1 или C2c3. Этот функциональный домен может быть связан (например, связан или слит с) одной частью разделенного C2c1 или обеими частями, или одной частью разделенного C2c3 или обеими частями. Один из них может быть связана с каждой из двух частей разделенного C2c1 или разделенного C2c3. Следовательно, они могут быть обычно предоставлены как части первой и/или второй слитой конструкции C2c1 или C2c3, будучи слитыми с этой конструкцией. Функциональные домены обычно слиты через линкер, такой как линкер GlySer, описанный в настоящем описании. Один или более функциональных доменов могут представлять собой трансактивационный домен или транскрипционный репрессорный домен. Хотя функциональные домены могут различаться, предпочтительно, чтобы все функциональные домены были либо трансактивационными, либо репрессорными доменами, и чтобы они не использовались в одной смеси.

[00475] Трансактивационный домен может представлять собой: VP64, p65, MyoDl, HSF1, RTA или SET7/9.

[00476] В одном из возможных аспектов изобретение относится к индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, в которой один или более функциональных доменов, связанных с C2c1 или C2c3, являются транскрипционным репрессорным доменом.

[00477] В одном из возможных аспектов изобретение относится к индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, в которой репрессорным доменом является домен KRAB.

[00478] В одном из возможных аспектов изобретение относится к индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, в которой транскрипционным репрессорным доменом является домен NuE, домен NcoR, домен SID или домен SID4X.

[00479] В одном из возможных аспектов изобретение относится к индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, в которой один или более функциональных доменов связаны с адаптерным белком, обладающим одним или более видами активности, включая метилазную активность, деметилазную активность, трансактивационную активность, транскрипционную репрессорную активность, активность в отношении высвобождения транскрипционных факторов, гистонмодифицирующую активность, РНК-расщепляющую активность, ДНК-расщепляющую активность, ДНК-интегразную активность или активность в отношении связывания нуклеиновых кислот.

[00480] Гистонмодифицирующие домены также являются предпочтительными в некоторых вариантах осуществления. Типовые гистонмодифицирующие домены обсуждаются далее. Транспозазные домены, домены аппарата, осуществляющего гомологичную рекомбинацию, рекомбиназные домены и/или интегразные домены также являются предпочтительными в качестве функциональных доменов в рамках настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления активность в отношении интеграции в ДНК предусматривает домены аппарата, осуществляющего гомологичную рекомбинацию, интегразные домены, рекомбиназные домены и/или транспозазные домены.

[00481] В одном из возможных аспектов изобретение относится к индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, расщепляющая ДНК активность которой происходит за счет наличия нуклеазы.

[00482] В одном из возможных аспектов изобретение относится к индуцибельной системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, в которой нуклеаза представляет собой нуклеазу FokI.

[00483] Использование таких функциональных доменов, которые являются предпочтительными для системе с разделенным C2c1 или разделенным C2c3 по настоящему изобретению, также подробно обсуждается в статье Konermaim et al. ("Genome-scale transcriptional activation with an engineered CRISPR-Cas9 complex" Nature, опубликованная 11 декабря 2014 года).

[00484] Система по настоящему изобретению может использоваться с любой направляющей последовательностью.

[00485] В некоторых вариантах осуществления могут использоваться модифицированные направляющие последовательности. Особенно предпочтительны направляющие последовательности, являющиеся реализацией концепции из упомянутой статьи Konermann Nature 11 Dec 2014. Эти направляющие последовательности модифицированы так, что в них добавлены связывающиеся с белком части РНК (такие как аптамеры). Соответствующие РНК-связывающие белковые домены могут использоваться для узнавания РНК и привлечения к направляющей последовательности функциональных доменов, таких как описанные в настоящем описании. Это может быть использовано, в первую очередь, вместе в случае мертвого C2c1 или мертвого C2c3, приводя к транскрипционной активации или репрессии или расщеплению ДНК нуклеазами, такими как FokI. Использование таких направляющих последовательностей в комбинации с мертвым C2c1 или мертвым C2c3 обладает высокой эффективностью, особенно в случае, когда C2c1 или C2c3 сам связан с собственным функциональным доменом, как описано в настоящем описании. Когда индуцируется восстановление мертвого C2c1 или мертвого C2c3 (с или без собственного связанного функционального домена) в соответствии с настоящим изобретением, т.е. разделенного C2c1 или разделенного C2c3, этот инструмент особенно полезен.

[00486] Направляющая РНК (гРНК), которая предпочтительно используется в рамках настоящего изобретения, может содержать направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе клетки, причем гРНК модифицирована путем вставки отдельной последовательности(ей) РНК, связывающейся с одним или более адаптерными белками, при этом адаптерный белок связан с одним или более функциональными доменами. C2c1 или C2c3 может содержать по меньшей мере одну мутацию, такую что фермент C2c1 или C2c3 обладает не более чем 5% нуклеазной активности фермента C2c1 или C2c3, не содержащего мутацию; и/или по меньшей мере один или более NLS. Также предусматривается не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, включающая: одну или более направляющих РНК (гРНК), содержащих направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе клетки, фермент C2c1 или C2c3, содержащий по меньшей мере один или более NLS, причем фермент C2c1 или C2c3 может содержать по меньшей мере одну мутацию, такую что фермент C2c1 или C2c3 обладает не более чем 5% нуклеазной активности фермента C2c1 или C2c3, не содержащего по меньшей мере одну мутацию, при этом по меньшей мере гРНК модифицирована путем вставки отдельной последовательности(ей) РНК, связывающейся с одним или более адаптерными белками, при этом адаптерный белок связан с одним или более функциональными доменами.

[00487] гРНК предпочтительно модифицированы путем вставки отдельной последовательности(ей) РНК, которая связывается с одним или более адаптерными белками. Вставка отдельной последовательности(ей) РНК, которая связывается с одним или более адаптерными белками, является предпочтительно последовательностями аптамеров, специфичных к одному или более адаптерным белкам. Адаптерный белок может являться: MS2, PP7, Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP50G, KU1, МU, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ϕСb5, ϕСb8г, ϕСb12г, ϕСb2Зr, 7s и PRR1. Могут быть полезны клеточные линии, стабильно экспрессирующие, среди прочего, разделенный мертвый C2c1 или разделенный мертвый C2c3.

[00488] Заявители показывают, что белок C2c1 или C2c3 может быть разделен на два различных фрагмента, который составляет функциональную полноразмерную нуклеазу C2c1 или C2c3 при объединении с помощью химической индукции. Архитектура разделенного C2c1 или разделенного C2c3 будет полезна при различных способах применения. Например, разделенный C2c1 может позволить генетические стратегии ограничения активности C2c1 определенными клеточными популяциями, путем помещения каждого фрагмента под контроль тканеспецифического промотора или разделенный C2c3 может позволить генетические стратегии ограничения активности C2c1 определенными клеточными популяциями, путем помещения каждого фрагмента под контроль другого тканеспецифического промотора. Кроме того, могут быть использованы различные химически индуцируемые димеризационные домены, такие как APA и гиббереллин.

[00489] Источником энергии индукции предпочтительно является химическая индукция.

[00490] Положение или место разделение представляет собой точку, в которой первая часть фермента C2c1 или C2c3 отделена от второй части. В некоторых вариантах осуществления первая часть включает или кодирует аминокислоты с 1 по Х, в то время как вторая часть включает аминокислоты с Х+1 по последнюю. В этом примере нумерация непрерывна, но это может быть не всегда необходимо, поскольку аминокислоты (или кодирующие их нуклеотиды) могут быть отрезаны с каждого из разделенных концов, так чтобы присутствовала достаточная ДНК-связывающая активность и, необязательно, ДНК-никазная или расщепляющая активность, например, по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% активность, по сравнению с C2c1 дикого типа или C2c3 дикого типа.

[00491] Иллюстративная нумерация, описанная в настоящем описании, может относиться к белку дикого типа, предпочтительно C2c1 дикого типа или C2c3 дикого типа. Однако предусматривается, что могут использоваться мутанты C2c1 дикого типа, такого как белок C2c1 Bacillus, или мутанты C2c3 дикого типа. Нумерация может не соответствовать точно нумерации C2c1 или C2c3, в частности, могут использоваться некоторые N- и C-концевые укорочения или делеции, но это можно учесть с помощью стандартных инструментов для выравнивания последовательностей. Ортологи также являются предпочтительными инструментами выравнивания последовательностей.

[00492] Таким образом, положение разделения может быть выбрано с использованием стандартных способов, например, на основе данных кристаллической структуры и/или предсказания структуры на основе компьютерного моделирования.

[00493] В идеальном случае положение разделения должно находиться внутри петли. Предпочтительно, чтобы положение разделения находилось там, где прерывание аминокислотной последовательности не приводит к частичному или полному разрушению структурного элемента (например, альфа-спирали или бета-листа). Часто лучшими вариантами являются неструктурированные участки (участки, которые не видны в кристаллических структурах, поскольку эти участки не структурированы в достаточной степени, чтобы быть "замороженными" в кристалле). Заявители могут для примера делать разделения в неструктурированных участках, которые экспонированы на поверхность C2c1 или C2c3.

[00494] Заявители могут следовать следующей методике, которая предоставлена в качестве предпочтительного примера и руководства. Поскольку неструктурированные участки не видны на кристаллических структурах, заявители соотносят окружающую аминокислотную последовательность кристалла с первичной аминокислотной последовательностью C2c1 или C2c3. Каждый неструктурированный участок может состоять из, к примеру, 3-10 аминокислот, которые не видны в кристаллической структуре. В таком случае заявители делают разделение в этом участке аминокислотной последовательности. Чтобы включить больше потенциальных участков разделения, заявители включают разделения, расположенные на петлях снаружи от C2c1 или C2c3, используя те же критерии, что и в случае неструктурированных участков.

[00495] В некоторых вариантах осуществления положение разделения находится на наружной петле C2c1 или C2c3. В других предпочтительных вариантах осуществления положение разделения находится в неструктурированном участке C2c1 или C2c3. Неструктурированный участок обычно представляет собой высокоподвижный участок снаружи от петли, структура которого не может быть определена на основе кристаллической решетки.

[00496] Как только положение разделения идентифицировано, могут быть спроектированы подходящие композиции.

[00497] Обычно NES на находится на N-конце первой части разделенной аминокислотной последовательности (или на 5'-концевом нуклеотиде, кодирующем ее). В таком случае NLS расположен на С-конце второй части разделенной аминокислотной последовательности (или на 3'-концевом нуклеотиде, кодирующем ее), таким образом, первая слитая конструкция C2c1 или C2c3 может быть функционально связана с одним или более NES, а вторая слитая конструкция C2c1 или C2c3 может быть функционально связана с одним или более NLS.

[00498] Конечно, может предусматриваться обратный порядок, при котором NLS находится на N-конце первой части разделенной аминокислотной последовательности (или на 5'-концевом нуклеотиде, кодирующем ее). В таком случае NES расположен на С-конце второй части разделенной аминокислотной последовательности (или на 3'-концевом нуклеотиде, кодирующем ее), таким образом, первая слитая конструкция C2c1 или C2c3 может быть функционально связана с одним или более NLS, и вторая слитая конструкция C2c1 или C2c3 может быть функционально связана с одним или более NES.

[00499] Разделенные системы, в которых две части (каждая из сторон разделенной системы) имеют приблизительно одинаковую длину, могут обладать преимуществами в отношении упаковки. Например, считается, что поддерживать стехиометрию между двумя частями проще, если транскрипты имеют приблизительно одинаковый размер.

[00500] В конкретных примерах N- и С-концевые части кодон-оптимизированного C2c1 человека, такого как C2c1, слиты с димеризационными доменами FRB и FKBP, соответственно. Такая организация может быть предпочтительной. Их можно поменять местами (т.е. N-конец слит с FKBP и C-конец слит с FRB). В конкретных примерах N- и С-концевые части кодон-оптимизированного C2c3 человека, такого как C2c3, слиты с димеризационными доменами FRB и FKBP, соответственно. Такая организация может быть предпочтительной. Их можно поменять местами (т.е. N-конец слит с FKBP и C-конец слит с FRB).

[00501] Использование линкеров, таких как (GGGGS)₃, является предпочтительным для отделения фрагмента C2c1 или фрагмента C2c3 от димеризационного домена. Остатки глицина являются наиболее гибкими, и остатки серина увеличивают вероятность того, что линкер будет находиться на внешней поверхности белка. В качестве альтернативы могут быть использованы линкеры (GGGGS)₆, (GGGGS)₉ или (GGGGS)₁₂. Другими предпочтительными альтернативами являются GGGGS)₁, (GGGGS)₂, (GGGGS)₄, (GGGGS)₅, (GGGGS)₇, (GGGGS)₈, (GGGGS)₁₀ или (GGGGS)₁₁.

[00502] Например, (GGGGS)₃ может быть включен между N-концом фрагмента C2c1 или фрагмента C2c3 и FRB. Например, (GGGGS)₃ может быть включен между FKBP и C-концом фрагмента C2c1 или фрагмента C2c3.

[00503] Возможны также и альтернативные линкеры, но считается, что высокоподвижные линкеры функционируют лучше всего, обеспечивая максимальную вероятность объединения C2c1 или C2c3 и, таким образом, восстановления активности C2c1 или C2c3. Одной из альтернатив является использование в качестве линкера NLS нуклеоплазмина.

[00504] Линкер также может использоваться для соединения C2c1 или C2c3 и любого функционального домена. Опять же, между C2c1 или C2c3 или функциональным доменом может быть использован линкер (GGGGS)₃ (или 6-, 9- или 12-кратные повторы) или NLS нуклеоплазмина.

[00505] Предусматриваются альтернативы системе FRB/FKBP, например, система АВА и гиббереллин.

[00506] Соответственно, предпочтительными примерами семейства FKBP являются любые из следующих индуцибельных систем: FKBP, который димеризуется с кальциневрином А (CNA) в присутствии FK506, FKBP, который димеризуется с CyP-Fas в присутствии FKCsA, FKBP, который димеризуется с FRB в присутствии рапамицина, GyrB, который димеризуется с GryB в присутствии кумермицина, GAI, который димеризуется с GID1 в присутствии гибберреллина, Snap-tag, который димеризуется с HaloTag в присутствии HaXS.

[00507] Альтернативы внутри семейства FKBP также являются предпочтительными. Например, FKBP, который гомодимеризуется (т.е. один FKBP димеризуется с другим FKBP) в присутствии FK1012. Таким образом, также предусматривается не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии система C2c1 или CRISPR-Cas C2c3, содержащая:

первую слитую конструкцию C2c1 или первую слитую конструкцию C2c3, связанную с первой половиной индуцибельного гомодимера, и вторую слитую конструкцию C2c1 или вторую слитую конструкцию C2c3, связанную со второй половиной индуцибельного гомодимера,

причем первая слитая конструкция C2c1 или первая слитая конструкция C2c3 функционально связана с одним или более NLS, причем первая слитая конструкция C2c1 или первая слитая конструкция C2c3 функционально связана с (необязательно одним или более) сигналом(ами) ядерного экспорта,

причем взаимодействие с источником энергии индукции объединяет первую и вторую половины индуцибельного гомодимера,

при этом объединение первой и второй половин индуцибельного гомодимера позволяет первой и второй слитым конструкциям C2c1 восстановить функциональную систему CRISPR-Cas C2c1 или первой и второй слитым конструкциям C2c3 восстановить функциональную систему CRISPR-Cas C2c3,

причем система C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 содержит направляющую РНК (гРНК), содержащую направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени клетки, и функциональная система C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 связывается с последовательностью-мишенью и необязательно редактирует геномный локус, изменяя экспрессию гена.

[00508] В одном варианте осуществления гомодимер предпочтительно представляет собой FKBP, и источником энергии индукции предпочтительно является FK1012. В другом варианте осуществления гомодимер предпочтительно представляет собой GryB, и источником энергии индукции предпочтительно является кумермицин. В другом варианте осуществления гомодимер предпочтительно представляет собой АВА, и источником энергии индукции предпочтительно является гиббереллин.

[00509] В других вариантах осуществления димер является гетеродимером. Предпочтительными вариантами гетеродимеров являются любые из следующих индуцибельных систем: FKBP, который димеризуется с кальциневрином А (CNA) в присутствии FK506, FKBP, который димеризуется с CyP-Fas в присутствии FKCsA, FKBP, который димеризуется с FRB в присутствии рапамицина, GyrB, который димеризуется с GryB в присутствии кумермицина, GAI, который димеризуется с GID1 в присутствии гибберреллина, Snap-tag, который димеризуется с HaloTag в присутствии HaXS.

[00510] Заявители использовали FKBP/FRB, поскольку эта система хорошо охарактеризована и оба домена достаточно малы (менее 100 аминокислот), что облегчает упаковку. Более того, рапамицин используется в течение длительного времени, и его побочные эффекты хорошо известны. Большие димеризационные домены (более 300 а.к.) также должны работать, но этом случае могут требоваться более длинные линкеры, чтобы сделать возможным восстановление C2c1 или C2c3.

[00511] В статье Paulmurugan and Gambhir (Cancer Res, August 15, 2005 65; 7413) обсуждается история системы FRB/FKBP/рапамицин. Другой полезной статьей является статья Crabtree et al. (Chemistry & Biology 13, 99-107, Jan 2006).

[00512] Например, конструируют один вектор, одну экспрессирующую кассету (плазмиду). гРНК находится под контролем промотора U6. Используются два различных разделенных C2c1 или разделенных C2c3. Конструкция разделенного C2c1 или разделенного C2c3 основана на первой слитой конструкции C2c1 или C2c3, фланкируемой NLS, в которой FKBP присоединен к С-концевой части разделенного C2c1 или разделенного C2c3 через глицин-сериновый линкер; и на второй слитой конструкции C2c1 или C2c3, фланкируемой NES, в которой FRB присоединен к N-концевой части разделенного C2c1 или разделенного C2c3 через глицин-сериновый линкер. Разделение первой и второй слитых конструкций C2c1 происходит во время транскрипции с помощью Р2А. Уровень образования инсерций-делеций в случае разделенного C2c1 или разделенного C2c3 в присутствии рапамицина является приблизительно таким же, как и в случае дикого типа, но значительно ниже, чем в случае дикого типа в отсутствие рапамицина.

[00513] Соответственно, предусматривается единственный вектор. Вектор содержит:

первую слитую конструкцию C2c1 или первую слитую конструкцию C2c3, соединенную с первой половиной индуцибельного димера, и вторую слитую конструкцию C2c1 или вторую слитую конструкцию C2c3, соединенную со второй половиной индуцибельного димера,

причем первая слитая конструкция C2c1 или первая слитая конструкция C2c3 функционально связана с одним или более сигналами ядерной локализации, причем первая слитая конструкция C2c1 или первая слитая конструкция C2c3 функционально связана с одним или более сигналами ядерного экспорта,

причем взаимодействие с источником энергии индукции объединяет первую и вторую половины индуцибельного гомодимера,

при этом объединение первой и второй половин индуцибельного гомодимера позволяет первой и второй слитым конструкциям C2c1 восстановить функциональную систему CRISPR-Cas C2c1 или первой и второй слитым конструкциям C2c3 восстановить функциональную систему CRISPR-Cas C2c3,

причем система C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 содержит направляющую РНК (гРНК), содержащую направляющую последовательность, способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени клетки, и функциональная система C2c1 или CRISPR-Cas C2c3 связывается с последовательностью-мишенью и необязательно редактирует геномный локус, изменяя экспрессию гена.

Эти элементы предпочтительно предоставляются на единственной конструкции, например, в составе экспрессирующей кассеты.

[00514] Первая слитая конструкция C2c1 или первая слитая конструкция C2c3 предпочтительно фланкирована по меньшей мере одним сигналом ядерной локализации на каждом конце. Вторая слитая конструкция C2c1 или вторая слитая конструкция C2c3 предпочтительно фланкирована по меньшей мере одним сигналом ядерного экспорта на каждом конце.

[00515] Также предусматривается способ лечения индивидуума, нуждающегося в этом, включающий индукцию редактирования гена путем трансформации индивидуума полинуклеотидом, кодирующим систему, или любым векторов, описанных в настоящем описании, и введение индивидууму источника энергии индукции. В одном из возможных аспектов применения указанного способа также может быть предоставлена матрица репарации, например, доставляемая вектором, содержащим указанную матрицу репарации.

[00516] Также предусматривается способ лечения индивидуума, нуждающегося в этом, включающий индукцию редактирования гена путем трансформации индивидуума полинуклеотидом, кодирующим систему, или любым векторов, описанных в настоящем описании, причем упомянутый полинуклеотид кодирует или включает каталитически неактивный C2c1 или C2c3 и один или более ассоциированных функциональныъ доменов; кроме того, способ включает введение индивидууму источника энергии индукции.

[00517] Также предусматриваются композиции, содержащие систему по настоящему изобретению для применения в упомянутом способе лечения. Также предусматривается способ использования системы по настоящему изобретению в производстве лекарственных средств для таких способов лечения.

[00518] Примеры синдромов, которые можно лечить с помощью системы по настоящему изобретению, описаны в настоящем описании или в документах, цитированных в настоящем описании.

[00519] Единственный вектор может включать агент, разделяющий траснкрипт, например, Р2А. Р2А разделяет транскрипт на два, разделяя первую и вторую слитые конструкции C2c1 или первую и вторую слитые конструкции C2c3. Разделение происходит за счет пропускания рибосомы. По сути, рибосома пропускает аминокислоту во время трансляции, что вызывает обрыв аминокислотной цепи и приводит к образованию двух различных полипептидов/белков. Использование единственного вектора также полезно, когда низкая фоновая активность не является необходимой, но желательна высокая активность индукции.

[00520] Одним из примеров может служить поколение линий клональных эмбриональных стволовых клеток. Нормальная процедура состоит во временной трансфекции плазмидами, кодирующими C2c1 дикого типа или C2c1-никазы, или C2c3 дикого типа или C2c3-никазы. Эти плазмиды продуцируют молекулы C2c1 или C2c3, которые остаются активными в течение нескольких дней и имеют более высокую вероятность нецелевой активности. Использование единственного экспрессинного вектора с разделенным C2c1 или разделенным C2c3 позволяет ограничить "высокий" уровень активности C2c1 или C2c3 до более короткого периода времени (например, одна доза индуктора, такого как рапамицин). Без непрерывного (ежедневного) введения индуктора (например, рапамицина) активность единственного экспрессионного вектора с разделенным C2c1 или разделенным C2c3 является низкой, таким образом, снижая вероятность возникновения нежелательных нецелевых эффетов.

[00521] Пик индуцированной активности C2c1 или C2c3 обладает преимуществами в некоторых вариантах осуществления и может быть легко достигнут с использованием единственного доставляющего вектора, но это также возможно при использовании двойной векторной системы (каждый вектор доставляет одну половину разделенного C2c1 или разделенного C2c3). Пик может представлять собой высокую активность и короткий период времени, обычно совпадающий со временем полужизни индуктора.

[00522] Соответственно, предусматривается способ получения линий клональных стволовых клеток, включающий трансфекцию одной или более эмбриональных стволовых клеток полинуклеотидом, кодирующим систему по настоящему изобретению, или одним из векторов по настоящему изобретению для экспрессии разделенного C2c1 или разделенного C2c3 и введение или взаимодействие одной или более стволовых клеток с источником энергии индукции по настоящему изобретению для индукции восстановления C2c1 или C2c3. Может быть предоставлена матрица репарации.

[00523] Так же как и в случае всех способов, описанных в настоящем описании, желательно, чтобы подходящая гРНК или направляющие молекулы требовались.

[00524] В случае, когда функциональные домены и т.п. "ассоциированы" с одной и второй частью фермента, они обычно представляют собой слитые конструкции. Термин "ассоциирован с" используется в настоящем описании в отношении того, как одна молекула ассоциирует с другой, например, между частями C2c1 и функциональным доменом или между частями C2c3 и функциональным доменом. В случае белок-белковых взаимодействий эта ассоциация может рассматриваться с точки зрения узнавания, подобно тому, как антитело распознает эпитоп. Альтернативно, один белок может быть ассоциирован с другим белком слиянием обоих белков, например, когда одна субъединица слита с другой субъединицей. Слияние обычно осуществляется добавлением аминокислотной последовательности одной субъединицы к аминокислотной последовательности другой, к примеру, за счет сплайсинга обеих нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый белок или субъединицу. Альтернативно, это может, по существу, рассматриваться как связывание двух молекул или прямое соединение, как например, слитый белок; в любом случае в состав слитого белка может входить линкер между двумя представляющими интерес субъединицами (т.е. между ферментом и функциональным доменом или между адаптерным белком и функциональным доменом). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления части C2c1 или C2c3 связаны с функциональными доменами, поскольку они слиты друг с другом необязательно через промежуточный линкер. Примеры линкеров включают упомянутые линкеры GlySer.

[00525] Другие примеры индукторов включают свет и гормоны. В случае света, индуцибельные димеры могут являться гетеродимерами и содержать первую индуцируемую светом половину димера и вторую (или комплементарную) индуцируемую светом половину димера. Предпочтительным примером первой и второй индуцируемых светом половин димера является система CIBI и CRY2. Домен CIBI представляет собой гетеродимерный белок, связывающийся с светочувствительным криптохромом 2 (CRY2).

[00526] В другом примере синяя отвечающая на свет магнитная димеризационная система (pMag и nMag) может быть слита с двумя частями разделенного белка C2c1 или разделенного белка C2c3. В ответ на стимуляцию светом pMag и nMag димеризуются и происходит сборка C2c1 или C2c3. Например, такая система описана в отношении Cas9 в статье Nihongaki et al. (Nat. Bjofechnol. 33, 755-790, 2015).

[00527] Изобретение предусматривает, что источником энергии индукции может быть тепловая энергия, ультразвук, энергия электромагнитного излучения или химическая энергия. В предпочтительном варианте осуществления изобретения источник энергии индукции может представлять собой абсцизовую кислоту (АВА), доксициклин (DOX), кумат, рапамицин, 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ), эстроген или экдизон. Изобретение предусматривает по меньшей мере один переключатель, который может быть выбран из группы, включающей системы, индуцируемые антибиотиками, системы, индуцируемые электромагнитным излучением, индуцибельные системы на основе ядерных рецепторов и индуцибельные системы на базе гормонов. В более предпочтительном варианте осуществления может быть выбран по меньшей мере один переключатель из группы, включающей тетрациклин/доксициклиновую (Tet/DOX) индуцибельную систему, индуцируемую светом систему, индуцируемую АВА систему, куматовую репрессор/операторную индуцибельную систему, 4-ОНТ/экстрогеновую индуцибельную систему, индуцибельную систему на основе экдизона и индуцируемую FKBP12/FRAP (комплексом FKBP12-рапамицин) систему. Такие индукторы также обсуждаются в настоящем описании и в PCT/US20I3/051418, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[00528] В целом, C2c1 или C2c3, либо дикого типа, либо никазы, либо мертвые C2c1/C2c3 (связанные или не связанные с функциональными доменами) могут применяться с использованием подхода разделенного C2c1 или разделенного C2c3 по настоящему изобретению.

[00529] В качестве следующего примера, могут быть созданы слитые конструкции разделенного C2el или C2c3 с флуоресцентным белком, таким как GFP. Это могло бы позволить визуализировать геномные локусы (см. "Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System" Chen В et al. Cell 2013), но индуцируемым способом. По существу, в некоторых вариантах осуществления одна или более частей C2сl или C2c3 могут быть связаны (в частности, слиты) с флуоресцентным белком, например, GFP.

[00530] Следующие эксперименты направлены на то, чтобы выяснить, есть ли различие в нецелевом расщеплении между C2сl дикого типа и разделенным C2c1 или C2с3 дикого типа и разделенным C2c3. Для этого заявители используют временную трансфекцию плазмид с C2c1 wt и разделенным C2c1 или с C2c3 wt или разделенным C2c3 и осуществляют сбор в различные моменты времени. Заявители проводят поиск нецелевой активации после нахождения набора образцов, в которых целевое разрезание находится в пределах 5%. Заявители создают клеточные линии со стабильной экспрессией фермента дикого типа или разделенного фермента (C2c1 или C2с3) без направляющих нуклеиновых кислот (с помощью лентивируса). После селекции посредством антибиотика доставляются направляющие нуклеиновые кислоты с помощью отдельного лентивируса, и проводят сбор клеток в различные моменты времени для определения целевого и нецелевого разрезания.

[00531] Заявители вводят дестабилизирующую последовательность (PEST, см. "Use of mRNA- and protein- destabilizing elements to develop a highly responsive reporter system" Voon DC et al. Nucleic Acids Research 2005) в фрагмент FRB(N)C2c1-NES или фрагмент FRB(N)C2c3-NES, что способствует более быстрой деградации и последующему снижению стабильности комплекса разделенный мертвый C2c1-VP64 или комплекса разделенный мертвый C2c3-VP64.

[00532] Такие дестабилизирующие последовательности, описанные в других местах настоящей заявки (включая PEST), могут обладать преимуществами для использования в системах разделенного C2c1 или разделенного C2c3.

[00533] Получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие разделенный мертвый C2c1-VP64 и MS2-p65-HSFl+направляющие последовательности. Скрининг по устойчивости к PLZ может продемонстирировать, что необратимая, своевременная транскрипционная активация может быть эффективна для скрининга низкомолекулярных веществ. Этот подход может обладать преимуществами в случае, когда разделенный мертвый C2c1-VP64 является необратимым.

[00534] Получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие разделенный мертвый C2c3-VP64 и MS2-p65-HSFl+направляющие последовательности. Скрининг по устойчивости к PLZ может продемонстирировать, что необратимая, своевременная транскрипционная активация может быть эффективна для скрининга низкомолекулярных веществ. Этот подход может обладать преимуществами в случае, когда разделенный мертвый C2c3-VP64 является необратимым.

[00535] В одном аспекте изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии системе CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, которая может включать по меньшей мере один переключатель, при этом активность упомянутой системы CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 регулируется контактом по меньшей мере с одним источником энергии индукции в качестве переключателя. В одном варианте осуществления изобретения регуляция в отношении по меньшей мере одного переключателя или активность упомянутой системы CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 может быть активирована, усилена, прекращена или репрессирована. Первым эффектом может являться одно или более событий импорта в ядро, экспорта из ядра, привлечения вторичного компонента (такого как эффекторная молекула), конформационных изменений (белка, ДНК или РНК), расщепления, высвобождения груза (такого как присоединенная молекула или кофактор), ассоциации или диссоциации. Второй эффект может представлять собой одно или более событий активации, усиления, терминации или репрессии регуляции по меньшей мере одного переключателя или активности упомянутой системы CRISPR-Cas C2c1 или C2c3.

[00536] В другом аспекте изобретения система CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 может далее включать по меньшей мере один сигнал ядерной локализации (NLS), сигнал ядерного экспорта (NES), функциональный домен, подвижный линкер, мутацию, делецию, изменение или укорачивание. Один или более NLS, NES или функциональных доменов могут быть активированы или инактивированы в определенных условиях. В другом варианте осуществления мутация может представлять собой одну или более мутаций в области гомологии фактору транскрипции, мутаций в ДНК-связывающем домене (таких как мутация основных остатков основного мотива спираль-петля-спираль), мутаций в эндогенном NLS или мутаций в эндогенном NES. Изобретение предусматривает, что источник энергии индукции может представлять собой тепловую энергию, ультразвук, энергию электромагнитного излучения или химическую энергию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения источник энергии индукции может представлять собой антибиотик, низкомолекулярное соединение, гормон, производное гормона, стероид или стероидное производное, или в более предпочтительном варианте осуществления источник энергии индукции может представлять собой абсцизовую кислоту (АВА), доксициклин (DOX), кумат, рапамицин, 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ), эстроген или экдизон. Изобретение предусматривает, что по меньшей мере один переключатель может быть выбран из группы, состоящей из индуцибельных систем на основе антибиотиков, индуцибельных систем на основе электромагнитного излучения, индуцибельных систем на основе низкомолекулярных соединений, индуцибельных систем на основе ядерных рецепторов, индуцибельных систем на основе гормонов. В более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один переключатель может быть выбран из группы, состоящей из тетрациклин/доксициклиновой (Tet/DOX) индуцибельной системы, индуцируемой светом системы, индуцируемой АВА системы, куматовой индуцибельной системы репрессор/оператор, 4-ОНТ/экстрогеновой индуцибельной системы, индуцибельной системы на базе экдизона и индуцируемуой FKBP12/FRAP (комплексом FKBP12-рапамицин) системы.

[00537] Аспекты регуляции, подробно изложенные в настоящей заявке, относятся по меньшей мере к одному или более переключателю(ям). Как используют в настоящем описании, термин "переключатель" относится к системе или набору компонентов, которые действуют согласованно, вызывая изменение, охватывающее все аспекты биологической функции, такой как активация, репрессия, усиление или терминация этой функции. В одном аспекте термин "переключатель" охватывает генетические переключатели, которые включают основные компоненты белков, участвующих в генной регуляции, и конкретные последовательности ДНК, узнаваемые этими белками. В одном аспекте переключатели связаны с индуцибельными и репрессорными системами, используемыми в генной регуляции. В целом, индуцибельная система может быть выключена до тех пор, пока не будет присутствовать некоторая молекула (называемая индуктором), которая обеспечивает генную экспрессию. Эту молекулу называют "индуцирующей экспрессию". Способ, которым это явление опосредовано, зависит от регуляторных механизмов, так и различий типов клеток. Репрессорная система включена, за исключением случаев, когда присутствует некоторая молекула (называемая корепрессором), которая супрессирует генную экспрессию. Эту молекулу называют "репрессирующей экспрессию". То, как это происходит, зависит от регуляторных механизмов, а также различий в типах клеток. Как используют в настоящем описании, термин "индуцибельный" может заключать в себе все аспекты переключения независимо от вовлеченного в это молекулярного механизма. Соответственно, переключатель, предусматриваемый изобретением, может включать, но не ограничиваться ими, индуцибельные системы на основе антибиотиков, индуцибельные системы на основе электромагнитного излучения, индуцибельные системы на основе низкомолекулярных соединений, индуцибельные системы на основе ядерных рецепторов, индуцибельные системы на основе гормонов. В более предпочтительных вариантах осуществления переключатель может быть выбран из группы, состоящей из тетрациклин/доксициклиновой (Tet/DOX) индуцибельной системы, индуцируемой светом системы, индуцируемой АВА системы, куматовой индуцибельной системы репрессор/оператор, 4-ОНТ/экстрогеновой индуцибельной системы, индуцибельной системы на основе экдизона и индуцируемой FKBP12/FRAP (комплексом FKBP12-рапамицин) системы.

[00538] Система CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению может быть сконструирована для модулирования или изменения экспрессии индивидуальных эндогенных генов в точно определенные временные и пространственные промежутки. Система CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 может быть разработана, чтобы связываться с промоторными последовательностями гена-мишени и изменять экспрессию гена. C2c1 или C2c3 может быть разделен на две части, причем одна половина слита с одной половиной гетеродимера криптохрома-2 (CIB1), в то время как оставшийся партнер криптохрома слит с другой половиной C2c1 или C2c3. В некоторых аспектах также в систему CRISPR-Cas C2c1 или C2c3 может быть включен транскрипционный репрессорный домен. Эффекторные домены могут представлять собой как активаторы, такие как VP16, VP64 или p65, так и репрессоры, такие как KRAB, EnR и SID. При отсутствии стимуляции одна половина белка C2c1-криптохром-2 или белка C2c3-криптохром-2 локализуется в промоторной области гена-мишени, но не связана с CIB1-эффекторным белком. При стимуляции светом синей области спектра криптохром-2 активируется и подвергается конформационным изменениям и становится доступным его связывающий домен. CIB1, в свою очередь, связывается с криптохромом-2, что приводит к локализации второй половины C2c1 или второй половины C2c3 в промоторной области гена-мишени и инициации редактирования генома, которое может приводить к суперэкспресии или сайленсингу гена. Аспекты LITE далее описаны в статье Liu, H et al., Science, 2008 and Kennedy M et al. Nature Methods 2010, содержание которой включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[00539] Активаторные и репрессорные домены, которые могут далее модулировать функции, могут быть выбраны, исходя из вида, силы, механизма, длительности, размера или любого числа других параметров. Предпочтительные эффекторные домены включают, но не ограничиваются ими, транспозазный домен, интегразный домен, рекомбиназный домен, резольвазный домен, инвертазный домен, протеазный домен, ДНК-метилтрансферазный домен, домен ДНК-деметилазы, гистонацетилазный домен, домен гистоновой деацетилазы, нуклеазный домен, репрессорный домен, активационный домен, домен, содержащий сигнал ядерной локализации, домен белков, рекрутирующих транскрипционные белки, домен, ассоциированный с поглощением веществ клеткой, домен, связывающий нуклеиновые кислоты, антигенпрезентирующий домен.

[00540] Существуют также несколько способов получения химически индуцибельных систем:

1. Система на основе ABI-PYL, индуцируемая абсцизовой кислотой (ABA) (см., например, вебсайт stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/sigtrans;4/1.64/rs2),

2. Система на основе FKBP-FRB, индуцируемая рапамицином (или аналогами на основе рапамицина) (см., например, вебсайт nature.com/nmeth/joumal/v2/n6/full/nmeth763.html),

3. Система на основе GID1-GAI, индуцируемая гиббереллином (GA) (см., например, вебсайт nature.com/nchembio/journal/v8/n5/full/nchembio.922.html).

[00541] Другая система, предусматриваемая настоящим изобретением, представляет собой химически индуцируемую систему на основе изменения внутриклеточной локализации. Заявители также предлагают систему CR1SPR-Cas C2c1 или C2c3, разработанную для нацеливания на геномный локус-мишень, причем фермент CR1SPR-Cas C2c1 или C2c3 разделен на две слитых конструкции, которые далее связаны с различными частями химически или энергетически чувствительного белка. Химически или энергетически чувствительный белок индуцирует изменения во внутриклеточной локализации любой половины фермента C2c1 или C2c3 (т.е. транспорт любой половины фермента C2c1 или C2c3 из цитоплазмы в ядро клетки) при связывании химического соединения или переносе энергии химически или энергетически чувствительному белку. Этот транспорт слитых конструкций из одного внутриклеточного компартмента или органеллы, в которых активность секвестрируется в силу отсутствия субстрата для восстановленной системы CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, в другой, в котором присутствует субстрат, позволяет компонентам объединиться и восстановить ее функциональную активность и затем провзаимодействовать с субстратом-мишенью (т.е. геномной ДНК в ядре млекопитающего) и привести к активации или репрессии экспрессии гена-мишени.

[00542] Предусматриваются другие индуцибельные системы, такие как, но не ограничиваются ими, регуляция тяжелыми металлами [Mayo KE et al., Cell AC 29:99-108; Searle PF et al., Mol Cell Biol. 1985, 5:1480-1489 and Brinster RL et al., Nature (London) 1982, 296:39-42], стероидными гормонами [Hynes NE et al., Proc Natl Acad Sci USA 181, 78:2038-2042; Klock G et al., Nature. (London) 1987, 329:734-736 и Lee F et al.. Nature (London) 1981, 294:228-232.], тепловым шоком [Nouer L: Heat Shock Response. Boca Raton, FL: CRC; 1991] и другими разработанными реагентами [Mullick A, Massie B: Transcription, translation and the control of gene expression. In Encyclopedia of Cell Technology Edited by: Speir RE. Wiley; 2000:1140-1164 and Fussenegger M,. Biotechnol Prog 2001, 17:1-51]. Однако в случае этих индуцибельных промоторов млекопитающих есть ограничение, заключающееся в «утечках» промоторов в «выключенном» состоянии и плейотропный эффект индукторов (теплового шока, тяжелых металлов, глюкокортикоидов и др.). Использование гормонов насекомых (экдизона) предложено в попытке снизить влияние на внутриклеточные процессы в клетках млекопитающих [No D et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93:3346-3351]. В другой предпочтительной и хорошо продуманной системе в качестве индуктора используется рапамицин [Rivera VM et al., Nat Med 1996. 2:1028-1032], но иммуносупрессорное действие рапамицина является основным ограничением для его использования in vivo, и поэтому было необходимо найти биологически инертное соединение [Saez E et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97:14512-14517] для регуляции генной экспрессии.

[00543] В конкретных вариантах осуществления системы редактирования генов, описанные в настоящем описании, находятся под контролем закодированного переключателя-убийцы, который является механизмом, эффективно обеспечивающим гибель клетки-хозяина, когда условия в клетке изменяются. Это обеспечивается введением гибридных транскрипционных факторов семейства LacI-GalR, для включения которых требуется присутствие IPTG (Chan et al. 2015 Nature Nature Chemical Biology doi:10.1038/nchembio.1979), что может быть использовано для индукции гена, кодирующего фермент, необходимый для выживания клетки. Комбинируя различные транскрипционные факторы, чувствительные к различным химическим веществам, можно создавать "код". Эта система может быть использована для временного и пространственного контроля распространения генетических модификаций, индуцируемых CRISPR, что может представлять интерес, когда необходимо избежать "выхода" GMO из предполагаемой ниши.

Доставка в целом

Редактирование гена или изменение локуса-мишени с помощью C2c1 или C2c3

[00544] Двуцепочечный разрыв или одноцепочечный разрыв в одной из цепей должен находиться достаточно близко к целевой позиции, таким образом, чтобы происходила репарация. В одном из возможных вариантов осуществления расстояние не должно превышать 50, 100, 200, 300, 350 или 400 нуклеотидов. Без связи с теорией, полагают, что разрыв должен находиться достаточно близко к целевой позиции, чтобы разрыв находился внутри области, которая предназначена для удаления посредством экзонуклеаз при удалении концов. Если расстояние между целевой позицией и разрывом слишком велико, мутация может не быть включена в удаление концов и, следовательно, не может быть репарирована, поскольку последовательность матричной нуклеиновой кислоты может быть использована для репарации последовательности только в пределах области удаления концов.

[00545] В одном из возможных вариантов осуществления, в котором направляющая РНК и молекула типа V/типа VI, в частности, C2c1/C2c3, или их ортолог или гомолог, предпочтительно нуклеаза C2c1 или C2c3, индуцирует двуцепочечный разрыв для индукции гомологичной репарации, участок расщепления находится в пределах 0-200 нуклеотидов (например, 0-175, 0-150, 0-125, 0-100, 0-75, 0-50, 0-25, 25-200, 25-175, 25-150, 25-125, 25-100, 25-75, 25-50, 50-200, 50-175, 50-150, 50-125, 50-100, 50-75, 75-200, 75-175, 75-150, 75-1 25, 75-100 нуклеотидов) от целевой позиции. В одном из возможных вариантов осуществления сайт расщепления находится в пределах 0-100 нуклеотидов (например, 0-75, 0-50, 0-25, 25-100, 25-75, 25-50, 50-100, 50-75 или 75-100 нуклеотидов) от целевой позиции. В следующем варианте осуществления две или более направляющих РНК в комплексе с C2c1 или C2c3, или их ортологом или гомологом, могут быть использованы для внесения множественных разрывов для индукции гомологичной репарации.

[00546] Плечо гомологии должно охватывать по меньшей мере тот участок, в котором может произойти удаление концов, например, чтобы обеспечить поиск удаленными одноцепочечными выступающими нуклеотидами комплементарного участка в пределах донорской матрицы. Полная длина может быть ограничена такими параметрами как размер плазмиды или пределы упаковывания с помощью вируса. В одном из возможных вариантов осуществления плечо гомологии может не достигать повторяющихся элементов. Типичная длина плеча гомологии включает по меньшей мере 50, 100, 250, 500, 750 или 1000 нуклеотидов.

[00547] Упомянутая здесь целевая позиция относится к участку в нуклеиновой кислоте-мишени или гене-мишени (например, хромосоме), который модифицируется молекулой типа V/типа VI, в частности, C2c1/C2c3 или их ортологом или гомологом, предпочтительно в ходе процесса, зависящего от молекулы C2c1 или C2c3. Например, в целевой позиции может происходить расщепление нуклеиновой кислоты-мишени молекулой модифицированного C2c1 или C2c3, и модификация, направляемая матричной нуклеиновой кислотой. Модификация может представлять собой, например, коррекциую (репарациую) целевой позиции. В одном из возможных вариантов осуществления целевая позиция может являться сайтом между двумя нуклеотидами, например, прилегающими нуклеотидами, на нуклеиновой кислоте, к которой добавляются один или более нуклеотидов. Целевая позиция может содержать один или более нуклеотидов, которые подвергаются изменениям, например, репарации с помощью матричной нуклеиновой кислоты. В одном из возможных вариантов осуществления целевая позиция может находиться в пределах последовательности-мишени (например, последовательности, с которой связывается направляющая). В одном из возможных вариантов осуществления целевая позиция находится выше или ниже последовательности-мишени (например, последовательности, с которой связывается направляющая РНК).

[00548] Матричная нуклеиновая кислота, как этот термин используют в настоящем описании, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая может быть использована в сочетании с молекулой типа V/типа VI, предпочтительно молекулой C2c1/C2c3 и молекулой направляющей РНК, чтобы изменить структуру целевой позиции. В одном из возможных вариантов осуществления нуклеиновая кислота-мишень модифицирована так, чтобы она содержала часть или всю последовательности матричной нуклеиновой кислоты, обычно рядом или в самом сайте (самих сайтах) расщепления. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота является двуцепочечной. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В другом варианте осуществления матричная нуклеиновая кислота является одноцепочечной ДНК.

[00549] В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота изменяет структуру целевой позиции, участвуя в гомологичной рекомбинации. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота изменяет структуру целевой позиции. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота приводит к включению модифицированного или не встречающегося в природе основания в нуклеиновую кислоту-мишень.

[00550] Матричная последовательность может подвергаться разрывам, опосредованным или катализируемым рекомбинацией с последовательностью-мишенью. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота может содержать последовательность, соответствующую участку на последовательности-мишени, который подвергается опосредованному C2c1 или C2c3 расщеплению. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота может содержать последовательность, соответствующую которая соответствует как первому участку в последовательности-мишени, расщепляемому в рамках первого опосредованного C2c1 или C2c3 события, так и второму участку в последовательности-мишени, расщепляемому в рамках второго опосредованного C2c1 или C2c3 события.

[00551] В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота может содержать последовательность, которая приводит к изменению в кодирующей последовательности транслируемой последовательности, например, последовательность, которая приводит к замене одной аминокислоты на другую в белковом продукте, например, трансформируя мутантный аллель в аллель дикого типа, трансформируя аллель дикого типа в мутантный аллель и/или внося стоп-кодон, вставку аминокислотного остатка или делецию аминокислотного остатка или нонсенс-мутацию. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота может содержать последовательность, которая приводит к изменению в некодирующей последовательности, например, изменению в экзоне или 5'- или 3'-нетранслируемой области (НТО) или нетранскрибируемой области. Такие изменения могут включать изменение в регуляторном элементе, например, промоторе, энхансере, или изменение в цис- или транс-регуляторном элементе.

[00552] Матричная нуклеиновая кислота, обладающая гомологией с целевой позицией в гене-мишени, может быть использована для изменения структуры последовательности-мишени. Матричная нуклеиновая кислота может быть использована для изменения нежелательной структуры, например, нежелательного или мутантного нуклеотида. Матричная нуклеиновая кислота может содержать последовательность, которая при интеграции приводит к: снижению активности позитивного регуляторного элемента; увеличению активности негативного регуляторного элемента; снижению экспрессии гена; увеличению экспрессии гена; увеличению устойчивости к синдрому или заболеванию; увеличению устойчивости к вирусному заражению; корректировке мутации или изменению нежелательного аминокислотного остатка, предоставляющего, увеличивающего, предотвращающего или снижающего биологическое свойство продукта гена, например, увеличение ферментативной активности фермента или увеличение способности продукта гена взаимодействовать с другой молекулой.

[00553] Матричная нуклеиновая кислота может содержать последовательность, которая приводит к изменениям в последовательности 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более нуклеотидов последовательности-мишени. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота может иметь длину 20+/-10, 30+/-10, 40+/-10, 50+/-10, 60+/-10, 70+/-10, 80+/-10, 90+/-10, 100-+/-10, 110+/-10, 120+/-10, 130+/-10, 140+/-10, 150+/-10, 160+/-10, 170+/-10, 1 80+/-10, 190+/-10, 200+/-10, 210+/-10 или 220+/-10 нуклеотидов. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота может иметь длину 30+/-20, 40+/-20, 50+/-20, 60+/-20, 70+/- 20, 80+/-20, 90+/-20, 100+/-20, 1 10+/-20, 120+/-20, 130+Л20, 140+/-20, I 50+/-20, 160+/-20, 170+/-20, 180+/-20, 190+/-20, 200+/-20, 210+/-20, 220+/-20 нуклеотидов. В одном из возможных вариантов осуществления матричная нуклеиновая кислота может иметь длину 10-1000, 20-900, 30-800, 40-700, 50-600, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200 или 50-100 нуклеотидов.

[00554] Матричная нуклеиновая кислота включает следующие компоненты: [5'-плечо гомологии]-[последовательность замены]-[3'-плечо гомологии]. Плечо гомологии обеспечивают рекомбинацию в хромосоме, заменяя, таким образом, нежелательный элемент, например мутацию или мотив, с помощью последовательности замены. В одном варианте осуществления гомологические плечи фланкируют самые отдаленные участки расщепления. В одном из вариантов осуществления 3'-конец 5'-плеча гомологии представляет собой положение рядом с 5'-концом последовательности замены. В варианте осуществления 5'-плечо гомологии может удлиняться по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 или 2000 нуклеотидов с 5'-стороны от 5'-конца последовательности замены. В варианте осуществления 5'-конец 3'-плеча гомологии представляет собой положение рядом с 3'-концом последовательности замены. В варианте осуществления 3'-плечо гомологии может включать по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 или 2000 нуклеотидов с 3'-стороны от 3'-конца последовательности замены.

[00555] В определенных вариантах осуществления одно или оба плеча гомологии могут быть укорочены, чтобы избежать включения определенных повторяющихся последовательностей. Например, 5'-плечо гомологии может быть укорочено, чтобы избежать включения повторяющейся последовательности. В других вариантах осуществления 3'-плечо гомологии может быть укорочено, чтобы избежать включения повторяющейся последовательности. В некоторых вариантах осуществления как 5'-, так и 3'-плечо гомологии может быть укорочено, чтобы избежать включения определенных повторяющихся последовательностей.

[00556] В определенных вариантах осуществления матричная нуклеиновая кислота для коррекции мутаций может быть сконструирована для использования в качестве одноцепочечных олигонуклеотидов. При использовании одноцепочечных олигонуклеотидов 5'- и 3'-плечо гомологии может иметь длину в диапазоне вплоть до 200 нуклеотидов, например, по меньшей мере 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 или 200 нуклеотидов.

Опосредованное системой комплекса эффекторного белка C2c1 или C2c3 негомологичное соединение концов

[00557] В некоторых вариантах осуществления индуцированное нуклеазами негомологичное соединение концов (NHEJ) может быть использовано для обеспечения специфических нокаутов генов. Индуцированное нуклеазами NHEJ также может быть использовано для удаления последовательности в гене-мишени. В целом, NHEJ репарирует двуцепочечный разрыв в ДНК путем соединения двух концов; однако, в целом, исходная последовательность восстанавливается только в случае, если два совместимых конца, точно в том виде, в котором они были образованы при двуцепочечном разрыве, точно лигированы. Концы двуцепочечного разрыва ДНК часто являются объектом ферментативных процессов, что приводит к добавлению или удалению нуклеотидов в случае одной или обеих цепей перед воссоединением концов. Это приводит к присутствию мутаций с вставками и/или делециями (инсерций-делеций) в последовательности ДНК в участке NHEJ-зависимой репарации. Две трети этих мутаций обычно изменяют рамку считывания и, следовательно, приводят к продукции нефункционального белка. Кроме того, мутации, которые сохраняют рамку считывания, но которые заключаются во вставке или делеции значительной части последовательности, могут сделать белок нефункциональным. Это зависит от локуса, поскольку вероятно, что мутации в критических функциональных доменах будут приводить к более значительным последствиям, что в некритических участках белков. Мутации в виде инсерций-делеций, внесенные посредством NHEJ, непредсказуемы по своей природе; однако в случае конкретного разрыва конкретные последовательности инсерций-делеций обладают большими преимуществами и более представлены в популяции, наиболее вероятно, за счет коротких участков микрогомологии. Длина делеций может значительно варьировать; наиболее часто она находится в диапазоне 1-50 нуклеотидов, но она может и превышать 50 нуклеотидов, например, достигая длины, превышающей 100-200 нуклеотидов. Вставки обычно являются более короткими и часто включают короткие дупликации последовательности, непосредственно окружающие сайт разрыва. Однако возможно обеспечить длинные вставки, и в этих случаях вставленная последовательность часто может отслеживаться в других участках генома или на плазмидной ДНК, присутствующей в клетках.

[00558] Поскольку NHEJ-зависимая репарация является мутагенным процессом, она может использоваться для удаления мотивов последовательностей, если образование специфической финальной последовательности не требуется. Если мишень двуцепочечного разрыва должна быть рядом с короткой последовательностью-мишенью, делеционные мутации, вызываемые NHEJ-зависимой репарацией, часто охватывают и, следовательно, удаляют нежелательные нуклеотиды. Для делеции более длинных сегментов ДНК внесение двух двуцепочечных разрывов, одного с каждой стороны последовательности, может приводить к негомологичному соединению концов (NHEJ) с последующим полным удаление лежащей между ними последовательности. Оба этих подхода могут быть использованы для удаления определенных последовательностей ДНК; однако природа негомологичного соединения концов, ведущая к высокой вероятности ошибок, может вызывать образование инсерций-делеций в участке репарации.

[00559] Обе индуцирующие двуцепочечный разрыв типа V/типа VI, молекулы в частности, C2c1/C2c3, или их ортологи или гомологи, предпочтительно молекулы C2c1 или C2c3, или индуцирующие одноцепочечный разрыв (никазы) молекулы типа V/типа VI, в частности, C2c1/C2c3, или их ортологи или гомологи, предпочтительно молекулы C2c1 или C2c3 могут быть использованы в описанных в настоящем описании способах и композициях для образования инсерций-делеций, опосредованных NHEJ-репарацией. NHEJ-опосредованные инсерции-делеции, нацеленные на ген, например кодирующую область, например, раннюю кодирующую область гена-мишени, могут быть использованы для нокаута (то есть устранения экспрессии) гена-мишени. Например, ранняя кодирующая область гена-мишени включает последовательность сразу после сайта начала транскрипции в пределах первого экзона кодирующей последовательности или в пределах 500 пар оснований от точки начала транскрипции (например, менее 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 нуклеотидов).

[00560] В одном из возможных вариантов осуществления, в которых направляющая РНК и молекула типа V/типа VI, в частности, C2c1/C2c3, или их ортолог или гомолог, предпочтительно нуклеаза C2c1 или C2c3, индуцирует двуцепочечный разрыв для индукции инсерций-делеций, опосредованных репарацией посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), направляющие РНК могут быть сконструированы так, чтобы позиция двуцепочечного находилась вблизи нуклеотида целевой позиции. В одном из возможных вариантов осуществления сайт расщепления может находиться в пределах 0-500 нуклеотидов от целевой позиции (например, меньше 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидов от целевой позиции).

[00561] В одном из возможных вариантов осуществления, в которых две направляющих РНК в комплексе с молекулами типа V/типа VI, в частности, C2c1/C2c3, или их ортологами или гомологами, предпочтительно никазами C2c1 или C2c3, индуцируют два одноцепочечных разрыва для индукции инсерций-делеций, опосредованных репарацией посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), две направляющих РНК могут быть разработаны так, чтобы позиции двух одноцепочечных разрывов были таковы, чтобы обеспечить репарацию нуклеотида в целевой позиции посредством NHEJ.

Комплексы эффекторного белка C2c1 или C2c3 могут доставлять функциональные эффекторные белки

[00562] В отличие от нокаута гена, опосредованного CRISPR-Cas, который перманентно элиминирует экспрессию мутантного гена на уровне ДНК, нокдаун с помощью CRISPR-Cas позволяет временно снизить экспрессию гена за счет использования искусственных транскрипционных факторов. Мутации ключевых остатков в обоих расщепляющих ДНК доменах белка C2c1 или C2c3 приводят к образованию каталитически неактивного C2c1 или C2c3. Каталитически неактивный C2c1 или C2c3 образует комплекс с направляющей РНК и локализуется на последовательности ДНК, определяемой доменом-мишенью направляющей РНК, однако не расщепляет ДНК-мишень. Слияние неактивного белка C2c1 или C2c3 с эффекторным доменом, например, транскрипционным репрессорным доменом, позволяет привлекать эффектор к любому участку ДНК, определяемому направляющей РНК. В определенных вариантах осуществления C2c1 или C2c3 могут быть слиты с транскрипционным репрессорным доменом и привлечены к промоторному участку гена. В частности, что касается генной репрессии, предполагается, что блокирование участка связывания эндогенного транскрипционного фактора может способствовать снижению уровня экспрессии гена. В другом варианте осуществления неактивный C2c1 или C2c3 может быть слит с белком, модицифицирующим хроматин. Изменение состояния хроматина может приводить к снижению экспрессии гена-мишени.

[00563] В одном из возможных вариантов осуществления молекула направляющей РНК может быть нацелена на известные транскрипционные респонсивные элементы (например, промоторы, энхансеры и т.п.), известные активирующие последовательности, находящиеся выше точки начала транскрипции, и/или последовательности известной или неизвестной функции, про которые предполагают, что они могут контролировать экспрессию целевой ДНК.

[00564] В некоторых способах полинуклеотид-мишень может быть инактивирован, чтобы осуществить модификацию экспрессии в клетке. Например, при связывании комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью в клетке, полинуклеотид-мишень инактивируется так, что последовательность не транскрибируется, кодируемый белок не продуцируется или последовательность не функционирует так, как функционирует последовательность дикого типа. Например, кодирующая последовательность белка или микроРНК может быть инактивирована так, чтобы белок не продуцировался.

[00565] В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR содержит одну или более мутаций, выбранных из перечня, состоящего из замен D917A, E1006A и D1225A, и/или одну или более мутаций в домене RuvC фермента CRISPR, или представляет собой другую мутацию, описанную в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR содержит одну или более мутаций в каталитическом домене, в котором во время транскрипции последовательность прямого повтора формирует одиночную шпильку и направляющая последовательность направляет специфическое для последовательности связывание с последовательностью-мишенью комплекса CRISPR, причем фермент далее включает функциональный домен. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен представляет собой транскрипционный репрессорный домен, предпочтительно KRAB. В некоторых вариантах осуществления транскрипционный репрессорный домен представляет собой SID и конкатемеры SID (SID4X). В некоторых вариантах осуществления функциональный домен представляет собой домен, вносящий эпигенетические модификации, если предоставлен белок, осуществляющий эпигенетические модификации. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен представляет собой активационный домен, который может являться активационным доменом Р65.

Доставка комплекса эффекторного белка C2c1 или C2c3 или его компонентов

[00566] В настоящем описании, а также из уровня техники, предусматривается, что TALE-нуклеазы, системы CRISPR-Cas или их компоненты, или их молекулы нуклеиновых кислот (в том числе, например, матрицу HDR), или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие или доставляющие их компоненты, могут быть доставлены системой доставки, описанной в настоящем описании как в общем виде, так и более подробно.

[00567] Векторная доставка, например, плазмидная, вирусная доставка: фермент CRISPR, например белок типа V, такой как C2c1 или C2c3, и/или любая из РНК по настоящему изобретению, например направляющая РНК, могут быть доставлены с использованием любого подходящего вектора, например, плазмидных или вирусных векторов, таких как аденоассоциированный вирус (AAV), лентивирус, аденовирус или другие типы вирусных векторов или их комбинации. Эффекторные белки и одна или более направляющих РНК могут быть упакованы в один или более векторов, например, плазмидные или вирусные векторы. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор, например, плазмидный или вирусный вектор, доставляется в целевую ткань, например, путем внутримышечной инъекции, в то время как в других случаях доставка осуществляется внутривенно, трансдермально, интраназально, перорально, через слизистые оболочки или другими способами доставки. Такая доставка может быть в виде единичной дозы либо в виде нескольких доз. Специалисту в данной области понятно, что фактическая дозировка, которая должна быть доставлена, может значительно варьироваться в зависимости от ряда факторов, таких как выбор вектора, тип клетки-мишени, самого организма или ткани, общее состояние пациента, желаемая степень трансформации/модификации, способ введения, режим введения, тип желаемой трансформации/модификации и т.д.

[00568] Такой препарат может в дальнейшем включать, например, носитель (в составе которого вода, водный раствор хлорида натрия, этанол, глицерин, лактоза, сахароза, фосфат кальция, желатин, декстран, агар, пектин, арахисовое масло, кунжутное масло и т.д.), растворитель, применяемый в фармакологии носитель (например, фосфатный солевой буфер), применяемый в фармакологии наполнитель и/или другие соединения, известные в данной области. Препарат, кроме того, может содержать одну или более применяемых в фармакологии солей, например, таких как соль неорганической кислоты, такая как гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат и т.д., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.д. Кроме того, также использоваться могут вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие, буферные растворы, гели или гелеобразователи, вкусовые добавки, красители, микросферы, полимеры, вещества, образующие суспензии и т.д. Кроме того, один или более других стандартно применяемых фармацевтических добавок, таких как консерванты, влагоудерживающие добавки, суспенизирующие добавки, поверхностно-активные добавки, антиоксиданты, противослеживающие добавки, наполнители, хелатирующие добавки, вещества оболочки, химические стабилизаторы и т.д. могут также быть использованы, особенно если дозировка имеет разбавленную форму. Подходящие иллюстративные компоненты включают микрокристаллическую целлюлозу, натрий карбокисметилцеллюлозу, полисорбат 80, фенилэтиловый спирт, хлорбутанол, сорбат калия, сорбиновую кислоту, двуокись серы, пропилгаллат, парабены, этилванилин, глицерин, фенол, парахлорофенол, желатин, альбумин и их комбинацию. Полное обсуждение применяемых в фармакологии наполнителей доступно в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub, Co., N.J. 1991), который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

[00569] В одном варианте осуществления изобретения, описанном в настоящем описании, доставка осуществляется с помощью аденовируса, который может быть доставлен в виде единичной вспомогательной дозы, содержащей по меньшей мере 1×10⁵ частиц (также называемых единицами частиц, еч) аденовирусного вектора. В одном варианте осуществления изобретения настоящего изобетения, предпочтительная доза составляет по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ частиц (например, приблизительно 1×10⁶-1×10¹² частиц), более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁷ частиц, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁸ частиц (например, приблизительно 1×10⁸-1×10¹¹ частиц или приблизительно 1×10⁸-1×10¹² частиц), и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁹ частиц (например, приблизительно 1×10⁹-1×10¹⁰ частиц или приблизительно 1×10⁹-1×10¹² частиц), или даже по меньшей мере приблизительно 1×10¹⁰ частиц (например, приблизительно 1×10¹⁰-1×10¹² частиц) аденовирусного вектора. Альтернативно, доза включает не больше чем приблизительно 1×10¹⁴ частиц, предпочтительно не больше чем приблизительно 1×10¹³ частиц, еще более предпочтительно не больше чем приблизительно 1×10¹² частиц, еще более предпочтительно не больше чем приблизительно 1×10¹¹ частиц, и наиболее предпочтительно не больше чем приблизительно 1×10¹⁰ частиц (например, не больше чем приблизительно 1×10⁹ частиц). Таким образом, доза может содержать единственную дозу аденовирусного вектора, например, с приблизительно 1×10⁶ единиц частиц (еч), приблизительно 2×10⁶ еч, приблизительно 4×10⁶ еч, 1×10⁷ еч, приблизительно 2×10⁷ еч, приблизительно 4×10⁷ еч, приблизительно 1×10⁸ еч, приблизительно 2×10⁸ еч, приблизительно 4×10⁸ еч, приблизительно 1×10⁹ еч, приблизительно 2×10⁹ еч, приблизительно 4×10⁹ еч, приблизительно 1×10¹⁰ еч, приблизительно 2×10¹⁰ еч, приблизительно 4×10¹⁰ еч, приблизительно 1×10¹¹ еч, приблизительно 2×10¹¹ еч, приблизительно 4×10¹¹ еч, приблизительно 1×10¹² еч, приблизительно 2×10¹² еч или приблизительно 4×10¹² еч аденовирусного вектора. См., например, аденовирусные векторы в заявке на патент США № 8454972, B2 Nabel, et al., поданной 4 июня 2013 года, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, и в ее колонке 29, строки 36-58. В одном варианте осуществления изобретения, описанном в настоящем описании, аденовирус доставляется посредством нескольких доз.

[00570] В описанном в настоящем описании варианте осуществления изобретения доставка осуществляется через AAV. Терапевтически эффективная дозировка для in vivo доставки AAV человеку, как полагают, находится в диапазоне от приблизительно 20 приблизительно до 50 мл солевого раствора, содержащего от приблизительно 1×10¹⁰ до приблизительно 1×10¹⁰ раствора функционального AAV/мл. Дозировка может быть скорректирована для уравновешивания терапевтического эффекта и каких-либо побочных эффектов. В одном варианте осуществления изобретения, описанном в настоящем описнии, доза AAV обычно находится в следующем диапазоне концентраций: от приблизительно 1×10⁵ до 1×10⁵⁰ геномов AAV, от приблизительно 1×10⁸ до 1×10²⁰ геномов AAV, от приблизительно 1×10¹⁰ до приблизительно 1×10¹⁶ геномов или от приблизительно 1×10¹¹ до приблизительно 1×10¹⁶ геномов AAV. Дозировка для человека может составлять приблизительно 1×10¹⁶ геномов AAV. В таких концентрациях можно доставить от приблизительно 0,001 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мл или от приблизительно 10 до приблизительно 25 мл раствора-носителя. Другие эффективные дозировки могут быть легко определены квалифицированным специалистом в данной области посредством стандартных испытаний, на основе которых строится кривая зависимости ответа от дозы. См., например, заявку на патент США № 8404658 B2 Hajjar, et al., поданную 26 марта 2013 года, колонка 27, строки 45-60.

[00571] В одном варианте осуществления изобретения, описанном в настоящем описании, доставка производится через плазмиду. В случае таких плазмидных конструкций их дозировка должна быть достаточной для того, чтобы вызвать ответ. Например, подходящее количество ДНК-плазмиды в конструкциях плазмиды может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг, или от приблизительно 1 пг до приблизительно 10 пг на человека массой 70 кг. Плазмиды по изобретению обычно включают (i) промотор: (ii) последовательность, кодирующую нацеленный на нуклеиновую кислоту фермент CRISPR, функционально связанный с указанным промотором; (iii) селективный маркер; (iv) ориджин репликации; и (v) терминатор транскрипции, находящийся ниже и функционально связанный с (ii). Плазмида может также кодировать РНК-компоненты комплекса CRISPR, но один или более из них может кодироваться другим вектором.

[00572] Дозы, описанные в настоящем описании, основаны на средней массе человека, равной 70 кг. Определение частоты введения входит в компетенции практикующего медицинского или ветеринарного специалиста (например, врач, ветеринар) или ученого-специалиста в данной области. Также отмечается, что мыши, используемые в экспериментах, как правило, имеют массу приблизительно 20 г, и результаты экспериментов на мышах могут быть экстраполированы на индивида массой 70 кг.

[00573] В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулы РНК по изобретению доставляют в составе липосом или в составе, содержащим липофектин и т.п. и могут быть получены с помощью способов, известных специалисту в данной области. Такие способы описаны, например, в патентах США № 5593972, 5589466 и 5580859, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Системы доставки для на усиленной и улучшенной доставки миРНК в клетки млекопитающих были разработаны (см., например, Shen et al. FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 и Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724) и могут быть использованы в рамках настоящего изобретения. Недавно миРНК была успешно использована для ингибирования экспрессии генов у приматов (см., например, Tolentino et al., Retina 24(4):660) и может также быть применена в рамках настоящего изобретения.

[00574] Действительно, РНК-доставка является эффективным способом для доставки in vivo. Возможно доставить нацеленный на нуклеиновую кислоту Cas, белок Cas9 и направляющую РНК - гРНК (и, например, матрицу для репарации HR) в клетки с использованием липосом или частиц. Таким образом, доставка нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas/ фермента CRISPR, такого как Cas-белок Cas9 и/или доставка направляющих РНК по изобретения может производится в форме РНК с использованием микровезикул, липосом или частиц. Например, мРНК Cas и направляющая РНК могут быть упакованы в липосомальные частицы для доставки in vivo. Липосомальные реактивы для трансфекции, такие как липофектамин производства Life Technologies и другие реактивы, доступные на рынке, могут эффективно доставить молекулы РНК в печень.

[00575] Предпочтительно, чтобы средства доставки РНК также включали доставку РНК через наночастицы (Cho, S, Goldberg, M, Son, S, Xu, Q, Yang, F, Mei, Y, Bogatyrev, S, Langer, R, and Anderson, D, Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Materials, 19; 3112-3118, 2010) или экзосомы (Schroeder, A, Levins, C, Cortez, C, Langer, R, and Anderson, D, Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641). Действительно, экзосомы, как показано, особенно полезны при доставке миРНК, системы, обладающей некоторым сходством с системой нацеливания на РНК. Например, El-Andaloussi S et al. ("Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 Nov 15.) описали, что экзосомы являются многообещающим инструментом доставки лекарственных средств через различные биологические барьеры и могут использоваться для доставки миРНК in vitro и in vivo. Данный подход состоит в производстве экзосом-мишеней посредством трансфекции вектора экспрессии, включающего экзосомный белок, слитый с лигандом-пептидом. Экзосомы далее проходят очистку и для отделения от клеточного супернатанта, далее РНК загружают в экзосомы. Доставка или введение согласно изобретению могут быть произведены с применением экзосом, к примеру, но не ограничиваясь этим, в мозг. Витамин Е (α-токоферол) может быть связан с нацеленным на нуклеиновую кислоту белком Cas и доставлен в мозг вместе с липопротеином высокой плотности (HDL), например, аналогично тому, как это было сделано Uno et al. (HUMAN GENE THERAPY 22:711-719 (June 2011)) для доставки милой интерферирующей РНК (миРНК)) в мозг. Мышам проводились вливание с применением осмотического микронасоса (модель 1007D; Alzet, Cupertino, Калифорния, США) фосфатного солевого буфера (PBS) или свободных ToсsiBACE или Toc-siBACE/HDL и подсоединяли к набору для вливаний в мозг (Brain Infusion Kit 3, Alzet). Используемая для вливаний в мозг канюля помещалась примерно на 0,5 мм позади брегмы по центральной линии для вливания в третий дорзальный желудочек. Uno et al. установили, что не более 3 нмоль Toc-siRNA с HDL могут вызывать целевое уменьшение в степени, сравнимой с таковой при применении интракраниального способа введения (ICV). Сходная дозировка нацеленного на нуклеиновые кислоты эффекторного белка, конъюгированного с α-токоферолом и введенного совместно с нацеленным на мозг HDL, предполагается для человека в рамках настоящего изобретения, например, может предполагаться от примерно 3 нмоль до примерно 3 мкмоль нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка, нацеленного в мозг. Zou et al. (HUMAN GENE THERAPY 22:465-475 (April 2011)) описывают способ опосредованной лентивирусом доставки кшРНК, нацеленной на PKCγ для подавления экспрессии генов in vivo в спинном мозге крыс. Zou et all. вводили примерно 10 мкл рекомбинантного лентивируса, имеющего титр 1×10⁹ трансдуцирующих частиц (тч)/мл, через интратекальный катетер. Сходная дозировка нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка, экспрессированного с лентивирусного вектора, нацеленного в мозг, также может предполагаться в рамках настоящего изобретения, например, также предполагается примерно 10-50 мл нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка, направленного в мозг, с титром лентивируса 1×10⁹ трансдуцирующих частиц (тч)/мл.

[00576] В отношении локальной доставки в мозг, возможны различные ее пути. Например, материал может быть доставлен в стриатум, например, путем инъекции. Инъекция может быть произведена стереотактически при трепанации черепа.

[00577] Повышение эффективности NHEJ или HR также является полезным для такой доставки. Предпочтительно, чтобы эффективность NHEJ была усилена одновременно экспрессируемыми ферментами процессинга концов, такими как Trex2 (Dumitrache et al. Genetics. 2011 August: 188(4): 787-797). Предпочтительно, чтобы эффективность HR была увеличена временным ингибированием машинерией NHEJ, в частности, Ku70 и Ku86. Эффективность HR может также быть увеличена путем одновременной экспрессии прокариотических или эукариотических ферментов рекомбинации, таких как RecBCD, RecA.

Общая характеристика Упаковки и Промоторов

[00578] Способы упаковки молекул нуклеиновых кислот, кодирующих нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок (такой как белок типа V, например C2c1 или C2c3), например, ДНК, в векторы, например, вирусные векторы, для опосредования модификации генома in vivo включают:

Для достижения опосредованного NHEJ нокаута гена:

Вектор на основе одного вируса:

Вектор, содержащий две или более кассет экспрессии:

Промотор-направляющая РНК-терминатор

Промотор-направляющая РНК (N-конец)-терминатор (до предела размера вектора)

Двойной вирусный вектор:

Вектор 1, содержащий одну экпрессирующую кассету для управления экспрессией нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка (такого как белок типа V, например, C2c1 или C2c3)

Промотор-молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок-терминатор

Вектор 2, содержащий одну или более экспрессирующих кассет для управления экспрессией одной или более направляющей(их) РНК

Промотор-направляющая РНК 1-терминатор

Промотор-направляющая РНК 1 (N-конец)-терминатор (до предела длины вектора)

Для опосредования гомологичной репарации.

В дополнение к подходам с одиночным и двойными векторами, дополнительный вектор используется для доставки матрицы репарации на основе гомологии.

[00579] Промотор, используемый для управления экспрессией нуклеиновой кислоты, нацеленной на нуклеиновую кислоту эффекторным белком (таким как белок типа V, такой как C2c1 или C2c3) может включать:

ITR AAV может выступать в качестве промотора: это предпочтительно для того, чтобы избавиться от дополнительного промоторного элемента (который занимает место в векторе). Освобожденное в результате этого дополнительное пространство может быть использовано, чтобы управлять экспрессией дополнительных элементов (направляющая РНК и т.д.). Кроме того, активность ITR относительно слабее, так что он может использоваться для уменьшения потенциальной токсичности из-за сверхэкспрессии нацеленного на нуклеиновые кислоты эффекторного белка (такого как белок типа V, такой как C2c1 или C2c3).

Для повсеместной экспрессии можно использовать промоторы: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, тяжелых или легких цепей ферритина, и т.д.

Для экспрессии в мозге или другой экспрессии в ЦНС можно использовать промоторы: промотор синапсина I для всех нейронов, CaMKIIalpha для возбуждающих нейронов, GAD67, GAD65 или VGAT для GABA-ергических нейронов, и т.д.

Для экспрессии в печени можно использовать промотор альбумина.

Для экспрессии в легких можно использовать SP-B.

Для эндотелиальных клеток можно использовать ICAM.

Для гемопоэтических клеток можно использовать IFN-бета или CD45.

Для остеобластов можно использовать OG-2.

[00580] Промотор, используемый для нацеливания направляющей РНК, может включать:

промотор РНК-полимеразы III, такой как U6 или H1,

использование промотора РНК-полимеразы II и интронных кассет экспрессии направляющей РНК.

Аденоассоциированный вирус (AAV)

[00581] Нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок (такой как белок типа V, такой как C2c1 или C2c3) и одна или более направляющих РНК могут быть доставлены с использованием аденоассоциированного вируса (AAV), лентивируса, аденовируса или других плазмидных или вирусных типов векторов, в частности, с использованием лекарственных форм и доз, приведенных, например, в заявках на патент США №№ 8454972 (лекарственные формы, дозы для аденовируса), 8404658 (лекарственные формы, дозы для AAV) и 5846946 (лекарственные формы, дозы для ДНК-плазмид) и клинических испытаниях и публикациях на тему клинических испытаний, включающих лентивирус, AAV и аденовирус. Для примера, для AAV способ введения, лекарственная форма и доза приведены в заявке на патент США № 8454972 и в клинических испытаниях, включающих AAV. Для аденовируса способ введения, лекарственная форма и доза приведены в заявке на патент США № 8404658 и в клинических испытаниях, включающих аденовирус. Для доставки плазмиды способ введения, лекарственная форма и доза приведены в заявке на патент США № 5846946 и в клинических испытаниях, включающих плазмиды. Дозы могут быть разработаны на основе среднестатистического человека весом 70 кг (например, взрослого мужчину), и могут быть адаптированы для пациентов, индивидов, млекопитающих различного веса и вида. Частота введения находится в пределах компетенции медицинского или ветеринарного практика (например, врача, ветеринара), в зависимости от обычных факторов включая возраст, пол, общее состояние здоровья, другие состояния пациента или индивида, и конкретное представляющее интерес состояние и симптомы. Вирусные векторы могут быть введены в ткань-мишень. Для специфической для типа клетки модификации генома экспрессия нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка (такого как белок типа V, такой как C2c1 или C2c3) может находиться под контролем специфического для типа клетки промотора. Например, специфическая для печени экспрессия может происходить под контролем промотора альбумина, и специфическая для нейронов экспрессия (например, для нацеливания на расстройства центральной нервной системы) может происходить под контролем промотора синапсина I.

[00582] С точки зрения доставки in vivo AAV предпочтительнее других вирусных векторов по двум причинам:

-низкая токсичность (возможно, благодаря способу очистки, не требующему ультрацентрифугирования частей клетки, которые могут вызывать иммунную реакцию), и

-низкая вероятность возникновения инсерционного мутагенеза, потому что AAV не интегрируется в геном хозяина.

[00583] Предел упаковывания AAV составляет 4,5 или 4,75 т.п.н. Это означает, что нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок (такой как белок типа V, такой как C2c1 или C2c3), а также промотор и терминатор транскрипции должны быть помещены один и тот же вирусный вектор. Следовательно, варианты осуществления изобретения включают использование гомологов нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка (такого как белок типа V, такого как C2c1 или C2c3), которые короче.

[00584] Что касается AAV, то AAV может представлять собой AAV1, AAV2, AAV5 или любую комбинацию. Можно выбрать ААV, исходя из клеток, на которые проводят нацеливание; например, можно выбрать серотипы AAV 1, 2, 5 или AAV1, AAV2, AAV5 с гибридным капсидом или любую их комбинацию для нацеливания в клетки головного мозга или нейроны; можно выбрать AAV4 для нацеливания в сердечную ткань, AAV8 пригоден для доставки в печень. В рамках настоящего изобретения предпочтительными являются индивидуальные промоторы и векторы. Соответствие определенных серотипов AAV и типов клеток (см. Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887- 5911 (2008)) является следующим:

Лентивирус

[00585] Лентивирусы представляют собой сложные ретровирусы, способные заражать и экспрессировать свои гены как в митотических, так и в постмитотических клетках. Наиболее известным лентивирусом является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который использует гликопротеины вирусной оболочки других вирусов для нацеливания в широкий диапазон типов клеток.

[00586] Лентивирусы могут быть получены следующим образом. После клонирования pCasES10 (который содержит основу трансферной плазмиды лентивируса), HEK293FT при небольшом числе пересевов (p=5) были посеяны в колбе T-75 до 50% смыкания монослоя за день до трансфекции в DMEM с 10% эмбриональной бычьей сывороткой и без антибиотиков. Через 20 часов питательные среды заменяли на среду OptiMEM (без сыворотки) и трансфекция проводили через 4 часа. Клетки трансфицировали 10 мкг лентивирусной плазмиды для переноса (pCasES10) и следующими упаковочными плазмидами: 5 мкг pMD2.G (псевдотип VSV-g) и 7,5 мкг psPAX2 (gag/pol/rev/tat). Трансфекцию проводили в 4 мл OptiMEM со средством доставки катионных липидов (50 мкл Lipofectamine 2000 и 100 мкл реагента Plus). Через 6 часов питательную среду заменяли на DMEM без антибиотика с 10% эмбриональной бычьей сывороткой. В этих способах используется сыворотку во время культивирования, однако предпочтительными являются способы без сыворотки.

[00587] Лентивирус может быть очищен следующим образом. Вирусные супернатанты собирали через 48 часов. Супернатанты сначала очищали от дебриса и пропускали через 0,45-мкм фильтр с низким связыванием белков (PVDF). Затем их ультрацентрифугировали в течение 2 часов при скорости 24000 об/мин. Затем осадки с вирусом ресуспендировали в 50 мкл DMEM в течение ночи при 4°C. Потом их были разделяли на аликвоты и сразу же замораживали при -80°C.

[00588] В другом варианте осуществления изобретения также предусматривается минимальный вектор на основе лентивируса животного, отличного от примата, основанный на вирусе инфекционной анемии лошадей (EIAV), особенно для генотерапии глаза (см., например, Balagaan, J Gene Med 2006; 8; 275-285). В другом варианте осуществления изобретения также предусматривается RetinoStat®, лентивирусный вектор для генной терапии на основе вируса инфекционной анемии лошадей, экспрессирующий ангиостатические белки эндостатин и ангиостатин, доставляемый через субретинальную инъекцию для лечения возрастной дегенерации желтого пятна (см., например, Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (September 2012)) и этот вектор может быть изменен для использования в систему нацеливания на нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.

[00589] В другом варианте осуществления изобретения самоинактивирующиеся лентивирусные векторы с миРНК, нацеленной на экзон, общий для генов tat/rev ВИЧ, локализованной в ядрышке TAR-ловушки и анти-CCR5-специфического рибозима типа "hammerhead" (см, например, DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43), может использоваться и/ или быть адаптирован для использования в нацеленной на нуклеиновую кислоту системе по настоящему изобретению. Минимум 2,5×10⁶ CD34+ клеток на килограмм веса пациента могут быть получены предварительным стимулированием в течение 16-20 часов в питательной среде X-VIVO 15 (Lonza), содержащей 2 мкМ L-глютамина, фактор стволовых клеток (100 нг/мл), лиганд Flt-3 (Flt-3L) (100 нг/мл) и тромбопоэтин (10 нг/мл) (CellGenix) в плотности 2×10⁶ клеток/мл. Предварительно стимулированные клетки могут быть трансдуцированы лентивирусным вектором при множественности инфекции, равной 5, в течение 16-24 часов в 75-см² колбах для культивирования тканей, покрытых фибронектином (25 мг/см²) (RetroNectin, Takara Bio Inc.).

[00590] Лентивирусые векторы описаны для лечения для болезни Паркинсона, см., например, публикацию патентных заявок США № 20120295960, № 7303910 и № 7351585. Лентивирусые векторы описаны как способ лечения заболеваний глаз, см., например, публикации патентных заявок США № 20060281180, 20090007284, US20110117189; US20090017543; US20070054961, US20100317109. Лентивирусные векторы были также описаны как средство доставки в мозг, см., например, публикации патентных заявок США № US20110293571; US20110293571, US20040013648, US20070025970, US20090111106 и патент США № US7259015.

Доставка РНК

[00591] Доставка РНК: нацеленный на нуклеиновую кислоту белок Cas, например, белок типа V, такой как C2c1 или C2c3, и/или направляющая РНК, могут также быть доставлены в форме РНК. мРНК нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas (например, белка типа V, такого как C2c1 или C2c3) может быть получена с использованием транскрипции in vitro. мРНК нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas (например, белка типа V, такого как C2c1 или C2c3) может быть синтезирована с использованием ПЦР-кассеты, содержащей следующие элементы: промотор T7-последовательность Козака (GCCACC)-эффекторный белок-3'-нетранслируемая область (UTR) полиА-последовательности бета-глобина (последовательность из 120 или более остатков аденина). Такая кассета может быть использована для транскрипции с участием Т7-полимеразы. Направляющие РНК могут также быть транскрибированы путем транскрипции in vitro с кассеты, содержащей промотор T7-GG-последовательность направляющей РНК.

[00592] Для усиления экспрессии и уменьшения возможной токсичности последовательность, кодирующая нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок, и/или направляющая РНК могут быть модифицированы так, чтобы содержать один или более модифицированных нуклеозидов, например, с использованием псевдо-U или 5-метил-C.

[00593] Способы доставки мРНК в настоящее время представляются особенно перспективными для доставки в печень.

[00594] Значительные клинические усилия по доставке РНК были сфокусированы на РНК-i или антисмысловых молекулах, однако такие системы могут быть адаптированы для доставки РНК с целью осуществления настоящего изобретения. В соответствии с этим следует прочесть ссылки на РНК-I и т.д., приведенные ниже.

Системы доставки частиц и/или составов:

[00595] Несколько типов систем доставки частиц и/или составов нашли применение в широком спектре биомедицинских применений. В целом, частица определяется как малый объект, ведущий себя как целая единица в отношении ее перемещения и свойств. Далее частицы подразделяются в соответствии с диаметром. Крупные частицы соответствуют диапазону от 2500 до 10000 нанометров. Тонкие частицы имеют размер от 100 до 2500 нанометров. Ультратонкие частицы или наночастицы в целом от 1 до 100 нанометров в размере. Основой для выбора предела в 100 нм является проявление новых свойств, отличающих частицы от насыпного материала, которые обычно развиваются при переходном масштабе длины менее 100 нм.

[00596] Как используют в настоящем описании, система доставки частиц/лекарственная форма определяется как любая биологическая система доставки/лекарственная форма, которая включает частицу в соответствии с настоящим изобретением. Частица в соответствии с настоящем изобретением представляет собой любой объект, имеющий самое большое измерение (например, диаметр) менее 100 микронов (мкм). В некоторых вариантах осуществления изобретения частицы по изобретению имеют самое большое измерение менее 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение меньше, чем 2000 нанометров (нм). В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретени имеют самое большое измерение меньше, чем 1000 нанометров (нм). В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение меньше, чем 900 нм, 800 нм, 700 нм, 600 нм, 500 нм, 400 нм, 300 нм, 200 нм или 100 нм. Как правило, частицы по изобретению имеют самое большое измерение (например, диаметр) 500 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение (например, диаметр) 250 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение (например, диаметр) 200 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение (например, диаметр) 150 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления изобретения разработанные частицы имеют самое большое измерение (например, диаметр) 100 нм или меньше. Меньшие частицы, например, имеющие самое большое измерение 50 нм или меньше используется в некоторых вариантах осуществления изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения частицы по изобретению имеют самое большое измерение в диапазоне от 25 нм до 200 нм.

[00597] Охарактеризацию частиц (включая, например, морфологию, измерение, и т.д.) проводят с использованием ряд различных способов. Общие способы представляют собой электронную микроскопию (ТЕМ, SEM), атомно-силовую микроскопию (AFM), динамическое рассеяние света (DLS), рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS), порошковую рентгеновскую дифракцию (XRD), инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье (FTIR), времяпролетную матрично-активированную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI-TOF), оптическую спектроскопию, интерферометрию двойной поляризации и ядерный магнитный резонанс (NMR). Охарактеризация (измерение размеров) может быть проведена относительно нативных частиц (т.е. перед загрузкой) или после загрузки груза (в настоящем описании груз относится, например, к одному или более компонентам системы CRISPR-Cas, например, ферменту CRISPR, или мРНК, или направляющей РНК, или любой их комбинации, и может включать дополнительные носители и/или эксципиенты), чтобы обеспечить частицы оптимального размера для доставки в любом способе применения настоящего изобретения in vitro, ex vivo и/или in vivo. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения охарактеризация размеров частиц (например, диаметра) основана на измерении с использованием динамического рассеяния света (DLS). Упоминаются заявка на патент США № 8709843; заявка на патент США № 6007845, патент США № 5855913; патент США № 5985309; заявка на патент США № 5543158; и публикация James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014) опубликованная через интернет 11 мая 2014 года, doi:10.1038/nnano.2014.84, касающаяся частицы, способов их получения и применения и измерения.

[00598] Системы доставки частиц в рамках настоящего изобретения могут быть представлены в любой форме, включая, но не ограничиваясь ими, твердую, полутвердую, эмульсию или коллоидные частицы. По существу любые такие системы доставки, описанные в настоящем описании, включая, но не ограничиваясь ими, например, системы, основанные на липидах, липосомах, мицеллах, микровезикулах, экзосомах или генных пушках, могут быть предоставлены для доставки частиц в рамках настоящего изобретения.

Частицы

[00599] мРНК фермента CRISPR и направляющая РНК могут быть доставлены одновременно с использованием частиц или липидных вирусных оболочек; например, фермент CRISPR и РНК по изобретению, например, в виде комплекса, могут быть доставлены с помощью частиц согласно Dahlman et al., WO2015089419 A2 и документам, цитируемых в них, таких как 7C1 (см., например, работу James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014) опубликованную через интернет 11 мая 2014 года, doi:10.1038/nnano.2014.84), например, частица доставки, включающая липид или липидоид и гидрофильный полимер, например, катионный липид, и гидрофильный полимер, например, такой, где катионный липид включает 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP) или 1,2-дитетрадеканоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC) и/или где гидрофильный полимер включает этиленгликоль или полиэтиленгликоль (PEG); и/или где частица далее включает холестерин (например, частица состава 1=DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, холестерин 0; состава номер 2=DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, холестерин 0; состава номер 3=DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, холестерин 5), где частицы сформированы c использованием эффективного, многоступенчатого процесса, где сначала, эффекторный белок и РНК смешивают вместе, например, в молярном отношении 1:1, например, при комнатной температуре, например, в течение 30 минут, например, в стерильном, свободном от нуклеаз 1X PBS; и отдельно, DOTAP, DMPC, PEG и холестерин, как применимо для состава, растворяют в спирте, например, 100% этаноле; и, эти два раствора смешивают вместе, чтобы сформировать частицы, содержащие комплексы).

[00600] мРНК нацеленных на нуклеиновые кислоты эффекторных белков (таких как белки типа V, таких как C2c1 или C2c3) и направляющая РНК могут быть доставлены одновременно с использованием частиц или липидов вирусных оболочек.

[00601] Например, Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ ("In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles" Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87. doi: 10.1021/mpl00390w. Epub 2011 Apr 1) описывают биоразлагаемые структурированные частицы c ядром из поли(β-аминоэфира) (PBAE), окруженным фосфолипидным бислоем. Они были разработаны для доставки мРНК in vivo. pH-зависимый компонент PBAE был выбран, чтобы способствовать эндосомному разрушению, в то время как поверхностный липидный слой был выбран, чтобы минимизировать токсичность ядра поликатиона. Следовательно, такой способ предпочтителен для доставки РНК по настоящему изобретению.

[00602] В одном варианте осуществления изобретения рассмотрены частицы на основе самосборки биоадгезивных полимеров, которые могут быть применены для доставки пептидов в головной мозг различными способами доставки: пероральным, внутривенным, назальным. Также предусматриваются другие варианты осуществления, такие как пероральная и окулярная доставка гидрофобных лекарств. Технология молекулярной оболочки включает спроектированную полимерную оболочку, которая защищена и доставлена к области заболевания (см., например, Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026; Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1): 14-28; Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012. 161(2):523-36; Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6): 1665-80; Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6): 1764-74, Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6):458-68; Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5):681-688, Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7:S423-33; Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5):629-40; Qu, X. et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9 и Uchegbu, IF., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199). Предусматриваются дозы приблизительно 5 мг/кг с единичными или множественными дозами, в зависимости от ткани-мишени.

[00603] В одном варианте осуществления частицы, которые могут доставить РНК в злокачественную клетку, чтобы остановить рост опухоли, разработанные лабораторией Dan Anderson в MIT, могут использоваться/и или адаптированы для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. В частности, лаборатория Anderson разработала полностью автоматизированные, комбинаторные системы для синтеза, очистки, охарактеризации и составляения новых биоматериалов и нанолекарственных форм. См., например, Alabi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 6; 110(32): 12881-6; Zhang et al., Adv Mater. 2013 Sep 6;25(33):4641-5; Jiang et al., Nano Lett. 2013 Mar 13;13(3): 1059-64; Karagiannis et al., ACS Nano. 2012 Oct 23;6(10):8484-7; Whitehead et al., ACS Nano. 2012 Aug 28;6(8):6922-9 and Lee et al., Nat Nanotechnol. 2012 Jun 3,7(6):389-93.

[00604] Заявка на патент США 20110293703 касается липидоидных комплексов, особенно полезных при введении полинуклеотидов, которые могут быть применены для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. В одном аспекте аминоспиртовые липидоидные соединения комбинируют с агентом для доставки в клетку или индивидууму для формирования микрочастиц, наночастиц, липосом или мицелл. Агент, доставляемый частицами, липосомами или мицеллами, может быть в форме газа, жидкости или твердого тела, и агент может быть полинуклеотидом, белком, пептидом или низкомолекулярным соединением. Аминоспиртовые липидоидные соединения могут быть объединены с другими аминоспиртовыми липидоидными соединениями, полимерами (синтетическими или естественными), поверхностно-активными веществами, холестерином, углеводами, белками, липидами, и т.д. для формирования частиц. Затем эти частицы могут быть произвольно объединены с фармацевтическим наполнителем для получения фармацевтической композиции.

[00605] В заявке на патент США № 20110293703 также описаны способы получения аминоспиртовое липидоидное соединение. Одному или более эквивалентам амина позволяют реагировать с одним или более эквивалентами соединений с эпоксидной концевой группой, что при подходящих условиях позволяет сформировать аминоспиртовое липидоидное соединение по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения все аминогруппы амина полностью реагируют с эпоксидными концевыми группами с образованием третичных аминов. В других вариантах осуществления изобретения все аминогруппы амина не полностью реагируют с эпоксидными концевыми группами, таким образом, приводя к образованию первичных или вторичных аминов в аминоспиртовом липидоидном соединении. Эти первичные или вторичные амины сохраняют способность реагировать с другими электрофилами, такими как различные соединения с эпоксидной концевой группой. Как может оценить специалист в данной области, реакция амина с недостатком соединения с эпоксидными группами приводит ко множеству различных аминоспиртовых липидоидных соединений с различным числом хвостовых частей. Определенные амины могут быть полностью функционализированы двумя соединениями с эпоксидной концевой группой с образованием двух хвостовых частей, в то время как другие молекулы не являются полностью функционализированными соединениями с эпоксидной концевой группой с образованием хвостовых частей. Например, диамин или полиамин могут включать один, два, три, или четыре полученных из соединений с эпоксидной концевой группой хвостовых частей, присоединенных к разным аминогруппам молекулы, что приводит к образованию первичных, вторичных, и третичных аминов. В некоторых вариантах осуществления изобретения все аминогруппы не полностью функционализируются. В некоторых вариантах осуществления изобретения используются два соединения с эпоксидной концевой группой одного типа. В других вариантах осуществления изобретения используются два или более различных соединений с эпоксидными концевыми группами. Синтез аминоспиртовых липидоидных соединений может происходить с растворителем или без него, и синтез может быть выполнен при более высоких температурах в пределах 30-100°C, предпочтительно приблизительно при 50-90°C. Подготовленные аминоспиртовые липидоидные соединения необязательно могут быть очищены. Например, смесь аминоспиртовых липидоидных соединений может быть очищена, чтобы обеспечить аминоспиртовое липидоидное соединение с конкретным числом полученных из эпоксида составных хвостовых частей. Или смесь может быть очищена, чтобы привести к определенному стерео- или региоизомеру. Аминоспиртовые липидоидные соединения также могут быть алкилированы с использованием алкилгалогенида (например, метилиодида) или другого алкилирующего агента, и/или они могут быть ацилированы.

[00606] В заявке на патент США № 20110293703 также описаны библиотеки аминоспиртовых липидоидных соединений, полученных способами по изобретению. Эти аминоспиртовые липидоидные соединения могут быть получены и/или исследованы с использованием высокопроизводительных способов, включающих жидкостные манипуляторы, роботы, микропланшеты для титрования, компьютеры, и т.д. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминоспиртовые липидоидные соединения подвергают скринингу в отношении их способности трансфицировать полинуклеотиды или другие агенты (например, белки, пептиды, маленькие молекулы) в клетку.

[00607] Заявка на патент США № 20130302401 касается класса поли(бета-аминоспиртов) (PBAA), которые получают с помощью комбинаторной полимеризации. Разработанные PBAA могут использоваться в биотехнологии и биомедицинских способах применения как покрытия (такие как покрытия пленок или многослойных пленок для медицинских устройств или имплантатов), добавки, материалы, наполнители, агенты, не подверженные биологическому обрастанию, агенты для микроструктурирования и агенты клеточной инкапсуляции. Использование PBAA в качестве поверхностных покрытий позволило индуцировать разные уровни воспаления, как in vitro, так in vivo, в зависимости от химической структуры. Большое химическое разнообразие этого класса материалов позволило идентифицировать полимерные покрытия, которые ингибируют активацию макрофагов in vitro. Кроме того, эти покрытия уменьшают привлечение клеток воспаления и уменьшают фиброз после подкожной имплантации карбоксилированных микрочастиц полистирола. Эти полимеры могут использоваться для формирования капсулы комплекса полиэлектролита для инкапсуляции клетки. У изобретения может также быть много других биологических способов применения, таких как антибактериальные покрытия, доставка ДНК или миРНК, и тканевая инженерия на основе стволовых клеток. Рекомендации заявки на патент США № 20130302401 могут быть применены к нацеленной на нуклеиновые кислоты системе по настоящему изобретению.

[00608] В другом варианте осуществления изобретения предусматриваются липидные наночастицы (LNP). Малая интерферирующая РНК против антитранстиретина была заключена в капсулу липидных наночастиц и доставлена в человеческие клетки (например, см. Coelho et al., N Engl J Med 2013;369:819-29), и такая система может быть а.даптирована и применена для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. Рассмотренные дозы составляют от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 мг на кг массы тела при доставке внутривенно. Для снижения риска инфузионных реакций предусматриваются такие лекарственные препараты как дексаметазон, ацетаминофен, дифенгидрамин, цетиризин и ранитидин. Рассмотрено применение в виде множественных доз, составляющих приблизительно 0,3 мг на килограмм массы тела каждые 4 недели до пяти доз.

[00609] Показана высокая эффективность LNP для доставки миРНК в печень (см, например, Tabemero et al, Cancer Discovery, April 2013, Vol. 3, No. 4, pages 363-470), следовательно, LNP могут использоваться для доставки РНК, кодирующей нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок к печени. Дозировка может составлять приблизительно четыре дозы по 6 мг/кг LNP каждые две недели. Tabemero et al. продемонстрировали, что регресс опухоли наблюдался после первых 2 циклов LNP при дозировке на уровне 0,7 мг/кг, к концу 6 циклов пациент достиг частичной ремиссии с полной регрессией метастазов лимфатических узлов и существенным уменьшением опухолей печени, полная ремиссия была достигнута после 40 доз, потом ремиссия сохранилась, лечение было закончено после 26 месяцев. У двух пациентов с RCC и внепеченочными участками заболевания, включая почку, легкое и лимфатические узлы, которые прогрессировали после предшествующей терапии с ингибиторами каскада VEGF, было стабильное заболевание во всех областях в течение приблизительно 8-12 месяцев, и пациент с PNET и метастазами печени продолжил лечение в дополнительном исследовании в течение 18 месяцев (36 доз) со стабильным заболеванием.

[00610] Однако заряд LNP также должен быть принят во внимание. Катионные липиды комбинируются с отрицательно заряженными липидами для индукции небислойных структур для облегчения внутриклеточной доставки. Поскольку заряженные LNP быстро покидают кровоток после внутривенной инъекции, были разработаны ионизируемые катионные липиды со значениями pKa ниже 7 (см., например, Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011). Отрицательно заряженные полимеры, такие как РНК могут быть загружены в LNP при низких значениях pH (например, pH 4), когда ионизируемые липиды имеют положительный заряд. Однако при физиологических значениях pH LNP имеют низкий поверхностный заряд, совместимый с более длительным временем циркуляции. Исследование было сосредоточено на четырех видах ионизируемых катионных липидов, а именно, 1,2-дилинеоил-3-диметиламмоний-пропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилокси-3-N, N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилинолеилокси-кето-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinKDMA) и 1,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLinKC2-DMA). Было показано, что системы миРНК LNP, содержащие эти липиды, показывают значительно отличающиеся свойства подавления экспрессии генов в гепатоцитах in vivo с эффективностью, варьирующей согласно ряду DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP при использовании моделей подавления экспрессии гена фактора VII (см., например, Rosin et al, Molecular Therapy, vol, 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec, 2011). Может быть рассмотрена дозировка 1 мкг/мл LNP или РНК CRISP-Cas внутри или в ассоциации с LNP, особенно для лекарственного препарата, содержащего DLinKC2-DMA.

[00611] Подготовка LNP и инкапсуляция CRISPR-Cas может быть использована или адаптирована из Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec, 2011. Катионные липиды 1,2-дилинеоил-3-диметиламмоний-пропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилокси-3-N, N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилинолеилокси-кето-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinKDMA), 1,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLinKC2-DMA), (3-o-[2"-(метоксиполиэтиленгликоль 2000)сукциноил]-1,2-димиристоил-sn-гликоль (PEG-S-DMG) и R-3-[(ко-метокси-поли(этиленгликоль)2000) карбамоил]-1,2-димиристилоксипропил-3-амин (PEG-C-DOMG) могут быть приобретены у Tekmira Pharmaceuticals (Ванкувер, Канада) или синтезированы. Холестерин может быть приобретен у Sigma (Сент-Луис, Миссури). РНк конкретного нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса (CRISPR-Cas) может быть заключена в капсулу из LNP, содержащую DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA и DLinKC2-DMA (катионный липид:DSPC:CHOL:PEGS-DMG или PEG-C-DOMG в молярных отношениях 40:10:40:10). Необязательно 0,2% SP-DiOC18 (Invitrogen, Берлингтон, Канада) может быть включен в состав, чтобы оценить клеточный захват, внутриклеточную доставку и биораспределение. Инкапсуляция может быть выполнена путем растворения липидной смеси, состоящей из катионного липида:DSPC:холестерола:PEG-c-DOMG (молярное отношение 40:10:40:10), в этаноле до конечной концентрации липида 10 ммоль/л. Этот раствор липида в этаноле может быть добавлен по каплям к цитрату с концентрацией 50 ммоль/л, pH 4,0, для формирования многослойных везикул в целях достижения конечной концентрации этанола 30% по объему. Большие однослойные везикулы могут быть сформированы после пропускания многослойных везикул через два сложенных поликарбонатных фильтра Nuclepore на 80 нм с использованием экструдера (Northern Lipids, Ванкувер, Канада). Инкапсуляция может быть достигнута добавлением РНК, растворенной до концентрации 2 мг/мл, в 50 ммоль/л цитрата, pH 4,0, содержащего 30% этанола по объему, по каплям к предварительно сформированным большим однослойным пузырькам и инкубации при температуре 31°C в течение 30 минут с постоянным перемешиванием до конечного отношения РНК/липид по весу, равного 0,06/1. Удаление этанола и нейтрализация полученного состава буфером могут быть выполнены с помощью диализа против натрий-фосфатного буфера (PBS), pH 7,4, в течение 16 часов с использованием восстановленных целлюлозных мембран для диализа Spectra/Por 2. Гранулометрический состав может быть определен динамическим рассеянием света с использованием гранулометра NICOMP 370, режима везикул/интенсивности и Гауссовской аппроксимации (Nicomp Particle Sizing, Санта-Барбара, Калифорния). Размер частиц для всех трех систем LNP может составлять ~70 нм в диаметре. Эффективность инкапсуляции РНК может быть определена удалением свободной РНК с использованием колонки VivaPureD Mini (Sartorius Stedim Biotech) из образцов, собранных до и после диализа. Инкапсулированная РНК может быть извлечена из элюированных частиц и определена количественно на уровне 260 нм. Отношение РНК к липидам может быть определено измерением содержания холестерина в везикулах с использованием ферментативного анализа с холестерином E от Wako Chemicals USA (Ричмонд, Вирджиния). Вместе с обсуждаемыми в настоящем описании LNP и липидами PEG, пегилированные липосомы или LNP так же подходят для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы или ее компонентов.

[00612] Получение липидных наночастиц (LNP) возможно производить согласно и/или адаптировано из Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011. Предварительно подготовленный раствор липидной смеси (с общей концентрацией липидов 20,4 мг/мл) может быть получен в этаноле, содержащем DLinKC2-DMA, DSPC и холестерин в молярных соотношениях 50:10:38,5. Ацетат натрия может быть добавлен в предварительно подготовленный раствор липидной смеси в молярном соотношении 0,75:1 (ацетат натрия: DLinKC2-DMA). Липиды могут быть далее гидратированы с использованием смеси 1,85 объема цитратного буфера (10 ммоль/л, pH 3,0) при активном перемешивании, приводящем к спонтанному образования липосом в водном буфере, содержащем 35% этанол. Раствор липосом может быть инкубирован при 37°C, чтобы сделать возможным зависимое от времени увеличение размеров частиц. Аликвоты могут быть удалены в разные моменты времени в ходе инкубации для исследования изменений размера липосом с помощью способа динамического светорассеяния (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, Великобритания). При достижении желаемого размера частиц водный раствор PEG и липидов (исходный раствор=10 мг/мл PEG-DMG в 35% (объем/объем) этанола) может быть добавлен к смеси липосом для достижения конечной концентрации PEG 3,5% от общего липида. При добавлении PEG-липидов липосомы должны быть примерно их размера и эффективно подавляя дальнейший рост. Далее РНК может быть добавлена к пустым липосомам при соотношении РНК к общим липидам примерно 1:10 (вес:вес) с последующей инкубацией на протяжении примерно 30 мин при 37°C для образования загруженных липидных наночастиц (LNP). Такая смесь может быть в дальнейшем подвергнута диализу на протяжении ночи в PBS) и фильтрации через 0,45-пм фильтр-шприц.

[00613] Конструкции сферических нуклеиновых кислот (Spherical Nucleic Acid, SNA™) и другие частицы (в частности, частицы золота) также предусматриваются в качестве средства доставки нацеленных на нуклеиновую кислоту систем к предполагаемым мишеням. Значительный объем данных демонстрирует полезность конструкций терапевтических сферических нуклеиновых кислот от AuraSense (SNA™), основанных на функционализированных нуклеиновой кислотой золотых частицах.

[00614] Литература, которая может быть использована в совокупности с изложенными в настоящем описании идеями, включает: Cutler et al., J. Am. (Chem. Soc. 2011 133:9254-9257, Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162, Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391, Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975- 80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638 Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488- 1691, Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630, Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ral52 (2013) и Mirkin, et al., Small, 10:186-192.

[00615] Самособирающиеся частицы с РНК могут быть произведены из полиэтиленимина (PEI), связанного с PEG через пептидный лиганд Arg-Gly-Asp (RGB), присоединенный к дальнему концу PEG. Такая система была использована, например, в качестве средства для нацеливания на сосуды опухоли, экспрессирующей интегрины, и доставки миРНК, ингибирующей экспрессию рецептора факторов роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR2), и достижения, таким образом, ангиогенеза в опухоли (см., например, Sehiffelers et al, Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 19). Наноплексы могут быть приготовлены смешиванием равных объемов водных растворов катионного полимера и нуклеиновой кислоты для получения чистого молярного избытка ионизируемого азота (полимер) относительно фосфата (нуклеиновая кислота) в диапазоне от 2 до 6. Электростатические взаимодействия между катионными полимерами и нуклеиновой кислотой приводят к образованию полиплексов со средним значением распределения размеров примерно 100 нм, в связи с чем в настоящем описании они названы наноплексами. Предусматривается дозировка примерно от 100 до 200 мг РНК комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, для доставки в самособирающихся частицах согласно Sehiffelers et al.

[616] Наноплексы, описанные Bartlett et al. (PNAS, September 25, 2007,vol. 104, no. 39) также могут быть применены в рамках настоящего изобретения. Наноплексы, описанные Bartlett et al., получают смешиванием равных объемов водных растворов катионного полимера и нуклеиновой кислоты для получения чистого молярного избытка ионизируемого азота (полимера) по отношению к фосфату (нуклеиновая кислота) в диапазоне от 2 до 6. Электростатические взаимодействия между катионными полимерами и нуклеиновой кислотой приводят к образованию полиплексов со средним значением распределения размеров примерно 100 нм, в связи с чем здесь они названы наноплексами. DOTA-миРНК, описанная Bartlett et al., была синтезирована следующим образом: 1,4,7,10-тетразациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты моно (N-гидроксисукцинимид эфир) (DOTA-эфир NHS) был заказан у Macrocyclics (Даллас, Техас, США). Кодирующая цепь аминомодифицированной РНК со 100-кратным молярным избытком эфира DOTA-NHS в карбонатном буфере (pH 9) была помещена в пробирку для микроцентрифугирования. Реакция содержимого была проведена при перемешивании на протяжении 4 ч при комнатной температуре. Связанные DOTA-кодирующая РНК были осаждены этанолом, ресуспенидрованы в воде и прошли отжиг на немодифицированную некодирующую цепь для получения DOTA-миРНК. Все жидкости были предварительно обработаны Chelex-100 (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США) для удаления следов загрязнения металлом. Нацеленные на Tf и ненацеленные частицы миРНК могут быть образованы с использованием содержащих циклодекстрин поликатионов. Обычно частицы образуются в воде при соотношении зарядов (+/-), равном 3, и концентрации миРНК 0,5 г/л. Один процент молекул адамантан-PEG на поверхности нацеленных частиц был модифицирован (адамантан-PEG-Tf). Частицы были суспендированы в 5% (масса/объем) полученного раствора переносчика глюкозы для инъекций.

[00617] Davis et al. (Nature, Vol 464, 15 April 2010) провели клинические испытания РНК с использованием системы доставки нацеленных частиц (регистрационный номер клинического испытания NCT00689065). Пациенты с солидным типом злокачественной опухли, нечувствительной к стандартным способам лечения, получали дозировки направленных частиц в дни 1, 3, 8 и 10 21-дневного курса путем 30-минутного внутривенного вливания. Такие частицы включают, по существу состоят или состоят из синтетической системы доставки, содержащей: (1) линейный полимер на основе циклодекстрина (CDP), (2) лиганд, нацеленный на белок трансферрин человека (TF), находящийся снаружи наночастицы для активации рецепторов TF (TFR) на поверхности злокачественных клеток, (3) гидрофильный полимер (полиэтиленгликоль, PEG) используется для увеличения стабильности наночастиц в биологических жидкостях) и (4) миРНК, разработанная для уменьшения экспрессии RRM2 (используемая в клинической практике последовательность ранее была обозначена как siR2B+5). На протяжении долгого времени было известно, что TFR активнее экспрессируется в клетках злокачественных опухолей, поэтому RRM2 является доказанная мишень терапии против злокачественной опухоли. Такие частицы (используемая в клинической практики версия обозначена как CALAA-01) продемонстрировали хорошую переносимость в исследованиях с различными дозировками на отличных от человека приматах. Хотя ранее один пациент с хроническим миелоидным лейкозом получал миРНК путем доставки липосомами, клинические испытания Davis et al. являются первичными для систематической доставки миРНК с нацеленной системой доставки и с целью лечения пациентов с солидными злокачественными опухолями. Для проверки того, может ли система направленной доставки обеспечить эффективную доставку функциональной миРНК в опухоли у человека, Davis et al. исследовали материалы биопсии трех пациентов из трех групп по дозировке: пациенты A, В и C, каждый из которых имел метастазирующую меланому и получал CALAA-01 в дозах 18, 24 и 30 мг/м² миРНК соответственно. Сходные дозы могут также быть предположены для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. Доставка согласно изобретению может быть достигнута с использованием частиц, содержащих линейный полимер на основе циклодекстрина (CDP), лиганд, нацеленный на белок трансферрин человека (TF), находящийся снаружи наночастицы для активации рецепторов TF (TFR) на поверхности злокачественных клеток и/или гидрофильный полимер (например, полиэтиленгликоль (PEG), используемый для повышения стабильности в биологических жидкостях).

[00618] В отношении настоящего изобретения, предпочтительно наличие одного или более компонентов нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, например, нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка или мРНК, либо направляющая РНК, доставленных при помощи частиц или липидной упаковки. Другие системы доставки или векторы могут быть использованы в совокупности с частицами в соответствующих вариантах изобретения.

[00619] В целом под "наночастицей" понимают любую частицу с диаметром менее 1000 нм. В определенных предпочитаемых вариантах осуществления наночастицы по настоящему изобретению имеют размер вдоль длинной оси (например, в диаметре) 500 нм или менее. В других предпочитаемых вариантах, описываемых в данном изобретении, наночастицы имеют наибольший размер в диапазоне между 25 нм и 200 нм. В других предпочитаемых вариантах описываемые в данном изобретении наночастицы имеют вдоль длинной оси размер 100 нм или менее. В других предпочитаемых вариантах описываемые в данном изобретении наночастицы имеют размер от 35 нм до 60 нм.

[00620] Частицы, относящиеся к настоящему изобретению, могут быть доставлены в различных формах, например, твердые частицы (например, металлы как серебро, золото, железо, титан), неметаллы, твердые частицы на основе липидов, полимеры, суспензии частиц или их комбинации. Могут быть получены частицы из металлов, диэлектриков или полупроводников, как и гибридные структуры (например, с ядром и оболочкой). Частицы из полупроводниковых материалов могут быть также маркированы квантовыми точками, если имеют размер, достаточно малый (обычно менее 10 нм) для возможности квантования электронных уровней. Такие наночастицы используются в биомедицинских применениях в качестве носителей для лекарств или агентов для визуализации и могут быть адаптированы для сходных целей в рамках настоящего изобретения.

[00621] Были произведены полутвердые и мягкие частицы, входящие в объем настоящего изобретения. Частицей-прототипом полутвердой природы является липосома. Различные типы липосомных частиц в настоящее время используются в клинической практике в качестве систем доставки для противораковых лекарств и вакцин. Наполовину гидрофильные и наполовину гидрофобные частицы называются янус-частицами и они особенно эффективны для стабилизации эмульсий. Они способны к самостоятельной сборке на поверхностях раздела вода/масло и действуют как твердые поверхностно-активные вещества.

[00622] В патенте США № 8709843, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложена система доставки лекарств для нацеленной доставки содержащих терапевтический агент частиц к тканям, клеткам и внутриклеточным компартментам. Настоящее изобретение относится к нацеленным частицам, содержащим полимер, связанный с поверхностно-активным веществом, гидрофильный полимер или липид.

[00623] В патенте США № 6007845, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложены частицы, имеющие ядро из мультиблочного сополимера, образованное путем ковалентного связывания мультифункционального соединения с одним или более гидрофильными полимерами, и содержащие биологически активный материал.

[00624] В патенте США № 5855913, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложена композиция частиц, включающая аэродинамически легкие частицы с плотностью менее 0,4 г/см³ и средним диаметром от 5 пм до 30 пм, имеющих на поверхности поверхностно-активное вещество для доставки лекарств в систему легких.

[00625] В патенте США № 5985309, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложены частицы, содержащие поверхностно-активное вещество и/или гидрофильный или гидрофобный комплекс с положительно или отрицательно заряженным лекарственным веществом или агентом для диагностики и заряженную частицу с противоположным зарядом для доставки в легкие.

[00626] В патенте США № 5543158, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложены биоразлагаемые инъецируемые частицы с биоразлагаемым твердым ядром, содержащим биологически активный материал и остатки поли(алкиленгликоля) на поверхности.

[00627] В WO2012135025 (также опубликованной как US20120251560), включенной в настоящем описании в качестве ссылки, описаны полимеры конъюгированного полиэтиленимина (PEI) и конъюгированных азамакроциклов (вместе называемых "конъюгированный липомер" или "липомеры"). В некоторых вариантах осуществления может быть предусмотрено, что такие способы и материалы из цитируемых в настоящем описании документов, например, конъюгированные липомеры, могут быть использованы в контексте нацеленной на нуклеиновую кислоту системы для достижения in vitro, ex vivo и in vivo изменений генома для модификации экспрессии генов, а также экспрессии белков.

[00628] В одном варианте осуществления частица может быть модифицированным эпоксидом липидным полимером, предпочтительно 7C1 (см., например, James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014) опубликованная через интернет 11 мая 2014 года, doi:10.1038/nnano.2014.84). C71 был синтезирован в реакции Cl5 липидов с концевыми эпоксидными группами с PEI600 при молекулярном соотношении 14:1 и составлен с C14PEG2000 для получения частиц (диаметр между 35 и 60 нм), стабильных в растворе PBS (фосфатно-солевой буфер, PBS) на протяжении не менее 40 дней.

[00629] Модифицированный эпоксидными группами липид-полимер может быть использован для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению в клетки легких, сердечно-сосудистой системы или почек, однако, квалифицированный специалист в данной области может адаптировать систему для доставки к другим органам-мишеням. Предполагаются дозировки в диапазоне от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,6 мг/кг. Также предусматриваются дозировки, вводимые на протяжении нескольких суток или недель с общей дозой приблизительно 2 мг/кг.

Экзосомы

[00630] Экзосомы являются эндогенными нановезикулами, транспортирующими РНК или белки, которые могут доставлять РНК в головной мозг и другие органы-мишени. Для уменьшения иммуногенности Alvarez-Erviti et al. (2011, Nat Biotechnol 29: 341) использовали полученные ими собственные дендритные клетки мышей для получения экзосом. Нацеливание в головной мозг было достигнуто инженерией дендритных клеток, приводящей к экспрессии Lamp2b, экзосомального мембранного белка, слитого со специфическим пептидом нейронов RVG. Очищенные экзосомы были загружены экзогенной РКН с помощью электропорации. миРНК GAPDH, доставленная введенными внутривенно нацеленными на RVG экзосомами в нейроны, микроглию, олигодендроциты в головном мозге вызывает нокдаун конкретного гена. Предварительная обработка экзосомами RVG не ослабляла нокдаун, неспецифический захват в других тканях не наблюдался. Терапевтический потенциал опосредованной экзосомами доставки миРНК был продемонстрирован сильным нокдауном мРНК (60%) и белка (62%) ВACE1, терапевтической мишени болезни Альцгеймера.

[00631] Для получения совокупности иммунологически инертных экзосом Alvarez-Erviti et al. взяли пробы костного мозга мышей инбредной линии C57BL/6 с однородным гаплотипом по главному комплексу гистосовместимости (MHC). Поскольку незрелые дендритные клетки производят большие объемы экзосом, лишенных активаторов Т-клеток, таких как MHC-II и CD86, Alvarez-Erviti et al. отбирали дендритные клетки с использованием гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) на протяжении 7 дней. Экзосомы были очищены от культурального супернатанта на следующий день с использованием стандартных протоколов ультрацентрифугирования. Полученные экзосомы были физически однородны с распределением размеров, имеющим пик, соответствующий диаметру 80 нм, как установлено путем анализа траекторий частиц (NTA) и электронной микроскопией. Alvarez-Erviti et al. получили 6-12 мкг экзосом (измерено на основе концентрации белка) на 10⁶ клеток.

[00632] Далее Alvarez-Erviti et al. исследовали возможность загрузки модифицированных экзосом экзогенным грузом при помощи протоколов электропорации, адаптированных для применения в наномасштабе. Поскольку электропорация мембранных частиц в наноразмерном масштабе недостаточно охарактеризована, неспецифическая маркированная Cy5 РНК была использована для оптимизации протокола электропорации эмпирически. Количество упакованной РНК было оценено после ультрацентрифугирования и лизиса экзосом. Электропорация при 400 В и 125 пФ привела к максимальному удержанию РНК и использовалась во всех последующих экспериментах.

[00633] Alvarez-Erviti et al. вводили 150 мкг каждой миРНК BACE1, упакованной в 150 пг экзосом RVG, нормальным мышам C57BL/6 и сравнивали эффективность нокдауна с четырьмя контролями: интактные мыши, мыши, которым вводились только экзосомы RVG, мыши, которым вводились миРНК BACE1 в комплексе с in vivo реагентом катионных липосом и мыши, которым вводились миРНК BACE1 в комплексе с RVG-9R, пептидом RVG, связанным с 9 остатками D-аргинина, электростатически связанными с миРНК. Образцы кортикальной ткани были проанализированы после 3 дней введения, был обнаружен существенный нокдаун белка (45%, P<0,05, против 62%, P<0,01) у получавших экзосомы как с миРНК-RVG-9R, так и с миРНК-RVG, что было следствием существенного уменьшения уровней мРНК BACE1 (66% [+ или -] 15%, P<0,001 и 61% [+ или -] 13% соответственно, P<0,01). Более того, заявители продемонстрировали существенное уменьшение (55%, P<0,05) общих уровней бета-амилоида 1-42, главного компонента амилоидных бляшек при патологии болезни Альцгеймера в случае животных, которым вводили экзосомы RVG. Наблюдаемое уменьшение превосходило уменьшение для бета-амилоида 1-40 у нормальных мышей после внутрижелудочкового введения ингибиторов BACE1. Alvarez-Erviti et al. осуществили быструю амплификацию 5'-концов кДНК (RACE) для продукта расщепления BACE1, что предоставило доказательства опосредованного РНК-интерференцией нокдауна за счет миРНК.

[00634] Наконец, Alvarez-Erviti et al. исследовали, вызывают ли экзосомы РНК-RVG иммунный ответ in vivo путем измерения концентраций L-6, IP-10, TNFα и IFN-α в сыворотке. После введения экзосомам для всех цитокинов были зарегистрированы несущественные изменения, сходные с возникающими при введении реагента для трансфекции миРНК, и противоположные возникающим при обработке миРНК-RVG-9R, которая стимулирует высокую секрецию IL-6, что подтверждает иммунологическую инертность при введении экзосом. Учитывая, что экзосомы содержат только 20% миРНК, доставка RVG-экзосомами представляется более эффективной, чем доставка RVG-9R при достижении сравнимого уровня нокдауна мРНК с использованием меньшего в 5 раз количества миРНК без соответствующего уровня иммунной стимуляции. Данный эксперимент продемонстрировал терапевтический потенциал технологии RVG-экзосом, которая может подходить для долговременного сайленсинга генов, связанных с нейродегенеративными заболеваниями. Система доставки с использованием экзосом по Alvarez-Erviti et al. может быть применена для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению к мишеням терапии, особенно в случае нейродегенеративных заболеваний. Доза в диапазоне примерно от 100 до 1000 мг нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, упакованной в от ~100 до ~1000 мг RVG-экзосом, может быть предусмотрена в рамках настоящего изобретения.

[00635] El-Andaloussi et al. (Nature Protocols 7,2112-2126(2012)) установили, каким образом полученные из культивируемых клеток экзосомы могут быть использованы для доставки РНК in vitro и in vivo. Данный протокол вначале описывает получение нацеленных экзосом путем трансфекции экспрессирующего вектора, содержащего экзосомальный белок, слитый с пептидным лигандом. Далее El-Andaloussi et al. описывают очистку и охарактеризацию экзосом из супернатанта трансфицированных клеток. Далее El-Andaloussi et al. детализируют ключевые шаги загрузки РНК в экзосомы. В конце El-Andaloussi et al. кратко описывают использование экзосом для эффективной in vitro и in vivo доставки РНК в головной мозг мыши. Примеры ожидаемых результатов, для которых количественно оценена опосредованная экзосомами доставка путем функционального анализа и визуализации, также приведены. Полный протокол занимает ~3 недели. Доставка или введение согласно изобретению могут быть выполнены с использованием экзосом, полученных из дендритных клеток пациента. В соответствии с описанными в настоящем описании идеями, это может быть использовано в практике использования изобретения.

[00636] В другом варианте осуществления рассматриваются экзосомы плазмы из Wahlgren et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 el30). Экзосомы являются наноразмерными везикулами (размером 30-90 нм), производимыми многими типами клеток, включая дендритные клетки (DC), В-клетки, T-клетки, тучные клетки, эпителиальные клетки и клетки опухоли. Такие везикулы образуются путем впячивания и отделения поздних эндосом и далее освобождаются во внеклеточную среду при слиянии с плазматической мембраной. Поскольку экзосомы в естественном состоянии переносят РНК между клетками, такое их свойство может быть полезно для генной терапии, и исходя из данного описания экзосомы могут быть использованы при применении настоящего изобретения.

[00637] Экзосомы из плазмы могут быть получены путем центрифугирования фракции тромбоцитов и белых клеток крови при 900g на протяжении 20 мин для выделения плазмы с последующим отбором супернатанта, центрифугирования при 300g на протяжении 10 мин для удаления клеток и при 16500g на протяжении 30 мин с последующей фильтрацией через 0,22-мм фильтр. Экзосомы осаждаются при ультрацентрифугировании при 120000g на протяжении 70 мин. Химическая трансфекция миРНК в экзосомы выполнена согласно рекомендациям производителя для начального набора для РНК-i человек/мышь (RNAi Human/Mouse Starter Kit, Quiagen, Хильден, Германия). миРНК добавляется к 100 мл PBS в конечной концентрации 2 ммоль/мл. После добавления реагента для трансфекции HiPerFect смесь инкубируется на протяжении 10 мин при нормальных условиях. Для того, чтобы удалить избыток мицелл, экзосомы вновь выделяют с использованием альдегид/сульфатных латексных шариков. Химическая трансфекция нацеленной на нуклеиновую кислоту системы в экзосомы может быть проведена сходным образом с таковой для миРНК. Такие экзосомы могут быть сокультивированы с моноцитами и лимфоцитами, выделенными из периферической крови здоровых доноров. Следовательно, можно предположить, что экзосомы, содержащие нацеленную на нуклеиновые кислоты систему, могут быть введены в моноциты и лимфоциты и аутологично вновь введены в человека. В соответствии с этим, доставка или введение в соответствии с изобретением могут быть выполнены с применением экзосом плазмы.

Липосомы

[00638] Доставка или введение по изобретению могут быть выполнены с помощью липосом. Липосомы представляют собой сферические везикулярные структуры, состоящие из одно- или многослойного липидного бислоя, окружающего внутренние водные компартменты, и относительно непроницаемого внешнего липофильного фосфолипидного бислоя. Липосомы привлекают значительное внимание как переносчики для доставки лекарственных средств, потому что они биологически совместимы, нетоксичны, могут доставлять и гидрофильные и липофильные молекулы препарата, защитить свой груз от деградации ферментами плазмы и переносить свой груз через биологические мембраны и гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) (см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 для обзора).

[00639] Липосомы могут состоять из нескольких различных типов липидов; однако, для производства липосом в качестве переносчиков препаратов обычно используются фосфолипиды. Липосомы образуются самопроизвольно при смешивании липидной пленки с водным раствором, но этот процесс может быть ускорен с помощью механического воздействия в виде встряхивания при помощи гомогенизатора, генератора ультразвука или экструдера (см.. например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 для обзора).

[00640] Несколько других добавок могут быть добавлены к липосомам, чтобы изменить их структуру и свойства. Например, холестерин или сфингомиелин могут быть добавлены к липосомальной смеси для стабилизации структуры липосом и предотвращения потери внутреннего груза. Далее, липосомы могут быть получены из гидрированного фосфатидилхолина яйца или фосфатидилхолина яйца, холестерина и диацетилфосфата, и средние размеры везикул могут быть доведены до приблизительно 50 и 100 нм. (см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 для подробного обзора).

[00641] Лекарственная форма липосомы может состоять, главным образом, из естественных фосфолипидов и липидов, таких как 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (DSPC), сфингомиелин, фосфатидилхолины яйца и монозиалоганглиозид. Так как эта лекарственная форма составлена только из фосфолипидов, при создании липосом возникло много проблем, в том числе их нестабильность в плазме. Было предпринято несколько попыток преодолеть эти проблемы, в основном путем изменения состава липидной мембраны. Одна из этих попыток заключалась в добавлении холестерина. Добавление холестерина к обычным лекарственным формам замедляет высвобождение инкапсулированного биологически активного вещества в плазму, или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) увеличивает стабильность (см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 для обзора).

[00642] В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения желательно использование липосом, действующих по принципу "троянского коня" (также известный как "молекулярные троянские кони"), и протоколы можно найти по ссылке http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long. Эти частицы обеспечивают доставку трансгена ко всему головному мозгу после внутрисосудистой инъекции. Без ограничения, считается, что нейтральные липидные частицы со специфичными антителами, связанными с их поверхностью, способны пересекать гематоэнцефалический барьера путем эндоцитоза. Заявитель утверждает, что липосомы, действующие по принципу "троянского коня", могут быть использованы для доставки семейства нуклеаз CRISPR к головному мозгу путем внутрисосудистой инъекции, что позволило бы создавать животных с трансгенным головным мозгом без потребности в манипуляции с эмбрионами. Приблизительно 1-5 г ДНК или РНК могут быть использованы для введения in vivo в липосомах.

[00643] В другом варианте осуществления изобретения нацеленную на нуклеиновую кислоту систему или ее компоненты можно доставить при помощи липосом, например, стабильной нуклео-липидной частицы (SNALP) (см., например, Morissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005). Предусматриваются ежедневные внутривенные инъекции приблизительно 1, 3 или 5 мг/кг/сутки конкретной нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, нацеленной в SNALP. Ежедневное лечение может быть проведено приблизительно за три дня и затем еженедельно в течение приблизительно пяти недель. В другом варианте осуществления изобретения также предусматривается конкретная нацеленная на нуклеиновую кислоту система, заключенная в SNALP, введенная внутривенной инъекцией в дозах приблизительно 1 или 2,5 мг/кг (см., например, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006). Состав SNALP может содержать липиды 3-N-[(вметоксиполи(этиленгликоль)2000)карбамоил]-1,2-димиристилокси-пропиламин (PEG-C-DMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinDMA), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC) и холестерин, в соотношении 2:40:10:48 молярных процентов (см., например, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006).

[00644] В другом варианте осуществления было доказано, что стабильные нуклео-липидные частицы (SNALP) являются эффективными молекулами для доставки в сильно васкуляризированные опухоли печени, полученные из HepG2, но не в слабо васкуляризированные опухоли печени, образованные из НСТ-116 (см., например, Li, Gene Therapy (2012) 19, 775-780). Липосомы SNALP могут быть получены смешением D-Lin-DMA и PEG-C-DMA с дистероилфосфатидилхолином (DSPC), холестерином и миРНК, использованных в соотношении 25:1 липид/миРНК и молярным соотношением 48/40/10/2 для холестерина/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA. Полученные липосомы SNALP имеют размер примерно 80-100 нм.

[00645] В еще одном варианте осуществления стабильные частицы нуклеиновая кислота-липид (SNALP) могут включать синтетический холестерин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), дипальмитоилфосфатидилхолин (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Алабама, США), 3-N-[(w-метокси-поли(этиленгликоль)2000)карбамоил]-1,2-димиристоилоксипропиламин и катионный 1,2-дилиеноилокси-3-N,N-диметиламинопропанан (см., например, Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905). Может предусматриваться дозировка примерно 2 мг/кг нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, введенная, например, внутривенной болюсной инфузий.

[00646] В еще одном варианте осуществления изобретения SNALP может включать синтетический холестерин (Sigma-Aldrich), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-cDMA, и 1,2-дилинолеилокси-3-(N;N-диметил)аминопропан (DLinDMA) (см, например, Judge, J. Clin. Invest. 119:661-673 (2009)). Составы, используемые для исследований in vivo, могут включать конечное соотношение липид/РНК по массе приблизительно 9:1.

[00647] Безопасность нанолекарств на основе РНК-i была рассмотрена Barros and Gollob из Alnylam Pharmaceuticals (см., например, Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1730-1737). Стабильная нуклео-липидная частица кислоты (SNALP) состоит из четырех различных липидов: ионизируемого липида (DLinDMA), который является катионным при низких значениях pH, нейтрального липида-помощника, холестерина и способного к диффузии липида на основе полиэтиленгликоля (PEG). Частица составляет приблизительно 80 нм в диаметре и имеет нейтральный заряд при физиологическом pH. Ионизируемый липид служит для связывания липида с анионной РНК во время формирования частицы. При увеличении кислотности внутри эндосомы, ионизируемый липид становится положительно заряженным и опосредует слияние SNALP с мембраной эндосомы, высвобождая РНК в цитоплазму. PEG-содержащий липид стабилизирует частицу и уменьшает агрегирование во время сборки, впоследствии обеспечивая нейтральную гидрофильную поверхность, которая улучшает фармакокинетические свойства.

[00648] На данный момент две клинические программы были начаты с использованием смесей SNALP с РНК. Tekmira Pharmaceuticals недавно закончили фазу I клинического испытания с применением единственной дозы SNALP-ApoB на взрослых добровольцах с повышенным уровнем холестерина LDL. ApoB преимущественно экспрессируется в печени и тощей кишке и необходим для сборки и секреции VLDL и LDL. Семнадцать участников исследования получили единственную дозу SNALP-ApoB (постепенное увеличение дозы на протяжении 7 уровней). Не было никаких доказательств токсичности для печени (ожидались как потенциальная ограничивающая дозу токсичность на основе доклинических исследований). Один (из двух) испытуемых при получении самой высокой дозы испытал гриппоподобные симптомы, согласующиеся со стимуляцией иммунной системы, и было принято решение завершить испытание.

[00649] Alnylam Pharmaceutcals так же занимались продвижением ALN-TTR01, который использует технологию SNALP, описанную выше, и нацелен на продукцию гепатоцитами мутанта и TTR дикого типа для лечения амилоидоза TTR (ATTR). Были описаны три синдрома ATTR: семейная амилоидная полинейропатия (FAP) и семейная амилоидная кардиомиопатия (FAC) - оба вызываемые аутосомными доминирующими мутациями в TTR; и старческий системный амилоидоз (SSA), вызываемый TTR дикого типа. Недавно была закончена фаза I плацебо-контролируемых испытаний на пациентах с ATTR единственный дозы ALN-TTR01 c ее постепенным увеличением. ALN-TTR01 был введен в виде 15-минутного внутривенного вливания 31 пациенту (23 с препаратом исследования и 8 с плацебо) в диапазоне дозы от 0,01 до 1,0 мг/кг (на основе миРНК). Испытуемые хорошо переносили лечение без значительных увеличений функции печени в тестах. Инфузионные реакции были отмечены в 3 из 23 пациентов при дозе более 0,4 мг/кг; все реагировали на замедление скорости вливания и все продолжили участие в исследовании. Минимальное и временное повышение уровня цитокинов IL-6, IP-10 и IL-1ra в сыворотке крови было отмечено у двух пациентов при самой высокой дозе 1 мг/кг (как предполагалось исходя из доклинических испытаний и исследований на приматах). Понижая уровень TTR в сыворотке, ожидаемый фармакодинамический эффект от введения ALN-TTR01, наблюдался при дозе 1 мг/кг.

[00650] В еще одном варианте осуществления изобретения SNALP может быть собран с помощью растворения катионного липида, DSPC, холестерина и PEG-липида, например, в этаноле, например, в молярном отношении 40:10:40:10, соответственно (см., например, Semple et al., Nature Biotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177). Липидная смесь была добавлена к водному буферу (50-мМ цитрата, pH 4) до достижения окончательной концентрации этанола и липидов 30% (по объему) и 6,1 мг/мл, соответственно, и была уравновешена при 22°C в течение 2 минут перед экструзией. Гидратированные липиды были экструдированы через два сложенных фильтра с размером пор 80 нм (Nuclepore) при 22°C с использованием Lipex Extruder (Northern Lipids) до достижения диаметра везикулы 70-90 нм, как определено динамическим анализом рассеяния света. Это обычно требовало 1-3 проходов. миРНК (растворенная в 50 мМ цитрата, водном растворе с pH 4, содержащем 30% этанола), была добавлена к предварительно уравновешенным (35°C) везикулам со скоростью 5 мл/минуту при смешивании. После достижения окончательного целевого отношения миРНК/липид, равного 0,06 (вес/вес), смесь была инкубирована в течение 30 минут при 35°C, чтобы обеспечить реорганизацию везикул и инкапсуляцию миРНК. Потом этанол был удален и внешний буфер заменен на PBS (155 мМ NaCl, 3 мМ Na2HP04, 1 мМ KH2PO4, pH 7,5) либо диализом, либо фильтрованием из тангенциального потока. миРНК была заключена в капсулу из SNALP с использованием контролируемого пошагового процесса растворения. Липидными компонентами KC2-SNALP были DLin-KC2-DMA (катионный липид), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC; Avanti Polar Lipids), синтетический холестерин (Sigma) и PEG-C-DMA в молярном отношении 57,1:7,1:34,3:1,4. После формирования нагруженных частиц SNALP были диализированы против PBS, фильтрат был простерилизован через 0,2 мкм-фильтр перед использованием. Средние размеры частиц составляли 75-85 нм, и 90-95% миРНК были инкапсулированы в липидных частицах. Окончательное отношение миРНК/липид в составах, использовавшихся для in vivo тестирования, составляло ~0,15 (вес/вес). Системы LNP-миРНК, содержавшие миРНК против фактора VII, были сразу растворены до соответствующих концентраций в стерильном PBS перед использованием, и составы были введены внутривенно через боковую хвостовую вену в суммарном объеме 10 мл/кг. Этот способ и эти системы доставки могут быть экстраполированы на нацеленную на нуклеиновую кислоту систему по настоящему изобретению.

[00651] Другие катионные липиды, такие как аминолипид 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA) могут быть использованы, чтобы инкапсулировать нацеленную на нуклеиновую кислоту систему, компоненты этой системы или молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты, кодирующие компоненты этой системы, например, подобные миРНК (см., например, Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529-8533) и, следовательно, могут использоваться в практике изобретения. Может быть рассмотрен предварительно сформированная везикула со следующим липидным составом: аминолипид, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), холестерин и (R)-2,3-бис(октадецилокси)пропил-1-(метоксиполи(этиленгликоль)2000)пропилкарбамат (PEG-липид) в молярном отношении 40/10/40/10, соответственно, и отношении мРНК фактора свертывания крови VII (FVII)/общее количество липидов, приблизительно равном 0,05 (в весовом отношении). Чтобы гарантировать узкое распределение размеров частиц в диапазоне 70-90 нм и низкий индекс полидисперсности 0,11+0,04 (n=56), частицы могут быть экструдированы до трех раз через 80-нм мембраны до добавления направляющей РНК. Могут быть использованы частицы, содержащие сильнодействующий аминолипид 16, в котором молярное отношение четырех липидных компонентов равно 16, DSPC, холестерин и PEG-липид (50/10/38,5/1,5), которое может быть далее оптимизировано, чтобы увеличить активность in vivo.

[00652] Michael S D Kormann et al. ("Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volume:29, Pages: 154-157 (2011)) описывают использование липидных оболочек для доставки РНК. Использование липидных оболочек также предпочтительно в данном изобретении.

[00653] В другом варианте осуществления изобретения липиды могут быть смешаны с нацеленной на нуклеиновую кислоту системой по настоящему изобретению, ее компонентом(ами) или молекулой(ами) нуклеиновой(ых) кислот(ы), кодирующей таковой(ые), для образования липидных наночастиц (LNP). Липиды включают, без наложения ограничений, DLin-KC2- DMA4, C12-200 и колипиды дистероилфосфатидилхолина, холестерин и PEG-DMG могут быть смешаны с нацеленной на РНК системой вместо миРНК (см., например, Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) I, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3) с использованием процедуры спонтанного образования везикул. Молярное отношение компонентов может быть примерно 50/10/38,5/1,5 (DLin-KC2-DMA или C12-200/дистероилфосфатидилхолин/холестерин/PEG-DMG). Конечное весовое соотношение липид:РНК может составлять 12:1 и 9:1 в случае липидных частиц (LNP) с DLin-KC2-DMA и C12-200, соответственно. Такие составы могут содержать частицы со средним диаметром ~80 нм при эффективности захвата >90%. Может предусматриваться доза 3 мг/кг.

[00654] Tekmira располагает портфолио, содержащим примерно 95 семейств патентов в США и в других странах, относящихся к различным аспектам липидных наночастиц (LNP) и их смесей (см., например, патенты США № 7982027; 7799565; 8058069; 8283333; 7901708; 7745651; 7803397; 8101741; 8188263; 7915399; 8236943 и 7838658 и европейские патенты № 1766035; 1519714; 1781593 и 1664316), все могут быть использованы и/или адаптированы для использования в настоящем изобретении.

[00655] Нацеленная на нуклеиновую кислоту система или ее компоненты или молекула(ы), кодирующая(ие) таковые, могут быть доставлены в упакованном в микросферы PLGA виде таким образом, как описано в опубликованных патентных публикациях США 20130252281, 20130245107 и 20130244279 (приписываются Modema Therapeutics), относящихся к аспектам составления композиций, включающих молекулы модифицированной нуклеиновой кислоты, которые могут кодировать белок, предшественник белка или частично или полностью процессированную форму белка или предшественника белка. Смесь может иметь молярное соотношение 50:10:38,5:1,5:3,0 (катионный липид: фузогенный липид:холестерин:PEG-липид). PEG-липид может быть выбран, но не ограничиваясь ими, из PEG-c-DOMG, PEG-DMG. Фузогенным липидом может являться DSPC. См. также Schrum et aJ., Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids, опубликованное приложение US 20120251618.

[00656] Технологии Nanomerics призваны преодолеть трудности, связанные с биодоступностью для широкого круга терапевтических применений, включая низкомолекулярные гидрофобные лекарства, пептиды и основанные на нуклеиновых кислотах препараты (плазмиды, миРНК, микроРНК). Конкретные пути введения, для которых показаны значительные преимущества данной технологии, включают пероральное введение, транспортировка через гематоэнцефалический барьер, доставка в солидные опухоли, а также глаз. См., например, Mazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 Feb 26;7(2): 1016-26; Uchegbu and Slew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10 и Lalatsa et al., 2012, J Control Release, 2012 Jul 20; 161 (2):523-36.

[00657] В публикации патентной заявки США № 20050019923 описываны катионные дендримеры для доставки биоактивных молекул, таких как молекулы полинуклеотидов, пептидов или полипептидов, и/или фармакологических агентов, в тело млекопитающего. Такие дендримеры подходят для направления доставки биоактивных молекул, например, в печень, селезенку, легкие, почку или сердце (или даже в головной мозг). Дендримеры представляют собой трехмерные макромолекулы, полученные за несколько этапов из простых разветвленных единиц-мономеров, природа и функциональность которых может легко контролироваться и изменяться. Дендримеры синтезируют пyтем повторяющегося добавления структурных единиц к мультифункциональному ядру (дивергентный способ синтеза) или их наращивания в направлении мультифункционального ядра (конвергентный способ синтеза), и каждое добавление к трехмерной оболочке структурных единиц приводит к образованию следующего поколения дендримеров. Полипропилениминовые дендимеры образуются, начиная с диаминобутанового ядра, к которому присоединяются вдвое больше аминогруппп в реакции Михаэля с присоединением акрилонитрила к первичным аминам и последующей гидрогенизацией нитрилов. Это приводит к удвоению количества аминогрупп. Полипропилениминовые дендримеры содержат 100% протонируемых азотов и до 64 терминальных аминогрупп (поколение 5, DAB 64). Протонируемыми группами обычно являются аминогруппы, которые способны присоединять протоны при нейтральном pH. Использование дендримеров в качестве агентов доставки генов было в значительной степени сфокусировано на использовании полиамидоамина, и фосфорсодержащие соединения со смесью аминов/амидов или N-P(02)S как конъюгирующих единиц, соответственно, при этом не было сообщений об использовании предшествующих поколений полипропилениминовых дендримеров для доставки генов. Полипропилениминовые дендримеры также исследовались в качестве чувствительных к pH систем контролируемого высвобождения для доставки лекарств и для их упаковки в качестве гостевых молекул при их химической модификации периферическими аминокислотными группами. Цитотоксичность и взаимодействие полипропилениминовых дендримеров с ДНК, а также эффективность трансфекции DAB 64 также были изучены.

[00658] Патентная публикация США № 20050019923 основана на наблюдении о том, что, в противоречие с более ранними сообщениями, катионные дендримеры, такие как полипропилениминовые дендримеры, демонстрируют подходящие свойства, такие как специфическое нацеливание и низкая токсичность, для использования для направленной доставки биоактивных молекул, таких как молекулы генетического материала. В дополнение к этому, производные катионных дендримеров также демонстрируют подходящие свойства для направленной доставки биоактивных молекул. См. также Bioactive Polymers, опубликованная заявка США 20080267903, в которой описано: "Различные полимеры, включая катионные полиаминные полимеры и дендримерные полимеры, как было показано, обладают антипролиферативной активностью, и следовательно могут быть полезны для лечения заболеваний, характеризуемых нежелательной пролиферацией клеток, таких как новообразования и опухоли, воспалительные заболевания (включая аутоиммунные заболевания), псориаз и атеросклероз. Такие полимеры могут быть использованы как самостоятельно в качестве активных агентов или в качестве "контейнера" для доставки других терапевтических агентов, таких как молекулы лекарств или нуклеиновые кислоты для генной терапии. В таких случаях собственная присущая полимеру противоопухолевая активность может дополнять активность доставляемого агента. Утверждения из данной патентной публикации могут быть использованы в совокупности с приведенными в настоящем описании идеями для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту систем(ы) или ее компонента(ов), или кодирующую таковые молекулу(ы) нуклеиновой кислоты.

Сверхзаряженные белки

[00659] Сверхзаряженные белки представляют собой класс полученных способами инженерии или природных белков с исключительно высоким положительным или отрицательным суммарным теоретическим зарядом, которые могут использоваться для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы(систем), или ее компонента(ов), или молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей их. Несущие как сверхположительный, так и сверхотрицательный заряд белки демонстрируют выдающуюся устойчивость к вызванному термически или химически агрегированию. Сверхположительно заряженные белки также способны проникать в клетки млекопитающих. Связывание с этими белками груза, такого как ДНК плазмиды, РНК или другие белки, может сделать возможной функциональную доставку этих макромолекул в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. Лаборатория под руководством David Liu сообщила о создании и описании сверхзаряженных белков в 2007 года (Lawrence et. al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112).

[00660] Отличная от вирусной доставка РНК и ДНК плазмиды в клетки млекопитающих представляет ценность как для исследований, так и для терапевтических применений (Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. 26, 561-569). Очищенный белок +36 GFP (или другой сверхположительно заряженный белок) смешивали с РНК на соответствующих питательных средах без сыворотки и оставляли для образования комплексов перед добавлением к клеткам. Добавление сыворотки на этой стадии ингибирует формирование сверхзаряженных комплексов белок-РНК и снижает эффективность лечения. Приведенный ниже протокол продемонстрировал эффективность для ряда клеточных линий (McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 106, 6111-6116). Однако экспериментальные эксперименты, изменяющие дозу белка и РНК, должны быть выполнены, чтобы оптимизировать процедуру специфичных клеточных линий. Однако следует провести пробные эксперименты с изменениями дозы белка и РНК для оптимизации использования процедуры применительно к конкретным клеточным линиям.

(1) За один день до обработки высевают 1×10⁵ клеток на лунку в 48-луночный планшет.

(2) В день обработки растворяют очищенный белок +36 GFP в питательных средах без сыворотки до конечной концентрации 200 нМ. Добавляют РНК до конечной концентрации 50 нМ. Перемешивают при помощи устройства для встряхивания и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут.

(3) Во время инкубации удаляют питательную среду клеток и промывают PBS один раз.

(4) После инкубации +36 GFP с РНК к клеткам добавляют комплексы белок-РНК.

(5) Инкубируют клетки с комплексами при 37°C в течение 4 часов.

(6) После инкубации отбирают питательные среды и промывают три раза раствором гепарина в PBS (20 Е/мл). Инкубируют клетки с содержащими сыворотку питательными средами на протяжении 48 ч или более в зависимости от анализа активности.

(7) Анализируют клетки при помощи иммуноблоттинга, к-ПЦР, анализа фенотипа или другого соответствующего способа.

[00661] Лаборатория под руководством David Liu также установила, что белок +36 GFP является эффективным агентом доставки плазмид в различные клетки. Поскольку ДНК плазмиды является большим грузом, чем миРНК, для эффективного образования комплексов с плазмидами требуется пропорционально большее количество белков +36 GFP. Для эффективной доставки плазмиды заявители доставки разработали вариант +36 GFP, несущий C-концевую метку HA2, пептида, для которого известна способность разрушать эндосомы, полученного из белка гемагглютинина вируса гриппа. Следующий протокол продемонстрировал эффективность для ряда клеток, однако как и рекомендовано выше, необходимо, чтобы дозы ДНК плазмиды и сверхзаряженного белка были оптимизированы для конкретных клеточных линий и различных применений способа доставки.

(1) За день до обработки высевают по 1×10⁵ клеток на лунку в 48-луночный планшет.

(2) В день обработки растворяют очищенный белок+36 GFP в питательных средах без сыворотки до конечной концентрации 2 нМ. Добавляют 1 мг ДНК плазмиды. Перемешивают с помощью устройства для встряхивания и инкубируют при комнатной температуре на протяжении 10 мин.

(3) Во время инкубации отбирают питательные среды клеток и промывают PBS один раз.

(4) После инкубации +36 GFP и ДНК плазмиды осторожно добавляют комплексы белок-ДНК к клеткам.

(5) Инкубируют клетки с комплексами при 37°C на протяжении 4 ч.

(6) После инкубации удаляют питательные среды, и промывают клетки PBS. Инкубируют клетки в содержащих сыворотку питательных средах и инкубируют следующие 24-48 часов.

(7) Анализируют доставку плазмиды (например, по управляемой плазмидой экспрессии генов) в зависимости от ситуации.

[00662] См. также, например, McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116 (2009); Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752 (2010); Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838 (2011); Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319 (2012); Thompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831-843 (2012). Способы с применением сверхзаряженных белков могут использоваться и/или адаптированы для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. Такие системы Dr. Lui и приведенные в настоящей заявке документы в совокупности с изложенными в настоящем описании идеями могут использоваться при доставке нацеленной на нуклеиновую кислоту систем(ы) или ее компонента(ов) или кодирующей молекул(ы) нуклеиновой кислот.

Пептиды, проникающие в клетки (CPP)

[00663] В еще одном варианте осуществления изобретения рассмотрено использование пептидов, проникающих в клетки (CPP), для доставки системы CRISPR-Cas. CPP представляют собой короткие пептиды, которые облегчают захват клетками различных молекулярных грузов (от наноразмерных частиц до маленьких химических молекул и больших фрагментов ДНК). Термин "груз" как используют в настоящем описании, включает, но не ограничивается ими, состоящую из терапевтических агентов, диагностических зондов, пептидов, нуклеиновых кислот, антисмысловых олигонуклеотидов, плазмид, белков, частиц, включая наночастицы, липосом, хромофоров, низкомолекулярных соединений и радиоактивных материалов. Аспекты изобретения подразумевают также, что груз может также включать любой компонент системы CRISPR-Cas или целую функциональную систему CRISPR-Cas. В одном аспекте изобретение относится к следующим способам доставки желаемого груза индивиду, включающим: (a) получение комплекса, включающего пептид, который способен проникать в клетки, и желаемый груз, и (b) пероральное, внутрисуставное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутриартериальное, интраназальное, внутрипаренхимное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, дермальное, ректальное или местное введение комплекса индивиду. Груз связывают с пептидами посредством химической связи (ковалентной) или посредством нековалентных взаимодействий.

[00664] Функцией проникающих в клетки пептидов (CPP) является доставка груза в клетки - процесс, который обычно осуществляется посредством эндоцитоза груза, доставленного к эндосомам живых клеток млекопитающих. Проникающие в клетку пептиды (CPP) имеют различные размеры, последовательность аминокислот и заряд, но все CPP объединяет одна отличительная особенность, которая состоит в способности перемещаться через плазменную мембрану и облегчать доставку различных молекулярных грузов в цитоплазму или органеллы. Такое перемещение CPP может быть разделено на три главные группы в соответствии с механизмами входа: прямое проникновение через мембрану, опосредованный эндоцитозом вход и перемещение с формированием переходной структуры. CPP нашли многочисленные способы применения в медицине в качестве агентов доставки лекарственных средств при лечении различных заболеваний, включая противораковые средства и средства для лечения вирусных заболеваний, а также контрастирующих агентов для маркировки клетки. Примеры последних включают использование в качестве переносчика GFP, контрастирующих агентов для МРТ или квантовых точек. CPP имеют большой потенциал в качестве векторов как in vitro, так и in vivo доставки для исследований и использования в медицине. CPP, как правило, либо имеют аминокислотный состав с высоким относительным содержанием положительно заряженных аминокислот, таких как лизин или аргинин, либо содержат последовательности, имеющие чередующийся паттерн полярных/заряженных аминокислот и неполярных, гидрофобных аминокислот. Эти два типа структур обозначают как поликатионные или амфифильные соответственно. Третий класс CPP представляет собой гидрофобные пептиды, содержащие только неполярные остатки с низким суммарным зарядом или имеющие гидрофобные аминокислотные группы, которые крайне важны для клеточного захвата. Один из первых обнаруженных CPP - трансактивирующий активатор транскрипции (Tat) вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), который эффективно захватывается из питательных сред многочисленными типами культивируемых клеток. Позднее количество известных CPP значительно увеличилось, и были получены небольшие молекулярные синтетические аналоги, более эффективные при трансдукции белка. CPP включают, но не ограничиваются ими: пенетратин, Tat (48-60), транспортан и (R-AhX-R4) (Ahx=аминогексаноил).

[00665] В патенте США 8372951 описан CPP, полученный из эозинофильного катионного белка (ECP), который демонстрирует высокую эффективность проникания в клетку и низкую токсичность. Также описаны особенности доставки CPP с грузом в представителях позвоночных. Будущие аспекты CPP и их доставки описаны в патентах США 8575305; 8614194 и 8044019. CPP может использоваться для доставки системы CRISPR-Cas или ее компонентов. Использование CPP для доставки системы CRISPR-Cas или ее компонентов также описано в рукописи "Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA", by Suresh Ramakrishna, Abu-Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor, et al. Genome Res. 2014 Apr 2, [Epub в печати], включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном оъеме, где продемонстрировано, что лечение рекомбинантным белком Cas9, конъюгированным с CPP, и направляющими РНК в комплексе с CPP приводит к генным нарушениям эндогенного характера в клеточных линиях человека. В статье белок Cas9 был связан с CPP через тиоэфирную связь, тогда как направляющая РНК была в комплексе с CPP, формируя уплотненные, положительно заряженные частицы. Было показано, что одновременная и последовательная обработка клеток человека, включая эмбриональные стволовые клетки, фибробласты кожи, клетки HEK293T, клетки HeLa и эмбриональные клетки карциномы, модифицированным Cas9 и направляющей РНК, ведет к эффективным генным изменениям с уменьшением количества нецелевых мутаций по сравнению с трансфекцией плазмидами.

Имплантируемые устройства

[00666] В другом варианте осуществления изобретения имплантируемые устройства также предусматриваются для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, ее компонента (компонентов) или молекулы (молекул) нуклеиновых кислот, кодирующих их. Например, в публикации патентной заявки США 20110195123 описано имплантируемое медицинское устройство, которое местно элюирует лекарственное средство и находится в человеке длительное время, включая несколько типов такого устройства, способы лечения и способы имплантации. Устройство, включающее полимерную подложку, такую как матрица, например, которая используется в качестве корпуса устройства, и лекарственное средство, и в некоторых случаях дополнительные каркасные материалы, такие как металлы или дополнительные полимеры и материалы, чтобы увеличить видимость и визуализацию. Имплантируемое устройство может быть предпочтительно для местной доставки лекарственного средства в течение длительного периода, когда препарат доставляется непосредственно во внеклеточный матрикс (ECM) пораженной заболеванием области, такой как опухоль, область воспаления, дегенерации, или для симптоматического лечения, или к травмированным клеткам гладкой мускулатуры, или для профилактики. Одним типом лекарственного средства является РНК, как описано выше, и эта система может быть использована/и или адаптирована для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. Способы имплантации в некоторых вариантах осуществления изобретения представляют собой существующие способы имплантации, которые разработаны и используются в настоящее время для других способов лечения, включая брахитерапию и биопсию при помощи иглы. В таких случаях размеры нового импланта, описанного в этом изобретении, подобны оригинальному импланту. Как правило, несколько устройств могут быть имплантированы во время одной лечебной процедуры.

[00667] В публикации патента США 20110195123 описано лекарственное средство, которое обеспечивает имплантируемую или вставную систему, включая системы, применимые для полостей, таких как брюшная полость, и/или любого другого типа введения, в которых система доставки лекарственного средства не закреплена или прикреплена, содержащую биостабильную и/или разлагаемую и/или биоабсорбируемую полимерную подложку, которая в некоторых случаях может представлять собой, например, матрицу. Следует отметить, что термин "установка" также включает имплантацию. Система доставки лекарственного средства предпочтительно реализуется как "Loder", как описано в публикации патента США 20110195123.

[00668] Полимер или множество полимеров являются биосовместимыми, включающими агент и/или множество агентов, что позволяет высвобождать агент с контролируемой скоростью, причем общий объем полимерного субстрата, такого как матрица, например, в некоторых вариантах осуществления необязательно и предпочтительно не превышают максимального объема, который позволяет достичь терапевтического уровня агента. В качестве неограничивающего примера такой объем предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 м³ до 1000 мм³, как того требует объем для загрузки агента. "Loder" в некоторых случаях может быть более крупным, например, когда он включен в устройство, размер которого определяется функциональностью, например, но без ограничения, коленный сустав, кольцо шейки матки и тому подобное.

[00669] Система доставки лекарственного средства (для доставки состава) сконструирована в некоторых вариантах осуществления, чтобы предпочтительно использовать разлагаемые полимеры, где основным механизмом высвобождения является объемная эрозия; или в некоторых вариантах осуществления используются нерастворимые или медленно деградирующие полимеры, в которых основным механизмом высвобождения является диффузия, а не объемная эрозия, так что наружная часть функционирует как мембрана, а ее внутренняя часть функционирует как резервуар для лекарственных средств, который практически не испытывает влияния окружения в течение длительного периода времени (например, от недели до нескольких месяцев). Могут также использоваться комбинации различных полимеров с различными механизмами высвобождения. Градиент концентрации на поверхности предпочтительно эффективно поддерживается постоянным в течение значительной части полного периода высвобождения лекарственного средства, и поэтому скорость диффузии является фактически постоянной (называемой диффузией "нулевого режима"). Под термином "постоянная" подразумевается скорость диффузии, которая предпочтительно поддерживается выше нижнего порога терапевтической эффективности, но которая может по-прежнему в некоторых случаях иметь начальный всплеск и/или может колебаться, например увеличиваясь и уменьшаясь в определенной степени. Скорость диффузии предпочтительно поддерживают в течение длительного периода времени, и ее можно считать постоянной до определенного уровня для оптимизации терапевтически эффективного периода, например эффективного периода подавления экспрессии генов.

[00670] Система доставки лекарственного средства необязательно и предпочтительно предназначена для защиты терапевтического агента на основе нуклеотидов от деградации, будь то химическая по своей природе или из-за действия ферментов и других факторов в организме индивида.

[00671] Система доставки лекарственного средства, описанная в публикации патента США 20110195123, в некоторых случаях связана с чувствительными и/или активирующими устройствами, которые работают во время и/или после имплантации устройства, посредством неинвазивных и/или минимально инвазивных способов активации и/или ускорения/замедления, например, необязательно включая, но не ограничиваясь ими, нагревание и охлаждение, лазерные лучи и ультразвук, включая фокусированные ультразвуковые и/или радиочастотные (RF) способы или устройства.

[00672] Согласно некоторым вариантам публикации патента США 010195123, область для местной доставки может необязательно включать целевые области, характеризующиеся высокой аномальной пролиферацией клеток и подавленным апоптозом, включая опухоли, активные и хронические воспаления и инфекции, включая аутоиммунные заболевания, дегенерацию тканей, включая мышцы и нервную ткань, хронические боли, участки дегенерации и места переломов костей и других ран для улучшения регенерации ткани и поврежденной сердечной, гладкой и поперечно-полосатой мускулатуры.

[00673] Область для имплантации композиции или целевая область, предпочтительно представляет собой радиус, область и/или объем, который достаточно мал, для целенаправленной локальной доставки. Например, целевой участок произвольно имеет диаметр в диапазоне приблизительно от 0,1 мм до приблизительно 5 см.

[00674] Местоположение целевой области должно быть выбрано предпочтительно для максимальной терапевтической эффективности. Например, композицию системы доставки лекарственных средств (необязательно с устройством для имплантации, как описано выше) необязательно и предпочтительно имплантируют непосредственно в саму опухоль или ее ближайшее окружение или связанные с ней кровеносные сосуды.

[00675] Например, композицию (необязательно вместе с устройством) необязательно имплантируют непосредственно в или вблизи поджелудочной железы, предстательной железы, молочных желез, печени, через сосок, в сосудистую систему и т.д.

[00676] Положение целевой области может быть выбрано из группы, включающей, по существу состоящей или состоящей из следующих примеров (не налагающих ограничений, поскольку любой участок тела может подходить для имплантации Loder): 1. дегенеративные участки мозга в базальных ганглиях, белом и сером веществе при заболеваниях Паркинсона или Альцгеймера, 2. позвоночник, например, в случае бокового амиотрофического склероза (ALS); 3. шейка матки для предотвращения инфекции вирусом папилломы человека (HPV); 4. суставы с острым и хроническим воспалением; 5. кожа, например, в случае псориаза; 6. симпатические и сенсорные нервы для получения обезболивающего эффекта; 7. внутрикостная имплантация; 8. области острой и хронической инфекции; 9. внутривлагалищная имплантация; 10. внутреннее ухо - слуховая система, лабиринт внутреннего уха, вестибулярная система; 11. внутритрахеальная имплантация; 12. внутрисердечная, коронарная, эпикардиальная имплантация; 13. имплантация в мочевой пузырь; 14. имплантация в желчную систему; 15. паренхимная ткань, включающая, не ограничиваясь, почкой, печенью, селезенкой; 16. лимфатические узлы; 17. слюнные железы; 18. десны; 19. внутрисуставная имплантация (в суставы); 20. внутриглазная имплантация; 21. ткани головного мозга; 22. желудочки мозга; 23. полости, включая брюшную полость (включая, не ограничиваясь, рак яичника); 24. внутрь пищевода и 25. ректально.

[00677] В некоторых случаях введение системы (например, устройства, содержащего состав), связано с инъекцией материала во внеклеточный матрикс в целевой области и вблизи этой области для изменения локального значения pH, и/или температуры, и/или других биологических факторов, влияющих на диффузию препарата и/или фармакокинетику во внеклеточном матриксе целевой области и вблизи нее.

[00678] В некоторых случаях, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, высвобождение указанного агента может быть связано с сенсорами и/или активирующими устройствами, управление которыми производится до и/или во время и/или после имплантации, неинвазивными и/или минимально инвазивными и/или другими способами активации и/или способами ускорения/замедления, включая использование лазерных лучей, радиации, нагревания и охлаждения, и ультразвуковое воздействие, включая фокусированный ультразвук и/или радиочастотные способы или устройства, а также химические активаторы.

[00679] Согласно другим вариантам осуществления изобретения, описанным в публикации патента США 20110195123, используемый препарат предпочтительно включает РНК, например для локализованных случаев рака молочной железы, поджелудочной железы, мозга, почки, мочевого пузыря, легкого и простаты, как описано ниже. Несмотря на то, что в качестве примера приводится РНК-интерференция, многие лекарственные препараты применимы при инкапсулирования в "Loder", и могут использоваться совместно с данным изобретением при условии, что такие лекарственные препараты сами по себе могут быть инкапсулированы в субстрат "Loder", например, такой как матрица, и эта система может быть использована и/или адаптирована для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению.

[00680] В качестве другого примера конкретного применения можно привести нервные и мышечные дегенеративные заболевания, развивающиеся из-за аномальной экспрессии генов. Локальная доставка РНК может проявлять терапевтическое действие свойства для изменения аномальной экспрессии генов. Локальная доставка антиапоптотических, противовоспалительных и антидегенеративных лекарственных препаратов, включая небольшие по размеру молекулы препаратов и макромолекулы может также быть терапевтической. В таких случаях "Loder "применяется для длительного высвобождения с постоянной скоростью и/или через специализированное устройство, которое имплантируется отдельно. Все это может быть использовано и/или адаптировано для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению.

[00681] В качестве еще одного примера конкретного применения могут быть приведены психиатрические и когнитивные заболевания, которые можно лечить с помощью модификаторов активности генов. Генный нокдаун является вариантом лечения этих заболеваний. "Loder", местно доставляющие терапевтические агенты к участкам центральной нервной системы, являются терапевтическими вариантами лечения психиатрических и когнитивных заболеваний включая, но не ограничиваясь ими, психоз, биполярные расстройства, невротические заболевания и поведенческие расстройства. "Loder" также могут местно доставлять лекарственные препараты, включая небольшие молекулы лекарственных препаратов и макромолекулы после имплантации в конкретные области головного мозга. Все это может быть использовано и/или адаптировано для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению.

[00682] Другим примером конкретного применения является подавление экспрессии врожденных и/или адаптивных медиаторов иммунитета в локальных участках, что позволяет предотвратить отторжение трансплантатов. Локальная доставка РНК и иммуномодулирующих реактивов с использованием Loder, имплантированного в пересаженный орган и/или область имплантации, способствует локальному иммунному подавлению, отражая иммуноциты, такие как CD, активированные в отношении пересаженного органа. Все это может быть использовано/и или адаптировано для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению.

[00683] В качестве другого примера конкретного применения можно привести факторы роста сосудов, включая VEGF, ангиогенин и другие, необходимые для неоваскуляризации. Локальная доставка факторов, пептидов, пептидомиметиков или подавление их репрессоров является важным терапевтическим способом; подавление репрессоров и локальная доставка факторов, пептидов, макромолекул и небольших молекул лекарств, стимулирующих ангиогенез с помощью "Loder", являются терапевтическими для периферических, системных и сердечно-сосудистых заболеваний.

[00684] Способ введения, такой как имплантация, может уже использоваться для других типов имплантации тканей и/или для введения и/или для отбора проб тканей, в некоторых случаях без модификаций, или, альтернативно, в некоторых случаях только с незначительными модификациями в таких способах. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, способы брахитерапии, биопсии, эндоскопии вместе с/или без применения ультразвука, такие как ретроградная холангиопанкреатография (ERCP,) стереотаксические способы для тканей головного мозга, лапароскопию, включая имплантацию лапароскопом в суставы, органы брюшной полости, стенку мочевого пузыря и полости тела.

[00685] Обсуждаемая в настоящем описании технология имплантируемых устройств может быть использована в рамках настоящего изобретения и, следовательно, благодаря этой информации и знаниям в данной области, система CRISPR-Cas, ее компоненты, их молекулы нуклеиновых кислот, или кодирующие или обеспечивающие их компоненты могут быть доставлены через имплантируемое устройство.

Пациент-специфические способы скрининга

[00686] Нацеленная на нуклеиновую кислоту система, которая нацелена на РНК, например, тринуклеотидные повторы, может быть использована для скрининга пациентов или образцов клеток/тканей пациентов на предмет наличия таких повторов. Повторы могут быть мишенью РНК системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, и при наличии связывания с ней с помощью системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, это связывание может быть обнаружено, тем самым указывая на то, что такой повтор присутствует. Таким образом, систему нацеливания на нуклеиновую кислоту можно использовать для скрининга пациентов или образцов клеток/тканей пациентов на наличие повторов. Затем пациенту можно назначить подходящее соединение (соединения) для лечения этого состояния; или может быть введена система нацеливания на нуклеиновую кислоту для связывания, которое приводит к инсерции, делеции или мутации и облегчению состояния.

[00687] Изобретение относится к нуклеиновым кислотам для связывания последовательностей РНК-мишеней.

мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющая РНК

[00688] мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющая РНК могут также доставляться отдельно. мРНК эффекторного белка системы CRISPR можно доставить до направляющей РНК, чтобы дать время для экспрессии белка CRISPR. мРНК эффекторного белка системы CRISPR можно вводить за 1-12 часов (предпочтительно приблизительно 2-6 часов) до введения направляющей РНК.

[00689] Альтернативно, мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющую РНК можно вводить вместе. Предпочтительно вторую усиливающую дозу направляющей РНК можно вводить через 1-12 часов (предпочтительно приблизительно 2-6 часов) после первоначального введения мРНК эффекторного белка CRISPR+направляющей РНК.

[00690] Эффекторный белок CRISPR согласно настоящему изобретению, а именно эффекторный белок C2c1 или C2c3, иногда упоминается в настоящем описании как фермент CRISPR. Понятно, что эффекторный белок основан или получен из фермента, поэтому термин "эффекторный белок", безусловно, включает "фермент" в некоторых вариантах осуществления изобретения. Однако также следует понимать, что эффекторный белок может, как требуется в некоторых вариантах осуществления, связывать ДНК или РНК, но не обязательно разрезать или вносить одноцепочечный разрыв, что является функцией "мертвого" эффекторного белка Cas.

[00691] Дополнительное введение мРНК эффекторного белка CRISPR и/или направляющей РНК может быть полезным для достижения наиболее эффективных уровней модификации генома. В некоторых вариантах осуществления фенотипическое изменение предпочтительно является результатом модификации генома, когда мишенью является генетическое заболевание, особенно в способах терапии, и предпочтительно, когда обеспечивается матрица репарации для коррекции или изменения фенотипа.

[00692] В некоторых вариантах осуществления заболевания, которые могут быть мишенью, включают заболевания, которые связаны с дефектами сплайсинга.

[00693] В некоторых вариантах осуществления клеточные мишени включают гемопоэтические стволовые клетки/клетки-предшественники (CD34+); Т-клетки человека; и клетки сетчатки - например, клетки-предшественники фоторецепторов.

[00694] В некоторых вариантах осуществления гены-мишени включают: ген бета-глобина человека - HBB (для лечения серповидноклеточной анемии, включая стимуляцию генной конверсии (с использованием близкородственного гена HBD в качестве эндогенной матрицы)); CD3 (Т-клетки) и CEP920 - сетчатка (глаза).

[00695] В некоторых вариантах осуществления болезни-мишени также включают: злокачественную опхуоль; серповидноклеточную анемию (основанную на точечной мутации); ВИЧ; бета-талассемию; и офтальмологические или глазные заболевания - например, амавроз Лебера (LCA), вызываемый дефектом сплайсинга.

[00696] В некоторых вариантах осуществления способы доставки включают: опосредованную катионными липидами "прямую" доставку комплекса фермент-гид (рибонуклеопротеин) и электропорацию плазмидной ДНК.

[00697] Способы по изобретению могут дополнительно включать доставку матриц, таких как матрицы репарации, которые могут представлять собой дцОДН или оцОДН, см. ниже. Доставка матриц может быть произведена одновременно или отдельно от доставки любого или всех эффекторных белков CRISPR или направляющих молекул, и через один и тот же механизм доставки или любой другой. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы матрица доставлялась вместе с направляющей молекулой и также предпочтительно эффекторным белком CRISPR. Примером может служить вектор AAV.

[00698] Способы по изобретению могут дополнительно включать: (а) доставку в клетку двухцепочечного олигодезоксинуклеотида (дцОДН), включающего выступающие концы, комплементарные выступающим концам, созданным упомянутым разрывом двойной цепи, причем указанный дцОДН встраивается в локус-мишень, или - (б) доставку в клетку одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (оцОДН), где указанный оцОДН действует как матрица для гомологичной направленной репарации разрыва двойной цепи. Способы по изобретению могут быть предназначены для профилактики или лечения заболевания у индивида, когда указанное заболевание вызвано дефектом в указанном локусе-мишени. Способы по изобретению могут осуществляться in vivo в индивидууме или ex vivo на клетке, взятой у индивида, где в некоторых случаях указанную клетку возвращают индивиду.

[00699] Для минимизации токсичности и неспецифических эффектов важно контролировать концентрацию доставляемых мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющей РНК. Оптимальные концентрации мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющей РНК могут быть определены путем тестирования различных концентраций на клеточной или животной модели и с использованием глубокого секвенирования для анализа степени модификации в потенциально нецелевых геномных локусах. Например, для направляющей последовательности, нацеленной на 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3' в гене EMX1 генома человека, глубокое секвенирование может быть использовано для оценки уровня модификации в следующих двух нецелевых локусах: 1: 5'-GAGTCCTAGC AGGAGAAG AA-3' и 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3'. Концентрация, которая дает наивысший уровень модификации мишени, минимизируя уровень внецелевой модификации, должна быть выбрана для доставки in vivo.

Индуцируемые системы

[00700] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок CRISPR может составлять компонент индуцируемой системы. Индуцируемый характер системы позволяет пространственно-временный контроль редактирования генов или экспрессии генов с использованием энергии. Форма энергии может включать, но не ограничивается ими, электромагнитное излучение, звуковую энергию, химическую энергию и тепловую энергию. Примеры индуцируемой системы включают стимулирующие тетрациклин промоторы (Tet-On или Tet-Off), системы двугибридной активации транскрипции с малой молекулой (FKBP, ABA и т.д.) или светоиндуцируемые системы (фитохром, LOV-домены или криптохром). В одном варианте осуществления эффекторный белок CRISPR может быть частью светоиндуцируемого эффектора транскрипции (LITE) для прямого изменения транскрипционной активности последовательность-специфическим образом. Светоиндуцируемые компоненты могут включать эффекторный белок CRISPR, светочувствительный гетеродимер цитохрома (например, Arabidopsis thaliana) и домен активации/репрессии транскрипции. Другие примеры индуцибельных связывающих ДНК белков и способы их применения приведены в US 61/736465 и US 61/721283 и WO 2014018423 A2, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Самоинактивирующиеся cистемы

[00701] Как только все копии гена в геноме клетки отредактированы, продолжение экспрессии эффекторного белка CRISPR/C2c1 или C2c3 в такой клетке больше не требуется. Действительно, длительная экспрессия является нежелательной с точки зрения нецелевых эффектов на не являющихся мишенью участках генома и т.д. Таким образом, является полезной ограниченная по времени экспрессия. Одним из подходов является индуцируемая экспрессия, но, кроме того, заявители сконструировали cамоинактивирующуюся систему CRISPR, которая основана на использовании некодирующей направляющей последовательности-мишени в самом векторе CRISPR. Таким образом, после начала экспрессии система CRISPR произведет собственное разрушение, но прежде чем разрушение завершится, у системы будет время, чтобы отредактировать геномные копии гена-мишени (который в случае боычной точечной мутации в диплоидной клетке требует не более двух редактирований). Просто самоинактивирующаяся система CRISPR-Cas включает дополнительную РНК (т.е. направляющую РНК), которая нацелена на кодирующую последовательность самого эффекторного белка CRISPR или нацелена на одну или более некодирующих направляющих последовательностей-мишеней, комплементарных уникальным последовательностям, находящимся в одном или более из следующих полжоений:

(a) в промоторе, управляющем экспрессией некодирующих элементов РНК,

(b) в промоторе, управляющем экспрессией гена эффекторного белка C2c1 или C2c3,

(c) в 100 п.о. от кодона начала трансляции ATG в последовательности, кодирующей эффекторный белок C2c1 или C2c3,

(d) в инвертированном концевом повторе (iTR) вирусного вектора доставки, например, в геноме AAV.

[00702] Кроме того, такая РНК может быть доставлена посредством вектора, например, отдельного вектора или того же самого вектора, который кодирует комплекс CRISPR. При доставке посредством отдельного вектора РНК CRISPR, нацеленная на экспрессию Cas, может быть введена последовательно или одновременно. При последовательном введении, РНК CRISPR, нацеленная на экспрессию Cas, должна быть доставлена после РНК CRISPR, которая предназначена, например, для генного редактирования или генной инженерии. Этот период может продолжаться минуты (например, 5 минут, 10 минут, 20 минут, 30 минут, 45 минут, 60 минут). Этот период может продолжаться часы (например, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов, 24 часа). Этот период может продолжаться дни (например, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 7 дней). Этот период может продолжаться недели (например, 2 недели, 3 недели, 4 недели). Этот период может продолжаться месяцы (например, 2 месяца, 4 месяца, 8 месяцев, 12 месяцев). Этот период может продолжаться годы (2 года, 3 года, 4 года). Там, где направляющая РНК нацеливает на последовательности, кодирующие экспрессию белка Cas, эффекторный белок становится препятствием, и система становится самоинактивирующейся. Таким же образом РНК CRISPR, нацеленная на экспрессию Cas, применяемую посредством, например липосом, липофекции, частиц, микровезикул, как описано в настоящемописании, может быть введена последовательно или одновременно. Точно так же самоинактивация может использоваться для инактивации одной или более направляющих РНК, использовавшихся для нацеливания на одну или более мишеней.

[00703] В некоторых аспектах предусматривается единственная гРНК, способная к гибридизации с низлежащей последовательностью по отношению к старт-кодону эффекторного белка CRISPR, таким образом, после промежутка времени наблюдается потеря экспрессии эффекторного белка CRISPR. В некоторых вариантах предлагаются одна или более гРНК, способных к гибридизации с одним или более кодирующими или некодирующими участками полинуклеотида, кодирующего систему CRISPR-Cas, в результате чего после промежутка времени происходит инактивация одного или более, или в некоторых случаях всех, систем CRISPR-Cas. В некоторых аспектах системы, и не ограничиваясь теорией, клетка может включать множество комплексов CRISPR-Cas, где первая подгруппа комплексов CRISPR включает первую направляющую РНК, способную к нацеливанию на геномный локус или локусов для редактирования, и вторая подгруппа комплексов CRISPR включает по меньшей мере одну вторую направляющую РНК, способную к нацеливанию на полинуклеотид, кодирующий систему CRISPR-Cas, где первая подгруппа комплексов CRISPR-Cas опосредует редактирование геномного локуса или локусов, являющихся мишенью, и вторая подгруппа комплексов CRISPR в итоге инактивирует систему CRISPR-Cas, таким образом инактивируя дальнейшую экспрессию CRISPR-Cas в клетке.

[00704] Таким образом изобретение отностся к системе CRISPR-Cas, включающей один или более векторов для доставки в эукариотическую клетку, где вектор(ы) кодирует: (i) эффекторный белок CRISPR; (ii) первую направляющую РНК, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в клетке; (iii) вторую направляющую РНК, способную к гибридизации с одной или более последовательностями-мишенями в векторе, кодирующем эффекторный белок CRISPR, таким образом отличаясь только направляющей последовательностью, где при экспрессии в клетке первая направляющая РНК направляет специфическое для последовательности связывание первого комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью в клетке, вторая направляющая РНК направляет специфическое для последовательности связывание второго комплекса CRISPR к последовательности-мишенью в векторе, который кодирует эффекторный белок CRISPR; комплексы CRISPR включают эффекторный белок CRISPR, связанный с направляющей РНК, так что направляющая РНК может гибридизироваться с ее последовательностью-мишенью; и второй комплекс CRISPR инактивирует систему CRISPR-Cas для предотвращения продолжительной экспрессии эффекторного белка CRISPR клеткой.

[00705] Следующие характеристики вектора(ов), кодируемого фермента, направляющих последовательностей, и т.д. раскрыты в других разделах здесь. Система может кодировать (i) фермент CRISPR, более конкретно C2c1 или C2c3; (ii) первую направляющую РНК, включающую последовательность, способную к гибридизации с первой последовательностью-мишенью в клетке, (ii) вторую направляющую РНК, способную к гибридизации с вектором, который кодирует фермент CRISPR. Точно так же фермент может включать одну или более последовательностей NLS и т.д.

[00706] Различные кодирующие последовательности (эффекторный белок CRISPR и направляющие РНК) могут быть включены в единственный вектор или в несколько векторов. Например, возможно закодировать эффекторный белок в одном векторе и различные последовательности РНК в другом векторе, или закодировать эффекторный белок и одну направляющую РНК в одном векторе и оставшуюся направляющую РНК в другом векторе, или возможна любая другая перестановка. В целом предпочтительна система с использованием всего одного или двух различных векторов.

[00707] При использовании нескольких векторов, возможно доставлять их в неравных количествах, и идеально с избытком вектора, кодирующего первую направляющую РНК относительно второй направляющей РНК, таким образом помогая задерживать конечную инактивацию системы CRISPR, чтобы произошло редактирование генома.

[00708] Первая направляющая РНК может быть нацелена на любую представляющую интерес последовательность-мишень в геноме, как описано в других разделах здесь. Вторая направляющая РНК нацелена на последовательность в векторе, который кодирует эффекторный белок C2c1 или C2c3 системы CRISPR, и таким образом инактивирует экспрессию эффекторного белка c этого вектора. Таким образом, последовательность-мишень в векторе должна быть способна инактивировать экспрессию. Подходящие последовательности-мишени могут находиться, например, вблизи или в старт-кодоне трансляции кодирующей последовательности эффекторного белка C2c1 или C2c3, в некодирующей последовательности в промоторе, управляющем экспрессией некодирующих элементов РНК, в промоторе, управляющем экспрессией гена эффекторного белка C2c1 или C2c3, в 100 п.о. от старт-кодона трансляции ATG в кодирующей последовательности Cas, и/или в инвертированном концевом повторе (iTR) вирусного вектора доставки, например, в геноме AAВ. Двухцепочечный разрыв около этого участка может вызывать изменение структуры в кодирующей последовательности Cas, вызывая потерю экспрессии белка. Альтернативная последовательность-мишень для "самоинактивирующейся" направляющей РНК иметь целью редактирование/инактивацию регуляторных областей/последовательностей, необходимых для экспрессии системы CRISPR с эффекторным белком C2c1 или C2c3 или для стабильности вектора. Например, если промотор для кодирующей Cas последовательности разрушен, тогда транскрипция может ингибироваться или прекращаться. Точно так же, если вектор включает последовательности для репликации, поддержания или стабильности, тогда можно осуществлять нацеливание на них. Например, в векторе AAВ полезная последовательность-мишень находится в инвертированных концевых повторах (iTR). Другие полезные последовательности для нацеливания могут представлять собой последовательности промотора, участки полиаденилирования и т.д.

[00709] Кроме того, если направляющие РНК будут экспрессироваться в формате матрицы, то "самоинактивирующиеся" направляющие РНК, которые нацелены на оба промотора одновременно, приведут к вырезанию находящихся между ними нуклеотидов из конструкции, экспрессирующей CRISPR-Cas, эффективно приводя к ее полной инактивации. Точно так же вырезание промежуточных нуклеотидов будет приводить к результату в случаях, где направляющие РНК нацелены на оба инвертированных концевых повтора (ITR), или нацелены на два или более других компонентов CRISPR-Cas одновременно. Самоинактивация, как объяснено в настоящем описании, в целом применима для регулирования работы систем CRISPR-Cas. Например, самоинактивация, как объяснено в настоящем описании, может быть применена для репарации мутаций системой CRISPR, например, нарушений, вызванных экспансией повторов. В результате самоинактивации репарация при помощи системы CRISPR обладает временной активностью.

[00710] Добавление ненацеливающих нуклеотидов к 5'-концу (например, 1-10 нуклеотидов, предпочтительно 1-5 нуклеотидов) "самоинактивирующейся" направляющей РНК может использоваться для задержки ее процессинга и/или изменения ее эффективности в качестве средства обеспечения редактирования в геномном локусе-мишени до прекращения работы системы CRISPR-Cas.

[00711] В одном аспекте самоинактивирующейся системы AAV-CRISPR-Cas плазмиды, совместно экспрессирующие одну или более направляющих РНК, нацеленных на представляющие интерес геномные последовательности (например, 1-12, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-30), могут быть сконструированы с "самоинактивирующимися" направляющими РНК, которые нацелены на последовательность SpCas9 непосредственно в или вблизи сконструированного старт-кодона ATG (например, в пределах 5 нуклеотидов, в пределах 15 нуклеотидов, в пределах 30 нуклеотидов, в пределах 50 нуклеотидов, в пределах 100 нуклеотидов). Также направляющая РНК может осуществлять нацеливание на регуляторную последовательность в области промотора U6. Направляющие РНК, управляемые U6, могут быть сконструированы в формате матрицы, таким образом, что одновременно может высвобождаться несколько последовательностей направляющей РНК. Псле первоначальной доставки в ткань/клетки, являющиеся мишенью, (покинувшие клетку) направляющие РНК начинают накапливаться, в то время как уровни Cas повышаются в ядре. Комплексы Cas со всеми направляющими РНК опосредуют геномное редактирование и самоинактивацию плазмид CRISPR-Cas.

[00712] Одним из аспектов самоинактивирующейся системы CRISPR-Cas является экспрессия отдельно или в формате тандемной матрице от 1 до 4 или более различных направляющих последовательностей; например, до приблизительно 20 или приблизительно 30 направляющих последовательностей. Каждая индивидуальная самоинактивирующаяся направляющая последовательность может осуществлять нацеливание на отдельную мишень. Таковая может быть процессирована из, например, одного химерного транскрипта pol3. Могут использоваться промоторы Pol3, такие как промоторы U6 или Hl. Также могут использоваться промоторы Pol2, такие как описанные в настоящем описании. Последовательности инвертированных концевых повторов (iTR) могут фланкировать промотор Pol3-направляющую (направляющие) РНК-промотор Pol2-Cas.

[00713] Одним из аспектов транскрипта с тандемной матрицей является то, что одна или более направляющих РНК редактируют одну или более мишень(ей), в то время как одно или более самоинактивирующихся направляющих РНК инактивирует систему CRISPR-Cas. Таким образом, например, описанная система CRISPR-Cas для репарации экспансии повторов может быть непосредственно объединена с самоинактивирующейся системой CRISPR-Cas, описанной в настоящем описании. У такой системы может быть, например, две направляющих РНК, нацеливающих на учасок-мишень для редактирования, а также по меньшей мере третья направляющая РНК, нацеливающая на самоинактивацию CRISPR-Cas. См. заявку с серийным номером № PCT/US2014/069897 под названием "Compositions And Methods Of Use Of Crispr-Cas Systems In Nucleotide Repeat Disorders", опубликованную 12 декабря 2014 года в качестве WO/2015/089351.

[00714] Направляющая РНК может быть контрольной направляющей РНК. Например, она может быть сконструирована для нацеливания на последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сам фермент CRISPR, как описано в US2015232881Al, описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения система или композиция может содержать только направляющую РНК, сконструированную для нацеливания на последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент CRISPR. Кроме того, система или композиция может содержать направляющую РНК, сконструированную для нацеливания на последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент CRISPR, а также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент CRISPR и, необязательно, вторую направляющую РНК и, далее необязательно, матрицу репарации. Вторая направляющая РНК может быть основной мишенью системы или композиции CRISPR (такой как терапевтическая, диагностическая, предназначенная для нокаута и т.д., как определено в настоящем описании). Таким образом система или композиция являются самоинактивирующимися. Это проиллюстрировано в отношении Cas9 в US2015232881A1 (также изданном как WO2015070083(Al), упоминаемой в настоящем описании, и может быть экстраполировано на C2c1 или C2c3.

Ферменты согласно изобретению используемые в мультиплексном (тандемном) подходе нацеливания

[00715] Авторы изобретения показали, что ферменты CRISPR, как определено в настоящем описании, могут использовать более одной направляющей РНК, не теряя активности. Это позволяет использовать ферменты CRISPR, системы или комплексы, как определено в настоящем описании, для нацеливания на несколько ДНК, генов или локусов, являющихся мишенями, посредством одного фермента, системы или комплекса, как определено в настоящем описании. Направляющие РНК могут быть расположены тандемно, и необязательно разделены последовательностью нуклеотидов, такой как прямой повтор, как определено здесь. Положение различных направляющих РНК в тандеме не влияет на активность. Отмечено, что термины "система CRISPR-Cas", "Комплекс CRISPR Cas" "комплекс CRISPR" и "система CRISPR" используются взаимозаменяемо. Также термины "фермент CRISPR", "фермент Cas", или "фермент CRISPR-Cas", могут использоваться взаимозаменяемо. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанный фермент CRISPR, фермент CRISPR-Cas или фермент Cas является C2c1 или C2c3 или любым из модифицированных или мутированных их вариантов, описанных в настоящем описании в других разделах.

[00716] В одном из аспектов изобретение относится к не встречающемуся в природе или сконструированному способами инженерии ферменту CRISPR, предпочтительно ферменту CRISPR 2 класса, предпочтительно ферменту CRISPR типа V или VI, как описано в настоящем описании, такому как, но не ограничиваясь ими, C2c1 или C2c3, описанные в настоящем описании, для применения для тандемного или мультиплексного нацеливания. Нужно понимать, что в данном подходе может использоваться любой из ферментов CRISPR (или CRISPR-Cas или Cas), комплексов или систем согласно изобретению, как описано здесь в других разделах. Любой из способов, продуктов, композиций и применения, как описано в настоящем описании, в равной степени применим в мультиплексном или тандемном подходе к нацеливанию, как подробно описано ниже. В качестве дальнейшего руководства предложены следующие конкретные аспекты и варианты осуществления изобретения.

[00717] В одном из аспектов изобретение относится к применению фермента C2c1 или C2c3, комплекса или системы, как определено в настоящем описании, для нацеливания на несколько локусов генов. В одном из вариантов осуществления изобретения это может быть осуществлено при помощи нескольких (тандемных или мультиплексных) последовательностей направляющей РНК (гРНК).

[00718] В одном из аспектов изобретение относится к способам применения одного или более элементов фермента C2c1 или C2c3, комплекса или системы, как определено в настоящем описании, для тандемного или мультиплексного нацеливания, где указанная система CRISPR включает несколько последовательностей направляющей РНК. Предпочтительно, чтобы указанные последовательности гРНК были разделены последовательностями нуклеотидов, такими как прямой повтор, как определено в настоящем описании.

[00719] Фермент C2c1 или C2c3, система или комплекс, как определено в настоящем описании, обеспечивают эффективное средство для модификации нескольких полинуклеотидов-мишеней. Фермент C2c1 или C2c3, система или комплекс, как определено в настоящем описании, имеет большое разнообразие применений, включая модификацию (например, делецию, инсерцию, транслокацию, инактивацию, активацию) одного или более полинуклеотидов-мишеней в разнообразных типах клеток. Как таковой фермент C2c1 или C2c3, система или комплекс по изобретению, как определено в настоящем описании, имеет широкий спектр применений, например, в генной терапии, скрининге лекарственных средств, диагностике заболеваний и прогнозировании, включая нацеливание на несколько локусов генов посредством единственной системы CRISPR.

[00720] В одном из аспектов изобретение относится к ферменту C2c1 или C2c3, системе или комплексу, как определено в настоящем описании, т.е. комплексу CRISPR-Cas C2c1 или C2c3, имеющему белок C2c1 или C2c3, к тому же имеющему по меньшей мере один домен дестабилизации, ассоциированный с ним, и несколько направляющих РНК, которые нацелены на несколько молекул нуклеиновых кислот, такие как молекулы ДНК, посредством чего каждая из указанных нескольких направляющих РНК специфически нацелена на соответствующую молекулу нуклеиновой кислоты, например, молекулу ДНК. Каждая молекула нуклеиновой кислоты, являющаяся мишенью, например, молекула ДНК, может кодировать продукт гена или содержать локус. Следовательно, использование нескольких направляющих РНК позволяет нацеливание на несколько локусов или более генов. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3 может расщеплять молекулу ДНК, кодирующую продукт гена. В некоторых вариантах осуществления изобретения экспрессия продукта гена изменена. Белок C2c1 или C2c3 и направляющие РНК в природе не встречаются вместе. Изобретение охватывает направляющие РНК, включающие тандемно расположенные направляющие последовательности. Изобретение далее охватывает кодирующие последовательности для белка C2c1 или C2c3, являющиеся кодон-оптимизированными для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, клеткой растения или клеткой дрожжей, и в более предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка млекопитающего является клеткой человека. Экспрессия продукта гена может быть уменьшена. Фермент C2c1 или C2c3 может являться частью системы CRISPR. или комплекса, который далее включает, тандемно расположенные направляющие РНК (гРНК), включающие серию из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 25, 30 или более 30 направляющих последовательностей, каждая из которых способна к специфичной гибридизации к последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени в клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональная система или комплекс CRISPR C2c1 или C2c3 связывается с несколькими последовательностями-мишенями. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональная система CRISPR или комплекс могут редактировать несколько последовательностей-мишеней, например, последовательности-мишени могут включать геномный локус, и в некоторых вариантах осуществления изобретения может происходить изменение экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональная система CRISPR или комплекс могут включать дополнительные функциональные домены. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу изменения или модификации экспрессии нескольких продуктов генов. Способ может включать введение в клетку, содержащую указанные нуклеиновые кислоты, являющиеся мишенью, например, молекулы ДНК, или содержащую и экспрессирующую нуклеиновые кислоты, являющиеся мишенью, например, молекулы ДНК; например, нуклеиновые кислоты, являющиеся мишенями, могут кодировать продукты генов или обеспечивать экспрессию продуктов генов (например, регуляторные последовательности).

[00721] В предпочтительных вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR, используемый для мультиплексного нацеливания, является C2c1 или C2c3, или системой или комплексом CRISPR, которые включают C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR, используемый для мультиплексного нацеливания, представляет собой AacC2c1, или система или комплекс CRISPR, используемые для мультиплексного нацеливания, включают AacC2c1. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR является AacC2c1, или система или комплекс CRISPR включают AacC2c1. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент С2с1, используемый для мультиплексного нацеливания, расщепляет обе цепи ДНК, внося двухцепочечный разрыв (DSB). В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR, используемый для мультиплексного нацеливнаия, является никазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3, используемый для мультиплексного нацеливания, является двойной никазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3, используемый для мультиплексного нацеливания, является ферментом C2c1 или C2c3, таким как фермент C2c1 или C2c3, как определено в настоящем описании.

[00722] В некоторых основных вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3, используемый для мультиплексного нацеливания, связан с одним или более функциональными доменами. В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR, используемый для мультиплексного нацеливания, является мертвым C2c1 или мертвым C2c3, как определено в настоящем описании.

[00723] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к средству для доставки фермента C2c1 или C2c3, системы или комплекса для использования во множественном нацеливании, как определено в настоящем описании, или полинуклеотидов, определенных в настоящем описании. Неограничивающие примеры таких средств доставки включают, например, частицы(ы), доставляющие компонент(ы) комплекса, вектор(ы), включающие полинуклеотид(ы), обсуждаемые в настоящем описании (например, кодирующие ферменты CRISPR, обеспечивающие нуклеотиды, кодирующие комплекс CRISPR). В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор может быть плазмидой или вирусным вектором, таким как ААV или лентивирус. Временная трансфекция с плазмидами, например, в клетки HEK может быть преимущественной, особенно учитывая ограничения ААV в отношении размера и что, в то время как C2c1 или C2c3 помещаются в ААV, с дополнительными направляющими РНК может быть достигнут верхний предел.

[00724] Также предусматривается модель, которая конститутивно экспрессирует фермент C2c1 или C2c3, комплекс или систему, используемые в рамках настоящего изобретения для мультиплексного нацеливания. Организм может быть трансгенным и может быть трансфицирован векторами по настоящему изобретению или может быть потомком организма, трансфицированного таким образом. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к композициям, включающим фермент CRISPR, систему и комплекс, как определено в настоящем описании, или полинуклеотиды или векторы, описанные в настоящем описании. Также предусматриваются системы CRISPR C2c1 или C2c3 или комплексы, включающие несколько направляющих РНК, предпочтительно организованные в формате тандема. Указанные различные направляющие РНК могут быть разделены последовательностями нуклеотидов, такими как прямые повторы.

[00725] Также предусматривается способ лечения индивидуума, например, индивидуума, нуждающегося в этом, включающий индукцию генного редактирования посредством трансформации индивидуума полинуклеотидами, кодирующими систему CRISPR C2c1 или C2c3 или комплекс, или любым из полинуклеотидов или векторов, описанных в настоящем описании и вводимых субъекту. Также предусматривается подходящая матрица репарации, например доставлена вектором, включающим указанную матрицу репарации. Также предусматривается способ лечения индивидуума, например, индивидуума, нуждающегося в этом, включающий индукцию активации или репрессии транскрипции нескольких локусов-мишеней посредством трансформации индивидуума полинуклеотидами или векторами, описанными в настоящем описании, где указанные полинуклеотиды или векторы кодируют или включают фермент C2c1 или C2c3, комплекс или систему, включающие несколько направляющих РНК, предпочтительно расположенных тандемно. Если какой-либо лечение происходит ex vivo, например в клеточной культуре, тогда понятно, что термин "индивидуум" может быть заменен фразой "клетка или клеточная культура".

[00726] Также предлагаются композиции, включающие фермент C2c1 или C2c3, комплекс или систему, включающие множественные направляющие РНК, предпочтительно тандемно расположенные, или полинуклеотид или вектор, кодирующий или включающий указанный фермент C2c1 или C2c3, комплекс или систему, включающие множественные направляющие РНК, предпочтительно тандемно расположенные, для применения в способах лечения, как определено в настоящем описании. Может предусматриваться набор, включающий такие композиции. Также предусматривается использование указанной композиции для изготовления лекарственных средств для таких способов лечения. Также изобретение предусматривает использование системы CRISPR C2c1 или C2c3 в скрининге, например, скрининге приобретения функции. Клетки, которые искусственным образом вынудили сверхэкспрессировать ген, способны со временем снизить экспрессию гена (обратное восстановление равновесия), например, посредством отрицательной обратной связи. Ко времени начала скрининга экспрессия нерегулируемого гена снова может снизиться. Использование индуцибельного активатора C2c1 или C2c3 позволяет вызывать транскрипцию прямо перед скринингом и поэтому минимизирует вероятность ложноотрицательных результатов. Таким образом, при использовании настоящего изобретения в скрининге, например, скрининге приобретения функции, вероятность ложных отрицательных результатов может быть сведена к минимуму.

[00727] В одном из аспектов изобретение относится к сконструированной способами инженерии не встречающейся в природе системе CRISPR, включающей белок C2c1 или C2c3 и несколько направляющих РНК, каждая из которых специфически нацелена на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена в клетке, посредством чего каждая из нескольких направляющих РНК нацелена на конкретную молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, и белок C2c1 или C2c3 расщепляет молекулу ДНК-мишень, кодирующую продукт гена, посредством чего экспрессия продукта гена изменяется, и где белок CRISPR и направляющие РНК в природе не встречаются вместе. Изобретение охватывает несколько направляющих РНК, включая несколько направляющих последовательностей, предпочтительно отделенные нуклеотидной последовательностью, такой как прямой повтор. В одном варианте осуществления изобретения белок CRISPR является белком CRISPR-Cas типа V или VI, и в более предпочтительном варианте осуществления изобретения белок CRIPSR является белком C2c1 или C2c3. Кроме того, изобретение включает белок C2c1 или C2c3, являющийся кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, и в более предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка млекопитающего является клеткой человека. В дальнейшем варианте осуществления изобретения уменьшена экспрессия продукта гена.

[00728] В другом аспекте изобретение относится к сконструированной способами инженерии не встречающейся в природе векторной системе, включающей один или более векторов, включающих первый регуляторный элемент, функционально связанный со несколькими направляющими РНК системы CRISPR C2c1 или C2c3, каждая из которых специфически нацелена на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, и второй регуляторный элемент, функционально связанный с последовательностью, кодирующей белок CRISPR. Оба регуляторных элемента могут быть расположены на том же самом векторе или на различных векторах системы. Несколько направляющих РНК нацелено на несколько молекул ДНК, кодирующих несколько продуктов генов в клетке, и белок CRISPR может расщеплять несколько молекул ДНК, кодирующих продукты генов (он может расщеплять одну или обе цепи или по существу не иметь никакой нуклеазной активности), посредством чего экспрессия нескольких продуктов генов может быть изменена; и где белок CRISPR и несколько направляющих РНК в природе не встречаются вместе. В предпочтительном варианте осуществления изобретения белок CRISPR является белком C2c1 или C2c3, необязательно кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, клеткой растения или клеткой дрожжей, и в более предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка млекопитающего является клеткой человека. В следующем варианте осуществления изобретения экспрессия каждого из нескольких продуктов генов изменена, предпочтительно уменьшена.

[00729] В одном из аспектов изобретение относится к векторной системе, включающей один или более векторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения система включает: (a) первый регуляторный элемент, функционально связанный с последовательностью прямого повтора и одним или более участками вставки для вставки одной или более направляющих последовательностей выше или ниже последовательностей прямого повтора, где, когда экспрессируются, одна или более направляющих последовательностей управляют специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR с одной или более нацеливающими последовательностями в эукариотической клетке, где комплекс CRISPR включает фермент C2c1 или C2c3 в комплексе с одной или более направляющими последовательностями, гибридизованными с одной или более последовательностями-мишенями, и (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей указанный фермент C2c1 или C2c3, предпочтительно включая по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации и/или по меньшей мере одну последовательность NES; где компоненты (a) и (b) расположены на одной и той же или на различных векторах системы. В некоторых вариантах осуществления изобретения компонент (a) далее включает две или более направляющих последовательностей, функционально связанных с первым регуляторным элементом, где при экспрессии каждая из двух или более направляющих последовательностей управляет специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR C2c1 или C2c3 c различными последовательностями-мишенями в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения комплекс CRISPR включает одну или более последовательностей ядерной локализации и/или один или более NES достаточной силы, чтобы стимулировать накопление указанного комплекса CRISPR C2c1 или C2c3 в поддающемся обнаружению количестве внутри или снаружи ядра эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый регуляторный элемент является промотором полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй регуляторный элемент является промотором полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждая из направляющих последовательностей имеет длину по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 25 нуклеотидов, или 16-30, или 16-25, или 16-20 нуклеотидов.

[00730] Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут включать полинуклеотиды, кодирующие фермент C2c1 или C2c3, систему или комплекс для применения в множественном нацеливании, как определено в настоящем описании, в форме, подходящей для экспрессии такой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что такие рекомбинантные экспрессирующие векторы содержат один или более регуляторных элементов, которые могут быть выбраны в соответствии с используемыми для экспрессии клетками хозяина и которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована. В рекомбинантном векторе экспрессии "функционально связанный" должно означать, что нуклеотидная последовательность-мишень связана с регуляторным(и) элементом(ами) таким образом, что экспрессия такой нуклеотидной последовательности является возможной (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке хозяина при введении вектора в клетку хозяина).

[00731] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин временно или постоянно трансфицирована одним или более векторами, включающими полинуклеотиды, кодирующие фермент C2c1 или C2c3, систему или комплекс для использования во множественном нацеливании, как определено в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения трансфицирована клетка, естественным образом встречающаяся у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка, которая трансфицирована, получена от индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка происходит от клеток, полученных от индивидуума, таких как клеточная линия. Большое разнообразие клеточных линий для культуры тканей известно в данной области и иллюстрируются в настоящем описании. Доступны клеточные линии из множества источников, известных квалифицированным специалистам в данной области (см., например, American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Вирджиния)). В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка, трансфицированная одним или более векторами, включающими полинуклеотиды, кодирующие фермент C2c1 или C2c3, систему или комплекс для использования во множественном нацеливании, как определено в настоящем описании, используется для создания новой клеточной линии, включающей одну или более происходящих из вектора последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка, временно трансфицированная компонентами системы CRISPR C2c1 или C2c3 или комплекса для использования во множественном нацеливании, как описано в настоящем описании (например, посредством временной трансфекции одного или более векторов или трансфекции РНК), и модифицированная посредством активности системы CRISPR C2c1 или C2c3 или комплекса, используется для получения новой клеточной линии, включающей клетки, содержащие модификацию, но лишенные какой-либо другой экзогенной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, временно или постоянно трансфицированные одним или более векторами, включающими полинуклеотиды, кодирующие фермент C2c1 или C2c3, систему или комплекс для использования во множественном нацеливании, как определено в настоящем описании, или клеточные линии, полученные из таких клеток, используются в оценке одного или более исследуемых соединений.

[00732] Термин "регуляторный элемент" определен в настоящем описании в других разделах.

[00733] Преимущественные векторы включают лентивирусы и адено-ассоциированные вирусы, и такие типы векторов также могут быть отобраны для нацеливания на конкретные типы клеток.

[00734] В одном из аспектов изобретение относится к эукариотической клетке-хозяину, включающей (a) первый регуляторный элемент, функционально связанный с последовательностью прямого повтора и одним или более участками вставки для вставки одной или более последовательностей направляющей РНК выше или ниже (в зависимости от того, что применимо) относительно последовательности прямого повтора, где, когда экспрессируется, направляющая последовательность(и) управляет последовательность-специфическим связыванием комплекса CRISPR C2c1 или C2c3 c соответствующей последовательностью(и)-мишенью в эукариотической клетке, где комплекс CRISPR C2c1 или C2c3 включает фермент C2c1 или C2c3 в комплексе с одной или более направляющими последовательностями, гибридизованными с соответствующей последовательностью(и)-мишенью; и/или (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей указанный фермент C2c1 или C2c3, включающий предпочтительно по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации и/или NES. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин включает компоненты (a) и (b). В некоторых вариантах осуществления изобретения компонент (a), компонент (b) или компоненты (a) и (b) стабильно встраиваются в геном эукариотической клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления изобретения компонент (a) далее включает две или более направляющих последовательностей, функционально связанных с первым регуляторным элементом, и необязательно разделенных прямым повтором, где при экспрессии каждая из двух или более направляющих последовательностей управляет специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR C2c1 или C2c3 с различными последовательностями-мишенями в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3 включает одну или более последовательностей ядерной локализации и/или последовательностей ядерного экспорта (NES) достаточной силы, чтобы стимулировать накопление указанного фермента CRISPR в поддающемся обнаружению количестве внутри и/или снаружи ядра эукариотической клетки.

[00735] В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3 является ферментом системы CRISPR типа V или VI. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 является ферментом AacC2c1. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 получен из Alicyclobacillus acidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacillus contaminans (например, DSM 17975), Desulfovibrio inopinatus (например, DSM 10711), Desulfonatronum thiodismutans (например, штамм MLF-1), бактерий Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (например, DSM 17572), Bacillus thermoamylovorans (например, штамм B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (например, DSM 18734), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM 13609), Citrobacter freundii (например, ATCC 8090), Brevibacillus agri (например, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (например, ORS 2060), и может включать дальнейшие изменения или мутации C2c1, как определено в настоящем описании, и может быть химерным C2c1. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3 кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR управляет расщеплением одной или двух цепей в определенном положении последовательности-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый регуляторный элемент является промотором полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй регуляторный элемент является промотором полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или более направляющих последовательностей (каждая) составляют по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 25 нуклеотидов, или 16-30, или 16-25, или 16-20 нуклеотидов в длину. Когда используется несколько направляющих РНК, они предпочтительно разделены последовательностью прямого повтора. В одном из аспектов изобретение относится к эукариотическому организму, не являющемуся человеком; предпочтительно многоклеточному эукариотическому организму, включающему эукариотическую клетку-хозяина согласно любому из описанных вариантов осуществления изобретения. В других аспектах изобретение относится к эукариотическому организму, предпочтительно многоклеточному эукариотическому организму, включая эукариотическую клетку-хозяина согласно любому из описанных вариантов осуществления изобретения. В некоторых вариантах осуществления организм согласно этим аспектам изобретения может быть животным, например млекопитающим. Кроме того, организм может быть членистоногим, таким как насекомое. Организм также может быть растением. Кроме того, организм может быть грибом.

[00736] В одном из аспектов изобретение относится к набору, включающему один или более компонентов, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает векторную систему и инструкции по применению набора. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторная система включает (a) первый регуляторный элемент, функционально связанный с последовательностью прямого повтора и одним или более участками вставки для вставки одной или более направляющих последовательностей выше или ниже (в зависимости от того, что применимо) относительно последовательности прямого повтора, где при экспрессии направляющая последовательность управляет специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR C2c1 или C2c3 c последовательностью-мишенью в эукариотической клетке, где комплекс CRISPR C2c1 включает фермент C2c1 или C2c3 в комплексе с направляющей последовательностью, гибридизованной с последовательностью-мишенью; и/или (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей указанный фермент C2c1 или C2c3, включающий последовательность ядерной локализации. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает компоненты (a) и (b), расположенные на одном и том же или на различных векторах системы. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор (a) далее включает две или более направляющих последовательности, функционально связанных с первым регуляторным элементом, где при экспрессии каждая из этих двух или более направляющих последовательностей управляет специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR с различными последовательностями-мишенями в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3 включает одну или более последовательностей ядерной локализации достаточной силы, чтобы стимулировать накопление указанного фермента CRISPR в обнаружимом количестве в ядре эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR является ферментом системы CRISPR типа V или VI. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR является ферментом C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 получен из Alicyclobacillus acidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacillus contaminans (например, DSM 17975), Desulfovibrio inopinatus (например, DSM 10711), Desulfonatronum thiodismutans (например, штамм MLF-1), бактерии Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (например, DSM 17572), Bacillus thermoamylovorans (например, штамм B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium. butyrativorans (например, DSM 18734), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM 13609), Citrobacter freundti (например, ATCC 8090), Brevibacilhis agri (например, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (например, ORS 2060) (например, модифицированный, чтобы иметь или быть связанными по меньшей мере с одним доменом дестабилизации («DD»), и может включать дальнейшее изменение или мутацию C2c1, и может быть химерным C2c1. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент DD-CRISPR кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент DD-CRISPR управляет расщеплением одной или двух цепей в определенном положении последовательности-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент DD-CRISPR лишен ферментативной активности расшепления цепи ДНК (например, имеет не более, чем 5% нуклеазной активности по сравнению с ферментом дикого типа или ферментом, не имеющим мутации или изменения, которое уменьшает нуклеазную активность). В некоторых вариантах осуществления изобретения первый регуляторный элемент является промотором полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй регуляторный элемент является промотором полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая последовательность составляет по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 25 нуклеотидов, или 16-30 или 16-25 или 16-20 нуклеотидов в длину.

[00737] В одном из аспектов изобретение относится к способу модификации нескольких полинуклеотидов-мишеней в клетке-хозяине, такой как эукариотическая клетка. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ позволяет комплексу CRISPR C2c1 или C2c3 связываться с несколькими полинуклеотидами-аишенями, например, производя расщепление указанных нескольких полинуклеотидов-мишеней, таким образом модифицируя несколько полинуклеотидов-мишеней, где комплекс CRISPR C2c1 или C2c3 включает фермент C2c1 или C2c3 в комплексе со несколькими направляющими последовательностями, каждая из которых гибридизована с определенной последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде-мишени, где указанные несколько направляющих последовательностей связаны с последовательностью прямого повтора. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное расщепление включает расщепление одной или двух цепей в определенном положении каждой последовательности-мишени указанным ферментом C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное расщепление приводит к уменьшению транскрипции нескольких генов-мишеней. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ далее включает репарацию одного или более указанных расщепленных полинуклеотидов-мишеней посредством гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, где указанная репарация приводит к мутации, включающей инсерцию, делецию или замену одного или более нуклеотидов в одном или более указанных полинуклеотидах-мишенях. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные мутации приводят к одному или более изменениям в аминокислотной последовательности белка, экспрессируемого с гена, включающего одну или более последовательностей-мишеней. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ далее включает доставку одного или более векторов в указанную эукариотическую клетку, где один или более векторов осуществляют экспрессию одного или более из фермента C2c1 или C2c3 и нескольких последовательностей направляющих РНК, связанных с последовательностью прямого повтора. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные векторы доставляются в эукариотическую клетку в индивидууме. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные модификация происходят в указанной эукариотической клетке в клеточной культуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ далее включает извлечение указанной эукариотической клетки из индивидуума до произведения указанной модификации. В некоторых вариантах осуществления изобретение способ далее включает обратное введение указанной эукариотической клетки и/или клеток, полученных из нее, указанному индивидууму.

[00738] В одном из аспектов изобретение относится к способу модификации экспрессии нескольких полинуклеотидов в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ позволяет комплексу CRISPR C2c1 или C2c3 связываться со несколькими полинуклеотидами, таким образом, таким образом, что указанное связывание приводит к увеличению или уменьшению экспрессии указанных полинуклеотидов; где комплекс CRISPR C2c1 или C2c3 включает фермент C2c1 или C2c3 в комплексе со несколькими направляющими последовательностями, каждая из которых специфически гибридизирована со своей собственной последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде, где указанные направляющие последовательности связаны с последовательностью прямого повтора. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ далее включает доставку одного или более векторов в указанные эукариотические клетки, где один или более векторов осуществляют экспрессию одного или более из фермента C2c1 или C2c3 и нескольких направляющих последовательностей, связанных с последовательностями прямого повтора.

[00739] В одном из аспектов изобретение относится к рекомбинантному полинуклеотиду, включающему несколько последовательностей направляющей РНК выше или ниже (в зависимости от того, что применимо) относительно последовательности прямого повтора, где каждая из направляющих последовательностей, когда экспрессируется, управляет специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR C2c1 или C2c3 с соответствующей ему последовательностью-мишенью, присутствующей в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень является вирусной последовательностью, присутствующей в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень является протоонкогеном или онкогеном.

[00740] Аспекты изобретения охватывают не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию, которая может включать направляющую РНК (гРНК), включающую направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе в клетке и фермент C2c1 или C2c3, как определено в настоящем описании, который может включать по меньшей мере одну или более последовательностей ядерной локализации.

[00741] Один из аспектов изобретения охватывает способы модификации представляющего интерес геномного локуса для изменения экспрессии гена в клетке посредством введения в клетку любой из композиций, описанных в настоящем описании.

[00742] Одним из аспектов изобретения является то, что вышеупомянутые элементы содержатся в единственной композиции или содержатся в индивидуальных композициях. Эти композиции могут быть успешно применены к хозяину, чтобы выявить функциональный эффект на геномном уровне.

[00743] Как используется в настоящем описании, термин «направляющая РНК» или «гРНК» имеет такое же значение, как в других разделах, и включает любую полинуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность с последовательностью нуклеиновой кислоты, являющейся мишенью, чтобы гибридизироваться с последовательностью нуклеиновой кислоты, являющейся мишенью, и управлять специфическим для последовательности связыванием нацеленного на нуклеиновые кислоты комплекса с последовательностью нуклеиновой кислоты, являющейся мишенью. Каждая гРНК может быть сконструирована, чтобы включать множественные сайты узнавания для связывания (например, аптамеры) специфичные к одному или различным адаптерным белкам. Каждая гРНК может быть сконструирована для связывания с промоторной областью -1000-+1 нуклеотид выше сайта начала транскрипции (т.е. TSS), предпочтительно в участке -200 нуклеотид. Это расположение служит для улучшения функциональных доменов, которые влияют на активацию генов (например, активаторы транскрипции) или ингибирование генов (например, репрессоры транскрипции). Модифицированная гРНК может содержать одну или более модифицированных гРНК, нацеливающих на один или более локусов-мишеней (например, по меньшей мере 1 гРНК, по меньшей мере 2 гРНК, по меньшей мере 5 гРНК, по меньшей мере 10 гРНК, по меньшей мере 20 гРНК, по меньшей мере 30 гРНК, по меньшей мере 50 гРНК), находящихся в композиции. Указанные множественные последовательности гРНК могут быть организованы в формате тандема и предпочтительно разделены прямым повтором.

[00744] Таким образом, каждый из гРНК, фермента CRISPR, как определено в настоящем описании, может индивидуально находиться в композиции и вводиться хозяину индивидуально или совместно. Альтернативно, эти компоненты могут содержаться в единой композиции для введения хозяину. Введение хозяину может быть выполнено посредством вирусных векторов, известных квалифицированному специалисту или описанных в настоящем описании, для доставки хозяину (например, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, вектор ААV). Как объяснено в настоящем описании, использование различных селективных маркеров (например, для селекции лентивирусной гРНК) и концентрация гРНК (например, в зависимости от того, используется ли несколько гРНК) может быть преимущественным для выявления улучшенного эффекта. На основании этой концепции существует несколько вариантов выявления событий в геномном локусе, включая расщепление ДНК, активацию и инактивацию генов. Используя предложенные композиции, квалифицированный специалист в данной области может преимущественно и специфически осуществлять нацеливание на один или более локусов с использованием одинаковых или различных функциональных доменов для выявления одного или более событий в геномном локусе. Композиции могут быть применены в большом разнообразии способов скрининга библиотек в клетках и функциональном моделировании in vivo (например, активация генов длинными межгенными некодирующими РНК (lincРНК) и идентификация функций; моделирование приобретения функции; моделирование потери функции; использование композиций изобретения для создания клеточных линий и трансгенных животных в целях оптимизации и скрининга).

[00745] Настоящее изобретение охватывает использование композиций по настоящему изобретению для создания и использования трансгенных по зависимой от условий или индуцибельной системе CRISPR клеток/животных; см., например, Platt et al., Cell (2014), 159(2): 440-455 или патентную публикацию PCT, цитируемую в настоящем описании, такую как WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667). Например, клетки или животные, такие как животные, не являющиеся человеком, например, позвоночные животные или млекопитающие, такие как грызуны, например, мыши, крысы или другие лабораторные или не лабораторные животные, например, кошки, собаки, овцы, и т.д., могут быть "нокин" (knock-in), в результате чего животное в зависимости от условий или индуцируемо экспрессирует C2c1 или C2c3, как в статье Platt et al. Таким образом, клетка-мишень или животное-мишень включают фермент CRISRP (например, C2c1 или C2c3) в зависимости от условий или индуцируемо (например, в форме Cre-зависимой композиции), после экспрессии вектора, введенного в клетку-мишень, экспрессия вектора индуцирует или создает условия для экспрессии фермента CRISRP (например, C2c1 или C2c3) в клетке-мишени. Посредством применения руководства и композиции, как определено в настоящем описании, с известным способом создания комплекса CRISPR, индуцируемые события в геноме также являются аспектом настоящего изобретения. Примеры таких индуцируемых событий описаны в настоящем описании в других разделах.

[00746] В некоторых вариантах осуществления фенотипическое изменение предпочтительно является результатом модификации генома, когда мишенью является генетическое заболевание, особенно в способах терапии, и предпочтительно, когда обеспечивается матрица репарации для коррекции или изменения фенотипа.

[00747] В некоторых вариантах осуществления заболевания, которые могут быть мишенью, включают заболевания, которые связаны с дефектами сплайсинга.

[00748] В некоторых вариантах осуществления клеточные мишени включают гемопоэтические стволовые клетки/клетки-предшественники (CD34+); Т-клетки человека; и клетки сетчатки - например, клетки-предшественники фоторецепторов.

[00749] В некоторых вариантах осуществления гены-мишени включают: ген бета-глобина человека - HBB (для лечения серповидноклеточной анемии, включая стимуляцию генной конверсии (с использованием близкородственного гена HBD в качестве эндогенной матрицы)); CD3 (Т-клетки) и CEP920 - сетчатка (глаза).

[00750] В некоторых вариантах осуществления болезни-мишени также включают: злокачественную опхуоль; серповидноклеточную анемию (основанную на точечной мутации); ВИЧ; бета-талассемию; и офтальмологические или глазные заболевания - например, амавроз Лебера (LCA), вызываемый дефектом сплайсинга.

[00751] В некоторых вариантах осуществления способы доставки включают: опосредованную катионными липидами "прямую" доставку комплекса фермент-гид (рибонуклеопротеин) и электропорацию плазмидной ДНК.

[00752] Способы, продукты и применения, описанные в настоящем описании, могут использоваться в нетерапевтических целях. Кроме того, любой из способов, описанных в настоящем описании, может быть применен in vitro и ex vivo.

[00753] В одном из аспектов предусматривается не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, включающая:

I. две или более полинуклеотидных последовательностей системы CRISPR-Cas, содержащих

(a) первую направляющую последовательность, способную к гибридизации с первой последовательностью-мишенью в локусе полинуклеотида,

(b) вторую направляющую последовательность, способную к гибридизации со второй последовательностью-мишенью в локусе полинуклеотида,

(c) последовательность прямого повтора, и

II. фермент C2c1 или вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую его, или фермент C2c3 или вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую его,

где при транскрипции первая и вторая направляющие последовательности управляют специфическим для последовательности связыванием первого и второго комплекса CRISPR C2c1 или C2c3 c первыми и вторыми последовательностями-мишенями, соответственно,

где первый комплекс CRISPR включает фермент C2c1 или фермент C2c3 в комплексе с первой направляющей последовательностью, которая способна к гибридизации с первой последовательностью-мишенью,

где второй комплекс CRISPR включает фермент C2c1 или фермент C2c3 в комплексе со второй направляющей последовательностью, которая способна к гибридизации со второй последовательностью-мишенью, и

где первая направляющая последовательность управляет расщеплением одной цепи дуплекса ДНК вблизи первой последовательности-мишени, и вторая направляющая последовательность управляет расщеплением другой цепи вблизи второй последовательности-мишени, вызывая двойной разрыв цепи, таким образом модифицируя организм или организм, не являющийся животным или не являющийся человеком. Точно так же могут предусматриваться композиции, включающие более двух направляющие РНК, например, каждая РНК специфична к одной мишени и все РНК организованы тандемно в композиции, или системе CRISPR, или комплексе, как описано в настоящем описании.

[00754] В другом варианте осуществления изобретения C2c1 или C2c3 доставляется в клетку в виде белка. В другом и особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения C2c1 или C2c3 доставляется в клетку в виде белка или в виде нуклеотидной последовательности, кодирующей его. Доставка к клетке в виде белка может включать доставку комплекса рибонуклеопротеина (RNP), где белок образует комплекс с несколькими направляющими последовательностями.

[00755] В одном из аспектов предусматриваются клетки-хозяева и клеточные линии, модифицированные или включающие композиции, системы или модифицированные ферменты по настоящему изобретению, включая стволовые клетки и их потомков.

[00756] В одном из аспектов предусматриваются способы клеточной терапии, где, например, одну клетку или популяцию клеток отбирают или культивируют, эту клетку или клетки модифицируют ex vivo, как описано в настоящем описании, и потом повторно вводят (извлеченные клетки) или вводят (культивируемые клетки) в организм. Стволовые клетки, эмбриональные или индуцированные плюрипотентные или тотипотентные стволовые клетки, также особенно предпочтительны в этом отношении. Но, конечно, также предусматриваются варианты осуществления изобретения in vivo.

[00654] Способы по изобретению могут дополнительно включать доставку матриц, таких как матрицы репарации, которые могут представлять собой дцОДН или оцОДН, см. ниже. Доставка матриц может быть произведена одновременно или отдельно от доставки любого или всех эффекторных белков CRISPR или направляющих молекул, и через один и тот же механизм доставки или любой другой. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы матрица доставлялась вместе с направляющей молекулой и также предпочтительно эффекторным белком CRISPR. Примером может служить вектор AAV.

[00655] Способы по изобретению могут дополнительно включать: (а) доставку в клетку двухцепочечного олигодезоксинуклеотида (дцОДН), включающего выступающие концы, комплементарные выступающим концам, созданным упомянутым разрывом двойной цепи, причем указанный дцОДН встраивается в локус-мишень, или - (б) доставку в клетку одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (оцОДН), где указанный оцОДН действует как матрица для гомологичной направленной репарации разрыва двойной цепи. Способы по изобретению могут быть предназначены для профилактики или лечения заболевания у индивида, когда указанное заболевание вызвано дефектом в указанном локусе-мишени. Способы по изобретению могут осуществляться in vivo в индивидууме или ex vivo на клетке, взятой у индивида, где в некоторых случаях указанную клетку возвращают индивиду.

[00759] Изобретение также охватывает продукты, полученные с использованием фермента CRISPR, или фермента Cas, или фермента C2c1, или фермента C2c3, или фермента CRISPR-CRISPR, или системы CRISPR-Cas, или системы CRISPR-C2c1, или системы CRISPR-C2c3 для использования в тандемном или множественном нацеливании, как определено в настоящем описании.

Наборы

[00760] В одном из аспектов изобретение предлагает наборы, содержащие любой один или более элементов, описанных для вышеупомянутых способов и композиций. В некоторых вариантах осуществления набор включает векторную систему, как описано в настоящем описании и в инструкциях по применению наборов. Элементы могут быть предоставлены индивидуально или в комбинациях и могут быть предоставлены в любом подходящем контейнере, таком как флакон, бутылка или тюбик, в некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает инструкции на одном или более языках, например на более чем одном языке. Инструкции могут быть специальными для приложений и способов, описанных в настоящем описании.

[00761] В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает один или более реактивов для использования в способе, в котором используется один или более элементов, описанных в настоящем описании. Реактивы могут быть предоставлены в любом подходящем контейнере. Например, в наборе может быть предоставлен один или более буферов для хранения или проведения реакций. Реактивы могут быть предложены в форме, которая применима в конкретном анализе, или в форме, которая требует добавления одного или более других компонентов перед использованием (например, в концентрате или лиофилизированной форме). Буфер может быть любым буфером, включая, но не ограничиваясь ими, натрий-карбонатный буфер, натрий-бикарбонатный буфер, боратный буфер, Tris-буфер, буфер MOPS, буфер HEPES и их комбинациями. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер является щелочным. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер имеет pH от приблизительно 7 до приблизительно 10. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает один или более олигонуклеотидов, соответствующих направляющей последовательности, для вставки в вектор для функционального связывания направляющей последовательности и регуляторного элемента. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает гомологичный полинуклеотид матрицы рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает один или более векторов и/или один или более полинуклеотидов, описанных в настощоящем описании. Набор преимущественно позволяет предоставить все элементы систем изобретения по изобретению.

[00762] В одном из аспектов изобретение относится к способам применения одного или более элементов системы CRISPR. Комплекс CRISPR по изобретению обеспечивает эффективное средство модификации полинуклеотида-мишени. Комплекс CRISPR по изобретению имеет большое разнообразие полезных применений, включая модификацию (например, удаление, вставку, перемещение, инактивацию, активацию) полинуклеотида-мишени в разнообразных типах клеток. Как таковой, комплекс CRISPR по изобретению имеет широкий спектр применений, например, в генотерапии, скрининге лекарств, диагностике заболеваний и прогнозировании. Типичный комплекс CRISPR включает эффекторный белок CRISPR в комплексе с направляющей последовательностью, гибридизованной с последовательностью-мишенью в полинуклеотиде-мишени. В определенных вариантах осуществления изобретения последовательность прямого повтора связана с направляющей последовательностью.

[00763] В одном из вариантов осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способу расщепления полинуклеотида-мишени. Способ включает модификацию полинуклеотида-мишени с использованием комплекса CRISPR, который связывается с полинуклеотидом-мишенью и производит расщепление указанного полинуклеотида-мишени. Как правило, комплекс CRISPR по изобретению при введении в клетку создает разрыв (например, одноцепочечный или двухцепочечный разрыв) в последовательности генома. Например, способ может использоваться для расщепления гена заболевания в клетке.

[00764] Разрыв, внесенный комплексом CRISPR, может быть восстановлен процессами репарации, такими как негомологичное соединение концов (NHEJ), подверженное ошибкам, или гомологичная репарация (HDR) с высокой точностью. Во время этих процессов репарации экзогенная полинуклеотидная матрица может быть встроена в последовательность генома. В некоторых способах для модификации последовательности генома используется процесс HDR. Например, экзогенная полинуклеотидная матрица, содержащая последовательность, подлежащую встраиванию, фланкированную нижележащей последовательностью и вышележащей последовательностью, вводится в клетку. Вышележащая и нижележащая последовательности имеют сходство с каждой стороной сайта интеграции в хромосоме.

[00765] Где желаемо, донорный полинуклеотид может представлять собой ДНК, например, плазмидную ДНК, бактериальную искусственную хромосому (ВАС), дрожжевую искусственную хромосому (YAC), вирусный вектор, линейный фрагмент ДНК, фрагмент ПЦР, "голую" нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с носителем для доставки, таким как липосома или полоксамер.

[00766] Экзогенная полинуклеотидная матрица включает последовательность, которая будет встроена (например, мутированный ген). Последовательность для интеграции может быть последовательностью, эндогенной или экзогенной по отношению к клетке. Примеры последовательностей для интеграции включают полинуклеотиды, кодирующие белок или некодирующую РНК (например, микроРНК). Таким образом, последовательность для интеграции может быть функционально связана с соответствующей контрольной последовательностью или последовательностями. Альтернативно, последовательность для интеграции может иметь регуляторную функцию.

[00767] Вышележащие и нижележащие последовательности в экзогенной полинуклеотидной матрице выбирают, чтобы обеспечить рекомбинацию между интересующей хромосомной последовательностью и донорным полинуклеотидом. Вышележащая последовательность является последовательностью нуклеиновых кислот, имеющей сходство с последовательностью генома, вышележащей относительно целевого участка интеграции. Точно так же нисходящая последовательность является последовательностью нуклеиновых кислот, имеющей сходство с хромосомной последовательностью, нижележащей относительно целевого участка интеграции. У вышележащих и нижележащих последовательностей в экзогенной полинуклеотидной матрице может быть 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% сходство последовательности с последовательностью генома, являющейся мишенью. Предпочтительно, когда вышележащие и нижележащие последовательности в экзогенной полинуклеотидной матрице имеют приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% сходство последовательности с последовательностью генома, являющейся мишенью. В некоторых методах вышележащие и нижележащие последовательности в экзогенной полинуклеотидной матрице имеют приблизительно 99% или 100% сходства последовательности с последовательностью генома, являющейся мишенью.

[00768] Вышележащая или нижележащая последовательность может включать от приблизительно 20 п.о. до приблизительно 2500 пн, например, приблизительно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, или 2500 п.о. В некоторых способах типичная вышележащая или нижележащая последовательность имеет от приблизительно 200 п.о. до приблизительно 2000 п.о., от приблизительно 600 п.о. до приблизительно 1000 п.о., или более конкретно от приблизительно 700 п.о. до приблизительно 1000 п.о.

[00769] В некоторых методах экзогенная полинуклеотидная матрица может дополнительно включать маркер. Такой маркер может облегчить скрининг на заданную интеграцию. Примеры подходящих маркеров включают участки рестрикции, флуоресцентные белки или выбираемые маркеры. Экзогенная полинуклеотидная матрица изобретения может быть сконструирована с использованием рекомбинантных методов (см., например, Sambrook et al, 2001 and Ausubel et al., 1996).

[00770] В типичном способе модификации полинуклеотида-мишени посредством интеграции экзогенной полинуклеотидной матрицы, двухцепочечный разрыв вносится в последовательность генома комплексом CRISPR, разрыв восстанавливается путем гомологичной рекомбинации с экзогенной полинуклеотидной матрицей, таким образом, что матрица интегрируется в геном. Присутствие двухцепочечного разрыва облегчает интеграцию матрицы.

[00771] В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. Способ включает увеличение или уменьшение экспрессии полинуклеотида-мишени при помощи комплекса CRISPR, который связывается с полинуклеотидом.

[00772] В некоторых методах полинуклеотид-мишень может быть инактивирован, чтобы произвести модификацию экспрессии в клетке. Например, после связывания комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью в клетке, полинуклеотид-мишень инактивируется таким образом, что последовательность не транскрибируется, кодируемый белок не синтезируется, или последовательность не функционирует как последовательность дикого типа. Например, кодирующая последовательность белка или микроРНК могут быть инактивированы таким образом, что синтез белка прекращается.

[00773] В некоторых способах контрольная последовательность может быть инактивирована таким образом, что она больше не функционирует как контрольная последовательность. Как используют в настоящем описании, "контрольная последовательность" относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая производит транскрипцию, трансляцию или обеспечивает доступность последовательности нуклеиновой кислоты. Примеры контрольной последовательности включают промотор, терминатор транскрипции, и энхансер. Инактивированная последовательность-мишень может включать делеционную мутацию (т.е. делецию одного или более нуклеотидов), инсерционную мутацию (т.е. инсерцию одного или более нуклеотидов) или нонсенс-мутацию (т.е. замена единственного нуклеотида на другой нуклеотид, таким образом, что получается стоп-кодон). В некоторых методах инактивация последовательности-мишени приводит к "нокауту" последовательности-мишени.

Иллюстративные способы применения системы CRISPR Cas

[00774] Изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, или одному или более полинуклеотидам, кодирующим компоненты указанной композиции, или векторам или системам доставки, содержащим один или более полинуклеотидов, кодирующих компоненты указанной композиции, для применения для модификации клетки-мишени in vivo, ex vivo или in vitro, и это может быть осуществлено способом, который изменяет клетку таким образом, что после модификации потомки или клеточная линия модифицированной клетки CRISPR сохраняет измененный фенотип. Модифицированные клетки и их потомки могут быть частью многоклеточного организма, такого как растение или животное, с применением системы CRISPR ex vivo к желаемым типам клеток. Изобретение CRISPR может представлять собой терапевтический способ лечения. Терапевтический способ лечения может включать редактирование гена или генома, или генную терапию.

Использование инактивированного фермента CRISPR C2c1 или С2с3 для способов обнаружения, таких как FISH

[00775] В одном из аспектов изобретение относится к сконструированной способами инженерии не встречающейся в природе системе CRISPR-Cas, включающую каталитически инактивированный белок Cas, описанный в настоящем описании, предпочтительно инактивированный C2c1 (dC2c1) или инактивированный C2c3 (dC2c3), и к применению этой системы в способах обнаружения, таких как флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). dC2c1 или dC2c3, лишенный способности производить двухцепочечные разрывы двойной цепи ДНК, может быть связан с маркером, таким как флуоресцентный белок, такой как усиленный зеленый флуоресцентный белок (eEGFP) и совместно экспрессирован с небольшими направляющими РНК для нацеливания на перицентрические, центрические и теломерные повторы in vivo. Системы с dC2c1 или dC2c3 могут использоваться для визуализации как повторяющихся последовательностей, так и индивидуальных генов в геноме человека. Такие новые применения маркированных систем CRISPR-Cas могут быть важны для визуализации клеток и изучения функциональной ядерной архитектуры, особенно в случае маленького объема ядра или сложных 3D-структур. (Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, Park J, Blackburn EH, Weissman JS, Qi LS, Huang B. 2013. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas Cell 155(7): 1479-91, doi: 10.1016/j.cel1.2013.12.001)

Модификация Мишени посредством системы или комплекса CRISPR Cas (например, комплекса C2c1/C2c3-РНК)

[00776] В одном аспекте изобретение относится к способам модификации полинуклеотида-мишени в эукариотической клетке, которая может быть in vivo, ex vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления способ включает отбор образца клетки или популяции клеток у человека или животного, не являющегося человеком, и модификацию клетки или клеток. Культивирование может происходить на любом этапе ex vivo. Клетка или клетки могут быть повторно введены в животное или растение, отличное от человека. Для вновь введенных клеток особенно предпочтительно, чтобы клетки были стволовыми клетками.

[00777] В некоторых вариантах осуществления способ включает предоставление возможности CRISPR-комплексу связываться с полинуклеотидом-мишенью для осуществления расщепления указанного полинуклеотида-мишени, в результате чего происходит модификация полинуклеотида-мишени, где комплекс CRISPR содержит эффекторный белок CRISPR и направляющую последовательность, гибридизованную или способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде-мишени.

[00778] В одном из вариантов изобретение относится к способу модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает предоставление комплексу CRISPR возможности связываться с полинуклеотидом, так что указанное связывание приводит к увеличению или уменьшению экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс CRISPR содержит эффекторный белок CRISPR, объединенный с направляющей последовательностью, гибридизованной или способной к гибридизации с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде. Аналогичные соображения и условия применяются, как указано выше, для способов модификации полинуклеотида-мишени. Фактически, эти варианты отбора проб, культивирования и повторного введения применяются во всех аспектах настоящего изобретения.

[00779] Действительно, в любом аспекте изобретения комплекс CRISPR может содержать эффекторный белок CRISPR в комплексе с направляющей последовательностью, гибридизованной или способной к гибридизации с последовательностью-мишенью. Аналогичные соображения и условия применяются, как указано выше, для способов модификации полинуклеотида-мишени.

[00780] Таким образом, любой из не встречающихся в природе эффекторных белков CRISPR, описанных в настоящем описании, имеет по меньшей мере одну модификацию, и, тем самым, эффекторный белок обладает определенными улучшенными возможностями. В частности, любой из эффекторных белков способен образовывать комплекс CRISPR с направляющей РНК. Когда такой комплекс образуется, направляющая РНК способна связываться с полинуклеотидной последовательностью-мишенью, и эффекторный белок способен модифицировать локус-мишень. Кроме того, эффекторный белок в комплексе CRISPR уменьшает способность модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом/эффекторным белком.

[00781] Кроме того, модифицированные ферменты CRISPR, описанные в настоящем описании, охватывают ферменты которые обеспечивают повышение способности эффекторного белка комплекса CRISPR модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом/эффекторным белком. Такая функция может быть предоставлена отдельно или предоставлена в сочетании с вышеописанной уменьшенной способностью модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенями. Любые такие эффекторные белки могут быть снабжены любой из дополнительных модификаций в эффекторном белке CRISPR, как описано в настоящем описании, например, в сочетании с любой активностью, обеспечиваемой одним или более связанными гетерологичными функциональными доменами, любыми другими мутациями для снижения активности нуклеазы и т.п.

[00782] В предпочтительных вариантах осуществления изобретения модифицированный эффекторный белок CRISPR обладает сниженной способностью модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенями, по сравнению с немодифицированным ферментом/эффекторным белком и повышает способность модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом/эффекторным белком. В сочетании с дополнительными модификациями эффекторного белка может быть достигнута значительно увеличенная специфичность. Например, комбинация таких предпочтительных вариантов осуществления с одной или более дополнительными мутациями предусматривается в том случае, если одна или более дополнительных мутаций находятся в одном или более активных каталитически активных доменах. Такие дополнительные мутации каталитического домена могут сообщать никазную функциональность, как подробно описано в настоящем описании. В таких эффекторных белках повышенная специфичность может быть достигнута благодаря улучшенной специфичности в отношении активности эффекторного белка.

[00783] Модификации для уменьшения нецелевых эффектов и/или усиления целевых эффектов, как описано выше, могут быть сделаны для аминокислотных остатков, расположенных в положительно заряженной области/желобке, расположенных между доменами RuvC-III и HNH. Понятно, что любой из описанных выше функциональных эффектов может быть достигнут путем модификации аминокислот в вышеупомянутом желобке, а также путем модификации аминокислот, смежных с этим желобком или вне него.

[00784] Дополнительные функциональные возможности, которые могут быть внесены способами инженерии в модифицированные эффекторные белки CRISPR, как описано в настоящем описании, включают следующие. 1. модифицированные эффекторные белки CRISPR, которые нарушают взаимодействия ДНК:белок, не влияя на третичную или вторичную структуру белка. Это включает остатки, которые контактируют с любой частью дуплекса РНК:ДНК. 2. модифицированные эффекторные белки CRISPR, которые ослабляют внутрибелковые взаимодействия путем поддержания C2c1 или C2c3 в конформации, необходимой для нуклеазного разрезания в ответ на связывание ДНК (целевое или нецелевое). Например, модификация, которая мягко ингибирует, но все равно допускает конформацию нуклеазы домена HNH (расположена на расщепляющемся фосфате), 3. модифицированные эффекторные белки CRISPR, которые усиливают внутрибелковые взаимодействия путем поддержания C2c1 или C2c3 в конформации, ингибирующей активность нуклеазы в реакции связывания ДНК (целевой или нецелевой). Например: модификация, которая стабилизирует HNH-домен в конформации расщепляющегося фосфата. Любое такое дополнительное функциональное усиление может быть обеспечено в сочетании с любой другой модификацией эффекторного белка CRISPR, как подробно описано в данной заявке в другом пункте.

[00785] Любая из описанных в настоящем описании улучшенных функциональных возможностей может быть внесена способами инженерии в любой эффекторный белок CRISPR, такой как эффекторный белок C2c1 или C2c3. Однако будет понятно, что любая из описанных в настоящем описании функциональных возможностей может быть внесена способами инженерии в эффекторные белки C2c1 или C2c3 из других ортологов, включая химерные эффекторные белки, содержащие фрагменты из множества ортологов.

Нуклеиновые кислоты, аминокислоты и белки, регуляторные последовательности, векторы и т.д.

[00786] В рамках изобретения используются нуклеиновые кислоты для связывания последовательностей ДНК-мишеней. Это перспективно, так как нуклеиновые кислоты намного легче и дешевле производить, чем белки, а также специфичность может варьироваться в зависимости от длины участка, гомологии которого требуется. Например, не требуется сложное трехмерное позиционирование нескольких пальцев. Термины "полинуклеотид", "нуклеотид", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" используются взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую из возможных известных или неизвестных функций. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: кодирующие или некодирующие области гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенные из анализа сцепления, экзоны, интроны, информационные РНК (мРНК), транспортные РНК (тРНК), рибосомные РНК (рРНК), малые интерферирующие РНК (миРНК), короткие шпилечные РНК (кшРНК), микроРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Этот термин также охватывает структуры, подобные нуклеиновой кислоте, с синтетическими скелетами, см., например, Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; and Samstag, 1996. Полинуклеотид может содержать один или более модифицированных нуклеотидов, таких как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. При их наличии, модификации нуклеотидной структуры могут происходить до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с меченым компонентом. Используемый в настоящем описании термин "дикий тип" является термином, понятным специалистам, и означает типичную форму организма, штамма, гена или характеристик, которая существует в природе, в отличие от мутантных или вариантных форм. "Дикий тип" может быть базовой линией. Как используют в настоящем описании, термин "вариант" следует понимать как проявление качеств, отличающихся от существующих в природе. Термины "не встречающиеся в природе" или "сконструированные способами инженерии" используются взаимозаменяемо и указывают на участие руки человека. Термины, относящиеся к молекулам нуклеиновой кислоты или полипептидам, означают, что молекула нуклеиновой кислоты или полипептид по меньшей мере по существу свободна от по меньшей мере одного другого компонента, с которым они естественно связаны в природе и существуют в природе. "Комплементарность" относится к способности нуклеиновой кислоты образовывать водородную связь (связи) с другой последовательностью нуклеиновой кислоты либо традиционным спариванием оснований Уотсона-Крика, либо другими нетрадиционными типами. Процентная комплементарность обозначает процентное содержание остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (например, уотсон-криковское спаривание оснований) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарные). "Полностью комплементарные" означает, что все смежные остатки последовательности нуклеиновой кислоты связаны водородной связью с таким же количеством смежных остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. "По существу комплементарные", как используется в настоящем описании, относится к степени комплементарности, которая составляет по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более нуклеотидов или относится к двум нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в жестких условиях. Как используют в настоящем описании, термин "жесткий условия" для гибридизации относится к условиям, при которых нуклеиновая кислота, имеющая комплементарность с последовательностью-мишенью, преимущественно гибридизуется с последовательностью-мишенью и по существу не гибридизуется с последовательностями, не являющимися мишенями. Жесткие условия, как правило, зависят от последовательности и меняются в зависимости от ряда факторов. В общем, чем длиннее последовательность, тем выше температура, при которой последовательность специфически гибридизуется с ее целевой последовательностью. Неограничивающие примеры жестких условий подробно описаны в Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y. Когда приводится полинуклеотидная последовательность, то также предусматриваются комплементарные или частично комплементарные последовательности. Они предпочтительно способны гибридизироваться с упоминаемой последовательностью в очень жестких условиях. Как правило, для максимизации скорости гибридизации выбирают условия относительно низкой гибридизации: примерно на 20-25° C ниже, чем термическая температура плавления (Tm). Tm представляет собой температуру, при которой 50% конкретной последовательности-мишени гибридизуется с идеально комплементарным зондом в растворе при определенной ионной силе и рН. Как правило, для того, чтобы требовать по меньшей мере ~85% нуклеотидной комплементарности гибридизованных последовательностей, выбирают очень жесткие условия промывки примерно на 5-15°C ниже, чем Tm. Чтобы требовать по меньшей мере приблизительно 70% нуклеотидной комплементарности гибридизованных последовательностей, выбирают умеренно жесткие условия промывки примерно на 15-30°C ниже, чем Tm. Условия высокой разрешимости (очень низкая жесткость) могут быть на 50°C ниже Tm, что обеспечивает высокий уровень ошибочного соответствия между гибридизованными последовательностями. Специалисты в данной области понимают, что другие физические и химические параметры на этапах гибридизации и промывки также могут быть изменены для влияния на результат детектируемого сигнала гибридизации с определенного уровня гомологии между последовательностями-мишенями и зондами. Предпочтительные очень жесткие условия включают инкубацию в 50% формамиде, 5 x SSC и 1% SDS при 42°C или инкубацию в 5×SSC и 1% SDS при 65°C с промывкой 0,2×SSC и 0,1% SDS при 65°C. "Гибридизация" относится к реакции, в которой один или более полинуклеотидов реагируют с образованием комплекса, который стабилизируется посредством водородной связи между основаниями нуклеотидных остатков. Водородное связывание может происходить по принципу спаривания оснований Уотсона-Крика, хугстиновского связывания или любым другим способом, специфичным для последовательности. Комплекс может содержать две цепи, образующие дуплексную структуру, три или более цепей, образующих многоцепочечный комплекс, одну цепь, которая гибридизируется сама с собой, или любую их комбинацию. Реакция гибридизации может представлять собой стадию в более широком процессе, таком как инициирование ПЦР или расщепление полинуклеотида ферментом. Последовательность, способная к гибридизации с данной последовательностью, называется "комплементарной" данной последовательности. Используемый в настоящем описании термин "геномный локус" или "локус" (множественное число: локусы) представляет собой специфическое местоположение гена или последовательности ДНК на хромосоме. "Ген" относится к участкам ДНК или РНК, которые кодируют полипептид или цепь РНК, которая играет функциональную роль в организме и, следовательно, является молекулярной единицей наследственности в живых организмах. Для целей настоящего изобретения можно считать, что гены включают области, которые регулируют продукцию гена, независимо от того, являются ли такие регулятивные последовательности "смежными" с кодирующими и/или транскрибируемыми последовательностями. Соответственно, ген включает, но не обязательно ограничивается ими, последовательности промоторов, терминаторы, последовательносты регуляторов трансляции, такими как сайты связывания рибосом и внутренние сайты входа рибосомы, энхансеры, сайленсеры, изоляторы, пограничные элементы, точки начала репликации, сайты прикрепления матрикса и области контроля локуса. Как используют в настоящем описании, термин "экспрессия геномного локуса" или "экспрессия гена" представляет собой процесс, посредством которого информация, заключенная в гене, используется для синтеза функционального генного продукта. Продукты экспрессии генов часто являются белками, но в генах, не содержащих белок, таких как гены рРНК или гены тРНК, продукт представляет собой функциональную РНК. Процесс экспрессии генов используется всеми известными живыми организмами - эукариотами (включая многоклеточные организмы), прокариотами (бактериями и археями) и вирусами для выработки функциональных продуктов для выживания. Как используют в настоящем описании, термин "экспрессия" гена или нуклеиновой кислоты охватывает не только экспрессию клеточного гена, но также транскрипцию и трансляцию нуклеиновой кислоты (кислот) в системах клонирования и в любом другом контексте. Как используют в настоящем описании, термин "экспрессия" также относится к способу, посредством которого полинуклеотид транскрибируется из ДНК-матрицы (например, в мРНК или другой транскрипт РНК), и/или к процессу, посредством которого транскрибированная мРНК затем транслируется в пептиды, полипептиды или белки. Транскрипты и кодированные полипептиды могут в совокупности обозначаться как "генный продукт". Если полинуклеотид получен из геномной ДНК, экспрессия может включать сплайсинг мРНК в эукариотической клетке. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может быть прерван неаминокислотами. Термины также включают модифицированный аминокислотный полимер; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидацию, ацетилирование, фосфорилирование или любые другие манипуляции, такие как конъюгация с меченым компонентом. Как используют в настоящем описании, термин "аминокислота" включает природные и/или неприродные или синтетические аминокислоты, включая глицин и оба оптических изомера D или L, а также аминокислотные аналоги и пептидомиметики. Как используют в настоящем описании, термин "домен" или "белковый домен" относится к части белковой последовательности, которая может существовать и функционировать независимо от остальной белковой цепи. Как описано для аспектов данного изобретения, идентичность последовательности связана с гомологией последовательности. Сравнения гомологии могут проводиться на глаз или, чаще всего, с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут вычислять процентную (%) гомологию между двумя или более последовательностями и также могут вычислять идентичность последовательностей, которой обладают две или более последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот.

[00787] В определенных вариантах изобретения термин "направляющая РНК" относится к полинуклеотидной последовательности, содержащей одну или более предполагаемых или идентифицированных tracr-последовательностей и предполагаемых или идентифицированных последовательностей cr-РНК или направляющей последовательности. В конкретных вариантах осуществления "направляющая РНК" включает предполагаемую или идентифицированную последовательность cr-РНК или направляющую последовательность. В других вариантах осуществления направляющая РНК не включает предполагаемую или идентифицированную tracr-последовательность.

[00788] Как используют в настоящем описании, термин "дикий тип" является термином, понятным квалифицированным специалистам, и означает типичную форму организма, штамма, гена или характеристики в том виде, как они встречаются в природе, в отличие от мутантных или вариантных форм. "Дикий тип" может быть базовой линией.

[00789] Как используют в настоящем описании, термин "вариант" следует понимать как проявление свойств, которые имеют характерные черты, по которым эти свойства отличаются от природных свойств.

[00790] Термины "неприродный" или "сконструированный способами инженерии" используются взаимозаменяемо и указывают на вмешательство человека. Эти термины, относящиеся к молекулам нуклеиновой кислоты или полипептидам, означают, что молекула нуклеиновой кислоты или полипептид по меньшей мере в некоторой степени лишены одного другого компонента, с которым они естественным образом ассоциированы в своем природном виде. Во всех аспектах и вариантах осуществления, независимо от того, включают ли они эти термины или нет, следует понимать, что использование этих терминов необязательно и, следовательно, не существует предпочтения по их включению. Кроме того, термины "неприродный" или "полученный способами инженерии" могут использоваться взаимозаменяемо и поэтому могут применяться по отдельности или вместе, и то или другое может заменить упоминание обоих вместе. В частности, "полученный способами инженерии" предпочтительнее вместо "неприродный" или "неприродный и/или полученный способами инженерии".

[00791] Гомология последовательностей может быть определена любой из ряда компьютерных программ, известных в данной области, например BLAST или FASTA et al. Подходящей для выполнения такого выравнивания компьютерной программой является пакет GCG Wisconsin Bestfit (Университет Висконсина, США, University of Wisconsin, U.S.A; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Примеры другого программного обеспечения, способного выполнять сравнения последовательностей, включают, без наложения ограничений, пакет BLAST (см. Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) и набор инструментов сравнения GENEWORKS. Как BLAST, так и FASTA доступны для поиска оффлайн и онлайн (см. Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60). При этом предпочтительно использование программы GCG Bestfit. Процент (%) гомологии последовательно может быть рассчитан для перекрывающихся последовательностей, т.е. одна последовательность выровнена против другой и аминокислота или нуклеотид одной последовательности напрямую сравнивается с соответствующей другой аминокислотой или нуклеотидом другой последовательности по одной(му) за раз. В этом случае его называют "выравнивание без пропусков". Обычно такое выравнивание без пропусков выполнятся только для сравнительно небольшого числа остатков. Хотя это очень простой и логичный способ, он не способен рассматривать, к примеру, случаи идентичных в других отношениях пары последовательностей, где одна инсерция или делеция может привести к тому, что последующий аминокислотный остаток окажется вне рассмотрения выравнивания, тем самым приводя к возможному большому уменьшению % гомологии при выполнении глобального выравнивания. В результате большинство способов сравнения последовательностей разработаны для проведения оптимального выравнивания с учетом возможных инсерций и делеций без необоснованного наложения штрафа общей гомологии или балла идентичности. Это достигается путем вставления "пропусков" в выравнивании последовательности с целью максимизации локальной гомологии или идентичности. Однако такие более сложные способы налагают "штраф за внесение пропуска" для каждого пропуска, возникающего в выравнивании, так что для того же числа идентичных аминокислот возможно добавление нескольких пропусков - что отражает более близкое родство между двумя сравниваемыми последовательностями - и позволяет достичь более высокого балла, чем в случае одной со многими пропусками. "Цена сродства пропусков" обычно используется для наложения сравнительно большого штрафа за присутствие пропуска и меньшее - за каждый последующий остаток в пропуске. Это наиболее часто используемая система оценки пропусков. Высокие штрафы за пропуски могут, разумеется, давать в результате оптимизированные выравнивания с меньшим числом пропусков. Большинство программ выравнивания допускают внесение изменений в штрафы за пропуски. Однако предпочтительно использование исходных значений при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей. Например, при использовании пакета GCG Wisconsin Bestfit исходный штраф за пропуск в аминокислотных последовательностях равен -12 за каждый пропуск и -4 за каждую вставку. Расчет максимального % гомологии, таким образом, сначала требует проведения оптимального выравнивания с рассмотрением штрафов за пропуски. Подходящая компьютерная программа для проведения такого выравнивая - пакет GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Niic. Acids Research 12 p387). Примерами другого программного обеспечения, способного выполнять сравнение последовательностей являются, но не ограничиваются ими, пакеты BLAST (см. Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4to Ed. - Chapter 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol Biol. 403-410) и набор инструментов сравнения GENEWORKS. Как BLAST, так и FASTA доступны для поиска оффлайн и онлайн (см. Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60). Однако для решения некоторых задач предпочтительно использование программы GCG Bestfit. Новый инструмент, называющийся BLAST 2 Sequences, также используется для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1): 187-8 и веб-сайт Национального Центра Биотехнологии на веб-сайте Национального Института Здравоохранения США). Хотя конечный % гомологии может быть измерен в смысле идентичности, процесс проведения выравнивания сам по себе не основан на сравнении "все-или-ничего" пар. Вместо этого обычно используется масштабированная матрица оценки сходства для расчета баллов для каждого попарного сравнения на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой часто используемой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица, используемая по умолчанию для набора программ BLAST. Программы GCG Wisconsin обычно используют либо общедоступные значения по умолчанию, либо пользовательскую таблицу сравнения символов при ее наличии (см. руководство пользователя для дальнейших деталей). Для решения некоторых задач предпочтительно использование общедоступных значений по умолчанию пакета GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицы по умолчанию, такой как BLOSUM62. Альтернативно этому, процент гомологии может быть рассчитан с использованием свойства множественного выравнивания из DNASIS™ (Hitachi Software), основанного на алгоритме, аналогичном CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PIVI (1988), Gene 73(1), 237-244). После того как программное обеспечение нашло оптимальное выравнивание, становится возможным рассчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательности. Данное программное обеспечение обычно производит это в ходе сравнения последовательностей и приводит численный результат. Последовательности могут также иметь делеции, инсерции или замены аминокислотных остатков, что приводит к изменению без уведомления и получению в результате функционально эквивалентных состояний. Преднамеренные замены аминокислот могут быть сделаны на основе сходства в свойствах аминокислот (таких как полярность, заряд, растворимость, гидрофобность, гидрофильность и/или амфипатическая природа остатков) и, как следствие, полезны для объединения аминокислот в функциональные группы. Аминокислоты могут быть сгруппированы на основе свойств только их боковых цепей. Однако более целесообразно также включать данные о мутациях. Наборы аминокислот, полученные таким образом, с большой вероятностью являются консервативными в связи с их структурой. Такие наборы могут быть описаны в форме диаграмм Венна (Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol 119, 205-218). Могут быть произведены консервативные замены, например в соответствии с таблицей ниже, которая описывает общепринятую группировку аминокислот в виде диаграммы Венна.

[792] Термины "субъект", "индивид" и "пациент" используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения позвоночного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, мышей, обезьян, людей, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и домашних животных. Также охватываются ткани, клетки и их потомки, полученные от биологического объекта in vivo или культивируемые in vitro.

[00793] Термины "терапевтический агент", "терапевтически способный агент" или "лечебный агент" используются взаимозаменяемо и относятся к молекуле или соединению, которые придают какой-либо полезный эффект при введении индивиду. Полезный эффект включает обеспечение диагностических определений; облегчение протекания заболевания, симптома, расстройства или патологического состояния; уменьшение или предотвращение возникновения заболевания, симптома, расстройства или состояния; и в целом противодействие заболеванию, симптому, расстройству или патологическому состоянию.

[00794] Как используют в настоящем описании, термины "лечение" или "облегчение" или "улучшение" используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к подходу для получения полезных или желаемых результатов, включая, но не ограничиваясь ими, терапевтический эффект и/или профилактическую пользу. Под терапевтическим эффектом понимается любое терапевтически значимое улучшение или воздействие на одно или более заболеваний, состояний или симптомов, подлежащих лечению. Для профилактической пользы конструкции могут вводиться индивиду, подверженному риску развития конкретного заболевания, состояния или симптома, или индивиду, демонстрирующему один или более физиологических симптомов заболевания, хотя болезнь, состояние или симптом, возможно, еще не проявились.

[00795] Термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к количеству агента, достаточному для получения полезных или желаемых результатов. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от одного или более факторов: индивид и состояние заболевания, подвергаемого лечению, вес и возраст индивида, тяжесть заболевания, способ введения и т.п., которые могут быть легко определены специалистом в данной области. Этот термин также относится к дозе, которая обеспечит визуализацию для обнаружения любым из способов визуализации, описанных в настоящем описании. Конкретная доза может варьироваться в зависимости от одного или более факторов: выбранный конкретный агент, режим дозирования, который следует соблюдать, введение комбинации с другими соединениями, время введения, подлежащая визуализации ткань и физическая система доставки.

[00796] В практике настоящего изобретения используются, если не указано иначе, общепринятые способы иммунологии, биохимии, химии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, геномики и рекомбинантных ДНК, которые входят в компетенции специалистов. См. Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F, M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Flames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

[00797] Несколько аспектов изобретения относятся к векторным системам, содержащим один или более векторов, или к векторам как таковым. Векторы могут быть разработаны для экспрессии транскриптов CRISPR (например, транскриптов нуклеиновых кислот, белков или ферментов) в прокариотических или эукариотических клетках. Например, транскрипты CRISPR могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как Escherichia coli, клетках насекомых (с использованием экспрессирующих векторов бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждаются далее в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор можно транскрибировать и транслировать in vitro, например, с использованием регуляторных последовательностей промотора T7 и полимеразы T7.

[00798] Варианты осуществления изобретения включают последовательности (как полинуклеотидные, так и полипептидные), которые могут содержать гомологичную замену ("замещение" используются в настоящем описании для обозначения обмена существующего аминокислотного остатка или нуклеотида с альтернативным остатком или нуклеотидом), которая может происходить, например, для подобной замены в случае аминокислот, таких как основные для основных, кислотные для кислотных, полярные для полярных и т. д. Негомологичное замещение может также происходить, то есть из одного класса остатков в другой или, в качестве альтернативы, включение неестественных аминокислот, таких как орнитин (далее обозначаемый как Z), орнитин диаминомасляной кислоты (далее называемый B), норлейцин орнитин (далее называемый O), пироариланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин. Вариантные аминокислотные последовательности могут включать подходящие спейсерные группы, которые могут быть вставлены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, включая алкильные группы, такие как метил-, этил- или пропильные группы, в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Специалисты в данной области могут хорошо понимать дальнейшую форму вариации, которая включает присутствие одного или более аминокислотных остатков в пептоидной форме. Во избежание сомнений, "пептоидная форма" используется для обозначения вариантов аминокислотных остатков, в которых α-углеродная заместительная группа находится на атоме азота остатка, а не на α-углероде. Способы получения пептидов в пептоидной форме известны в данной области, например, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 и Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.

[00799] Моделирование гомологии: соответствующие остатки в других ортологах C2c2 могут быть идентифицированы с помощью способов Zhang et al., 2012 (Nature, 490 (7421): 556-60) и Chen et al., 2015 (PLoS Comput Biol; 11 (5): e1004248) - способ вычисления белок-белкового взаимодействия (PP1) для прогнозирования взаимодействий, опосредованных поверхностями контакта домен-мотив. PrePPI (Predicting PPI), основанный на структуре способ прогнозирования PPI, объединяет структурные доказательства с неструктурными данными с использованием байесовской статистической модели. Способ включает взятие пары белков запроса и использование структурного выравнивания для идентификации структурных представителей, соответствующим либо их экспериментально определенным структурам, либо гомологичным моделям. Структурное выравнивание далее используется для идентификации как близких, так и отдаленных структурных соседей путем рассмотрения глобальных и локальных геометрических отношений. Всякий раз, когда два соседа структурных представителей образуют комплекс, указанный в Protein Data Bank, это определяет шаблон для моделирования взаимодействия между двумя белками запросов. Модели комплекса создаются путем наложения репрезентативных структур на соответствующего структурного соседа в шаблоне. Этот подход далее описан в Dey et al, 2013 (Prot Sci, 22: 359-66).

[00800] Для целей настоящего изобретения амплификация означает любой способ, использующий праймер и полимеразу, способную реплицировать последовательность-мишень с разумной точностью. Амплификацию можно проводить с помощью природных или рекомбинантных ДНК-полимераз, таких как ДНК-полимераза TaqGold™, T7, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli и обратная транскриптаза. Предпочтительным способом амплификации является ПЦР.

[00801] В некоторых вариантах изобретение включает векторы. Как используют в настоящем описании, термин "вектор" представляет собой инструмент, который позволяет или облегчает передачу объекта из одной среды в другую. Это репликон, такой как плазмида, фаг или космида, в которые может быть вставлен другой сегмент ДНК, чтобы вызвать репликацию вставленного сегмента. Как правило, вектор способен к репликации, когда он связан с соответствующими элементами управления. В общем, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Векторы включают, но не ограничиваются, молекулами нуклеиновых кислот, которые являются однонитевыми, двухцепочечными или частично двухцепочечными; молекулами нуклеиновых кислот, которые содержат один или более свободных концов, или не содержат свободных концов (например, круглые); молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат ДНК, РНК или и то, и другое; и другие разновидности полинуклеотидов, известных в данной области. Один тип вектора представляет собой "плазмиду", которая относится к круглой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть добавлены дополнительные сегменты ДНК стандартными способами молекулярного клонирования. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором в векторе для упаковки в вирус присутствуют вирусные ДНК или РНК (например, ретровирусы, ретровирусы с дефектами репликации, аденовирусы, аденовирусы с дефектами репликации и аденоассоциированные вирусы (AAV)). Вирусные векторы также включают полинуклеотиды, переносимые вирусом для трансфекции в клетку-хозяина. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина, после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы упоминаются в настоящем описании как "экспрессирующие векторы". Обычные экспрессирующие векторы, использующиеся в способах рекомбинантной ДНК, часто имеют форму плазмид.

[00802] Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут содержать нуклеиновые кислоты по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновых кислот в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные экспрессирующие векторы включают один или более регуляторных элементов, которые могут быть выбраны на основе клеток-хозяев, используемых для экспрессии, и которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновых кислот, которая должна быть экспрессирована. Внутри рекомбинантного экспрессирующего вектора "функционально связанный" означает, что целевая нуклеотидная последовательность связана с регуляторным элементом(ами) таким образом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе in vitro транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда вектор вводится в клетку-хозяина). Что касается способов рекомбинации и клонирования, может быть упомянута заявка на патент США 10/815730, опубликованная 2 сентября 2004 года в качестве US 2004-0171156 A1, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полом объеме.

[00803] Аспекты изобретения относятся к бицистронным векторам для направляющей РНК и РНК дикого типа, модифицированных или мутированных эффекторных белков/ферментов CRISPR (например, C2c2). Бицистронные экспрессирующие векторы направляющей РНК и РНК дикого типа, модифицированных или мутированных эффекторных белков/ферментов CRISPR (например, C2c1 или C2c3). В целом и, в частности, в этом варианте осуществления и диком типе, модифицированные или мутированные эффекторные белки/ферменты CRISPR (например, C2c1 или C2c3) предпочтительно находятся под контролем промотора CBh. РНК может предпочтительно находиться под контролем промотора РНК-полимеразы III, такого как промотор U6. В идеале эти два промотора сочетаются.

[00804] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена петля в направляющей РНК. Это может быть шпилька или тетрапетля. Петля предпочтительно представляет собой GAAA, но не ограничивается этой последовательностью или даже длиной 4 п.о. Действительно, предпочтительные последовательности формирования петли для использования в структурах шпильки имеют длину четыре нуклеотида и наиболее предпочтительно имеют последовательность GAAA. Однако могут использоваться более длинные или более короткие последовательности петель, а также альтернативные последовательности. Последовательности предпочтительно включают нуклеотидный триплет (например, AAA) и дополнительный нуклеотид (например, C или G). Примеры последовательностей, формирующих петли, включают CAAA и AAAG.

[00805] При осуществления любого из способов, описанных в настоящем описании, подходящий вектор может быть введен в клетку или эмбрион посредством одного или более способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, микроинъекцию, электропорацию, сонопорацию, биолистику, опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, катионную трансфекцию, трансфекцию липосом, трансфекцию дендримера, трансфекцию теплового шока, нуклеофекцию, магнитотрансфекцию, липофекцию, импалефекцию, оптическую трансфекцию, запатентованное усиленное агентом поглощение нуклеиновых кислот, доставку посредством липосом, иммунолипосом, виросом или искусственных вирионов. В некоторых способах вектор вводится в эмбрион путем микроинъекции. Вектор или векторы могут быть введены посредством микроинъекции в ядро или цитоплазму эмбриона. В некоторых способах вектор или векторы могут быть введены в клетку путем нуклеофекции.

[00806] Термин "регуляторный элемент" используется для обозначения промоторов, энхансеров, участков внутренней посадки рибосомы (IRES) и других элементов управления экспрессией (например, сигналов терминации транскрипции, таких как сигналы полиаденилирования и последовательности поли-U). Такие регуляторные элементы описаны, например, в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Регуляторы включают как те, которые напрямую определяют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, так и те, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Тканеспецифический промотор может управлять экспрессией в основном в желаемой интересующей ткани, такой как мышца, нейрон, кость, кожа, кровь, специфические органы (например, печень, поджелудочная железа) или конкретные типы клеток (например, лимфоциты). Регуляторные элементы также могут управлять экспрессией в зависимости от времени, например, в зависимости от стадии клеточного цикла или стадии развития, и могут быть или не быть специфичным для тканей или клеток. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит один или более промоторов ДНК-полимеразы III (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов ДНК-полимеразы III), один или более промоторов ДНК-полимеразы II (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов ДНК-полимеразы II), один или более промоторов ДНК-полимеразы I (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов ДНК-полимеразы I) или их комбинации. Примеры промоторов ДНК-полимеразы III включают, но не ограничиваются ими, промоторы U6 и HI. Примеры промоторов ДНК-полимеразы II включают, но не ограничиваются ими, ретровирусный промотор LTR RAR-саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно с энхансером CMV) [см., например, Boshart et al., Ceil, 41: 521-530 (1985)], промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы, промотор 3-актина, промотор фосфоглицерин-киназы (PGK) и промотор EF1a. Кроме того, термин "регуляторный элемент" охватывает энхансерные элементы, такие как WPRE; энхансеры CMV; сегмент R-U5' в LTR HTLV-I (Mol, Cell. Biol, том 8 (1), стр. 466-472, 1988); энхансер SV40; и интронная последовательность между экзонами 2 и 3 белка кролика P-глобина (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., т. 78 (3), p, 1527-31, 1981). Специалистам в данной области будет понятно, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которая должна быть трансфицирована, а также желаемый уровень экспрессии и т.д. Вектор может быть введен в клетки таким образом, чтобы они продуцировали транскрипты, белки или пептиды, включая слитые белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано в настоящем описании (например, транскрипты системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR), их белки, ферменты, их мутантные формы, их слитые белки и т.д.). Что касается регуляторных последовательностей, то может быть упомянута заявка на патент США 10/491026, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Что касается промоторов, упоминается публикация РСТ WO 2011/028929 и Приложение США 12/511940, содержание которых включено в настоящее в качестве ссылки в полном объеме.

[00807] Векторы могут быть сконструированы для экспрессии транскриптов CRISPR (например, транскриптов нуклеиновых кислот, белков или ферментов) в прокариотических или эукариотических клетках. Например, транскрипты CRISPR могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как Escherichia coli, клетках насекомых (с использованием экспрессирующих векторов бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки обсуждаются далее в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор можно транскрибировать и транслировать in vitro, например, с использованием регуляторных последовательностей промотора T7 и полимеразы T7.

[00808] Векторы могут введены и увеличены в количестве в прокариотических организмах или прокариотических клетках. В некоторых вариантах осуществления прокариотический организм используют для амплификации копий вектора, который должен быть введен в эукариотическую клетку или в качестве промежуточного вектора при образовании вектора, который должен быть введен в эукариотическую клетку (например, амплификация плазмиды как части вирусной векторная упаковочная система). В некоторых вариантах осуществления прокариотический организм используется для амплификации копий вектора и экспрессии одной или более нуклеиновых кислот, например, для обеспечения источника одного или более белков для доставки в клетку-хозяина или организм-хозяин. Экспрессия белков в прокариотах чаще всего происходит в Escherichia coli с векторами, содержащими конститутивные или индуцируемые промоторы, которые направляют экспрессию либо слитых, либо неслитых белков. Слитые векторы встраивают ряд аминокислот в кодируемый им белок, например, на N-конце рекомбинантного белка. Такие слитые векторы могут служить одной или более целям, таким как: (i) увеличение экспрессии рекомбинантного белка; (ii) увеличение растворимости рекомбинантного белка; и (iii) содействие очистке рекомбинантного белка, действуя как лиганд в аффинной очистке. Часто в слитых экспрессирующих векторах вводится сайт протеолитического расщепления на стыке области слияния и рекомбинантного белка, чтобы обеспечить отделение рекомбинантного белка от слитого фрагмента после очистки слитого белка. Такие ферменты и их родственные последовательности распознавания включают фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Примеры экспрессирующих векторов слияния включают pGEX (Pharmacia Biotech Inc, Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) И pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), которые производят слияние глютатион S-трансферазы (GST), связывающего мальтозу белка E или белка A, соответственно, с целевым рекомбинантным белком.

[00809] Примеры подходящих индуцибельных неслитых экспрессирующих векторов E.coli включают pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315) и pET lid (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, Сан-Диего, Калифорния (1990) 60-89).

[00810] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой экспрессирующий вектор дрожжей. Примеры экспрессирующих векторов в дрожжах Saccharomyces cerivisae включают pYepSeel (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA.) и picZ (InVitrogen Corp, Сан-Диего, Калифорния).

[00811] В некоторых вариантах осуществления вектор управляет экспрессией белка в клетках насекомых с использованием экспрессирующих векторов бакуловируса. Бакуловирусные векторы, доступные для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых (например, клетки SF9), включают серию pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol., 3: 2156-2165) и серию pVL (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

[00812] В некоторых вариантах осуществления вектор способен приводить к экспрессии одной или более последовательностей в клетках млекопитающих с использованием вектора экспрессии в млекопитающих. Примеры экспрессирующих векторов млекопитающих включают pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) и pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). При использовании в клетках млекопитающих функции управления вектором экспрессии обычно выполняются одним или более регуляторными элементами. Например, обычно используемые промоторы получают из полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса, вируса SV40 и других, описанных в настоящем описании и известных в данной области. Другие подходящие системы экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток можно изучить по: см., например, главы 16 и 17 Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Laboratory Cold Spring Harbor, Laboratory Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989.

[00813] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор млекопитающих способен направлять экспрессию нуклеиновых кислот предпочтительно в конкретном типе клеток (например, тканеспецифические регуляторные элементы используются для экспрессии нуклеиновой кислоты). Специфические для ткани регуляторные элементы известны в данной области. Не ограничивающие примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают промотор альбумина (специфический для печени: Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), лимфоидспецифические промоторы (Calarne and Eaton, 1988. Adv. Immunol 43: 235-275), в частности, промоторы рецепторов Т-клеток (Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) и иммуноглобулины (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), нейроспецифические промоторы (например, промотор нейрофиламентов, Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5473-5477), специфические для поджелудочной железы промоторы (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) и промоторы молочной железы, специфические для молочной железы (например, промотор молочной сыворотки, патент США № 4873,316 и публикация Европейской заявки № 264,166). Регулируемые развитием организма промоторы также включают, например, hox-промоторы мыши (Kessel and Grass, 1990. Science 249: 374-379) и промотор α-фетопротеина (Campes and Tilghman, 1989. Гены Dev. 3: 537-546). Что касается этих прокариотических и эукариотических векторов, то может быть упомянут патент США 6750509, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме полноте. Другие варианты осуществления изобретения могут относиться к использованию вирусных векторов, в отношении которых упоминается заявка на патент США 13/1002085, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Специфичные для ткани регуляторные элементы известны в данной области, и в этой связи упоминается патент США 7776321, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[00814] В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент функционально связан с одним или более элементами системы CRISPR, чтобы управлять экспрессией одного или более элементов системы CRISPR. В целом, CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами), также известный как SPIDR (рассеянные между спейсерами прямые повторы), представляют собой семейство локусов ДНК, которые обычно специфичны для конкретных видов бактерий. Локус CRISPR содержит отчетливый класс чередующихся коротких повторов последовательности (SSR), которые были описаны в E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol. 169: 5429-5433 [1987] и Nakata et al., J. Bacteriol., 171: 3553- 3556 [1989]) и ассоциированных генов. Аналогичные участки SSR были идентифицированы в Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena и Mycobacterium tuberculosis (см. Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: 1057-1065 [1993], Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263 [1999], Masepohl et al., Biochim Biophys Acta 1307: 26-30 [1996], Mojica et al., Mol. Microbiol., 17: 85-93 [1995]). Локусы CRISPR, как правило, отличаются от других SSR структурой повторов, которые называются короткими регулярно прерывающимися повторами (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33 [2002], и Mojica et al., Mol. Microbiol., 36: 244-246 [2000]). В общем случае, повторы представляют собой короткие элементы, которые образуют кластеры, которые регулярно распределены по уникальным перемежаемым последовательностям с примерно постоянной длиной (Mojica et al., [2000], см. выше). Хотя повторяющиеся последовательности очень консервативны для разных штаммов, количество прерывающихся повторов и последовательностей спейсерных областей обычно отличаются для разных штаммов (van Embden et al., J. Bacteriol, 182: 2393-2401 [2000]). Локусы CRISPR были идентифицированы более чем у 40 прокариотов (см., Например, Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: 1565-1575 [2002] и Mojica et al., [2005]), включая, но не ограничиваясь, Aeropyrum, Pyrobacidum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermobacterium, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desidfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema и Thermotoga.

[00815] В целом понятие "система нацеливания на нуклеиновую кислоту", используемая в настоящем изобретении, относится в совокупности к транскриптам и другим элементам, участвующим в экспрессии или направляющим активность нацеливания на нуклеиновых кислоты CRISPR-ассоциированных ("Cas") генов (также называемых в настоящем описании эффекторными белками), включая последовательности, кодирующие белок (эффекторный), нацеленный на нуклеиновую кислоту, и направляющую РНК (содержащую последовательность cr-РНК и трансактивирующую последовательность РНК (tracr-РНК) системы CRISPR/Cas) или другие последовательности и транскрипты из локуса CRISPR, нацеленного на нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления один или более элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту получены из системы CRISPR, нацеленной на нуклеиновые кислоты, типов V/VI. В некоторых вариантах осуществления один или более элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту получают из конкретного организма, включающего эндогенную систему CRISPR, нацеленную на нуклеиновые кислоты. В целом система нацеливания на нуклеиновую кислоту характеризуется элементами, которые способствуют образованию комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, на участке последовательности-мишени. В контексте формирования комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, "последовательность-мишень" относится к последовательности, для которой предназначена направляющая последовательность, и которая имеет комплементарность, необходимую для гибридизации между последовательностью-мишенью и направляющей РНК, что способствует образованию комплекса с ДНК или РНК. Полная комплементарность не обязательна, если имеется достаточная комплементарность, вызывающая гибридизацию и способствующая образованию комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту. Последовательность-мишень может содержать полинуклеотиды РНК. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень находится в ядре или цитоплазме клетки. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень может находиться внутри органелл эукариотической клетки, например митохондрий или хлоропластов. Последовательность или матрица, которая может быть использована для рекомбинации в локусе-мишени, содержащем последовательность-мишень, упоминается как "редактирующая матрица или "редактирующая РНК" или "редактирующая последовательность". В аспектах изобретения экзогенная РНК-матрица может упоминаться как матрица редактирования. В любом аспекте изобретения рекомбинация представляет собой гомологичную рекомбинацию.

[00816] Как правило, в контексте эндогенной системы нацеливания на нуклеиновую кислоту образование комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту (содержащего направляющую РНК, гибридизованную с последовательностью-мишенью, в комплексе с одним или более эффекторными белками, нацеленными на нуклеиновую кислоту) приводит к расщеплению одной или обеих цепей РНК (примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований) целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления один или более векторов, управляющих экспрессией одного или более элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, вводят в клетку, так что экспрессия элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту руководит образованием комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, в одном или более участках-мишенях. Например, эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислотe, и направляющая РНК могут быть функционально связаны с отдельными регуляторными элементами на отдельных векторах. Альтернативно, два или более элемента, экспрессируемые с участием одних и тех же или разных регуляторных элементов, могут быть объединены в одном векторе с одним или более дополнительными векторами, обеспечивающими другие компоненты системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, не включенные в первый вектор. Компоненты системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, объединенные в одном векторе, могут быть расположены в любой подходящей ориентации, такой как один элемент, расположенный в направлении 5'-конца относительно (в восходящем направлении) или 3'-конца относительно (в нисходящем направлении) второго элемента. Кодирующая последовательность одного элемента может быть расположена на той же или противоположной цепи кодирующей последовательности второго элемента и быть ориентирована в том же или противоположном направлении. В некоторых вариантах осуществления один промотор руководит экспрессией транскрипта, кодирующего эффекторный белок, нацеленный нуклеиновую кислоту, и направляющей РНК, встроенной в одну или более интронных последовательностей (например, каждая в отдельном интроне, два или более по меньшей мере в одном интроне или все в одном интроне). В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, и направляющая РНК функционально связаны и экспрессируются с одного и того же промотора.

[00817] В общем, направляющая последовательность представляет собой любую полинуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность с полинуклеотидной последовательностью-мишенью для гибридизации с последовательностью-мишенью и прямого специфического для последовательности связывания комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между направляющей последовательностью и соответствующей ей последовательностью-мишенью при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания составляет приблизительно или более чем 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% и более. Оптимальное выравнивание может быть определено с использованием любого подходящего алгоритма для выравнивания последовательностей, неограничивающие примеры которого, включают алгоритм Смита-Уотермана, алгоритм Нидлмана-Вунча, алгоритмы, основанные на преобразовании Берроуза-Уилера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAST, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (iIllumina, Сан-Диего, Калифорния), SOAP (доступно на soap.genornics.org.cn) и Maq (доступно на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления, направляющая последовательность составляет приблизительно или больше, чем приблизительно 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая последовательность меньше чем приблизительно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов в длину. Способность направляющей последовательности управлять специфическим для последовательности связыванием нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса с последовательностью-мишенью может быть оценена любым подходящим способом. Например, компоненты нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, достаточные для образования данного комплекса, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, могут быть доставлены в клетку, имеющую соответствующую последовательность-мишень, например, с помощью трансфекции векторами, кодирующими компоненты нацеленной на нуклеиновые кислоты последовательности CRISPR с последующей оценкой предпочтительного расщепления в пределах или вблизи последовательности-мишени, такой как анализ Surveyor, описанный в настоящем описании. Аналогично, расщепление полинуклеотидной последовательности-мишени (или последовательности вблизи нее) может быть оценено в пробирке путем предоставления последовательности-мишени, компонентов нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, и контрольной направляющей последовательности, отличной от тестируемой направляющей последовательности, и сравнения связывания или скорости расщепления происходящего непосредственно в или вблизи последовательности-мишени между реакциями тестовой и контрольной направляющих последовательностей. Другие способы анализа также возможны и могут быть разработаны специалистами в данной области.

[00818] Направляющая последовательность может быть выбрана так, чтобы нацеливать на любую последовательность-мишень. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень представляет собой последовательность внутри транскрипта гена или мРНК.

[00819] В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень представляет собой последовательность в геноме клетки.

[00820] В некоторых вариантах осуществления выбирается направляющая последовательность для компактизации вторичной структуры внутри направляющей последовательности. Вторичная структура может быть определена любым подходящим алгоритмом фолдинга полинуклеотидов. Некоторые программы основаны на вычислении минимальной свободной энергии Гиббса. Примером такого алгоритма является mFold, как описано Zuker и Stiegler (Nucleic Acids Res., 9 (1981), 133-148). Другим примером алгоритма выявления фолдинга является вебсервер RNAfold, разработанный в Институте теоретической химии Венского университета, с использованием алгоритма прогнозирования центроида (см., например, AR Gruber era, 2008, Cell 106 (1): 23-24; PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27 (12): 1151-62). Другие алгоритмы могут быть найдены в заявке США серийного номера TBA (номер патентного реестра 44790.11.2022, широкая ссылка В1-2013/004A); включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[00821] В некоторых вариантах осуществления предусматривается матрица рекомбинации. Матрица рекомбинации может быть компонентом другого вектора, описанного в настоящем описании, может содержаться в отдельном векторе или предоставляться в виде отдельного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления матрица рекомбинации разработана так, чтобы служить матрицей гомологичной рекомбинации рядом с последовательностью-мишенью или в пределах последовательности-мишени, которая расщепляется или в которую вносится ник-разрыв нацеленным на нуклеиновую кислоту эффекторным белком, будучи частью нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса. Матричный полинуклеотид может обладать любой подходящей длиной, составляющей приблизительно или превышающей 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид комплементарен части полинуклеотида, содержащего последовательность-мишень. При оптимальном выравнивании матричный полинуклеотид может перекрываться с одним или более нуклеотидами последовательности-мишени (например, приблизительно или более 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более нуклеотидов). В некоторых вариантах осуществления при оптимальном выравнивании матричного полинуклеотида с полинуклеотидом, содержащим последовательность-мишень, ближайший нуклеотид матричной последовательности находится в пределах 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 или более нуклеотидов от последовательности-мишени.

[00822] В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, является частью слитого белка, содержащего один или более гетерологичных белковых доменов (например, приблизительно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доменов в дополнение к эффекторному белку, нацеленному на нуклеиновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок/фермент CRISPR является частью слитого белка, содержащего один или более гетерологичных белковых доменов (например, приблизительно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, или более доменов в дополнение к ферменту CRISPR). Эффекторный белок/фермента CRISPR может содержать любую дополнительную белковую последовательность и необязательно линкерную последовательность между любыми двумя доменами. Примеры белковых доменов, которые могут быть слиты с эффекторным белком, включают, но не ограничиваются ими, метки эпитопов, последовательности репортерного гена и белковые домены, имеющие одну или более из следующих активностей: метилазная, деметилазная активность, активность активации транскрипции, активность подавления транскрипции, активность фактора терминации транскрипции, активность модификации гистонов, активность расщепления РНК и активность связывания нуклеиновых кислот. Неограничивающие примеры меток эпитопов включают метки гистидина (His), метки V5, метки FLAG, метки гемагглютинина (HA) гриппа, метки Мус, метки VSV-G и теги тиоредоксина (Trx). Примеры репортерных генов включают, но не ограничиваются следующими: глутатион-S-трансфераза (GST), пероксидаза хрена (HRP), бета-галактозидаза ацетитрансферазы хлорамфеникола (CAT), бета-глюкуронидаза, люцифераза, зеленый флуоресцентный белок (GFP), HcRed, DsRed, голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и аутофлуоресцентные белки, включая синий флуоресцентный белок (BFP). Эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, может быть слит с последовательностью гена, кодирующей белок или фрагмент белка, который связывает молекулы ДНК или связывает другие клеточные молекулы, включая, но не ограничиваясь, следующими: мальтоза-связывающий белок (MBP), S-tag, слитые конструкции ДНК-связывающего домена (DBD) Lex A, слитые конструкции ДНК-связывающего домена GAL4 и слитые конструкции белка BP16 вируса простого герпеса (HSV). Дополнительные домены, которые могут быть частью слитого белка, включающего эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, описаны в патентной публикации США 20110059502, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления меченый эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, используется для идентификации местоположения последовательности-мишени.

[00823] В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR может являться компонентом индуцируемой системы. Индуцируемый характер системы обеспечивает пространственно-временный контроль над редактированием генов или экспрессией генов с использованием энергии. Форма энергии может включать, но не ограничивается ими, электромагнитное излучение, звуковую энергию, химическую энергию и тепловую энергию. Примеры индуцируемой системы включают индуцируемые тетрациклином промоторы (Tet-On или Tet-Off), двугибридные системы активации транскрипции с малой молекулой (FKBP, ABA и т. д.), светоиндуцируемые системы (фитохром, LOV-домены или криптохром). В варианте одном осуществления изобретения фермент CRISPR может быть частью светоиндуцируемого эффектора транскрипции (LITE) для непосредственного изменения транскрипционной активности, специфичного к последовательности. Светоиндуцируемые компоненты могут включать фермент CRISPR, светочувствительный гетеродимер цитохрома (например, Arabidopsis thaliana) и домен активации/подавления транскрипции. Другие примеры индуцируемых связывающих ДНК белков и способы их использования приведены в US 61/736465 и US 61/721283 и WO 2014/018423 и US8889418, US8895308, US20140186919, US20140242700, US20140273234, US20140335620, WO2014093635, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

Доставка

[00824] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, включающим доставку одного или более полинуклеотидов, таких как или один или более векторов, как описано в настоящем описании, один или более его транскриптов и/или один или более белков, транскрибируемых с них, в клетку. В некоторых аспектах изобретение, кроме того, относится к клеткам, полученным такими способами, и организмам (таким как животные, растения или грибы), содержащим или полученным из таких клеток. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, в сочетании с (и, возможно, в составе комплекса) с направляющей РНК доставляется в клетку. Обычные вирусные и невирусные способы переноса генов могут быть использованы для введения нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих или в целевые ткани. Такие способы могут быть использованы для введения нуклеиновых кислот, кодирующих компоненты системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, в клетки культуры или организма. Системы доставки невирусных векторов включают ДНК-плазмиды, РНК (например, транскрипт вектора, описанного в настоящем описании), "голую" нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту в комплексе со средством доставки, таким как липосома. Системы вирусной доставки векторов включают ДНК и РНК-вирусы, которые имеют либо эписомальные, либо интегрированные геномы после доставки в клетку. Обзор способов генной терапии см. в Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nab el & Feigner, TIBTECH 11: 211-217 (1993), Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon, TIBTЕСН 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1995), Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1): 31-44 (1995); Haddada et al., В Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bomm (eds) (1995) и Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994).

[00825] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включают липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, генные пушки, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, поликатионы или конъюгаты липидов с нуклеиновыми кислотами, "голую" ДНК, искусственные вирионы и усиленное агентом поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патентах США № 5049386, 4946787; и 4897355), и липофекционные реагенты продаются на коммерческой основе (например, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, которые пригодны для эффективного распознавания рецепторов липофекции полинуклеотидов, включают таковые Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. Доставка может осуществляться в клетки (например, in vitro или ex vivo) или ткани-мишени (например, in vivo).

[00826] Получение комплексов липидов с нуклеиновыми кислотами, включая целевые липосомы, такие как иммунолипидные комплексы, хорошо известно специалисту в данной области (см., например, Crystal, Science 270: 404-410 (1995), Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995), Behr et at., Bioconjugate Chem., 5: 382-389 (1994), Remy et al., Bioconjugate Chem., 5: 647-654 (1994), Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995), Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992), патенты США №№ 4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 и 4946787).

[00827] В применении РНК или ДНК-вирусных систем для доставки нуклеиновых кислот используются современные способы нацеливания вируса на конкретные клетки в организме и передачи вирусного генома в ядро. Вирусные векторы могут вводиться непосредственно пациентам (in vivo) или их можно использовать для обработки клеток in vitro, а модифицированные клетки могут быть введены пациентам (ex vivo). Обычные вирусные системы могут включать ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные и вирусные вирусы простого герпеса для переноса генов. Встраивание в геном хозяина возможно с помощью способов переноса генов ретровирусов, лентивирусов и аденоассоциированных вирусов, часто приводящих к длительной экспрессии введенного трансгена. Кроме того, высокая эффективность трансдукции наблюдалась во многих других типах клеток- и тканей-мишеней.

[00828] Тропизм ретровируса может быть изменен путем включения чужеродных белков оболочки, что позволяет расширить потенциальную популяцию клеток, которые могут стать мишенью генного воздействия. Лентивирусные векторы представляют собой ретровирусные векторы, которые способны трансформировать или инфицировать не делящиеся клетки и, как правило, имеют высокие вирусные титры. Поэтому выбор ретровирусной системы переноса генов будет зависеть от ткани-мишени. Ретровирусные векторы состоят из цис-действующих длинных концевых повторов с упаковочной емкостью до 6-10 т.п.н. чужеродной последовательности. Минимальные цис-действующие LTR достаточны для репликации и упаковки векторов, которые затем используются для интеграции терапевтического гена в клетку-мишень для обеспечения постоянной трансгенной экспрессии. Широко используемые ретровирусные векторы включают векторы, основанные на вирусе лейкемии мышей (MuLV), вирусе лейкемии гиббонов (GaLV), вирусе иммунодефицита обезьян (SIV), вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ) и их комбинациях (см., например, Buchscher et al., J. Virol, 66: 2731-2739 (1992), Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640 (1992), Sommnerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990), Wilson et al., J. Virol, 63: 2374-2378 (1989), Miller et al., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991), PCT/US94/05700). В тех вариантах, где предпочтительна временная экспрессия, могут быть использованы аденовирусные системы. Аденовирусные векторы способны к очень высокой эффективности трансдукции во многих типах клеток и не требуют деления клеток. С такими векторами был получен высокий титр и уровни экспрессии. Этот вектор может быть получен в больших количествах в относительно простой системе. Векторы на основе аденоассоциированных вирусов ("AAV") также могут быть использованы для трансдукции клеток целевыми нуклеиновыми кислотами, например, при продуцировании in vitro нуклеиновых кислот и пептидов, а также для процедур генной терапии in vivo и ex vivo (см., например, West et al., Virology 160: 38-47 (1987), US 4797368, WO 93/24641, Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994), Muzyczka, J. Clin. Invest.: 1351 (1994). Конструирование рекомбинантных векторов AAV описано в ряде публикаций, включая патент США № 5173414, Tratschin et al. Mol. Cell, Biol., 5: 3251-3260 (1985), Tratschin, et al., Mol. Cell, Biol., 4: 2072-2081 (1984), Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466-66470 (1984) и Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1989).

Варианты для ДНК/РНК, или ДНК/ДНК, или РНК/РНК, или белка/РНК

[00829] В некоторых вариантах осуществления компоненты CRISPR-систем могут доставляться в различных формах, таких как комбинации ДНК/РНК, или РНК/РНК, или белок/РНК. Например, C2c1 или C2c3 может быть доставлен как ДНК-кодирующий полинуклеотид или как РНК-кодирующий полинуклеотид или как белок. Направляющая молекула может быть доставлена как ДНК-кодирующий полинуклеотид или как РНК. Предусмотрены все возможные комбинации, включая смешанные формы доставки.

[00830] В некоторых вариантах осуществления предусматриваются все такие комбинации (ДНК/РНК, или ДНК/ДНК, или РНК/РНК, или белок/РНК).

[00831] В некоторых вариантах осуществления, когда C2c1 или C2c3 доставляют в форме белка, возможна предварительная сборка с одной или более направляющими молекулами.

Наноклубки

[00832] Кроме того, система CRISPR может доставляться с использованием наноклубков, например, описанных в Sun W et al, Cocoon-like self-degradable DNA nanoclew for anticancer drag delivery., J Am Chem Soc. 2014 Oct 22; 136(42): 14722-5. doi: 10.1021/ja5088024. Epub 2014 Oct 13; или в Sun W et al, Self- Assembled DNA Nanoclews for the Efficient Delivery of CRISPR-Cas9 for Genome Editing., Angew Chem Int Ed En), 2015 Oct 5;54(41): 12029-33. doi: 10.1002/anie.201506030. Epub 2015 Aug 27.

[00833] В практическом применении настоящего изобретения используются, если не указано обратное, общепринятые способы иммунологии, биохимии, химии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, геномики и технологии рекомбинантной ДНК, которые являются стандартными для специалистов в данной области. См. See Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); серия METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hanies and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

Модели генетических и эпигенетических условий

[00834] Способ по изобретению может быть использован для создания растения, животного или клетки, которые могут быть использованы для моделирования и/или изучения генетических или эпигенетических условий, представляющих интерес, например, посредством модели представляющих интерес мутаций или заболеваний. Как используют в настоящем описании, термин "заболевание" относится к заболеванию, расстройству или симптому у индивида. Например, способ по изобретению может быть использован для создания животного или клетки, которые включают модификацию в одной или более последовательностях нуклеиновых кислот, связанных с заболеванием, или растение, животное или клетку, в которых экспрессия одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, связанных с заболеванием, изменена. Такая последовательность нуклеиновых кислот может кодировать связанную с заболеванием последовательность белка или может быть связанной с заболеванием последовательностью контроля. Соответственно, понятно, что в вариантах осуществления изобретения растение, индивид, пациент, организм или клетка могут быть не являющимися человеком пациентом, организмом или не происходящей от человека клеткой. Таким образом, изобретение относится к растению, животному или клетке, полученным способами по настоящему изобретению, или к их потомству. Потомство может быть клоном произведенного растения или животного или может быть результатом полового размножения путем скрещивания с другими особями одного и того же вида для внедрения других желательных признаков в их потомство. Клетка может находиться in vivo или ex vivo в случае многоклеточных организмов, особенно животных или растений. В случае, когда клетка культивируется, клеточная линия может быть создана, если соответствующие условия культивирования удовлетворяются, и предпочтительно, если клетка подходяще приспособлена для этой цели (например, стволовая клетка). Также предусматриваются бактериальные клеточные линии, полученные с соответствии с изобретением. Таким образом, клеточные линии также предусматриваются.

[00835] В некоторых способах модель болезни может быть использована для изучения эффектов мутаций на животное или клетку, развития и/или прогрессирования заболевания с использованием мер, обычно используемых при изучении этого заболевания. Альтернативно, такая модель болезни полезна для изучения влияния фармацевтически активных соединений на заболевание.

[00836] В некоторых способах модель болезни может быть использована для оценки эффективности потенциальной стратегии генной терапии. То есть связанный с болезнью ген или полинуклеотид может быть модифицирован таким образом, что развитие заболевания и/или его прогрессирование ингибируются или уменьшаются. В частности, способ включает модификацию связанного с заболеванием гена или полинуклеотида таким образом, что образуется измененный белок и, как результат, животное или клетка имеют измененный ответ. Соответственно, в некоторых способах генетически модифицированное животное можно сравнить с животным, предрасположенным к развитию заболевания, что даст возможность оценить влияние генной терапии.

[00837] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам разработки биологически активного агента, который изменяет сигнал клеток, связанных с геном болезни. Способ включает приведение в контакт испытуемого соединения с клеткой, содержащей один или более векторов, управляющих экспрессией одного или более ферментов CRISPR, и последовательность прямого повтора, связанную с направляющей последовательностью; и обнаружение изменения в показаниях, которое указывает на уменьшение или увеличение сигнала клетки, связанного, например, с мутацией в гене болезни, содержащемся в клетке.

[00838] Модель клетки или модель на животных может быть создана в сочетании со способом изобретению для диагностики изменения клеточной функции. Такая модель может быть использована для изучения влияния последовательности генома, модифицированной комплексом CRISPR по изобретению, на интересующую клеточную функцию. Например, модель клеточной функции может использоваться для изучения влияния модифицированной последовательности генома на внутриклеточную передачу сигнала или внеклеточную передачу сигнала. Альтернативно, модель клеточной функции может использоваться для изучения эффектов модифицированной последовательности генома на сенсорное восприятие. В некоторых таких моделях модифицирована одна или более геномных последовательностей, связанных с сигнальным биохимическим путем в модели.

[00839] Было исследовано несколько моделей заболеваний. К ним относятся исследование de novo генов риска аутизма CHD8, KATNAL2 и SCN2A; и гена синдромного аутизма (синдром Ангельмана) UBE3A. Конечно, эти гены и результирующие модели аутизма предпочтительнее, но служат для того, чтобы показать широкую применимость изобретения для генов и соответствующих моделей.

[00840] Измененная экспрессия одной или более геномных последовательностей, связанных с сигнальным биохимическим путем, может быть определена путем анализа разности уровней мРНК соответствующих генов между тестовой модельной клеткой и контрольной клеткой, когда они контактируют с кандидатом. Альтернативно, дифференциальная экспрессия последовательностей, связанных с сигнальным биохимическим путем, определяется путем обнаружения различий в количестве кодируемого полипептида или генного продукта.

[00841] Для анализа индуцированного агентом изменения уровня транскриптов мРНК или соответствующих полинуклеотидов нуклеиновую кислоту, содержащуюся в образце, сначала экстрагируют в соответствии со стандартными способами в данной области. Например, мРНК может быть выделена с использованием различных литических ферментов или химических растворов в соответствии с методиками, изложенными в Sambrook et al. (1989) или экстрагирована путем связывания нуклеиновой кислоты со смолами в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителей. Затем мРНК, содержащуюся в образце экстрагированной нуклеиновой кислоты, выявляют с помощью способов амплификации или обычных анализов гибридизации (например, нозерн-блоттинга) в соответствии со способами, широко известными в данной области или на основе способов, описанных в настоящем описании.

[00842] Для целей настоящего изобретения амплификация означает любой способ, использующий праймер и полимеразу, способную реплицировать последовательность-мишень с достаточной точностью. Амплификацию можно проводить с помощью природных или рекомбинантных ДНК-полимераз, таких как ДНК-полимераза TaqGold™, T7, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli и обратная транскриптаза. Предпочтительным способом амплификации является ПЦР. В частности, выделенная РНК может быть подвергнута анализу с использованием обратной транскрипции, которая сопряжена с количественной полимеразной цепной реакцией (ОТ-РЦР), чтобы количественно определить уровень экспрессии последовательности, связанной с сигнальным биохимическим путем.

[00843] Определение уровня экспрессии гена может проводиться в реальном времени в анализе с использованием амплификации. В одном из аспектов амплифицированные продукты могут быть непосредственно визуализированы с помощью флуоресцентных связывающих ДНК агентов, включая, но не ограничиваясь ими: интеркаляторы ДНК и связывающиеся с желобками ДНК агенты. Поскольку количество интеркаляторов, включенных в молекулы двухцепочечной ДНК, как правило, пропорционально количеству амплифицированных продуктов ДНК, удобно определять количество амплифицированных продуктов путем количественной оценки флуоресценции интеркалировавшего красителя с использованием стандартно применяемых оптических приборов, используемых в данной области. ДНК-связывающие красители, подходящие для применения с этой целью, включает SYBR green, SYBR blue, DAPI, пропидия йодид, hoechst, SYBR gold, бромид этидия, акридиновые красители, дауномицин, хлорохин, дистамицин D, хромомицин, митрамицин, полипиридины рутения, антрамицин и т.п.

[00844] В другом аспекте в реакции амплификации могут быть использованы другие флуоресцентные метки, такие как специфические для последовательности зонды для облегчения обнаружения и количественного определения амплифицированных продуктов. Количественная амплификация на основе использования зонда зависит от специфического для последовательности определения желаемого продукта амплификации. Она использует флуоресцентные целеспецифичные зонды (например, зонды TaqMan®), что приводит к повышению специфичности и чувствительности. Способы осуществления количественной амплификации на основе использования зонда хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 5210015.

[00845] В еще одном варианте аспекте могут быть выполнены обычные анализы гибридизации с использованием зондов гибридизации, гомологичных последовательностям, связанным с сигнальным биохимическим путем. Обычно допускается формирование зондами стабильных комплексов с последовательностями, связанными с сигнальным биохимическим путем, содержащимися в биологическом образце, полученном от исследуемого индивидуума, в ходе реакции гибридизации. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что, когда антисмысловая последовательность используется в нуклеиновой кислоте-зонде, полинуклеотиды-мишени, представленные в образце, выбирают так, чтобы они были комплементарными антисмысловым последовательностям нуклеиновых кислот. Напротив, когда нуклеотидный зонд является смысловой последовательностью нуклеиновой кислоты, в качестве полинуклеотида-мишени выбирают комплементарную к последовательностям смысловую последовательность нуклеиновой кислоты.

[00846] Гибридизация может выполняться в условиях, различающихся по уровню жесткости. Подходящие условия гибридизации для практики настоящего изобретения таковы, что взаимодействие при распознавании зондом последовательностей, ассоциированных с сигнальным биохимическим путем, является достаточно специфичным и достаточно стабильным. Условия, которые повышают жесткость условий реакции гибридизации, широко известны и опубликованы в данной области. См., например, (Sambrook, et al., (1989), Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, second edition). Анализ гибридизации может быть проведен с использованием зондов, иммобилизованных на любом твердом носителе, включая, но не ограничиваясь, нитроцеллюлозу, стекло, силикон и множество генных матриц. Является предпочтительным проведение анализа гибридизации на генных чипах высокой плотности, как описано в патенте США № 5445934.

[00847] Для удобного обнаружения комплексов зонд-мишень, образующихся во время анализа гибридизации, нуклеотидные зонды могут быть конъюгированы с поддающейся обнаружению меткой. Поддающиеся обнаружению метки, подходящие для использования в рамках настоящего изобретения, включают любую конструкцию, детектируемую фотохимическими, биохимическими, спектроскопическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими способами. В данной области известно большое количество подходящих поддающихся обнаружению меток, которые включают флуоресцентные или хемилюминесцентные метки, метки радиоактивного изотопа, ферментативные или другие лиганды. В предпочтительных вариантах осуществления, вероятно, может быть желательным использовать флуоресцентную метку или метку фермента, такую как дигоксигенин, β-галактозидаза, уреаза, щелочная фосфатаза или пероксидаза, комплекс авидин/биотин.

[00848] Способы обнаружения, используемые для обнаружения или количественной оценки гибридизации, обычно зависят от выбора метки. Например, радиоактивные метки могут быть обнаружены с использованием фотопленки или прибора Phosphoimager. Флуоресцентные маркеры могут быть обнаружены и количественно определены с помощью фотоприемника для обнаружения испускаемого света. Ферментативные метки обычно обнаруживают путем обеспечения фермента субстратом и измерения количества полученного продукта реакции, создаваемого воздействием фермента на субстрат; и, наконец, колориметрические метки обнаруживаются путем простой визуализации цветной метки.

[00849] Индуцированное агентом изменение экспрессии последовательностей, связанных с сигнальным биохимическим путем, также может быть определено путем изучения соответствующих продуктов гена. Определение уровня белка обычно включает: а) проведение реакции белка, содержащегося в биологическом образце, с агентом, который специфически связывается с белком, ассоциированным с сигнальным биохимическим путем; и (b) идентификацию любого образовавшегося комплекса агент-белок. В одном аспекте данного варианта осуществления агент, который специфически связывает белок, связанный с сигнальным биохимическим путем, представляет собой антитело, предпочтительно моноклональное антитело.

[00850] Реакцию проводят путем связывания агента с образцом белков, ассоциированных с сигнальным биохимическим путем, полученным из пробных образцов, в условиях, которые позволяют образование комплекса агентом и белками, ассоциированными с сигнальным биохимическим путем. Образование комплекса может быть обнаружено прямо или косвенно в соответствии со стандартными методиками в данной области. При использовании способа прямого обнаружения агенты снабжаются поддающейся обнаружению меткой, и непрореагировавшие агенты могут быть удалены из комплекса; количество неиспользованной метки тем самым позволяет определить количество образовавшегося комплекса. Для такого способа предпочтительно выбирать метки, которые остаются связанными с агентом даже при жестких условиях промывания. Предпочтительно, чтобы метка не мешала реакции связывания. В альтернативном варианте процедура косвенного обнаружения может использовать агент, который содержит метку, введенную либо химическим, либо ферментативным путем. Желательная метка обычно не препятствует связыванию или стабильности полученного комплекса полипептида и агента. Однако метка обычно предназначена для того, чтобы быть доступной для эффективного связывания антителом и, следовательно, генерировать распознаваемый сигнал.

[00851] В данной области известно большое количество меток, подходящих для определения уровней белка. Неограничивающие примеры включают радиоизотопы, ферменты, коллоидные металлы, флуоресцентные соединения, биолюминесцентные соединения и хемилюминесцентные соединения

[00852] Количество комплексов агент-полипептид, образующихся во время реакции связывания, может быть количественно определено стандартными количественными способами анализа. Как проиллюстрировано выше, образование комплекса агент-полипептид может быть непосредственно измерено по количеству метки, оставшейся в участке связывания. В альтернативном варианте белок, связанный с сигнальным биохимическим путем, тестируют на его способность конкурировать с меченым аналогом за сайты связывания специфического агента. В этом конкурентном анализе количество захваченной метки обратно пропорционально количеству белковых последовательностей, ассоциированных с сигнальным биохимическим путем, присутствующих в тестируемом образце.

[00853] Ряд способов анализа белка, основанных на общих принципах, изложенных выше, доступен в данной области. Они включают, но не ограничиваются ими, радиоиммунные способы анализа, ELISA (иммунорадиометрические анализ с ферментным связыванием), "сэндвич-иммуноанализ", иммунорадиометрический анализ, иммунологический анализ in situ (с использованием, например, коллоидного золота, фермента или радиоизотопной метки), анализ с использованием вестерн-блоттинга, анализ иммунопреципитации, иммунофлуоресцентный анализ и SDS-PAGE.

[00854] Антитела, которые специфически распознают или связывают с белки, связанные с сигнальным биохимическим путем, являются предпочтительными для проведения вышеупомянутых анализов белка. При желании можно использовать антитела, которые распознают конкретный тип посттрансляционных модификаций (например, индуцирбельные модификации сигнального биохимического пути). Посттрансляционные модификации включают, но не ограничиваются ими: гликозилирование, липидирование, ацетилирование и фосфорилирование. Эти антитела могут быть приобретены у коммерческих поставщиков. Например, доступны антитела к антифосфотирозину, которые специфически распознают тирозин-фосфорилированные белки, ряда поставщиков, включая Invitrogen и Perkin Elmer. Антитела к антифосфотирозину особенно полезны для обнаружения белков, которые по-разному фосфорилируются по остаткам тирозина в ответ на стресс ER. Такие белки включают, но не ограничиваются этим, эукариотический фактор инициации трансляции 2 альфа (eIF-2a). Альтернативно, эти антитела могут быть получены с использованием традиционных технологий поликлональных или моноклональных антител путем иммунизации животного-хозяина или клетки, продуцирующей антитела, целевым белком, который демонстрирует желаемую посттрансляционную модификацию.

[00855] При практическом осуществлении способа введения в индивида может быть желательным выявить паттерн экспрессии белка, связанного с сигнальным биохимическим путем в различных тканях организма, в разных типах клеток и/или в разных субклеточных структурах. Эти исследования могут быть выполнены с использованием специфичных для ткани, специфичных для клеток или субклеточных структур антител, способных связываться с маркерами белка, которые предпочтительно экспрессируются в определенных тканях, типах клеток или субклеточных структурах.

[00856] Измененная экспрессия гена, связанного с сигнальным биохимическим путем, также может быть определена путем изучения изменения активности генных продуктов в сравнении с контрольной клеткой. Анализ вызванного агентом изменения активности белка, связанного с сигнальным биохимическим путем, будет зависеть от биологической активности и/или пути передачи сигнала, который исследуется. Например, когда белок является киназой, изменение его способности фосфорилировать субстрат (субстраты) ниже в том же пути можно определить с помощью различных анализов, известных в данной области. Типичные способы анализа включают, однако не ограничиваются такими как: иммуноблоттинг и иммунопреципитацию антителами, такими как антитела к антифосфотирозину, которые распознают фосфорилированные белки. Кроме того, активность киназы может быть обнаружена с помощью высокопроизводительных хемилюминесцентных способов анализа, таких как AlphaScreen™ (доступный от Perkin Elmer) и eTag™ (Chan-Hui, et al., (2003) Clinical Immunology 111: 162-174).

[00857] Если белок, связанный с сигнальным биохимическим путем, является частью сигнального каскада, приводящего к колебаниям внутриклеточного рН, в качестве репортерных молекул можно использовать чувствительные к рН молекулы, такие как флуоресцентные рН-индикаторы. В другом примере, где белок, связанный с сигнальным биохимическим путем, является ионным каналом, можно контролировать флуктуации мембранного потенциала и/или концентрации внутриклеточных ионов. Ряд коммерческих наборов и высокопроизводительных устройств особенно подходит для быстрого и надежного скрининга модуляторов ионных каналов. Типичные устройства включают FLIPR™ (Molecular Devices, Inc.) и VIPR (Aurora Biosciences). Эти приборы способны одновременно обнаруживать реакции в более чем 1000 лунках образцов микропланшета и обеспечивать измерение и функциональные данные в режиме реального времени в течение секунд или даже миллисекунд.

[00858] При использовании любого из описанных в настоящем описании способов подходящий вектор может быть введен в клетку или эмбрион с использованием одного или более способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, микроинъекции, электропорацию, образование пор с использованием ультразвука, биолистику, опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, катионную трансфекцию, липосомную трансфекцию, трансфекцию с использованием дендримеров, трансфекцию с использованием теплового шока, трансфекцию-нуклеофекцию, магнитофекцию, липофекцию, импалефекцию, оптическую трансфекцию, захват нуклеиновых кислот патентованным агентом и доставку с использованием липосом, иммунолипосом, вирусом и искусственных вирионов. В некоторых способах вектор вводится в эмбрион путем микроинъекции. Вектор или векторы могут быть введены посредством микроинъекции в ядро или цитоплазму эмбриона. В некоторых способах вектор или векторы могут быть введены в клетку путем нуклеофекции.

[00859] Полинуклеотид-мишень комплекса CRISPR может быть любым полинуклеотидом, эндогенным или экзогенным для эукариотической клетки. Например, полинуклеотид-мишень может представлять собой полинуклеотид, который находится в ядре эукариотической клетки. Полинуклеотид-мишень может представлять собой последовательность, кодирующую генный продукт (например, белок) или некодирующую последовательность (например, регуляторный полинуклеотид или мусорную ДНК).

[00860] Примеры полинуклеотидов-мишеней включают последовательность, связанную с сигнальным биохимическим путем, например, сигнальным биохимическим путем, ассоциированным с геном или полинуклеотидом. Примеры полинуклеотидов-мишеней включают связанный с заболеванием ген или полинуклеотид. Понятие ген или полинуклеотид, "ассоциированный с заболеванием" относится к любому гену или полинуклеотиду, который производит продукты транскрипции или трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетках, полученных из тканей, пораженных болезнью, по сравнению с контрольными тканями или клетками, не пораженными заболеванием. Это может быть ген, который экспрессируется на аномально высоком уровне; это может быть ген, который экспрессируется на аномально низком уровне, причем изменения уровня экспрессии коррелируют с возникновением и/или прогрессированием заболевания. Ассоциированный с заболеванием ген также относится к гену, имеющему мутацию(и) или генетическую вариацию, которая непосредственно ответственна или находится в неравновесной взаимосвязи с геном (генами), который ответственен за этиологию заболевания. Продукты транскрипции или трансляции могут быть известны или неизвестны и могут быть на нормальном или аномальном уровне.

[00861] Полинуклеотид-мишень комплекса CRISPR может быть любым полинуклеотидом, эндогенным или экзогенным, в эукариотической клетке. Например, полинуклеотид-мишень может быть полинуклеотидом, находящимся в ядре эукариотической клетки. Полинуклеотид-мишень может представлять собой последовательность, кодирующую генный продукт (например, белок) или некодирующую последовательность (например, регуляторный полинуклеотид или мусорную ДНК). Не ограничиваясь теорией, считается, что последовательность-мишень должна быть связана с PAM (мотив, находящийся вблизи протоспесера); то есть короткой последовательностью, распознаваемой комплексом CRISPR. Точные требования к последовательности и длине для последовательности PAM различаются в зависимости от используемого фермента CRISPR, но последовательность PAM обычно находится в 2-5 парах оснований от протоспейсера (то есть последовательности-мишени). Примеры последовательностей PAM приведены в разделе примеров ниже, и квалифицированный специалист в данной области сможет идентифицировать дальнейшие последовательности PAM для использования с данным ферментом CRISPR.

[00862] Полинуклеотид-мишень комплекса CRISPR может включать ряд ассоциированных с заболеванием генов и полинуклеотидов, а также генов и полинуклеотидов, ассоциированных с сигнальными биохимическими путями, как указано в предварительных патентных заявках США 61/736527 и 61/748427, обе под названием "SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION", поданных 12 декабря 2012 года и 2 января 2013 года, соответственно, и заявке РСТ PCT/US2013/074667, озаглавленной "DELIVERY, ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION AND THERAPEUTIC APPLICATIONS", поданной 12 декабря 2013 года, содержание каждой из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[00863] Примеры полинуклеотидов-мишеней включают последовательность, ассоциированную с сигнальным биохимическим путем, например, ген или нуклеотид, ассоциированный с сигнальным биохимическим путем. Примеры полинуклеотидов-мишеней включают ассоциированный с заболеванием ген или полинуклеотид. Ген или полинуклеотид, "ассоциированный с заболеванием", относится к любому гену или полинуклеотиду, который дает продукты транскрипции или трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетках, полученных из тканей, пораженных заболеванием, по сравнению с контрольными тканями или клетками, не пораженными заболеванием. Это может быть ген, который экспрессируется на аномально высоком уровне; это может быть ген, который экспрессируется на аномально низком уровне, когда измененная экспрессия коррелирует с возникновением и/или прогрессированием заболевания. "Ассоциированный с заболеванием ген" также относится к гену, обладающему мутацией (мутациями) или генетической вариацией, которая непосредственно ответственна или находится в неравновесии по сцеплению с геном(ами), который отвечает за этиологию заболевания. Транскрибированные или транслированные продукты могут быть известны или неизвестны и могут быть на нормальном или ненормальном уровне.

Полногеномный скрининг посредством нокаута

[00864] Экспериментальные белковые комплексы CRISPR, описанные в настоящем описании, могут быть использованы для проведения эффективного и экономически эффективного функционального геномного скрининга. При таком скрининге можно использовать геномные библиотеки, основанные на эффекторном белке CRISPR. Такой скрининг и библиотеки могут обеспечить определение функций генов, клеточных путей, в которые вовлечены гены, и то, как какое-либо изменение экспрессии гена может привести к определенному биологическому процессу. Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что система CRISPR позволяет избежать нецелевого связывания и возникающих в результате неспецифических эффектов. Это достигается с использованием систем, организованных с высокой степенью специфичности последовательности к ДНК-мишени. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения комплексы эффекторных белков CRISPR представляют собой комплексы эффекторных белков C2c1 или C2c3.

[00865] В вариантах осуществления изобретения полногеномная библиотека может содержать множество направляющих РНК для C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, включая направляющие последовательности, которые способны нацеливать на множество последовательностей-мишеней во множестве геномных локусов в популяции эукариотических клеток. Популяция клеток может представлять собой популяцию эмбриональных стволовых (ES) клеток. Последовательность-мишень в геномном локусе может быть некодирующей последовательностью. Некодирующая последовательность может быть интронной, регуляторной последовательностью, сайтом сплайсинга, 3-'UTR, 5'-UTR или сигналом полиаденилирования. Функция одного или более генных продуктов может быть изменена путем нацеливания. Нацеливание может привести к нокауту функции гена. Нацеливание на генный продукт может включать более одной направляющей РНК. Нацеливание на генный продукт может быть осуществлено посредством 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 направляющих РНК, предпочтительно от 3 до 4 на ген. Нецелевые модификации могут быть сведены к минимуму за счет использования ступенчатых разрывов двойной цепи, образуемых эффекторными белковыми комплексами C2c1 или C2c3, или с использованием способов, аналогичных тем, которые используются в системах CRISPR-Cas9 (см., например, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TX, Marraffmi, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi: 10.1038/nbt.2647 (2013)), включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Нацеливание может охватывать приблизительно 100 или более последовательностей. Нацеливание может охватывать приблизительно 1000 или более последовательностей. Нацеливание может составлять приблизительно 20000 или более последовательностей. Нацеливание может охватывать весь геном. Нацеливание может охватывать ряд последовательностей-мишеней, ориентированных на соответствующий или желательный процесс. Процесс может быть иммунным процессом. Процесс может быть процессом клеточного деления.

[00866] Один из вариантов изобретения охватывает геномную библиотеку, которая может содержать множество направляющих РНК для C2c1 или C2c3, которые могут содержать направляющие последовательности, которые могут нацеливать на множество последовательностей-мишеней во множестве (геномных) локусов, приводя к нокауту функции гена. Эта библиотека может потенциально содержать направляющие РНК, которые нацелены на каждый ген в геноме организма.

[00867] В некоторых вариантах осуществления изобретения организм или индивид является эукариотическим организмом (включая млекопитающее, включая человека), или эукариотическим организмом, не являющимся человеком, или животным, не являющимся человеком, или млекопитающим, не являющимся человеком. В некоторых вариантах осуществления организм или индивид является животным, не являющимся человеком, и может быть членистоногим, например насекомым, или может быть нематодой. В некоторых способах изобретения организм или индивид является растением. В некоторых способах по изобретению организм или субъект представляет собой млекопитающее или млекопитающее, не являющееся человеком. Млекопитающее, не являющееся человеком, может быть, например, грызуном (предпочтительно мышью или крысой), копытным или приматом. В некоторых способах по изобретению организм или субъект является водорослью, включая микроводоросли, или грибом.

[00868] Нокаут функции гена может включать введение в каждую клетку в популяции клеток векторной системы из одного или более векторов, содержащих сконструированную, не встречающуюся в природе систему эффекторного белка C2c1 или C2c3, содержащую I. эффекторный белок C2c1 или C2c3, и II. одну или более направляющих РНК, где компоненты I и II могут находиться на одном или разных векторах системы, встраивающих компоненты I и II в каждую клетку, причем направляющая последовательность нацелена на уникальный ген в каждой клетке, где эффекторный белок C2c1 или C2c3 является функционально связанным с регуляторным элементом, где при транскрипции направляющая РНК, содержащая направляющую последовательность, обеспечивает последовательность-специфическое связывание системы эффекторного белка C2c1 или C2c3 с последовательностью-мишенью в геномных локусах уникального гена, вызывая расщепление геномных локусов эффекторным белком C2c1 или C2c3, и подтверждение различных случаев нокаута во множестве уникальных генов в каждой клетке популяции, тем самым, получая библиотеку клеток с нокаутом гена. Изобретение подразумевает, что популяция клеток представляет собой популяцию эукариотических клеток, и в предпочтительном варианте осуществления популяция клеток представляет собой популяцию эмбриональных стволовых клеток (ES).

[00869] Один или более векторов могут быть плазмидными векторами. Вектор может представлять собой один вектор, содержащий эффекторный белок C2c1 или C2c3, одноцепочечную направляющую РНК и необязательно селективный маркер для клеток-мишеней. Без связи с теорией, одновременная доставка эффекторного белка C2c1 или C2c3и одноцепочечной направляющей РНК с помощью одного вектора позволяет применять этот способ к любому типу клеток-мишеней без необходимости сначала получать клеточные линии, которые экспрессируют эффекторный белок C2c1 или C2c3. Регулирующим элементом может быть индуцибельный промотор. Индуцируемый промотор может быть промотором, индуцируемым доксициклином. В некоторых способах по изобретению экспрессия направляющей последовательности находится под контролем промотора Т7 и направляется экспрессией Т7-полимеразы. Подтверждение различных вызывающих нокаут мутаций может быть осуществлено полноэкзомным секвенированием. Вызывающая нокаут мутация может быть достигнута в 100 или более уникальных генах. Вызывающая нокаут мутация может быть достигнута в 1000 или более уникальных генах. Вызывающая нокаут мутация может быть достигнута в 20000 или более уникальных генов. Вызывающая нокаут мутация может быть достигнута и во всем геноме. Нокаут функции гена может быть достигнут во множестве уникальных генов, которые функционируют в определенном физиологическом процессе или состоянии. Процесс или состояние может быть иммунным процессом или состоянием. Процесс или состояние может быть процессом или состоянием деления клеток.

[00870] Изобретение также относится к наборам, включающим обширные библиотеки геномов, упомянутые в настоящем описании. Набор может содержать один контейнер, содержащий векторы или плазмиды, содержащие библиотеку по изобретению. Набор может также содержать панель, содержащую отобранный комплект уникальных направляющих РНК системы эффекторных белков C2c1 или C2c3, содержащих направляющие последовательности из библиотеки по изобретению, причем отобранный комплект соответствует конкретному физиологическому состоянию. В рамках изобретения подразумевается, что нацеливанию подвергается приблизительно 100 или более последовательностей, приблизительно 1000 или более последовательностей или приблизительно 20000 или более последовательностей или весь геном. Кроме того, панель последовательностей-мишеней может быть сфокусирована на соответствующем или желательном процессе, таком как иммунный процесс или деление клеток.

[00871] В дополнительном аспекте изобретения эффекторный белок C2c1 или C2c3 может содержать одну или более мутаций и может быть использован в качестве общего ДНК-связывающего белка с или без слияния с функциональным доменом. Мутации могут быть искусственно введенными мутациями или мутациями приобретения или потери функции. Мутации были охарактеризованы, как описано в настоящем описании. В одном аспекте изобретения функциональный домен может быть доменом активации транскрипции, который может быть VP64. В других аспектах изобретения функциональный домен может быть доменом подавления транскрипции, который может быть KRAB или SID4X. Другие аспекты изобретения относятся к мутантному эффекторному белку C2c1 или C2c3, слитому с доменами, которые включают, но не ограничиваются, ими: активатор транскрипции, репрессор, рекомбиназу, транспозазу, ремоделирующий гистон, деметилазу, ДНК-метилтрансферазу, криптохром, светоиндуцируемый/контролируемый домен или химически индуцируемый/контролируемый домен. Некоторые способы по изобретению могут включать индукцию экспрессии генов-мишеней. В одном варианте осуществления индукция экспрессии путем нацеливания на множество последовательностей-мишеней во множестве геномных локусов в популяции эукариотических клеток осуществляется с использованием функционального домена.

[00872] В практике настоящего изобретения, использующего комплексы эффекторного белка C2c1 или C2c3, могут использоваться способы, в которых используются системы CRISPR-Cas9, и может быть приведена ссылка на:

[00873] Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BE., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science Dec 12. (2013). Опубликовано в окончательной редакции как: Science. 2014 Jan 3; 343(6166): 84-87

[00874] В Shalem et al. описан новый способ исследования функции гена в масштабе всего генома. Их исследования показали, что доставка полногеномной библиотеки с нокаутом CRISPR-Cas9 (GeCKO), нацеленной на 18080 генов с 64751 уникальными направляющими последовательностями, позволила скрининг как с отрицательной, так и с положительной селекцией в клетках человека. Во-первых, авторы показали использование библиотеки GeCKO для идентификации генов, необходимых для жизнеспособности клеток в злокачественных и плюрипотентных стволовых клетках. Затем, с использованием модели меланомы, авторы провели скрининг генов, утрата которых связана с резистентностью к вемурафенибу, препарату, который ингибирует мутантную протеинкиназу BRAF. Их исследования показали, что кандидаты с самым высоким рейтингом включают ранее подтвержденные гены NF1 и MED 12, также как и новые высокие результаты: NF2, CUL3, TADA2B и TADA1. Авторы наблюдали высокий уровень согласованности между независимыми направляющими РНК, нацеленными на один и тот же ген, и высокий показатель подтверждения высоких результатов, и, таким образом, продемонстрировали перспективность скрининга генома с помощью Cas9.

[00875] См. также патент США №20140357530; и публикацию патентной заявки РСТ W02014093701, включенные в настоящее описание в качестве ссылки. Также см. пресс-релиз NIH от 22 октября 2015 года под названием "Researchers identify potential alternative to CRISPR-Cas genome editing tools: New Cas enzymes shed light on evolution of CRISPR-Cas systems", включенный в настоящее описание в качестве ссылки.

Функциональные изменения и скрининг

[00 876] В другом аспекте осуществления настоящее изобретение относится к способу функциональной оценки и скрининга генов. Использование системы CRISPR согласно настоящему изобретению для точной доставки функциональных доменов, для активации или подавления генов или для изменения эпигенетического состояния путем точного изменения сайта метилирования в конкретном локусе-мишени может быть выполнено с использованием одной или более направляющих РНК для одной клетки, или популяции клеток, или библиотеки, примененной к геному в совокупности клеток ex vivo или in vivo, включая введение или экспрессию библиотеки, содержащей множество направляющих молекул РНК (sg-РНК), и где скрининг дополнительно включает использование эффекторного белка C2c1 или C2c3, причем комплекс CRISPR, содержащий эффекторный белок C2c1 или C2c3, модифицирован таким образом, чтобы содержать гетерологичный функциональный домен. В одном аспекте изобретение обеспечивает способ скрининга генома, включающий введение хозяину или экспрессию в хозяине библиотеки in vivo. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, дополнительно включающему активатор, вводимый хозяину или экспрессируемый в хозяине. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор присоединен к эффекторному белку C2c1 или C2c3. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор присоединен к N-концу или C-концу эффекторного белка C2c1 или C2c3. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор присоединен к петле sg-РНК. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, дополнительно включающему репрессор, вводимый хозяину или экспрессируемый в хозяине. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, где скрининг включает изменение и обнаружение активации гена, ингибирования гена или расщепления в конкретном локусе.

[00877] В одном аспекте изобретение обеспечивает эффективную целевую активность и минимизирует нецелевую активность. В одном аспекте изобретение обеспечивает эффективное целевое расщепление эффекторным белком C2c1 или C2c3 и сводит к минимуму нецелевое расщепление эффекторным белком C2c1 или C2c3. В одном аспекте изобретение обеспечивает направляющее специфическое связывание эффекторного белка C2c1 или C2c3 в локусе гена без расщепления ДНК. Соответственно, в одном аспекте изобретение обеспечивает мишень-специфическую генную регуляцию. В одном аспекте изобретение обеспечивает направляющее специфическое связывание эффекторного белка C2c1 или C2c3 в локусе гена без расщепления ДНК. Соответственно, в одном варианте изобретение предусматривает расщепление в одном локусе гена и регуляцию гена в другом локусе гена с использованием одного эффекторного белка C2c1 или C2c3. В одном аспекте изобретение обеспечивает ортогональную активацию, и/или ингибирование, и/или расщепление множества мишеней с использованием одного или более эффекторных белков C2c1 или C2c3 и/или ферментов.

[00878] В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором клетка-хозяин является эукариотической клеткой. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором хозяин представляет собой эукариотический организм, отличный от человека. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором эукариотический организм, отличный от человека, является млекопитающим, отличным от человека. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, где млекопитающее, отличное от человека, представляет собой мышь. Одним аспектом изобретения является способ, описанный в настоящем описании, включающий доставку комплексов эффекторных белков C2c1 или C2c3 или их компонента(ов) или молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей их, где указанная молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана(ы) с регуляторной последовательностью(ми) и экспрессируется in vivo. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором экспрессия in vivo осуществляется с использованием лентивируса, аденовируса или AAV. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором доставка осуществляется через частицу, наночастицу, липид или проникающий в клетку пептид (CPP).

[00879] В одном аспекте изобретение относится к паре комплексов CRISPR, включающих эффекторный белок C2c1 или C2c3, каждый из которых содержит направляющую молекулу РНК (sg-РНК), содержащую направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени в клетке, где по меньшей мере одна петля каждой sg-РНК модифицирована вставкой отдельной последовательности(ей) РНК, которая связана с одним или более адаптерными белками, и где адаптерный белок связан с одним или более функциональными доменами, где каждая sg-РНК каждого комплекса эффекторного белка C2c1 или C2c3 включает функциональный домен, обладающий активностью расщепления ДНК. В одном аспекте изобретение относится к парным комплексам эффекторного белка C2с1 или C2c3, как описано в настоящем описании, где активность расщепления ДНК обусловлена нуклеазой Fok1.

[00880] В одном аспекте изобретение относится к способу разрезания последовательности-мишени в представляющем интерес геномном локусе, включающему доставку к клетке комплексов эффекторного белка C2c1 или C2c3, или его компонента или молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей их, причем молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной последовательностью (последовательностями) и экспрессируется in vivo. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором доставка производится с использованием лентивируса, аденовируса или AAV. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, или парному комплексу эффекторного белка C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, в котором последовательность-мишень для первого комплекса пары находится на первой цепи двухцепочечной ДНК и последовательность-мишень для второго комплекса пары находится на второй цепи двухцепочечной ДНК. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, или парному комплексу эффекторного белка C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, в котором последовательности-мишени первого и второго комплексов находятся вблизи друг друга, так что ДНК разрезается таким образом, чтобы облегчить направляемую гомологией репарацию. В одном аспекте способ настоящего изобретения может дополнительно включать введение в клетки матрицы ДНК. В одном аспекте описанный в настоящем описании способ или описанные в настоящем описании парные комплексы эффекторного белка C2c1 или C2c3 могут вовлекать случаи, где каждый комплекс эффекторного белка C2c2 имеет эффекторный фермент C2c1 или C2c3, в который внесена мутация таким образом, что он имеет не более чем приблизительно 5% активности нуклеазы эффекторного фермента C2c1 или C2c3, который не имеет мутации.

[00881] В одном аспекте изобретение относится к библиотеке, способу или комплексу, как описано в настоящем описании, в которых одноцепочечная направляющая sg-РНК модифицирована, чтобы иметь по меньшей мере одну некодирующую функциональную шпильку, например, где по меньшей мере одна некодирующая функциональная шпилька является репрессивнной; например, в которой, по меньшей мере одна некодирующая функциональная петля содержит Alu.

[00882] В одном аспекте изобретение относится к способу изменения или модификации экспрессии продукта гена. Указанный способ может включать введение в клетку, содержащую и экспрессирующую молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, сконструированной, не встречающейся в природе системы CRISPR, содержащей эффекторный белок C2c1 или C2c3 и направляющую РНК, которая нацелена на молекулу ДНК, в результате чего направляющая РНК осуществляет нацеливание на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, и эффекторный белок C2c1 или C2c3 расщепляет молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, в результате чего экспрессия продукта гена изменяется, и где эффекторный белок C2c1 или C2c3 и направляющая РНК не встречаются вместе в естественных условиях. Изобретение охватывает направляющую РНК, содержащую направляющую последовательность, связанную с последовательностью прямого повтора. Кроме того, изобретение подразумевает, что эффекторный белок C2c1 или C2c3 является кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, а в более предпочтительном варианте осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку человека. В дальнейшем варианте осуществления изобретения экспрессия продукта гена уменьшается.

[00883] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов связаны с эффекторным белком C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов связаны с адаптерным белком, например, с использованием модифицированных направляющих молекул Konnerman et al. (Nature 517, 583-588, 29 января 2015 года). В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов связаны с "мертвой" одноцепочечной направляющей (sg-РНК, d-РНК). В некоторых вариантах осуществления комплекс d-РНК с активным эффекторным белком C2c1 или C2c3 обеспечивает регуляцию гена посредством функционального домена в локусе гена, тогда как sg-РНК обеспечивает расщепление ДНК активным эффекторным белком C2c1 или C2c3 в другом локусе, например, как описано аналогично для систем CRISPR-Cas9 в Dahlman et al., "Orthogonal gene control with a catalytically active Cas9 nuclease" (в печати). В некоторых вариантах осуществления d-РНК выбирают так, чтобы максимизировать селективность регуляции представляющего интерес локуса гена по сравнению с неспецифической регуляцией. В некоторых вариантах осуществления d-РНК выбирают так, чтобы максимизировать регулирование гена-мишени и минимизировать расщепление мишени.

[00884] Для целей последующего обсуждения "функциональный домен" может представлять собой функциональный домен, связанный с эффекторным белком C2c1 или C2c3, или функциональный домен, связанный с адаптерным белком.

[00885] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов представляют собой NLS (последовательность ядерной локализации) или NES (ядерный экспортный сигнал). В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов являются доменом активации транскрипции, включающим VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9 и гистонацетилтрансферу. Другие случаи упоминания в настоящем описании доменов активации (или доменов-активаторов) в отношении доменов, которые связаны с ферментом CRISPR, включают любой известный домен активации транскрипции и, в частности, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9 или гистонацетилтрансферазу.

[00886] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов являются доменами подавления транскрипции. В некоторых вариантах осуществления доменами подавления транскрипции является KRAB-домен. В некоторых вариантах осуществления домен подавления транскрипции является доменом NuE, доменом NcoR, доменом SID или доменом SID4X.

[00887] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов имеют одну или более функциональных активностей, включающих метилазную активность, деметилазную активность, активность активации транскрипции, активность подавления транскрипции, активность фактора терминации транскрипции, активность модификации гистонов, активность расщепления РНК, активность расщепления ДНК, активность интеграции ДНК или активность связывания нуклеиновых кислот.

[00888] Домены модификации гистонов также предпочтительны в некоторых вариантах осуществления. Типичные домены модификации гистонов обсуждаются ниже. В качестве функциональных доменов в рамках настоящего изобретения также предпочтительными являются домены транспозазы, домены HR (гомологичной рекомбинации), домены рекомбиназы и/или интегразы. В некоторых вариантах осуществления активность интеграции ДНК включает домены HR, домены интегразы, домены рекомбиназы и/или домены транспозазы. В некоторых вариантах предпочтительны домены гистонацетилтрансферазы.

[00889] В некоторых вариантах осуществления активность расщепления ДНК обусловлена нуклеазой. В некоторых вариантах осуществления нуклеаза содержит нуклеазу Fok1. См. "Dimeric CRISPR RNA-guided Fok1 nucleases for highly specific genome editing", Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014), которая относится к димерным Fok1-нуклеазам, направляемым РНК, которые распознают расширенные последовательности и могут редактировать эндогенные гены с высокой эффективностью в клетках человека.

[00890] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов присоединены к эффекторному белку C2c1 или C2c3, так что при связывании с одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК) и мишенью функциональный домен находится в пространственной ориентации, позволяющей функциональному домену выполнять свойственную ему функцию.

[00891] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов присоединены к адаптерному белку, так что после связывания эффекторного белка C2c1 или C2c3 с одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК) и мишенью функциональный домен находится в пространственной ориентации, позволяющей функциональному домену выполнять свойственную ему функцию.

[00892] В одном аспекте изобретение относится к композиции, описанной в настоящем описании, в которой один или более функциональных доменов присоединены к эффекторному белку C2c1 или C2c3 или адаптерному белку посредством линкера, необязательно линкера GlySer, как описано в настоящем описании.

[00893] Эндогенное подавление транскрипции часто опосредуется ферментами, модифицирующими хроматин, такими как гистон-метилтрансферазы (ГМТ) и деацетилазы (HDAC). Репрессивные эффекторные домены гистонов известны, и их иллюстративный список приведен ниже. В таблице предпочтение отдавалось белкам и функциональным укороченным частям небольшого размера для облегчения эффективной упаковки вирусов (например, посредством AAV). В общем, однако, домены могут включать домены деацетилазы (HDAC), гистон-метилтрансферазы (HMT) и ингибиторы гистонацетилтрансферазы (HAT), а также белки, рекрутирующие HDAC и HMT. Функциональный домен может быть или включать в некоторых вариантах осуществления эффекторные домены HDAC, рекрутирующие эффекторные домены HDAC, эффекторные домены гистонацетилтрансферазы (HMT), рекрутирующие эффекторные домены гистон-метилтрансферазы (HMT), рекрутирующие эффекторные домены гистонацетилтрансферазы.

Эффекторные домены HDAC

[894] Соответственно, репрессорные домены по настоящему изобретению могут быть выбраны из гистон-метилтрансферазы (ГМТ), гистондезацетилаз (HDAC), ингибиторов гистонацетилтрансферазы (HAT), а также привлекающих HDAC и HMT белков.

[00895] Домен HDAC может быть любым из приведенных в таблице выше: HDAC8, RPD3, MesoLo4, HDAC11, HDT1, SIRT3, HST2, CobB, HST2, SIRT5, Sir2A или SIRT6.

[00896] В некотором варианте осуществления функциональный домен может быть рекрутирующим эффекторным доменом HDCP. Предпочтительные примеры включают те, которые приведены в таблице ниже, а именно MeCP2, MBD2b, Sin3a, NcoR, SALL1, RCOR1. NcoR проиллюстрирован в примерах настоящего описания и, хотя использование этого белка предпочтительно, предполагается, что другие представители класса также будут полезны.

Таблица HDAC рекрутирующие эффекторные домены

[897] В некотором варианте осуществления функциональный домен может быть эффекторным доменом метилтрансферазы (HMT). Предпочтительные примеры включают те, которые приведены в таблице ниже, а именно NUE, vSET, EHMT2/G9A, SUV39H1, dim-5, KYP, SUVR4, SET4, SET1, SETD8 и TgSET8. NUE проиллюстрированы в примерах настоящего описания и, хотя использование этого белка предпочтительно, предполагается, что другие представители класса также будут полезны.

Таблица эффекторных доменов гистонметилтрансферазы (HMT)

[898] В некоторых вариантах осуществления функциональный домен может представлять собой рекрутирующий эффекторный домен гистон-метилтрансферазы (HMT). Предпочтительные примеры включают примеры, приведенные в таблице ниже, а именно Hp1a, PHF19 и NIPP1.

[899] Таблица эффективности рекрутирующих эффекторных доменов гистонметилтрансферазы (HMT).

[900] В некоторых вариантах осуществления функциональный домен может быть ингибиторным эффекторным доменом гистонацетилтрансферазы. Предпочтительные примеры включают SET/TAF-1β, перечисленные в таблице ниже.

[901] Таблица ингибиторных эффекторных доменов гистонацетилтрансферазы.

[902] Также является предпочтительным нацеливание на эндогенные (регуляторные) элементы контроля (такие как энхансеры и сайленсеры), дополнительно к промотору или элементам, расположенным проксимально относительно промотора. Таким образом, изобретение может также использоваться для нацеливания на эндогенные элементы контроля (включая энхансеры и сайленсеры) в дополнение к нацеливанию на промотор. Эти элементы контроля могут быть расположены в восходящем- и нисходящем-направлении от точки начала транскрипции (TSS), начиная с 200 п.н. от TSS до 100 т.п.н от нее. Нацеливание на известные элементы контроля может быть использовано для активации или подавления гена-мишени. В некоторых случаях один элемент управления может влиять на транскрипцию нескольких генов-мишеней. Таким образом, нацеливания на один элемент контроля может использоваться для управления транскрипцией нескольких генов одновременно.

[00903] Нацеливание на предполагаемые элементы контроля с другой стороны, (например, путем охвата области предполагаемого элемента контроля, а также от 200 п.н. до 100 т.п.н. вокруг элемента) может использоваться как средство подтверждения таких элементов (путем измерения транскрипции представляющего интерес гена) или для обнаружения новых элементов контроля (например, путем охвата области, находящейся на расстоянии 100 т.п.н. в восходящем и нисходящем направлении от TSS представляющего интерес гена). Кроме того, нацеливание на предполагаемые элементы контроля может быть полезно в контексте понимания генетических причин заболевания. Многие мутации и распространенные SNP-варианты, связанные с фенотипами заболевания, расположены за пределами кодирующих областей. После нацеливания на такие области с помощью систем активации или подавления, описанных в настоящем описании, можно провести определение данных транскрипции для либо a) набора предполагаемых мишеней (например, набора генов, расположенных в непосредственной близости от элемента контроля), либо b) для всего транскриптома, например, с помощью секвенирования РНК или микрочипа. Это позволило бы идентифицировать вероятные гены-кандидаты, вовлеченные в фенотип болезни. Такие гены-кандидаты могут быть полезны в качестве новых мишеней лекарственных препаратов.

[00904] В настоящем описании упоминаются ингибиторы гистонацетилтрансферазы (HAT). Однако в некоторых вариантах осуществления альтернатива заключается в том, что один или более функциональных доменов содержат ацетилтрансферазу, предпочтительно гистонацетилтрансферазу. Они полезны в области эпигеномики, например, в способах исследования эпигенома. Способы исследования эпигенома могут включать, например, нацеливание на эпигеномные последовательности. Нацеливание на эпигемомные последовательностей может включать направляющую молекулу, направленную на эпигеномную последовательность-мишень. В некоторых вариантах осуществления эпигеномная последовательность-мишень может включать последовательность промотора, сайленсера или энхансера.

[00905] Использование функционального домена, связанного с эффекторным белком C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, предпочтительно мертвым эффекторным белком C2c1 или C2c3, более предпочтительно мертвым эффекторным белком AacC2c1 или C2c3, для нацеливания на эпигеномные последовательности возможно для активации или подавления промоторов, сайленсеров или энхансеров.

[00906] Примеры ацетилтрансфераз известны, но могут включать, в некоторых вариантах осуществления, гистонацетилтрансферазы. В некоторых вариантах осуществления гистонацетилтрансфераза может содержать каталитическое ядро ацетилтрансферазы р300 человека (Gerbasch & Reddy, Nature Biotech, 6th April 2015).

[00907] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления функциональный домен связан с мертвым эффекторным белком C2c1 или C2c3 для нацеливания на и активации эпигеномных последовательностей, таких как промоторы или энхансеры. Одна или более направляющих молекул, нацеленных на такие промоторы или энхансеры, также могут быть предоставлены для управления связыванием фермента CRISPR с такими промоторами или энхансерами.

[00908] Термин "ассоциированный с" используется в настоящем описании в отношении ассоциации функционального домена с эффекторным белком C2c1 или C2c3 или адаптерным белком. Он используется в отношении того, как одна молекула "ассоциирует" (связывается) с другой, например, между адаптерным белком и функциональным доменом, или между эффекторным белком C2c1 или C2c3 и функциональным доменом. В случае таких белок-белковых взаимодействий эту ассоциацию можно рассматривать с точки зрения распознавания, подобно тому, как антитело распознает эпитоп. Альтернативно, один белок может быть связан с другим белком посредством слияния двух субъединиц, например, одна субъединица является слитой с другой субъединицей. Слияние обычно происходит путем добавления одной аминокислотной последовательности к другой, например, путем совместного сплайсинга нуклеотидных последовательностей, которые кодируют каждый белок или субъединицу. Альтернативно, это может по существу рассматриваться как связывание двух молекул или прямое образование связи, такое как слитый белок. В любом случае слитый белок может включать линкер между представляющими интерес субъединицами (то есть между ферментом и функциональным доменом или между адаптерным белком и функциональным доменом). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эффекторный белок C2c1 или C2c3 или адаптерный белок ассоциирован с функциональным доменом путем связывания с ним. В других вариантах осуществления эффекторный белок C2c1 или C2c3 или адаптерный белок ассоциирован с функциональным доменом, потому что оба слиты вместе, необязательно посредством промежуточного линкера.

[00909] Присоединение функционального домена или слитого белка может производиться посредством линкера, например, гибкого глицин-серинового (GlyGlyGlySer) или (GGGS)₃, либо жесткого альфа-спирального линкера, в частности, (Ala(GluAlaAlaAlaLys)Ala). Предпочтительно для разделения доменов белка или пептида в рамках настоящего изобретения используются линкеры, подобные (GGGGS)₃. (GGGGS)₃ является предпочтительным поскольку он является сравнительно длинным линкером (15 аминокислот). Остатки глицина являются наиболее гибкими, остатки серина усиливают вероятность пребывания линкера снаружи белка. В качестве предпочтительных альтернатив могут использоваться (GGGGS)₆ (GGGGS) или (GGGGS)₁₂. Другими предпочтительными вариантами являются (GGGGS)₁, (GGGGS)₂, (GGGGS)₄, (GGGGS)₅, (GGGGS)₇, (GGGGS)₈, (GGGGS)₁₀ или (GGGGS)_n. Альтернативные линкеры также доступны, однако линкеры с высокой гибкостью считаются функционирующими наилучшим образом для обеспечения возможности для 2 частей C2c1 или C2c3 сблизиться и, таким образом, восстановить активность C2c1 или C2c3. Альтернативным является, в частности, использование NLS в качестве линкера. Например, линкер может также быть находиться между C2c1 и любым функциональным доменом или между C2c3 и любым функциональным доменом. Вновь, линкер (GGGGS)₃ (или его разновидности, содержащие 6, 9 или 12 повторов) или NLS нуклеоплазмина могут быть использованы здесь в качестве линкера между C2c1 и функциональным доменом или между C2c3 и функциональным доменом.

Насыщающий мутагенез

[00910] Система(ы) эффекторного белка C2c1 или C2c3, описанная в настоящем описании, может быть использована для выполнения насыщающего или глубоко сканирующего мутагенеза геномных локусов в сочетании с клеточным фенотипом, например, для определения критических минимальных признаков и дискретных уязвимостей функциональных элементов, необходимых для экспрессии генов, лекарственной устойчивости и купирования заболевания. Под "насыщающим" или "глубоко сканирующим мутагенезом" подразумевается, что каждое или по существу каждое основание ДНК разрезается внутри геномных локусов. В популяцию клеток можно ввести библиотеку направляющих РНК эффекторных белков C2c1 или C2c3. Библиотека может быть введена таким образом, что каждая клетка получает одну направляющую молекулу РНК (sg-РНК). В случае, когда библиотека вводится путем трансдукции вирусного вектора, как описано в настоящем описании, используется низкая множественность инфекции. Библиотека может включать sg-РНК, нацеленные на каждую последовательность в восходящем направлении от последовательности, прилегающей к протоспейсеру (PAM) в геномном локусе. Библиотека может включать по меньшей мере 100 непересекающихся геномных последовательностей в восходящем направлении от PAM для каждых 1000 пар оснований в геномном локусе. Библиотека может включать sg-РНК, нацеливающие на последовательности в восходящем направлении по меньшей мере от одной отличающейся PAM. Системы эффекторного белка C2c1 или C2c3 могут включать более одного белка C2c1 или C2c3. Можно использовать любой эффекторный белок C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, включая ортологи или сконструированные эффекторные белки C2c1 или C2c3, которые распознают различные последовательности PAM. Частота не являющихся мишенями сайтов для sg-РНК может составлять менее 500. Оценка нецелевого связывания sg-РНК необходима для отбора sg-РНК с наименьшим уровнем возможного связывания с не являющимися мишенями участками. Любой фенотип, который, как установлено, связан с разрезанием участке-мишени sg-РНК, может быть подтвержден с использованием sg-РНК, нацеленных на один и тот же сайт в одном эксперименте. Валидация участка-мишени также может быть выполнена с использованием модифицированного эффекторного белка C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, и двух sg-РНК, нацеливающих на участок-мишень в геноме. Без связи с теорией, можно утверждать, что участок-мишень действительно установлен, если изменение фенотипа наблюдается в экспериментах по проверке достоверности.

[00911] Геномные локусы могут включать по меньшей мере одну непрерывную геномную область. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может включать и весь геном. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать функциональный элемент генома. Функциональный элемент может находиться в некодирующей области, кодирующем гене, интронной области, промоторе или энхансере. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать по меньшей мере 1 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере 50 т.п.н. геномной ДНК. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать сайт связывания фактора транскрипции. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать область, гиперчувствительную к расщеплению ДНК-азой I. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать усиливающий транскрипцию энхансер или подавляющий транскрипцию репрессорный элемент. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать сайт, обогащенный эпигенетической сигнатурой. По меньшей мере одна непрерывная область геномной ДНК может содержать эпигенетический инсулятор. По меньшей мере, одна непрерывная геномная область может содержать две или более непрерывных геномных областей, которые физически взаимодействуют. Геномные области, которые взаимодействуют, могут определяться "технологией 4C". 4C-технология позволяет провести скрининг всего генома непредвзятым образом для сегментов ДНК, которые физически взаимодействуют с выбранным фрагментом ДНК, как описано в Zhao et al. ((2006) Nat Genet 38, 1341-7) и в патенте США 8642295, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Эпигенетическая сигнатура может представлять собой ацетилирование, метилирование, убиквитинилирование, фосфорилирование гистонов, метилирование ДНК или отсутствие всего вышеперечисленного.

[00912] Система(ы) эффекторного белка C2c1 или C2c3 для насыщающего или глубоко сканирующего мутагенеза может быть использована в популяции клеток. Система эффекторного белка C2c1 или C2c3 может использоваться в эукариотических клетках, включая, но не ограничиваясь ими, клетки млекопитающих и растений. Популяция клеток может состоять из прокариотических клеток. Популяция эукариотических клеток может быть популяцией эмбриональных стволовых (ES) клеток, нейронов, эпителиальных клеток, иммунных клеток, эндокринных клеток, мышечных клеток, эритроцитов, лимфоцитов, растительных клеток или дрожжевых клеток.

[00913] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга функциональных элементов, связанных с изменением фенотипа. Библиотека может быть введена в популяцию клеток, которые адаптированы для содержания эффекторного белка C2c1 или C2c3. Клетки могут быть рассортированы по меньшей мере на две основные группы на основе фенотипа. Фенотип может включать экспрессию гена, рост или жизнеспособность клеток. Может быть определена относительная представленность направляющих РНК, присутствующих в каждой группе, причем геномные сайты, связанные с изменением фенотипа, определяются по представленности направляющих РНК, присутствующих в каждой группе. Изменение фенотипа может быть изменением экспрессии гена-мишени. Экспрессия гена-мишени может быть повышена, понижена, или полностью выключена (нокаут гена). Клетки могут быть отсортированы в группы с высокой и низкой экспрессией. Популяция клеток может включать репортерную конструкцию, которая определяет фенотип. Конструкция репортера может включать поддающийся обнаружению маркер. Клетки могут быть отсортированы с помощью поддающегося обнаружению маркера.

[00914] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга геномных сайтов, связанных с устойчивостью к химическому соединению. Химическое соединение может быть лекарственным средством или пестицидом. Библиотека может быть введена в популяцию клеток, адаптированных к содержанию эффекторного белка C2c1 или C2c3, где каждая клетка популяции содержит не более одной направляющей РНК; популяцию клеток обрабатывают химическим соединением; и представленность направляющих РНК определяют после обработки химическим соединением в более поздний момент времени по сравнению с ранним моментом времени, при котором геномные участки, связанные с устойчивостью к химическому соединению, определяются по обогащению направляющими РНК. Представленность sg-РНК может быть определена способами глубокого секвенирования.

[00915] Полезными в практике настоящего изобретения с использованием комплексов эффекторных белков C2c1 или C2c3 являются способы, в которых используются системы CRISPR-Cas9, и может быть приведена ссылка на статью под названием "BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis". Canver, M.C., Smith,E.C., Sher, F., Pinello, L., Sanjana, N.E., Shalem, O., Chen, D.D., Schupp, P.G., Vinjamur, D.S., Garcia, S.P., Luc, S., Kurita, R., Nakamura, Y., Fujiwara, Y., Maeda, T., Yuan, G., Zhang, F., Grkin, S.H., & Bauer, D.E. DOI:10.1038/naturel552I, published online September 16, 2015, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки и кратно обсуждается ниже.

[00916] Canver et al. использует новые объединенные библиотеки направляющих cr-РНК-Cas9, чтобы выполнять насыщающий мутагенез in situ человеческих и мышиных эритроидных энхансеров BCL11A, ранее идентифицированных как энхансер, ассоциированный с уровнем фетального гемоглобина (HbF), и мышиный ортолог которого необходим для экспрессии эритроида BCL11A. Этот подход выявил критические минимальные признаки и дискретную уязвимость этих энхансеров. Благодаря редактированию первичных человеческих предшественников и трансгенеза мышей, авторы подтвердили, что эритроидный энхансер BCL11A может быть использован в качестве мишени для реиндукции HbF. Авторы создали подробную карту энхансера, которая может быть использована при терапевтическом редактировании генома.

Способы использования систем C2c1 или C2c3 для модификации клетки или организма

[00917] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу модификации клетки или организма. Клетка может быть прокариотической или эукариотической. Клетка может быть клеткой млекопитающего. Клетка может быть не принадлежащей человеку клеткой млекопитающего, клеткой примата, коровы, свиньи, грызуна или мыши. Клетка может быть эукариотической клеткой не млекопитающего, такой как клетка домашней птицы, рыбы или креветки. Клетка также может быть растительной клеткой. Растительная клетка может быть клеткой зерновой культуры, такой как маниока, кукуруза, сорго, пшеница или рис. Растительная клетка может быть клеткой водоросли, дерева или овоща. Модификация, введенная в клетку согласно настоящему изобретению, может быть такой, что клетка и потомки клетки изменяются для улучшения производства биологических продуктов, таких как антитела, крахмал, спирт или другой желаемый клеточной продукции. Модификация, введенная в клетку согласно настоящему изобретению, может быть такой, что клетка и ее потомки включают изменение, которое изменяет продуцируемый ими биологический продукт.

[00918] Описываемая система может содержать один или более различных векторов. В одном аспекте изобретения эффекторный белок является кодон-оптимизированным для экспрессии в желаемом типе клеток, предпочтительно эукариотических клеток, предпочтительно клеток млекопитающего или клеток человека.

[00919] Упаковочные клетки обычно используются для получения вирусных частиц, которые способны инфицировать клетку-хозяина. Такие клетки включают клетки 293, которые упаковывают аденовирусы и клетки ψ2 или клетки РА317, которые упаковывают ретровирусы. Вирусные векторы, используемые в генной терапии, обычно получают путем создания клеточной линии, которая производит упаковку векторов нуклеиновой кислоты в вирусные частицы. Векторы обычно содержат минимальные вирусные последовательности, необходимые для упаковки и последующей интеграции в клетку-хозяина, при этом другие вирусные последовательности заменяются кассетой экспрессии для полинуклеотида(ов), подлежащего(их) экспрессии. Отсутствующие функции вируса обычно поставляются в процессе доставки упаковочными клетками линии. Например, векторы AAV, используемые в генной терапии, обычно имеют только последовательности ITR из генома AAV, которые необходимы для упаковки и интеграции в геном хозяина. Вирусная ДНК упаковывается с помощью клеточной линии, которая содержит вспомогательную плазмиду, кодирующую другие гены AAV, а именно rep и cap, но не содержащую последовательность ITR. Линия клеток также может быть инфицирована аденовирусом в качестве вспомогательной частицы. Вспомогательный вирус способствует репликации вектора AAV и экспрессии генов AAV из вспомогательной плазмиды. Вспомогательная плазмида не может быть упакована в больших количествах из-за отсутствия последовательности ITR. Контаминация аденовирусом может быть уменьшена, например, с помощью термообработки, к которой аденовирус более чувствителен, чем AAV. Квалифицированным специалистам в данной области известны дополнительные способы доставки нуклеиновых кислот в клетки. См., например, US20030087817, включенную в настоящее описание в качестве ссылки.

Доставка

[00920] Изобретение охватывает по меньшей мере один компонент комплекса CRISPR, например РНК, доставляемый посредством по меньшей мере одного комплекса наночастиц. В некоторых аспектах изобретение относится к способам, включающим доставку одного или более полинуклеотидов, в частности, одного или более векторов, как описано в настоящем описании, одного или более их транскриптов и/или одного или более белков, транскрибированных с них, в клетку-хозяина. В некоторых аспектах изобретение также относится к клеткам, полученным с помощью таких способов, и животным, содержащим указанные клетки или полученные из указанных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR в сочетании (необязательно в составе комплекса) с направляющей последовательностью доставляется в клетку. Традиционные способы переноса генов, как основанные, так и не основанные на использовании вирусов, могут использоваться для введения нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих или ткани-мишени. Такие способы могут быть использованы для введения нуклеиновых кислот, кодирующих компоненты системы CRISPR, в клетки в культуре или организме хозяина. Отличные от вирусных системы доставки включают ДНК-плазмиды, РНК (например, транскрипт описываемого в настоящей спецификации вектора), "голую" нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту в комплексе со средством доставки, таким как липосома. Системы доставки на основе вирусных векторов включают ДНК- или РНК-вирусы, которые имеют эписомальные или интегрированные геномы после доставки в клетку. Обзор методик генной терапии см. в Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 1.1:21.1-217 (1993); Mitam & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorati ve Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); и Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

[00921] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включают липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, генные пушки, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, поликатионы или конъюгаты липидов с нуклеиновыми кислотами, "голую" ДНК, искусственные вирионы и усиленное агентом поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патентах США № 5049386, 4946787; и 4897355), и липофекционные реагенты продаются на коммерческой основе (например, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, которые пригодны для эффективного распознавания рецепторов липофекции полинуклеотидов, включают таковые Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. Доставка может осуществляться в клетки (например, in vitro или ex vivo) или ткани-мишени (например, in vivo).

[00922] Получение комплексов липидов с нуклеиновыми кислотами, включая нацеленные липосомы, такие как иммунолипидные комплексы, хорошо известно специалисту в данной области (см., например, Crystal, Science 270: 404-410 (1995), Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995), Behr et at., Bioconjugate Chem., 5: 382-389 (1994), Remy et al., Bioconjugate Chem., 5: 647-654 (1994), Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995), Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992), патенты США №№ 4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 и 4946787).

[00923] В применении РНК или ДНК-вирусных систем для доставки нуклеиновых кислот используются современные способы нацеливания вируса на конкретные клетки в организме и передачи вирусного груза в ядро. Вирусные векторы могут вводиться непосредственно пациентам (in vivo) или их можно использовать для обработки клеток in vitro, а модифицированные клетки могут быть введены пациентам (ex vivo). Обычные вирусные системы могут включать ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные и вирусные вирусы простого герпеса для переноса генов. Встраивание в геном хозяина возможно с помощью способов переноса генов ретровирусов, лентивирусов и аденоассоциированных вирусов, часто приводящих к длительной экспрессии введенного трансгена. Кроме того, высокая эффективность трансдукции наблюдалась во многих других типах клеток- и тканей-мишеней.

[00924] Тропизм ретровируса может быть изменен путем включения чужеродных белков оболочки, что позволяет расширить потенциальную популяцию клеток-мишеней. Лентивирусные векторы представляют собой ретровирусные векторы, которые способны трансформировать или инфицировать не делящиеся клетки и, как правило, имеют высокие вирусные титры. Поэтому выбор ретровирусной системы переноса генов будет зависеть от ткани-мишени. Ретровирусные векторы состоят из цис-действующих длинных концевых повторов с упаковочной емкостью до 6-10 т.п.н. чужеродной последовательности. Минимальные цис-действующие LTR достаточны для репликации и упаковки векторов, которые затем используются для интеграции терапевтического гена в клетку-мишень для обеспечения постоянной трансгенной экспрессии. Широко используемые ретровирусные векторы включают векторы, основанные на вирусе лейкемии мышей (MuLV), вирусе лейкемии гиббонов (GaLV), вирусе иммунодефицита обезьян (SIV), вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ) и их комбинациях (см., например, Buchscher et al., J. Virol, 66: 2731-2739 (1992), Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640 (1992), Sommnerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990), Wilson et al., J. Virol, 63: 2374-2378 (1989), Miller et al., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991), PCT/US94/05700).

[00925] В другом варианте осуществления предусматриваются псевдотипированные оболочкой везикуловируса Cocal ретровирусные векторные частицы (см., например, публикацию патента США № 20120164118, зарегистрированную Fred Hutchinson Cancer Research Center). Вирус Cocal принадлежит к роду Vesiculovirus и является возбудителем везикулярного стоматита у млекопитающих. Исходно вирус Cocal был выделен из клещей в Тринидаде, Honkers et al. Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964)), и случаи инфекции были установлены в Тринидаде, Бразилии и Аргентине у насекомых, крупного рогатого скота и лошадей. Многие везикуловирусы, заражающие млекопитающих, были выделены из зараженных естественным образом членистоногих, что предполагает их трансмиссивность. Антитела к везикуловирусам распространены у людей, живущих в промышленных регионах, где данные вирусы эндемичны и получены в лабораториях; заражение людей обычно приводит к симптомам, сходных с гриппом. Гликопротеин оболочки вируса Cocal на аминокислотном уровне имеет 71,5% идентичности с VSV-G Indiana, и филогенетическое сравнение гена оболочки везикуловирусов демонстрирует, что вирус Cocal является серологически отличным от штаммов VSV-G Indiana, но имеет наибольшее родство с ним (Jonkers et al. Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964) and Travassos da Rosa et al. Am. J. Tropical Med. & Hygiene 33:999-1006 (1984)). Псевдотипированные оболочкой везикуловируса Cocal ретровирусные векторные частицы могут включать, например, лентивирусные, альфаретровирусные, бетаретровирусные, гаммаретровирусные и эпсилон ретровирусные векторные частицы, которые могут содержать ретровирусные Gag, Pol и/или один или более вспомогательный/ых белок/белков, а также белок оболочки везикуловируса Cocal. В некоторых аспектах изобретения Gag, Pol и вспомогательные белки являются лентивирусными и/или гаммаретровирусными. Изобретение охватывает AVV, содержащие или состоящие по большей части из молекул экзогенных нуклеиновых кислот, кодирующих систему CRISPR, например, многообразие кассет, включающее или состоящее из первой кассеты, включающей или по существу состоящей из промотора, нуклеиновой кислоты, молекулы, кодирующей ассоциированный с CRISPR (Cas) белок (предполагаемые белки-нуклеазы или хеликазы), например, C2c1 или C2c3 и терминатор, и 2 или более, предпочтительно до предела объема емкости упаковки, например, в общей сложности пять (включая первую кассету) кассет, содержащих или по существу состоящих из промотора, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей направляющую РНК (гРНК) и терминатор (например, каждая кассета может быть схематически представлена как промотор-гРНК1-терминатор, промотор-гРНК2-терминатор … промотор-гРНК(N)-терминатор (где N - количество, которое может быть вставлено, представляет собой верхний предел упаковки вектора), или два или более отдельных rAAV, каждый из которых содержит одну или более кассет системы CRISPR, например, первый rAAV, содержащий первую кассету, включающую или по существу состоящую из промотора, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Cas, например, Cas (C2c1 или C2c3) и терминатор, и второй rAAV, содержащий многообразие из четырех кассет, содержащих или по существу состоящих из промотора, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей направляющую РНК (гРНК) и терминатор (например, каждая кассета может быть схематически представлена как промотор-gРНК1-терминатор, промотор-gРНК2-терминатор … промотор-gРНК(N)-терминатор (где N - количество, которое может быть вставлено, представляет собой верхний предел упаковки вектора). Поскольку rAAV является ДНК-содержащим вирусом, молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем описании в отношении AAV или rAAV предпочтительно представляет собой ДНК. В некоторых модификациях промотор предпочтительно является промотором cинапсина I (hSyn). Дополнительные способы доставки нуклеиновых кислот в клетку известны специалисту в данной области. См., например, US20030087817, включенный в настоящее описание в качестве ссылки.

[00926] В некоторых вариантах осуществления клетку-хозяина временно или постоянно трансфицируют одним или более векторами, описанными в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления клетку трансфицируют в том виде, в каком она присутствует у индивидуума естественным образом. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетку, которую трансфицируют, извлекают из субъекта, такого как клеточная линия. В данной области известно большое разнообразие клеточных линий для тканевой культуры. Примеры клеточных линий включают, но не ограничиваются ими: C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bc1-1, ВС-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, эпителий почки обезьяны BS-C-1, фибробласты эмбрионов мыши BALB/3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 фетальные фибробласты человека, фибробласты мыши 10.1, 293-Т, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, ВхРСЗ, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY клетки, клетки K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R. MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN /OPCT клеточные линии, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, клетки Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1, U373, U87, U937, VCaP, клетки Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR и их трансгенные разновидности. Клеточные линии доступны из множества источников, известных квалифицированным специалистам в данной области (см., например, Американскую коллекцию типовых культур (ATCC) (Manassus, Va.)). В некоторых вариантах осуществления клетка, трансфицированная одним или более векторами, описанными в настоящем описании, используется для получения новой клеточной линии, содержащей одну или более последовательностей, полученных из вектора. В некоторых вариантах осуществления клетка, временная трансфицированная компонентами системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем описании (например, путем временной трансфекции одного или более векторов или трансфекции РНК) и модифицированная посредством активности комплекса нацеливания на нуклеиновую кислоту, используется для создания новой клеточной линии, содержащей клетки, имеющие модификацию, но не имеющие какой-либо другой экзогенной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, временно или постоянно трансфицированные одним или более векторами, описанными в настоящем описании, или клеточные линии, полученные из таких клеток, используются для оценки одного или более тестируемых соединений.

[00927] В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более векторов, описанных в настоящем описании, используются для получения трансгенного животного, отличного от человека, или трансгенного растения. В некоторых вариантах осуществления трансгенное животное представляет собой млекопитающее, такое как мышь, крыса или кролик. В некоторых вариантах осуществления организм или субъект является растением. В некоторых вариантах осуществления организм, субъект или растение являются водорослями. Способы получения трансгенных растений и животных известны в данной области и обычно начинаются с использования способа трансфекции клеток, как описано в настоящем описании. В другом варианте осуществления устройство для доставки жидкости игольчатой матрицей (см., например, публикацию патента США № 20110230839 за авторством Fred Hutchinson Cancer Research Center) может рассматриваться как средство для доставки CRISPR Cas в твердые ткани. Устройство согласно публикации патента США № 20110230839 для доставки жидкости в твердую ткань может состоять из множества игл, объединенных в матрицу; ряда резервуаров, каждый из которых связан потоком жидкости с соответствующей иглой из матрицы игл, а также множества приводов, функционально сопряженных с соответствующими им резервуарами и настроенных таким образом, чтобы контролировать давление жидкости в резервуаре. В некоторых вариантах осуществления каждый из множества приводов может включать один из множества поршней, один конец каждого из множества поршней соединен с соответствующим ему одному из множества резервуаров, и в некоторых дальнейших вариантах осуществления поршни из множества поршней функционально соединены вместе соответствующим вторым концом таким образом, что возможно одновременное надавливание на них. Некоторые дальнейшие варианты осуществления могут включать пусковой механизм поршня, настроенный таким образом, чтобы надавливать на множество поршней с избираемой варьирующейся скоростью. В других модификациях каждый из множества приводов может включать один из множества передающих жидкость линий, имеющих первый и второй конец, первый конец каждой из множества передающих жидкость линий сопряжен с соответствующим ему из множества резервуаров. В других вариантах осуществления такое устройство может включать источник давления жидкости и каждый из множества приводов включает гидравлическую передачу между источником давления и соответствующему ему из множества резервуаров. В следующих вариантах осуществления источник давления жидкости может содержать по меньшей мере один из следующих элементов: компрессор, вакуумный накопитель, перистальтический насос, главный цилиндр, микроструйный насос и клапан. В другом варианте осуществления каждая из множества игл может содержать множество отверстий, распределенных по ее длине.

[00928] В одном аспекте изобретение относится к способам модификации полинуклеотида-мишени в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления такой способ включает позволение комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, связываться с полинуклеотидом-мишенью для расщепления указанного полинуклеотида-мишени, тем самым модифицируя полинуклеотид-мишень, причем комплекс, нацеленный на нуклеиновую кислоту, включает эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, и направляющую РНК, гибридизованную с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде-мишени.

[00929] В одном аспекте изобретение относится к способу модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает позволение комплексу, нацеленному на нуклеиновую кислоту, связываться с полинуклеотидом, так что указанное связывание приводит к увеличению или уменьшению экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс, нацеленный на нуклеиновую кислоту, содержит эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, связанный с направляющей РНК, которая гибридизована с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде.

[00930] Компоненты комплекса CRISPR могут быть доставлены в сочетании с транспортирующими частями (адаптированными, например, из подходов, описанных в патентах США № 8106022, 8313772). Стратегии доставки нуклеиновой кислоты могут, например, быть использованы для улучшения доставки направляющей РНК, матричных РНК или кодирующих ДНК, в которых закодированы компоненты комплекса CRISPR. Например, молекулы РНК могут включать в себя модифицированные нуклеотиды РНК для повышения стабильности, снижения иммуностимуляции и/или улучшения специфичности (см. Deleavey, Glen F. et al., 2012, Chemistry & Biology, Volume 19, Issue 8, 937-954; Zalipsky, 1995, Advanced Drug Delivery Reviews 16. 157-182; Caliceti and Veronese, 2003, Advanced Drug Delivery Reviews 55: 1261-1277). Описаны различные структуры, которые могут быть использованы для модификации нуклеиновых кислот, таких как гРНК, с целью более эффективной доставки, в частности, обратимо нейтрализующие заряд модификации остова фосфотриэфира, которые могут быть адаптированы для модификации гРНК, обеспечивающей ей более высокую гидрофобность и меньшую анионность, облегчая вход в клетку (Meade BR et al., 2014, Nature Biotechnology 32,1256-1261). В дальнейших альтернативных вариантах осуществления отдельные мотивы РНК могут быть полезны для опосредования трансфекции клеток (Magalhaes M, et al., Molecular Therapy (2012); 20 3, 616-624). Сходным образом, аптамеры могут быть адаптированы для доставки компонентов комплекса CRISPR, например, путем присоединения аптамеров к молекулам гРНК (Tan W. et al., 2011, Trends in Biotechnology, December 2011, Vol. 29, No. 12).

[00931] В некоторых вариантах осуществления конъюгат трехантенного N-ацетилгалактозамина (GalNAc) с олигонуклеотидными компонентами может быть использован для улучшения доставки, например, доставки в заданные типы клеток, например, гепатоциты (см. WO2014118272, включенные в настоящее описание в качестве ссылки; Nair, JK et al., 2014, Journal of the American Chemical Society 136 (49), 16958-16961). Он может рассматриваться как основанная на молекуле сахара частица, и дальнейшие подробности, затрагивающие другие основанные на использование частиц системы доставки и/или составы приведены в настоящем описании, таким образом, GalNAc может рассматриваться как частица согласно приведенному в настоящем описании определению, так что главные способы использования и другие вопросы, например, затрагивающие доставку названных частиц, распространяются также на частицы GalNAc. Стратегия получения конъюгатов в растворе может быть, например, использована для присоединения трехантенных кластеров (с молекулярным весом ~2000), активированных в качестве эфиров PFP (пентафлуорофенил) c 5'-гексамино-модифицированным олигонуклеотидам (5'-HA ASO, молекулярная масса ~8000 Да; Ostergaard et al., Bioconjugate Chem., 2015, 26 (8), pp 1451-1455). Сходным образом, описано применение поли(акрилатных полимеров для доставки нуклеиновых кислот in vivo (см. WO2013158141, включенную в настоящее описание в качестве ссылки). В следующих альтернативных вариантах осуществления предварительное добавление наночастиц CRISPR (или белковых комплексов) к естественно присутствующим в плазме белкам плазмы может использоваться для улучшения способов доставки (Akinc A et al, 2010, Molecular Therapy vol. 18 no. 7, 1357-1364).

[00932] Доступны способы скрининга для применения с целью идентификации средств усиления доставки, например, скрининг химических библиотек (Gilleron J. et al., 2015, Nucl. Acids Res. 43 (16): 7984-8001). Также описаны подходы для количественной оценки эффективности средств доставки, в частности, липидные наночастицы, которые могут быть использованы для идентификации эффективных средств доставки компонентов CRISPR (см. Sahay G. et al., 2013, Nature Biotechnology 31, 653-658).

[00933] В некоторых вариантах осуществления доставка белковых компонентов CRISPR может быть облегчена за счет добавления функциональных пептидов к белку, в частности, пептидов, изменяющих гидрофобность, например, для того, чтобы улучшить функциональность in vivo. Белки, являющиеся компонентами CRISPR, сходным образом могут быть модифицированы для облегчения протекания химических реакций. Например, возможно добавление аминокислот к белку, имеющему группы, подвергнутые модификации способом клик-химии (Nikie I. et al., 2015, Nature Protocols 10,780-791). В таких вариантах осуществления участвующая в клик-реакции группа может далее быть использована для добавления широкого круга альтернативных структур, в частности, поли(этиленгликоля) с целью повышения стабильности, проникающих в клетку пептидов, РНК-аптамеров, липидов и углеводов, в частности, GalNAc. В дальнейших альтернативных вариантах белковый компонент CRISPR может быть адаптирован для проникновения в клетку (см. Svensen et al., 2012, Trends in Pharmacological Sciences, Vol. 33, No. 4), например, путем присоединения к белку проникающих в клетку пептидов (см. Kauffman, W. Berkeley et al., 2015, Trends in Biochemical Sciences, Volume 40, Issue 12, 749-764; Koren and Torchilin, 2012, Trends in Molecular Medicine, Vol. 18, No. 7). В следующих альтернативных вариантах осуществления пациентам или индивидуумам могут предварительно быть введены соединения или составы, способствующие последующей доставке компонентов CRISPR.

Комплексы эффекторного белка C2c1 и C2c3 могут использоваться в растениях

[00934] Система(ы) эффекторного белка C2c1 или C2c3 (например, одиночная или мультиплексированная) может использоваться в сочетании с новейшими достижениями в геномике культур. Описанную в настоящем описании систему можно использовать для выполнения результативного и экономически эффективного исследования или манипуляции с геном или геномом растений, например, для быстрого исследования, и/или отбора, и/или выбора, и/или сравнения, и/или манипуляций, и/или трансформации растительных генов или геномов, например, для создания, идентификации, разработки, оптимизации или присвоения определенной характеристики(характеристик) или признака (набора признаков) растениям или для трансформации генома растения. Таким образом, может быть улучшено производство растений, а именно новых растений с новыми комбинациями признаков или характеристик или новых растений с улучшенными признаками. Система или системы из эффекторного белка C2c1 или C2c3 может использоваться на растениях при использовании следующих способов: сайт-направленной интеграции (SDI) или редактирования генов (GE), близкого обратного скрещивания (NRB) или обратного скрещивание (RB). Аспекты использования описанных в настоящем описании эффекторных систем C2c1 или C2c3 могут быть аналогичны использованию систем CRISPR-Cas (например, CRISPR-Cas9) в растениях. В этой связи заслуживает упоминания веб-сайт Университета Аризоны "CRISPR-PLANT" (http: /www.genome.arizona.edu/crispr/) (поддерживается PennState и AGI). Варианты осуществления изобретения могут быть использованы при редактировании генома в растениях или в тех случаях, где ранее применялись способы с использованием иРНК или аналогичных способов редактирования генома; см., например, Nekrasov, "Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR-Cas system," Plant Methods 2013, 9:39 (doi: 10.1186/1746-4811-9-39); Brooks, "Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR-Cas9 system," Plant Physiology September 2014 pp 114.247577; Shan, "Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system," Nature Biotechnology 31, 686-688 (2013); Feng, "Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system," Cell Research (2013) 23:1229-1232 doi:10.1038/cr.2013.114; published online 20 August 2013; Xie, "RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system," Mol Plant. 2013 Nov;6(6):1975- 83. doi: 10.1093/mp/sstl 19. Epub 2013 Aug 17; Xu, "Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice," Rice 2014, 7:5 (2014), Zhou et af., "Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate: CoA ligase specificity and Redundancy," New Phytologist (2015) (Forum) 1-4 (доступен через интернет по ссылке wmv.newphytologist.com); Caliando et al, "Targeted DNA degradation using a CRISPR device stably carried in the host genome, NATURE COMMUNICATIONS 6:6989,DOI: 10.1038/ncomms7989, vvwvv.nature.com/naturecommunications DOI: 10.1038/ncomms7989; патент США № 6603061 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; патент США № 7868149 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof, и US 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits, содержание каждого из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В практическом воплощении изобретения, содержание и раскрытие Morrell et al. "Crop genomics: advances and applications", NatRevGenet. 2011 Dec 29; 13(21:85-96; включено в настоящее описание в качестве ссылки, в том числе в отношении того, как данное изобретение может быть применено к растениям. Соответственно, данная ссылка может также применяться и к клеткам животных, с учетом возможных различий, к растительным клеткам, если не указано иное; и в этом случае ферменты, обладающие сниженными неспецифическими эффектами и системы, использующие такие ферменты, могут быть использованы применительно к растениям, в том числе к тем, которые упомянуты в настоящей заявке.

Применение систем CRISPR C2c1 или C2c3 в растениях и дрожжах

Определение:

[00935] В целом термин "растение" касается любых разнообразных фотосинтетических, эукариотических, одноклеточных или многоклеточных организмов царства Растения (Plantae), для которых характерен рост путем клеточного деления, наличие хлоропластов, и клеточных стенок, состоящих из целлюлозы. Термин "растение" включает однодольные и двудольные растения. Более конкретно, предполагается, что растения включают, но не ограничиваются ими, покрытосеменные и голосеменные растения, такие как акация, люцерна, амарант, яблоко, абрикос, артишок, ясень, спаржа, авокадо, банан, ячмень, бобы, свекла, береза, бук, ежевика, черника, брокколи, брюссельская капуста, капуста, канола, мускусная дыня, морковь, маниока, цветная капуста, кедр, хлебные злаки, сельдерей, каштан, вишня, китайская капуста, цитрусовые, клементин, клевер, кофе, кукуруза, хлопок, вигна (коровий горох), огурец, кипарис, баклажан, вяз, эндивий, эвкалипт, фенхель, инжир, ель, герань, виноград, грейпфрут, земляной орех, физалис, тсуга, гикори, кудрявая капуста (кале), киви, кольраби, лиственница, салат-латук, лук-порей, лимон, лайм, робиния, сосна, адиантум, маис, манго, клен, дыня, просо, гриб, горчица, орехи, дуб, овес, масличная пальма, бамия, лук, апельсин, декоративное растение или цветок или дерево, папайя, пальма, петрушка, пастернак, горох, персик, арахис, груша, сфагнум, перец, хурма, голубиный горох (каян), сосна, ананас, подорожник, слива, гранат, картофель, тыква, радиккио, редька, рапс, малина, рис, рожь, сорго, сафлор, ива, соя, шпинат, ель, патиссон, земляника, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, батат, сладкая кукуруза, мандарин, чай, табак, помидор, деревья, тритикале, газонные травы, репа, виноградная лоза, грецкий орех, водяной кресс, арбуз, пшеница, ямс, тис и цукини. Термин растение также охватывает водоросли (Algae), которые являются, главным образом, фотоавтотрофами, объединенными, прежде всего, отсутствием корней, листьев и других органов, которые характеризуют высшие растения.

[00936] Способы редактирования генома с использованием системы C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, могут использоваться для придания желаемых свойств по существу любому растению. Большое разнообразие растений и систем растительных клеток с желаемыми физиологическими и агрономическими характеристиками, описанными в настоящем описании, может быть разработано с использованием конструкции из нуклеиновых кислот, описанных в настоящем описании, и различных упомянутых выше способов преобразования. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения целевые растения и растительные клетки для инженерии включают, но не ограничиваются ими, однодольные и двудольные растения, такие как зерновые культуры, включая хлебные культуры (например, пшеница, кукуруза, рис, просо, ячмень), фруктовые культуры (например, помидор, яблоко, груша, клубника, апельсин), кормовые культуры (например, люцерна), овощные культуры (например, морковь, картофель, сахарная свекла, ямс), листовые овощные культуры (например, салат, шпинат); цветущие растения (например, петуния, роза, хризантема), хвойные деревья и (например, соснa, пихта, ель), растения, используемые в фиторемедиации (например, растения, накапливающие тяжелые металлы); масличные культуры (например, подсолнечник, рапс) и растения, используемые в экспериментальных целях (например, Arabidopsis). Таким образом, способы и системы CRISPR-Cas могут использоваться в широком спектре растений, например, в двудольных растениях, принадлежащих к следующим отрядам: Magnoliales, llliciales, Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papaverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violales, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales и Asterales; способы и системы CRISPR-Cas могут использоваться в однодольных растениях, таких как растения, принадлежащие к следующим отрядам: Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales и Orchidales, или в растениях, принадлежащих к голосеменным, например, принадлежащих к отрядам: Pinales, Ginkgoales, Cycadales, Araucariales, Cupressales и Gnetales.

[00937] Системы CRISPR C2c1 или C2c3 и способы их применения, описанные в настоящем описании, могут использоваться в широком диапазоне видов растений, включенных в неограниченный список двудольных, однодольных или голосеменных растений, принадлежащих к следующим родам: Atropa, Alseodaphne, Anacardium, Arachis, Beilschmiedia, Brassica, Carthamus, Cocculus, Croton, Cucumis, Citrus, Citrullus, Capsicum, Catharanthus, Cocos, Coffea, Cucurbita, Daucus, Duguetia, Eschscholzia, Ficus, Fragaria, Glaucium, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hyoscyamus, Lactuca, Landolphia, Linum, Litsea, Lycopersicon, Lupinus, Manihot, Majorana, Malus, Medicago, Nicotiana, Olea, Parthenium, Papaver, Persea, Phaseolus, Pistacia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Senecio, Sinomenium, Stephania, Sinapis, Solanum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Vicia, Vinca, Vitis, and Vigna; and the genera Allium, Andropogon, Eragrostis, Asparagus, Avena, Cynodon, Elaeis, Festuca, Festulolium, Heterocallis, Hordeum, Lemna, Lolium, Musa, Oryza, Panicum, Pannesetum, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum, Zea, Abies, Cunninghamia, Ephedra, Picea, Pirns и Pseudotsuga.

[00938] Системы CRISPR C2c1 или C2c3 и способы их применения могут также использоваться в широком спектре "водорослей" или "клеток водорослей"; включая, например, водоросли, отобранные из нескольких эукариотических филюмов, включая следующие: Rhodophyta (красные водоросли), Chlorophyta (зеленые водоросли), Phaeophyta (коричневые водоросли), Bacillariophyta (диатомовые водоросли), Eustigmatophyta и динофлагелляты, а также прокариотический филюм Cyanobacteria (сине-зеленые водоросли). Термин "водоросли" включает, например, водоросли, отобранные из следующих родов: Amphora, Anabaena, Ankistrodesmus, Botryococcus, Chaetoceros, Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Cyclotella, Cylindrotheca, Dunaliella, Emiliana, Euglena, Hematococcus, Isochrysis, Monochrysis, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Nodularia, Nostoc, Oochromonas, Oocystis, Oscillatoria, Pavlova, Phaeodactylum, Playtmonas, Pleurochrysis, Porphyra, Pseudoanabaena, Pyramimonas, Stichococcus, Synechococcus, Synechocystis, Tetraselmis, Thalassiosira и Trichodesmium.

[00939] Часть растения, т.е. "растительная ткань" может быть обработана согласно способам по настоящему изобретению, чтобы получить растение c улучшенными свойствами. Понятие "растительная ткань" также включает растительные клетки. Термин "растительная клетка", как используют в настоящем описании, относится к отдельным единицам живого растения, как в интактном целом растении, так и в изолированной форме, выращенной в культуре тканей in vitro, на питательных средах или агаре, в суспензии на питательной среде или буфере или в качестве части более высокоорганизованных единиц, например, таких как растительная ткань, орган растения или целое растение.

[00940] Термин "протопласт" относится к растительной клетке, защитная клеточная стенка которой была полностью или частично удалена, например, механическим или ферментативным способом, что привело к появлению интактной биохимически компетентной единице живого растения, которая способна заново сформировать клеточную стенку, пролиферировать, регенерировать и вырасти в целое растение при надлежащих условиях выращивания.

[00941] Термин "трансформация" в широком смысле относится к процессу генетической модификации растения-хозяина с помощью введения ДНК посредством Agrobacteria или одного из ряда химических или физических способов. Как используют в настоящем описании, термин "растение-хозяин" относится к растениям, включая любые клетки, ткани, органы или потомство растений. Много подходящих растительных тканей или растительных клеток могут быть преобразованы и включают, но не ограничены, следующими: протопласты, соматические эмбрионы, пыльца, листья, саженцы, стебли, каллусы, столоны, микроклубни и побеги. Понятие "растительная ткань" также относится к любому клону такого растения, семени, потомству, черенкам, возникших в результате полового или вегетативного размножения, и потомкам любого из них, такие как черенки или семена.

[00942] Термин "трансформированный", как используют в настоящем описании, относится к клетке, ткани, органу или организму, в которые была введена чужеродная конструкция, такая как молекула ДНК. Введенная молекула ДНК может быть интегрирована в ДНК клетки-реципиента, ткани, органа или организма, таким образом, что введенная молекула ДНК передается последующему потомству. В этих вариантах осуществления изобретения "трансформированная" или "трансгенная" клетка или растение также могут включать потомство клетки или растения и потомство, полученное с помощью искусственного разведения, использующего такое преобразованное растение в качестве родителя в скрещивании, и демонстрирующее измененный фенотип в результате присутствия введенной молекулы ДНК. Предпочтительно, трансгенное растение фертильно и способно к передаче введенной ДНК потомству посредством полового размножения.

[00943] Термин "потомство", такое как потомство трансгенного растения, относится к тому, что порождается, происходит от или получено из растения или трансгенного растения. Введенная молекула ДНК также может быть временно введена в клетку реципиента, таким образом, что последующее потомство не наследует введенную молекулу ДНК и, таким образом, не считается "трансгенным". Соответственно, как используют в настоящем описании, "нетрансгенное" растение или растительная клетка является растением, не содержащим чужеродную ДНК, устойчиво интегрированную в его геном.

[00944] Термин "промотор растения", как используют в настоящем описании, является промотором, способным к инициированию транскрипции в растительных клетках, независимо от того, происходит ли он из растительной клетки. Иллюстративные подходящие промоторы растений включают, но не ограничиваются ими, промоторы, полученные из растений, вирусов растения и бактерий, таких как Agrobacterium или Rhizobium, которые включают гены, экспрессируемые в растительных клетках.

[00945] Как используют в настоящем описании, "клетка гриба" относится к любым организмам из царства грибов, включая Ascomycota, Basidiomycota, Blastocladiomycota, Chytridiomycota, Glomeromycota, Microsporidia и Neocallimastigomycota. Клетки грибов могут включать дрожжи, плесени и филаментные грибы. В некоторых модификациях изобретения клеткой гриба является дрожжевая клетка.

[00946] Как используют в настоящем описании, термин "дрожжевая клетка" относится к любой клетке гриба в родов Ascomycota и Basidiomycota. Дрожжевые клетки могут включать почкующиеся дрожжевые клетки, делящиеся дрожжевые клетки и клетки плесени. Не будучи ограниченным этими организмами, многие типы дрожжей, используемых в лабораторных и промышленных условиях, являются частью рода Ascomycota. В некоторых вариантах осуществления изобретения дрожжевая клетка является клеткой S. cerevisiae, Kluyveromyces marxianus или Issatchenkia orientalis cell. Другие дрожжевые клетки могут включать, но не ограничиваться ими, Candida spp. (например, Candida albicans), Yarrowia spp. (например, Yarrowia lipolytica), Pichia spp. (например, Pichia pastoris), Kluyveromyces spp. (например, Kluyveromyces laсtis и Kluyveromyces marxianus), Neurospora spp. (например, Neurospora crassa), Fusarium spp. (например, Fusarium oxysporum), и Issatchenkia spp. (например, Issatchenkia orientalis, также именуемые Pichia kudriavzevii и Candida acidothermophilum). В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является нитевидной клеткой гриба. Как используют в настоящем описании, термин "нитевидная клетка гриба" относится к любому типу клетки гриба, которая растет в виде нитей, т.е. гиф или мицелия. Примеры волокнистых клеток гриба могут включать, но не ограничиваться ими, Aspergillus spp. (например, Aspergillus niger), Trichoderma spp. (например, Trichoderma reesei), Rhizopus spp., (например, Rhizopus oryzae) и Mortierella spp. (например, Mortierella isabellina).

[00947] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является промышленным штаммом. Как используют в настоящем описании, "промышленный штамм" относится к любому штамму клетки гриба, используемому в или выделенному из производственного процесса, например, производства продукта в коммерческих или промышленных масштабах. Понятие "промышленный штамм" может относиться к виду гриба, который, как правило, используется в производственном процессе, или оно может относиться к изоляту вида гриба, который также может использоваться в непромышленных целях (например, лабораторных исследованиях). Примеры производственных процессов могут включать брожение (например, в производстве продуктов питания или напитков), дистилляцию, производство биотоплива, производство различных соединений и полипептидов. Примеры промышленных штаммов могут включать, но не ограничиваться ими, JAY270 и АТСС4124.

[00948] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является полиплоидной клеткой. Как используют в настоящем описании, понятие "полиплоидная" клетка может относиться к любой клетке, геном в которой присутствует больше, чем в одной копии. Понятие "полиплоидная клетка" может относиться к клетке, которая естественным образом существует в полиплоидном состоянии, или к клетке, полиплоидное состояние генома которой было вызвано искусственно (например, посредством специфического регулирования, изменения, инактивации, активации, или модификации мейоза, цитокинеза, или репликации ДНК). "Полиплоидная клетка" может относиться к клетке, весь геном которой является полиплоидным, или к клетке, которая является полиплоидом в конкретном геномном локусе-мишени. Чтобы не привязываться к теории, считается, что изобилие направляющих РНК может ограничивать скорость генной инженерии полиплоидных клеток в большей степени, чем гаплоидных клеток, и, таким образом, в способах использования системы CRISPR с белком С2с1 или С2с2, описанных в настоящем описании, могут использоваться преимущества определенного типа клетки гриба.

[00949] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является диплоидной клеткой. Как используют в настоящем описании, понятие "диплоидная" клетка может относиться к любой клетке, геном которой присутствует в двух копиях. Диплоидная клетка может относиться к типу клетки, которая естественным образом существует в диплоидном состоянии, к клетке, диплоидное состояние генома которой было вызвано искусственно (например, посредством специфического регулирования, изменения, инактивации, активации или модификации мейоза, цитокинеза или репликации ДНК). Например, штамм S. cerevisiae, S228C, может находиться в гаплоидном или диплоидном состоянии. "Диплоидная" клетка может относиться к клетке, весь геном которой является диплоидным, или к клетке, которая является диплоидной в конкретном геномном локусе-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является гаплоидной клеткой. Как используют в настоящем описании, "гаплоидная" клетка может относиться к любой клетке, геном которой присутствует в одной копии. Гаплоидная клетка может относиться к типу клетки, которая естественно находится в гаплоидном состоянии, или к клетке, гаплоидное состояние генома которой было вызвано искусственно (например, посредством специфичного регулирования, изменения, инактивации, активации или модификации мейоза, цитокинеза или репликации ДНК). Например, штамм S. cerevisiae, S228C, может находиться в гаплоидном или диплоидном состоянии. "Гаплоидная" клетка может относиться к клетке, весь геном которой является гаплоидным, или к клетке, которая является гаплоидной в конкретном геномном локусе-мишени.

[00950] Как используют в настоящем описании, "экспрессирующий вектор дрожжей" относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит одну или более последовательностей, кодирующих РНК и/или полипептид, и может далее содержать любые желаемые элементы, которые управляют экспрессией нуклеиновой кислоты (кислот), а также любыми элементами, которые обеспечивают репликацию и сохранение вектора экспрессии в дрожжевой клетке. В данной области известно множество подходящих экспрессирующих векторов дрожжей и их особенностей; например, различные векторы и способы иллюстрированы в Yeast Protocols, 2nd edition, Xiao, W., ed. (Humana Press, New York, 2007) and Buckholz, R.G. and Gleeson, M.A. (1991) Biotechnology (NY) 9(11): 1067-72. Векторы дрожжей могут содержать, без ограничения, центромерную (CEN) последовательность, автономно реплицирующуюся последовательность (ARS), промотор, такой как промотор РНК-полимеразы III, функционально связанный с целевой последовательностью или геном, терминатор, такой как терминатор РНК-полимеразы III, ориджин репликации и маркерный ген (например, ауксотрофии, антибиотика или другие выбранные маркеры). Примеры экспрессирующих векторов для использования в дрожжах могут включать плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы, плазмиды 2μ, дрожжевые интегративные плазмиды, дрожжевые репликативные плазмиды, челночные векторы и эписомы.

Стабильная интеграция компонентов системы CRISPR С2с1 или С2с3 в геном растений и растительных клеток

[000001] В конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается, что полинуклеотиды, кодирующие компоненты системы CRISPR С2с1 или С2с3 вводятся для стабильной интеграции в геном растительной клетки. В этих вариантах осуществления изобретения конструкция вектора трансформации или системы экспрессии может быть отрегулирована в зависимости от того, когда, где и при каких условиях направляющая РНК и/или ген С2с1 или С2с3 экспрессируются.

[000002] В конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается введение компонентов системы CRISPR С2с1 или С2с3 стабильно в геномную ДНК растительной клетки. Дополнительно или альтернативно, предусматривается введение компонентов системы CRISPR С2с1 или С2с3 для стабильной интеграции в ДНК органелл растений, таких как, но не ограниченных ими, пластиды, митохондрии или хлоропласты.

[000003] Система экспрессии для стабильной интеграции в геном растительной клетки может содержать один или более следующих элементов: элемент промотора, который может использоваться для экспрессии РНК и/или фермента С2с1 или С2с3 в растительной клетке; 5'-нетранслируемые области для увеличения экспрессии; элемент интрона для дальнейшего увеличения экспрессии в определенных клетках, таких как клетки однодольного растения, сайт множественного клонирования, чтобы обеспечить удобные сайты рестрикции для вставки направляющей РНК и/или последовательности гена С2с1 или С2с3 и других желаемых элементов; и 3'-нетранслируемые области для обеспечения эффективной терминации экспрессируемого транскрипта.

[000004] Элементы системы экспрессии могут быть на одной или более конструкциях экспрессии, которые являются либо кольцевыми, такими как плазмида или вектор трансформации, либо линейными, такими как двойная спираль ДНК.

[000005] В конкретном варианте система экспрессии CRISPR С2с1 или С2с3 включает, по меньшей мере:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую направляющую РНК (гРНК), которая гибридизируется с последовательностью-мишенью в растении, и где направляющая РНК включает направляющую последовательность и последовательность прямого повтора;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок С2с1 или С2с3,

[00951] где компоненты (a) или (b) расположены на одной и той же или на различных конструкциях, и посредством чего различные нуклеотидные последовательности могут находиться под контролем одного и того же или различных регуляторных элементов, действующих в растительной клетке.

[00952] Конструкция (конструкции) ДНК, содержащая компоненты системы CRISPR С2с1 или С2с3 и, когда применимо, последовательность матрицы, может быть введена в геном растения, часть растения или растительную клетку рядом обычных способов. Процесс обычно включает этапы отбора подходящей клетки или ткани, введение конструкции (конструкций) в клетку или ткань и регенерацию растительных клеток или растений из клеток или тканей.

[00953] В конкретных вариантах осуществления изобретения конструкция ДНК может быть введена в растительную клетку с использованием способов, таких как, но не ограничиваясь этим, электропорация, микроинъекция, аэрозольная инъекция протопластов растительной клетки, или конструкции ДНК могут быть введены непосредственно в растительную ткань с использованием биолистических способов, таких как бомбардировка частицами ДНК (см. также Fu et al., Transgenic Res, 2000 Feb;9(1):11 -9). Бомбардировка клеток частицами основана на ускорении частиц, покрытых геном(генами)-мишенью, приводящем к проникновению частиц в протоплазму и типично стабильной интеграции в геном, (см., например, Klein et al., Nature (1987), Klein et al., Bio/Technology (1992), Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993)).

[00954] В конкретных вариантах осуществления изобретения конструкции ДНК, содержащие компоненты системы CRISPR С2с1 или С2с3, могут быть введены в растение с помощью агробактериальной трансформации. Конструкции ДНК могут быть объединены с подходящими регионами фланкирования T-ДНК и введены в обычный вектор Agrobacterium tumefaciens. Чужеродная ДНК может быть включена в геном растений путем заражения растений или инкубирования протопластов растения с бактериями Agrobacterium, содержащими одну или более Ti-плазмид (индуцирующая опухоль плазмида) (см., например, Fraley et al., (1985), Rogers et al., (1987) и патент США № 5563055).

Промоторы растений

[00955] Для обеспечения подходящей экспрессии в растительной клетке, компоненты системы CRISPR С2с1 или С2с3, описанной в настоящем описании, как правило, помещены под контроль промотора растения, т.е. промотора, действующего в растительных клетках. Предусматривается использование различных типов промоторов.

[00956] Конститутивный промотор растения - промотор, который способен экспрессировать открытую рамку считывания (ORF), которую он контролирует во всех или почти всех тканях растения во время всех или почти всех стадий развития растения (называется "конститутивной экспрессией"). Одним не ограничивающим примером конститутивного промотора является промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Понятие "регулируемый промотор" относится к промоторам, которые управляют экспрессией генов не конститутивно, а регулируемым во времени и/или пространстве образом, и включает тканеспецифичные, тканепредпочтительные и индуцируемые промоторы. Различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, или на различных стадиях развития, или в ответ на различные условия окружающей среды. В конкретных вариантах осуществления изобретения один или более компонентов системы CRISPR С2с1 или С2с3 экспрессируется под контролем конститутивного промотора, такого как промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Тканепредпочтительные промоторы могут быть использованы для нацеливания на увеличенную экспрессию в определенных типах клеток в определенных тканях растения, например клеток сосудов в листьях или корнях или в определенных клетках семени. Примеры конкретных промоторов для использования в системе CRISPR С2с1 или С2с3 можно найти в Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255- 65; Hire et al., (1992) Plant Mol Biol 20:207-18,Kuster et al., (1995) Plant Mol Biol 29:759-72, и Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681-91.

[00957] Иллюстратвные индуцибельные промоторы, обеспечивающие пространственно-временной контроль редактирования или экспрессии генов, могут использовать энергию. Форма энергии может включать, но не ограничиваться этим, звуковую энергию, электромагнитную радиацию, химическую энергию и/или тепловую энергию. Примеры индуцируемых систем включают тетрациклин-индуцируемые промоторы (Tet-On или Tet-Off), двухгибридные системы активации транскрипции, использующие небольшие молекулы (FKBP, ABA, и т.д.), или системы, индуцируемые светом (фитохромы, домены LOV или криптохромы), такие как эффектор транскрипции, индуцируемый светом (LITE), которые управляют изменениями в транскрипционной активности последовательность-специфическим образом. Компоненты индуцируемой светом системы могут включать фермент CRISPR С2с1 или С2с3 светочувствительный гетеродимер цитохрома (например, из Arabidopsis thaliana), и транскрипционный домен активации/репрессии. Другие примеры индуцируемых ДНК-связывающих белков и способов их применения приведены в US 61/736465 и US 61/721283, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[00958] В определенных вариантах осуществления изобретения временная или индуцируемая экспрессия может быть достигнута при помощи, например, регулируемых химическими стимулами промоторов, т.е. таких, для которых применение экзогенного химического агента вызывает экспрессию генов. Модуляция экспрессии генов может также быть достигнута при использовании репрессируемых химическими стимулами промоторов, т.е. таких, для которых применение химического агента подавляет экспрессию генов. Такие индуцируемые химическими стимулами промоторы включают, не ограничиваются ими, промотор кукурузы ln2-2, активируемый антидотами бензолсульфонамидных гербицидов (De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77), промотор кукурузы GST (GST-lI-27, W093/01294), активированный гидрофобными электрофильными соединениями, используемыми в общих гербицидах, наносимых до всхода урожая, и промотор табака PR 1 (Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7), активируемый салициловой кислотой. Промоторы, активность которых регулируется антибиотиками, такие как индуцируемые тетрациклином и репрессируемые тетрациклином промоторы (Gatz et al, (1991) Mol Gen Genet 227:229-37; патенты США № 5814618 и 5789156) также могут быть использованы в рамках насоящего изобретения.

Перемещение к определенным органеллам и/или экспрессия в определенных органеллах растения

[00959] Система экспрессии может включать элементы для транслокации в и/или экспрессии в определенной органелле растения.

Нацеливание в хлоропласты

[00960] В конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается использование системы CRISPR С2с1 или С2с3 для того, чтобы специфически изменить гены хлоропласта или обеспечить экспрессию в хлоропласте. С этой целью используются способы трансформации хлоропласта или компартментализации компонентов системы CRISPR С2с1 или С2с3 в хлоропласте. Например, введение генетических модификаций в геноме пластида может снизить проблемы биологической безопасности, такие как перенос генов через пыльцу.

[00961] Способы трансформации хлоропласта известны в данной области и включают баллистическую трансформацию с бомбардировкой частицами, обработку PEG и микроинъекцию. Кроме того, можно использовать способы, включающие перемещение кассет трансформации от ядерного генома к пластиде, согласно описанию в WO2010061186.

[00962] Альтернативно этому, предусматривается нацеливание одного или более компонентов CRISPR С2с1 или С2с3 в хлоропласт растения. Это достигается за счет встраивания в конструкцию экспрессии последовательности, кодирующей транзитный пептида хлопласта (CTP) или транзитный пептид пластида, функционально связанный с 5'-концевой областью последовательности, кодирующей белок С2с1 или С2с3. CTP удаляется на этапе процессинга во время перемещения в хлоропласт. Квалифицированному специалисту известно о нацеливания экспрессируемых белков в хлоропласт (см., например, Protein Transport into Chloroplasts, 2010, Annual Review of Plant Biology, Vol. 61: 157-180). В таких вариантах осуществления изобретения также желательно нацеливание направляющей РНК в хлоропласт растения. Способы и конструкции, которые могут использоваться для транслокации направляющей РНК в хлоропласт благодаря последовательности локализации в хлоропласте, описаны, например, в US 20040142476 и включены в настоящее описание в качестве ссылки. Такие изменения конструкций могут быть введены в системы экспрессии по настоящему изобретению с целью эффективного перемещения направляющей(их) РНК, нацеливающей С2с1 или С2с3.

Введение полинуклеотидов, кодирующих систему CRISPR С2с1 или С2с3 в водорослевые клетки

[00963] Трансгенные водоросли (или другие растения, такие как рапс) могут быть особенно полезными для производства растительных масел или биотоплива, такого как спирты (особенно метанол и этанол) или другие продукты. Они могут быть модифицированы способами инженерии таким образом, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать большие объемы масла или спиртов для использования в отраслях промышленности, использующих нефть или биотопливо.

[00964] В US 8945839 описан способ модификации способами инженерии вида микроводорослей (клетки Chlamydomonas reinhardtii) с использованием Cas9. Используя подобную технику, способы с использованием описанной в настоящем описании системы CRISPR С2с1 или С2с3 могут быть применены для видов рода Chlamydomonas и других водорослей. В определенных вариантах осуществления изобретения С2с1 или С2с3 и направляющая РНК введены в водоросли, в которых они экспрессируются, с использованием вектора экспрессии С2с1 или С2с3 под контролем конститутивного промотора, такого как Hsp70A-Rbc S2 или бета-2-тубулина. Направляющая РНК необязательно может быть доставлена с использованием вектора, содержащего промотор T7. Альтернативно этому, в клетки водоросли может быть доставлена РНК Cas9 и транскрибированная in vitro направляющая РНК. Квалифицированному специалисту доступны протоколы электропорации, в том числе стандартный рекомендуемый протокол из набора GeneArt Chlamydomonas Engineering kit.

[00965] В конкретных вариантах осуществления используемая в рамках настоящего изобретения эндонуклеаза представляет собой разделенный фермент C2c1 или разделенный фермент C2c3. Разделенные ферменты C2c1 или C2c3 предпочтительно используется в водорослях для направленной модификации генома, как описано для Cas9 в WO 2015086795. Использование разделенных систем C2c1 или C2c3 особенно подходит для случая индуцируемого метода нацеливания на геном и позволяет избежать потенциального токсического эффекта сверхэкспрессии C2c1 или C2c3 в клетках водорослей. В определенных вариантах осуществления названные разделенные домены C2c1 или C2c3 (домены RuvC и HNH) могут быть одновременно или последовательно введены в клетку таким образом, что указанный разделенный домен(ы) C2c1 или C2c3 производят процессинг последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в клетке водоросли. Уменьшенный размер разделенного C2c1 или C2c3 в сравнении с C2c1 или C2c3 дикого типа делает возможным применение других способов доставки системы CRISPR в клетки, в частности, использование проникающих в клетку пептидов, как описано в настоящем описании. Этот способ представляет особый интерес для получения генетически модифицированных водорослей.

Введение полинуклеотидов, кодирующих компоненты C2c1 или C2c3 в дрожжевые клетки

[00966] В определенных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к применению системы CRISPR C2c1 или C2c3 для редактирования генома дрожжевых клеток. Способы трансформации дрожжевых клеток, которые могут быть использованы для введения полинуклеотидов, кодирующих компоненты системы CRISPR C2c1 или C2c3, известны квалифицированному специалисту и рассмотрены в Kawai et al., 2010, Bioeng Bugs. 2010 Nov-Dec, 1(6): 395-403). Неограничивающие примеры включают трансформацию дрожжевых клеток обработкой ацетатом лития (с возможностью дальнейшей обработки ДНК-переносчиком и PEG), баллистического способа или электропорации.

Временная экспрессия компонентов системы CRISPR C2c1 или C2c3 в растениях и растительной клетке

[00967] В определенных вариантах осуществления изобретения предусматривается, что направляющая РНК и/или ген C2c1 или C2c3 экспрессируется в растительной клетке. В таких вариантах осуществления изобретения система CRISPR C2c1 или C2c3 способна обеспечить модификацию гена-мишени только тогда, когда и направляющая РНК, и белок C2c1 или C2c3 присутствуют в клетке, причем в дальнейшем возможен контроль модификации генома. Поскольку экспрессия фермента C2c1 или C2c3 является временной, растения, регенерирующие из таких растительных клеток, как правило, не содержат чужеродной ДНК. В конкретных вариантах осуществления изобретения фермент C2c1 или C2c3 стабильно экспрессируется растительной клеткой и направляющая последовательность экспрессируется временно.

[00968] В конкретных вариантах осуществления изобретения компоненты системы CRISPR C2c1 или C2c3 могут быть введены в растительные клетки с использованием вирусного вектора растений (Scholthof et al. 1996, Annu Rev Pbytopathol. 1996;34:299-323). В следующих конкретных вариантах осуществления указанный вирусный вектор является вектором ДНК-вируса. Например, геминивируса (geminivirus) (например, вирус листовой курчавости капусты, вирус желтой карликовости фасоли, вирус карликовости пшеницы, вирус листовой курчавости томата, вирус полосатости кукурузы, вирус листовой курчавости табака или вирус золотой мозаики томата), или нановируса (nanovirus) (например, вирус желтого некроза бобовых). В других конкретных вариантах указанный вирусный вектор является вектором РНК-вируса, например, тобравируса (tobravirus) (например, вирус погремковости табака, вирус табачной мозаики), потексвируса (potexvirus) (например, X-вирус картофеля) или гордеивируса (hordeivirus) (например, вирус полосатой мозаики ячменя). Геномы репликации вирусов растений являются неинтегральными векторами.

[00969] В некоторых вариантах осуществления вектор, используемый для временной экспрессии конструкций CRISPR C2c1 или C2c3, может быть, в частности, вектором pEAQ, сконструированным специально для опосредованной Agrobacterium временной экспрессии в протопласте (Sainsbury F. et al., Plant Biotechnol J. 2009 Sep:7(7):682-93). Точное нацеливание на локализацию в геноме было продемонстрировано с использованием вектора на основе модифицированного вируса листовой курчавости капусты (CaLCuV) для экспрессии направляющих РНК в стабильно траснгенных растениях, экспрессирующих фермент CRISPR (Scientific Reports 5, Article number: 14926 (2015), doi: 10.1038/srep14926).

[00970] В конкретных вариантах осуществления изобретения фрагменты двухцепочечной ДНК, кодирующие направляющую РНК и/или ген C2c1 или C2c3, могут быть временно введены в клетку растения. В таких вариантах осуществления внесенные двухцепочечные фрагменты ДНК присутствуют в количествах, достаточных для модификации клетки, но не остаются после окончания рассматриваемого периода времени или после одного или более клеточных делений. Способы прямого переноса ДНК известны квалифицированному специалисту (см., например, Davev et al. Plant Mol Biol 1989 Sep;13(3):273-85.)

[00971] В других вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий белок C2c1 или C2c3, вводят в растительную клетку с его последующей трансляцией и процессированием в клетке, синтезирующей этот белок в количестве, достаточном для изменения клетки (в присутствии по меньшей мере одной молекулы направляющей РНК), но который не остается после окончания рассматриваемого периода времени или после одного или более клеточных делений. Способы введения мРНК в протопласт растения известны квалифицированному специалисту ((см., например, Gallie, Plant Cell Reports (1993), 13; 119-122).

[00972] Tакже предусматриваются комбинации различных описанных выше способов.

Доставка компонентов CRISPR C2c1 или C2c3 в растительную клетку

[00973] В конкретных вариантах осуществления изобретения требуется доставить один или более компонентов системы CRISPR C2c1 или C2c3 напрямую в растительную клетку. Это представляет интерес, среди прочего, для получения нетрансгенных растений (см. ниже). В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более компонентов C2c1 или C2c3 получен(ы) вне растения или растительной клетки и доставлен(ы) в клетку. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения белок C2c1 или C2c3 получен in vitro до введения в растительную клетку. Белок C2c1 или C2c3 может быть получен различными известными квалифицированному в данной области специалисту способами, в том числе рекомбинантным получением. После экспрессии белок C2c1 или C2c3 выделяют, подвергают рефолдингу в случае необходимости, очищают и необязательно из него удаляют меток для очистки, такой как His-метка. Когда неочищенный, частично очищенный или более полно очищенный белок C2c1 или C2c3 получен, его можно вводить в растительную клетку.

[00974] В определенных вариантах осуществления изобретения белок C2c1 или C2c3 объединен с направляющей молекулой РНК, нацеливающей на ген-мишень, для образования предварительно собранного рибонуклеопротеина.

[00975] Отдельные компоненты или сам предварительно собранный рибонуклеопротеин могут быть введены в растительную клетку путем электропорации, бомбардировки частицами, покрытыми продуктом гена, ассоциированным с C2c1 или C2c3, химической трансфекции или некоторых другими средств транспорта через клеточную мембрану. Например, была продемонстрирована трансфекция протопласта растения с предварительно собранным рибонуклеопротеином CRISPR с целью подтвердить модификацию генома растения (как описано в Woo et at. Nature Biotechnology, 2015; DQI: 1.0.1038/nbt.3389).

[00976] В конкретных вариантах осуществления изобретения система CRISPR C2c1 или C2c3 может быть введена в растительные клетки с использованием наночастиц. Компоненты, такие как белок, нуклеиновая кислота или их сочетание, могут быть загружены или упакованы в наночастицы и применены к растениям (как описано, например, в WO 2008042156 и US 20130185823). В частности, варианты осуществления изобретения включают наночастицы, в которые загружена или в которых содержится молекула(ы) ДНК, кодирующая белок C2c1 или C2c3, молекулы ДНК, кодирующие направляющую РНК, и/или выделенная направляющая РНК, как описано в WO2015089419.

[00977] Следующим средством введения одного или более компонентов систем CRISPR C2c1 или C2c3 в растительную клетку является использование проникающих в клетку пептидов (CPP). В соответствии с этим отдельные варианты осуществления изобретения включают композиции, содержащие проникающие в клетку пептиды, связанные с белком C2c1 или C2c3. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения белок C2c1 или C2c3 и/или направляющая РНК сопряжены с одним или более CPP для их эффективной доставки в протопласт растения (также см. Ramakrishna, Genome Res. 2014 Jun;24(6):1020-7, для Cas9 в клетках человека). В других вариантах осуществления ген нацеленного на РНК белка и/или направляющая(ие) РНК кодируются одной или более кольцевыми или некольцевыми молекулой(ами), сопряженными с одним или более CPP для доставки в протопласт растения. Протопласты растения далее регенерируют в растительные клетки, а далее в растения. CPP в целом представляют собой короткие пептиды длиной менее 35 аминокислот полученные либо из белка, либо из химерных последовательностей, способных транспортировать биомолекулы через клеточную мембрану вне зависимости от рецепторов. CPP могут представлять собой катионные пептиды, пептиды, имеющие гидрофобные последовательности, амфипатические пептиды, пептиды, богатые пролином, и антимикробные последовательности, а также химерные или двухкомпонентные пептиды (Pooga and Langel, 2005). CPP способны проникать через биологические мембраны и при этом запускать движение различных биомолекул через мембраны клеток в цитоплазму и улучшать их внутриклеточное перемещение, тем самым облегчая взаимодействие биомолекулы с мишенью. Примеры CPP в числе прочих включают: Tat, ядерный белок-активатор транскрипции, необходимый для репликации вируса ВИЧ типа I, пенетратин, сигнальная пептидная последовательность фактора роста фибробластов (FGF) Капоши, сигнальная пептидная последовательность интегрина β3; последовательность пептида полиаргинина Args, богатые аргинином молекулярные транспортеры, пептид "sweet arrow".

Использование систем CRISPR C2c1 или C2c3 для получения генетически модифицированных нетрансгенных растений

[00978] В определенных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, используются для модификации эндегенных генов или модификации их экспрессии без введения на постоянной основе в геном растения каких-либо чужеродных генов, в том числе кодирующих компоненты CRISPR, чтобы избежать присутствия чужеродной ДНК в геноме растения. Это может представлять интерес в связи с тем, что нормативные требования к нетрансгенным растениям являются менее строгими.

[00979] В конкретных вариантах осуществления изобретения это обеспечивается временной экспрессией компонентов CRISPR C2c1 или C2c3. В некоторых вариантах осуществления один или более компонентов CRISPR экспрессируются с одного или более вирусных векторов, которые производят достаточное количество белка C2c1 или C2c3 и направляющей РНК для того, чтобы стабильно и непрерывно обеспечивать модификацию представляющего интерес гена в соответствии со способом, описанным в настоящем описании.

[00980] В конкретных вариантах осуществления временная экспрессия конструкций CRISPR C2c1 или C2c3 осуществляется в протопластах растения и, таким образом, не происходит их встраивание в геном. Экспрессия с ограниченной продолжительностью может быть достаточной для того, чтобы система CRISPR C2c1 или C2c3 была способна модифицировать ген-мишени, как описано в настоящем описании.

[00981] В некоторых вариантах осуществления изобретения различные компоненты системы CRISPR C2c1 или C2c3 введены в растительную клетку, протопласт или растительную ткань по отдельности или в виде смеси с помощью молекул для доставки в форме частиц, таких как наночастицы или молекулы CPP, как описано выше.

[00982] Экспрессия компонентов CRISPR C2c1 или C2c3 может вызывать направленную модификацию генома за счет либо прямого действия нуклеаз C2c1 или C2c3 и необязательно введения ДНК-матрицы, либо за счет модификации генов-мишеней при помощи системы CRISPR C2c1 или C2c3, как это описано в настоящей заявке. Различные стратегии, описанные выше, делают возможным опосредованное C2c1 или C2c3 редактирование генома, не требующее введение компонентов CRISPR C2c1 или C2c3 в геном растения. Компоненты, которые временно введены в растительную клетку, обычно не сохраняются после кроссинговера.

Обнаружение модификаций в геноме растений - селективные маркеры

[00983] В некоторых вариантах осуществления, в которых способ включает модификацию эндогенного гена-мишени в геноме растения, любой подходящий способ может быть использован для того, чтобы после того, как растение, часть растения или растительная клетка инфицированы или трансфицированы системой CRISPR C2c1 или C2c3, определить, имело ли место нацеливание на ген или направленный мутагенез по сайту-мишени. В случае если способ включает введение трансгена, трансформированная растительная клетка, каллус или растение могут быть идентифицированы и выделена за счет отбора или скрининга модифицированного растительного материала на предмет наличия трансгена или признаков, кодируемых трансгеном. Для идентификации растений или растительных клеток-трансформантов, содержащих встроенные генные конструкции или эндогенные модификации ДНК, могут быть использованы физические или биохимические способы. Такие способы включают, но не ограничиваются ими: 1) саузерн=анализ или ПЦР-амплификация для обнаружения и определения структуры рекомбинантной ДНК-вставки или модифицированных эндогенных генов; 2) нозерн-блоттинг, защита от РНК-азы S1, удлинение праймеров или амплификация ПЦР с обратной транскриптазой для обнаружения и изучения транскриптов РНК генных конструкций; 3) ферментный анализ для определения активности ферментов или рибозимов, где такие генные продукты кодируются генной конструкцией или на экспрессию влияет генетическая модификация; 4) гель-электрофорез белков, методики вестерн-блота, иммунопреципитация, иммуноанализ, связанный с активностью белков, когда генные конструкции или эндогенные продукты гена являются белками. Дополнительные методики, такие как гибридизация in situ, ферментное окрашивание, иммуноокрашивание могут также использоваться для детектирования присутствия или экспрессии рекомбинантных конструкций или обнаружения модификации эндогенного гена в конкретных органах и тканях растения. Способы проведения всех данных способов анализа хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту.

[00984] Дополнительно (или альтернативно) экспрессирующая система, кодирующая компоненты CRISPR C2c1 или C2c3, обычно сконструирована таким образом, чтобы включать один или более селективных маркеров, которые обеспечивают инструмент для выделения или эффективного отбора клеток, содержащих и/или модифицированных системой CRISPR C2c1 или C2c3 на ранних стадиях и в больших масштабах.

[00985] В случае опосредованной Agrobacterium трансформации кассета-маркер может быть расположенной вблизи или между границ фланкирующей Т-ДНК и может находиться внутри бинарного вектора. В другом варианте осуществления такая кассета-маркер может находиться вне Т-ДНК. Селективная кассета-маркер также может находиться внутри или вблизи границ Т-ДНК, в то время как экспрессирующая кассета может находиться в другом месте внутри второй Т-ДНК на бинарном векторе (например, система 2 Т-ДНК).

[00986] Для бомбардировки частицами или трансформации протопластов система экспрессии может включать один или более выделенных линейных фрагментов или может являться частью большей конструкции, которая может содержать бактериальные элементы репликации, бактериальные селективные маркеры или другие поддающиеся обнаружению элементы. Такая экспрессирующая кассета(ы), содержащая полинуклеотиды, кодирующие направляющую молекулу и/или C2c1 или C2c3, может быть физически соединена с кассетой-маркером или может находиться в смеси с второй молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей кассету-маркер. Кассета-маркер состоит из необходимых для экспрессии поддающегося обнаружению или селективного маркера элементов, которые делают возможным эффективную селекцию трансформированных клеток.

[00987] Процедура отбора клеток, основанная на селективном маркере, зависит от природы гена-маркера. В определенных вариантах осуществления используется селективный маркер, т.е. маркер, делающий возможным прямой отбор клеток на основе экспрессии маркера. Селективный маркер может обеспечивать положительный или отрицательный отбор и быть зависимым или не зависимым от присутствия внешних субстратов (Miki et al. 2004, 107(3): 193-232). Более распространен случай, когда гены устойчивости к антибиотику или гербициду используются в качестве маркера, тем самым отбор осуществляется путем выращивания растительного материала на средах, содержащих ингибирующие концентрации антибиотика или гербицида, устойчивость к которым придает ген-маркер. Примерами таких генов являются гены, которые придают устойчивость к антибиотикам, таким как гигромицин (hpt) и канамицин (nptII), и гены, которые придают устойчивость к гербицидам, таким как фосфинотрицин (bar) и хлоросульфорон (als).

[00988] Трансформированные растения и растительные клетки могут также быть идентифицированы с помощью скрининга активности видимого маркера, обычно фермента, способного к процессингу окрашенного субстрата (например, β-глюкуронидаза, люцифераза, гены В или Cl). Такая методология селекции и скрининга хорошо известна специалисту в данной области.

Культуры и регенерация растений

[00989] В определенных вариантах осуществления растительная клетка, которая имеет модифицированный геном, произведенный или полученный любым из описанных в настоящей спецификации способов, может быть культивирована для регенерации целого растения, имеющего модифицированный генотип и, как следствие, желаемый фенотип. Традиционно применяемые методики регенерации основаны на манипулировании определенными фитогормонами в среде для роста культуры ткани и обычно основаны на биоцидном и/или гербицидном маркере, который вводится вместе с желаемой нуклеотидной последовательностью. В определенных дальнейших модификациях изобретения регенерация растения достигается на основе культивируемых протопластов, каллусов растения, эксплантов, органов, пыльцы, эмбрионов или их частей (см., например, Evans et. al. (1983), Handbook of Plant Cell Culture, Klee et al (1987) Ann. Rev. of Plant Phys.).

[00990] В определенных вариантах осуществления трансформированные или улучшенные растения, как описано в настоящей спецификации, могут быть самоопыляющимися для обеспечения семян для гомозиготных улучшенных растений по настоящему изобретению (гомозиготные для модификации ДНК) или могут быть скрещены с нетрансгенными растениями или иными улучшенными растениями для того, чтобы обеспечить семена для гетерозиготных растений. В случае если рекомбинантная ДНК была введена в растительную клетку, получаемое в результате такого скрещивания растение является гетерозиготным в отношении рекомбинантной молекулы ДНК. Такие растения, как гомозиготные, так и гетерозиготные, полученные путем скрещивания улучшенных растений и содержащие генетические модификации (которые могут представлять собой рекомбинантную ДНК) в настоящем описании называются "потомством". Растения-потомство представляют собой растения, происходящие от исходного трансгенного растений и содержащие модификации генома или введенную с помощью способов, описанных в настоящем описании, рекомбинантную молекулу ДНК. Альтернативно этому генетически модифицированные растения могут быть получены с помощью одного из описанных выше способов с использованием фермента C2c1 или C2c3, в соответствии с чем чужеродная ДНК не встраивается в геном. Потомство таких растений, полученных путем последующей селекционной работы, может также содержать генетические модификации. Селекционная работа выполняется с помощью любых широкого применяемых способов селекции для различных сельскохозяйственных культур (например, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960).

Получение растений с улучшенными агрономическими характеристиками

[00991] Системы CRISPR, основанные на C2c1 или C2c3, описанные в настоящем описании, могут быть использованы для внесения направленных двухцепочечных или одноцепочечных разрывов и/ил введения систем активаторов или репрессоров гена и, не ограничиваясь этим, могут быть использованы для нацеливания на гены, замены генов, направленного мутагенеза, направленных делеций или инсерций, направленных инверсий и/или транслокаций. За счет совместных экспрессии нескольких нацеливающих РНК, направленных на несколько модификаций в одной клетке, возможно обеспечить мультиплексированные модификации генома. Данная технология может быть использована для высокоточного конструирования растений с улучшенными свойствами, включая улучшенные пищевые характеристики, увеличенную устойчивость к заболеваниям или устойчивость к стрессу биологической или абиотической природы и увеличенную продукцию имеющих коммерческое значения продуктов или гетерологических соединений.

[00992] В определенных вариантах осуществления системы CRISPR C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, используются для внесения напралвенных двухцепочечных разрывов (DSB) в эндогенную последовательность ДНК. DSB активируют пути репарации ДНК в клетке, что может быть использовано для достижения желаемых модификаций последовательности ДНК вблизи положения разрыва. Это представляет интерес в случае, если инактивация эндогенных генов может обеспечить или внести вклад в желаемую характеристику. В определенных вариантах осуществления гомологичная рекомбинация с последовательностью-матрицей может быть осуществлена в участке DSB для того, чтобы внести представляющий интерес ген.

[00993] В определенных вариантах осуществления системы CRISPR C2c1 или C2c3 могут быть использованы в качестве связывающего нуклеиновую кислоту белка в общем понимании с его слиянием или функциональным связыванием с функциональным доменом для активации и/или репрессии эндогенных генов растения. Примеры традиционно применяемых функциональных доменов могут включать, не ограничиваться ими, инициатор трансляции, активатор трансляции, репрессор трансляции, нуклеазы, в частности, рибонуклеазы, сплайсосому, микрогранулы, активируемый/контролируемый светом домен или активируемый/контролируемый химическими стимулами домен. В случае таких модификаций изобретения белок C2c1 или C2c3 обычно содержит по меньшей мере одну мутацию, в частности такую, что он имеет не более 5% активности белка C2c1 или C2c3, не имеющих такой по меньшей мере одной мутации; направляющая РНК включает направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью.

[00994] Описанные в настоящем описании способы в целом обеспечивают получение улучшенных растений, имеющих одну или более желательных характеристик по сравнению с растениями дикого типа. В определенных вариантах осуществления полученные растения, растительные клетки или части растений являются трансгенными растениями, содержащими экзогенную последовательность ДНК, встроенную в геном всех или части клеток растения. В конкретных вариантах осуществления получают нетрансгенные генетически модифицированные растения, части растений или клетки в том смысле, что в геном любых из клеток растения не включена экзогенная последовательность ДНК. В таких вариантах осуществления изобретения улучшенные растения является нетрансгенными. В случае если обеспечена только модификация некоторого эндогенного гена и чужеродные гены не внесены и не поддерживаются в геноме растения, полученные в результате генетически модифицированные культуры не содержат чужеродных генов и, таким образом, по существу должны рассматриваться как нетрансгенные. Различные применения систем CRISPR C2c1 или C2c3 для редактирования растительных геномов более детально описаны ниже:

Введение одного или более чужеродных генов для сообщения представляющей интерес агрономической характеристики

[00995] Настоящее изобретение относится к способам редактирования генома или модификации последовательностей, ассоциированных с или расположенных в представляющих интерес локусах-мишенях, где такой способ включает введение комплекса эффекторного белка C2c1 или C2c3 в растительную клетку, в связи с чем комплекс эффекторного белка C2c1 или C2c3 эффективно встраивает ДНК-вставку, например, кодирующую интересующий чужеродный ген в геном растительной клетки. В предпочтительных вариантах осуществления такой интеграции ДНК-вставки способствует HR с экзогенно введенной матрицей ДНК или матрицей репарации. Обычно экзогенно введенная матрица ДНК или матрица репарации доставляются совместно с комплексом эффекторного белка C2c1 или C2c3, или одним компонентом или полинуклеотидным вектором для экспрессии компонента комплекса.

[00996] Системы CRISPR C2c1 или C2c3, предусматриваемые в рамках настоящего изобретения, делают возможной направленную доставку генов. Становится все более очевидным, что эффективность экспрессии представляющего интерес гена в большой степени определяется локализацией встраивания в геноме. Способы по настоящему изобретению делают возможной направленную интеграцию чужеродного гена в желаемое положение в геноме. Локализация может быть выбрана на основе информации ранее полученных вставок или может быть выбрана с помощью способов, описанных в настоящем описании.

[00997] В определенных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, включают (a) введение в клетку комплекса CRISPR C2c1 или C2c3, содержащего направляющую РНК, включающую прямой повтор и направляющую последовательность, где направляющая последовательность гибридизуется c последовательностью-мишенью, являющейся эндогенной для растительной клетки; (b) введение в растительную клетку эффекторной молекулы C2c1 или C2c3, которая образует комплекс с направляющей РНК, где направляющая последовательность гибридизуется с последовательностью-мишенью и вызывает двухцепочечный разрыв в или вблизи последовательности, на которую нацеливает направляющая; (c) введение в клетку нуклеотидной последовательности, кодирующей матрицу репарации HDR, которая кодирует представляющий интерес ген и которая вводится в место локализации двухцепоченого разрыва в результате HDR. В определенных вариантах осуществления изобретения этап введения может включать доставку в растительную клетку одного или более полинуклеотидов, кодирующих эффекторной белок C2c1 или C2c3, направляющую РНК и матрицу репарации. В определенных вариантах осуществления эти полинуклеотиды доставляются в клетку ДНК-содержащим вирусом (например, джеминивирусом) или РНК-содержащим вирусом (например, тобравирусом). В определенных вариантах осуществления этапы введения включают доставку в растительную клетку Т-ДНК, содержащей одну или более полинуклеотидных последовательностей, кодирующих эффекторный белок C2c1 или C2c3, направляющую РНК и матрицу репарации, где доставка опосредована Agrobacterium. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей эффекторный белок C2c1 или C2c3 может быть функционально соединена с промотором, в частности, конститутивным промотором (например, промотором 35S вируса мозаики цветной капусты) или специфическим для клетки либо индуцибельным промотором. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид вводится с помощью бомбардировки микрочастицами. В определенных вариантах осуществления способ также включает скрининг растительной клетки после этапов введения с целью определить, была ли матрица репарации, т.е. представляющий интерес ген, успешно введена. В определенным вариантах осуществления данные способы включают этап регенерации растения из растительной клетки. В последующих вариантах осуществления такие способы включают скрещивание растения для получения потомства с желаемыми генетическими свойствами. Примеры чужеродных генов, кодирующих представляющую интерес характеристику, перечислены ниже.

b) Редактирование эндогенных генов для сообщения представляющего интерес агрономического признака

[00998] Настоящее изобретение относится к способам редактирования или модификации последовательностей, ассоциированных с или расположенных в представляющем интерес локусе-мишени, где такой способ включает введение комплекса эффекторного белка C2c1 или C2c3 в растительную клетку, в связи с чем комплекс C2c1 или C2c3 модифицирует экспрессию эндогенного гена растения. Этого можно достичь различными путями. В определенных вариантах осуществления желательно прекращение экспрессии эндогенного гена и комплекс CRISPR C2c1 или C2c3 используется для нацеливания и расщепления эндогенного гена для того, чтобы модифицировать экспрессию гена. В таких вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, включают (a) введение в растительную клетку комплекса C2c1 или C2c3, включающего направляющую РНК, содержащую прямой повтор и направляющую последовательность, где направляющая последовательность гибридизуется с последовательностью-мишенью внутри представляющего интерес гена в геноме растительной клетки; (b) введение в клетку эффекторного белка C2c1 или C2c3, который при связывании с направляющей РНК включает направляющую последовательность, которая гибридизована с последовательностью-мишенью, и вносит двухцепочечный разрыв в или вблизи последовательности, на которую нацеливает направляющая последовательность. В определенных вариантах осуществления этап введения может включать доставку в растительную клетку одного или более полинуклеотидов, кодирующих эффекторный белок C2c1 или C2c3 и направляющую РНК.

[00999] В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды доставляются в клетку ДНК-содержащим вирусом (например, джеминивирусом) или РНК-содержащим вирусом (например, тобравирусом). В определенных вариантах осуществления этапы введения включают доставку в растительную клетку Т-ДНК, содержащей одну или более полинуклеотидных последовательностей, кодирующих эффекторный белок C2c1 или C2c3 и направляющую РНК, где доставка опосредована Agrobacterium. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей компоненты системы эффекторного белка C2c1 или C2c3, может быть функционально соединена с промотором, в частности, конститутивным промотором (например, промотором 35S вируса мозаики цветной капусты) или специфическим для клетки либо индуцибельным промотором. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид вводится с помощью бомбардировки микрочастицами. В определенных вариантах осуществления способ также включает скрининг растительной клетки после этапов введения с целью определить, была ли матрица репарации, т.е. представляющий интерес ген, успешно введена. В определенным вариантах осуществления данные способы включают этап регенерации растения из растительной клетки. В последующих вариантах осуществления такие способы включают скрещивание растения для получения потомства с желаемыми генетическими свойствами.

[001000] В конкретных вариантах осуществления способов, описанных выше, устойчивые к заболеваниям зерновые культуры, получают посредством целенаправленной мутации генов восприимчивости к заболеванию или генов, кодирующих отрицательные регуляторы (например, ген Mio) генов защиты растений. В конкретном варианте устойчивые к гербицидам зерновые культуры получают путем целенаправленной замены конкретных нуклеотидов в генах растений, таких как те, которые кодируют ацетолактатсинтазу (ALS) и протопорфириногеноксидазу (PPO). В конкретных вариантах осуществления устойчивые к засухе и засолению зерновые культуры получают путем целенаправленной мутации в генах, кодирующих отрицательные регуляторы устойчивости к абиотическому стрессу, зерновые с низким содержанием амилозы - путем целенаправленной мутации гена Waxy, рис или другие зерновые с уменьшенной прогорклостью -путем целенаправленной мутации основных генов липазы в алейроновом слое, и т.д. Более обширный список эндогенных генов, кодирующих интересующие признаки, приведен ниже.

c) модулирование эндогенных генов системой CRISPR C2c1 или CRISPR C2c3 для получения представляющих интерес сельскохозяйственных характеристик

[001001] Также в рамках настоящего изобретения предусматриваются способы модулирования (т.е. активации или подавления), экспрессии эндогенных генов с использованием белка C2c1 или C2c3, описанного в настоящем описании. В таких способах используется определенная последовательность(и) РНК, которую встраивают в геном растения посредством комплекса C2c1 или C2c3. Более подробно, определенная последовательность(и) РНК связывается с двумя или более адаптерными белками (например, аптамерами), посредством чего каждый адаптерный белок связан с одним или более функциональными доменами и где по меньшей мере один из одного или более функциональных доменов, связанных с адаптерным белком, имеет один или более типов активности, включающих метилазную активность, деметилазную активность, активность активации транскрипции, активность репрессии транскрипции, активность фактора терминации транскрипции, активность модификации гистонов, активность интеграции ДНК, активность расщепления РНК, активность расщепления ДНК или активность связывания нуклеиновых кислот. Функциональные домены используются для модуляции экспрессии эндогенных генов растений для получения желаемых характеристик. Как правило, в этих вариантах осуществления изобретения эффекторный белок C2c1 или C2c3 имеет одну или более мутаций, таким образом, чтобы он имел не более 5% нуклеазной активности эффекторного белка C2c1 или C2c3, не имеющего ни одной мутации.

[001002] В конкретных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, включают следующие стадии: (a), введение в клетку комплекса CRISPR C2c1 или CRISPR C2c3, включающего направляющую РНК, содержащую прямой повтор и направляющую последовательность, где направляющая последовательность гибридизируется с последовательностью-мишенью, которая является эндогенной по отношению к растительной клетке; (b) введение в растительную клетку эффекторной молекулы C2c1 или C2c3, которая образует комплекс с направляющей РНК, когда направляющая последовательность гибридизируется с последовательностью-мишенью; и где или направляющая РНК модифицирована, чтобы включать определенную последовательность РНК (аптамер), связывающуюся с функциональным доменом, и/или эффекторный белок C2c1 или C2c3 модифицирован для связывания с функциональным доменом. В конкретных вариантах осуществления изобретения, стадия введения может включать доставку в растительную клетку одного или более полинуклеотидов, кодирующих (модифицированный) эффекторный белок C2c1 или C2c3 и (модифицированную) направляющую РНК. Детали компонентов системы CRISPR C2c1 или C2c3 для использования в этих методах описаны в других разделах настоящего изобретения.

[001003] В конкретных вариантах осуществления полинуклеотиды доставляются в клетку посредством ДНК-вируса (например, джеминивирусом) или РНК-вирусом (например, тобравирусом). В конкретных вариантах осуществления стадия введения включают доставку в растительную клетку T-ДНК, содержащей одну или более полинуклеотидных последовательностей, кодирующих эффекторный белок C2c1 или C2c3 и направляющую РНК, где доставка осуществляется посредством Agrobacterium. Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая один или более компонентов системы CRISPR C2c1 или C2c3 CRISPR, может быть функционально связанной c промотором, таким как конститутивный промотор (например, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты), или специфический для клетки или индуцибельный промотор. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид вводится путем бомбардировки микрочастицами. В конкретных вариантах осуществления метод далее включает скрининг растительной клетки после введения, чтобы определить, была ли модифицирована экспрессия интересующего гена. В конкретных вариантах осуществления методы включают стадию регенерации растения из растительной клетки. В дальнейших вариантах осуществления методы включают скрещивание растений для получения, генетически желаемой линии растений. Более обширный список эндогенных генов, кодирующих представляющие интерес характеристики, упомянут ниже.

Использование С2с1 или С2с3 для модификации полиплоидных растений

[001004] Многие растения являются полиплоидами, что означает, что они содержат дуплицированные копии своих геномов - иногда целых шесть, как в пшенице. Согласно настоящему изобретению, методы, использующие эффекторный белок C2c1 или C2c3 системы CRISPR, могут быть "мультиплексированы" для воздействия на все копии гена или нацеливания на десятки генов сразу. Например, в конкретных вариантах осуществления способы по настоящему изобретению используют, чтобы одновременно вносить мутацию потери функции в различные гены, ответственные за подавление защиты от заболевания. В конкретных вариантах осуществления методы данного изобретения используются для одновременного подавления экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот TaMLO-A1, TaMLO-B1 и TaMLO-D1 в растительной клетке пшеницы и регенерации растения пшеницы из нее, чтобы обеспечить устойчивость пшеницы к мучнистой росе (см. также WO2015109752).

Иллюстративные гены, ответственные за агрономические характеристики

[000006] Как описано в настоящем описании выше, в конкретных вариантах осуществления изобретение охватывает использование системы C2c1 или C2c3 CRISPR, как описано в настоящем описании, для инсерции представляющей интерес ДНК, включая один или более способных к экспрессии генов. В дальнейших конкретных вариантах изобретение охватывает способы и инструменты, использующие систему C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, для частичной или полной делеции одного или более экспрессируемых растениями генов. В других дальнейших конкретных вариантах изобретение охватывает способы и инструменты, использующие систему C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, для обеспечения модификации одного или более экспрессируемых растением генов мутацией, заменой, инсерцией, одного или более нуклеотидов. В других конкретных вариантах изобретение охватывает использование системы CRISPRC2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, для обеспечения модификации экспрессии одного или более экспрессируемых растением генов путем специфической модификации одного или более регуляторных элементов, управляющих экспрессией указанных генов.

[000007] В конкретных вариантах осуществления изобретение охватывает способы, которые включают введение экзогенных генов и/или нацеливание на эндогенные гены и их регуляторные элементы, такие как упомянуты ниже:

[000008] 1. Гены, придающие устойчивость к вредителям или заболеваниям:

- Гены устойчивости к заболеваниям растений. Растение может быть трансформировано клонированными генами устойчивости для создания способами инженерии растений, устойчивых к специфичным штаммам патогенов. См., например, Jones et al., Science 266:789 (1994) (клонирование гена томата Cf-9 для устойчивости к Cladosporium fulvum); Martin et al., Science 262:1432 (1993) (ген томата Pto для устойчивости к Pseudomonas syringae pv, томат кодирует протеинкиназу); Mindrinos et al, Cell 78:1089 (1994) (ген RSP2 Arabidopsmay be для устойчивости к Pseudomonassyringae).

- Гены, сообщающие устойчивость к вредителю, такому как нематода кисты сои. См., например, заявку PCT WO 96/30517, заявку PCT WO 93/19181.

- Белки Bacillus thuringiensis см., например, Geiser et al. Gene 48:109 (1986).

- Лектины, см., например, VanDamme et al. Plant Molec. Biol. 24:25 (1994).

- Белки, связывающие витамины, такие как авидин, см. заявку PCTUS93/06487, в которой описано использование авидина и гомологов авидина в качестве ларвицида против насекомых-вредителей.

- Ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы протеазы или протеиназы, или ингибиторы амилазы. См., например, Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987), Huub et al. Plant Molec. Biol. 21:985 (1993), Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993) и патент США № 5494813.

- Специфические для насекомых гормоны или феромоны, такие как экдистероид или ювенильный гормон, их варианты, миметики на их основе или их антагонисты или агонисты. См., например, Nature 344:458 (1990).

- Специфические для насекомых пептиды или нейропептиды, которые в результате экспрессии нарушают физиологию затронутого вредителя. Например, Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994) and Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989). См. также патент США № 5266317.

- Специфические для насекомых яды, производимые в природе змеями, осами или любыми другими организмами. Например, см. Pang et al., Gene 116: 165 (1992).

- Ферменты, ответственные за гипераккумуляцию монотерпена, сесквитерпена, стероида, гидроксамовой кислоты, производную фенилпропаноида или другой небелковой молекулы с инсектицидной активностью.

- Ферменты, вовлеченные в модификацию, включая пост-трансляционную модификацию, биологически активной молекулы, например, гликолитического фермента, протеолитического фермента, липолитического фермента, нуклеазы, циклазы, трансаминазы, эстеразы, гидролазы, фосфатазы, киназы, фосфорилазы, полимеразы, эластазы, хитиназы и глюканазы, естественной или синтетической. См. заявку PCT WO93/02197, Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993) и Kawalleck et al., Plant Molec. Biol 21:673 (1993).

- Молекулы, стимулирующие трансдукцию сигнала. Например, см. Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994), and Griess et al., Plant Physiol. 104:1467 (1994).

- Инвазивные вирусные белки или комплексный токсин на их основе. См. Beachy et al., Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (1990).

- Белки, задерживающие развитие, продуцируемые в природе патогеном или паразитом. См. Lamb et al., Вio/Technology 10:1436 (1992) и Toubart. et al., Plant J. 2:3(57 (1992).

- Белки, задерживающие развитие, продуцируемые в природе растением. Например, Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992).

- В растениях патогены часто являются специфическими для хозяина. Например, некоторые виды Fusarium вызывают увядание томатов, но поражает только томаты, а другие разновидности Fusarium поражают только пшеницу. Растения имеют врожденный (конститутивный) и приобретенный (индуцированный) фитоиммунитет для защиты от большинства патогенов. Мутации и события рекомбинации в поколениях растений приводят к генетической изменчивости, которая приводит к восприимчивости, тем более что патогены воспроизводятся с большей частотой, чем растения. Растения могут иметь устойчивость, не связанную с хозяином, например, хозяин и патоген несовместимы, или частичную устойчивость против всех рас патогена, которой, как правило, управляют много генов, и/или также полную устойчивость к некоторым расам патогенов, но не к другим расам. Такой устойчивостью, как правило, управляют несколько генов. Используя способы и компоненты системы CRISPR-C2c1 или CRISPR-C2c3, теперь существует новый инструмент для индуцирования специфичных мутаций замедленного действия и превентивного характера. Соответственно, можно проанализировать геном источников генов устойчивости, и в растениях, имеющих желаемые характеристики или свойства, использовать способ и компоненты системы CRISPRC2c1 или C2c3, чтобы вызвать повышение экспрессии генов устойчивости. Настоящие системы могут сделать это с большей точностью, чем предыдущие мутагенные агенты и, следовательно, ускорить и улучшить программы селекции растения.

[000009] 2. Гены, вовлеченные в болезни растений, такие как перечисленные в WO 2013046247:

- Болезни риса: Magnaporthe grisea, Cochliobolus miyabeanus, Rhizoctonia solani, Gibberella fujikuroi; Болезни пшеницы: Erysiphe graminis, Fusarium graminearum, F. avenaceum, F. culmorum, Microdochium nivale, Puccinia striiformis, P. graminis, P. recondita, Micronectriella nivale, Typhula sp., Ustilago tritici, Tilletia caries, Pseudocercosporella herpotrichoides, Mycosphaerella graminicola, Stagonospora nodorum, Pyrenophora tritici-repentis; Болезни ячменя: Erysiphe graminis, Fusarium graminearum, F. avenaceum, F. culmorum, Microdochium nivale, Puccinia striiformis, P. graminis, P. hordei, Ustilago nuda, Rhynchosporium secalis, Pyrenophora teres, Cochliobolus sativus, Pyrenophora graminea, Rhizoctonia solani; Болезни кукурузы: Ustilago maydis, Cochliobolus heterostrophus, Gloeocercospora sorghi, Puccinia polysora, Cercospora zeae-maydis, Rhizoctonia solani.

- Болезни цитрусов: Diaporthe citri, Elsinoe fawcetti, Penicillium digitatum, P. italicum, Phytophthora parasitica, Phytophthora citrophthora; Болезни яблока: Monilinia mali, Valsa ceratosperraa, Podosphaera leucotricha, Alternaria alternata яблочный патотип, Venturia inaequalis, Colletotrichum acutatum, Phytophtora cactorum;

- Болезни груши: Venturia nashicola, V. pirina, Alternaria alternata. Японский грушевый патотип, Gymnosporangium haraeanum, Phytophtora cactorum;

- Болезни персика: Monilinia fructicola, Cladosporium carpophilum, Phomopsis sp.;

- Болезни винограда: Elsinoe ampelina, Glomerella cingulata, Uninula necator, Phakopsora ampelopsidis, Guignardia bidwellii, Plasmopara viticola;

- Болезни хурмы: Gloesporium kaki, Cercospora kaki, Mycosphaerela nawae;

- Болезни тыквы: Colletotrichum lagenarium, Sphaerotheca fuliginea, Mycosphaerella melonis, Fusarium oxysporum, Pseudoperonospora cubensis, Phytophthora sp., Pythium sp.;

- Болезни томата: Alternaria solani, Cladosporium fulvum, Phytophthora infestans;

- Болезни баклажана: Phomopsis vexans, Erysiphe cichoracearum;

- Болезни овощей семейства Крестоцветные: Alternaria japonica, Cercosporella brassicae, Plasmodiophora brassicae, Peronospora parasitica;

- Болезни лука-батуна: Puccinia allii, Peronospora destructor;

- Болезни сои: Cercospora kikuchii, Elsinoe glycines, Diaporthe phaseolorum var. sojae, Septoria glycines, Cercospora sojina, Phakopsora pachyrhizi, Phytophthora sojae, Rhizoctonia solani, Corynespora casiicola, Sclerotinia sclerotiorum;

- Болезни фасоли: Colletrichum lindemthianum;

- Болезни арахиса: Cercospora personata, Cercospora arachidicola, Sclerotium rolfsii;

- Болезни гороха: Erysiphe pisi;

- Болезни картофеля: Alternaria solani, Phytophthora infestans, Phytophthora erythroseptica, Spongospora subterranea, f. sp. Subterranea;

- Болезни клубники: Sphaerotheca humuli, Glomerella cingulata;

- Болезни чая: Exobasidium reticulatum, Elsinoe leucospila, Pestalotiopsis sp., Colletotriсhum theae-sinensis;

- Болезни табака: Alternaria longipes, Erysiphe cichoracearum, Colletotrichum tabacum, Peronospora. tabacina, Phytophthora nicotianae;

- Болезни рапса: Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani;

- Болезни хлопка: Rhizoctonia solani;

- Болезни свеклы: Cercospora beticola, Thanatephorus cucumeris, Aphanomyces cochlioides;

- Болезни розы: Diplocarpon rosae, Sphaerotheca pannosa, Peronospora sparsa;

- Болезни хризантем и семейства Сложноцветные: Bremia lactuca, Septoria chrysanthemi-indici, Puccinia horiana;

- Болезни различных растений: Pythium. aphanidermatum, Pythium debarianum, Pythium graminicola, Pythium irregulare, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum;

- Болезни редиса: Alternaria brassicicola;

- Болезни зойсии: Sclerotinia homeocarpa, Rhizoctonia solani;

- Болезни бананов: Mycosphaerella fijiensis, Mycosphaerella musicola;

- Болезни подсолнечника: Plasmopara halstedii;

- Болезни семян или болезни наначальной стадии роста различных растений, вызываемых Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., Gibberella spp., Tricoderma spp., Thielaviopsis spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Corticium spp., Rhoma spp., Rhizoctonia spp., Diplodia. spp., и т.п.;

- Вирусные заболевания различных растений, опосредованных Polymixa spp., Olpidium spp., и т.п.

[000010] 3. Примеры генов, придающих устойчивость к гербицидам;

- Устойчивость к гербицидам, которые ингибируют точки роста или меристему, такую как имидазолинон или сульфонилмочевина, например, Lee et al., EMBOJ. 7:1241 (1988), и Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990), соответственно.

- Устойчивость к глифосату (устойчивость передается, например, мутантными генами 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSP), генами aroA и генамиглифосатацетилтрансферазы (GAT), соответственно), или устойчивость к другим соединениям с фосфоногруппой, таким как глюфосинат (гены фосфинотрицинацетилтрансферазы (PAT) из видов Streptomyces, включая Streptomyces hygroscopicus и Streptomyces viridichromogenes), и к пиридинокси-илифенокси-пропионовым кислотам и циклогексенам посредством генов, кодирующих ингибитор ACC-азы. См., например, патент США № 4940835 и патент США № 6248876, патент США № 4769061, EP№ 0 333 033 и патент США № 4975374. См. также № 0242246, DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989), Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992), WO 2005012515 Castle et. al. и WO 2005107437.

- Устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосинтез, такие как триазин (гены psbA и. gs+) или бензонитрил (геннитрилазы), иглутатион S-трансфераза в Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991), патент США № 4810648 и Hayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992).

- Гены, кодирующие Ферменты, детоксифицирующие гербицид, или мутантный фермент глутаминсинтетазы, устойчивый к ингибированию, например, в патентной заявке США с серийным номером № 11/760602. В ином случае детоксифицирующий фермент является ферментом, кодирующим фосфинотрицин ацетилтрансферазу (такую как белок bar или pat из видов Streptomyces). Фосфинотрицин ацетилтрансферазы описаны, например, в патентах США № 5561236; 5648477, 5646024; 5273894; 5637489; 5276268; 5739082; 5908810 и 7112665.

- Ингибиторы гидроксифенилпируват-диоксигеназы (HPPD), то есть, встречающиеся в природе ферменты, устойчивые к HPPD, или гены, кодирующие мутированный или химерный фермент HPPD, как описано в WO 96/38567, WO 99/24585, и WO 99/24586, WO 2009/144079, WO 2002/046387 или в патенте США № 6768044.

[000011] 4. Примеры генов, вовлеченных в устойчивость к абиотическому стрессу:

- Трансген, способный к уменьшению экспрессии и/или активности гена поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP) в растительных клетках или растениях, как описано в WO00/04173 или, WO/2006/045633.

- Трансгены, способные к уменьшению экспрессии и/или активности кодирующих PARG генов растений или клеток растений, как описано, например; в WO2004/090140.

- Трансгены, кодирующие функциональный в растениях фермент "спасательного" пути синтеза никотинамидадениндинуклеотида, включая никотинамидазу, никотинат фосфорибозилтрансферазу, мононуклеотид-аденилтрансферазу никотиновой кислоты, никотинамидадениндинуклеотид-синтетазу или никотинамидфосфорибозил-трансферазу, как описано, например, в EP 04077624.7, WO2006/133827, PCT/EP07/002433, EP 1999263, или WO2007/107326.

- Ферменты, участвующие в биосинтезе углеводов, включают ферменты, описанные, например, в EP 0571427, WO 95/04826, EP 0719338, WO 96/15248, WO 96/19581, WO 96/27674, WO 97/11188, WO 97/26362, WO 97/32985, WO 97/42328, WO 97/44472, WO 97/45545, WO 98/27212, WO 98/40503, WO99/58688, WO 99/58690, WO 99/58654, WO 00/08184, WO 00/08185, WO 00/08175, WO 00/28052, WO 00/77229, WO 01/12782, WO 01/12826, WO 02/101059, WO 03/071860, WO 2004/056999, WO 2005/030942, WO 2005/030941, WO 2005/095632, WO 2005/095617, WO 2005/095619, WO 2005/095618, WO 2005/123927, WO 2006/018319, WO 2006/103107, WO 2006/108702, WO 2007/009823, WO 00/22140, WO 2006/063862, WO 2006/072603, WO 02/034923, EP 06090134.5, EP 06090228.5, EP 06090227.7, EP 07090007.1, EP 07090009.7, WO 01/14569, WO 02/79410, WO 03/33540, WO 2004/078983, WO 01/19975, WO 95/26407, WO 96/34968, WO 98/20145, WO 99/12950, WO 99/66050, WO 99/53072, патенте США № 6734341, WO 00/11192, WO 98/22604, WO 98/32326, WO 01/98509, WO 01/98509, WO 2005/002359, патенте США № 5824790, патенте США № 6013861, WO94/04693, WO94/09144, WO94/11520, WO95/35026 или WO97/20936 или ферменты, участвующие в синтезе полифруктанов, особенно типа инулина и левана, как описано в EP 0663956, WO 96/01904, WO 96/21023, WO 98/39460, иWO 99/24593, синтезе альфа-1,4-глюканов, как описано вWO 95/31553, US 2002031826, патенте США № 6284479, патенте США № 5712107, WO 97/47806, WO 97/47807, WO 97/47808 и WO 00/14249, синтезе альфа-1,6-разветвленных альфа-1,4-глюканов, как описано в WO 00/73422, синтезе альтернана, как описано, например, в WO 00/47727, WO 00/73422, EP 06077301.7, патенте США № 5908975 и EP 0728213, синтезе гиалуронана, описанного в качестве примера в WO 2006/032538, WO 2007/039314, WO 2007/039315, WO 2007/039316, JP 2006304779 и WO 2005/012529.

- Гены, повышающие устойчивость к засухе. Например, в WO 2013122472 описано, что отсутствие или сниженный уровень функционального белка убиквитинлигазы (UPL), более конкретно UPL3, приводят к уменьшению потребности в воде или улучшению устойчивости к засухе указанного растения. Другие примеры трансгенных растений с увеличенной устойчивостью к засухе описаны, например, в US2009/0144850, US2007/0266453, и WO2002/083911. В US2009/0144850 описано растение, имеющее фенотип устойчивости к засухе благодаря измененной экспрессии нуклеиновой кислоты DR02. В US2007/0266453 описано растение, имеющее фенотип устойчивости к засухе благодаря измененной экспрессии нуклеиновой кислоты DR03, и WO 2002/083911 описано растение, имеющее увеличенную устойчивость к засухе благодаря уменьшению активности переносчика ABC, который экспрессируется в замыкающих клетках устьиц. Другим примером является работа Kasuga с соавторами (1999), которая описывает сверхэкспрессию комплементарной ДНК (кДНК), кодирующей DREB1A в трансгенных растениях, что активировало экспрессию многих генов устойчивости к стрессу при нормальных условиях выращивания и привело к улучшению устойчивости к засухе, засолению и замораживанию. Однако экспрессия DREB1A также привела к серьезному замедлению роста при нормальных условиях выращивания (Kasuga (1999) NatBiotechnol 17(3) 287-291).

[000012] В следующих конкретных вариантах хлебные злаки могут быть улучшены путем влияния на конкретные характеристики растений. Это может быть осуществлено, например, путем разработки устойчивых к пестицидам растений, улучшения устойчивости растений к болезням, улучшения устойчивости растений к насекомым и нематодам, улучшения устойчивости растений к паразитарным сорнякам, улучшения устойчивости растений к засухе, улучшения пищевой ценности растений, улучшения устойчивости растений к стрессу, избегания самоопыления, увеличения усвояемости биомассы растительных кормов, увеличения урожайности зерна и т.д. Несколько конкретных неограничивающих примеров предложены в настоящем описании ниже.

[001005] В дополнение к целенаправленному внесению мутаций в одиночные гены, комплексы CRISPR с C2c1 или C2c3 могут быть разработаны для целенаправленного внесения мутаций в множественные гены, делеции хромосомных фрагментов, сайт-специфичной интеграции трансгенов, сайт-направленного мутагенеза in vivo, и точной замены гена или аллеля в растениях. Поэтому способы, описанные в настоящем описании, имеют широкое применение для обнаружения и проверки генов, мутационной и цисгенной селекции, и гибридной селекции. Эти заявки облегчают производство нового поколения генетически модифицированных зерновых культур с различными улучшенными агрономическими характеристиками, такими как устойчивость к гербицидам, устойчивость к болезням, устойчивость к абиотическому стрессу, высокая урожайность и высшее качество.

Использование гена C2c1 или C2c3 для создания мужских стерильных растений

[001006] Гибридные растения, как правило, имеют выгодные агрономические характеристики по сравнению с инбредными растениями. Однако для самоопыляемых растений создание гибридов может быть затруднено. В различных типах растений были определены гены, которые важны для фертильности растений, более конкретно мужской фертильности. Например, для кукурузы было определено, что по меньшей мере два гена важны для фертильности (Amitabh Mohanty International Conference on New Plant Breeding Molecular Technologies Technology Development And Regulation, Oct 9-10, 2014, Jaipur, India; Svitashev et al. Plant Physiol. 2015 Oct; 1.69(2):93 N45; Djukanovic et al. PlantJ. 2013 Dee;76(5):888-99). Способы, описанные в настоящем описании, могут использоваться для нацеливания на гены, необходимые для мужской фертильности, чтобы производить мужские стерильные растения, которые легко скрещиваются с образованием гибридов. В конкретных вариантах осуществления система CRISPRc C2c1 или C2c3, описанная в настоящем описании, используется для целенаправленного мутагенеза цитохром P450-подобного гена (MS26) или гена мегануклеазы (MS45), таким образом, обеспечивая мужскую стерильность растений кукурузы. Растения кукурузы, генетически измененные таким образом, могут использоваться в программах гибридной селекции.

Увеличение фертильной стадии в растениях

[001007] В конкретных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, используются для продления фертильной стадии растения, такого как рис. Например, на ген фертильной стадии риса, такой как Ehd3, можно осуществлять нацеливание для внесения мутации в ген, и всходы могут быть отобраны для длительной регенерации фертильной стадии растения (как описано в CN 104004782).

Использование C2c1 или C2c3 для создания наследственной изменчивости в представляющей интерес культуре

[001008] Доступность дикой гермоплазмы и наследственной изменчивости в хлебных злаках является ключом к программам их улучшения, но доступное разнообразие гермоплазм хлебных злаков ограничено. Настоящее изобретение относится к способам создания разнообразия наследственной изменчивости в представляющей интерес гермоплазме. В этом способе применения систем CRISPR C2c1 или C2c3 предполагается введение в растительные клетки библиотеки направляющих РНК, нацеленных на различные места в геноме растения, вместе с эффекторным белком C2c1 или C2c3. Таким образом, может быть создана коллекция точечных мутаций и генных нокаутов в масштабах размера генома. В конкретных вариантах осуществления способы включают создание части растения или растения из клеток, полученных таким образом, и скрининг клеток в отношении представляющего интерес признака. Гены-мишени могут включать как кодирующие, так и некодирующие участки. В конкретных вариантах осуществления признаком является устойчивость к стрессу, и способ представляет собой способ создания устойчивых к стрессу разновидностей культур.

Использование C2c1 или C2c3 для влияния на созревание фруктов

[001009] Дозревание - нормальная фаза в процессе созревания фруктов и овощей. Спустя только несколько дней после начала дозревания, фрукт или овощ становится несъедобным. Этот процесс приносит значительные убытки для фермеров и потребителей. В конкретных вариантах осуществления способы по настоящему изобретению используются для уменьшения синтеза этилена. Это обеспечивается одним или более из следующих способов: a. подавление экспрессии гена АЦК-синтазы. АЦК (1-аминоциклопропан -l-карбоксильная кислота)-синтаза является ферментом, ответственным за преобразование S-аденозилметионина (SAM) в АЦК; предпоследнему шагу в биосинтезе этилена. Экспрессии фермента затрудняется, когда антисмысловая ("зеркальное отображение") или усеченная копия синтезированного гена вставляется в геном растения, b. Инсерция гена АЦК-дезаминазы. Ген, кодирующий фермент, получен из Pseudomonas chlororaphis, обыкновенной непатогенной почвенной бактерии. Этот фермент преобразовывает AЦК в другое соединение, таким образом, уменьшая количество AЦК, доступного для синтеза этилена; c. Инсерция гена SAM-гидролазы. Этот подход подобен таковому с АЦК-дезаминазой, где синтез этилена прекращается, когда количество предшествующего ему метаболита уменьшается; в этом случае SAM преобразуется в гомосерин. Ген, кодирующий фермент, получен из бактериофага T3 E. coli, и d. Подавление экспрессии гена АЦК-оксидазы. АЦК-оксидаза является ферментом, катализирующим окисление AЦК до этилена, последний шаг в биосинтетическом пути этилена. Используя способы, описанные в настоящем описании, регуляция по типу отрицательной обратной связи гена оксидазы AЦК приводит к подавлению синтеза этилена, таким образом задерживая дозревание фруктов. В конкретных вариантах осуществления, дополнительно или альтернативно к модификациям, описанным выше, способы, описанные в настоящем описании, используются для модификации этиленовых рецепторов, для вмешательства в этиленовые сигналы, получаемые фруктами. В конкретных вариантах осуществления экспрессия гена ETR1, кодирующего связывающий этилен белок, модифицирована, более конкретно - подавлена. В конкретных вариантах осуществления, дополнительно или альтернативно модификациям, описанным выше, способы, описанные в настоящем описании, используются для модификации экспрессии гена, кодирующего полигалактуроназу (PG), которая является ферментом, ответственным за разрушение пектина, вещества, поддерживающего целостность клеточной стенки растительной клетки. Разрушение пектина происходит в начале процесса дозревания, что приводит к размягчению фруктов. Соответственно, в конкретных вариантах осуществления, описанные в настоящем описании способы используются для внесения мутации в ген PG или подавления активации гена PG, чтобы уменьшить количество синтезированного фермента PG, таким образом, замедляя деградацию пектина.

[001010] Таким образом, в конкретных вариантах осуществления способы включают использование системы CRISPR c C2c1 или C2c3 для осуществления одной или более модификаций генома растительной клетки, таких как описано выше, и регенерации растения из этих клеток. В конкретных вариантах осуществления растение является томатом.

Увеличение жизни хранения растений

[001011] В конкретных вариантах осуществления способы по изобретению используют для модификации генов, участвующих в производстве соединений, которые затрагивают срок хранения части растения или растения. Более подробно, модификация вносится в ген, который предотвращает накопление восстанавливающихся сахаров в картофельных клубнях. После высокотемпературной обработки эти восстанавливающиеся сахара реагируют со свободными аминокислотами, что приводит к образованию коричневых продуктов с горьким вкусом и повышенным содержанием акриламида, который является потенциальным канцерогеном. В конкретных вариантах осуществления изобретения способы, описанные в настоящем описании, используют, чтобы уменьшить или препятствовать экспрессии гена вакуолярной инвертазы (VInv), кодирующей белок, который расщепляет сахарозу до глюкозы и фруктозы (Clasen et al. DOI: 10 1111/pbi. 12370).

Использование системы CRISPR C2c1 или C2c3 для обеспечения увеличения ценности

[000013] В конкретных вариантах осуществления система C2c1 или C2c3 CRISPR используется для производства сельскохозяйственных зерновых культур с улучшенными питательными свойствами. В конкретных вариантах осуществления, способы, описанные в настоящем описании, адаптированы для производства "функциональных продуктов", т.е. модифицированных продуктов питания или их ингредиентов, которые могут быть более полезны для здоровья. Кроме традиционных питательных веществ они содержат "нутрицевтик", т.е. вещество, которые можно считать продуктом питания или частью продукта питания, приносящим пользу для здоровья, включая профилактику и лечение заболеваний. В конкретных вариантах осуществления нутрицевтики полезны для предотвращения и/или лечения одного или более типов рака, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний и гипертонии.

[000014] Примеры зерновых культур с улучшенными питательными свойствами включают (Newell-McGloughlin, Plant Physiology, July 2008, Vol. 147, pp. 939-953):

- модифицированное качество белка, содержание и/или аминокислотный состав, которые были описаны для Байя (Luciani et al. 2005, Florida Genetics Conference Poster), канолы (Roesler et al., 1997, Plant Physiol 113 75-81), Кукурузы (Cromwell et al, 1967, 1969 JAnim Sci 26 1325-1331, O'Quin et al. 2000 JAnim Sci 78 2144-2149, Yang et al. 2002, Transgenic Res 11 11-20, Young et al. 2004, Plant J 38 910-922), картофеля (Yu J and Ao, 1997 Acta Bot Sin 39 329-334; Chakraborty et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97 3724-3729; Li et al., 2001 Chin Sci Bull 46 482-484), риса (Katsube et al. 1999, Plant Physiol 120 1063-4074), сои (Dinkins et al. 2001, Rapp 2002, In Vitro Cell Dev Biol Plant 37 742-747), Батата (Egnin. and Prakash 1997, In Vitro Cell Dev Biol 33 52A).

- содержание незаменимых аминокислот, что было описано для канолы (Falco et al. 1995, Bio/Technology 13 577-582), люпина (White et al. 2001, J Sci Food Agric 81 147-154), кукурузы (Lai and Messing, 2002, Agbios 2008 GM crop database (March 11, 2008)), картофеля (Zeh et al. 2001, Plant Physiol 127 792-802), сорго (Zhao et al. 2003, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 413-416), Сои (Falco et al. 1995 Bio/Technology 13 577-582; Galdi et al. 2002 Crit Rev Plant Sci 21:167-204).

- Масла и жирные кислоты, такие как для канолы (Dehesh et al. (1996) Plant J 9 167-172 [PubMed]; Del Vecchio (1996) INFORM International News on Fats, Oils and Related Materials 7 230-243; Roesler et al. (1997) Plant Physiol 113 75 81 [PMC free article] [PubMed]; Froman and Ursin (2002, 2003) Abstracts of Papers of The American Chemical Society 223 U35; James et al. (2003) Am J Clin Nutr 77 1140-1145 [PubMed]; Agbios (2008, выше), хлопка (Chapman et al. (2001). J Am. OH Chem. Soc 78 941-947; Liu et al. (2002) J Am Coll Nutr 21 205S-21 IS [PubMed]; O'Neill (2007) Australian Life Scientist http://www.biotechnews.com.au/index.php/id;866694817;fp;4;fpid;2 (June 17, 2008), льна (Abbadi et al., 2004, Plant Cell 16: 2734-2748), кукурузы (Young et al., 2004, Plant J 38 910-922), масличной пальмы (Jalani et al. 1997, J Am Oil Chem Soc 74 1451 1455; Parveez, 2003, AgBiotechNet 113 1-8), Риса (Anai et al., 2003, Plant Cell Rep 21 988-992), Сои (Reddy and Thomas, 1996, Nat Biotechnol 14 639-642; Kinney and Kwolton, T9Q8. Blackie Academic and Professional, London, pp 193-213), подсолнечника (Arcadia, Biosciences 2008).

- Углеводы, такие как фруктаны, описанные для цикория (Smeekens (1997) Trends Plant Sci 2 286-287, Sprenger et al. (1997) FEBS Lett 400 355-358, Sévenier et al. (1998) Nat Biotechnol 16 843-846), кукурузы (Caimi et al. (1996) Plant Physiol 110 355-363), картофеля (Hellwege et al.,1997 Plant J 12 1057-1065), сахарной свеклы (Smeekens et al. 1997, above); инулин, как описано для картофеля (Hellewege et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97 8699-8704), крахмал, как описано для риса (Schwall et al. (2000) Nat Biotechnol 18 551-554, Chiang et al. (2005) Mol Breed 15 125-143).

- Витамины и каратиноиды, как описано для канолы (Shintani and DellaPenna (1998) Science 282 2098-2100), кукурузы (Rocheford et al. (2002) J Am Coll Nutr 21 191S-198S, Cahoon et al. (2003) Nat Biotechnol 21 1082-1087, Chen et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100 3525-3530), горчичного семени (Shewmaker et al. (1999) Plant J 20 401- 412), картофеля (Ducreux et al., 2005, J Exp Bot 56 81-89), Риса (Ye et al. (2000) Science 287 303-305), клубники (Agius et al. (2003), Nat Biotechnol 21 177-181), томата (Rosati et al. (2000) Plant J 24 413-419, Fraser et al. (2001) J Sci Food Agric 81 822-827, Mehta et al. (2002) Nat Biotechnol 20 613-618, Diaz de la Garza et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101 13720-13725, Enfissi et al. (2005) Plant Biotechnol J 3 17-27, DellaPenna (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104 3675-3676).

- Функциональные вторичные метаболиты, такие как описаны для яблока (стильбены, Szankowski et al. (2003) Plant Cell Rep 22: 141-149), люцерны (ресвератрол, Hipskind and Paiva (2000) Mol Plant Microbe Interact 13 551-562), киви (ресвератрол, Kobayashi et al. (2000) Plant Cell Rep 19 904-910), кукурузы и сои (флавоноиды, Yu et al. (2000) Plant Physiol 124 781-794), картофеля (антоцианы, алкалоиды и гликоиды, Lukaszewicz et al. (2004) J Agric Food Chem. 52 1526-1533), риса (флавоноиды и ресвератрол, Stark-Lorenzen et al. (1997) Plant Cell Rep 16 668-673, Shin et al. (2006) Plant Biotechnol J 4 303-315), томата (ресвератрол, хлорогеновая кислота, флавоноиды, стильбены, Rosati. et al. (2000) above, Muir et al. (2001) Nature 19 470-474, Niggeweg et al. (2004) Nat Biotechnol 22 746-754, Giovinazzo et al. (2005) Plant Biotechnol J 3 57-69), пшеницы (кофейная и феруловая кислоты, ресвератрол, United Press International (2002)); и

- Минеральные вещества, такие как описаны для люцерны (фитаза, Austin-Phillips et al. (1999) http://www.molecularfarming.com/nonmedical.html), салата-латука (железо, Goto et al. (2000) TheorApplGenet 100 658-664), риса (железо, Lucca et al. (2002) JAmCollNutr 21 184S-190S), кукурузы, сои и пшеницы (фитаза, Drakakaki et al. (2005) Plant Mol Biol 59 869-880, Denbow et al. (1998) Poult Sci 77 878-881, Brinch-Pedersen et al. (2000) Mol Breed 6 195-206).

[000015] В конкретных вариантах осуществления признак повышения ценности связан с предусматриваемой пользой для здоровья соединений, присутствующих в растении. Например, в конкретных вариантах осуществления, культура с добавленной стоимостью получена с применением способов по изобретению для модификации или индукции/увеличения синтеза одного или более следующих соединений:

- Каротиноиды, такие как α-каротин, содержащийся в моркови, который нейтрализует свободные радикалы, которые могут наносить ущерб клеткам, или β-каротин, содержащийся в различных фруктах и овощах, который нейтрализует свободные радикалы

- Лютеин, содержащийся в зеленых овощах, который способствует поддержанию здорового зрения

- Ликопин, содержащийся в томатах и продуктах из томатов, который, как считается, снижает риск рака предстательной железы

- Зеаксантин, содержащийся в цитрусовых и кукурузе, который способствует поддержанию здорового зрения

- Диетические волокна, такие как нерастворимые волокна, содержащиеся в пшеничных отрубях, которые могут снижать риск рака молочной железы и/или рака толстой кишки и β-глюканы, содержащиеся в овсяном зерне, растворимые волокна, содержащиеся в Psylium и цельных зерновых культурах, которые могут снижать риск сердечно-сосудистых заболеваний (CVD)

- Жирные кислоты, такие как ω-3-жирные кислоты, которые могут снижать риск сердечно-сосудистых заболеваний и улучшать умственные и зрительные функции, Конъюгированная линолевая кислота, которая может улучшать форму тела, снижать риск развития некоторых видов рака и GLA, который может снижать риск воспаления при злокачественной опухоли и сердечно-сосудистых заболеваниях (CVD), может улучшать форму тела

- Флавоноиды, такие как гидроксициннаматы, содержащиеся в пшенице, могут иметь Антиокcидантную активность, снижать риск дегенеративных заболеваний, флавонолы, катехины и танины, содержащиеся во фруктах и овощах, нейтрализуют свободные радикалы и могут снижать риск рака

- Глюкозинолаты, индолы, изотиоцианаты, такие как сульфорафан, содержащийся в Крестоцветных овощах (брокколи, листовой капусте), хрене, которые нейтрализуют свободные радикалы, могут снижать риск рака

- Фенолы, такие как стильбены, содержащиеся в винограде, могут снижать риск дегенеративных заболеваний, заболеваний сердца, а также рака, могут положительно влиять на продолжительность жизни, кофейная кислота и ферульная кислота, содержащиеся в овощах и цитрусовых, имеют подобную антиоксидантную активность, могут снижать риск дегенеративных заболеваний, заболеваний сердца, и заболеваний глаз и эпикатехин, содержащийся в какао, имеет подобную антиоксидантную активность, может снижать риск дегенеративных заболеваний и заболеваний сердца

- Растительные станолы/стерины, содержащиеся в кукурузе, сое, пшенице и деревянных маслах, которые могут снижать риск ишемической болезни сердца, понижая уровень холестерина в крови

- Фруктаны, инулины, фруктоолигосахариды, содержащиеся в топинамбуре, луке-шалоте, луковом порошке, который может улучшать здоровье желудочно-кишечного тракта

- Сапонины, содержащиеся в сое, могут понижать уровень холестерина ЛПНП

- Белок сои, содержащийся в сое, может снижать риск заболеваний сердца

- Фитоэстрогены, такие как изофлавоны, содержащиеся в сое, могут уменьшать симптомы менопаузы, такие как приливы, могут снижать риск развития остеопороза и сердечно-сосудистых заболеваний (CVD) и лигнаны, содержащиеся во льне, ржи и овощах, могут защищать от заболеваний сердца и некоторых случаев рака, могут понижать холестерин ЛПНП, общий холестерин.

- Сульфиды и тиолы, такие как диаллилсульфид, содержащийся в луке, чесноке, маслинах, луке-порее, и сквален и аллилметилтрисульфид, дитиолтионы, содержащиеся в крестоцветных овощах, которые могут понижать уровень холестерина ЛПНП, помогают поддерживать здоровье иммунной системы

- Танины, такие как проантоцианидины, содержащиеся в клюкве, какао, могут улучшать здоровье мочевых путей, снижать риск развития сердечно-сосудистых заболеваний (CVD) и высокого кровяного давления

- и т.д.

[0016] Кроме того, способы по изобретению также предусматривают модификацию функциональности белка/крахмала, срока годности, вкуса/эстетических характеристик, качества волокон и аллергенов, антинутриентов и признаки снижения содержания токсинов.

[000017] Соответственно, изобретение охватывает способы производства растений с увеличенной питательной ценностью, причем указанные способы включают введение в растительную клетку гена, кодирующего фермент, вовлеченный в синтез компонента увеличенной питательной ценности, с использованием системы CRISPR C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, и регенерации растения из указанной растительной клетки, где указанное растение характеризуется увеличением экспрессии указанного компонента увеличенной питательной ценности. В конкретных вариантах система CRISPRC2c1 или C2c3 используется для модификации эндогенного синтеза этих соединений косвенно, например, модификации одного или более транскрипционных факторов, управляющих метаболизмом этого соединения. Способы введения интересующего гена в растительную клетку и/или модификации эндогенного гена с использованием системы CRISPRC2c1 или C2c3 описаны в настоящем описании выше.

[000018] Некоторые конкретные примеры модификаций в растениях, которые были модифицированы для приобретения признака увеличенной ценности включают: растения с модифицированным метаболизмом жирных кислот, например, путем трансформации растения с антисмысловым геном стеарил-ACP-десатуразы для увеличения содержания стеариновой кислоты в растении. См. Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (1992). Другой пример включает уменьшение содержания фитата, например путем клонирования и затем повторного ввода ДНК, ассоциированной с единственным аллелем, которая может быть ответственным за мутантов кукурузы, характеризуемых низкими уровнями фитиновой кислоты. См. Raboy et al, Maydica 35:383 (1990).

[001012] Аналогично экспрессия генов кукурузы (Zea mays) Tfs C1 и R, которые регулируют производство флавоноидов в алейроновых слоях кукурузы под контролем сильного промотора, привела к высокой скорости накопления антоцианинов в арабидопсисе (Arabidopsisthaliana), предположительно посредством активации всего пути (Bruce et al., 2000, PlantCell 12:65-80). DellaPenna (Welsch et al., 2007 AnnaRevPlantBiol 57: 711-738) обнаружил, что Tf RAP2.2 и взаимодействующий с ним SINAT2, увеличивали каротиногенез в листьях Арабидопсиса. Экспрессия Tf Dof1 вызвало-регулирование генов, кодирующих для синтеза углеродного скелета, заметный рост содержания аминокислот и сокращение уровня Glc в трансгенном Арабидопсисе (Yanagisawa, 2004 PlansCellPhysiol 45: 386-391), и DOF Tf AtDof1.1 (OBP2) интенсифицировал все шаги глюкозинолатного биосинтетического пути в Арабидопсисе (Skirycz et al., 2006 Plant J 47: 10-24).

Уменьшение содержания аллергенов в растениях

[001013] В конкретных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, используют, чтобы произвести растения со сниженным уровнем аллергенов, делая их более безопасными для потребителя. В конкретных вариантах осуществления способы включают модификацию экспрессии одного или более генов, ответственных за производство аллергенов растения. Например, в конкретных вариантах осуществления способы включают понижающую регуляцию экспрессии гена Lolp5 в растительной клетке, такой как растительная клетка райграсса и регенерирующее из нее растение, чтобы уменьшить аллергенность пыльцы указанного растения (Bhalla et al. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96: 1.1.676-11680).

[001014] Аллергия на арахис и аллергия на бобовые в общем являются реальной и серьезной медицинской проблемой. Система эффекторного белка C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению может использоваться для идентификации, а затем редактирования или подавления генов, кодирующих аллергенные белки таких бобовых. Не ограничиваясь такими генами и белками, Nicolaou et al. идентифицировали аллергенные белки в арахисе, сое, чечевице, горохе, люпине, зеленой фасоли и бобах мунг. См., Nicolaou et al., Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2011; 11 (3):222).

Способы скрининга представляющих интерес эндогенных генов

[001015] Способы, описанные в настоящем описании, далее позволяют проводить идентификацию ценных генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в производство компонентов увеличенной питательной ценности или в целом генов, затрагивающих представляющие интерес агрономические признаки, среди видов, типов и всего царства растений. Посредством выборочного нацеливания, например, на гены, кодирующие ферменты метаболических путей в растениях с использованием системы CRISPRC2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, могут быть определены гены, ответственные за определенные пищевые аспекты растения. Точно так же, посредством выборочного нацеливания на гены, которые могут затрагивать желательную агрономическую характеристику, могут быть определены соответствующие гены. Соответственно, настоящее изобретение охватывает способы скрининга генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в синтез соединений с определенной питательной ценностью и/или агрономическими признаками.

Следующие применения системы CRISPR C2c1 или C2c3 в растениях и дрожжах

Использование системы CRISPR C2c1 или C2c3 при производстве биотоплива

[001016] Под термином "биотопливо" в настоящем описании понимается альтернативное топливо, полученное из растений и других растительных ресурсов. Возобновляемое биотопливо может быть извлечено из органического вещества, энергия которого была запасена в ходе процесса фиксации углерода или получена посредством использования или конверсии биомассы. Эта биомасса может быть использована в качестве биотоплива или может быть переведена в форму удобных содержащих энергию веществ за счет термической, химической или биохимической переработки. Такая переработка позволит получить топливо в твердой, жидкой или газообразной форме. Существует два типа биотоплива: биоэтанол и биодизель. Биоэтанол получают в основном путем сбраживания углеводов - целлюлозы (крахмала), получаемых главным образом из кукурузы и сахарного тростника. Биодизель, с другой стороны, производится главным образом из масличных культур, таких как рапс, масличная пальма и соя. Биотопливо используется, главным образом, в качестве топлива для транспортных средств.

Улучшение свойств растения для производства биотоплива

[001017] В конкретных вариантах осуществления способы с использованием системы CRISPR C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, используют для изменения свойств клеточной стенки с целью облегчения доступа ключевых агентов гидролиза и более эффективного высвобождения сахаров, используемых для брожения. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть модифицирован биосинтез целлюлозы и/или лигнина. Целлюлоза является главным компонентом клеточной стенки. Биосинтез целлюлозы и лигнина регулируются согласованно. Уменьшая долю лигнина в растении можно увеличить долю целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в настоящем описании способы используются для снижения уровня биосинтеза лигнина в растении с целью увеличения доли сбраживаемых углеводов. Конкретнее, способы, описанные в настоящем описании, используются для снижения активности по меньшей мере первого гена биосинтеза лигнина, выбранного из группы, состоящей из 4-кумарат-3-гидроксилазы (C3H), фенилаланинаммонийлиазы (PAL), циннамат-4-гидроксилазы (C4H), гидрокслициннамоилттрансферазы (HCT), O-метилтрансферазы кофейной кислоты (COMT), коффеоил-КоA-3-O-метилтрансферазы (CCoAOMT), ферулат-5-гидроксилазы (F5H), дегидрогеназы циннамилового спирта (CAD), циннамоил-КоA-редуктазы (CCR), 4-кумароат-КоA-лигазы (4CL), монолигнол-лигнин-специфической гликозилтрансферазы и альдегиддегидрогеназы (ALDH), как описано в WO 2008064289 A2.

[001018] В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в настоящем описании способы используются для производства биомассы растения, образующей более низкие уровни уксусной кислоты при сбраживании (см. также WO 2010096488). Более конкретно, способы, описанные в настоящем описании, используют для внесения мутаций в гомологи CasIL для снижения ацетилирования полисахаридов.

Модификация дрожжей для производства биотоплива

[001019] В конкретных вариантах осуществления изобретения предлагаемый фермент C2c1 или C2c3 используется для производства биоэтанола в рекомбинантных микроорганизмах. Например, ферменты C2c1 или C2c3 могут быть использованы для получения микроорганизмов, таких как дрожжи, для производства биотоплива или биополимеров из сбраживаемых сахаров и, возможно, для разложения лигноцеллюлозы, полученной из растений, извлеченных из отходов сельского хозяйства в качестве источника сбраживаемых сахаров. Конкретнее, изобретение относится к способам, в которых комплекс CRISPR C2c1 или C2c3 используется для внесения в микроорганизмы чужеродных генов, необходимых для синтеза биотоплива, и/или изменения эндогенных генов, которые могут препятствовать синтезу биотоплива. Более конкретно, такие способы подразумевают введение в микроорганизм, такой как дрожжи, одной или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты, участвующие в преобразовании пирувата в этанол или иной целевой продукт. В определенных вариантах осуществления такие способы обеспечивают стимуляцию экспрессии одного или более ферментов, позволяющих микроорганизмам разлагать целлюлозу, таких как целлюлаза. В других последующих вариантах осуществления нацеленный на РНК комплекс CRISPR, используется, чтобы подавить эндогенные метаболические процессы, конкурирующие с процессом производства биотоплива.

[001020] Соответственно, в более конкретных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, используются, чтобы модифицировать микроорганизм следующим образом:

[001021] введение по меньшей мере одной гетерологичной нуклеиновой кислоты или увеличение экспрессии по меньшей мере одной эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, разрушающий клеточную стенку растений, чтобы указанный микроорганизм был способен к экспрессии указанной нуклеиновой кислоты и к синтезу и секреции указанного фермента, разрушающего клеточную стенку растений;

[001022] введение по меньшей мере одной гетерологичной нуклеиновой кислотой или увеличение экспрессии по меньшей мере одной эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, который преобразует пируват в ацетальдегид, необязательно объединенный по меньшей мере с одной гетерологичной нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент, который преобразует ацетальдегид в этанол так, чтобы указанная клетка-хозяин была способна к экспрессии указанной нуклеиновой кислоты; и/или

[001023] модификация по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент в метаболическом пути в указанной клетке-хозяине, где указанный путь производит метаболит кроме ацетальдегида из пирувата или этанола из ацетальдегида, и где указанная модификация приводит к уменьшению производства указанного метаболита, или введение по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей ингибитор указанного фермента.

Модификация водорослей и растений для производства растительных масел или биотоплива

[1024] Трансгенные водоросли или другие растения, такие как рапс, могут быть особенно востребованы при производстве растительных масел или биотоплива, например, такого как спирты (особенно метанол и этанол). Они могут быть целенаправленно разработаны для экспрессии или сверхэкспрессии больших объемов масел или спиртов для использования в отраслях промышленности, связанных с нефтью или биотопливом.

[001025] Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения, система CRISPR C2c1 или C2c3 используется для производства богатых липидами диатомовых водорослей, полезных в производстве биотоплива.

[001026] В конкретных вариантах осуществления предусматривается специфическая модификация генов, которые вовлечены в модификацию количества липидов и/или качества липидов, произведенных клеткой водоросли. Примеры генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в пути синтеза жирных кислот, могут кодировать белки, имеющие, например, ацетил-КoA-карбоксилазу, синтазу жирных кислот, 3-кетоацил-ацил-переносящий белок-синтазу III, глицерол-3-фосфат дегидрогеназу (G3PDH), еноил-ацил-переносящий белок-редуктазу, глицерол-3-фосфат-ацилтрансферазу, лизофосфатид-ацилтрансферазу или диацилглицерол-ацилтрансферазу, фосфолипид:диацилглицерол-ацилтрансферазу, фосфатидат-фосфатазу, тиоэстеразу жирных кислот, такие тиоэстераза пальмитоил-белка или ферментативная активность в отношении яблочной кислоты. В дальнейших вариантах осуществления изобретения предусматривается создать диатомовые водоросли, в которых увеличено накопление липидов. Это может быть достигнуто посредством нацеливания на гены, уменьшающие катаболизм липидов. Особенный интерес для использования в способах по настоящему изобретению представляют гены, вовлеченные в активацию как триацилглицерина, так и свободных жирных кислот, а также гены, непосредственно вовлеченные в β-окисление жирных кислот, такие как ацил-КоА-синтетаза, 3-кетоацил-КоА-тиолаза, активность ацил-КоА-оксидазы и фосфоглюкомутаза. Система CRISPR C2c1 или C2c3 и способы, описанные в настоящем описании, могут использоваться для специфической активации таких генов в диатомовых водорослях для повышения содержания в них липидов.

[001027] Организмы, такие как дрожжи и микроводоросли, широко используются в синтетической биологии. Stovicek et al. (Metab.Eng. Comm., 2015; 2:13) описывают редактирование генома промышленных дрожжей, например Saccharomyces cerevisae, для эффективного создания устойчивых штаммов в целях промышленного производства. Stovicek использовал кодон-оптимизированную систему CRISPR-Cas9 для дрожжей, чтобы одновременно производить как разрыв аллели эндогенного гена, так и нокин гетерологичного гена. Cas9 и гРНК экспрессировали в геномных или эписомальных положениях на векторе. Авторы также показали, что эффективность разрушения гена может быть улучшена путем оптимизации уровней экспрессии Cas9 и гРНК. Hlavova et al. (Biotechnol, Adv., 2015) описали развитие видов или штаммов микроводорослей с использованием таких способов, как CRISPR, для нацеливания на ядерные и хлоропластные гены в целях инсерционного мутагенеза и скрининга. Те же самые плазмиды и векторы могут быть применены к системам C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению.

[001028] В US 8945839 описан способ модификации способами инженерии вида микроводорослей (клетки Chlamydomonas reinhardtii) с использованием Cas9. Используя подобную технику, способы с использованием описанной в настоящем описании системы CRISPR C2c1 или C2c3 могут быть применены для видов рода Chlamydomonas и других водорослей. В определенных вариантах осуществления изобретения белок C2c1 или C2c3 и направляющая(ие) РНК введены в водоросли, в которых они экспрессируются, с использованием вектора экспрессии белка C2c1 или C2c3 под контролем конститутивного промотора, такого как Hsp70A-Rbc S2 или бета-2-тубулина. Направляющая РНК необязательно может быть доставлена с использованием вектора, содержащего промотор T7. Альтернативно этому, в клетки водоросли может быть досталвена мРНК C2c1 или C2c3 и транскрибированная in vitro направляющая РНК. Квалифицированному специалисту доступны протоколы электропорации, в том числе стандартный рекомендуемый протокол из набора GeneArt Chlamydomonas Engineering kit.

Использование C2c1 или C2c3 для создания микроорганизмов, способных производить жирные кислоты

[001029] В конкретных вариантах осуществления способы по изобретению используются для создания генетически модифицированных микроорганизмов, способных к производству сложных эфиров жирных кислот, таких как сложные метиловые эфиры жирных кислот ("FAME") и этиловые эфиры жирных кислот ("FAEE").

[001030] Как правило, клетки-хозяева могут быть сконструированы для производства сложных эфиров жирных кислот из источника углерода, такого как спирт, находящегося в среде, посредством экспрессии или сверхэкспрессии гена, кодирующего тиоэстеразу, гена, кодирующего ацил-КоА-синтазу, и гена, кодирующего синтазу сложного эфира. Соответственно, способы, описанные в настоящем описании, используются для модификации микроорганизмов, чтобы сверхэкспрессировать или ввести ген тиоэстеразы, ген, кодирующий ацил-КоА-синтазу, и ген, кодирующий синтазу сложного эфира. В конкретных вариантах осуществления ген тиоэстеразы отобран из tesA, 'tesA, tesB, fatB, fatB2, fatB3, fatA1 или fatA. В конкретных вариантах осуществления ген, кодирующий афил-КоА-синтазу, отобран из fadDJadK, BH3103, pf1-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa39, или идентифицированного гена, кодирующего фермент, имеющий те же самые свойства. В конкретных вариантах осуществления ген, кодирующий синтазу сложного эфира, является геном, кодирующим синтазу/ацил-КоА:диацилглицерил-ацилтрансферазу из Simmondsiachinensis, Acinetobacter sp. ADP, Alcanivoraxborkumensis, Pseudomonasaeruginosa, Fundibacterjadensis, Arabidopsisthaliana, или Alkaligeneseutrophus или их вариант. Дополнительно или альтернативно, способы, описанные в настоящем описании, используются для уменьшения экспрессии в указанном микроорганизме по меньшей мере одного из гена, кодирующего ацил-КоА-дегидрогеназу, гена, кодирующего белковый рецептор внешней мембраны, и гена, кодирующего транскрипционный регулятор биосинтеза жирных кислот. В конкретных вариантах осуществления один или более из этих генов инактивированы, например, внесением мутации. В конкретных вариантах осуществления ген, кодирующий ацил-КоА-дегидрогеназу, представляет собой fadE. В конкретных вариантах осуществления ген, кодирующий транскрипционный регулятор биосинтеза жирных кислот, кодирует репрессор транскрипции ДНК, например, fabR.

[001031] Дополнительно или альтернативно, указанный микроорганизм модифицирован, чтобы уменьшить экспрессию по меньшей мере одного гена, кодирующего, пируват-формиат-лиазу, гена, кодирующего лактат-дегидрогеназу или обоих этих генов. В конкретных вариантах осуществления ген, кодирующий пируват-формиат-лиазу, представляет собой pflB. В конкретных вариантах осуществления ген, кодирующий лактат-дегидрогеназу, является IdhA. В конкретных вариантах осуществления один или более из этих генов инактивированы, например, введением в них мутации.

[001032] В конкретных вариантах осуществления микроорганизм выбирается из следующих родов: Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Synechococcus, Synechoystis, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trameles, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia или Streptomyces.

Использование C2c1 или C2c3 для создания микроорганизмов, способных производить органические кислоты

[001033] Способы, описанные в настоящем описании, далее используются для конструирования способами инженерии микроорганизмов, способных производить органические кислоты, более конкретно, из пентозных или гексозных сахаров. В конкретных вариантах осуществления способы включают введение в микроорганизм экзогенного гена LDH. В конкретных вариантах осуществления производство органических кислот в указанных микроорганизмах дополнительно или альтернативно увеличено путем инактивации эндогенных генов, кодирующих белки, вовлеченные в эндогенный метаболический путь, который производит метаболит кроме представляющей интерес органической кислоты, и/или где эндогенный метаболический путь использует органическую кислоту. В конкретных вариантах осуществления модификация гарантирует, что производство метаболита кроме представляющей интерес органической кислоты уменьшено. Согласно конкретным вариантам, способы используются для внесения по меньшей мере одной внесенной способами инженерии делеции в ген и/или инактивации эндогенного пути, в котором органическая кислота используется или ген кодирует продукт, вовлеченный в эндогенный путь, производящий метаболит кроме интересующей органической кислоты. В конкретных вариантах осуществления эта по меньшей мере одна искусственно созданная делеция в гене или инактивация находятся в одном или более генах, кодирующих фермент, отобранный из группы, состоящей из пируват-декарбоксилазы (pdc), фумарат-редуктазы, алкогольдегидрогеназы(adh), ацетальдегиддегидрогеназы, фосфоенолпируват-карбоксилазы (ppc), D-лактат-дегидрогеназы (d-ldh), L-лактат-дегидрогеназы (l-ldh), лактат-2-монооксигеназы. В дальнейших вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна внесенная способами инженерии делеция и/или инактивация гена находятся в эндогенном гене, кодирующем пируват-декарбоксилазу (pdc).

[001034] В дальнейших вариантах осуществления изобретения микроорганизм сконструирован для производства молочной кислоты, и по меньшей мере одна внесенная способами инженерии генная делеция и/или инактивация находится в эндогенном гене, кодирующем лактат-дегидрогеназу. Дополнительно или альтернативно, микроорганизм включает по меньшей мере одну внесенную способами инженерии делецию или инактивацию гена в эндогенном гене, кодирующем цитохром-зависимую лактат-дегидрогеназу, такую как цитохром B2-зависимая L-лактат-дегидрогеназа.

Использование C2c1 или C2c3 для создания улучшенных использующих ксилозу или целлобиозу штаммов дрожжей

[001035] В конкретных вариантах осуществления система CRISPR C2c1 или C2c3 может быть применена для отбора улучшенных использующих ксилозу или целлобиозу штаммов дрожжей. ПЦР пониженной точности может использоваться для амплификации одного (или более) генов, участвующих в путях утилизации ксилозы или путях утилизации целлобиозы. Примеры генов, вовлеченных в пути утилизации ксилозы или пути утилизации целлобиозы, могут включать, но не ограничиваться ими, пути, описанные в Ha, S.J. et al. (2011) Proc. Natl Acad. Sci. USA 108(2):504-9 and Galazka, J.M., et al. (2010) Science 330(6000):84-6. Полученные библиотеки молекул двухцепочечной ДНК, каждая из которых включает случайную мутацию в таком отобранном гене, может быть ко-трансформирована с компонентами системы CRISPR C2c1 или C2c3 в штамм дрожжей (например, S288C), и могут быть отобраны штаммы с повышенной способностью утилизировать ксилозу или целлобиозу, как описано в WO2015138855.

Использование C2c1 или C2c3 в создании улучшенных штаммов дрожжей для биосинтеза изопреноидов

[001036] Tadas Jakociunas et al. описал успешное применение мультиплексной системы CRISPR/Cas9 для конструирования способами геномной инженерии до 5 различных геномных локусов за один шаг трансформации в пекарских дрожжах Saccharomyces cerevisiae (Metabolic Engineering Volume 28, March 2015, Pages 213 -222), что привело к созданию штаммов с высоким производством мевалоната, ключевого промежуточного соединения промышленно важного пути биосинтеза изопреноидов. В конкретных вариантах осуществления система CRISPR C2c1 или C2c3 может быть применена в мультиплексном способе геномной инженерии, как описано в настоящем описании, для идентификации дополнительных высокопроизводительных штаммов дрожжей для применения в синтезе изопреноидов.

Использование C2c1 или C2c3 для создания производящих молочную кислоту штаммов дрожжей

[001037] Другой вариант осуществления изобретения охватывает успешное применение мультиплексной системы C2c1 или C2c3 CRISPR. По аналогии с Vratislav Stovicek et al. (Metabolic Engineering Communications, Volume 2, December 2015, Pages 13-22), улучшенные производящие молочную кислоту штаммы могут быть разработаны и получены путем единственного трансформационного события. В конкретном варианте система C2c1 или C2c3 CRISPR используется для одновременной инсерции гетерологичного гена лактат-дегидрогеназы и разрушение двух эндогенных генов PDC1 и PDC5.

Следующие применения системы CRISPR C2c1 или C2c3 в растениях

[001038] В конкретных вариантах осуществления система CRISPR, и предпочтительно система CRISPR C2c1 или C2c3, описанная в настоящем описании, может использоваться для визуализации динамики генетических элементов. Например, с помощью CRISPR можно визуализировать как повторяющиеся, так и неповторяющиеся геномные последовательности, изменение длины теломеры и движения теломеры и отслеживать динамику генных локусов на протяжении клеточного цикла (Chen et al., Cell, 2013). Эти способы также могут быть применены к растениям.

[001039] Другие применения системы CRISPR, и предпочтительно системы CRISPR C2c1 или C2c3, описанной в настоящем описании, заключаются в скрининге для положительного отбора целевого разрушения гена in vitro и in vivo (Malina et al.., Genes and Development, 2013). Эти способы также могут быть применены к растениям.

[001040] В конкретных вариантах осуществления слияние инактивированных эндонуклеаз C2c1 или C2c3 с ферментами модификации гистонов может вносить направленные изменения в сложный эпигеном (Rusk et al., Nature Methods, 2014). Эти способы также могут быть применены к растениям.

[001041] В конкретных вариантах осуществления система CRISPR, и предпочтительно система CRISPR C2c1 или C2c3, описанная в настоящем описании, может использоваться для очищения конкретной части хроматина и определения связанных белков, чтобы выяснить их регуляторные роли в транскрипции (Waldrip et al., Epigenetics, 2014). Эти способы также могут быть применены к растениям.

[001042] В конкретных вариантах осуществления изобретения предполагается его использование в качестве терапии для удаления вирусов из растительных систем, поскольку оно позволяет расщеплять как вирусную ДНК, так и вирусную РНК. Предыдущие исследования, проведенные для систем человека, продемонстрировали успешное использование CRISPR для нацеливания на вирус гепатита С, содержащий одноцепочечную РНК (A. Price, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 2015), а также на вирус гепатита B, содержащий двухцепочечную ДНК (V. Ramanan, et al., Sci. Rep, 2015). Эти способы могут также быть адаптированы для использования нацеленной на РНК системы CRISPR в растениях.

[001043] В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение может использоваться для изменения сложности генома. В следующем конкретном варианте система CRISPR, и предпочтительно система CRISPR C2c1 или C2c3, описанная в настоящем описании, может использоваться, для разрушения или изменения числа хромосом и создания гаплоидных растений, которые содержат хромосомы только от одного родителя. В таких растениях можно индуцировать дупликацию хромосом с преобразованием в диплоидные растения, содержащие только гомозиготные аллели (Karimi-Ashtiyani et al., PNAS, 2015; Anton et al. Nucleus, 2014). Эти способы могут также быть применены к растениям.

[001044] В конкретных вариантах осуществления система CRISPR C2c1 или C2c3, описанная в настоящем описании, может использоваться для саморасщепления. В этих вариантах осуществления изобретения промотор фермента C2c1 или C2c3 и гРНК может быть конститутивным промотором, и вторая гРНК вводится в составе той же самой кассеты трансформации, но управляется индуцибельным промотором. Эта вторая гРНК может быть сконструирована, чтобы вызывать специфическое расщепление в гене C2c1 или C2c3 с образованием нефункционального C2c1 или C2c3. В следующем конкретном варианте вторая гРНК вызывает расщепление на обоих концах кассеты трансформации, что приводит к удалению кассеты из генома хозяина. Эта система предлагает контролируемую продолжительность воздействия фермента Cas на клетку и далее минимизирует нецелевое редактирование. Кроме того, расщепление обоих концов кассеты CRISPR/Cas может использоваться для производства свободных от трансгена растений T0 с биаллельными мутациями (как описано для Cas9, например, Moore et al., NucleicAcidsResearch, 2014; Schaeffer et al., PlantScience, 2015). Способы Moore et al. могут быть применены к системам CRISPR C2c1 или C2c3, описанным в настоящем описании.

[001045] Sugano et al. (Plant Cell Physiol. 2014 Mar;55(3):475-81. doi: 10.1093/pcp/pcu014. Epub 2014 Jan 18) сообщает о применении CRISPR-Cas9 для направленного мутагенеза печеночника Marchantiapolymorpha L., который стал использоваться как модель для экспериментов для изучения эволюции высших растений. Промотор U6 M. polymorpha идентифицировали и клонировали для экспрессии гРНК. Последовательность, являющаяся мишенью гРНК, была разработана для нарушения работы гена, кодирующего фактор ауксина 1 (ARF1) у M. polymorpha. Используя трансформацию при помощи Agrobacterium, Sugano et al. получили устойчивые мутанты в фазе гаметофита для M. polymorpha. При использовании CRISPR-Cas9 сайт-направленный мутагенез in vivo был получен с помощью промотора мозаики цветной капусты 35S или промотора M. polymorphaEF1α для экспрессии Cas9. Изолированные мутантные индивидуумы, демонстрирующие ауксин-устойчивый фенотип, не были химерами. Более того, стабильные мутанты были получены путем бесполого размножения растений T1. Многочисленные аллели arf1 легко получали с использованием направленного мутагенеза на основе системы CRIPSR/Cas9. Способы Sugano et al. могут быть использованы для системы эффекторных белков C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению.

[001046] Kabadi et al. (Nucleic Acids Res. 2014 Oct 29;42(19):e147. doi: 10.1093/nar/gku749. Epub 2014 Aug 13) разработали единую лентивирусную систему, чтобы экспрессировать вариант Cas9, ген-репортер и до четырех sg-РНК с независимых промоторов РНК-полимеразы III, которые включены в вектор с помощью достаточно удобного способа клонирования GoldenGate. Каждая sg-РНК была эффективно экспрессирована и может опосредовать редактирование мультиплексного гена и устойчивую активацию транскрипции в иммортализованных и первичных клетках человека. Способы Kabadi et al. могут быть использованы для системы эффекторных белков C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению.

[001047] Ling et al. (BMC Plant Biology 2014, 14: 327) разработали бинарный векторный набор CRISPR-Cas9 на основе каркаса pGreen или pCAMBIA, а также гРНК. Этот набор инструментов не требует каких-либо дополнительных ферментов рестрикции помимо ВsaI для создания конечных конструкций с высокой эффективностью всего за одну стадию клонирования. Этот инструментарий был подтвержден с использованием протопластов кукурузы, трансгенных линий кукурузы и трансгенных линий Arabidopsis и, как было показано, демонстрирует высокую эффективность и специфичность воздействия. Однако, что видится еще более важным, с использованием этого инструментария были обнаружены направленные мутации трех генов Arabidopsis в трансгенных ростках поколения T1. Более того, мутации с множественными генами могут быть унаследованы следующим поколением. Набор векторных модулей (направляющая РНК) использовался в качестве инструментария для мультиплексного редактирования генома в растениях. Инструментарий Ling et al. может быть использован для системы эффекторных белков C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению.

[001048] Протоколы для направленного редактирования генома растений c помощью CRISPR-Cas9 также доступны в томе 1284 серии Methods in Molecular Biology стр. 239-255, 10 февраля 2015 года. Описана подробная методика проектирования, конструирования и оценки двойных гРНК для геномного редактирования, опосредованного Cas9, кодон-оптимизированным для экспрессии в растениях (pcoCas9), с использованием протопластов Arabidopsis thaliana и Nicotiana benthamiana в качестве модельных клеточных систем. Стратегии применения системы CRISPR-Cas9 для внесения направленных модификаций в геном целых растений также обсуждены. Протоколы, описанные в этой главе, могут быть применены к системе эффекторных белков C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению.

[001049] Ma et al. (Mol Plant, 2015 Aug 3, 8 (8): 1274-84. Doi: 10.1016./j.molp.2015.04.007) сообщают о надежной векторной системе CRISPR-Cas9, использующей кодон-оптимизированный для растений ген Cas9 для удобного и высокоэффективного мультиплексного редактирования генома в однодольных и двудольных растениях. Ma et al. разработали специальные процедуры на основе ПЦР, для быстрого получения множественных экспрессирующих кассет для sg-РНК, которые могут быть собраны в бинарные векторы CRISPR-Cas9 за один раунд клонирования путем лигирования по типу GoldenGate или сборки Гиббса (GibsonAssembly). В этой системе Ma et al. отредактировали 46 целевых сайтов риса со средней скоростью мутации 85,4%, в основном в биаллельном и гомозиготном состоянии. Ma et al. приводят примеры моделирования генной мутации - потери функции в растениях риса T0 и Arabidopsis T1 путем одновременного нацеливания на несколько (до восьми) членов семейства генов, множественно генов в биосинтетическом пути или множество участков в одном гене. Способы Ma et al. могут быть использованы для системы эффекторных белков C2c1 или C2c3 по настоящему изобретению.

[001050] Lowder et al. (PlantPhysiol. 2015 Aug 21. doi: pp.00636.2015) также разработали набор инструментов CRISPR-Cas9, позволяющий редактировать мультиплексный геном и транскрипционную регуляцию экспрессированных генов, генов с подавленной экспрессией или некодирующих генов в растениях. Этот набор инструментов предоставляет исследователям протокол и реагенты для быстрой и эффективной сборки функциональных конструкций T-ДНК CRISPR-Cas9 для однодольных и двудольных растений с использованием способов клонирования GoldenGate и Gateway. Он предоставляется с полным набором возможных инструментов, включая мультиплексированное редактирование генов и активацию транскрипции или репрессирование эндогенных генов растений. Технология трансформации на основе Т-ДНК имеет фундаментальное значение для современной биотехнологии растений, генетики, молекулярной биологии и физиологии. Поэтому, авторы изобретения разработали способ сборки Cas9 (WT, никазы или dCas9) и одной или более гРНК в представляющий интерес конечный Т-ДНК-вектор. Способ сборки основан как на типе сборки GoldenGate, так и на рекомбинации MultiSite Gateway. Для сборки требуются три модуля. Первый модуль представляет собой исходный вектор Cas9, который содержит гены Cas9 без промоторов или производные от него гены, фланкированные сайтами attL1 и attR5. Второй модуль представляет собой вектор записи гРНК, который содержит входную гРНК. Экспрессирующие кассеты фланкированы сайтами attL5 и attL2. Третий модуль включает attR1-attR2-содержащие конечные Т-ДНК-векторы, которые обеспечивают промоторы выбора для экспрессии Cas9. Инструментарий Lowder et al. могут быть применен к системе эффекторных белков C2c1 или C2c3 согласно настоящему изобретению.

[001051] В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение может быть деревом. Настоящее изобретение также может использовать описанную в настоящем описании систему CRISPR-Cas для трав (см., например, Belhaj et al., Plant Methods 9: 39 и Harrison et al., Genes&Development, 28: 1859-1872). В особенно предпочтительном варианте осуществления система CRISPR-Cas по настоящему изобретению может быть нацелена на однонуклеотидный полиморфизм (SNP) в деревьях (см., например, Zhou et al., NewPhytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298-301, October 2015). Zhou et al. применили систему CRISPR-Cas на древесном многолетнем Populus с использованием семейства генов 4-кумарата:КоA-лигазы (4CL) в качестве примера и достигли 100% мутационной эффективности для двух преобразованных таким образом генов 4CL, при этом каждый трансформированный организм был исследован на предмет переноса двуаллельных модификаций. В исследовании Zhou et al. система CRISPR-Cas9 была очень чувствительна к однонуклеотидным полиморфизмам (SNP), поскольку расщепление третьего гена 4CL устранялось из-за SNP в последовательности-мишени. Эти способы могут быть применены к системе эффекторных белков C2c1 или C2c3 согласно настоящему изобретению.

[001052] Способы Zhou et al. (New Phytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298-301, October 2015) можно применить к настоящему изобретению следующим образом. Два гена 4CL, 4CL1 и 4CL2, связанные с биосинтезом лигнина и флавоноидов, соответственно, являются мишенью для редактирования CRISPR-Cas9. Populustremula x alba клон 717-1B4, обычно используемый для трансформации, отличается от генотипа Populus trichocarpa. Таким образом, гРНК 4CL1 и 4CL2, сконструированные на основе эталонного генома, могут быть проанализированы при помощи собственно полученных данных 717 секвенирований РНК, чтобы убедиться в отсутствии SNP, которые могут ограничивать эффективность Cas. Также предусматривается третья гРНК, предназначенная для 4CL5, дубликата 4CL1. Соответствующие 717 последовательностей содержат один SNP в каждом аллеле вблизи/внутри PAM, оба из которых, как ожидается, устраняют нацеливание посредством 4CL5-гРНК. Все три сайта-мишени гРНК расположены в пределах первого экзона. Для 717 трансформаций гРНК экспрессируется с промотора Medicago U6.6 вместе с кодон-оптимизированным Cas человека под контролем промотора CaMV 35S в бинарном векторе. Трансформация только с помощью вектора Cas может служить в качестве контроля. Случайно выбранные линии 4CL1 и 4CL2 подвергаются секвенированию ампликонов. Затем данные обрабатываются, а биаллельные мутации подтверждаются во всех случаях. Эти способы могут быть применены к системе эффекторных белков C2c1 или C2c3 согласно настоящему изобретению..

[001053] В растениях патогены часто специфичны по отношению к хозяину. Например, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici поражает только томат, а F. oxysporum f. dianthii Pucciniagraminis f. sp. tritici только пшеницу. Растения имеют естественную и индуцируемую защиту, чтобы противостоять большинству патогенов. Мутации и явления рекомбинации между поколениями растений приводят к генетической изменчивости, которая приводит к восприимчивости к болезням, особенно в том случае, когда патогены воспроизводятся с большей частотой, чем растения. В растениях может наблюдаться "нехозяйская" устойчивость, например, когда хозяин и патоген не совместимы. Также может наблюдаться горизонтальная устойчивость, например, частичная устойчивость к аллелям расы патогенных организмов, обычно контролируемая многими генами, и вертикальная устойчивость, например, полная устойчивость к некоторым расам патогена, но не к другим расам, обычно контролируемым несколькими генами. На уровне отношений "ген против гена" растения и патогены развиваются вместе, происходит извечное нарушение и восстановление баланса: генетические изменения в одном приводят к нарушениям в другом. Соответственно, используя природную вариативность генома, селекционеры объединяют в одном растении наиболее полезные гены для урожайности, качества, однородности, выносливости, сопротивления различным болезням. Источниками генов устойчивости являются местные или иностранные сорта, старые сорта негибридного происхождения, родственники диких растений и сорта с индуцированной мутацией, например, после обработки растительного материала мутагенными агентами. Так, в соответствии с настоящим изобретением селекционерам предлагается новый инструмент стимуляции мутаций. Соответственно, специалист в данной области сможет проанализировать геномы разных сортов - возможных источников резистентных генов, имеющих желаемые характеристики или признаки, и сможет использовать настоящее изобретение, чтобы индуцировать появление генов устойчивости со значительно большей точностью, чем предыдущие мутагенные агенты, что, следовательно, приведет к ускорению и улучшению селекции растений.

Улучшение свойств растений и дрожжей

[001054] Настоящее изобретение также относится к растениям и дрожжевым клеткам, которые могут быть получены с помощью способов, описанных в настоящем описании. Растения с улучшенными свойствами, полученные описанными в настоящем описании способами, могут быть полезны для производства продуктов питания или кормов через экспрессию генов, обеспечивающих, в частности, устойчивость к вредителям, гербицидам, засухе, низким или высоким температурам, чрезмерному увлажнению и т.д.

[001055] Растения с улучшенными свойствами, полученные описанными в настоящем описании способами, в особенности зерновые культуры и водоросли, могут быть произведены в качестве продуктов питания и кормов для обеспечения, например, более высокого содержания белков, углеводов, питательных веществ или витаминов по сравнения с таковыми для дикого типа. В этом отношении предпочтительны растения с улучшенными свойствами, в особенности бобовые и клубненосные.

[001056] Улучшенные водоросли или другие растения, такие как рапс, могут быть особенно полезными для производства растительных масел или биотоплива, например такого, как спирты (особенно метанол и этанол). Они могут быть модифицированы способам инженерии для экспрессии или сверхэкспрессии высоких уровней масел или спиртов с целью использования в отраслях промышленности, связанных с нефтью или биотопливом.

[1057] Также изобретение относится к улучшению составляющих частей растений. Такие части растения включают, но не ограничиваются ими, листья, стебли, корни, клубни, семена, эндосперм, яйцеклетки и пыльцу. Такие части растения, как предусматривается в рамках настоящего изобретения, могут быть жизнеспособными, нежизнеспособными, регенерируемыми и/или нерегенерируемыми.

[001058] Также настоящее изобретение охватывает получение растительных клеток и растений, полученных согласно способам по изобретению. Гаметы, семена, зародыши, либо зиготические либо соматические, потомство или гибриды растений, несущих генетическую модификацию, которые получены способами традиционного скрещивания, также входят в рамки настоящего изобретения. Такие растения могут содержать гетерологическую или чужеродную последовательность ДНК, встроенную в последовательность-мишень или ее заменяющую. Альтернативно, такие растения могут содержать только одну модификацию (мутация, делеция, инсерция, замена) в одном или более нуклеотидах. По существу такие растения могут отличаться от исходных растений только наличием конкретной модификации.

[001059] Таким образом, изобретение относится к растению, животному или клетке, полученным способами по настоящему изобретению, или к их потомству. Потомство может быть клоном полученного растения или животного или может быть результатом полового размножения путем скрещивания с другими особями того же вида для дальнейшей интрогрессии желаемых признаков потомству. Клетка может существовать in vivo или ex vivo в случае многоклеточных организмов, в частности, животных и растений.

[001060] Настоящее изобретение также может быть применено и в других сельскохозяйственных областях, таких как, например, фермерство и животноводство. Например, у свиней есть много особенностей, которые делают их привлекательными биомедицинскими моделями, особенно в регенеративной медицине. В частности, свиньи с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) могут служить подходящими моделями для регенеративной медицины, ксенотрансплантации и развития опухолей и помогут в разработке методов лечения пациентов с SCID человека. Lee et al., (Proc Natl Acad Sci USA. 2014 May 20, 11 ((20): 7260-5) использовали нуклеазы с доменами аналогов активаторов транскрипции (TALEN) для получения целевых модификаций гена активации рекомбинации (RAG) 2, включая те, которые воздействовали на оба аллеля, в соматических клетках с высокой эффективностью. В подобной системе можно использовать эффекторный белок C2c1 или C2c3.

[001061] Способы Lee et al. (Proc Natl Acad Set USA. 2014 May 20, 111 (20): 7260-5) могут быть применены в настоящем изобретении следующим образом. Свиньи с мутацией получают путем направленной модификации RAG2 в клетках фибробластов плода, после чего проводят SCNT и перенос эмбрионов. Конструкции, кодирующие CRISPR-Cas, и репортер вводят путем электропорации в клетки фибробластов плода. Через 48 ч трансфицированные клетки, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, сортируют в отдельные лунки 96-луночного планшета в предполагаемой концентрации одна клетка на лунку. Скрининг целевой модификации RAG2 проводят путем амплификации фрагмента геномной ДНК, фланкирующего любые участки разрезания CRISPR с последующим секвенированием продуктов ПЦР. После скрининга и проверки на отсутствие нецелевых мутаций клетки с целевой модификацией RAG2 используются для SCNT. Полярное тело вместе с частью соседней цитоплазмы ооцита, предположительно содержащее пластинку метафазы II, удаляют и донорскую клетку помещают в перивителлин. Восстановленные эмбрионы затем подвергают электропорации, чтобы соединить донорскую клетку с ооцитом, а затем химически активируют. Активированные эмбрионы инкубируют в среде Porcine Zygote Medium 3 (PZM3) с 0,5 Scriptaid (S7817, Sigma-Aldrich) в течение 14-16 часов. Затем эмбрионы промывают, чтобы удалить Scriptaid и культивируют в PZM3 до переноса в яйцеводы суррогатных свиней.

[001062] Настоящее изобретение также применимо для модификации посредством SNP других животных, таких как коровы. Tan et al, (Proc Natl Acad Sci USA, 2013 Oct 8, 110 (41): 16526-16531) расширили набор инструментов для редактирования генов в области животноводства путем включения нуклеаз с доменами аналогов активаторов транскрипции и кластерных коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)/Cas9-стимулированную гомологичную репарацию (HDR) с использованием плазмид, rAAV и олигонуклеотидных матриц. Ген-специфические последовательности гРНК клонировали в вектор Church lab gRNA vector (Addgene ID: 41824) в соответствии с их способами (Mali P, et al., (2013) RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339(6121):823-826). Нуклеазу Cas9 получали либо путем совместной трансфекцией с плазмидой hCas9 (Addenene ID: 41815), либо мРНК, синтезированной с RCIScript-hCas9. Эту RCIScript-hCas9 конструировали путем субклонирования фрагмента XbaI-AgeI из плазмиды hCas9 (охватывающей сДНК hCas9) в плазмиду RCIScript.

[001063] Heo et al. (Stem Cells Dev. 2015 Feb 1;24(3):393-402. doi: 10.1089/scd.2014.0278. Epub 2014 Nov 3) сообщили о высокоэффективном нацеливании на геном быка с использованием бычьих плюрипотентных клеток и кластерных коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами. Сначала Heo et al. получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки ((iPSC) из бычьих соматических фибробластов посредством эктопической экспрессии факторов яманаки и обработки ингибитором GSK3p и MEK (2i). Heo et al увидели, что бычьи iPSC похожи на наивные плюрипотентные стволовые клетки в отношении экспрессии генов и потенциала развития в тератомах. Более того, нуклеаза CRISPR-Cas9, специфичная для локуса NANOG у быков, показала высокую эффективность при редактировании бычьего генома в бычьих iPSC и эмбрионов.

[001064] Igenity® проводит профильный анализ животных, например, коров, с целью достижения и передачи признаков, имеющих промысловую важность, таких как состав туши, качество туши, материнские и репродуктивные характеристики, и средний привес в день. Комплексный профильный анализ Igenity® начинается с определения ДНК-маркеров (чаще всего однонуклеотидных полиморфизмов или SNP). Все ДНК маркеры в профиле Igenity® определялись независимыми ученым в научно-исследовательских институтах, включая университеты, исследовательские организации и правительственные организации, например, министерство сельского хозяйства США. Затем проводилось подтверждение маркеров на выборке Igenity®. Igenity® использует множество источников выборки, которые представляют различные условия производства и биологические типы, часто сотрудничая с партнерами по промышленности, например, коровье-телячьим, кормовым, упаковочным сегментом индустрии по производству говядины, что позволяет собрать редкие фенотипы, обычно недоступные. Широко доступны базы данных генома крупного рогатого скота, см., например, Программу координации генома крупного рогатого скота NAGRP (http://www.anirnaigenorne.org/cattle/rnaps/db.htnai). Таким образом, настоящее изобретение может быть применено к целевым бычьим SNP. Специалист в данной области техники может использовать вышеуказанные протоколы для направленного внесения SNP и применять их к бычьим SNP, как описано, например, Tan et al. или Heo et al.

[001065] Qingjian Zou et al. (Journal of Molecular Cell Biology, Advance Access published October 12, 2015) продемонстрировали увеличение мышечной массы собак путем нацеливания на первый экзон собачьего гена миостатина (MSTN) -негативного регулятора массы мускулов и скелета. Сначала подтверждали эффективность sg-РНК с помощью сотрансфекции sg-РНК, направленной на MSTN, и вектора Cas9 в эмбриональные фибробласты собаки. Затем получили MSTN KO собак путем микроинъекции мРНК Cas9 и sg-РНК MSTN в эмбрионы с нормальной морфологией и аутотрансплантацией зигот в яйцевод той же самки собаки. Нокаутированные щенки показали явный мускульный фенотип в области бедер по сравнению с однопометными животными дикого типа. Подобный результат может быть получен также с помощью CRISPR C2c1 или C2c3, описанных в настоящем описании.

Скот - свиньи

[001066] Мишени для вируса в домашнем скоте в некоторых вариантах осуществления могут включать CD163 свиней; например, в макрофагов свиней CD163 ассоциирован с инфекцией (которая, как считается, связана с проникновением вирусных клеток) с помощью PRRSv (свиной репродуктивный и респираторный вирус, артеривирус). Инфекция PRRSv, особенно свиных альвеолярных макрофагов (обнаруженная в легких), приводит к ранее неизлечимому свиному синдрому ("Загадочная болезнь свиней" или "болезнь голубого уха"), которая вызывает симптомы, включающие репродуктивную недостаточность, потерю веса и высокие показатели смертности у домашних свиней. Инфекции, вызываемые условно-патогенными организмами, а также благоприятными условиями, например, энзоотическая пневмония, менингит и отек уха, считаются вызванными иммунодефицитом на фоне потери активности макрофагов. Они также приводят к значительными финансовым и экологическим последствиям из-за повышенного приема антибиотиков и финансовых потерь ($660 млн. в год).

[001067] Как сообщили Kristin M Whitworth и Dr Randall Prather et al. (Nature Biotech 3434 published online 07 December 2015) в университете Миссури и в сотрудничестве с Genus Pic, на CD163 было осуществлено нацеливание с использованием CRISPR-Cas9, и потомки свиней с отредактированным геномом были устойчивы к PRRSv. Один самец и одна самка с мутациями экзона 7 были скрещены с целью получения потомства. У самца-основателя была делеция 11 п.о. в экзоне 7 на одном аллеле, что приводит к мутации рамки и пропусканию аминокислоты 45 в области 5 и, следовательно, преждевременному стоп-кодону на аминокислоте 64. Другой аллель имел 2 п.о. в экзоне 7 и делеции 377 п.о. в предшествующем интроне, которые, как предсказывалось, приводят к экспрессии первых 49 аминокислот домена 5 с последующим преждевременном стоп-кодоном на аминокислоте 85. У свиноматки было 7 п.о. на одном аллеле, что, как было предсказано, при транскрипции должно было привести к экспрессии первых 48 аминокислот домена 5, за которыми следует преждевременный стоп-кодон на аминокислоте 70. Другой аллель свиньи был неамплифицируемым. Было спрогнозировано, что после селекции потомство будет представлять собой нулевое животное (CD163 -/-), то будет иметь есть нокаут CD163.

[001068] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления белки CRISPR могут быть нацелены на альвеолярные макрофаги свиней. В некоторых вариантах осуществления белки CRISPR могут быть нацелены на CD163 свиньи. В некоторых вариантах осуществления CD163 свиньи может быть нокаутирован посредством введения DSNB или вставок и делеций, например, направленной делеции или модификации экзона 7, включая одну или более из описанных выше, или в других областях гена, например, делеции или модификации экзона 5.

[001069] Предусматриваются отредактированные свиньи и их потомство, например, свинья с нокаутом CD163. Это может быть осуществлено для целей животноводства, разведения или модулирования (например, модель на свиньях). Также предусматривается сперма с нокаутрованным геном.

[001070] CD163 является представителем суперсемейства фагоцитарных рецепторов, богатых цистеином (SRCR). Как показывают исследования in vitro, домен 5 белка SRCR представляет собой домен, отвечающий за распаковку и высвобождение вирусного генома. Следовательно, на другие члены суперсемейства SRCR также может быть осуществлено нацеливание с целью повышения резистентности к другим вирусам. PRRSV также является членом группы артеривирусов млекопитающих, которая также включает вирус роста мышиной лактатдегидрогеназы, вирус геморрагической лихорадки обезьяны и вирус конского артерита. Артеривирусы обладают важными свойствами патогенеза, включая тропизм макрофагов и способность вызывать как тяжелое заболевание, так и персистирующую инфекцию. Соответственно, может быть осуществлено нацеливание на артеривирусы и, в частности, вирус повышения уровня лактатдегидрогеназы мышей, вирус геморрагической лихорадки обезьян и вирус лошадиного артерита, например, через CD163 свиней или его гомологи у других видов, а также в моделях на мышах, обезьянах и лошадях, и также предусматривается нокаут.

[001071] Действительно, этот подход может быть расширен на вирусы или бактерии, которые вызывают другие болезни скота, которые могут передаваться людям, такие как штаммы вируса свиного гриппа (SIV), которые включают грипп C и подтипы гриппа A, известные как H1N1, H1N2, H2N1, H3N1, H3N2 и H2N3, а также пневмония, менингит и отек, упомянутые выше.

Терапевтическое нацеливание посредством направляемого РНК комплекса эффекторных белков C2c1 или C2c3

[001072] Как будет очевидно, предусматривается, что систему по настоящему изобретению можно использовать для нацеливания на любую представляющую интерес полинуклеотидную последовательность. Настоящее изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, или одному или более полинуклеотидам, кодирующих компоненты указанной композиции, или к векторным системам или системам доставки, содержащим один или более полинуклеотидов, кодирующих компоненты указанной композиции, для применения в модификации клетки-мишени in vivo, ex vivo или in vitro, и она может быть осуществлена способом, который изменяет клетку таким образом, что после модификации потомства или клеточной линии модифицированная посредством CRISPR клетка сохраняет измененный фенотип. Модифицированные клетки и потомство могут быть частью многоклеточного организма, такого как растение или животное с применением системы CRISPR ex vivo или in vivo в отношении желаемого типа клеток. CRISPR по изобретению может быть терапевтическим способом лечения. Терапевтический способ лечения может включать редактирования гена или генома, или генную терапию.

Лечение от патогенов, таких как бактериальные, грибковые и паразитарные патогены

[001073] Настоящее изобретение также может применяться для лечения от бактериальных, грибковых и паразитарных патогенов. Большинство усилий исследователей сосредоточено на разработке новых антибиотиков, которые после разработки, тем не менее, будут подвержены тем же проблемам лекарственной резистентности. Изобретение относится к новым альтернативам на основе CRISPR, которые преодолевают эти трудности. Кроме того, в отличие от существующих антибиотиков, лечение на основе CRISPR может быть специфическим для патогена, индуцируя гибель бактериальных клеток патогена-мишени, избегая при этом гибели полезных бактерий.

[001074] Jiang et al. ("RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems," Nature Biotechnology vol. 31, p. 233-9, March 2013) использовали систему CRISPR-Cas9, чтобы мутировать или вызывать гибель S. pneumoniae и E. coli. Эта работа, которая представляет точные мутации в геномах, основывается на двойном расщеплении участка генома, являющегося мишенью, направляемого РНК и Cas9, с целью обеспечения гибели немутантных клеток и обхода необходимости выбора маркеров или систем против отбора. Cистемы CRISPR могут использоваться для способствования регрессии лекарственной резистентности и исключить перенос резистентности между штаммами. Bickard et al. показали, что Cas9, перепрограммированный на нацеливание на гены вирулентности, убивает вирулентный, но не авирулентный, S. aureus. Перепрограммируя нуклеазу для генов устойчивости к антибиотикам, являющихся мишенью, осуществляли разрушение стафилококковых плазмид, которые содержали гены устойчивости к антибиотикам и имммунизировали против распространения генов резистентности плазмиды (см. Bikard et al, "Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials," Nature Biotechnology vol. 32, 1146-1150, doi: 1Q.1038/nbt.3043, published online 05 October 2014). Bikard показал, что противомикробные средства на основе CRISPR-Cas9 функционируют, уничтожая S. aureus в модели колонизации кожи мыши. Аналогично, Yosef et al. использовали CRISPR для нацеливания на гены, которые кодируют ферменты), придающие резистентность к β-лактамным антибиотикам (см. Yousef et al., "Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria," Proc. Nail Acad. Sci. USA, vol. 112, p. 72.67-72.72, doi: 10.1073/pnas. 1500107112, опубликованную через интернет 18 мая 2015 года).

[001075] Системы CRISPR можно использовать для редактирования геномов паразитов, устойчивых к другим генетическим подходам. Например, было показано, что система CRISPR-Cas9 вносит двухцепочечный разрыв в геном Plasmodium yoelii (см., Zhang et al., "Efficient Editing of Malaria Parasite Genome Using the CRISPR/Cas9 System," mBio. vol. 5, e01414-14, Jul-Aug 2014). Ghorbal et al. ("Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system," Nature Biotechnology, vol. 32., p. 819-821, doi: 10.1038/nbt.2925, опубликованную через интернет 1 июня 2014 года) модифицировали последовательности двух генов: orc1 и kelch13, которые предположительно участвуют в подавлении гена и возникающей устойчивости к артемизинину, соответственно. Паразиты, которые были изменены в соответствующих участках, восстанавливались с очень высокой эффективностью, несмотря на отсутствие прямой селекции по модификации, что указывает на то, что с помощью этой системы можно вносить нейтральные или даже вредные мутации. CRISPR-Cas9 также используется для модификации геномов других патогенных паразитов, включая Toxoplasma gondii (см. Shen et al., "Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii, using CRISPR/CAS9," mBio vol. 5:e01114-14, 2014; and SidiJk et al., "Efficient Genome Engineering of Toxoplasma, gondii Using CRISPR/Cas9," PLoS One vol. 9, el00450, doi: 10.1371/joumal.pone.0100450, опубликованную через интернет 27 июня 2014 года).

[001076] Vyas et al ("A Candida albicans CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families," Science Advances, vol. 1, el500248, DOI: 10.1126/seiadv.1500248, 3 апреля 2015 года) использовали систему CRISPR для преодоления давних препятствий в генной инженерии C. albicans и эффективно внесли мутацию в одном эксперименте в обе копии нескольких разных генов. В организме, где несколько механизмов способствуют лекарственной резистентности, Vyas получил гомозиготные двойные мутанты, которые больше не проявляли гиперрезистентность к флуконазолу или циклогексимиду, демонстрируемую родительским клиническим изолятом Can90. Vyas также получил гомозиготные мутации с потерей функциональности в основных генах C. albicans путем создания условных аллелей. Нуль-аллели DСR1, который необходим для обработки рибосомной РНК, являются летальными при низкой температуре, но жизнеспособны при высокой температуре. Vyas использовал шаблон восстановления, в котором вводилась нонсенс-мутация и изолировались мутанты dcr1/dcr1, которые не росли при 16°C.

[001077] Систему CRISPR по настоящему изобретению использовали в P. falciparum путем разрушения хромосомного локуса. Ghorbal et al. ("Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR.-Cas9 system.". Nature Biotechnology, 32, 81.9-821 (2014), DOI: 10.1038/nbt.2925, June 1, 2014) использовали систему CRISPR для внесения определенных генных нокаутов и однонуклеотидных замен в геноме малярии. Чтобы адаптировать систему CRISPR-Cas9 к P. falciparum, Ghorbal et al. сконструировали экспрессирующий вектор для контроля регуляторных элементов плазмодия в эписоме pUFl-Cas9, которая также несет селективный маркер ydhodh, который обеспечивает резистентность к DSM1, ингибитору дигидрогенатдегидрогеназы P. falciparum (PfDHODH), и для транскрипции sg-РНК использовали регуляторные элементы на основе малой ядерной (sn)РНК U6 P. facciparum, разместив направляющую РНК и донорную ДНК-матрицу для репарации на основе гомологичной рекомбинации на одной и той же плазмиде, pL7. См. также Zhang С. V al. ("Efficient editing of malaria parasite genome using the CRISPR/Cas9 system", MBio, 2014 Jul 1, 5(4):E01414-I4, doi: 10. EI.28/MbKO.O1.414-M) and Wagner et al. ("Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum, Nature Methods 11, 915-918 (2014), DOI: 10.1038/nmeth.3063).

Лечение от патогенов, таких как вирусные патогены, такие как ВИЧ

[001078] Cas-опосредованное редактирование генома может быть использовано для внесения защитных мутаций в соматические ткани для борьбы с негенетическими или комплексными заболеваниями. Например, NHEJ-опосредованная инактивация рецептора CCR5 в лимфоцитах (Lombardo et al., Nat Biotechnol. 2007 Nov; 25(11): 1298-306) может стать плодотворной стратегией в борьбе с ВИЧ-инфекцией, а делеция PC5K9 (Cohen et al., Nat Genet. 2005 Feb; 37(2): 1(51-5) или ангиопоэтина (Musunuru et al., N Engl J Med. 2010 Dec 2; 363(231:2220-7) может оказать терапевтический эффект при статин-резистентнй гиперхолестеролемии или гиперлипидемии. Хотя эти мишени могут быть удалены путем sg-РНК-опосредованного нокаута белка, уникальным преимуществом NHEJ-опосредованной инактивации является способность достичь постоянной терапевтической пользы без необходимости продолжения лечения. Как и при всех способах генной терапии, безусловно, важно удостовериться, что каждое предлагаемое терапевтическое использование имеет благоприятное соотношение пользы и риска.

[001079] Было показано, что гидродинамическая доставка плазмидной ДНК, кодирующей Cas9, и направлящей РНК вместе с матрицей репарации в печень в модели тирозинемии на взрослых мышах, скорректировала мутацию Fah гена и восстановила экспрессию белка Fah дикого типа в ~1 из 250 клеток(Nat Biotechnol. 2014 Jun; 32(6):551-3). Кроме того, в клинических испытаниях были успешно использованы нуклеазы с цинковыми пальцами для борьбы с ВИЧ-инфекцией путем нокаута рецептора CCR5 ex vivo. У всех пациентов снизился уровень ДНК ВИЧ, и у одного из четырех пациентов РНК ВИЧ стала неопределяемой (Tebas et al., N Engl J Med. 2014 Mar 6; 370(10):901-10). Оба результата показывают перспективы использования программируемых нуклеаз как новой терапевтической платформы.

[001080] В другом варианте осуществления изобретения самоинактивирующиеся лентивирусные векторы с миРНК, нацеленный экзон, общий для генов tat/rev ВИЧ, локализующейся в ядрышке TAR-ловушкой и анти-CCR5-специфичным рибозимом типа "hammerhead" (см, например, DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43), может использоваться и/или быть адаптирован для использования в нацеленной на нуклеиновые кислоты системе по настоящему изобретению. Минимум 2,5×10⁶ CD34⁺ клеток на килограмм массы тела пациента может быть собрано и подвергнуто предварительному стимулированию в течение 16-20 часов в питательной среде X-VIVO 15 (Lonza), содержащей 2 мкМ/L глютамина, фактор стволовой клетки (100 нг/мл), лиганд Flt-3 (Flt-3L) (100 нг/мл) и тромбопоэтин (10 нг/мл) (CellGenix) при плотности 2×10⁶ клеток/мл. Предварительно стимулированные клетки можно трансдуцировать лентивирусным вектором с множественностью инфекции, равной 5, в течение 16-24 часов в 75-см² флаконах для культивирования тканей, покрытых фибронектином (25 мг/см²) (RetroNectin, Takara Bio Inc.).

[01081] Специалисты в данной области, используя имеющуюся в данной области информацию и идеи в соответствии с настоящим изобретением, могут исправить HSC в отношении иммунодефицитного состояния, такого как ВИЧ/СПИД, путем приведения HSC в контакт с системой CRISPR-Cas9, которая нацелена на и нокаутирует CCR5. Направляющая РНК (и, предпочтительно, подход с двумя направляющими молекулами, например, парой различных направляющих РНК, например, направляющими РНК, нацеленными на два клинически значимых гена B2M и CCR5 в первичные CD4+ T-клетки и CD34+ гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (HSPC) человека), которая нацелена на и нокаутирует ССR5, и содержащие белки С2с1 или С2с3 частицы, приводят в контакт с HSC. Такие вступившие в контакт клетки можно вводить и, если необходимо, обрабатывать/увеличивать в количестве (см. Cartier., также см. Kiem, "Hematopoietic stem cell-based gene therapy for HIV disease", Cell Stem Cell Feb 3, 2012; 10(2): 137-147, включенные в настоящее описание в качестве ссылки вместе цитируемыми в них документами. Mandal et al., "Efficient Ablation of Genes in Human Hematopoietic Stem and Effector Cells using CRISPR/Cas9," Cell Stem Cell, Volume 15, Issue 5, p643--652, 6 November 2014, включенную в настоящее описание в качестве ссылки вместе с цитируемыми в ней документами. Также может быть упомянута Ebina, "CRlSPR7Cas9 system, to suppress HIV-1 expression by editing HIV-1 integrated proviral DNA" SCIENTIFIC REPORTS | 3: 2510 | DOI: 10.1038/srep02510, включенная в настоящее описание в качестве ссылки вместе с цитируемыми в ней документами, в качестве другого средства борьбы с ВИЧ/СПИДом с использованием системы CRISPR C2c1 или С2с3.

[001082] Основанием для редактирования генома для лечения ВИЧ является наблюдение, что гомозиготные индивидуумы по мутациям в CCR5 с потерей функции, клеточным корецепторе для вируса, обладают высокой устойчивостью к инфекции и в остальном являются здоровыми, что указывает на то, что попытка воссоздать данную мутацию может быть безопасным и эффективным способом лечения [Liu, R., et al. Cell 86, 367-377 (1996)]. Эта идея была подтверждена клиническими испытаниями, когда ВИЧ-инфицированному пациенту была проведена трансплантация аллогенного костного мозга от донора, гомозиготного по мутации CCR5 с потерей функции, что привело к не поддающимся обнаружению уровням ВИЧ и восстановлению нормальных показателей количества CD4 Т-клеток [Flutter, G., et al. The New England Journal Of Medicine 360, 692-698 (2009)]. Хотя трансплантация костного мозга не является реалистичным методом лечения для большинства пациентов с ВИЧ из-за стоимости и потенциальной реакции на трансплант, терапия ВИЧ, которая преобразует собственные Т-клетки пациента в мутантные по CCR5, является желательной.

[001083] Предшествующие исследования с использованием ZFN и HNEI для нокаута CCR5 в гуманизированной модели ВИЧ на мышах показали, что трансплантация CD4 T-клеток с отредактированным CCR5, снижала вирусную нагрузку и количество CD4 T-клеток [Perez, E.E., et al. Nature Biotechnology 26, 808-816 (2008)]. Важно отметить, что эти модели также показали, что ВИЧ-инфекция привела к селекции нуль-клеток по CCR5, указывая на то, что редактирование дает преимущество в выносливости и потенциально позволяет небольшому количеству отредактированных клеток обеспечить терапевтический эффект.

[001084] В результате этого и других перспективных доклинических исследований терапия редактирования генома, которая нокаутирует CCR5 в Т-клетках пациента, далее была протестирована на людях [Holt, N., et al. Nature Biotechnology 28, 839-847 (2010); Li, L., et al. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 1259-1269 (2013)]. В недавних клинических испытаниях фазы I, CD4+ Т-клетки у пациентов с ВИЧ были выделены, отредактированы посредством ZFN, предназначенными для нокаутирования гена CCR5, и аутологично пересажены обратно пациентам [Tebas, P., et al. The New England Journal Of Medicine 370, 901-910 (2014)].

[001085] В другом исследовании Mandal et al., Cell. Stem. Cell, Volume 15, Issue 5, p643-652, 6 November 2014), CRISPR-Cas9 нацеливали на два клинически значимых гена, B2M и CCR5, в CD4+ Т-клетках и CD34+ гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках (HSPC) человека. Использование одиночных направляющих РНК привело к высокоэффективному мутагенезу в HSPC, но не затронуло Т-клетки. Подход с двумя направляющими РНК повысил эффективность делеции генов в обоих типах клеток. HSPC, подвергшиеся редактированию генома посредством CRISPR-Cas9, сохранили потенциал в отношении множества ростков. Прогнозируемые мутации на и вне мишени, были исследованы с помощью секвенированияе с захватом мишени в HSPC, и низкие уровни мутагенеза вне мишени наблюдались только в одном участке. Эти результаты демонстрируют, что CRISPR-Cas9 может эффективно устранять гены в HSPC с минимальным мутагенезом вне мишени, что имеет широкую применимость в терапии на основе гемопоэтических клеток.

[001086] Wang et al. ((PLoS One, 2014 Dec 26;9(12):el 15987. doi: 10.1371/joumal.pone.Ol 15987) обеспечили сайленсинг CCR5 через ассоциированный с CRISPR белок 9 (Cas9) и единственную направляющую РНК (направляющие РНК) с использованием лентивирующих векторов, экспрессирующих Cas9 и направляющие РНК против CCR5. Wang et al. показали, что единичная циклическая трансдукция лентивирусных векторов, экспрессирующих Cas 9 и направляющие РНК против CCR5 в восприимчивые к ВИЧ-1 CD4+ клетки человека, приводит к высоким частотам разрушения гена CCR5. Клетки с нарушенным геном CCR5 не только устойчивы к R5-тропическому ВИЧ-1, в том числе передаваемые/основополагающие изоляты (T/F) ВИЧ-1, но также обладают селективным преимуществом по сравнению с клетками с неразрушенным CCR5 во время R5-тропической инфекции ВИЧ-1. Геномные мутации в потенциальных участках вне мишени, которые высоко гомологичны этим направляющим РНК против CCR5 в стабильно трансдуцированных клетках даже спустя 84 дня после трансдукции, не были обнаруживались с помощью анализа с эндонуклеазой I T7.

[001087] Fine et al. (Sci Rep. 2015 Jui 1;5:10777. doi: 10.1038/'srep10777) идентифицировали двухкассетную систему, экспрессирующую фрагменты белка Cas9 S. pyogenes (SpCas9), которые соединяются вместе в клетке с образованием функционального белка, способного к сайт-специфическому расщеплению ДНК. С помощью специфических направляющих цепей CRISPR, Fine et al. продемонстрировали эффективность этой системы при расщеплении генов HBB и CCR5 в клетках человека HEK-293T в виде единственного Cas9 и в виде пары никаз Cas9. Транс-сплайсированный SpCas9 (tsSpCas9) продемонстрировал ~35% активность нуклеазы по сравнению с SpCas9 дикого типа (wtSpCas9) при стандартных дозах трансфекции, но имел значительно сниженную активность при более низких уровнях дозирования. Существенно уменьшенная длина открытой рамки считывания tsSpCas9 по отношению к wtSpCas9 потенциально позволяет упаковывать более сложные и более длинные генетические элементы в вектор AAV, включая тканеспецифические промоторы, мультиплексную экспрессию направляющей РНК и слияние эффекторных доменов с SpCas9.

[001088] Li et al. (J Gen Virol. 2015 Aug;96(8):2381-93. doi: 10.1099/vir.0.000139. Epub 2015 Apr 8) продемонстрировали, что CRISPR-Cas9 может эффективно опосредовать редактирование локуса CCR5 в клеточных линиях, в результате чего индуцируется экспрессия CCR5 на поверхности клетки. Секвенирования нового поколения показало, что различные мутации были внесены вокруг спрогнозированного участка расщепления CCR5. Для каждой из трех наиболее эффективных направляющих РНК, которые были проанализированы, никаких значительных эффектов вне цели не было обнаружено в 15 наиболее перспективных участков. Конструируя химерные аденовирусы Ad5F35, несущие компоненты CRISPR-Cas9, Li et al. эффективно трансдуцировали первичные CD4+ Т-лимфоциты и нарушили экспрессию CCR5, и положительно трансдуцированные клетки получали резистентность к ВИЧ-1.

[001089] Специалист в данной области может применять любой из способов, изложенных выше, например, Holt, N, et al. Nature biotechnology 28, 839-847 (2010), Li, L., et al. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 1259-1269 (2013), Mandal et al., Cell Stem Cell, Volume 15, Issue 5, p643 65g, 6 November 2014, Wang et al. (PLoS One. 2014 Dec 26;9(12):e115987. doi: 10.1371/joumal.pone.0115987), Fine et al. (Sci Rep. 2015 Jul 1,5:10777. doi: 10.1038/srep 10777) and Li et al. (J Gen Virol. 2015 Aug;96(8): 23 81-93. doi: 10.1099/vir.0.000139. Epub 2015 Apr 8) для нацеливания на CCR5 при помощи системы CRISPR cas по настоящему изобретению.

Нацеливание на патогенs, например, вирусные патогены, такие как HBV

[001090] Настоящее изобретение также может применяться для лечения вируса гепатита B (HBV). Тем не менее, система CRISPR Cas должна быть адаптирована, чтобы избежать недостатков применения РНК-i, таких как риск перенасыщения эндогенных путей малой РНК, например, путем оптимизации дозы и последовательности (см., Grimm et al., Nature vol. 441, 26 May 2006). Например, предполагаются низкие дозы, такие как приблизительно 1-10×10¹⁴ частиц на человека. В другом варианте осуществления система CRISPR Cas, направленная на HBV, может вводиться в липосомах, таких как стабильная частица нуклеиновая кислота-липид (SNALP) (см., например, Morrissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No, 8, August 2005). Предусматриваются ежедневные внутривенные инъекции приблизительно в дозе 1, 3 или 5 мг/кг/сутки CRISPR Cas, нацеленного на РНК HBV в SNALP. Ежедневное лечение может длиться более трех дней, а затем продолжаться еженедельно в течение примерно пяти недель. В другом варианте осуществления система Chen et al. (Gene Therapy (2007) 14, 11-19) могут быть использованы и/или адаптированы для системы CRISPR Cas согласно настоящему изобретению. Chen et al. использовал двухцепочечный псевдотипированный вектор на основе аденоассоциированного вируса 8 fdsAAV2/8) для доставки кшРНК. Единственное введение вектора dsAAV2/8 (1×10¹² векторных геномов на мышь), несущего HBV-специфическую кшРНК, эффективно подавляло устойчивый уровень белка HBV, мРНК и репликативной ДНК в печени трансгенных мышей HBV, что приводило к снижению нагрузки HBV вплоть до 2-3 Log₁₀ в кровотоке. Значительное подавление HBV поддерживалось в течение по меньшей мере 120 дней после введения вектора. Терапевтический эффект кшРНК был зависимым от последовательности мишени и не включал активацию интерферона. Для настоящего изобретения система CRISPR Cas, направленная на HBV, может быть клонирована в вектор AAV, такой как вектор dsAAV2/8, и может быть введена человеку, например, в дозе приблизительно 1×10¹⁵ векторных геномов до примерно 1×10⁶ векторных геномов на человека. В другом варианте осуществления способ Wooddell et al. (Molecular Therapy, vol. 21, no 5, 973-985, May 2013) могут быть использованы и/или адаптированы к системе CRISPR Cas по настоящему изобретению, Woodell et al. показывают, что простая совместная инъекция направленного на гепатоцит связанного с N-ацетилгалактозамином мелиттин-подобного пептида (NAG-MLP) с тропной к печени конъюгированной с холестерином миРНК (chol-siРНК), нацеленной на фактор VII свертывания (F7), приводит к эффективному нокдауну F7 у мышей и не являющихся человеком приматов без изменений в клинической химии или индукции цитокинов. Используя переходные и трансгенные модели на мышах для инфекции HBV, Wooddell et al. показали, что одна совместная инъекция NAG-MLP с мощными chol-миРНК, направленными на консервативные последовательности HBV, приводила к репрессии, составляющей несколько порядков, вирусной РНК, белков и вирусной ДНК с большой продолжительностью действия. В настоящем изобретении могут быть предусмотрены внутримозговые совместные инъекции, например, около 6 мг/кг NAG-MLP и 6 мг/кг HBV-специфического CRISPR Cas. В альтернативном варианте около 3 мг/кг NAG-MLP и 3 мг/кг HBV-специфического CRISPR Cas может быть доставлено в первый день с последующим введением примерно 2-3 мг/кг NAG-MLP и 2-3 мг/кг HBV-специфического CRISPR Cas через две недели.

[001091] Lin et al. (Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Aug 19;3:el86. doi: 10.1Q38/mtna.2014.38) разработали восемь гРНК против HBV генотипа A. С помощью специфичных к HBV гРНК система CRISPR-Cas9 значительно уменьшала производство коровых и поверхностных белков HBV в клетках Huh-7, трансфицированных вектором экспрессии HBV. Среди восьми подвергнутых скринингу гРНК были идентифицированы две эффективные. Одна гРНК, нацеливающая на консервативную последовательность HBV, действовала против разных генотипов. Используя модель гидродинамической персистенции HBV на мышах, Lin et al. дополнительно продемонстрировали, что эта система может расщеплять внутрипеченочную содержащую геном HBV плазмиду и способствовать ее очистке in vivo, что приводит к снижению уровней поверхностного антигена сыворотки. Эти данные свидетельствуют о том, что система CRISPR-Cas9 может нарушить HBV-экспрессирующие матрицы как in vitro, так и in vivo, что указывает на ее потенциал к полному излечению стойкой инфекции HBV.

[001092] Dong et al. (Antiviral Res., 2015, 118: 110-7. Doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.015, Epub 2015 Apr 3) использовали систему CRISPR-Cas9 для нацеливания на геном HBV и эффективного ингибирования инфекции HBV. Dong et al. синтезировали четыре единичных направляющих РНК, направленных на консервативные области HBV. Экспрессия этих направляющих РНК с Cas9 уменьшила продукцию вируса в клетках Huh7, а также в HBV-репликационной клетке HepG2.2.15. Dong et al. также продемонстрировали, что прямое расщепление посредством CRISPR-Cas9 и опосредованный расщеплением мутагенез произошли в ccc-ДНК HBV трансфицированных клеток. В модели на мышах, несущих ccc-ДНК HBV, инъекция направляющих плазмид RNA-Cas9 через хвостовую вену приводила к низкому уровню ccc-ДНК и белка HBV.

[001093] Liu et al. (J Gen Virol, 2015, август, 96 (8): 2252-61. Doi: 10.1099/vir.0.000159. Epub 2015 Apr 22) разработали восемь направляющих РНК (гРНК), которые осуществляли нацеливание на консервативные области различных генотипов HBV, что могло значительно ингибировать репликацию HBV как in vitro, так и in vivo, чтобы исследовать возможность использования системы CRISPR-Cas9 для разрушения ДНК-матриц HBV. HBV-специфическая система гРНК/C2c1 или /C2c3 могла ингибировать репликацию HBV разных генотипов в клетках и уровень вирусной ДНК значительно снижался посредством одной системы гРНК/C2c1 или /C2c3 и устранялся посредством комбинации различных систем гРНК/C2c1 или /C2c3.

[001094] Wang et al. (World J Gastroenterol, 2015, август 28, 21 (32): 9554-65. Doi: 10.3748/wjg.v21.i32.9554) разработали 15 гРНК против HBV генотипов A-D. Были выбраны 11 комбинаций двух вышеуказанных гРНК (двойных гРНК), охватывающих регуляторную область HBV. Эффективность каждой гРНК и 11 двойных гРНК в отношении подавлении репликации HBV (генотипов A-D) исследовали путем количественного определения поверхностного антигена HBV (HBsAg) или антигена (HBeAg) в супернатанте культуры. Разрушение вектора, экспрессирующего HBV, исследовали в клетках HuH7, совместно трансфицированных двойными гРНК и вектором, экспрессирующим HBV, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и способом секвенирования, а разрушение ccc-ДНК исследовали в клетках HepAD38 с использованием осаждения с KCl, безопасное для плазмиды АТФ-зависимое расщеление ДНК-азой (PSAD), амплификации по типу катящегося кольца и комбинированного способа количественной ПЦР. Цитотоксичность этих гРНК оценивали посредством анализа митохондриального тетразолия. Все гРНК могли значительно снизить синтез HBsAg или HBeAg в супернатанте культуры, который зависит от области, на которую была нацелена гРНК. Все двойные гРНК могли эффективно подавлять продукцию HBsAg и/или HBeAg HBV генотипов A-D, а эффективность двойных гРНК в подавлении продукции HBsAg и/или HBeAg была значительно увеличена по сравнению с единственной гРНК. Кроме того, путем прямого секвенирования ПЦР авторы изобретения подтвердили, что эти двойные гРНК могут специфически разрушать HBV-экспрессирующую матрицу, удаляя фрагмент между сайтами расщепления двух используемых гРНК. Самое главное, количественного гРНК-5 и гРНК-12 могла не только эффективно подавлять продукцию HBsAg и/или HBeAg, но также разрушать резервуары ccc-ДНК в клетках HepAD38.

[001095] Karimova et al. (Sci Rep. 2015 Sep 3;5:13734. doi: 10.1038/srepl3734) идентифицировали перекрестно-генотипные консервативные последовательности HBV в S и X-области генома HBV, которые были специфически и эффективно нацелены на расщепление никазой Cas9. Этот подход нарушал не только эписомальную ccc-ДНК и интегрированные в хромосому участки-мишени HBV в линиях репортерных клеток, но также и репликацию HBV в хронически и de novo инфицированных клеточных линиях гепатомы.

[001096] Специалист в данной области может использовать любое из вышепредставленных исследований, например, Lin et al. (Mol Ther Nucleic Acids, 2014 Aug 19;3:e186, doi: 10.1038/mtna.2014.38), Dong et al. (Antiviral Res. 2015 Jun;l 18:110-7. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.015. Epub 2015 Apr 3), Liu et al. (J Gen Virol. 2015 Aug;96(8):2252-61. doi: 10.1099/vir.0.000159. Epub 2015 Apr 22), Wang et al. (World J Gastroenterol. 2015 Aug 28;21(32):9554-65. doi: 10.3748/wig.v21.132.9554) и Karimova et al. (Sci Rep. 2015 Sep 3;5:13734. doi: 10.1038/srepl3734) для нацеливания на HBV при помощи системы CRISPR cas по настоящему изобретению.

[001097] Хроническая инфекция вирусом гепатита (HBV) распространена, смертельна и редко излечивается из-за стойкости вирусной эписомальной ДНК (ccc-ДНК) в инфицированных клетках. Ramanan et al. (Ramanan V, Shiomai A, Cox DB, Schwartz RE, Michailidis E, Bhatta A, Scott IDA, Zhang F, Rice CM, Bhatia SN,.Sci Rep. 2 015 2 июня, 5: 10833. doi: 10.1038/srep10833, опубликованная через интернет 2 июня 2015 года) показали, что система CRISPR/Cas9 может быть специфически нацелена на и расщеплять консервативные области в геноме HBV, что приводит к устойчивому подавлению экспрессии и репликации вирусных генов. При устойчивой экспрессии Cas9 и соответственно выбранных направляющих РНК они продемонстрировали расщепление ccc-ДНК посредством Cas9 и резкое снижение как уровня ccc-ДНК, так и других параметров экспрессии и репликации вирусных генов. Таким образом, они показали, что непосредственное нацеливание на вирусную эписомальную ДНК является новым терапевтическим подходом для контроля над вирусом и, возможно, для излечения пациентов. Это также описано в WO2015089465 Al, из Tire Broad Institute и др., содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

[001098] Таким образом, нацеливание на вирусную ДНК при HBV является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления изобретения.

[001099] Настоящее изобретение также может быть применено для лечения патогенов, например, бактериальных, грибковых и паразитарных патогенов. Большинство усилий исследователей были сосредоточены на разработке новых антибиотиков, которые после разработки, тем не менее, подвержены тем же проблемам развития устойчивости к ним. Изобретение предусматривает новые альтернативы на основе CRISPR, которые преодолевают эти трудности. Кроме того, в отличие от существующих антибиотиков, лечение на основе CRISPR может быть смоделировано таким образом, чтобы оно было специфическим для патогена и индуцировало гибель бактериальных клеток патогена-мишени, но никак не влияло на полезные бактерии.

[001100] Настоящее изобретение также может применяться для лечения вируса гепатита С (HCV). К системе CRISPR-Cas могут применяться способы Roelvinki et al. (Molecular Therapy vol. 20 no. 9, 1737-1749 Sep 2012). Например, вектор AAV, такой как AAV8, может представлять собой предполагаемый вектор, и может быть предусмотрена дозировка примерно 1,25×10¹¹-1,25×10¹³ векторных геномов на килограмм массы тела. Настоящее изобретение также может быть применено для лечения патогенных микроорганизмов, например, бактерий, грибов и паразитов. Большинство усилий исследователей были сосредоточены на разработке новых антибиотиков, которые после разработки, тем не менее, подвержены тем же проблемам развития устойчивости к ним. Изобретение предусматривает новые альтернативы на основе CRISPR, которые преодолевают эти трудности. Кроме того, в отличие от существующих антибиотиков, лечение на основе CRISPR может быть смоделировано таким образом, чтобы оно было специфическим для патогена и индуцировало гибель бактериальных клеток патогена-мишени, но никак не влияло на полезные бактерии.

Jiang et al. ("RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems," Nature Biotechnology vol. 31, p. 233-9, March 2013) использовали систему CRISPR-Cas9, чтобы мутировать или вызывать гибель S. pneumoniae и E. coli. Эта работа, которая представляет точные мутации в геномах, основывается на двойном расщеплении участка генома, являющегося мишенью, направляемого РНК и Cas9, с целью обеспечения гибели немутантных клеток и обхода необходимости выбора маркеров или систем против отбора. Cистемы CRISPR могут использоваться для способствования регрессии лекарственной резистентности и исключить перенос резистентности между штаммами. Bickard et al. показали, что Cas9, перепрограммированный на нацеливание на гены вирулентности, убивает вирулентный, но не авирулентный, S. aureus. Перепрограммируя нуклеазу для генов устойчивости к антибиотикам, являющихся мишенью, осуществляли разрушение стафилококковых плазмид, которые содержали гены устойчивости к антибиотикам и имммунизировали против распространения генов резистентности плазмиды (см. Bikard et al, "Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials," Nature Biotechnology vol. 32, 1146-1150, doi: 1Q.1038/nbt.3043, published online 05 October 2014). Bikard показал, что противомикробные средства на основе CRISPR-Cas9 функционируют, уничтожая S. aureus в модели колонизации кожи мыши. Аналогично, Yosef et al. использовали CRISPR для нацеливания на гены, которые кодируют ферменты), придающие резистентность к β-лактамным антибиотикам (см. Yousef et al., "Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria," Proc. Nail Acad. Sci. USA, vol. 112, p. 72.67-72.72, doi: 10.1073/pnas. 1500107112, опубликованную через интернет 18 мая 2015 года).

[001075] Системы CRISPR можно использовать для редактирования геномов паразитов, устойчивых к другим генетическим подходам. Например, было показано, что система CRISPR-Cas9 вносит двухцепочечный разрыв в геном Plasmodium yoelii (см., Zhang et al., "Efficient Editing of Malaria Parasite Genome Using the CRISPR/Cas9 System," mBio. vol. 5, e01414-14, Jul-Aug 2014). Ghorbal et al. ("Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system," Nature Biotechnology, vol. 32., p. 819-821, doi: 10.1038/nbt.2925, опубликованную через интернет 1 июня 2014 года) модифицировали последовательности двух генов: orc1 и kelch13, которые предположительно участвуют в подавлении гена и возникающей устойчивости к артемизинину, соответственно. Паразиты, которые были изменены в соответствующих участках, восстанавливались с очень высокой эффективностью, несмотря на отсутствие прямой селекции по модификации, что указывает на то, что с помощью этой системы можно вносить нейтральные или даже вредные мутации. CRISPR-Cas9 также используется для модификации геномов других патогенных паразитов, включая Toxoplasma gondii (см. Shen et al., "Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii, using CRISPR/CAS9," mBio vol. 5:e01114-14, 2014; and SidiJk et al., "Efficient Genome Engineering of Toxoplasma, gondii Using CRISPR/Cas9," PLoS One vol. 9, el00450, doi: 10.1371/joumal.pone.0100450, опубликованную через интернет 27 июня 2014 года).

[001076] Vyas et al ("A Candida albicans CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families," Science Advances, vol. 1, el500248, DOI: 10.1126/seiadv.1500248, 3 апреля 2015 года) использовали систему CRISPR для преодоления давних препятствий в генной инженерии C. albicans и эффективно внесли мутацию в одном эксперименте в обе копии нескольких разных генов. В организме, где несколько механизмов способствуют лекарственной резистентности, Vyas получил гомозиготные двойные мутанты, которые больше не проявляли гиперрезистентность к флуконазолу или циклогексимиду, демонстрируемую родительским клиническим изолятом Can90. Vyas также получил гомозиготные мутации с потерей функциональности в основных генах C. albicans путем создания условных аллелей. Нуль-аллели DOR1, который необходим для обработки рибосомной РНК, являются летальными при низкой температуре, но жизнеспособны при высокой температуре. Vyas использовал шаблон восстановления, в котором вводилась нонсенс-мутация и изолировались мутанты dcr1/dcr1, которые не росли при 16°C.

Лечение заболеваний с генетическими или эпигенетическими аспектами

[001104] Системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению могут быть использованы для коррекции генетических мутаций, которые ранее предпринимались с ограниченным успехом с использованием TALEN и ZFN и были идентифицированы как потенциальные мишени для систем Cas9, в том числе, как и в опубликованных заявках EditasMedicine, описывающих способы использования Cas9 для нацеливания на локусы, чтобы с помощью генной терапии вылечивать болезни, в том числе, в WO 2015/048577 CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS Gluckmannet al, WO 2015/070083 CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS, Glucksmann et al. В некоторых вариантах осуществления предусматривается лечение, профилактика или диагностика первичной открытой глаукомы (POAG). Мишень предпочтительно представляет собой ген MYOC. Это описано в WO2015153780, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

[001105] Упоминается WO2015/134812 CRISPR/CAS-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING USHER SYNDROME AND RETINITIS PIGMENTOSA Maeder et al. В соответствии с идеями, описанными в настоящем описании, изобретение охватывает способы и материалы этих документов, применяемые в сочетании с идеями, поисанными в настоящем описании. В аспекте глазной и слуховой генной терапии способы и конструкции для лечения синдрома Ашера и пигментного ретинита могут быть адаптированы к системе CRISPR-Cas по настоящему изобретению (см., например, WO02015/134812). В одном варианте осуществления изобретение WO 2015/134812 включает лечение или задержку начала или прогрессирования синдрома Ашера типа IIА (USH2A, USHIIA) и пигментного ретинита 39 (RP39) путем редактирования генов, например, с использованием CRISPR-Cas9-опосредованных спсобов для исправления делеции гуанина в положении 2299 в гене USH2A (например, замена удаленного остатка гуанина в положении 2299 гена USH2A). Аналогичный эффект может быть достигнут с помощью C2c1 или C2c3. В родственном аспекте нацеливание на мутацию осуществляется путем расщепления одной или более нуклеазами, одной или более никазами или их комбинацией, например, для индуцирования HDR с помощью донорной матрицы, которая корректирует точечную мутацию (например, один нуклеотид, например, делеция гуанина). Изменение или коррекция мутантного гена USH2A может быть опосредована любым механизмом. Типичные механизмы, которые могут быть связаны с изменением (например, коррекцией) мутантного гена USH2A, включают, но не ограничиваются ими, негомологичное концевое соединение, опосредованное микрогомологией концевое соединение (MMEJ), восстановление, связанное с гомологией (например, опосредованное эндогенной донорной матрицей), SDSA (отжиг цепи, зависящий от синтеза), одноцепочечный отжиг или одноцепочечная инвазия. В одном варианте осуществления способ, используемый для лечения синдрома Ашера и пигментного ретинита, может включать сбор данных о мутации, имеющейся у индивидуума, например, путем секвенирования соответствующей части гена USH2A.

[001106] Также упоминается WO 2015/138510 и в соответствии идеями, описанными в настоящем описании, изобретение (с использованием системы CRISPR-Cas9) предусматривает лечение или задержку начала или прогрессирования врожденного амароза Лебера 10 (LCA 10). LCA 10 вызывается мутацией в гене CEP290, например, c.2991+1655, заменой аденина на гуанин в гене CEP290, что приводит к внесению скрытого сайта сплайсинга в интроне 26. Она представляет собой мутацию на нуклеотиде 1655 интрона 26 CEP290, например, замену А на G. CEP290 также известен как: CT87; MKS4; POC3; rd16, BBS14; JBTS5; LCAJO; NPHP6; SLSN6 и 3H11Ag (см., например, WO 2015/138510). В аспекте генной терапии изобретение включает внесение одного или более разрывов вблизи места расположения мишени LCA (например, c.2991+1655, замена А на G) по меньшей мере в одном аллеле гена CEP290. Изменение заденного положения LCA10 означает (1) индуцированное разрывом внесение инсерции-делеции (также упоминаемое в настоящем описании как опосредованное NHEJ внесение инсерции-делеции) в непосредственной близости или в заданном положении LCA10 (например, C.2991+1655A-G) или (2) делецию, вызванную разрывом (также упоминаемая в настоящем описании как NHEJ-опосредованная делеция) геномной последовательности, включающую мутацию в заданном положении LCA10 (например, C.2991+1655A-G). Оба подхода приводят к потере или разрушению скрытого участка сплайсинга в результате мутации в заданном положении LCA 10.

[001107] Исследователи рассматривают возможность использования генной терапии для лечения широкого спектра заболеваний. Системы CRISPR по настоящему изобретению на основе эффекторного белка C2c1 или C2c3 предусматриваются для таких терапевтических целей, включая, но не ограничиваясь ими, дополнительные иллюстративные области-мишени и способы доставки, как показано ниже. Некоторые примеры состояний или заболеваний, которые могут быть эффективно вылечены с использованием настоящей системы, включены в примеры генов, и ткже представлены ссылки, включенные в настоящее описание и в настоящее время ассоциируемые с этими состояниями. Представленные гены и состояния не являются исчерпывающими.

Лечение заболеваний системы кровообращения

[001108] Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas, в частности, новых белковых систем CRISPR, описанных в настоящем описании, в клетки крови или гемопоэтические стволовые клетки. Плазматические экзосомы согласно Wahlgren et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130) были описаны ранее и могут быть использованы для доставки системы CRISPR Cas в кровь. Система нацеливания на нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению также предусматривается для лечения гемоглобинопатий, таких как талассемия и серповидноклеточная анемия. См., например, международную патентную публикацию № WO 2013/126794 для потенциальных мишеней, на которые может быть осуществлено нацеливание системы CRISPR Cas по настоящему изобретению.

[001109] В Drakopoulou, "Review Article, The Ongoing Challenge of Hematopoietic Stem Cell-Based Gene Therapy for β-Thalassemia", Stem Cells International, Volume 2011, Article ID 987980, 10 pages, doi: 10.4061/2011/987980, включенной в настоящее описание в качестве ссылыки вместе с цитированными в ней документами, как если бы они были изложены полностью, описано изменение HSC с использованием лентивируса, который доставляет ген для β-глобина или γ-глобина. В отличие от использования лентивируса, c использованием знаний в данной области и идей, описанных в настоящем описании, квалифицированный специалист может скорректировать HSC в отношении β-талассемии с использованием системы CRISPR-Cas, которая нацелена на и исправляет мутацию (например, с подходящей матрицей HDR, которая доставляет кодирующую последовательность для β-глобина или γ-глобина, преимущественно не-серповидного β-глобина или γ-глобина); в частности, направляющая РНК может нацеливать на мутацию, которая приводит к β-талассемии, а HDR может обеспечивать кодирование для правильной экспрессии β-глобина или γ-глобина. Направляющую РНК, которая нацелена на мутацию, и содержащую белок Cas частицу, приводят в контакт с HSC, несущими мутацию. Частица также может содержать подходящую матрицу HDR, чтобы корректировать мутации для правильной экспрессии β-глобина или γ-глобина; или HSC можно приводить в контакт со второй частицей или вектором, которые содержат или доставляет матрицу HDR. Клетки, приведенные в контакт таким образом, можно вводить и необязательно обрабатывать/увеличивать в количестве, см. Cartier. В этой связи упоминаются Cavazzana, "Outcomes of Gene Therapy for β-Thalassemia Major via Transplantation of Autologous Hematopoietic Stem Cells Transduced Ex Vivo with a Lentiviral β^A-T87Q-Globin Vector." tif2014.org/abstractFiles/Jean%20Antoine%20Ribeil. Abstract.pdf; Cavazzana-Calvo, "Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human β-thalassaemia", Nature 467, 318-322 (16 September 2010) doi:10.1038/n.ature09328; Nienhuis, "Development of Gene Therapy for Thalassemia, Cold Spring Harbor Perpsectives in Medicine, doi: 10.n01/cshperspect.a011833 (2012), LentiGlobin BB305, a lentiviral vector containing an engineered β-globin gene (PA-T87Q); и Xie et al., "Seamless gene correction of β-thalassaemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyback" Genome Research gr.1713427.114 (2014) http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.173427.114 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); которые являются предметом работы Cavazzana, связанной с β-талассемией человека, и предметом работы Xie, и они включены в настоящее описание в качестве ссылки со всеми документами, цитированными в них или связанными с ним. В рамках настоящего изобретения матрица HDR может быть прдеоставлена HSC для экспрессии сконструированного гена β-глобина (например, βA-T87Q) или β-глобина согласно Xie.

[001110] Xu et al. (SciRep. 2015 Jul9;5:12065. doi: 10.1038/srepl2065) разработали TALEN и CRISPR-Cas9, для непосредственного нацеливания на сайт мутации интрона 2 IVS2-654 в гене глобина. Xu et al. наблюдали различные частоты двунитевых разрывов (DSB) в локусах IVS2-654 с использованием TALEN и CRISPR-Cas9, а TALEN опосредовали более высокую эффективность нацеливания на гомологичные гены по сравнению с CRISPR-Cas9 в сочетании с донором транспозона piggyBac. Кроме того, для CRISPR-Cas9 наблюдалось большее количество нецелевых событий по сравнению с TALEN. Наконец, iPSC-клоны, скорректированные TALEN, были выбраны для дифференцировки эритробластов с использованием системы совместного культивирования с OP9 и обнаружили относительно более высокую транскрипцию HBB, чем в нескорректированных клетках.

[001111] Song et al. (Stem Cells Dev. 2015 May 1;24(9): 1053-65. doi: 10, 1089/scd.2014.0347. Epub 2015 Feb 5) использовали CRISPR/Cas9 для исправления β-Thal iPSC; клетки со скорректированными генами демонстрировали нормальные кариотипы и полную плюрипотентность, поскольку эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) не продемонстрировали нецелевых эффектов. Затем Song et al. оценили эффективность дифференцирования генетически скорректированных P-Thal iPSC. Song et al. обнаружили, что при гемопоэтической дифференцировке генетически скорректированные P-Thal iPSC продемонстрировали повышенную долю эмбриоидных телец и различные процентные доли гемопоэтических предшественников. Что еще более важно, генетически скорректированные линии β-Thal iPSC восстанавливали экспрессию HBB и уменьшали производство активных форм кислорода по сравнению с нескорректированной группой. В исследовании Song et al. было показано, что эффективность гемопоэтической дифференцировки β-Thal iPSC значительно улучшилась после корректировки системой CRISPR-Cas9. Аналогичные способы могут быть применены с использованием описанных в настоящем описании систем CRISPR-Cas, например, систем, содержащих эффекторные белки C2c1 или C2c3.

[001112] Серповидноклеточная анемия является аутосомно-рецессивным генетическим заболеванием, в котором эритроциты принимают форму серпа. Это вызвано заменой одного основания в гене β-глобина, который расположен на коротком плече хромосомы 11. В результате вместо глутаминовой кислоты образуется валин, вызывая образование серповидного гемоглобина (HbS). Это приводит к образованию искаженной формы эритроцитов. Из-за этой аномальной формы мелкие кровеносные сосуды могут закупориваться, нанося серьезные повреждения тканям кости, селезенки и кожи. Это может привести к болевым эпизодам, частым инфекциям, синдрому "руки-стопы" или даже множественной органной недостаточности. Искаженные эритроциты также более восприимчивы к гемолизу, что приводит к серьезной анемии. Как и в случае β-талассемии, серповидноклеточная анемия может быть скорректирована путем изменения HSC с помощью системы CRISPR-Cas. Система позволяет специфически редактировать геном клетки, разрезая ее ДНК, а затем позволяя ей восстанавливать себя. Белок Cas вводится и направляется РНК к точке мутации, а затем разрезает ДНК в этой точке. Одновременно вводится нормальная версия последовательности. Эта последовательность используется собственной системой репарации для зашивания индуцированного разреза. Таким образом, CRISPR-Cas позволяет корректировать мутацию в ранее полученных стволовых клетках. Обладая знаниями данной области и идеями, описанными в настоящем описании, квалифицированный специалист может скорректировать HSC в отношении серповидноклеточной анемии с использованием системы CRISPR-Cas, которая нацелена на и корректирует мутацию (например, с подходящей матрицей HDR, которая обеспечивает кодирующую последовательность для β-глобина, преимущественно не-серповидного β-глобина); в частности, направляющая РНК может нацеливать на мутацию, которая вызывает серповидноклеточную анемию, и HDR может обеспечивать кодирование для правильной экспрессии β-глобина. Направляющую РНК, которая нацелена на мутацию, и частицу, содержащую белок Cas, приводят в контакт с HSC, несущими мутацию. Частица также может содержать подходящую матрицу HDR, чтобы корректировать мутации для правильной экспрессии β-глобина; или HSC можно приводить в контакт со второй частицей или вектором, которые содержат или доставляют матрицу HDR. Таким образом приведенные в контакт клетки могут быть введены или необязательно обработаны/увеличены в количестве. Матрица HDR может обеспечивать экспрессию в HSC сконструированного гена β-глобина (например, βA-T87Q) или β-глобин, как в Xie.

[001113] В Williams, "Broadening the Indications for Hematopoietic Stem Cell Genetic Therapies," Cell Stem Cell 13:263-264 (2013), включенной в настоящее описание в качестве ссылыки вместе с цитированными в ней документами, как если бы они были изложены полностью, описан опосредованный лентивирусом перенос гена в клетки HSC/P у пациентов с метахроматической лейкодистрофией (MLD), генетическим заболеванием, вызываемым дефицитом арилсульфатазы A (ARSA), что приводит к демиелинизации нервов; и перенос генов, опосредованных лентивирусом, в HSC у пациентов с синдромом Вискотта-Олдрича (WAS) (пациенты с дефектным белком WAS, являющимся эффектором малой ГТФ-азы CDC42, который регулирует функцию цитоскелета в линиях клеток крови и, таким образом, они страдают иммунодефицитом с рецидивирующими инфекциями, аутоиммунными симптомами и тромбоцитопенией с аномально малыми и дисфункциональными тромбоцитами, приводящими к чрезмерному кровотечению и повышенному риску лейкемии и лимфомы). В отличие от использования лентивируса, используя знания в данной области и идеи, описанные в настоящем описании, квалифицированный специалист может скорректировать HSC в отношении MLD (дефицит арилсульфатазы А (ARSA)) с использованием системы CRISPR-Cas, которая нацелена на и исправляет мутацию (дефицит арилсульфатазы А (ARSA)) (например, с подходящей матрицей HDR, которая обеспечивает кодирующую последовательность для ARSA); в частности, направляющая РНК может быть нацелена на мутацию, которая приводит к MLD, а HDR может обеспечивать кодирование для правильной экспрессии ARSA. Направляющую РНК, которая нацелена на мутацию, и частицу, содержащую белок Cas, приводят в контакт с HSC, несущими мутацию. Частица также может содержать подходящую матрицу HDR, чтобы корректировать мутации для правильной экспрессии ARSA; или HSC можно приводить в контакт со второй частицей или вектором, которые содержат или доставляют матрицу HDR. Таким образом приведенные в контакт клетки могут быть введены или необязательно обработаны/увеличены в количестве. В отличие от использования лентивируса, используя знания в данной области и идеи, описанные в настоящем описании, квалифицированный специалист может скорректировать HSC в отношении WAS с использованием системы CRISPR-Cas, которая нацелена на и исправляет мутацию (дефицит белка WAS) (например, с подходящей матрицей HDR, которая обеспечивает кодирующую последовательность для WAS); в частности, направляющая РНК может нацеливать на мутацию, которая приводит к дефициту WAS, а HDR может обеспечивать кодирование для правильной экспрессии WAS. Направляющую РНК, которая нацелена на мутацию, и частицу, содержащую белок Cas, приводят в контакт с HSC, несущими мутацию. Частица также может содержать подходящую матрицу HDR, чтобы корректировать мутации для правильной экспрессии WAS; или HSC можно приводить в контакт со второй частицей или вектором, которые содержат или доставляют матрицу HDR. Таким образом приведенные в контакт клетки могут быть введены или необязательно обработаны/увеличены в количестве.

[001114] В Watts, "Hematopoietic Stem Cell Expansion and Gene Therapy" Cytotherapy 13(10): 1164-1171. doi: 10.3109/14653249.2011.620748 (2011), включенной в настоящее описание в качестве ссылыки вместе с цитированными в ней документами, как если бы они были изложены полностью, описана генная терапия гемопоэтических стволовых клеткок (HSC), например вирус-опосредованная генная терапия HSC, в качестве в высокой степени привлекательного варианта лечения многих расстройств, включая гематологические состояния, иммунодефициты, такие как ВИЧ/СПИД, и другие генетические нарушения, такие как болезни лизосомного хранения, включая SCID-X1, ADA-SCID, β-талассемию, X-связанный CGD, синдром Вискотта-Олдрича, анемия Фанкони, адренолейкодистрофия (ALD) и метахроматическая лейкодистрофия (MLD).

[001115] Патентные публикации США №№ 20110225664, 20110091441, 20100229252, 20090271881 и 20090222937, закрепленные за Cellectis, относятся к вариантам CREI, где по меньшей мере один из двух мономеров I-CreI имеет по меньшей мере два заместителя, по одному в каждом из двух функциональных поддоменов центрального домена LAGLIDADG (SEQ ID NO: 26), расположенного соответственно в положениях 26-40 и 44-77 I-CreI, причем указанный вариант способен расщеплять последовательность ДНК-мишени из гена гамма-цепи рецептора человека (IL2RG) человека, также называемого общим геном гамма-цепи рецептора цитокинов или гамма C. Последовательности-мишени, идентифицированные в публикациях US 2011225664, 20110091441, 20100229252, 20090271881 и 20090222937, могут быть использованы для системы нацеливания на нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению.

[001116] Тяжелый комбинированный иммуннодефицит (SCID) является следствием дефекта созревания лимфоцитов T, всегда связанного с функциональным дефектом в лимфоцитах В (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). Общая встречаемость заболевания оценивается как 1 на 75000 рождений. Пациенты с не подвергнутым лечению SCID имеют множественные оппортунистические инфекции микроорганизмами и, как правило, не живут более одного года, SCID можно лечить с помощью аллогенной передачи гемопоэтических стволовых клеток от семейного донора. Гистосовместимость с донором может варьироваться широко. В случае дефицита аденозиндеаминазы (ADA), одной из форм SCID, пациентов можно лечить путем инъекции рекомбинантного фермента аденозиндезаминазы.

[001117] С тех пор как было показано, что ген ADA является мутантным у пациентов с SCID (Giblettetah, Lancet, 1972, 2, 1067-1069), было идентифицировано несколько других генов, участвующих в SCID (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., ImmunolRev., 2005, 203, 98-109). Для SCID существует четыре основные причины: (i) наиболее частая форма SCID, SCID-X1 (X-связанный SCID или X-SCID), вызвана мутацией в гене IL2RG, что приводит к отсутствию зрелых Т-лимфоцитов и NK-клеток. IL2RG кодирует белок γ-C (Noguchi, et al., Cell, 1.993, 73, 147-157), общий компонент по меньшей мере пяти рецепторных комплексов интерлейкина. Эти рецепторы активируют несколько мишеней через киназу JAK3 (Macchietah, Nature, 1995, 377, 65-68), инактивация которой приводит к тому же синдрому, что и инактивация гамма-C; (ii) мутация в гене ADA приводит к дефекту в метаболизме пуринов, который является летальным для предшественников лимфоцитов, что, в свою очередь, приводит практически к отсутствию В, Т и NK-клеток; (iii) V (D) J рекомбинация является существенной стадией созревания иммуноглобулинов и рецепторов Т-лимфоцитов (TCR). Мутации в активирующем рекомбинацию гене 1 и 2 (RAG1 и RAG2) и Artemis - трех генов, участвующих в этом процессе, приводят к отсутствию зрелых Т-лимфоцитов; и (iv) сообщалось также о мутациях в других генах, таких как CD45, участвующих в Т-клеточных каскадов, хотя они представляют меньшую часть случаев (Cavazzana-Calvo et al., Ann. Rev. Med., 2005, 56, 585- 602, Fischer et al., Immunol, Rev., 2005, 203, 98-109). С тех пор, как были идентифицированы их генетические основы, различные формы SCID стали парадигмой для подходов к генной терапии (Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109) по двум основным причинам. Во-первых, как и во всех заболеваниях крови, может предусматриваться лечение ex vivo. Гемопоэтические стволовые клетки (HSC) могут быть выделены из костного мозга и могут сохранить свои плюрипотентные свойства на протяжении нескольких клеточных делений. Поэтому их можно обрабатывать in vitro, а затем повторно вводить в организм пациента, где они заселяют костный мозг. Во-вторых, поскольку созревание лимфоцитов нарушается у пациентов с SCID, исправленные клетки имеют селективное преимущество. Поэтому небольшое количество исправленных клеток может восстановить функциональную иммунную систему. Эта гипотеза несколько раз подтверждалась: (i) частичным восстановлением иммунных функций, связанных с реверсированием мутаций у пациентов с SCID (Hirschhom et al., Nat. Genet., 1996, 13, 290-295; Stephan et al., N. Engl J. Med., 1996, 335, 1563-1567, Bousso et al., Proc. Natl., Acad. Set. USA, 2000, 97, 274-278, Wada et al., Proc. Natl. Acad. Set., 2001, 98, 8697-8702, Nishikomori et al., Blood, 2004, 103, 4565-4572), (ii) коррекцией дефицита SCTD-X1 in vitro в гемопоэтических клетках (Candotti et. Ah, Blood, 1996, 87, 3097-3102, Cavazzana-Calvo et al., Blood, 1996, Blood, 88, 3901-3909; Taylor et al., Blood, 1996, 87, 3103-3107; Hacein-Bey et al., Blood, 1998, 92, 4090-4097), (iii) коррекцией дефицита SCID-X1 (Soudais et al., Blood, 2000, 95, 3071-3077; Tsai et al., Blood, 2002, 100, 72-79), JAK-3 (Bunting et ah, Nat. Med., 1998, 4, 58-64, Bunting et al., Hum. Gene Ther., 2000, 11, 2353-2364) и RAG2 (Yates et al., Blood, 2002, 100, 3942-3949) in vivo в моделях на животных, и (iv) результатом клинических испытаний генной терапии (Cavazzana-Calvo et al., Science, 2000, 288, 669-672; Aiuti et al., Nat. Med., 2002; 8, 423-425, Gaspar et al., Lancet. 2004, 364, 2181-2187).

[001118]Патентная публикация США № 20110182867, присвоенная Корпорации детского медицинского центра, а также президенту и стипендиатам Гарвардского колледжа, относится к методам и использованиям модуляции фетального гемоглобина, экспрессии (HbF) в гемопоэтических клетках-предшественниках с помощью ингибиторов экспрессии или активности BCL11A, таких как RNAi и антитела. Мишени, раскрытые в опубликованной патентной публикации США № 20110182867, такой как BCL11A, могут быть подвергнуты нацеливанию системой CRISPR Cas по настоящему изобретению для модуляции экспрессии фетального гемоглобина. См. Также Bauer et al. (Science 11 October 2013: том 342, № 6155, pp. 253-257) и Xu et al. (Science 18 ноября 2011: том 334, № 6058 стр. 993-996) для дополнительных мишеней BCL11A.

[001119] Используя знания в данной области и идеи, описанные в настоящем описании, квалифицированный специалист может скорректировать HSC в отношении гематологических расстройств, таких как β-талассемия, гемофилия или генетическое лизосомальное заболевание.

Доставка HSC и редактирование гемопоэтических стволовых клеток; и конкретные состояния

[001120] Термин «гемопоэтическая стволовая клетка» или "HSC" включает в широком значении те клетки, которые считаются HSC, например, клетки крови, которые приводят к появлению всех других клеток крови и происходят из мезодермы; расположенные в красном костном мозге, который содержится в сердцевине большинства костей, HSC по изобретению включают клетки, имеющие фенотип гемопоэтических стволовых клеток, идентифицированных по небольшим размером, отсутствию маркеров линии (lin) и маркеров, которые принадлежат к кластерам дифференциации, например: CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, а также e-kit - рецептор фактора стволовых клеток. Гемопоэтические стволовые клетки отрицательны по маркерам, которые используются для выявления приверженности линии, и, таким образом, они называются Lin- и во время их очистки посредством FACS содержат до 14 различных зрелых маркеров крови, например CD13 и CD33 для миелоидных клеток, CD71 для эритроидных клеток, CD19 для В-клеток, CD61 для мегакариоцитов и т. д. для человека, и B220 (CD45 мыши) для В-клеток, Mac-1 (CD11b/CD18) для моноцитов, Gr-1 для гранулоцитов, Ter119 для эритроидов, IL7Ra, CD3, CD4, CD5, CD8 для Т-клеток и т. д. Маркеры HSC мыши: CD34lo/-, SCA-1+, Thy1.1+/lo, CD38+, C-kit+, lin- и маркеры HSC человека: CD34+, CD59+, Thyl/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+ и lin-. HSC идентифицируются маркерами. Следовательно, в вариантах осуществления, обсуждаемых в настоящем описании, HSC могут быть CD34+ клетками. HSC также могут представлять собой гемопоэтические стволовые клетки, которые являются CD34-/CD38-. Стволовые клетки, которые могут быть лишены c-kit на поверхности клетки, которые рассматриваются в данной области как HSC, входят в объем изобретения, также как и клетки CD133+, которые аналогично рассматриваются как HSC в данной области.

[001121] Система CRISPR-Cas (например, C2c1 или C2c3) может быть сконструирована для нацеливания на генетический локус или локусы в HSC. Можно получить белок Cas (например, C2c1 или C2c3), преимущественно кодон-оптимизированный для эукариотической клетки и особенно клетки млекопитающего, например клетки человека, HSC, и sg-РНК, нацеливающую на локус или локусы в HSC, например на ген EMX1. Они могут быть доставлены через частицы. Частицы могут быть образованы белком Cas (например, C2c1 или C2c3), смешанным с гРНК. Смесь гРНК и белка Cas можно смешивать, например, со смесью, содержащей или по существу состоящей из поверхностно-активного вещества, фосфолипида, биодеградируемого полимера, липопротеина и спирта, посредством чего могут формироваться частицы, содержащие гРНК и Cas (например, C2c1 или C2c3). Изобретение предусматривает, получение частиц таким образом и частицы, полученные таким способом, а также их применение.

[001122] В более общем случае частицы могут быть сформированы с использованием эффективного процесса. Во-первых, белок Cas (например, C2c1 или C2c3) и гРНК, нацеленная на ген EMX1 или контрольный ген LacZ, могут быть смешаны вместе в подходящем молярном соотношении, например, от 3:1 до 1:3 или от 2:1 до 1:2 или 1:1, при подходящей температуре, например, 15-30°С, 20-25°С, комнатной температуре, в течение подходящего периода времени, например 15-45, 30 минут, преимущественно в стерильном, свободном от нуклеаз буфере, например, 1X PBS. Отдельно компоненты частиц, такие как или содержащие: поверхностно-активное вещество, например катионный липид, 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP); фосфолипид, например димиристоилфосфатидилхолин (DMPC); биодеградируемый полимер, такой как полимер этиленгликоля или PEG, и липопротеин, такой как липопротеин низкой плотности, например холестерин, могут быть растворены в спирте, преимущественно С1-6-алкиловом спирте, таком как метанол, этанол, изопропанол, например 100% этанол. Эти два раствора могут быть смешаны вместе с образованием частиц, содержащих комплексы Cas (например, C2c1 или C2c3)-гРНК. В некоторых вариантах осуществления частица может содержать матрицу HDR. Это может быть частица, совместно вводимая с белоксодержащей частицей гРНК+Cas (например, C2c1 или C2c3) или помимо контактирования HSC с белоксодержащей частицей гРНК+Cas (например, C2c1 или C2c3) HSC контактирует с частицей, содержащей матрицу HDR; или HSC приводят в контакт с частицей, содержащей все из гРНК, Cas (например, C2c1 или C2c3) и матрицы HDR. Матрицу HDR можно вводить отдельным вектором, в результате чего в первом случае частица проникает в клетку HSC, а отдельный вектор также проникает в клетку, где геном HSC модифицируется гРНК+Cas (например, C2c1 или C2c3) и также присутствует матрицы HDR, в котором, например, геномные локусы модифицируются HDR, что может привести к исправлению мутации.

[001123] После образования частиц HSC в 96-луночных планшетах могут быть трансфицированы посредством 15 мкг белка Cas (например, C2c1 или C2c3) на лунку. HSC могут быть собраны через три дня после трансфекции, и может быть определено количество инсерций и делеций (инсерций-делеций) в локусе EMX1.

[001124] Это иллюстрирует, как HSC могут быть модифицированы с использованием CRlSPR-Cas (например, C2c1 или C2c3), нацеленным на геномный локус или локусы, представляющие интерес в HSC. HSC, которые должны быть модифицированы, могут быть in vivo, то есть в организме, например, человека или других эукариот, например, животных, таких как рыбы (данио-рерио), млекопитающих, в частности, приматов (шимпанзе, макак), грызунов (мышей, кроликов, крыс) собак, домашнего скота, птиц. HSC, которые должны быть модифицированы, могут быть in vitro, то есть вне такого организма. Далее, модифицированные HSC могут использоваться ex vivo, то есть одна или более HSC такого организма могут быть получены или выделены из организма, возможно, HSC могут быть увеличены в количестве, HSC модифицированы конструкцией, включающей CRISPR-Cas (например, C2c1 или C2c3), которые нацелены на генетический локус или локусы в HSC, например, путем контактирования HSC с конструкцией, например, где последняя содержит частицу, содержащую фермент CRISPR, и одну или более гРНК, которая нацелена на генетический локус или локусы в HSC, такие как частица, полученная или получаемая при смешивании смеси гРНК и белка Cas (например, C2c1 или C2C3) со смесью, содержащей или по существу состоящей из поверхностно-активного вещества, фосфолипида, биодеградируемого полимера, липопротеина и спирта (где одна или более гРНК нацелены на генетический локус или локусы в HSC), необязательно увеличивая в количестве полученные модифицированные HSC и вводя в организм результирующие модифицированные HSC. В некоторых случаях выделенные или полученные HSC могут быть из первого организма, такого как организм того же вида, что и второй организм, а второй организм может представлять собой организм, которому вводят полученные модифицированные HSC, например, первый организм может быть донором (таким как родственник (родитель или родной брат)) для второго организма. Модифицированные HSC могут иметь генетические модификации, чтобы устранить или облегчить, или уменьшить симптомы заболевания или состояния индивидуума, субъекта или пациента. Модифицированные HSC, например, в случае донорства первого организма второму, могут иметь генетические модификации, чтобы HSC имели один или более белков, таких как поверхностные маркеры или белки, больше похожие на маркеры второго организма. Модифицированные HSC могут иметь генетические модификации для имитации болезни или состояния индивидуума или субъекта или пациента и могут повторно вводиться в организм, не являющийся человеком, для получения моделей на животных. Увеличение HSC в количестве входит в компетенцию квалифицированного специалиста, на основании настоящего описания и знания в данной области, см., например, Lee, "Improved ex vivo expansion of adult hematopoietic stem cells by overcoming CUL4-mediated degradation of HOXB4." Blood. 2013 May 16;121(20):4082-9. doi: 10.1182/blood-2012-09- 455204. Epub 2013 Mar 21.

[001125] Как указано, для улучшения активности могут быть предварительно созданы комплексы гРНК с белком Cas (например, C2c1 или C2c3), перед тем как они окажутся в составе полного комплекса в частице. Составы могут созданы, исходя из различных молярных соотношений различных компонентов, про которые известно, что они могут способствовать доставке нуклеиновых кислот в клетки (например, 1,2-диолеил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP) или 1,2-дитетрадеканоил-sn-3-фосфохолин (DMPC), и/или в котором гидрофильный полимер содержит этиленгликоль или полиэтиленгликоль (PEG) и/или в котором частица далее содержит холестерин). Например, частица состава DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, холестерол 0; или DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, холестерин 0; или DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, холестерин 5, или DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, холестерин 0. Соответственно, изобретение предусматривает добавление гРНК, белка Cas (например, C2c1 или C2c3) и компонентов, формирующих частицу, а также частицы, получаемые при таком добавлении.

[001126] В предпочтительном варианте осуществления частицы, содержащие комплексы Cas (например, C2c1 или C2c3) с гРНК, могут быть образованы путем смешивания белка Cas (например, C2c1 или C2c3) и одной или более гРНК, предпочтительно в молярном соотношении фермента и направляющей РНК, равном 1:1. Отдельно различные компоненты, известные способностью способствовать доставке нуклеиновых кислот (например, DOTAP, DMPC, PEG и холестерин), растворяют, предпочтительно в этаноле. Два раствора смешивают вместе, чтобы сформировать частицы, содержащие комплексы Cas (например, C2c1 или C2c3) с гРНК. После образования частиц комплексы Cas (например, C2c1 или C2c3) с гРНК могут быть трансфицированы в клетки (например, HSC). Может применяться баркодирование. Частицы, Cas- и/или гРНК могут быть баркодированы.

[001127] Изобретение в одном из вариантов осуществления предусматривает способ получения частицы, содержащей белок Cas (например, C2c1 или C2c3) и гРНК, включающий смешение смеси гРНК и белка Cas (например, C2c1 или C2c3) со смесью, содержащей или по существу состоящей из поверхностно активных веществ, фосфолипидов, биодеградируемых липопротеина и спирта. Изобретение относится к частице, содержащей белок Cas (например, C2c1 или C2c3) и гРНК, согласно этому способу. Изобретение в одном из вариантов осуществления предусматривает использование частицы в способе модификации геномного локуса-мишени, или организма, или организма, не являющегося человеческим, путем манипуляции с последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени, включая приведение клетки, содержащей геномный локус-мишень, в контакт с частицей, где гРНК нацеливает на геномный локус-мишень; или способ модификации геномного локуса-мишени, или организма, или организма, не являющегося человеческим, путем манипуляции с последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени, включая приведение клетки, содержащей геномный локус-мишень, в контакт с частицей, где гРНК нацелена на геномный локус-мишень. В этих вариантах осуществления геномный локус-мишень преимущественно является геномным локусом в HSC.

[001128] Соображения для терапевтического применения: фактором, учитываемым в геном-редактирующей терапии является выбор нуклеазы, специфичной к последовательности, такой как вариант нуклеазы C2c1 или C2c3. Каждый вариант нуклеазы может обладать своим уникальным набором преимуществ и недостатков, многие из которых должны быть сбалансированы в контексте лечения, чтобы максимизировать терапевтическую эффективность. До сих пор два терапевтических подхода к редактированию нуклеазами продемонстрировали значительные перспективы: разрушение гена и коррекция гена. Разрушение гена включает стимуляцию репарации путем объединения негомологичных концов (NHEJ) для создания направленных инсерций-делеций в генетических элементах, что часто приводит к вызывающим потерю функции мутациям, которые полезны для пациентов. Напротив, для коррекции гена используется направляемая гомологией репарация (HDR), чтобы напрямую обратить мутацию, вызывающую заболевание, восстановить функцию, при этом сохраняя физиологическую регуляцию скорректированного элемента. Направляемая гомологией репарация также может быть использована для вставки терапевтического трансгена в определенный безопасный локус генома ("безопасную гавань"), чтобы восстановить потерянную функцию гена. Для того чтобы специфичная редактирующая терапия была эффективной, в популяции клеток-мишеней должен быть достигнут достаточно высокий уровень модификаций, чтобы обратить вспять симптомы заболевания. Этот "порог" терапевтической модификации определяется выживаемостью отредактированных клеток после лечения и количеством продукта гена, необходимого для обращения вспять симптомов. С учетом выживаемости клеток, редактирование создает три потенциальных результата для обработанных клеток относительно их неотредактированных копий: увеличение выживаемости, снижение выживаемости и отсутствие влияния на выживаемость. В случае увеличения выживаемости, например, при лечении X-сцепленного тяжелого иммунодефицита, модифицированные гемопоэтические клетки-предшественники селективно увеличиваются в количестве по сравнению с их неотредактированными копиями. X-сцепленный тяжелый иммунодефицит является заболеванием, вызванным мутациями в гене IL2RG, функционирование которого необходимо для правильного развития гемопоэтической лимфоцитарной линии [Leonard, W.J., et al. Immunological reviews 138, 61-86 (1994); Kaushansky, K. & Williams, W.J. Williams hematology, (McGraw-Hill Medical, New York, 2010)]. Во время клинических испытаний пациенты, получавшие вирусную генную терапию для лечения X-сцепленного тяжелого иммунодефицита при редком примере спонтанной коррекции мутации, связанной с X-сцепленным тяжелым иммунодефицитом, скорректированные гемопоэтические прогениторные клетки могут преодолевать этот блок развития и размножаться, по сравнению с их неотредактированными копиями, способствуя лечению [Bousso, P., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 274-278 (2000); Hacein-Bey-Abina, S, et al. The New England journal of medicine 346, 1185-1193 (2002); Gaspar, H.B., et al. Lancet 364, 2181-2187 (2004)]. В этом случае, когда отредактированная клетка обладает селективным преимуществом, даже низкое число отредактированных клеток могут быть увеличено в количестве, обеспечивая терапевтическую пользу для пациента. Напротив, редактирование других гемопоэтических заболеваний наподобие гранулематозного расстройства, может не вызывать изменений выживаемости отредактированных гемопоэтических клеток-предшественников, увеличивая порог терапевтической модификации. Гранулематозное расстройство вызвано мутациями в генах, кодирующих белки фагоцитарной оксидазы, которые обычно используются нейтрофилами для образования активных форм кислорода, чтобы убивать патогены [Mukherjee, S. & Thrasher, A.J. Gene 525, 17-4-181 (2013)]. Поскольку дисфункция этих генов не влияет на выживаемость или развитие гемопоэтических клеток-предшественников, а только на способность зрелых гемопоэтических клеток бороться с инфекцией, маловероятно, чтобы происходила предпочтительная экспансия отредактированных клеток при этом заболевании. Действительно, при гранулематозном расстройстве во время испытаний генной терапии в отредактированных гемопоэтических клетках-предшественниках не наблюдалось селективного преимущества, что приводило к трудностям при длительной имплантации клеток [Malech, H.L., et al. Proceedings of the National Academy of of the United States of America 94, 12133-12138 (1997); Kang, H.J., et al. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 19, 2092-2101 (2011)]. По существу, может требоваться значительно более высокий уровень редактирования для лечения заболеваний наподобие гранулематозного расстройства, при котором редактирование не создает преимущества для выживаемости, относительно заболеваний, при которых редактирование создает преимущества для выживаемости целевых клеток. Если редактирование лишает клетки преимущества для их выживаемости, как могло бы быть в случае восстановления функции гена опухолевого супрессора в опухолевой клетке, модифицированные клетки будут вытесняться неотредактированными клетками, из-за чего терапевтические преимущества оказались бы ниже относительно уровня редактирования. Этот последний класс заболеваний мог бы быть особенно трудным для лечения с помощью геномной редактирующей терапии.

[001129] В дополнение к выживаемости клеток, на минимальный уровень терапевтического редактирования генома, которое должно быть осуществлено для обращения вспять симптомов, также влияет количество продукта гена, необходимое для лечения заболевания. Гемофилия В является одним из заболеваний, при которых небольшое изменение количества продукта гена может приводить к значительным изменениям в клиническом результате. Это заболевание вызывается мутациями в гене, кодирующем фактор IX, белок, который в норме секретируется из печени в кровь, где он функционирует как компонент каскада реакций свертывания крови. Клиническая тяжесть гемофилии В связана с уровнем активности фактора IX. В то время как тяжесть заболевания связана с активностью ниже 1% от нормальной активности, более мягкие формы заболевания связаны активностью, превышающей 1% от нормальной активности фактора IX [Kaushansky, K. & Williams, W.J. Williams hematology, (McGraw-Hill Medical, New York, 2010), Lofqvist, T,, et al. Journal Of Internal Medicine 241, 395-400 (1997)]. Это позволяет предположить, что редактирующая терапия, которая может восстановить экспрессию фактора IX даже в небольшом проценте клеток печени, может оказать значительное влияние на клинический результат. Исследование, в котором используются ZFN для коррекции модели гемофилии В на мышах сразу после рождения, показало, что 3-7% достаточно для обращения вспять симптомов заболевания, обеспечивая доклинические доказательства для этой гипотезы [Li, H., et al. Nature Alb, 217-221 (2011)].

[001130] Расстройства, при которых малое изменение уровня продукта гена может влиять на клинический результат, и заболевания, при которых у отредактированных клеток появляются преимущества, связанные с выживанием, являются идеальными мишенями для терапии, связанной с редактированием генома, поскольку порог для терапевтической модификации достаточно низкий, чтобы обеспечить высокую вероятность успеха в условиях современных технологий. Использование в качестве мишеней этих заболеваний в настоящее время привело к успеху в редактирующей терапии на уровне доклинических исследований и фазе I клинических испытаний. Манипуляции для улучшения репарации двухцепочечных разрывов и доставки нуклеазы необходимы, чтобы экстраполировать эти многообещающие результаты на заболевания, при которых у отредактированных клеток нет преимуществ, связанных с выживанием, или при которых для лечения необходим больший уровень продукта гена. Таблица внизу показывает некоторые примеры применения редактирования генома для терапевтических моделей, и ссылки в таблице ниже и документы, цитированные в этих ссылках, включены в настоящем описании, как если бы они были изложены полностью.

[001131] Обращение к терапии каждого из состояний из таблицы с использованием системы CRISPR-Cas (например, C2c1 или C2c3) с помощью коррекции, опосредованной HDR, или вставки корректной последовательности гена, опосредованной HDR, преимущественно за счет системы доставки из настоящего изобретения, например, системы доставки частиц, входит в компетенцию квалифицированного специалиста на основании настоящего описания и знаний в данной области. Таким образом, один из возможных вариантов осуществления предусматривает взаимодействие HSC, несущих мутации, связанные с гемофилией В, тяжелым комбинированным иммунодефицитом или наследственной тирозинемией, с частицей, несущей гРНК и белок Cas (например, C2c1 или C2c3), направленными на геномный локус-мишень в случае гемофилии В, тяжелого комбинированного иммунодефицита (например, Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита, тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с недостаточностью аденозиндеаминазы) или наследственной тирозинемии (например, как в случае Li, Genovese or Yin). Частица может также содержать подходящую матрицу HDR для коррекции мутации; или HSC могут взаимодействовать со второй частицей или вектором, содержащим или доставляющим матрицу направляемой гомологией репарации. В этом отношении упоминается, что гемофилия В является сцепленным с Х-хромосомой рецессивным заболеванием, вызванным связанными с потерей функции мутациями в гене, кодирующим фактор IX, ключевой компонент каскада системы свертывания крови. Восстановление активности фактора IX выше 1% от его уровня у тяжелобольных может трансформировать заболевание в его значительно более мягкую форму, поскольку профилактическое введение рекомбинантного фактора IX в организм таких пациентов с раннего возраста для достижения такого уровня активности в значительной степени облегчает клинические осложнения. Обладая знаниями в данной области и идеями, описанными в настоящей заявке, квалифицированный специалист может корректировать HSC как в случае гемофилии В с использованием системы CRISPR-Cas (например, C2c1 или C2c3), которая направленно корректирует мутацию (Х-сцепленное рецессивное заболевание, вызванное вызывающей потерю функции мутацией в гене, кодирующем фактор IX) (например, с помощью подходящей матрицы HDR, которая доставляет кодирующую последовательность фактора IX), в частности, гРНК может быть направлена на мутацию, вызывающую развитие гемофилии В, и HDR может обеспечивать кодирование правильной экспрессии фактора IX. Частица, содержащая гРНК, направленную на мутацию, и белок Cas (например, C2c1 или C2c3), взаимодействует с несущими мутацию HSC. Частица может также содержать подходящую матрицу HDR, чтобы скорректировать мутацию для правильной экспрессии фактора IX, или HSC может взаимодействовать со второй частицей, которая содержит или доставляет матрицу HDR. Провзаимодействовавшие таким образом клетки могут быть введены; и необязательно обработаны/увеличены в количестве (см. статью Cartier, обсуждаемую в настоящем описании).

[001132] В статье Cartier, "MINI-SYMPOSIUM: X-Linked Adrenoleukodystrophypa, Hematopoietic Stem. Cell Transplantation and Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy in X-Linked Adrenoleukodystrophy," Brain Pathology 20 (2010) 857-862, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме с документами, которые в ней цитируются, утверждается, что аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSC) используется для доставки нормального лизосомального фермента в мозг пациента с болезнью Гурлер, и обсуждается генная терапия с помощью HSC для лечения адренолейкодистрофии. У двух пациентов периферические CD34+ клетки были собраны после мобилизации гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (G-CSF) и трансдуцированы энхансером вируса миелопролиферативной саркомы, участок негативной регуляции был удален, участок связывания праймера dl587rev был заменен в (MND)-ALD лентивирусном векторе. CD34+ клетки пациентов были трансдуцированы (MND)-ALD вектором в течение 16 ч в присутствии низкой концентрации цитокинов. Трансдуцированные CD34+ клетки были заморожены после трансдукции, чтобы провести на 5% клеток различные тесты на безопасность, которые включают, в частности, три анализа на репликационную компетентность лентивируса. Эффективность трансдукции CD34+ клеток варьировалась от 35% до 50% со средним значением числа интегрированных копий лентивируса между 0,65 и 0,7. После разморозки трансдуцированных CD34+ клеток пациентам было введено более 4.106 трансдуцированных CD34+ клеток/кг, после чего следовала миелоаблация с использованием бисульфана или циклофосфамида. HSC пациента были удалены, чтобы улучшить приживление HSC с корректированными генами. Гематологическое восстановление у двух пациентов происходило между 13 и 15 сутками. Почти полное иммунологическое восстановление происходило спустя 12 месяцев в случае первого пациента и спустя 9 месяцев в случае второго пациента. В отличие от использования лентивируса, квалифицированный специалист на основании знаний в данной области и идей, описанных в настоящем описании, может корректировать HSC при адренолейкодистрофии, используя систему CRISPR-Cas (например, C2c1 или C2c3), которая направленно корректирует мутацию (например, с помощью подходящей матрицы направляемой гомологией репарации); в частности, гРНК может быть направлена на мутации в гене ABCD1, расположенном на Х-хромосоме, которая кодирует ALD, лизосомальный мембранный белок-транспортер, и матрица HDR может обеспечить кодирование правильной экспрессии белка. Частица, содержащая гРНК, направленную на мутацию, и белок Cas (например, C2c1 или C2c3), взаимодействует с несущими мутацию HSC, например, с CD34+ клетками, несущими мутацию, согласно Cartier. Частица может также содержать подходящую матрицу HDR, чтобы скорректировать мутацию для правильной экспрессии лизосомального мембранного белка-транспортера, или HSC может взаимодействовать со второй частицей или вектором, который или которая содержит или доставляет матрицу HDR. Провзаимодействовавшие таким образом клетки могут быть обработаны, согласно Cartier. Провзаимодействовавшие таким образом клетки могут быть введены, согласно Cartier.

[001133] Упомянут патент WO 2015/148860, и за счет идей, описанных в настоящем описании, изобретение относится к способам и материалам этого документа, применимым в сочетании с идеями, описанными в настоящем описании. В аспекте генной терапии заболевания крови, методы и композиции для лечения β-талассемии могут быть адаптированы для CRISPR-Cas систем по настоящему изобретению (см, например, WO 2015/148860). В одном из возможных вариантов осуществления WO 2015/148860 включает лечение или профилактику β-талассемии или ее симптомов, например, посредством изменения гена В-клеточного CLL/лимфомы 11А (BCL11A). Ген BCL11A также известен как ген В-клеточного CLL/лимфомы 11А, BCLI1A-L, BCLI1A-S, BCL11AXL, CTIP1, HBFQTL5 и ZNF. BCLI1A кодирует белок с мотивом "цинковые пальцы", который вовлечен в регуляцию экспрессии генов глобинов. Изменяя ген BCL11A (например, один или оба аллеля гена BCL11A), можно увеличить уровень γ-глобина. γ-глобин может заменить β-глобин в комплексе гемоглобина и эффективно доставлять кислород в ткани таким образом, улучшая фенотип, характерный для β-талассемии.

[001134] Также упоминается патент WO 2015/148863, и за счет идей, описанных в настоящем описании, предусматриваются способы и материалы этого документа, которые могут быть адаптированы для систем CRISPR-Cas по настоящему изобретению. В одном из возможных аспектов лечения и предотвращения серповидноклеточной анемии, которая является наследственным заболеванием крови, WO 2015/148863 предусматривает изменение гена BCL11A. Путем изменения гена BCL11A (например, одного или обоих аллелей гена BCLI 1A), можно увеличить уровень γ-глобина. γ-глобин может заменить β-глобин в комплексе гемоглобина и эффективно доставлять кислород в ткани, таким образом, улучшая фенотип, характерный для серповидноклеточной анемии.

[001135] В одном из возможных аспектов изобретения предусматриваются способы и композиции, включающие редактирование последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или модулирование экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, и их применение в связи с иммунотерапией онкологических заболеваний путем адаптации системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Приводится ссылка на применение генной терапии в WO 2015/161276, которая включает способы и композиции, которые могут быть использованы для воздействия на Т-клеточную пролиферацию, выживаемость и/или функции путем изменения одного или более генов, экспрессируемых в Т-клетках, например, генов CBLB и/или PTPN6, генов FAS и/или BID, CTLA4 и/или PDCDI и/или TRAC и/или TRBC.

[001136] Т-клетки с химерным антигенным рецептором 19 (CAR19) демонстрируют противолейкозные эффекты у пациентов со злокачественными опухолями. Однако пациенты с лейкозами часто не имеют достаточно T-клеток для сбора, что означает, что лечение должно вовлекать модифицированные T-клетки доноров. Соответственно, представляет интерес создание банка донорских Т-клеток. В статье Qasim et al. ("First Clinical Application of Talen Engineered Universal CAR19 T Cells in B-ALL" ASH 57th Annual Meeting and Exposition, Dec. 5-8, 2015, Abstract 2046 (https://ash.confex.com/ash/2015/webprogram/Paper81653.html published online November 2015) обсуждается модификация CAR19 Т-клеток для предотвращения риска реакции "трансплантат против хозяина" посредством нарушения экспрессии Т-клеточного рецептора и нацеливания на CD52. Более того, было осуществлено нацеливание на клетки CD52 так, что они становились нечувствительными к алемтузумабу, и это позволяло алемтузумабу предотвращать реакцию отторжения хозяйским организмом CAR19 клеток с несовпадением человеческого лейкоцитарного антигена (HLA). Исследователи использовали самоинактивирующийся лентивирусный вектор 3-го поколения, кодирующий 4g7 CAR19 (CD19 scFv-4-1BB-CD3ζ), связанный с RQR8, затем вводили клетки посредством электропорации две пары мРНК TALEN для множественного нацеливания на оба локуса: локус α-константной цепи Т-клеточных рецепторов (TCR) и локус гена CD52. Совокупность клеток, которые продолжали экспрессировать TCR после увеличения в количестве ex vivo, истощали с помощью методики истощения α/β TCR CliniMacs, и получали продукт, состоящий из Т-клеток (UCART19) с экспрессией TCR <1% TCR, 85% которых экспрессировали CAR19 и 64% становились CD52-негативными. Модифицированные CAR19 Т-клетки вводили для лечения пациента с рецидивом острого лимфобластного лейкоза. Идеи, описанные в настоящем описании, обеспечивают эффективные способы предоставления модифицированных HSC и их потомков, включая, но не ограничиваясь ими, клетки миелоидной и лимфоидной линий клеток крови, включая Т-клетки, В-клетки, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, дендритные клетки и мегакариоциты или тромбоциты, или натуральные киллеры и их предшественники и производные клетки. Такие клетки могут быть модифицированы путем нокина, нокаута или других модулирующих агентов, например, для удаления или модулирования CD52, описанного выше, или других мишеней, таких как, но не ограничиваясь ими, CXCR4 и PD-1. Таким образом, композиции, клетки и способы по изобретению могут быть использованы для модулирования иммунных ответов и для лечения, но не ограничиваясь этим, злокачественных заболеваний, вирусных инфекций и иммунных заболеваний, в сочетании с модификацией введения Т-клеток и других клеток пациенту.

[001137] Упоминается патент WO 2015/148670, и за счет идей, описанных в настоящем описании, изобретение предусматривает способы и материалы этого документа, применимые в сочетании с идеями, изложенными в настоящем описании. В аспекте генной терапии предусматриваются способы и композиции для редактирования последовательности-мишени, родственной или связанной с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД). В связанном аспекте описываемое в настоящем описании изобретение предусматривает предотвращение и лечение ВИЧ-инфекции и СПИДа путем внесения одной или более мутаций в ген С-С хемокинового рецептора типа 5 (CCR5). CCR5 также известен как CKR5, CCR-5, CD195, CKR-5, CCCKR5, CMKBR5, 1DDM22 и CC-CKR-5. В следующем аспекте описываемое в настоящем описании изобретение предусматривает предотвращение или снижение ВИЧ-инфекции или снижение способности ВИЧ попадать в клетку-хозяина, например, у уже инфицированных индивидуумов. Приводимые в качестве примера клетки-хозяева ВИЧ включают, но не ограничиваются ими, CD4 клетки, T клетки, клетки лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником (GALT), макрофаги, дендритные клетки, клетки миелоидных предшественников и микроглию. Попадание вируса в клетку требует взаимодействия вирусных гликопротеинов gp41 и gpl20 одновременно с CD4 рецептором и корецептором, например, CCR5. Если корецептор, например CCR5, не присутствует на поверхности клеток-хозяев, вирус не может связываться и попадать в хозяйские клетки. Развитие заболевания таким образом затормаживается. Путем нокаута или нокдауна CCR5 в клетках-хозяевах, например, путем введения защитной мутации (такой как Δ32 мутация CCR5), предотвращается попадание ВИЧ в хозяйские клетки.

[001138] Х-сцепленная хроническая гранулематозная болезнь представляет собой наследственное заболевание защитной системы хозяина за счет отсутствия или снижения активности фагоцитарной NADPH-оксидазы. Предусматривается использование системы CR1SPR-Cas (C2c1 или C2c3), которая направленно корректирует мутацию (отсутствующую или сниженную активность фагоцитарной NADPH-оксидазы) (например, с помощью HDR-матрицы, которая доставляет кодирующую последовательность для фагоцитарной NADPH-оксидазы); в частности, гРНК может быть направлена на мутацию, которая дает начало Х-сцепленной гранулематозной болезни (недостаточность фагоцитарной NADPH-оксидазы), и HDR-репарация может обеспечить кодирование для правильной экспрессии фагоцитарной NADPH-оксидазы. Частицу, содержащая гРНК, направленную на мутацию, и белок Cas (например, C2c1 или C2c3), приводят в контакт с несущими мутацию HSC. Частица может также содержать подходящую HDR-матрицу, чтобы скорректировать мутацию для правильной экспрессии фагоцитарной NADPH-оксидазы, или HSC может взаимодействовать со второй частицей или вектором, которые содержат или доставляет HDR-матрицу. Провзаимодействовавшие таким образом клетки могут быть введены; и необязательно обработаны/увеличены в количестве (см. Cartier).

[001139] Анемия Фанкони: мутации по меньшей мере 15 генов (FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1/BRCA2, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ/BACTI1/BRIP1, FANCL/PHF9/POG, FANCM, FANCN/PALB2, FANCO/RadSlC и FANCP/SLX4/BTBD12) могут вызывать анемию Фанкони. Белки, образуемые этими генами, вовлечены в клеточный процесс, известный как сигнальный путь анемии Фанкони. Сигнальный путь анемии Фанкони включается (активируется), когда процесс создания новых копий ДНК, называемый репликацией ДНК, блокируется за счет повреждений ДНК. Сигнальный путь анемии Фанкони отправляет определенные белки к поврежденному участку, запуская репарацию ДНК, так что репликация ДНК может продолжаться. Сигнальный путь анемии Фанкони особенно чувствителен к конкретным типам повреждений ДНК, известным как межцепочечные сшивки. Межцепочечные сшивки происходят, когда два строительных блока ДНК (нуклеотида) на противоположных цепях ДНК аномально прикреплены друг к другу или соединены вместе, что останавливает процесс репликации ДНК. Межцепочечные сшивки могут быть вызваны встраиванием токсичных соединений, образуемых в организме, или при лечении некоторыми противоопухолевыми соединениями. Восемь белков, ассоциированных с анемией Фанкони, группируются вместе, образуя комплекс, известный как коровый FA-комплекс. Коровый FA-комплекс активирует два белка, называемых FANCD2 и FANCF. Активация этих двух белков привлекает белки репарации ДНК к участку межцепочечной сшивки, так что сшивка может быть удалена и репликация ДНК сможет продолжаться. В частности, коровый FA-комплекс является ядерным мультипротеиновым комплексом, состоящим из FANCA, FANCB, FANCC, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL и FANCM, функционирующим как убиквитинлигаза и опосредующим активацию ID-комплекса, который является гетеродимером, состоящим из FANCD2 и FANCI. Будучи моноубиквитинилированным, он взаимодействует с классическими опухолевыми супрессорами ниже по сигнальному пути анемии Фанкони, включая взаимодействия FANCD1/BRCA2, FANCN/PALB2, FANCJ/BRIP1 и FANCO/Rad51C, и таким образом, вносит вклад в репарацию ДНК за счет гомологичной рекомбинации. 80-90% случаев анемии Фанкони происходят за счет мутации от одного до трех генов: FANCA, FANCC и FANCG. Эти гены предоставляют инструкции для образования компонентов корового FA-комплекса. Мутации в таких генах, ассоциированных с коровым FA-комплексом, сделают комплекс нефункциональным и нарушат весь сигнальный путь анемии Фанкони. В результате повреждение ДНК не будет репарироваться эффективно, и межцепочечные сшивки будут со временем накапливаться. В статье Geiselhart, "Review Article, Disrupted Signaling through the Fanconi Anemia Pathway Leads to Dysfunctional Hematopoietic Stem Cell Biology: Underlying Mechanisms and Potential Therapeutic Strategies," Anemia Volume 2012 (2012), Article ID 265790, http://dx.doi.org/10. 1155/2012/265790 обсуждается анемия Фанкони и эксперименты на животных, включающие интрафеморальную инъекцию лентивируса, кодирующего ген FANCC, что приводило к коррекции HSC in vivo. Предусматривается использование системы CRISPR-Cas (C2c1 или C2c3), которая направлена на одну или более мутаций, ассоциированных с анемией Фанкони, например, системы CRISPR-Cas (C2c1 или C2c3), содержащей гРНК или HDR-матрицу(ы), которые соответственно направлены на одну или более мутаций FANCA, FANCC или FANCG, которые вызывают анемию Фанкони, и обеспечивает корректную экспрессию одного или более FANCA, FANCC или FANCG; например, гРНК может быть направлена на мутацию в FANCC, и HDR-репарация (направляемая гомологией репарация) может обеспечивать кодирование правильной экспрессии FANCC. Частицу, содержащую гРНК, направленную на мутацию(и) (например, одну или более, вовлеченные в развитие анемии Фанкони, такие как мутации(я) одного или более из FANCA, FANCC или FANCG) и белок Cas (C2c1 или C2c3) приводят в контакт с HSC, несущими мутацию(и). Частица может также содержать подходящую HDR-матрицу, чтобы скорректировать мутацию для правильной экспрессии одного или более белков, вовлеченных в развитие анемии Фанкони, или HSC может взаимодействовать со второй частицей или вектором, которые содержат или доставляют HDR-матрицу. Провзаимодействовавшие таким образом клетки могут быть введены и необязательно обработаны/увеличены в количестве (см. Cartier).

[001140] Упоминаемая в настоящем описании частица (например, содержащая гРНК и Cas (например, C2c1 или C2c3), необязательно HDR-матрицу(ы); например для заболеваний, таких как гемофилия В, тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID), Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит, тяжелый комбинированный иммунодефицит, связанный с недостаточностью аденозиндеаминазы, наследственная тирозинемия, β-талассемия, Х-сцепленная гранулематозная болезнь, синдром Вискотта-Олдрича, анемия Фанкони, адренолейкодистрофия, метахроматическая лейкодистрофия, ВИЧ-инфекция/СПИД, синдром иммунодефицита, гематологические заболевания или генетическая лизосомная болезнь накопления) преимущественно получают или могут получить при добавлении смеси гРНК и белка Cas (C2c1 или C2c3) (необязательно содержащей HDR-матрицу(ы) или такую смесь, содержащую только HDR-матрицу(ы), если желательна отдельная частица для матриц(ы)) к смеси, содержащей или по существу состоящей или состоящей из поверхностно активных веществ, фосфолипидов, биодеградируемых липопротеина и спирта (причем одна или более гРНК нацелены на геномный(е) локус(ы) в нейрональных стволовых клетках).

[001141] Действительно, изобретение особенно подходит для лечения генетических гемопоэтических заболеваний путем геномного редактирования и синдромов иммунодефицита, таких как генетические синдромы иммунодефицита, особенно за счет использования технологий частиц, описанных в настоящем описании. Генетические иммунодефициты являются заболеваниями, при которых могут быть успешными вмешательства путем редактирования генома, согласно настоящему изобретению. Причины включают: гемопоэтические клетки, подмножеством которых являются иммунные клетки, являются терапевтически доступными. Они могут быть удалены из организма и трансплантированы аутологично или аллогенно. Далее, конкретные генетические иммунодефициты, например, тяжелый комбинированный иммунодефицит, пролиферативно невыгодны для иммунных клеток. Коррекция генетических повреждений, вызывающих тяжелый комбинированный иммунодефицит, путем редких спонтанных "обратных" мутаций указывает на то, что коррекция даже одного предшественника лимфоцита может быть достаточной для восстановления функций иммунитета у пациентов (см. Bousso, P., et al. Diversity, functionality, and stability of the T cell repertoire derived in vivo from a single human T cell precursor. Proceedings of the- National Academy of Sciences of the United States of America 97, 274-278 (2000)). Селективное преимущество отредактированных клеток обеспечивает то, что даже низкий уровень редактирования приводит к терапевтическому эффекту. Этот эффект настоящего изобретения может быть виден при тяжелом комбинированном иммунодефиците, синдроме Вискотта-Олдрича и других упомянутых здесь состояниях, включая другие генетические болезни гемопоэтической системы, такие как α- и β-талассемия, при которых недостаточность гемоглобина отрицательно влияет на выживаемость предшественников эритроцитов.

[001142] Активность репарации NHEJ и HDR значительно варьируется в зависимости от типа клетки и состояния клетки. NHEJ-репарация не регулируется в значительной степени в зависимости от клеточного цикла и эффективна в различных типах клеток, что обеспечивает высокий уровень нарушения генов в доступных популяциях клеток-мишеней. Напротив, HDR-репарация происходит в основном во время S/G2-фазы и, следовательно, ограничивается клетками, которые активно делятся, что ограничивает мишени лечения, требующие точных геномных модификаций, митотическими клетками [Ciccia, A. & Elledge, S.J. Molecular cell 40, 179-204 (2010); Chapman, J.R., et al. Molecular cell 47, 497-510 (2012)].

[001143] Эффективность коррекции при HDR-репарации может регулироваться эпигенетическим состоянием или последовательностью локуса-мишени или конфигурацией используемой специфичной матрицы репарации (одно- или двухцепочечной, с длинными или короткими гомологичными плечами). [Hacein-Bey-Abina, S., et al. The New England journal of medicine 346, 1185-1193 (2002); Gaspar, H.B., et al. Lancet 364, 2181-2187 (2004); Beumer, K.J., et al. G3 (2013)]. Относительная активность машинерии NHEJ-репарации и HDR-репарации в клетках-мишенях может также влиять на на эффективность коррекции гена, поскольку эти пути могут конкурировать за репарацию двухцепочечных разрывов Beumer, K.J., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Slates of America 105, 19821-19826 (2008)], HDR-репарация также налагает ограничения на доставку, которых нет в случае стратегий NHEJ-репарации, поскольку она требует одновременной доставки нуклеаз и матриц репарации. При практическом применении эти ограничения до сих пор приводили к низкому уровню HDR-репарации в терапевтически значимых типах клеток. Клиническое применение поэтому во многом сфокусировано на стратегиях NHEJ-репарации для лечения заболеваний, хотя доклинические исследования по проверке концепции HDR-репарации сейчас описаны для модели гемофилии В на мышах и наследственной тирозинемии [Li, H., et al. Nature 475, 217-221 (2011); Yin, H, et al. Nature biotechnology 32, 551-553 (2014)].

[001144] Любое данное применение геномного редактирования может включать комбинации белков, молекул малых РНК и/или матриц репарации, что делает доставку множества этих частей значительно более сложной, чем терапия низкомолекулярными соединениями. Разработаны две основные стратегии доставки инструментов редактирования генома ex vivo и in vivo. При обработках ex vivo нарушенные клетки, ассоциированные с заболеванием, удаляются из организма, редактируются и трансплантируются обратно пациенту. Редактирование ex vivo обладает тем преимуществом, что позволяет четко определить популяцию клеток-мишеней и определить конкретную дозировку терапевтических молекул, доставляемых в клетки. Последнее соображение может быть особенно важным, когда есть угроза нецелевых модификаций, поскольку титрование количества нуклеазы может снизить уровень таких мутаций (Hsu et al., 2013). Другим преимуществом подходов ex vivo является обычно высокий уровень редактирования, который может быть достигнут за счет разработки эффективных систем доставки белков и нуклеиновых кислот в клетки в культуре в рамках исследований и применения в генной терапии.

[001145] У подходов ex vivo могут быть недостатки, которые ограничивают применение до малого числа заболеваний. Например, клетки-мишени должны быть способны выжить во время манипуляций вне организма. В случае многих тканей, таких как ткани мозга, культивирование клеток вне организма является главной проблемой, поскольку клетки или не выживают, или теряют свойства, необходимые для их функций in vivo. Таким образом, в свете настоящего изобретения и знаний в данной области возможна терапия ex vivo в случае тканей с популяциями стволовых клеток взрослых, таких как гемопоэтическая система, поддающихся культивированию и манипуляциям ex vivo посредством системы CRISPR-Cas (C2c1 или C2c3). [Bunn, H.F. & Aster, J. Pathophysiology Of Blood Disorders, (McGraw-Hill, New York, 2011)].

[001146] Геномное редактирование in vivo включает прямую доставку редактирующих систем в типы клеток в их ткани. Редактирование in vivo позволяет лечить заболевания, при которых популяция пораженных клеток не поддается манипуляциям ex vivo. Более того, доставка in situ нуклеаз в клетки позволяет лечить сразу множество тканей и клетки множества типов. Эти свойства, вероятно, позволяют применять обработки in vivo к более широкому спектру заболеваний, чем подходы к терапии ex vivo.

[001147] На сегодняшний день, редактирование in vivo было во многом достигнуто благодаря использованию вирусных векторов с определенным тканеспецифическим тропизмом. Такие векторы в настоящий момент ограничены с точки зрения размера переносимого груза и тропизма, ограничивая этот тип терапии системами органов, в которых трансдукция клинически эффективными векторами является эффективной, такими как печень, мышцы и глаза [Kotterman, M.A. & Schaffer, D.V. Nature reviews. Genetics 15, 445-451 (2014); Nguyen, T.H. & Ferry, N. Gene therapy 11 Suppl 1, S76-84 (2004), Boye, S.E., et al. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 509-519 (2013)].

[001148] Потенциальным барьером для доставки in vivo является иммунный ответ, который может спровоцироваться в ответ на высокое количество вируса, необходимо для лечения, но этот феномен не является уникальным для геномного редактирования и часто наблюдается при других способах генной терапии на основе вирусов [Bessis, N., et al. Gene therapy 11 Suppl 1, S10-17 (2004)]. Также возможно, что пептиды из редактирующих нуклеаз сами презентируются на молекулах MHC класса I, стимулируя иммунный ответ, хотя в доклинических исследованиях мало подтверждений этому. Другой значительной проблемой в связи с этим способом терапии является контроль распространения и впоследствии дозировки редактирующих геном нуклеаз in vivo, что приводит к нецелевым профилям мутаций, которые может быть сложно предсказать. Однако с учетом настоящего изобретения и знаний в данной области, использование способов терапии на базе вирусов и частиц для использования в лечении онкологических заболеваний, модифицикации HSC in vivo, например, с помощью доставки частицей или вирусом, входит в компетенцию квалифицированного специалиста.

[001149] Редактирующая терапия ex vivo: долгосрочные клинические исследования по очистке, культивированию и трасплантации гематопоээтических клеток позволили заболеваниям крови, таким как СПИД, анемия Фанкони, синдром Вискотта-Олдрича и серповидноклеточной анемии, оказаться в фокусе редактирующей терапии ex vivo. Другая причина сфокусироваться на HSC - это существование относительно высокоэффективных систем доставки, благодаря предшествовавшим попыткам разработать генную терапию заболеваний крови. С учетом этих преимуществ, данный способ терапии может применяться для заболеваний, при которых отредактированные клетки обладают преимуществом, связанным с выживанием, поэтому малое число привитых отредактированных клеток может размножаться и лечить заболевание. Одно такое заболевание представляет собой ВИЧ, при котором инфекция приводит к невыгодности выживания CD4+ T-клеток.

[001150] Область использования основанной на ex vivo редактировании терапии недавно расширилась и включила в себя стратегии коррекции генов. Препятствующие HDR ex vivo факторы были преодолены в недавней статье Genovese и соавторов, которым удалось выполнить генную коррекцию мутированного гена IL2RG в гемопоэтических стволовых клетках (HSC), полученных от пациента, страдающего X-сцепленным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID-X1) [Genovese, P., et al. Nature 510, 235240 (2014)]. Genovese et. al успешно осуществили генную коррекцию в HSC с использованием мультимодальной стратегии. Сначала проводилась трансдукция HSC с применением лентивируса со сниженной интеграцией, содержащего матрицу HDR, кодирующую терапевтическую кДНК для IL2RG. После трансдукции проводилась электропорация клеток с мРНК, кодирующей ZFN, нацеленную на "горячую точку" мутаций в IL2RG для того, чтобы стимулировать основанную на HDR генную коррекцию. С целью увеличения скорости HDR используются оптимизированные условия культивирования, стимулирующие деление HSC. При оптимизированных условиях культивирования нуклеазы и матрицы HDR, несущие корректированные гены HSC от пациента с SCID-X1, были получены в культуре со скоростью, имеющей терапевтическую значимость. HSC от имеющих заболевание индивидов, к которым была применена та же самая процедура генной коррекции, могут поддерживать долговременный гемопоэз в мышах, являющихся золотым стандартом функций HSC, HSC способны производить гемопоэтические клетки всех типов и могут быть аутологично трансплантированы, что делает их исключительно ценной популяцией клеток для использования при всех гемопоэтических генетических заболеваний [Weissman, I.L. & Shizuru, J.A, Blood 112, 3543-3553 (2008)]. Прошедшие генную коррекцию в HSC могут, в принципе, быть использованы для лечения широкого круга генетических заболеваний крови, что делает настоящее исследование воодушевляющим прорывом в терапевтическом редактировании генома.

[001151] Терапия на основе редактирования in vivo: редактирование in vivo может быть успешно применено, как следует из настоящей Заявки и представлений данной области. В случае систем органов, для которых доставка осуществляется успешно, к настоящему времени достигнут ряд многообещающих успехов доклинических испытаний. Первый пример успешной терапии на основе редактирования in vivo был показан для модели гемофилии В на мышах [Li, H., et al. Nature 475, 217-221 (2011)]. Как отмечалось раннее, гемофилия В является X-сцепленным рецессивным заболеванием, вызванным мутацией типа "потеря функции" в гене, кодирующем фактор IX, являющийся ключевым компонентом каскада свертывания крови. Возвращение уровня активности Фактора IX до значений свыше 1% от уровня такового у индивидов с тяжелой патологией может перевести болезнь в значительно более мягкую форму, введение рекомбинантного Фактора IX таким пациентам в качестве профилактики начиная с раннего возраста для того, чтобы достигнуть таких уровней в значительной степени снижает выраженность клинических осложнений [Lofqvist, T. et al. Journal of internal medicine 241, 395-400 (1997)]. Таким образом, только низкие уровни коррекции гена HDR необходимы для изменения клинических исходов пациентов. Помимо этого, фактор IX синтезируется и секретируется печенью, органом, который может быть эффективно трансдуцирован посредством вирусных векторов, кодирующих системы редактирования.

[001152] С использованием гепатотропных аденоассоциированных вирусных (AAV) серотипов, кодирующих ZFN и корректирующую матрицу HDR, возможно добиться генной коррекции мутированного гуманизированного гена Факторв IX в печени мыши достигающей 7% [Li, H., et al. Nature 475, 217-221 (2011)]. Результатом этого стало улучшение кинетики тромбообразования, являющейся мерой функции каскада свертывания крови, впервые продемонстрировавшей, что терапия на основе редактирования in vivo не только возможна, но также эффективна. Как обсуждается в настоящем описании, квалифицированный специалист должен руководствоваться изложенными в настоящей спецификации идеями и знаниями в данной области, например, работами Li, для решения лечения гемофилии В с помощью содержащей частицу матрицы HDR и системы CRISPR-Cas (C2c1 или C2c3), которая нацелена на мутацию X-сцепленного рецессивного заболевания для того, чтобы обратить вспять мутацию с потерей функции.

[001153] Опираясь на данное исследование, другие группы ученых недавно использовали редактирование генома in vivo в печени с помощью CRlSPR-Cas для успешного лечения наследственной тирозинемии в модели на мышах и создания мутаций, обеспечивающих защиту против сердечно-сосудистых заболеваний. Эти два различных применения показывают универсальность данного подхода в случае заболеваний, включающих дисфункцию печени. [Yin, H., et al. Nature biotechnology, 32, 551-553 (2014); Ding, Q., et al. Circulation research 115, 488-492 (2014)]. Применение редактирования in vivo к другим системам органов необходимо для обоснования того, что данная стратегия является широко применимой. В настоящее время предпринимаются усилия по оптимизации как вирусных и невирусных векторов для того, чтобы расширить круг заболеваний, терапию которых возможно проводить с помощью такого подхода [Kotterman, M.A. & Schaffer, D.V. Nature reviews. Genetics 15, 445-451 (2014); Yin, H., et al. Nature reviews. Genetics 15, 541-555 (2014)]. Согласно настоящему описанию, квалифицированный специалист должен использовать приведенные здесь идеи и знания в данной области, например, работы Yin, для того чтобы применять при лечении наследственной тирозинемии содержащую частицы матрицу HDR и систему CRISPR-Cas (C2c1 или C2c3), нацеленную на эту мутацию.

[001154] Направленная делеция, терапевтические применения: может быть предпочтительной направленная делеция генов. Следовательно, предпочтительными являются гены, вовлеченные в иммунодефицитные состояния, гематологические расстройства или генетические лизосомные болезни накопления, например, гемофилию B, тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID), X-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID-X1), тяжелый комбинированный иммунодефицит с дефицитом аденозиндезаминазы (ADA-SCID), наследственную тирозинемию, β-талассемия, X-сцепленный хронический гранулематоз (CGD), синдром Вискотта-Олдрича, анемию Фанкони, адренолейкодистрофия (ALD), метахроматическую лейкодистрофию (MLD), ВИЧ/СПИД, другие метаболические заболевания, гены, кодирующие неправильно свернутые белки, вовлеченные в заболевания, гены, приводящие к потере функции, вовлеченные в заболевания; в целом, мутации, на которые может быть осуществлено нацеливание в HSC с применением любой описанной в настоящем описании системы доставки в системой на основе частиц, рассматриваются как предпочтительные.

[001155] В настоящем изобретении иммуногенность фермента CRISPR может быть снижена, в частности, с использованием подхода, впервые описанного Tangri et al. в отношении эритропоэтина и получившего дальнейшее развитие. В соответствии с этим направленная эволюция или рациональное конструирование могут быть использованы для снижения иммуногенности фермента CRISPR (например, C2c1 или C2c3) в организме хозяина (человека или других видов).

[001156] Редактирование генома: системы CRISPR/Cas (C2c1 или C2c3) по настоящему изобретению могут быть использованы для коррекции генетических мутаций, предыдущие попытки которой были преприняты ранее с ограниченным успехом при помощи TALEN, ZFN и лентивирусов, включая рассматриваемые в настоящем описании; см. также WO2013163628.

Лечение заболеваний головного мозга, центральной нервной и иммунной систем

[001157] Настоящее изобретение также предусматривает доставку систем CRISPR-Cas в головной мозг или нейроны. Например, РНК-интерференция (РНК-i) предоставляет возможности для терапии этих расстройств путем снижения экспрессии HTT, гена, вызывающего болезнь Хантингтона (см., например, McBride et al. Molecular Therapy vol. 19 no. 12 Dec. 2011, pp. 2152-2162), следовательно, заявители утверждают, что ее можно использовать вместе с и/или адаптировать к системе CRISPR-Cas. Система CRISPR-Cas может быть получена при помощи алгоритма снижения потенциала нецелевого действия антисмысловых последовательностей. Последовательности CRISPR-Cas могут быть нацелены на последовательность экзона 512 мыши, резус или хантингин человека и быть экспрессированы с помощью вирусного вектора, в частности, AAV. Животным, включая человека, могут быть произведены примерно три микроинъекции на одно полушарие (всего шесть инъекций): первая на 1 мм ростральнее передней комиссуры (12 мкл) и две остальные инъекции (12 и 10 мкл, соответственно), локализованные на 3 и 6 мм каудальнее первой инъекции, содержащие 1e12 мг/мл AAV со скоростью примерно 1 мкл/мин, причем игла остается на месте еще на 5 мин, чтобы позволить введенному раствору распространиться от кончика иглы.

[001158] DiFiglia et al. (PNAS, October 23, 2007, vol. 104, no. 43, 17204-17209) сделали наблюдение, что единичное введение в стриатум взрослого миРНК, нацеленных на HTT, может вызывать сайленсинг мутантного HTT, ослаблять патологию нейронов и отсрочить проявление патологического фенотипа поведения, наблюдаемого при быстро развивающейся форме полученной с помощью вируса трансгенной модели HD. В работе DiFiglia производилось введение мышам интрастриально 2 мкл Су3-меченной cc-миРНК-HTT или неконъюгированной миРНК-HTT в концентрации 10 мкМ. Сходная дозировка CRISPR Cas, нацеленного на HTT, может предусматриваться в рамках настоящего изобретения для человека, например, приблизительно 5-10 мл 10 мкМ CRISPR Cas, нацеленного на HTT, можно вводить интрастриально.

[001159] В другом случае Boudreau et al. (Molecular Therapy vol. 17 no. 6 June 2009) вводили 5 мкл рекомбинантного векторов AAV серотипа 2/1, экспрессирующих вирус с HTT-специфичной iРНК (в концентрации 4×10¹² геномов вируса/мл) в стриатум. Сходная дозировка CRISPR Cas, нацеленного на HTT, может предусматриваться в рамках настоящего изобретения для человека, например, приблизительно 10-20 мл раствора CRISPR Cas, нацеленного на HTT, с концентрацией 4×10¹² вирусных геномов на мл, могут вводиться интрастриально.

[001160] Другим примером является CRISPR Cas, который нацелен на HTT и вводится непрерывно (см., например, Yu et al., Cell 150, 895-908, August 31, 2012). Yu et al. использовали осмотические насосы, вливающие 0,25 мкл/ч (Model 2004) для доставки оц-миРНК или фосфатно-солевой буфер со скоростью 300 мг/сутки (PBS) (Sigma Aldrich) на протяжении 28 суток, и насосы, сконструированные для доставки 0,5 мкл/час (Model 2002), использовались для вливания 75 мг/день положительного контроля MOE ASO на протяжении 14 суток. Насосы (Durect Corporation) заполняли оц-миРНК или MOE, растворенными в стерильном PBS, и далее инкубировали при 37°C на протяжении 24 или 48 часов (Model 2004) перед имплантацией. В качестве анестезии мышам вводился 2,5% изофлуоран, срединный разрез производился в основании черепа. Стереотаксически направляемая имплантация канюли служила для ее введения в правый латеральный желудочек, далее она герметично закреплялась клеем Loctite. Катетер, присоединенный к осмотической мини-помпе, соединялся с канюлей; помпа помещалась подкожно в области средней лопатки. На место разреза накладывали нейлоновые швы 5,0. Сходная дозировка CRISPR Cas, нацеленного на HTT, может предусматриваться в рамках настоящего изобретения для человека, например, возможно введение приблизительно от 500 до 1000 г CRISPR Cas, нацеленного на HTT, ежедневно.

[001161] В другом примере непрерывного введения, Stiles et al. (Experimental Neurology 233 (2012) 463-471) имплантировали внутрь паренхимы катетер с титановым кончиком иглы в правый путамен. Катетер соединялся с насосом SynchroMed® II Pump (Medtronic Neurological, Миннеаполис, Миннесота), имплантированным подкожно в брюшную полость. После 7 суток вливания фосфатного солевого буфера со скоростью 6 мкл/суток, насосы повторно наполняли тестируемым образцом и программировали на непрерывное вливание на протяжении 7 дней. Примерно от 2,3 до 11,52 мг миРНК в день вливались с изменяющейся скоростью введения, равной примерно от 0,1 до 0,5 мкл/мин. Сходная дозировка CRISPR Cas, нацеленного на HTT, может предусматриваться в рамках настоящего изобретения для человека, например, возможно введение приблизительно от 20 до 200 мг CRISPR Cas, нацеленного на HTT. В другом примере способы патентной публикации США № 20130253040, зарегистрированной Sangamo, могут также быть адаптированы на основе TALES для нацеленной на нуклеиновые кислоты системы по настоящему изобретению с целью лечения болезни Хантингтона.

[001162] Другим примером служат способы патентной публикации США № 20130253040 (WO2013130824), зарегистрированной Sangamo, которые также могут быть адаптированы с TALES к системе CRISPR Cas по настоящему изобретению с целью лечения болезни Хантингтона.

[001163] В WO2015089354 A1, зарегистрированной Broad Institute et al., включенной в настоящее описание в качестве ссылки, описаны мишени для болезни Хантингтона (HD). Возможные гены-мишени комплекса CRISPR применительно к болезни Хантингтона: PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4 и TGM2. В соответствии с этим в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или более из списка PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4 и TGM2 могут быть выбраны в качестве мишеней для болезни Хантингтона.

[001164] Другие заболевания связанны с тринуклеотидными повторами. Таковые могут включать любые из следующих: категория I включает болезнь Хантингтона (HD) и спиномозжечковые атаксии; экспансии категории II отличаются фенотипически от гетерогенных экспансий, которые обычно имеют малую протяженность, но также находятся в экзонах генов; категория III включает синдром хрупкой X-хромосомы, миотоническую дистрофию, две спиномозжечковые атаксии, ювенильную миоклоническую эпилепсию и атаксию Фридрейха.

[001165] Следующий аспект изобретения относится к использованию системы CRISPR-Cas для коррекции дефектов в генах EMP2A и EMP2B, которые были идентифицированы как ассоциированные с болезнью Лафоры. Болезнь Лафоры является аутосомно-рецессивным заболеванием, которое характеризуется прогрессивным миоклональной эпилепсией, которая может начинаться с эпилептических припадков в подростковом возрасте. Редкие случаи данного заболевания могут быть вызваны мутациями в не идентифицированных к настоящему времени генах. Данное заболевание вызывает припадки, спазмы мышц, нарушения ходьбы, деменцию и, в конечном итоге, смерть. В настоящее время нет способов лечения, продемонстрировавших эффективность в отношении прогрессирования заболевания. Cистема CRISPR-Cas также может быть нацелена на другие генетические аномалии, ассоциированные с эпилепсией, и лежащие в основе генетические механизмы описаны в Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, edited by Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology: 20; 2009).

[001166] Способы патентной публикации США № 20110158957, зарегистрированной Sangamo BioSciences, Inc., вовлеченные в инактивации генов Т-клеточных рецепторов (TCR), могут также быть модифицированы для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. В другом примере способы патентной публикации США № 20100311124, зарегистрированной Sangamo BioSciences, Inc., и способы патентной публикации США № 20110225664, зарегистрированной Cellectis, которые в обоих случаях вовлечены в инактивацию экспрессии гена глутаминсинтетазы, могут также быть модифицированы для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

[001167] Выбор способов доставки в головной мозг включает инкапсуляцию фермента CRISPR и направляющей РНК в форме ДНК или РНК в липосомы и их конъюгацию с молекулярными "троянскими конями" для доставки через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ). Молекулярные "троянские кони" продемонстрировали эффективность для доставки векторов экспрессии B-gal в головной мозг приматов, отличных от человека. Тот же подход может быть использован для доставки при помощи векторов, содержащих фермент CRISPR и направляющую РНК. Например, Xia CF and Boado RJ, Pardridge WM ("Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology." Mol Pharm. 2009 May- Jun;6(3):747-51. doi: 10.1021/mp800194) описывает, каким образом доставка малых интерферирующих РНК (миРНК) в клетки культуры и in vivo может быть возможна при комбинированном применении рецептор-специфичных моноклональных антител (mAb) и технологии авидина и биотина. Авторы также сообщили о том, что в силу того, что связь между нацеливающим mAb и миРНК является стабильной при использовании технологии авидина-биотина, эффекты РНК-i в отдаленных участках, в частности, в головном мозге, наблюдаются in vivo после внутривенного введения нацеленной миРНК.

[001168] Zhang et al. (Mol Ther. 2003 Jan;7(l):11-8.)) описывают плазмиды экспрессии, кодирующие репортерные конструкции, такие как люцифераза, инкапсулированные внутри вируса, содержащего пегилированные иммунолипосомы размером 85 нм, которые нацелены на головной мозг макака-резус in vivo, посредством моноклональных антител (MAb) к рецептору инсулина человека (HIR). HIRMAb делает возможным перенос липосомой экзогенного гена для его последующего трансцитоза через гемато-энцефалический барьер и эндоцитоза через плазматическую мембрану нейрона после внутривенного введения. Уровень экспрессии гена люциферазы в головном мозге был в 50 раз выше в случае макака-резус в сравнении с мышью. Протекание нейронной экспрессии гена бета-галактозидазы в значительной части головного мозга было продемонстрировано при помощи гистохимии и конфокальной микроскопии. Авторы указывают, что данный подход делает возможным обратимый трансгенез у взрослых на протяжении 24 часов. В соответствии с этим использование иммунолипосом является предпочтительным. Они могут быть использованы в сочетании с антителами для нацеливания на конкретные ткани или белки клеточной поверхности.

[001169] В патентной публикации США № 20110023153 описывано использование нуклеаз типа цинковых пальцев для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с болезнью Альцгеймера (AD). После модификации клетки и животные могут в дальнейшем быть протестированы с применением известных способов для исследования эффектов направленных мутаций на развитие и/или прогрессирование AD с применением широко используемых при изучении AD показателей, таких как, но не ограничиваясь ими, обучение и память, тревожность, депрессия, зависимость, чувствительные и моторные функции, а также способы анализа, оценивающие поведенческие, функциональные, патологические, метаболические и биохимические функции.

[001170] Настоящая заявка охватывает редактирование любых хромосомных последовательностей, кодирующих белки, ассоциированные с AD. Связанные с AD белки обычно выбирают на основе показанной в экспериментах ассоциации связанных с AD белков с заболеванием AD. Например, скорость образования или циркулирующая концентрация связанного с AD белка может быть повышена или понижена в популяции, имеющей расстройства, связанные с AD, в сравнении с популяцией без AD. Различия в уровнях белков могут быть оценены с использованием методик протеомики, включая, но не ограничиваясь ими, вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание, иммуноферментный анализа (ELISA) и масс-спектрометрию. Альтернативно этому связанные с AD белки могут быть идентифицированы путем получения профилей генной экспрессии для генов, кодирующих белки, с применением методик геномики, включающих, не ограничиваясь таковыми, анализ на микрочипах ДНК, серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (кПЦР).

[001171] Примерами ассоциированных с болезнью Альцгеймера белков являются рецептор липопротеина очень низкой плотности (VLDLR), кодируемый геном VLDLR, подобный убиквитину модифицирующий активирующий белок 1 (UBA1), кодируемый геном UBA1, или белок, NEDD8-активирующий каталитическую субъединицу E1 фермента (UBE1C), кодируемый, например, геном UBA3.

[001172] В качестве неограничивающего примера, ассоциированные с AD белки могут включать, но не ограничиваться ими, следующие: кодируемый хромосомной последовательностью белок ALAS2, дельта-аминолевуленатсинтаза 2 (ALAS2), ABCA1 ATP-связывающий кассетный транспортер (ABCA1), ангиотензин-превращающий фермент I ACE (ACE), предшественник аполипопротеина E APOE (APOE), белок-предшественник амилоида APP (APP), белок аквапорин I AQP1 (AQP1), зависимый от Myc-бокса взаимодействующий белок I BIN1 или соединяющий интегрирующий белок 1 (BIN1), нейротрофический фактор головного мозга BDNF (BDNF), подобный бутирофилину белок 8 BTNL8 (BTNL8), открытая рамка считывания 49 хромосомы 1 C10RF49, кадгерин-4 CDH4, бета-2 субъединица рецептора ацетилхолина CHRNB2, подобный CKLF белок 2 CKLFSF2, содержащий трансмембранный домен MARVEL (CKLFSF2), лектиновый домен типа C, представитель семейства 4 CLEC4E (CLEC4E), белок кластерин CLU (также называемый J), рецептор комплемента эритроцитов 1 CR1 (CR1, также называемый CD35, рецептор C3b/C4b и рецептор иммунной адгезии), рецептор комплемента эритроцитов CR1L (CR1L), рецептор гранулоцитного колониестимулирующего фактора 3 CSF3R (CSF3R), цистатин C или цистанин 3 CST3, цитохром P450 2C CYP2C, ассоциированная со смертью протеинкиназа 1 DAPK1 (DAPK1), рецептор эстрогена 1 ESR1, фрагмент Fc рецептора IgA FCAR (FCAR, также называемый CD89), фрагмент Fc IgG, рецептор низкой плотности IIIb FCGR3B (FCGR3B или CD16b), рецептор свободных жирных кислот 2 FFA2 (FFA2), фибриноген FGA (фактор I), ассоциированный с GRB2 белок связывания 2 GAB2 (GAB2), ассоциированный с GRB2 белок связывания 2 GAB2 (GRB2), подобный галанину пептид GALP, сперматогенная глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа GAPDHS (GAPDHS), GMPB - GMBP, гаптоглобин HP (HP), рецептор 5-гидрокситриптофана (серотонина) 7 (зависимый от аденилатциклазы) FITR7, фермент деградации инсулина IDE, IF127 - IF127, интерферон, альфа-индуцируемый белок 6 IFI6 (IFI6), индуцируемый интерфероном белок с повторами тетратрикопептида 1 IFIT2 (IFIT2), IL1RN - антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-IRA), рецептор интерлейкина 8 ILSRA (ILSRA), рецептор альфа (IL8RA или CD181), рецептор интерлейкина 8 IL8RB (IL8RB), бета (IL8RB), Jagged I JAG1 (JAG1) калиевый канал прямого выпрямления, подсемейство J, представитель 15 KCNJ15 (KCNJ15), белок, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности 6 LRP6 (LRP6), ассоциированный с микротрубочками белок тау МАРТ (МАРТ), регулирующая сродство MAP/микротрубочки киназа 4 MARK4 (MARK4) фосфопротеин 1 фазы M MPHOSPH1, 5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза MTHFR, индуцированный интерферонов связываюзих GTP белок MX2, нибрин NBN, также называемый NBN, никастрин NCSTN, рецептор ниацина 2 NIACR2 (NIACR2, также называемый GPR109B), никотинамиднуклеотидаденилилтрансфераза 3 NMNAT3, нейротримин NTM (HINT), ороскумоид 1 ORM1 (ORM1) или гликопротеин 1 альфа-1-кислоты, пуринорецептор P2Y 13 P2RY13 (P2RY13), никотинамидфосфорибозилтрансфераза PBEF1 (NAmPRTase или Nampt), также называемая усиливающим образование колоний предшественников B-клеток фактором 1 (PBEF1) или висфатином, фосфоенолпируваткарбоксилаза PCK1, связывающий фосфатидилинозитол клатрин, участвующий в ассоциации (PICALM), активатор плазминогена типа урокиназы PLAU (PLAU), плексин PLXNC1 (PLXNC1), прионный белок PRNP, белок пресенилин 1 PSEN1 (PSEN1), белок пресенилин 2 PSEN2 (PSEN2), белок рецептора белковой тирозинфосфатазы типа A PTPRA (PTPRA), Ral GEF с доменом PH и связывающим SH3 мотивом 2 RALGPS2 (RALGPS2), белок, подобный регулятору сигналинга с участием G-белков 2, регулятор связанного с сигналингом с участием G-белков 2 RGSL2 (RGSL2), связывающий селен белок 1 SELENBP1 (SELNBP1), митоферрин 1 SLC25A37, связанный с сортилином рецептор L (класс DLR), содержащий повторы A белок SORL1 (SORL1), трансферрин TF, митохондриальный фактор транскрипции A TFAM, фактор некроза опухолей TNF, суперсемейство рецептора фактора некроза опухолей, представитель 10C TNFRSF10C (TNFRSF10C), суперсемейство рецептора фактора некроза опухолей (TRAIL), представитель 10a TNFSF10 (TNFSF10), подобный убиквитину активирующий белок-модификатор 1 UBA1 (UBA1), UBA3, NEDD8-активирующий каталитическую субъединицу фермента E1 (UBE1C), убиквитин В UBB (UBB), убиквитин-1 UBQLN1, убиквитин карбоксилтерминальная эстераза белка L1 UCHL1 (UCHL1), убиквитин карбоксилтерминальная гидролиаза изозима белка L3 UCHL3 (UCHL3), белок рецептора липопротеина очень низкой плотности VLDLR (VLDLR).

[001173] В иллюстративных вариантах осуществления белки, ассоциированные с AD, хромосомную последовательность которых подвергают редактированию, могут принадлежать белку рецептора липопротеина очень низкой плотности (VLDLR), кодируемому геном, подобному убиквитину активирующего фермента-модификатора 1 (UBA1), кодируемому геном UBA1 NEDD8-активирующему каталитическую субъединицу фермента E1 белку, кодируемому геном UBA3, белку аквапорину 1 (AQP1), кодируемому геном AQP1, белку убиквитин-карбоксилтерминальной эстеразе L1 (UCHL1), кодируемому геном UCHL1, белку убиквитин-карбоксилтерминальной гидролазе изозима L3 (UCHL3), кодируемому геном UCHL3, белку убиквитину В (UBB), кодируемому геном UBB, ассоциированному с микротрубочками белку тау (МАРТ), кодируемому геном МАРТ, белку тирозинфосфатазного рецептора типа A (PTPRA), кодируемому геном PTPRA, связывающему фосфатидилинозитол белку, участвующему в сборке клатрина (P1CALM), кодируемому геном P1CALM, белку кластерину (называемому также аполипопротеин J), кодируемому геном CLU, белку пресенелину 1, кодируемому геном PSEN1, белку пресенелину 2, кодируемому геном PSEN2, связанному с сортилином рецептору L (класс DLR), содержащему повторы A белку (SORL1), кодируемому геном SORL1, белку-предшественнику амилоида (APP), кодируемому геном APP, предшественнику аполипопротеина E (APOE), кодируемому геном APOE или мозговому нейротрофическому фактору (BDNF), кодируемому геном BDNF. В иллюстративных вариантах осуществления генетически модифицированными животными являются крысы, и подвергшаяся редактирования хромосомная последовательность, кодирующая белок, ассоциированный AD, может являться следующей: APP - белок-предшественник амилоида NM_019288, AQP1 - белок аквапорин 1 (AQP1) NM_012778, BDNF - мозговой нейротрофический фактор NM_012513, CLU - белок кластерин (так называемый NM_053021 - аполипопротеин J), МАРТ - ассоциированный с микротрубочками белок тау NM_017212 (МАРТ), PICALM - связывающий фосфатидилинозитол белок, участвующий в сборке клатрина NM_053554 (P1CALM), PSEN1 - белок пресенелин 1 (PSEN1) NM_019163, PSEN2 - белок пресенелин 2 (PSEN2) NM_031087, PTPRA - белок рецептора тирозинфосфатазы типа A NM_012763 (PTPRA), SORL1 - связанный с сортилином рецептор L (класс DLR, NM_053519), содержащий повторы A белок SORL1 XM_001065506, белок XM_217115, UBA1 - подобный убиквитину активирующий белок-модификатор 1 (UBA1) NM_001014080, UBA3 - белок, NEDD8-активирующий каталитическую субъединицу фермента E1 (NEDD8- activating enzyme E1 catalytic subunit protein, UBE1C, NM_057205), UBB - белок убиквитин В (UBB, NM_138895), UCHL1 - убиквитин карбоксилтерминальная эстераза белка L1 (UCHL1), UCHL3 убиквитин карбоксилтерминальная гидролиаза изозима белка L3 (UCHL3) NM_001110165, VLDLR - белок рецептора липопротеина очень низкой плотности (VLDLR) NM_013155.

[001174] Животное или клетка может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 или более прерванных хромосомных последовательностей, кодирующих белок, ассоциированный с AD, и ноль, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более хромосомно интегрированных последовательностей, кодирующий белок, ассоциированный с AD.

[001175] Отредактированная или интегрированная хромосомная последовательность может быть модифицирована таким образом, чтобы кодировать измененный белок, ассоциированный с AD. Для ряда мутаций в связанных с AD хромосомных последовательностей установлена ассоциация с AD. Например, миссенс-мутация V717I (т.е. замена валина в положении 717 на изолейцин) в APP вызывает семейную форму AD. Несколько мутаций в белке пресенилин-1, в частности, H163R (т.е. замена гистидина в положении 163 на аргинин), A246E (т.е. замена аланина в положении 246 на глутамат), L286V (т.е. замена лейцина в положении 286 на валин) и C410Y (т.е. замена цистеина в положении 410 на тирозин) вызывают семейную форму болезни Альцгеймера 3 типа. Мутации в белке пресенелине-2, в частности, N141I (т.е. замена аспарагина в положении 141 на изолейцин), M239V (т.е. замена метионина 239 на валин) и D439A (т.е. замена аспартата 439 на аланин) вызывают семейную форму болезни Альцгеймера 4 типа. Другие ассоциации генетических вариантов связанных с AD генов и заболеванием известны в настоящей области. См., например, Waring et al. (2008) Arch. Neurol. 65:329-334, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Связанные с секретазами нарушения

[001176] В публикации патента США № 20110023146 описано применение нуклеаз с цинковыми пальцами для генетической модификации клеток, животных или белков, ассоциированных с заболеваниями, связанными с секретазами. Секретазы необходимы для процессинга предшественников белков до их биологически активных форм. Дефекты в различных компонентах метаболических путей секретазы вносят вклад в различные заболевания, в частности, тех, которые имеют отличительные признаки - амилоидогенез и амилоидные бляшки, в частности, болезнь Альцгеймера (AD).

[001177] Связанные с секретазой нарушения и белки, ассоциированные с такими заболеваниями, представляют собой разнообразный набор белков, влияющих на предрасположенность к многочисленным заболеваниям, наличие таких заболеваний, их выраженность или их комбинацию. Настоящее изобретение включает редактирование любых хромосомных последовательностей, кодирующих белки, ассоциированные с расстройствами, связанными с секретазами. Связанные с нарушениями функционирования секретаз белки, выбраны на основе показанной в экспериментах ассоциации белков, ассоциированных с расстройствами, связанными с секретазами, с заболеванием, связанным с секретазами. Например, скорость образования или циркулирующая концентрация белка, ассоциированного с расстройством, связанным с секретазами, может быть повышена или понижена в популяции, имеющей расстройства, связанные с секретазами, в сравнении с популяцией без связанных с секретазами расстройств. Различия в уровнях белков могут быть оценены с использованием методик протеомики, включая, без наложения ограничений, вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и масс-спектрометрию. Альтернативно этому связанные с ассоциированными с секретазами нарушениями белки могут быть идентифицированы путем получения профилей генной экспрессии для генов, кодирующих белки, с применением методик геномики, включающих, не ограничиваясь таковыми, анализ на микрочипах ДНК, серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (кПЦР).

[001178] В качестве неограничивающего примера, белки, ассоциированные со связанными с секретазами нарушениями, включают PSENEN (гомолог энхансера пресенелина 2 (C. elegans)), CTSB (катепсин B), PSEN1 (пресенелин 1), APP (белок-предшественник бета-амилоида (A4)), APH1B (гомолог B дефекта передней глотки 1 (anterior pharynx defective 1 homolog В, C. elegans)), PSEN2 (пресенелин 2 (болезнь Альцгеймера 4)), BACE1 (расщепляющий APP по бета-сайту фермент 1), ITM2B (интегральный мембранный белок 2B), CTSD (катепсин D), NOTCH1 (гомолог Notch 1, ассоциированный с транслокацией (Drosophila)), TNF (фактор некроза опухолей (суперсемейство TNF, представитель 2)), INS (инсулин), DYT10 (дистония 10), ADAM 17 (металлопептидазный домен ADAM 17), APOE (аполипопротеин E), ACE (конвертирующий ангиотензин I фермент (пептидил-дипептидаза A) 1), STN (статин), TP53 (белок опухоли p53), IL6 (интерлейкин 6 (интерферон бета 2)), NGFR (рецептор фактора роста нервов (суперсемейство TNFR, представитель 16)), IL IB (интерлейкин I, бета), ACHE (ацетилхолинэстераза (Yt группа крови)), CTNNB1 (катенин (ассоциированный с кадерином белок), бета 1, 88 кДа), IGF1 (инсулиноподобный фактор роста 1 (соматомедин C)), IFNG (интерферон, гамма), NRG1 (нейрегулин 1), CASP3 (каспаза 3, связанная с апоптозом цистеинпептидаза), МАРК 1 (митогенактивирюущеая протеинкиназа 11), CDH1 (кадерин 1, тип 1, E- кодерин (эпителиалный)), APBB1 (связывающий белок-предшественник бета-амилоида (A4), семейство B, представитель 1 (Fe65)), HMGCR (3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент A редуктаза), CREB1 (белок 1, связывающийся с цАМФ-зависимым элементом), PTGS2 (простагландин эндопероксидсинтаза 2 (простагландин G/H синтаза и циклооксигеназа)), HES1 (ген hairy и энхансер splt 1, (Drosophila)), CAT (каталаза), TGFB1 (трансформирующий фактор роста бета 1), ENO2 (енолаза 2 (гамма, нейрональная)), ERBB4 (v-erb-a гомолог 4 вирусного онкогена эритробластной лейкемии (птичий)), TRAPPC10 (комплекс 10 частицы транспорта белка), MAOB (моноаминоксидаза B), NGF (фактор роста нервов (бета-полимпептид)), MMP12 (матриксная металлопептидаза 12 (эластаза макрофагов)), JAG1 (jagged 1 (синдром Алажиля)), CD40LG (лиганд CD40), PPARG (активированный пролифератором пероксисомы рецептор гамма), FGF2 (фактор роста фибробластов 2 (основной)), IL3 (интерлейкин 3 (колониестимулирующий фактор, несколько), LRP1 (белок 1, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности), NOTCH4 (гомолог 4 Notch (Drosophila)), MAPK8 (митогенактивируемая протеинкиназа 8), PREP (пролилэндопептидаза), NOTCH3 (гомолог 3 Notch 3 (Drosophila)), PRNP (прионный белок), CTSG (катепсин G), EGF (эпидермальный фактор роста (бета-урогастрон)), REN (ренин), CD44 (молекула CD44 (по индийской классификации групп крови)), SEEP (селектин P (140-кДа белок мембранных гранул, антиген CD62)), GHR (рецептор гормона роста), ADCYAP1 (активирующий аденилатциклазу полипептид 1 (гипофизарный)), INSR (рецептор инсулина), GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок), MMP3 (матриксная металлопептидаза 3 (стромелизин 1, прожелатиназа)), MAPK10 (митогенактивируемая протеинканаза 10), SP1 (транскрипционный фактор Sp1), MYC (гомологичный y-myc миелоцитоматозный вирусный онкоген (птичий)), CTSE (катепсин E), PPARA (активируемый профилератором пероксисом рецептор альфа), JUN (онкоген jun), TEMPI (ингибитор металлопептидазы TEMP 1), ILS (интерлейкин 5 (колониестимулирующий фактор, эозинофил)), ILIA (интерлейкин 1, альфа), MMP9 (матриксная металлопептидаза 9 (желатиназа B, 92-кДа желатиназа, 92-кДа коллагеназа IV типа)), HTR4 (рецептор 5-гирокситриптамина (серотонина) 4), HSPG2 (гепарансультфат протеогликан 2), KRAS (v-Ki-ras2 гомолог вирусного онкогена крысиной саркомы Кирстена), CYCS (цитохром c, соматический), SMG1 (SMG1 гомолог связанной с фосфатидилинозитол 3- киназой киназа (C. elegans)), IL1R1 (рецептор интерлейкина 1, тип I), PROK1 (прокинетицин 1), MAPK3 (митогенактивируемая протеинканаза 3), NTRK1 (рецептор нейроторфической тирозинкиназы типа 1), IL13 (интерлейкин 13), MME (мембранная металлоэндопептидаза), TKT (транскетолаза), CXCR2 (рецептор хемокина 2 (мотив C-X-C)), IGF1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста 1), KARA (рецептор ретиноевой кислоты, альфа), CREBBP (связывающий CREB белок), PTGS1 (простагландинэндопероксид синтаза 1 (простагландин G/H синтаза и циклооксигеназа)), GALT (галактозо-1-фосфат уридилтрансфераза), CHRM1 (холинергический рецептор, мускариновый 1), ATXN1 (аткасин 1), PAWR (PRKC, апоптоз, WT1, регулятор), NOTCH2 (гомолог 2 Notch (Drosophila)), M6PR (рецептор маннозо-6-фосфата (катионзависимый)), CYP46A1 (цитохром P450, семейство 46, подсемейство A, полипептид 1), CSNK1 D (казеинкиназа 1, дельта), MAPK14 (митогенактивируемая протеинканаза 14), PRG2 (протеогликан 2, костный мозг (активатор естественных киллеров, главный основный белок)), PRKCA (протеинкиназа C, альфа), LI CAM (молекула клеточной адгезии LI), CD40 (молекулы CD40, рецептор суперсемейства TNF, представитель 5), NRH2 (ядерный рецептор подсемейства 1, группа I, представитель 2), JAG2 (jagged 2), CTNND1 (катенин (кадеринассоциированный белок), дельта 1), CDH2 (кадерин 2, тип 1, N-кадерин (нейрональный)), CMA1 (химаза 1, тучные клетки), SORT (сортилин 1), DLK1 (дельтаподобны гомолог 1 (Drosophila)), THEM4 (суперсемейства тиоэстерезы, представитель 4), JUP (плакоглобин участка соединения), CD46 (молекула D46, регуляторный белок комплемента), CCL11 (лиганд хемокина (мотив C-C)11), CAV3 (кавеолин 3), RNASES (рибонуклеаза, семейство РНКаз A, 3 (катионный белок эозинофилов)), HSPA8 (белок теплового шока белок 8 массой 70 кДа), CASP9 (каспаза 9, связанный с апоптозом цистеиновая пептидазаза), CYP3A4 (цитохром P450, семейство 3, подсемейство A, полипептид 4), CCR3 (рецептор хемокина (мотив C-C) 3), TFAP2A (транскрипционный фактор AP-2 альфа (активирующий связывающий энхансер белок 2 альфа)), SCP2 (белок-переносчик стирола 2), CDK4 (циклинзависимая киназа 4), HIF1A (альфа-субъединица фактора (щелочной транскрипционный фактор спираль-петля-спираль), индуцируемого гипоксией 1), TCF7L2 (7-подобный транскрипионный фактор 2 (специфичный для T-клеток, бокс HMG)), IL1R2 (рецептор интерлейкина 1, тип II), B3GALTL (подобный 1,3-галактозилтрансферазе), MDM2 (Mdm2 гомолог связывающего p53 белок (мыши)), RELA (v-rel гомолог A онкогена вируса ретикулоэндотелиоза (птичий)), CASP7 (каспаза 7, связанная с апоптозом цистеиновая пептидаза), IDE (инсулиндеградирующий фермент), FABP4 (связывающий жирные кислоты белок 4, адипоцит), CASK (кальций/кальмодулин-зависимая сериновая протеинкиназа (семейство MAGUK)), ADCYAP1R1 (рецептор активирующего аденилатиклазу полипептида 1 (гипофиз) типа type I), ATF4 (активирующий транскрипционный фактор 4 (отвечающий на tax (tax-responsive) энхансерный элемент B67)), PDGFA (полипептид альфа фактора роста тромбоцитов), C21 или 03 (открытая рамка считывания 33 хромосомы 21), SCG5 (секретогранин V (белок 7B2)), RNF123 (белок c цинковыми пальцами 123), NFKB1 (ядерный фактор энхансера гена легкого полипептида каппа в B-клетках 1), ERBB2 (v-erb-b2 гомолог 2 вирусного онкогена эритробластной лейкемии, полученные из нейро/глиобластомы гомолог онкогена (птичий)), CAV1 (кавеолин 1, белок ямки, 22 кДа), MMP7 (матриксная металлопептидаза 7 (матрилизин, утерин)), TGFA (трансформирующий фактор роста, альфа), RXRA (ретиноидный рецептор X, альфа), STX1A (синтаксин 1A (мозг)), PSMC4 (субъединиа 26S АТФ-азы 4 протеосомы (просома, мультикаталитическая протеаза), P2RY2 (пуринергический рецептор P2Y, сопряженный с G-белком, 2), TNFRSF21 (семейства фактора некроза опухоли, представитель 21), DLG1 (диски, большой гомолог 1 (Drosophila)), NUMBL (гомолог, подобный гену numb (Drosophila)), SPN (сиалофорин), PLSCR1 (фосфолипидскрамблаза 1), UBQLN2 (убиквитин 2), UBQLN1 (убиквитин 1), PCSK7 (предшественник конвертазы субтилизин/кексин типа 7), SPON1 (spondin 1, extracellular matrix protein), SILV (гомолог silver (мышь)), QPCT (глутамилпептид циклотрансфераза), HESS (hairy и энхансер split 5 (Drosophila)), GCC1 (GRIP и содержащий coiled-coil домен 1) или любую их комбинацию.

[001179] Генетически модифицированное животное или клетка могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более прерывающихся хромосомных последовательностей, кодирующих белок, ассоциированный с заболеваниями, связанными с секретазами, и ноль, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более интегрированных в хромосому последовательностей, кодирующих прерывающийся белок, ассоциированный со связанными с секретазой заболеваниями.

ALS

[001180] В патентной публикации США № 20110023144 описано применение нуклеаз с цинковыми пальцами к генетически модифицированным клеткам, животным и белкам, ассоциированным с амиотрофическим латеральным склерозом (ALS). ALS характеризуется постепенной стабильной дегенерацией некоторых нервных клеток в коре головного мозга, стволе головного мозга и спинном мозге, которые вовлечены в произвольные движения.

[001181] Заболевания, связанные с моторными нейронами и белки, ассоциированные с такими заболеваниями, представляют собой разнообразный набор белков, которые вызывают подверженность развитию заболеваний моторных нейронов, выраженность заболевания моторных нейронов или их любую комбинацию. Настоящее изобретение охватывает редактирование любых хромосомных последовательностей, кодирующих белки, ассоциированные с ALS, специфическим заболеванием моторных нейронов. Ассоциированные с ALS белки обычно выявляют на основе экспериментальной ассоциации связанных с ALS белков с ALS. Например, скорость образования или циркулирующая концентрация связанного с ALS белка может быть повышена или понижена в популяции с ALS в сравнении с популяцией без ALS. Различия в уровнях белков могут быть оценены с использованием методик протеомики, включая, без наложения ограничений, вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и масс-спектрометрию. Альтернативно этому связанные с ALS белки могут быть идентифицированы путем получения профилей генной экспрессии для генов, кодирующих белки, с применением методик геномики, включающих, не ограничивающихся ими, анализ на микрочипах ДНК, серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (кПЦР).

[001182] В качестве неограничивающего примера, ассоциированные с ALS белки включают, но не ограничиваются ими, следующие: SOD1 супероксиддисмутаза 1, ALS3 растворимый сенатаксин амиотрофического латерального склероза 3 SETX, ALS5 5 FUS амиотрофического латерального склероза, в виде химеры в саркоме, ALS7 - амиотрофического латерального склероза 7, ALS2 амиотрофического латерального склероза, DPP6 дипептидилпептидаза 6 склероза 2, простагландинполипептид эндопероксидсинтаза 1 тяжелого PTGS1 нейрофиламента NEFH, SLC1A2 растворимый переносчик семейства 1, TNFRSF10B фактор некроза опухолей (подсемейство глиальных рецепторов с высокой афинностью, глутаматный транспортер), представитель 10b, представитель 2, PRPH периферин, HSP90AA1 90-кДА белок теплового шока альфа (цитозольный), класс A, представитель 1, GRIA2 глутаматный рецептор, IFNG интерферон, гамма ионотропный, AMPA 2 S100B S100 кальцийсвязывающий, FGF2 белок B фактора роста фибробластов 2, A0X1 альдегидоксидаза 1, CS цитратсинтаза, TARDBP TAR ДНК-связыващий белок, TXN тиоредоксин, RAPH1 Ras ассоциация, MAP3K5 митогенактивирущий белок (RaIGDS/AF-6) и домены гомологии 1 киназы 5 плекстрина, NBEAL1 нейробичин-подобный 1, GPX1 глутатионпероксидаза 1, ICA1L аутоантиген клеток островка, RAC1 субстрат связанного с ras C3 подобного 1,69-кДа ботулинотоксину токсина 1, МАРТ ассоиированный с микротрубочками, ITPR2 трифосфатный рецептор инозитол-1,4,5-белка тау, тип 2, ALS2CR4 амиотрофического латерального склероза, GLS глутаминаза склероза 2 (ювенильная) хромосомного региона, кандидат 4, ALS2CR8 амиотрофического латерального, CNTFR - рецептор хромосомного региона цилиарного нейротрофического фактора склероза (ювенильный), кандидат 8, ALS2CR11 амиотрофического латерального склероза, FOLH1 хромосоный регион фолатгидролазы 1 склероза 2 (ювенильный), кандидат 11, FAM117B семейство с последовательностью P4HB пролил-4-гидроксилазы, сходство 117, представитель В бета полипептид, CNTF цилиарный, нейротрофический фактор, SQSTM1 секвестосома 1, STRADB связанная с STE20 киназа, NAIP семейство NLR, ингибиторный белок адаптора бета апоптоза, YWHAQ тирозин 3-SLC33A1 растворимый переносчик семейства 33 монооксигеназа/триптофан (транспортер ацетил-CoA), представитель 1 активирующего 5-монооксигеназу белка, тета-полипептид, TRAK2 белок транспорта, FIG. 4 FIG. 4 гомолог, SACI липидфосфатазный домен, связывающий кинезин 2, содержащий NIF3L1, NIF3, NGGI, взаимодействующий INA, интемексин, нейрональный фактор 3 типа 1, белок промежуточного филамента, альфа PARD3B par-3 (разделяющий) COX8A дефективный гомолог B цитохромоксидазы c, субъединица VIHA, CDK15 циклинзависимая киназа, HECW1, HECT, C2 и WW 15 содержащая домен убиквитин E3 протеинлигаза 1, NOS1 синтаза оксида азота 1, MET протоонкогне met, SOD2 супероксиддисмутаза 2, HSPB1 митохондриальный белок теплового шока 1, 27-кДа, NEFL нейрофиламент, легкий, CTSB полипептид катепсина В, ANG ангиогенин, HSPA8 рибонуклеаза теплового шока, 70-кДа, РНКаза A белка 8 семейства 5, 5 VAPB, VAMP (ассоциированный с везикулярным-ESR1 рецептором эстрогена 1 мембранный белок)-ассоциированный белок В и C, SNCA синуклеин, альфа, HGF фактор роста гепатоцитов, CAT каталаза, ACTB актин, бета, NEFM нейрофиламент, средний, TH полипептид тирозингидроксилазы, BCL2 В-клеток,l CLL/лимфома 2, FAS Fas (рецептор суперсемейства TNF, представитель 6), CASP3 каспаза 3, связанная с апоптозом CLU-кластерином цистеиновая пептидаза, SMN1 выживания моторных нейронов, G6PD глюкозо-6-фосфат 1, теломерная дегидрогеназа, BAX, ассоциированный с BCL2 X, HSF1 транскрипционный фактор теплового шока 1, RNF19A белок цинковых пальцев AA, JUN онкоген jun, ALS2CR12 амиотрифического латериального склероза, HSPA5 70-кДа белок теплового шока склероза 2 (ювенильный), белок 5 хромосомного региона, кандидат 12, MAPK14 митогенактивируемый белок, IL10 интерлейкин 10 киназа 14, APEX1 нуклеаза APEX, TXNRD1 тиоредоксинредуктаза 1 (мультифункциональный домен репарации ДНК) 1, NOS2 синтаза оксида азота 2, TIMP1 TIMP индуцибельный ингибитор металлопептидазы 1, CASP9 каспаза 9, апоптоз- XIAP X-связанный ингибитор связанной цистеиновой пептидазы апоптоза, GLG1 гликопротеин комплекса Гольджи 1, EPO эритропоэтин, VEGFA фактор роста эндотелия сосудов фактор A, эластин ELN factor A, GDNF ядерный фактор NFE2L2, полученный из глиальных клеток, группа (производный эритроидный нейротрофический фактор 2), 2 SLC6A3 растворимый переносчик, семейство 6, HSPA4 70-кДа белок теплового шока (белок-переносчик нейромедиаторов 4, допамин), представитель 3, APOE аполипопротеин E, PSMB8 субъединица бета протеосомы (просома, мультикаталитическая протеаза), тип 8, DCTN1 динактин 1, TIMP A3 TIMP металлопептидазный ингибитор 3, KIFAP3 кинезинассоциированный SLC1A1 растворимый переносчик семейства 1, белок 3 (нейрональный/эпителиальный глутаматный транспортер высокой афинности, система Xag), представитель 1, SMN2 циклин C2 выживания моторных нейронов CCNC, мембранный белок центромер MPP4, STUB1, STIP1 гомологии и U-пальмитолеированный содержащий бокс 4 белок 1, ALS2 амилоид бета (A4), PRDX6 белок-предшественник пероксиредоксина 6, SYP синаптофизин, CABIN1 связывающий кальцийнейрин белок 1, CASP1 каспаза 1, апоптоз-GART фосфорибозилглицинамин-связанная цистеиндеформилтрансфераза, пептидаза фосфорибозилглицинаминдесинтетаза, фосфорибозиламиноимидазолсинтетаза, CDK5 циклинзависимая киназа 5, ATXN3 атаксин 3, RTN4 ретикулон 4, C1QB компонент комплемента 1, субкомпонент q, В цепь фактора роста нервов VEGFC, HTT рецептор хантингина, PARK7 болезни Паркинсона 7, XDH ксантиндегидрогеназа, GFAP глиальный фибриллярный кислотный белок, MAP2 ассоциированный с микротрубочками белок 2, CYCS цитохром c, соматический, FCGR3B Fc фрагмент IgG, низкой афинности IIIb, CCS медный шаперон убиквитиноподобной супероксиддисмутазы 5 UBL5, MMP9 матриксная металлопептидаза 9, SLC18A3 растворимый переносчик семейства 18 ((везикулярный аетилхолин), представитель 3, TRPM7 транзиентный рецептор, HSPB2 катионный канал теплового шока 27-кДа, белок 2 подсемейства M, представитель 7, AKT1 v-akt мышиной тимомы, DERL1 семейство подобных Der1 доменов, гомолог вирусного онкогена 1, предстаувитель 1, CCL2 хемокин(мотив C--C), NGRN нейгрин, нейритный лиганд 2, связанная с почкованием GSR гутатион редуктаза, TPPP3 семейство стимулирующего полимеризацию тубулина белка, представитель 3, APAF1 пептидаза апоптоза, BTBD10 активирующи домен BTB (POZ) фактор 1, содержащий 10 GLUD1 глутамат, CXCR4 хемокин (мотив C--X--C), рецептор 4 дегирогеназы 1, SLC1A3 растворимый переносчик семейства 1, FLT1 связанный с fms тирозиновый (глиальный глутаматный транспортер высокой афинности), представитель 3, PON1 параоксоназа 1, рецепотр андрогена AR, L1P ингибиторный фактор лейкемии, ERBB3 v-erb-b2 гомолог 3 вирусного онкогена эритроблатсный лейкемии, LGALS1 лектин, галактозид, CD44 связывающий CD44, растворимый белок 1, TP53 белок опухоли p53, TLR3 толл-подобный рецептор 3, GR1A1 глутаматный рецептор, GAPDH глицеральдегид-3-ионотропный, АМРА 1 фосфатдегидрогеназа, GR1K1 глутаматный рецептор, DES десмин, ионотропный, каинат 1, CHAT холинацетилтрансфераза, FLT4 связанный с fms триозинкиназа 4, CHMP2B модифицирующий хроматин, BAG1 ассоциированный с BCL2 белок, 2B атаноген, MT3 металлотионенин 3, CHRNA4 холинергически рецептор, никотиновый, альфа 4, GSS - глутатионсинтетаза BAK1, антагонист BCL2/киллер 1, KDR домен вставки киназы, GSTP1 рецептор глутатион S-трансферазы (рецептор тирозинкиназы типа III pi 1), OGG1 8-оксогуанин ДНК, IL6 интерлейкин 6 (интерферон, гликозилаза бета 2).

[001183] Животное или клетка могут включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более прерывающихся хромосомных последовательностей, кодирующих белок, ассоциированный с ALS и нуль, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более хромосомно интегрированных последовательностей, кодирующих прерывающийся белок, ассоциированный с ALS. Предпочтительные белки, ассоциированные с ALS, включают SOD1 (супероксиддисмутаза 1), ALS2 (белок амиотрофического латерального склероза 2), FUS (слитый в саркоме), TARDBP (TAR ДНК связывающий белок), VAGFA (фактор роста эндотелия сосудов A), VAGFB (фактор роста эндотелия сосудов B) и VAGFC (фактор роста эндотелия сосудов C) и любую их комбинацию.

Аутизм

[001184] В публикации патента США № 20110023145 описано применение нуклеаз с цинковыми пальцами к генетически модифицированным клеткам, животным или белкам, ассоциированным с расстройствами аутистического спектра (ASD). Расстройства аутистического спектра (ASD) представляют собой группу заболеваний, характеризующихся количественным ухудшением социальных взаимодействий и коммуникации, и фиксированными повторяющимися и стереотипными паттернами поведения, интересов и активности. Три заболевания: аутизм, синдром Аспергера (AS) и первазивное расстройство развития без дополнительных уточнений (PDD-NOS) представляют собой спектр одного расстройства с варьирующей степенью тяжести, связанного интеллектуального функционирования и состояние здоровья. ASD являются преимущественно генетическими заболеваниями с наследственностью около 90%.

[001185] В публикации патента США № 20110023145 описано редактирование любых хромосомных последовательностей, кодирующих белки, ассоциированные с ASD, к которым могут применяться системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Связанные с ASD белки обычно устанавливаются на основе показанной в экспериментах ассоциации связанных с ASD белками с встречаемостью или проявлением ASD. Например, скорость образования или циркулирующая концентрация связанного с ASD белка может быть повышена или понижена в популяции, имеющей ASD в сравнении с популяцией без ASD. Различия в уровнях белков могут быть оценены с использованием методик протеомики, включая, но не ограничиваясь ими, вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание, иммуноферментный анализ (ELISA) и масс-спектрометрию. Альтернативно этому связанные с ASD белки могут быть идентифицированы путем получения профилей генной экспрессии для генов, кодирующих белки, с применением методик геномики, включающих, не ограничиваясь таковыми, анализ на микрочипах ДНК, серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (кПЦР).

[001186] Не ограничивающие примеры патологических состояний или расстройств, которые могут быть ассоциированы с белками, связанными с ASD, включают аутизм, синдром Аспергера (AS), первазивное расстройство развития без дополнительных уточнений (PDD-NOS), синдром Ретта, туберозный склероз, фенилкетонурия, синдром Смита-Лемли-Опица и синдром хрупкой X-хромосомы. В качестве не ограничивающего примера, белки, ассоциированные с ASD включают, не ограничиваясь, следующие: ATP10C аминофосфолипид, MET рецептор MET, транспортирующий АТФазу тирозинкиназу (ATP10C), BZRAP1 MGLUR5 (GRM5) метаботропный глутаматный рецептор 5, (MGLUR5) CDH10 кадерин-10, MGLUR6 (GRM6) метаботропный глутаматный рецептор 6 (MGLUR6), CDH9 кадерин-9 NLGN1, нейролигин-1, CNTN4 контактин-4, NLGN2 нейролигин-2, CNTNAP2 контакин-ассоциированный, SEMA5A тип нейролигина-3 белок 2 (CNTNAP2), DHCR7 7-дегилрохолестерин, NLGN4X нейролигин-4, связанный с X-редуктазой (DHCR7) DOC2A, двойной подобный C2-домен, NLGN4Y нейролигин-4, связанный с Y-содержащим белком альфа, DPP6 дипепидил, NLGN5 нейролигин-5, подобный аминопептидазе белок 6, EN2 engrailed 2 (EN2), NRCAM молекула адгезии нейрональных клеток (NRCAM), MDGA2 умственной отсталости при хрупкой X-хромосоме, NRXN1 - нейрексин-1 1 (MDGA2), FMR2 (AFF2), семейство AF4/FMR2 представитель 2 OR4M2 обонятельный рецептор (AFF2), 4M2 FOXP2 белок с боксом Forkhead P2, OR4N4 обонятельный рецептор (FOXP2), 4N4 FXR1 умственной отсталости при хрупкости X-хромосомы, OXTR рецептор окситоцина, аутосомальный (OXTR) гомолог 1, (FXR1) FXR2 умственной отсталости при хрупкой X -хромосоме, PAH фенилаланин гидроксилаза (PAH), гомолог 2, (FXR2) GABRA1 гамма-аминомасляная кислота, PTEN фосфатаза и рецептор, гомолог тензина, субъединица альфа-1 (GABRA1) (PTEN), GABRA5 GABAA (рецептор аминомасляной кислоты PTPRZ1) рецептор альфа 5 тирозин-белковая субъединица, (GABRA5) фосфатаза зета (PTPRZ1), GABRBI рилиновый рецептор аминомасляной кислоты RELN, субъединиа бета-1 (GABRB1), GABRB3 GABAA рецептор бета 3 субъединицы белка L10 (гамма-аминомасляной кислоты RPL10 рибосомы 60S), L10 (GABRB3), GABRG1 гамма-аминомасляная кислота, SEMA5A рецептор семафорина-5A, субъединица гамма-1, (SEMA5A) (GABRG1) HIRIP3 HIRA-взаимодействующий белок 3, SEZ6L2 группа связанного с припадками гомолога 6 (мышь), 2 HOXA1 белок гомеобокса Hox-A1, SHANKS SH3 и (HOXA1) домены множественных анкирин-повторов 3 (SHANKS), 1L6 интерлейкин- 6, SHBZRAP1 SH3 и домены множественных анкириновых повторов 3 (SHBZRAP1), LAMB1 ламинин, субъединица бета-1, SLC6A4 транспортер серотонина (LAMB1) (SERT), MAPK3 митогенактивируемый белок, TAS2R1 киназа вкусового рецептора 3, тип 2, представитель 1, TAS2R1 MAZ ассоциированный с Myc цинковый палец, TSC1 белок туберозного склероза 1, MDGA2 домен MAM, содержащий TSC2, белок гликозилфосфатидилинозитол 2, якорь 2 (MDGA2), MECP2 связывающий метил CpG, UBE3A белок убиквитин, 2, (MECP2) лигаза E3A (UBE3A), MECP2 связывающий метил CpG WNT2, белок типа Wingless 2 (MECP2), MMTV семейства сайта интеграции, представитель 2 (WNT2).

[001187] Тип белка, ассоциированного с ASD, хромосомная последовательность которого подвергается редактирования, может и будет варьировать. В предпочтительных вариантах осуществления, белки, ассоциированные с ASD, хромосомные последовательности которых могут редактироваться, могут быть следующими: связанный с бензодиазепиновым рецептором (периферическим) белок 1 (BZRAP1), кодируемый геном BZRAP1, белок из семейства AF4/FMR2, представитель 2 (AFF2), кодируемый геном AMA (также называемым MFR2), аутосомальный белок-гомолог 1 умственной отсталости при хрупкой X-хромосоме (FXR1), кодируемый геном FXR1, аутосомальный белок-гомолог 2 умственной отсталости при хрупкой X-хромосоме (FXR2), кодируемый геном FXR2, домен MAXI, содержащий гликозилфосфатидилинозитол якорный белок 2 (MDGA2), кодируемый геном MDGA2, связывающий метил-CpG белок 2 (XIECP2), кодируемый геном MECP2, метаботропный рецептор глутамата 5 (MGLUR5), кодируемый геном MGLUR5-1 (также называемый GRM5), белок нейрексин 1, кодируемый геном NRXN1 или белок семафорин-5A (SEMA5A), кодируемый геном SEMA5A. В служащем примером варианте осуществления генетически модифицированным животным является крыса, редактируемая хромосомная последовательность, кодирующей белок, ассоциированный с ASD, входит в следующий список: BZRAP1 бензодиазепиновый рецептор XM_002727789, (периферический) ассоциированный XM_001081125, AFF2 (FMR2), представитель 2 семейства AF4/FMR2 XM_219832, (AFF2) XM__001054673, FXR1 умствеенной отсталости при хрупкой X-хромосоме NM_001012179, аутосомальный гомолог 1 (FXR1) FXR2 умственной отсталости при хрупкой X-хромосоме NX_001100647, аутосомальный гомолог 2 (FXR2) MDGA2, домен MAXI, содержащий якорь 2 гликозилфосфатидилинозитола NM_199269, (MDGA2) MECP2 связывающий метил-CpG белок 2 NM_022673, (MECP2) MGLUR5 метаботропный глутаматный рецептор 5 NM_017012 (GRM5) (MGLUR5), NRXN1 нейрексин-1 NM_021767 SEMA5A, семафорин-5A (SEMA5A) NM_001107659.

Нарушения, связанные с экспансией тринуклеотидных повторов

[001188] В публикации патента США № 20110016540 описано использование нуклеаз цинковых пальцев для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с заболеваниями экспансии тринуклеотидных повторов. Заболевания экспансии тринуклеотидных повторов являются сложными, прогрессирующими заболеваниями, которые затрагивают нейробиологию развития и часто влияют на когнитивную сферу и сенсорно-моторные функции.

[001189] Белки экспансии тринуклеотидных повторов являются разнообразным набором белков, ассоциированных с подверженностью развитию заболевания экспансии тринуклеотидных повторов, наличием заболевания экспансии тринуклеотидных повторов или их комбинации. Заболевания экспансии тринуклеотидных повторов разделяют на 2 категории в зависимости от типа повторов. Наиболее распространенным повтором является триплет CAG, который, в случае присутствия в кодирующей области гена, кодирует аминокислоту глутамин (Q). Следовательно, такие заболевания называют полиглуматиновыми (polyQ) заболеваниями и включают следующие заболевания: болезнь Хантингтона (HD); спинобульбарная мышечная атрофия (SBMA), спиномозжечковые атаксии (SCA, типы 1, 2, 3, 6, 7 и 17), дентаторубро-паллидолюисова атрофия (DRPLA). Остальные заболевания тринуклеотидных повторов либо не подразумевают присутствия триплета CAG, либо триплет CAG не расположен кодирующей области гена и, как следствие, называются неполиглутаминовыми заболеваниями. Неполиглутаминовые заболевания включают синдром хрупкой X-хромосому (FRAXA); умственную отсталость при хрупкой X-хромосоме (FRAXE); атаксию Фридрейха (FRDA); миотоническую дистрофию (DM) и спиномозжечковую атаксию (SCA, типы 8 и 12).

[001190] Связанные с заболеваниями экспансии тринуклеотидных повторов белки, обычно устанавливают на основе показанной в экспериментах ассоциации связанных с заболеваниями экспансии тринуклеотидных повторов белков с заболеванием экспансии тринуклеотидных повторов. Например, скорость образования или циркулирующая концентрация связанного заболеваниями экспансии тринуклеотидных повторов белка может быть повышена или понижена в популяции, имеющей заболевание экспансии тринуклеотидных повторов в сравнении с популяцией без заболеваний экспансии тринуклеотидных повторов. Различия в уровнях белков могут быть оценены с использованием методик протеомики, включая, но не ограничиваясь ими, вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и масс-спектрометрию. Альтернативно этому связанные с заболеваниями экспансии тринуклеотидных повторов белки могут быть идентифицированы путем получения профилей генной экспрессии для генов, кодирующих белки, с применением методик геномики, включающих, не ограничиваясь таковыми, анализ на микрочипах ДНК, серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР).

[001191] Не ограничивающими примерами белков, ассоциированных с заболеваниями экспансии тринуклеотидных повторов, являются: AR (рецептор андрогена), FMR1 (умственной отсталости при хрупкой X-хромосоме1), HTT (хантингин), DMPK (протеинкиназа миотонической дистрофии), FXN (фратаксин), ATXN2 (атаксин 2), ATN1 (атрофин 1), FENl (структуроспеифичная эндонуклеаза flap 1), TNRC6A (содержащий тринуклеотидный повтор 6A), PABPN1 (связывающий поли(A) ядерный белок 1), JPH3 (юнктофилин 3), MED15 (субъединица 15 медиаторного комплекса), ATXN1 (атаксин 1), ATXN3 (атаксин 3), TBP (связывающий TATA-бокс белок), CACNA1A (кальциевый канал, потенциалозависимый, тип P/Q, субъединица альфа 1A), ATXN80S (ATXN8 обратной цепи (некодирующей)), PPP2R2B (протеинфосфатаза 2, регуляторная субъединица B, бета), ATXN7 (атаксин 7), TNRC6B (содержащий тринуклеотидный повтор 6B), TNRC6C (содержащий тринуклеотидный повтор 6C), CELF3 (CUGBP, Elav-подобное семейство, представитель 3), MAB21L1 (mab-21-подобный I (C. elegans)), MSH2 (гомолог mutS 2, рак прямой кишки, неполипозного типа 1 (E. coli)), TMEM185A (трансмемранный белок 185A), SIX5 (SIX гомеобокс 5), CNPY3 (гомолог canopy 3 (zebrafish)), FRAXE (хрупкий сайт, тип фолиевой кислоты, редкий, fra(X)(q28) E), GNB2 (связывающий нуклоетид гуанин белок (G-белок), бета-полипептид 2), RPL14 (рибосомальный белок L14), ATXN8 (атаксин 8), INSR (рецептор инсулина), TTR (транстиретин), EP400 (связывающий E1A белок p400), GIGYF2 (взаимодействующий с GRB10 GYT белок 2), OGGI (8-оксогуанин ДНК гликозилаза), STC1 (станниокальцин 1), CNDPI (карнозин дипептидаза 1 (семейство металлопептидазы M20)), C10orf2 (открытая рамка считывания 2 хромосомы 10), MAML3 подобный mastermind 3 (Drosophila), DKC1 (дискерин врожденного дискератоза 1), PAXIP1 PAX взаимодействующий (с доменом активации транскрипции домен) белок 1, CASK (кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (семейство MAGUK)), МАРТ (ассоциированный с микротрубочками белок тау), SP1 (транскрипионный фактор Sp1), POLG (ДНК-зависимая РНК-полимераза гамма), AFF2 (семейство AF4/FMR2, представитель 2), THBS1 (тромбоспондин 1), TP53 (белок опухолей p53), ESR1 (рецептор эстрогена 1), CGGBP1 (связывающий повторы триплета CGG белок 1), ABT1 (активатор базальной транскрипии 1), KLK3 (связанная с каликреином пептидаза 3), PRNP (прионный белок), JUN (онкоген jun), KCNN3 (калиевый средней/малой проводимости активируемый кальцием канал, подсемейство N, представитель 3), BAX (ассоциированный с BCL2 белок X), FRAXA (хрупкий сайт, тип фолиевой кислоты, редкий, fra(X)(q27.3), A (макроорхидизм при умственной отсталости)), KBTBD10 (повтор kelch и содержащий домен BTB (POZ) 10), MBNL1 (подобный muscleblind (Drosophila)), RAD51 (гомолог RAD51 (гомолог RecA, E. coli) (S. cerevisiae)), NCOA3 (коактиватор ядерного рецептора 3), ERDA1 (домен экспансированных повторов, CAG/CTG 1), TSC1 (туберозного склероза 1), COMIP (белок олигомерно матрикса хряща), GCLC (глутаматцистеиновая лигаза, каталитическая RRAD (связанная с Ras, ассоциированная с диабетом), MSH3 (гомолог mutS 3 (E. coli)), DRD2 (дофаминовый рецептор D2), CD44 (молекула CD44 (по индийской системе групп крови)), CTCF (связывающий CCCTC фактор (белок цинковый палец)), CCND1 (циклин DI), CLSPN (гомолог класпина (Xenopus laevis)), MEF2A (энхансерный фактор миоцитов 2A), PTPRU (протеиновая тирозинфосфатаза, тип рецептора U), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа), TRIM22 (трехчастный содержащий мотив 22), WT1 (опухоли Вилмса 1), AHR (рецептор арилуглеводорода), GPX1 (глутатионпероксидаза 1), TPMT (тиопурин-S- метилтрансфераза), NDP (болезнь Норри (псевдоглиома)), ARX (связанный с aristaless гомеобокс), MUS81 (MUS81 гомолог эндонуклеазы (S. cerevisiae)), TYR (тирозиназа (окулокутанный альбинизм LA)), EGR1 (раннего ростового ответа 1), UNG (урацил-ДНК гликозилаза), NUMBL (подобный гомологу numb (Drosophila)), FABP2 (связывающий жирные кислоты белок 2, кишечный), EN2 (engrailed, ген, содержащий гомеобокс 2), CRYGC (кристалин гамма C), SRP14 (14-кДа сигнальная частица узнавания (гомологичный Alu РНК-связывающий белок)), CRYGB (кристаллин, гамма B), PDCD1 (программируемой клеточной смерти 1), HOXA1 (гомеобокс Al), ATXN2L (подобный атаксину 2), PMS2 (PMS2 постмейотического усиления сегрегации 2 (S. cerevisiae)), GLA (галактозидаза, альфа), CBL (Cas-Br-M (мышиный) экотропическая ретровирусная трансформирующая последовательность), FTH1 (ферритин, тяжелый полипептид 1), IL12RB2 (рецептор интерлейкина 12, бета 2), OTX2 (гомеобокс orthodenticle 2), HOXA5 (гомеобокс A5), POLG2 (ДНК-зависимая РНК-полимераза, гамма 2, дополнительная субъединица), DLX2 (гомеобокс distal-less 2), SIRPA. (сигнальный регуляторный белок альфа), OTX1 (orthodenticle-гомеобокс 1), AHRR (репрессор арилуглеводородного рецептора), MANF (мезенцефальный происходящий из астроцитов нейротрофический фактор), TMEM158 (трансмембранный белок 158 (ген/псевдоген)) и ENSG00000078687.

[001192] Предпочтительные белки, ассоциированные с заболеваниями, связанными с экспансией тринуклеотидных повторов, включают HTT (хантингин), AR (рецептор андрогена), FXN (фратаксин), Atxn3 (атаксин), Atxn1 (атаксин), Atxn2 (атаксин), Atxn7 (атаксин), Atxn10 (атаксин), DMPK (протеинкиназа миотонической дистрофии), Atn1 (атрофин 1), СВР (связывающий creb белок), VLDLR (рецептор липопротеинов очень низкой плотности) и их комбинацию.

Лечение заболеваний слуха

[001193] Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в одно или оба уха.

[001194] Внимание исследователей уделяется вопросу о том, может ли генная терапия быть использована для того, чтобы улучшить существующие способы лечения глухоты, а именно кохлеарные импланты. Частой причиной глухоты является утрата или повреждение волосковых клеток, что вызывает нарушение передачи сигнала к слуховым нейронам. В таких случаях кохлеарные импланты могут использоваться для того, чтобы обеспечить реакцию на звук и передачу электрических сигналов к нервным клеткам. Однако такие нейроны часто дегенерируют и втягиваются из улитки при уменьшении количества факторов роста, выделяемых поврежденными волосковыми клетками.

[001195] В патентной заявке США 20120328580 описана инъекцию фармакологической смеси в ухо (например, введение в ухо), как, например, введение в просвет улитки (например, в среднюю лестницу (Scala media), лестницу преддверия (Scala vestibulae) и барабаннуюю лестницу (Scala tympani)), например, с использование шприца, например, одноразового шприца. К примеру, одно или более соединений, описанных в настоящей спецификации, могут быть введены с помощью интратимпанальной инъекции (в частности, в среднее ухо), и/или инъекций во наружное, среднее и/или внутреннее ухо. Такие методы широко применяются в данной области, например, для введения стероидов и антибиотиков в ухо человека. Инъекция может производиться, в частности, через круглое окно в ухе или капсулу улитки. Другие способы введения во внутреннее ухо также известны в данной (см., например, Salt and Plontke, Drug Discovery Today, 10:1299-1306, 2005).

[001196] При использовании другого способа введения фармакологическая смесь может быть введена in situ с помощью катетера или насоса. Катетер или насос могут, например, направлять фармакологическую смесь в кохлеарную полость или круглое окно в ухе и/или просвет прямой кишки. Широко применяемыми для доставки лекарств аппаратами и методами, которые подходят для введения одного или более описанных в настоящей спецификации соединений в ухо, например, ухо человека, как это описано в McKenna et al., (публикация США № 2006/0030837) и Jacobsen et al. (патент США № 7206639). В некоторых вариантах осуществления катетер или насос могут быть помещены, например, в ухе (например, в наружном, среднем и/или внутреннем ухе) пациента в ходе хирургического вмешательства. В некоторых модификациях изобретения катетер или насос могут быть помещены, например, в ухо (например, в наружном, среднем и/или внутреннем ухе) пациента без необходимости в хирургическом вмешательстве.

[001197] Альтернативно или в дополнительно к этому один или более компонентов, описанных в настоящей спецификации, может быть введен в сочетании с механическим устройством, таким как кохлеарный имплант и слуховой аппарат, которые помещают в наружное ухо. Широко используемый кохлеарный имплант, подходящий для использования вместе с настоящим изобретением, описан Edge et al. (публикация США № 2007/0093878).

[001198] В некоторых вариантах осуществления описанные выше способы введения могут быть использованы в произвольном порядке, одновременно или попеременно.

[001199] Альтернативно или в дополнение к этому настоящее изобретение может быть осуществлено в соответствии с любыми одобренными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration) методами, например, описанными в Руководстве по стандартам данных (Data Standards Manual) CDER версии номер 004 (которая доступна на fda.give/cd.er/dsmZDRG/drg003 01. htm).

[001200] В целом, способы клеточной терапии, описанные в заявке на патент США 20120328580, могут быть применены для того, чтобы привести к полной или частичной дифференцировке клетки или применены по отношению к зрелым типам клеток, например, внутреннего уха (например, волосковых клеток) in vitro. Клетки, полученные в результате применения таких способов, затем могут быть трансплантированы или имплантированы пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Способы культивирования клеток, необходимые для осуществления этих методов, включая способы идентификации и выбора подходящих типов клеток, способы содействия полной или частичной дифференцировке выбранных клеток, способы идентификации полных или частично дифференцированных типов клеток, а также способы имплантации полных или частично дифференцированных клеток описаны ниже.

[001201] Клетки, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, клетками, способными полностью или частично дифференцироваться в зрелую клетку внутреннего уха, например, волосковую клетку (например, внутреннюю и/или внешнюю волосковую клетку) при контакте, например, in vitro, с одним или более соединениями, описанными в настоящей заявке. Примеры клеток, способных дифференцироваться в волосковые клетки, включают, но не ограничиваются, стволовыми клетками (например, стволовыми клетками внутреннего уха, взрослыми стволовыми клетками, стволовыми клетками костного мозга, эмбриональными стволовыми клетками, мезенхимальными стволовыми клетками, стволовыми клетками кожи, индуцированными стволовыми клетками iPS и стволовыми клетками, полученные из жировой ткани), клетками-предшественниками (например, клетками-предшественниками внутреннего уха), вспомогательными клетками (например, клетками Дейтерса, столбчатыми клетками, внутренними фаланговыми клетками, клетками тектума и клетками Хенсена) и/или зародышевыми клетками. Использование стволовых клеток для замены сенсорных клеток внутреннего уха описано в Li et al. (публикация США № 2005/0287127) и Li et al. (патент США № 11/953,797). Использование стволовых клеток, полученных из костного мозга, для замены сенсорных клеток внутреннего уха описано в Edge et al., PCT/US2007/084654. Использование индуцируемых стволовых клеток (iPS) клеток описано, например, в Takahashi et al. Cell, Volume 131, Issue 5, Pages 861-872 (2007); Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-76 (2006); Okita et al., Nature 448, 260-262 (2007); Yu, J. et al., Science 318(5858):1917-1920 (2007), Nakagawa et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); and Zaehres and Scholer, Cell 131(5):834- 835 (2007). Такие подходящие клетки можно идентифицировать, анализируя (например, качественно или количественно) наличие одного или более тканеспецифических генов. Например, экспрессия гена может быть обнаружена путем обнаружения белкового продукта одного или более тканеспецифических генов. Способы обнаружения белка включают окрашивающие белки (например, с использованием экстрактов клеток или целых клеток) с использованием антител против соответствующего антигена. В этом случае подходящим антигеном является белковый продукт тканеспецифической экспрессии гена. Хотя, в целом, первичное антитело (то есть антитело, которое связывает антиген) может быть меченым, более частым является (и улучшает визуализацию) использование второго антитела к первому (например, анти-IgG). Это второе антитело конъюгировано либо с флуорохромами, либо с соответствующими ферментами для колориметрических реакций, либо с золотыми шариками (для электронной микроскопии), либо с системой биотина-авидина, так что можно определить местоположение первичного антитела и, следовательно, антигена.

[001202] Молекулы CRISPR Cas по настоящему изобретению могут быть доставлены в ухо путем прямого внесения фармацевтической композиции в наружное ухо с композициями, модифицированными из опубликованной заявки США 20110142917. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция доставляется в ушной канал. Доставка в ухо может также называться ушной или проводимой в ухо доставкой.

[001203] В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулы РНК по изобретению поставляются в композициях липосомы или липофектина и тому подобных и могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области. Такие способы описаны, например, в патентах США № 5599772, 5589466 и 5580859, которые включены в настоящее описание в качестве отсылки.

[001204] Системы доставки, нацеленные специфично на расширенную и улучшенную доставку миРНК в клетки млекопитающих, были разработаны (см., например, Shen et al. FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107- 108 и Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724) и могут быть применены к данному изобретению. Недавно миРНК была успешно использована для ингибирования экспрессии генов у приматов (см., например, Tolentino et al., Retina 24(4):660) и может также быть применена к данному изобретению.

[001205] Qi et al. описывает способы эффективной трансфекции миРНК во внутреннее ухо через интактное круглое отверстие согласно новой протеоидной технологии доставки, которая может быть применена к системе нацеливания на нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению (см., например, Qi et al., Gene Therapy (12013), 1-9). В частности, доставка двухцепочечных РНК-связывающих доменов ТАТ (TAT-DRBD), которые могут трансфицировать меченную Cy3 миРНК в клетки внутреннего уха, включая внутренние и внешние волосковые клетки, полукружные каналы (crista ampullaris), слуховые пятна: овального мешочка (macula utriculi) и пятно сферического мешочка (macula sacculi), посредством интактного проникновения в круглое отверстие была успешной для двухцепочечных миРНК in vivo для лечения различных заболеваний внутреннего уха и сохранения слуховой функции. Приблизительно 40 мкл 10 мМ РНК можно рассматривать как оптимальную дозировку для введения в ухо.

[001206] Согласно Rejali et al. (Hear Res, 2007 Jun, 228 (l-2): 180-7), функционирование кохлеарного имплантата может быть улучшена путем хорошей сохранности спиральных ганглиозных нейронов, которые являются объектом электрической стимуляции имплантатом. Ранее было показано, что нейротропный фактор мозга (BDNF) повышает выживаемость спирального ганглия в экспериментально оглушенных ушах. Rejali et al. протестировали модифицированную конструкцию кохлеарного имплантационного электрода, которая включала покрытие из клеток фибробластов, трансдуцированных вирусным вектором с вставкой гена BDNF. Чтобы выполнить этот тип передачи гена ex vivo, Rejali et al. трансдуцировали фибробласты морской свинки с аденовирусом с вставкой из кассеты BDNF и удостоверились, что эти клетки секретируют BDNF, а затем прикрепили BDNF-секретирующие клетки к кохлеарному имплантату с помощью агарозного геля и имплантировали электрод в барабанную лестницу (scala tympani). Rejali et al.. определили, что экспрессирующие BDNF электроды смогли сохранить значительно больше спиральных ганглиозных нейронов в базальных витках улитки после 48 дней имплантации по сравнению с контрольными электродами и продемонстрировали возможность объединения лечения при помощи кохлеарной имплантации с переносом гена ex vivo для усиления выживаемости нейронов спирального ганглия. Такая система может быть применена к системе нацеливания на нуклеиновые кислоты, представленной в изобретении, для доставки к уху.

[001207] Mukherjea et al. (Antioxidants & Redox Signaling Volume 13, Number 5, 2010), продемонстрировали, что нокдаун N0X3 с использованием короткой интерферирующей (si) РНК блокировал ототоксичность цисплатина, о чем свидетельствует защита внешних волосковых клеток (OHC) от повреждения и снижение пороговых сдвигов в слуховой реакции ствола головного мозга (ABR). Различные дозы siNOX3 (0,3, 0,6 и 0,9 мкг) вводили крысам, а экспрессию NOX3 оценивали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Самая низкая доза используемой NOX3 миРНК (0,3 мкг) не показала никакого ингибирования мРНК N0X3 по сравнению с транстимпаническим введением скремблированной миРНК или необработанными слуховыми улитками. Однако введение более высоких доз миРНК N0X3 (0,6 и 0,9 мкг) уменьшало экспрессию N0X3 по сравнению с контрольной скремблированной миРНК. Такая система может быть применена к системе CRISPR Cas согласно настоящему изобретению для транстимпанического введения при дозе от примерно 2 мг до примерно 4 мг CRISPR Cas для введения человеку.

[001208] Jung et al. (Molecular Therapy, vol. 21 no. 4, 834-841 apr. 2013) демонстрируют, что уровень Hes5 в эллиптическом мешочке уменьшался после применения миРНК и что количество волосковых клеток в указанном эллиптическом мешочке было значительно больше, чем в контроле. Данные показывают, что технология с применением миРНК может быть полезна для индукции восстановления и регенерации во внутреннем ухе и что сигнальный путь Notch является потенциально полезной мишенью для специфического ингибирования экспрессии генов. Jung et al. вводили 8 мкг миРНК Hes5 в объеме 2 мкл, полученном путем добавления стерильного нормального физиологического раствора к лиофилизированной миРНК к вестибулярному эпителию уха. Такая система может быть применена к системе нацеливания нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению для введения в вестибулярный эпителий уха с дозой от примерно 1 до примерно 30 мг CRISPR Cas для введения человеку.

Нацеливание на гены в неделящихся клетках (нейроны и мышцы)

[001209] Неделящиеся (особенно неделящиеся, полностью дифференцированные) типы клеток представляют проблемы для нацеливания на гены или генной инженерии, например, поскольку гомологичная рекомбинация (HR) обычно подавляется в фазе клеточного цикла G1. Однако, изучая механизмы, с помощью которых клетки контролируют нормальные системы репарации ДНК, Durocher обнаружил ранее неизвестный переключатель, который удерживает HR в "выключеном" состоянии в неделящихся клетках и разработал стратегию для переключения этого переключателя обратно. Orthwein et al. (лаборатория Daniel Durocher в больнице Mount Sinai в Оттаве, Канада) недавно опубликовали (Nature 16142, опубликовано через интернет 9 декабря 2015 года) что подавление HR может быть отменено, и, таким образом, нацеливание на гены как в клетках почек (293T), так и в клетках остеосаркомы (U2OS) проведено успешно. Известно, что опухолевые супрессоры BRCA1, PALB2 и BRAC2 способствуют восстановлению двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) путем гомологичной рекомбинации (HR). Они обнаружили, что образование комплекса BRCA1 с PALB2-BRAC2 регулируется сайтом убиквитина на PALB2, так, что такое действие регулируется на указанном сайте с помощью убиквитин-лигазы E3. Эта убиквитин-лигаза E3 состоит из KEAP1 (белка, взаимодействующего с PALB2) в комплексе с куллином-3 (CUL3)-RBX1. Убиквитиляция PALB2 подавляет его взаимодействие с BRCA1 и противодействует деубиквитиназе USP11, которая сама по себе контролируется клеточным циклом. Восстановление взаимодействия BRCA1-PALB2 в сочетании с активацией резекции (удаления) концов ДНК являются достаточными для индукции гомологичной рекомбинации в G1, что можно измерить рядом способов, включая анализ нацеливания на гены на основе CRISPR-Cas9, направленный на USP11 или KEAP1 (экспрессируемый из вектора pX459). Однако, когда взаимодействие BRCA1-PALB2 восстанавливалось в грамотрицательных G1-клетках с использованием либо истощения KEAP1, либо экспрессии мутанта PALB2-KR, было обнаружено достоверное увеличение случаев нацеливания на гены.

[001210] Таким образом, в некоторых вариантах предпочтительна реактивация HR в особенности в неделящихся клетках полностью дифференцированных типов клеток. В некоторых вариантах осуществления обеспечение взаимодействия BRCA1-PALB2 является предпочтительным. В некоторых вариантах осуществления целевая клетка является неделящейся. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой нейрон или мышечную клетку. В некоторых вариантах осуществления нацеливание на клетку-мишень происходит in vivo. В некоторых вариантах осуществления клетка находится в G1 и HR подавлена. В некоторых вариантах осуществления предполагается использование KEAP1-истощения, например, ингибирования экспрессии активности KEAP1, что является предпочтительным. KEAP1-истощение может быть достигнуто посредством миРНК, например, как показано в Orthwein et al. Альтернативно, экспрессия мутанта PALB2-KR (без всех восьми остатков Lys в домене взаимодействия BRCA1) является предпочтительной и используется либо отдельно, либо в сочетании с истощением KEAP1. PALB2-KR взаимодействует с BRCA1 независимо от периода клеточного цикла, таким образом, продвижение или восстановление взаимодействия BRCA1-PALB2, особенно в клетках G1, является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления, особенно там, где клетки-мишени не делятся, или где удаление и возврат (нацеливание на ген ex vivo) проблематично, например, в нейронах и мышечных клетках. миРНК KEAP1 можно получить от ThermoFischer. В некоторых вариантах реализации в клетку G1 может быть доставлен комплекс BRCA1-PALB2. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть стимулирована деубиквитинирование PALB2, например, путем увеличения экспрессии деубиквитиназы USP11, поэтому предполагается, что конструкция может быть предоставлены для стимуляции или повышения регуляции экспрессии или активности деубиквитиназы USP11.

Лечение заболеваний глаз

[001211] Настоящее изобретение также предполагает доставку системы CRISPR-Cas в один или оба глаза.

[001212] В еще одном варианте изобретения система CRISPR-Cas может использоваться для коррекции глазных дефектов, которые возникают из нескольких генетических мутаций, описанных подробно далее в Genetic Diseases of the Eye, Second Edition, edited by Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.

[001213] Для введения в глаза особенно предпочтительны лентивирусные векторы, в частности вирусы инфекционной анемии лошадей (EIAV).

[001214] В одном из вариантов осуществления предусматриваются также минимальные лентивирусные векторы, на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), особенно для глазной генной терапии (см., например, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275-285, Published online 21 November 2005 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOF 10.1002/jgm.845). Предполагается, что векторы имеют промотор цитомегаловируса (CMV), индуцирующий экспрессию гена-мишени. Интракамеральные, субретинальные, интраокулярные и интравитреальные инъекции (см., например, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275-285, Published online 21 November 2005 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Интраокулярные инъекции могут выполняться с помощью операционного микроскопа. Для субретинальных и интравитреальных инъекций глаза могут быть пролабированы под небольшим давлением и под наблюдением и при осмотре, которые визуализируются с использованием системы контактных линз, состоящей из капли раствора соединительной среды, на роговице, покрытой покровным стеклом микроскопа. Для субретинальных инъекций кончик 10-мм 34-калибральной иглы, установленный на шприце с галоидом 5 мкл, может быть продвинут под непосредственной визуализацией через высшую экваториальную склеру тангенциально к заднему полюсу до тех пор, пока отверстие иглы не будет видно в субретинальное пространство. Затем может быть введено 2 мкл векторной суспензии для получения выступающей буллезной отслойки сетчатки, что подтверждает введение субретинального вектора. Этот подход создает самогерметичную склеротомию, позволяющую удерживать векторную суспензию в субретинальном пространстве до тех пор, пока она не будет поглощена пигментным эпителием сетчатки (RPE), обычно в течение 48 часов после процедуры. Эту процедуру можно повторить в нижнем полушарии, чтобы произвести там отслоение сетчатки. Этот способ приводит к экспонированию примерно 70% нейросенсорной сетчатки и пигментного эпителия сетчатки (RPE) к суспензии вектора. Для интравитреальных инъекций наконечник иглы можно продвигать через склеру 1 мм сзади к корнеосклеральному лимбу и вводить 2 мкл векторной суспензии в стекловидную полость. Для внутрикамеральных инъекций наконечник иглы может быть продвинут через корнеосклеральный лимбальный парацентез, направленный к центральной роговице, и может быть введено 2 мкл векторной суспензии. Эти векторы могут быть инъецированы в титрах 1,0-1,4×10¹⁰ или 1,0-1,4×10⁹ трансдуцирующих единиц (TU)/мл.

[001215] В другом варианте осуществления изобретения, RetinoStat®, основанная на вирусе инфекционной анемии лошадей лентивирусная генотерапия использует вектор, экспрессирующий ангиостатические белки эндостатин и ангиостатин, доставляемые посредством субретинальную инъекцию для лечения сетчатой формы возрастной макулодегенерации (см, например, Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (September 2012)). Такой вектор может быть изменен для использования в нацеленной на нуклеиновые кислоты системе по настоящему изобретению. Каждый глаз можно лечить RetinoStat® в дозировке 1,1×10⁵трансдуцирующих единиц на глаз (TU/глаз) в общем объеме 100 мкл.

[001216] В другом варианте осуществления E1-, частичный E3-, E4-удаленный аденовирусный вектор может быть предусмотрен для доставки в глаз. Двадцать восемь пациентов с развитой неоваскулярной возрастной макулодистрофией (AMD) получили одну интравитреальную инъекцию E1-, частичного E3-, E4-удаленного аденовирусного вектора, экспрессирующего пигментный фактор эпителиального происхождения (AdPEDF II) (см. например, Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167-176 (February 2006). Были исследованы дозы от 10⁶ до 10^9,5 единиц (PU) и не было показано никаких серьезных побочных эффектов, связанных с AdPEDF II, и отсутствовала токсичность, накладывающая ограничения на дозу препарата (см., например, Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167-176 (February 2006)). Аденовирусный перенос окулярного гена при помощи вектора, по-видимому, является продуктивным способом для лечения глазных заболеваний и может быть применен к системе CRISPR Cas.

[001217] В другом варианте осуществления система sd-rxRNA® RXi Pharmaceuticals может быть использована и/или адаптирована для доставки CRISPR-Cas в глаз. Данная система подразумевает одно интравитреальное введение 3 мкг sd-rxRNA, которое приводит к последовательному снижению уровня мРНК PPIB в течение 14 дней. Система sd-rxRNA® может быть применена к системе нацеливания на нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, предполагая дозу приблизительно от 3 до 20 мг CRISPR, вводимую человеку.

[001218] Millington-Ward et al. (Molecular Therapy, vol. 19 no. 4, 642-649 apr. 2011) описывают использование аденоассоциированных вирусов (AAV) для доставки супрессора родопсина, основанного на РНК-интерференции (РНК-i), и кодон-модифицированного гена родопсина, устойчивого к супрессии вследствие нуклеотидных изменений в вырожденных позициях в сайте-мишени РНК интерференции. Инъекция в глаз дозы 6,0×10⁸ вирусных частиц (вч) или 1,8×10¹⁰ вч AAV была произведена субретинентально Millington-Ward et al. ААV-векторы Millington-Ward et al. могут быть применены к системе CRISPR Cas согласно настоящему изобретению, с предполагаемой дозой от примерно 2×10¹¹ до примерно 6×10¹³ вирусных частиц (вч), вводимую человеку.

[001219] Dalkara et al. (Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013)) также обращается к направленной эволюции in vivo для создания AAV-вектора, который доставляет версии дефектных генов дикого типа по всей сетчатке после неинвазивной инъекции в стекловидное тело глаза. Dalkara описывает 7-мерную пептидную библиотеку и AAV-библиотеку, сконструированную путем ДНК-шаффлинга генов cap из AAV1, 2, 4, 5, 6, 8 и 9. Библиотеки rcAAV и векторы rAAV, экспрессирующие GFP под воздействием промотора CAG или Rho, были упакованы и, были получены устойчивые к воздействию дезоксирибонуклеаз геномные титры при помощи количественной ПЦР. Библиотеки были объединены, и были проведены два раунда эволюции, каждый из которых состоял из первоначальной диверсификации библиотек, за которой следовали три этапа отбора in vivo. На каждом таком этапе мышам P30 rho-GFP интравитреально вводили 2 мл очищенной иодиксанолом фосфатно-буферной солевой (PBS)-диализованной библиотеки с геномным титром около 1×10¹² вирусных геномов (вг)/мл. AAV-векторы Dalkara et al. могут быть применены к системе нацеливания нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, предусматривающей дозу приблизительно от 1×10¹⁵ до приблизительно 1×10¹⁶ вирусных геномов (вг)/мл, вводимую человеку.

[001220] В другом варианте может быть осуществлено нацеливание на ген родопсина для лечения пигментного ретинита (RP), в этом варианте система согласно патентной публикации США № 20120204282 закрепленная за Sangamo BioSciences Inc. может быть модифицирована в соответствии с системой CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

[001221] В одном из вариантов осуществления способы патентной публикации США № 20130183282, закрепленные за Cellectis, которые заключаются в методах расщепления последовательности-мишени из гена родопсина человека, также могут быть модифицированы для системы нацеливания на нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению.

[001222] Патентная публикация США № 20130202678, закрепленная за Academia Sinica, относится к способам лечения ретинопатий и угрожающих зрению офтальмологических расстройств, связанных с доставкой гена Puf-A (который экспрессируется в ганглии сетчатки и пигментированных клетках тканей глаза и показывает уникальную антиапоптозную активность) в субретинальное или интравитреальное пространство глаза. В частности, желательными мишенями являются zgc: 193933, prdm1a, spata2, tex10, rbb4, ddx3, zp2.2, Blimp-1 и HtrA2, на все из которых может быть нацелена система нацеливания нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению.

[001223] Wu (Cell Stem Cell, 13: 659-62, 2013) разработали направляющую РНК, которая направляла Cas9 к мутации в единственной паре оснований, вызывавшей катаракту у мышей, где она индуцировала расщепление ДНК. Затем, используя либо другой аллель дикого типа, либо олигонуклеотиды, вводимые в зиготы, механизмы репарации корректировали последовательность сломанного аллеля и исправляли генетический дефект, вызывающий катаракту у мутантной мыши.

[001224] В патентной публикации США № 20120159653 описано использование нуклеаз с цинковыми пальцами для генетической модификации клеток, животных и белков, связанных с макулярной дегенерацией (МD). Макулярная дегенерация (MD) является основной причиной нарушения зрения у пожилых людей, но также является определяющим симптомом детских заболеваний, таких как болезнь Штаргардта, дистрофия глазного дна Сорсби, и фатальные нейродегенеративные болезни у детей, с проявлением первых признаков заболевания в младенчестве. Дегенерация макулы (желтого пятна) приводит к потере зрения в центре поля зрения (макулы), поскольку повреждается сетчатка. В настоящее время существующие животные модели не повторяют основные признаки болезни таким образом, наблюдающиеся у людей. Доступные животные модели, содержащие мутантные гены, кодирующие белки, связанные с MD, также приводят к проявлению в значительной степени разнообразных фенотипов, что усложняет переход к изучению заболевания у человека и создает проблемы для разработки терапии.

[001225] В одном аспекте патентная публикация США № 20120159653 относится к редактированию любых хромосомных последовательностей, которые кодируют белки, связанные с развитием MD, которые могут быть применены к системе нацеливания нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Белки, связанные с MD, обычно выбираются экспериментальным путем, связывая белок, ассоциированный с MD, с расстройством МD. Например, скорость синтеза или циркулирующая концентрация белка, связанного с МD, может быть повышена или понижена в популяции, имеющей расстройство MD, относительно популяции, у которой отсутствует расстройство MD. Различия в уровнях белка могут быть оценены с использованием методов протеомики, включая, но не ограничиваясь ими: вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание, иммуноферментный анализ (ELISA) и масс-спектрометрию. Альтернативно, белки, связанные с МD, могут быть идентифицированы путем получения профилей генной экспрессии генов, кодирующих белки, при помощи геномных методов, включая, но не ограничиваясь ими, анализ на микрочипах ДНК, последовательный анализ экспрессии генов (SAGE) и количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (кПЦР).

[001226] В качестве неограничивающего примера белки, связанные с МD, включают, но не ограничиваются ими: ATP-связывающую кассету, член 4 (ABCA4) подсемейства A (ABC1), член 4 ACHM1-ахроматопсии (палочковая монохромазия), 1 ApoE аполипопротеин E (ApoE), C1QTNF5 (CTRP5) Clq и связанный с фактором некроза опухоли белок 5 (C1QTNF5), C2 компонент комплемента 2 (C2), компоненты комплемента C3 (C3), CCL2 лиганд хемокинов (CC-мотив) 2 (CCL2), CCR2 рецептор 2 хемокинов (CC мотив) (CCR2), CD36 кластер дифференциации 36, CFB фактор комплемента В, CFH фактор комплемента CFH, фактор комплемента 1, связанный с Н CFHR1, фактор комплемента 3, связанный с Н CFHR3, циклический нуклеотид закрытого канала бета 3 CNGB3, CP-целлюлоплазмин (CP), CRP C-реактивный белок (CRP), CST3 цистатин C или цистатин 3 (CST3), CTSD катепсин D (CTSD), CX3CR1 рецептор 1 хемокинов (C-X3-C-мотив), ELOVL4 белок удлинение очень длинноцепочечных жирных кислот 4, эксцизионной репарации ДНК ERCC6, белок кросс-дополняющего дефицита грызунов, группа комплемента 6, фибулин-5 FBLN5, фибулин 6 FBLN6, FSCN2 фасцин (FSCN2), HMCN1 гемицентрин 1, HTRA1 HTRA сериновая пептидаза 1 (HTRA1), IL-6 интерлейкин 6, IL-8 интерлейкин 8, LOC387715, гипотетический белок PLEKHA1, член 1 семейства А, содержащего домен гомологии плекстрина (PLEKHA1), PROM1 проминин 1 (PROM1 или CD133), PRPH2 периферин-2, RPGR регулятор GTP-азы пигментного ретинита, SERPING1 ингибитор серпиновой пептидазы, член 1 клады G (Cl-ингибитор), TCOF1, Treacle TIMP3 ингибитор металлопротеиназы 3 (TIMP3), Toll-подобный рецептор 3 TLR3.

[001227] Тип белка, связанного с MD, хромосомная последовательность которого отредактирована, может и будет изменяться. В предпочтительных вариантах осуществления белки, связанные с MD, хромосомная последовательность которыхподвергается редактированию, могут представлять АТФ-связывающую кассету, член 4 (ABCA4) подсемейства A (ABC1), кодируемый геном ABCR, аполипопротеин E (APOE), кодируемый ген APOE, лиганд хемокинов (C-C мотив) 2 (CCL2), кодируемый геном CCL2, рецептор хемокина 2 (C-C мотив) (CCR2), кодируемый геном CCR2, церулоплазмин (CP), кодируемый геном CP, катепсин D (CTSD), кодируемый геном CTSD, или ингибитор металлопротеиназы 3 (TIMP3), кодируемый геном TIMP3. В иллюстративном варианте осуществления генетически модифицированное животноеявляется крысой, а отредактированная хромосомная последовательность, кодирующая белок, связанный с MD, может быть: (ABCA4) ATP-связывающая кассета, подгруппа NM_000350 подсемейства A (ABC1), член 4 APOE аполипопротеин E NM138828 (APOE), CCL2 лиганд 2 хемокинов (C-C NM_031530 мотив) (CCL2), CCR2 хемокин (C-C NM_021866 мотив) рецептор 2 (CCR2), CP церулоплазмин (CP) NM_012532, CTSD катепсин D (CTSD) NM_134334, ингибитор металлопротеиназы TIMP3 NM_012886 3 (TIMP3). Животное или клетка могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более нарушенных хромосомных последовательностей, кодирующих белок, ассоциированный с MD, а также ноль, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более хромосомно-интегрированные последовательностей, кодирующих разрушенный белок, связанный с MD.

[001228] Измененная или интегрированная хромосомная последовательность может быть модифицирована для кодирования измененного белка, связанного с MD. Несколько мутаций в хромосомных последовательностях были связаны с MD. Неограничивающие примеры мутаций в хромосомных последовательностях, связанных с MD, включают те, которые могут вызывать MD, в том числе в белке ABCR, E471K (т.е. глутамат в положении 471 заменен на лизин), R1129L (то есть аргинин в положении 11129 заменен на лейцин), T1428M (т.е. треонин в положении 1428 заменен на метионин), R1517S (т.е. аргинин в положении 1517 заменен на серин), I1562T (т.е. изолейцин в положении 1562 заменен на треонин), а G1578R (т.е. глицин в положении 1578 изменен на аргинин); в белке CCR2 V64I (то есть валин в положении 192 заменен на изолейцин); в белке CP G969B (т.е. глицин в положении 969 заменен на аспарагин или аспартат); в белке TIMP3 S156C (т.е. серин в положении 156 заменен на цистеин), G166C (т.е. глицин в положении 166 заменен на цистеин), G167C (т.е. глицин в положении 167 заменен на цистеин), Y168C (т.е. тирозин в положении 168 изменен на цистеин), S17C (т.е. серин в положении 170 заменен на цистеин), Y172C (т.е. тирозин в положении 172 заменен на цистеин) и S181C (т.е. серин в положении 181 заменен на цистеин). Также и другие ассоциации генетических вариантов в MD-ассоциированных генах и заболеваниях известны в данной области.

Лечение заболеваний кровеносной и мышечной систем

[001229] Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas, описанной здесь, например, систем эффекторных белков C2c1 или C2c3 в сердце. Для доставки в сердце предпочтительным является аденоассоциированный вирус миокарда (AAVM), в частности AAVM41, который показал преимущественный перенос генов в сердце (см., например, Lin-Yanga et al., PNAS, March 10, 2009, vol, 106, no. 10). Доставка может быть системной или локальной. Для системного введения предусматривается дозировка около 1-10×10¹⁴ векторных геномов. Смотрите, например, Eulalio et al. (2012) Nature 492: 376 and Somasuntharam et al. (20013) Biomaterials 34: 7790.

[001230] Например, в патентной публикации США № 20110023139 описано использование нуклеаз цинковых пальцев для генетической модификации клеток, животных и белков, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Сердечно-сосудистые заболевания обычно включают высокое артериальное давление, сердечные приступы, сердечную недостаточность и инсульт и TIA. Любая хромосомная последовательность, вовлеченная в сердечно-сосудистое заболевание или белок, кодируемый любой хромосомной последовательностью, участвующий в сердечно-сосудистых заболеваниях, может быть использованы в способах, описанных в настоящем описании. Белки, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями, обычно выбираются на основе экспериментальной ассоциации связанного с сердечно-сосудистыми заболеваниями белка с развитием сердечно-сосудистых заболеваний. Например, скорость синтеза или циркулирующая концентрация связанного с сердечно-сосудистым заболеванием белка может быть повышена или понижена в популяции, имеющей сердечно-сосудистое расстройство, относительно популяции, не имеющей сердечно-сосудистого расстройства. Различия в уровнях белка могут быть оценены с использованием методов протеомики, включая, но не ограничиваясь ими: вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание, иммуноферментный анализ (ELISA) и масс-спектрометрию. Альтернативно, белки, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями, могут быть идентифицированы путем получения профилей экспрессии генов, кодирующих белки, с использованием геномных методов, включая, но не ограничиваясь ими, анализ на микрочипах ДНК, последовательный анализ экспрессии генов (SAGE) и количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (кПЦР).

[001231] В качестве примера хромосомная последовательность может включать, но не ограничивается, следующими: IL1B (интерлейкин 1, бета), XDH (ксантиндегидрогеназа), TP53 (белок опухолей p53), PTGIS (простагландин 12 (простациклин) синтаза), MB (миоглобин), IL4 (интерлейкин 4), ANGPT1 (ангиопоэтин 1), ABCG8 (АТФ-связывающая кассета, подсемейство G (WHITE), член 8), CTSK (катепсин K), PTGIR (простагландин 12 (простациклин) рецептор (IP)), KCNJ11 (калиевый канал внутреннего выпрямления, подсемейство J, член 11), INS (инсулин), CRP (C-реактивный белок, связанный с пентраксином), PDGFRB (рецептор фактора роста тромбоцитов, бета-полипептид), CCNA2 (циклин A2), PDGFB (бета-полипептид фактора роста тромбоцитов (вирусный онкогенный гомолог саркомы обезьян (v-sis)), KCNJ5 (калиевый канал внутреннего выпрямления, подсемейство J, член 5), KCNN3 (кальций-активируемые калиевые каналы средней/малой проводимости, подсемейство N, член 3), CAPN10 (кальпаин 10), PTGES (простагландин-E-синтаза), ADRA2B (адренергический, альфа-2B-, рецептор), ABCG5 (ATФ-связывающая кассета, подгруппа G (WHITE), элемент 5), PRDX2 (пероксиредоксин 2), CAPN5 (кальпаин 5), PARP14 (семейство поли (ADФ-рибоза), полимераз, член 14), MEX3C (мекс-3 гомолог С (С. elegans)), ACE фермент превращения ангиотензина I (пептидилдипептидаза А) 1, ФНО (фактор некроза опухолей (надсемейство TNF, член 2)), IL6 (интерлейкин 6 (интерферон, бета 2)), STN (статин), SERPINE1 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада E (нексин, ингибитор активатора плазминогена типа 1), член 1), ALB (альбумин), ADIPOQ (адипонектин, C1Q и содержащий домен коллагена), APOB (аполипопротеин В (включая Ag (x) антиген)), APOE (аполипопротеин E) LEP (лептин), MTHFR (5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза (NADPH)), APOA1 (аполипопротеин A-I), EDN1 (эндотелин I), NPPB (предшественник натрийуретического пептида B), NOS3 (синтаза оксида азота 3 (эндотелиальная клетка)), PPARG (гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом), PLAT (активатор плазминогена, ткань), PTGS2 (простагландин-эндопероксид-синтаза 2 (простагландин G/H-синтаза и циклооксигеназа)), CETP (белок переноса холестеринового эфира, плазма), AGTR1 (рецептор ангиотензина II, тип 1), HMGCR (3-гидрокси-3-4-метилглютарил-кофермент A редуктаза), IG F1 (инсулиноподобный фактор роста 1 (соматомедин C)), SELE селектин Е E), REN (ренин), PPARA (рецептор альфа,активируемый пролифератором пероксисом), PON1 (параоксоназа 1), KNG1 (кининоген 1), CCL2 (хемокин (CC мотив) лиганд 2), LPL (липопротеинлипаза), VWF (фактор фон Виллебранда), F2 (фактор коагуляции II (тромбин)), ICAM1 (молекула межклеточной адгезии 1), TGFB1 (трансформирующий фактор роста, бета 1), NPPA (предшественник натрийуретического пептида A), IL10 (интерлейкин 10), EPO (эритропоэтин), SOD1 (супероксиддисмутаза 1, растворимый), VCAM1 (васкулярная молекула клеточной адгезии 1), IFNG (интерферон, гамма), LPA (липопротеин, Lp (a)), MPO (миелопероксидаза), ESR1 (рецептор эстрогена 1), MAPK1 (митоген-активированная протеинкиназа 1), HP (гаптоглобин), F3 (фактор коагуляции III (тромбопластин, тканевой фактор)), CST3 (цистатин C), COG2 (компонент олигомерного комплекса Гольджи 2), MMP9 (матриксная металлопептидаза 9 (желатиназа B, 92-кДа желатиназа, коллагеназа IV типа), SERPINC1 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада C (антитромбин), член 1), F8 (фактор коагуляции VIII, прокоагулянтный компонент), HMOX1 (гемоксигеназа (дециклирующая) 1), APOC3 (аполипопротеин C-III), IL8 (интерлейкин 8), PROK1 (прокинетицин 1), CBS (цистатионин-бета-синтаза), NOS2 (синтаза оксида азота 2, индуцибельная), TLR4 (толл-подобный рецептор 4), SELF (селектин P (гранульный мембранный белок 140 кДа, антиген CD62)), ABCA1 (АТФ-связывающая кассета, подсемейство А (АВС 1), член 1), AGT (ангиотензиноген (ингибитор серпиновой пептидазы, клада A, член 8)), LDLR (рецептор липопротеинов низкой плотности), GPT (глутамат-пируват трансаминаза (аланинаминотрансфераза)), VEGFA (фактор роста эндотелия сосудов A), NR3C2 (подсемейство ядерных рцепторов 3, группа C, член 2), IL18 (интерлейкин 18 (интерферон-гамма-индуцирующий фактор)), NOS1 (синтаза оксида азота 1 (нейронная)), NR3C1 (подсемейство ядерных рецепторов 3, группа C, член 1 (глюкокортикоидный рецептор)), FGB (бета-цепь фибриногена), HGF (фактор роста гепатоцитов (гепапоэтин A, фактор рассеяния)), IL1A (интерлейкин 1, альфа), RETN (резистин), AKT1 (мышиный тимома вирусный онкогенный гомолог (v-akt) 1), LIPC (липаза, печеночная), HSPD1 (60 кДа белок теплового шока 1 (шаперонин)), МАРК14 (митоген-активируемая протеинкиназа 14), SPP1 (секретируемый фосфопротеин 1), ITGB3 (интегрин, бета 3 (тромбоцитарный гликопротеин 111a, антиген CD61)), CAT (каталаза), UTS2 (уротензин 2), THBD (тромбомодулин), F10 (фактор коагуляции X), CP (церулоплазмин (ферроксидаза)), TNFRSF11B (надсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 11b), EDNRA (рецептор эндотелина типа A), EGFR (рецептор эпидермального фактора роста (вирусный онкогенный гомолог эритробластного лейкоза (v-erb-b), птичий)), MMP2 (матриксная металлопептидаза 2 (желатиназа A, 72 кДа желатиназа, 12 кДа коллагеназа IV типа), PLG (плазминоген), NPY (нейропептид Y), RHOD (семейство генов ras, член D), MAPK8 (митоген-активируемая протеинкиназа 8), MYC (v-myc myelocytomatosis вирусный онкогенный гомолог миелоцитоматоза (v-myc) (птичий)), FN1 (фибронектин 1), CMA1 (химаза 1, тучная клетка), PLAU (активатор плазминогена, урокиназа), GNB3 (гуанин-нуклеотид связывающий белок (G-белок), бета-полипептид 3), ADRB2 бета-2-адренорецептор, поверхностный), APOA5 (аполипопротеин A-V), SOD2 (супероксиддисмутаза 2, митохондриальная), F5 (фактор коагуляции V (проакцелерин, лабильный фактор)), VDR (рецептор витамина D (1,25-дигидроксивитамин D3)), ALOX5 (арахидонатная 5-липоксигеназа), HLA-DRB1 (главный комплекс гистосовместимости, класс II, DR бета I), PARP1 (поли (AДФ-рибоза) полимераза 1), CD40LG (лиганд CD40), PON2 (параоксоназа 2), AGER (рецептор конечных продуктов гликозилирования), IRS1 (субстрат рецептора инсулина 1), PTGS1 (простагландин-эндопероксид-синтаза 1 (простагландин G/H-синтаза и циклооксигеназа)), ECE1 (эндотелин-конвертирующий фермент 1), F7 (фактор свертывания крови VII (ускоритель конверсии протромбина сыворотки)), URN (антагонист рецептора интерлейкина 1), EPHX2 (эпоксидгидролаза 2, цитоплазматическая), IGFBP1 (инсулиноподобный белок, связывающий фактор роста 1), МАРК 10 (митоген-активируемая протеинкиназа 10), FAS (Fas (суперсемейство рецепторов TNF, член 6)), ABCB1 (ATФ-связывающая кассета, подсемейство (MDR/TAP), член 1), JUN (jun-онкоген), IGFBP3 (инсулиноподобный белок, связывающий фактор роста 3), CD14 (молекула CD14), PDE5A (фосфодиэстераза 5A, cGMP-специфичная), AGTR2 (рецептор ангиотензина II, тип 2), CD40 (молекула CD40, член суперсемейства TNF-рецепторов 5), LCAT (лецитинхолестеринацилтрансфераза), CCR5 (рецептор хемокина (C-C мотив) 5), MMP1 (матриксная металлопептидаза 1 (интерстициальная коллагеназа)), TIMP1 (ингибитор металлопептидазы TIMP 1), ADM (адреномедуллин), DYT10 (дистония 10), STAT3 (сигнальный белок и активатор транскрипции 3 (фактор ответа острой фазы), MMP3 (матриксная металлопептидаза 3 (стромелизин 1, прожелатиназа)), ELN (эластин), USF1 (фактор транскрипции upstream 1), CFH (фактор комплемента H), HSPA4 (70-кДа белок теплового шока 4), MMP12 (матриксная металлопептидаза 12 (макрофагальная эластаза)), MME (мембранная металлоэндопептидаза), F2R (рецептор фактора свертывания крови II (тромбина)), SELL (селектин L), ANXA5 (аннексин A5), ADRB1 (бета-1-адренорецептор), CYBA (цитохром b-245, альфа-полипептид), FGA (альфа-цепь фибриногена), GGT1 (гамма-глутамилтрансфераза 1), LIPG (липаза, эндотелиальная), HIF1A (фактор, индуцируемый гипоксией 1, альфа-субъединица (основной фактор транскрипции с доменом "спираль-петля-спираль")), CXCR4 (рецептор хемокина (мотив C-X-C)), PROC (белок C (инактиватор факторов свертывания крови Va и VIIIa)), SCARB1 (скавенджер-рецептор класса B, член 1), CD79A (молекула CD79a, ассоциированная с иммуноглобулином альфа), PLTP (белок переноса фосфолипидов), ADD1 (аддуктин 1 (альфа)), FGG (гамма-цепь фибриногена), SAA1 (сывороточный амилоид Al), KCNH2 (потенциал-зависимый калиевый канал, подсемейство H (связанные с eag), член 2), DPP4 (дипептидилпептидаза 4), G6PD (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), NPR1 (натрийуретический пептидный рецептор A/гуанилатциклаза A (рецептор атрионатриуретического пептида A)), VTN (витронектин), KIAA0101 (KIAA0101), FOS (гомолог вирусного онкогена мышиной остеосаркомы FBJ), TLR2 (толл-подобный рецептор 2), РРIG (пептидил-пролил-изомераза G (циклофилин G)), IL1R1 (рецептор интерлейкина 1, тип I), AR (андрогеновый рецептор), CYP1A1 (цитохром P450, семейство 1, подсемейство A, полипептид 1), SERPINA1 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада A (альфа-1 антипротеиназа, антитрипсин), член 1), MTR (5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин метилтрансфераза), RBP4 (ретинол-связывающий белок 4, плазма), APOA4 (аполипопротеин A-IV), CDKN2A (ингибитор циклинзависимой киназы 2A (меланома, p16, ингибирует CDK4)), FGF2 (фактор роста фибробластов 2 (основной)), EDNRB (рецептор эндотелина типа B), ITGA2 (интегрин, альфа 2 (CD49B, альфа-2 субъединица рецептора VLA-2)), CABIN1 (связывающий кальциневрин белок 1), SHBG (глобулин, связывающий половые гормоны), HMGB1 (белок из группы с высокой подвижностью 1), HSP90B2P (90 кДа белок теплового шока бета (Grp94), член 2 (псевдоген)), CYP3A4 (цитохром P450, семейство 3, подсемейство A, полипептид 4), GJA1 (белок щелевого соединения, альфа 1, 43 кДа), CAV1 (кавеолин 1, белок кавеолы, 22 кДа), ESR2 (рецептор эстрогена 2 (ER beta)), LTA (лимфотоксин альфа (надсемейство TNF, член 1)), GDF15 (фактор дифференцировки роста 15), BDNF (нейротрофический фактор мозга), CYP2D6 (цитохром P450, семейство 2, подсемейство D, полипептид 6), NGF (фактор роста нервов (бета-полипептид)), SP1 (фактор транскрипции Spl), TGIF1 (фактор гомеобокс 1, индуцированный TGFB), SRC (гомолог вирусного онкогена саркомы (Шмидт-Руппин А-2) v-src (птичья)), EGF (эпидермальный фактор роста (бета-урогастрон)), PIK3CG (фосфоинозитид-3-киназа, каталитический, гамма-полипептид), HLA-A (главный комплекс гистосовместимости, класс I, A), KCNQ1 (потенциал-зависимый калиевый канал, KQT-подобное подсемейство, член 1), CNR1 (каннабиноидный рецептор 1 (мозг)), FBN1 (фибриллин 1), CHKA (холинкиназа альфа), BEST1 (бестрофин 1), APP (белок предшественника бета-амилоида (A4)), CTNNB1 (катенин (связанный с кадгерином белок), бета 1, 88 кДа), IL2 (интерлейкин 2), CD36 (молекула CD36 (рецептор тромбоспондина)), PRKAB1 (протеинкиназа, AMФ-активируемая, некаталитическая субъединица бета 1), TPO (пероксидаза щитовидной железы), ALDH7A1 (семейство альдегиддегидрогеназы 7, член A1), CX3CR1 (рецептор хемокина (C-X3-C мотив) 1), TH (тирозингидроксилаза), F9 (фактор свертывания крови IX), GH1 (гормон роста 1), TF (трансферрин), HFE (гемохроматоз), IL17A (интерлейкин 17A), PTEN (гомолог фосфатазы и тензина), GSTM1 (глутатион S-трансфераза mu 1), DMD (дистрофин), GATA4 (GATA-связывающий белок 4), F13A1 (фактор свертывания крови XIII, полипептид А1), TTR (транстиретин), FABP4 (связывающий жирные кислоты белок 4, адипоцит), PON3 (параоксоназа 3), APOC1 (аполипопротеин C-I), INSR (инсулиновый рецептор), TNFRSF1B (семейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1B), HTR2A (рецептор 5-гидрокситриптамина (серотонина) 2A), CSF3 (колониестимулирующий фактор 3 (гранулоцит)), CYP2C9 (цитохром P450, семейство 2, подсемейство C, полипептид 9), TXN (тиоредоксин), CYP11B2 (цитохром P450, семейство 11, подсемейство B, полипептид 2), PTH (паратиреоидный гормон), CSF2 (колониестимулирующий фактор 2 (гранулоцит-макрофаг)), KDR (рецептор киназного вставочного домена(рецептор тирозинкиназы типа III), PLA2G2A (фосфолипаза A2, группа IIА (тромбоциты, синовиальная жидкость)), B2M (бета-2-микроглобулин), THBS1 (тромбоспондин 1), GCG (глюкагон), RHOA (семейство генов гомологии ras, член A), ALDH2 (семейство альдегиддегидрогеназы 2 (митохондриальный)), TCF7L2 (транскрипционный фактор 7-подобный 2 (специфичный для Т-клеток, группа генов с высокой мобильностью - HMG-box)), BDKRB2 (рецептор брадикинина B2), NFE2L2 (ядерный фактор 2, подобный эритроидному деривату), NOTCH1 (гомолог Notch 1, связанный с транслокацией (Drosophila)), UGT1A1 (семейство УДФ-глюкуронозилтрансферазы 1, полипептид Al), IFNA1 (интерферон, альфа I), PPARD (дельта-рецептор, активируемый пероксисомным пролифератором), SIRT1 (сиртуин (гомолог silent mating type information regulation 2) 1 (S. cerevisiae)), GNRH1 (гонадотропин-рилизинг-гормон 1 (лютеинизирующий гормон)), PAPPA (ассоциированный с беременностью протеин-A плазмы, паппализин 1), ARR3 (аррестин 3, сетчатка (X-аррестин)), NPPC (предшественник натрийуретического пептида C), AHSP (стабилизирующий белок альфа-гемоглобина), PTK2 (белок PTK2 тирозинкиназа 2), IL13 (интерлейкин 13), MTOR (механистическая мишень рапамицина (серин/треонинкиназа)), ITGB2 (интегрин, бета 2 (комплементарный компонент 3 рецептора 3 и субъединицы 4)), GSTT1 (глутатион S-трансфераза тета 1), IL6ST (сигнальный белок интерлейкина 6 (gpl30, рецептор онкостатина M)), CPB2 (карбоксипептидаза B2 (плазма)), CYP1A2 (цитохром P450, семейство 1, подсемейство A, полипептид 2), HNF4A (ядерный фактор гепатоцитов 4, альфа), SLC6A4 (семейство транспортеров растворенных веществ 6 (транспортер нейротрансмиттеров, серотонин), член 4), PLA2G6 (фосфолипаза A2, группа VI (цитозольная, не зависящая от кальция)), TNFSF11 (надсемейство фактора некроза опухолей (лиганд), член 11), SLC8A1 (семейство транпортеров растворенных веществ 8 (натрий/кальциевый обменник), член 1), F2RL1 (фактор свертывания крови II (тромбин), подобный рецептору 1), AKR1A1 (альдокеторедуктаза семейства 1, член Al (альдегидредуктаза), ALDH9A1 (альдегиддегидрогеназа семейства 9, член Al), BGLAP (белок костного гамма-карбоксиглутамата (gla)), MTTP (микросомальный белок переноса триглицеридов), MTRR (редуктаза 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеинметилтрансферазы), SULT1A3 (семейство сульфотрансфераз, цитозольный, 1A, фенол-предпочтительный, член 3), RAGE (почечный опухолевый антиген), C4B (компонент комплемента 4B (группа крови Chido), P2RY12 (пуринергический рецептор P2Y, G-белок связанный, 112.), RNLS (реналаза, FAD-зависимая аминоксидаза), CREB1 (белок, связывающий цАМФ-отзывчивый элемент 1), POMC (проопиомеланокортин), RAC1 (связанный с ras субстрат ботулотоксина C3 1 (семейство rho, небольшой ГТФ-связывающий белок Racl)), LMNA (ламин NC), CD59 (молекула CD59, регуляторный белок комплемента), SCN5A (потенциал-зависимый натриевый канал, тип V, альфа-субъединица), CYP1B1 (цитохром P450, семейство 1, подсемейство B, полипептид 1), MIF (ингибитор миграции макрофагов) (фактор ингибирования гликозилирования)), MMP13 (матриксная металлопептидаза 13 (коллагеназа 3)), TIMP2 (ингибитор металлопептидазы ингибитор TIMP 2), CYP19A1 (цитохром P450, семейство 19, подсемейство A, полипептид 1), CYP21A2 (цитохром P450, семейство 21, подсемейство A, полипептид 2), PTPN22 (протеиновая тирозинфосфатаза, не рецепторный тип 22 (лимфоидный)), MYH14 (миозин, тяжелая цепь 14, немышечный), MBL2 (маннозосвязывающий лектин (белок C) 2, растворимый (опсонический дефект)), SELPLG (лиганд P-селектина), AOC3 (аминоксидаза, содержащая медь 3 (сосудистый адгезионный белок 1)), CTSL1 (катепсин L1), PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток), IGF2 (инсулиноподобный фактор роста 2 (соматомедин A)), ITGB1 (интегрин, бета 1 (рецептор фибронектина, бета-полипептид, антиген CD29 включает MDF2, MSK12)), CAST (кальпастатин), CXCL12 (хемокин (мотив C-X-C) лиганд 12 (фактор стромальных клеток 1)), IGHE (тяжелая константная цепь эпсилон иммуноглобулина), KCNE1 (потенциал-зависимый калиевый канал, семейство, связанное с Isk, член 1), TFRC (рецептор трансферрина (p90, CD71)), COL1A1 (коллаген, тип I, альфа 1), COL1A2 (коллаген, тип I, альфа 2), IL2RB (рецептор интерлейкина 2, бета), PLA2G10 (фосфолипаза A2, группа X), ANGPT2 (ангиопоэтин 2), PROCR (рецептор белка C, эндотелиальный (EPCR)), NOX4 (-НАДФH-оксидаза 4), HAMP (антимикробный пептид гепсидин), PTPN11 (протеиновая тирозинфосфатаза, не рецепторный тип 11), SLC2A1 (семейство транспортеров растворенных веществ 2 (облегченный переносчик глюкозы), член 1), IL2RA (рецептор интерлейкина 2, альфа), CCL5 (хемокин (C-C мотив) лиганд 5), IRF1 (интерферон регуляторный фактор 1), CFLAR (CASP8- и FADD-подобные регуляторы апоптоза), CALCA (связанный с кальцитонином полипептид альфа), EIF4E (фактор инициации трансляции эукариот 4E), GSTP1 (глутатион S-трансфераза pi 1), JAK2 (Янус-киназа2), CYP3A5 (цитохром P450, семейство 3, подсемейство A, полипептид 5), HSPG2 (гепарансульфат-протеогликан 2), CCL3 (хемокин (C-C мотив) лиганд 3), MYD88 (ген миелоидной дифференцировки первичного ответа (88)), VIP (вазоактивный интестинальный пептид), SOAT1 (стерол-O-ацилтрансфераза 1), ADRBK1 (киназа бета-адренорецептора 1), NR4A2 (подсемейство 4 ядерных рецепторов, группа A, член 2), MMP8 (матричная металлопептидаза 8 (нейтрофильная коллагеназа)), NPR2 (натрийуретический пептидный рецептор B/гуанилатциклаза В (атрионатриуретический пептидный рецептор B)), GCH1 (ГТФ-циклогидролаза 1), EPRS (глутамил-пролил-тРНК-синтетаза), PPARGC1A (гамма-активатор, активируемый пероксисомным пролифератором, коактиватор 1 альфа), F12 (фактор свертывания крови XII (фактор Хагемана)), PECAM1 (молекула адгезии тромбоцитов/эндотелиальных клеток), CCL4 (хемокин (C-C мотив) лиганд 4), SERPINA3 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада A (альфа-1 антипротеиназа, антитрипсин), член 3), CASR (кальций-чувствительный рецептор), GJA5 (белок щелевого контакта, альфа 5, 40 кДа), FABP2 (белок, связывающий жирные кислоты 2, кишечный), TTF2 (фактор терминации транскрипции, РНК-полимераза II), PROS1 (белок S (альфа)), CTF1 (кардиотрофин 1), SGCB (саркогликан, бета (43 кДа, дистрофин-ассоциированный гликопротеин)), YME1L1 (YME1-подобный 1 (S. cerevisiae)), CAMP (антимикробный пептид кателицидин), ZC3H12A (цинковый палец CCCH-типа, содержащий 12А), AKR1B1 (альдокеторедуктаза 1 семейства, член B1 (альдозоредуктаза)), DES (десмин), MMP7 (матричная металлопептидаза 7 (матрилизин, маточный), AHR (арильный углеводородный рецептор), CSF1 (колониестимулирующий фактор 1 (макрофагальный)), HDAC9 (гистондеацетилаза 9), CTGF (фактор роста соединительной ткани), KCNMA1 (кальций-активируемый калиевый канал высокой проводимости, подсемейство M, член альфа 1), UGT1A (семейство UDP УДФ-глюкуронозилтрансфераза 1 семейства, комплексный локус полипептида A), PRKCA (протеинкиназа C, альфа), COMT (катехол-бета-метилтрансфераза), S100B (кальций-связывающий белок S100 B), EGR1 (early growth factor 1), PRL (пролактин), IL15 (интерлейкин 15), DRD4 (дофаминовый рецептор D4), CAMK2G (кальций/кальмодулинзависимая протеинкиназа II гамма), SLC22A2 (семейство транспортеров растворенных веществ 22 (транспортер органических катионов) член 2), CCL11 (хемокин (C-C мотив) лиганд 11), PGF (плацентарный фактор роста B321), THPO (тромбопоэтин), GP6 (гликопротеин VI (тромбоцитарный)), TACR1 (рецептор тахикинина 1), NTS (нейротензин), HNF1A (HNF1 гомеобокс A), SST (соматостатин), KCND1 (потенциал-зависимый калиевый канал Shal-связанного подсемейства, член 1), LOC646627 (ингибитор фосфолипазы), TBXAS1 (тромбоксан-А-синтаза 1 (тромбоцитарный)), CYP2J2 (цитохром P450, семейство 2, подсемейство J, полипептид 2), TBXA2R (рецептор тромбоксана A2), ADH1C (алкогольдегидрогеназа 1C(класс I), гамма-полипептид), ALOX12 (арахидонат-12-липоксигеназа), AHSG (альфа-2-HS-гликопротеин), BHMT (бетаин-гомоцистеин-метилтрансфераза), GJA4 (белок щелевого контакта, альфа 4, 37 кДа), SLC25A4 (семейство транспортеров растворенных веществ 25 (митохондриальный переносчик; аденин-нуклеотидный транслокатор), член 4), ACLY (АТФ-цитратлиаза), ALOX5AP (белок, активирующий арахидонат-5-липоксигеназа-), NUMA1 (белок митотического аппарата ядра 1), CYP27B1 (цитохром P450, семейство 27, подсемейство B, полипептид 1), CYSLTR2 (рецептор цистеинил- лейкотриена 2), SOD3 (супероксиддисмутаза 3, внеклеточная), LTC4S (лейкотриенC4-синтаза), UCN (урокортин), GHRL (препропептид грелина/обестатина), APOC2 (аполипопротеин C-II), CLEC4A (семейство лектиновых доменов C-типа 4, член A), KBTBD10 (белок, содержащий kelch-повтор и домен BTB (POZ) 10), TNC (тенасцин C), TYMS (тимидилатсинтетаза), SHC1 (SHC (содержащий домен гомологии src)-трансформирующий белок 1), LRP1 (белок 1, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности), SOCS3 (супрессор цитокинового сигнала 3), ADH1B (алкогольдегидрогеназа 1B (класс I), бета-полипептид), KLK3 (калликреин-связанная пептидаза 3), HSD11B1 (11 бета-гидроксистероид--дегидрогеназа 1), VKORC1 (комплекс эпоксид-редуктазы витамина К, субъединица 1), SERPINB2 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада В (овальбумин), член 2), TNS1 (тензин 1), RNF19A (ring-белок 19A), EPOR (рецептор эритропоэтина), ITGAM (интегрин, альфа M (компонент комплемента рецептор 3 субъединица 3)), РITХ2 (парноподобный гомеодомен 2), MAPK7 (митоген-активируемая протеинкиназа 7), FCGR3A (Fc фрагмент IgG, низкое сродство 111a, рецептор (CD16a)), LEPR (рецептор лептина), ENG (эндоглин), GPX1 (глутатионпероксидаза 1), GOT2 (глутамат-оксалоацетат-трансаминаза 2, митохондриальная (аспартатаминотрансфераза 2)), HRH1 (рецептор гистамина H1), NR112 (подсемейство ядерного рецептора 1, группа I, член 2), CRH (кортикотропин-рилизинг-гормон), HTR1A (рецептор 5- гидрокситриптамина (серотонина) lA), VDAC1 (потенциал-зависимый анионный канал 1), HPSE (гепараназа), SFTPD (белок D), TAP2 (транспортер 2, АТФ-связывающая кассета, подгруппа В (MDR/TAP)), RNF123 (ring-белок 123), PTK2B (белок PTK2B-тирозинкиназа 2-бета), NTRK2 (нейротрофическая тирозинкиназа, рецептор, тип 2), IL6R (рецептор интерлейкина 6), ACHE (ацетилхолинэстераза (группа крови Yt)), GLP1R (рецептор глюкагоноподобного пептида 1), GHR (рецептор гормона роста), GSR (глутатионредуктаза), NQO1 (НАД (Ф) H дегидрогеназа, хинон 1), NR5A1 (подсемейство 5 ядерных рецепторов, группа A, член 1), GJB2 (белок щелевого контакта, бета 2, 26 кДа), SLC9A1 (семейство транспортеров растворенных веществ 9 (натрий/водородный обменник), член 1), MAOA (моноаминоксидаза A), PCSK9 (пропротеиновая конвертаза субтилизин-кексинового типа 9), FCGR2A (Fc-фрагмент IgG, низкое сродство IIa, рецептор (CD32)), SERPINF1 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада F (альфа-2-антиплазмин, пигментный эпителий-происходящий фактор), член 1), EDN3 (эндотелин 3), DHFR (дигидрофолатредуктаза), GAS6 (growth arrest specific 6), SMPD1 (сфингомиелин-фосфодиэстераза 1, кислая лизосомальная), UCP2 (разобщающий белок 2 (митохондриальный, переносчик протонов)), TFAP2A (транскрипционный фактор AP-2 альфа (активирующий энхансер-связывающий белок 2 альфа), C4BPA (белок, связывающий компонент комплемента 4, альфа), SERPINF2 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада F (альфа-2-антиплазмин, пигментный эпителий-происходящий фактор), член 2), TYMP (тимидинфосфорилаза), ALPP (щелочная фосфатаза, плацентарная (изофермент Реган)), CXCR2 (хемокиновый (C-X-C мотив) рецептор 2), SLC39A3 (семейство транспортеров растворенных веществ 39 (переносчик цинка), член 3), ABCG2 (АТФ-связывающая кассета, подсемейство G (WHITE), член 2), ADA (аденозиндезаминаза), JAK3 (Янус-киназа 3), HSPA1A (70 кДа белок теплового шока 1A), FASN (синтаза жирных кислот), FGF1 (фактор роста фибробластов 1 (кислотный)), F11 (фактор свертывания крови XI), ATP7A (АТФаза, перенос Cu++, альфа-полипептид), CRI (рецептор компонента комплемента (3b/4b) 1 (группа крови Knops)), GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок), ROCK1 (Rho-ассоциированная содержащая домен coiled-coilпротеинкиназа 1), MECP2 (метил- CpG-связывающий белок 2 (синдром Ретта)), MYLK (киназа легких цепей миозина), BCHE (бутирилхолинэстераза), LIPE (липаза, гормон- чувствительная), PRDX5 (пероксиредоксин 5), ADORA1 (рецептор аденозина A1), WRN (синдром Вернера, RecQ хеликаза-подобный), CXCR3 (хемокиновый (C-X-C-мотив) рецептор 3), CD81 (молекула CD81), SMAD7 (член семейства SMAD 7), LAMC2 (ламинин, гамма 2), MAP3K5 (митоген-активируемая протеинкиназа к 5), CHGA (хромогранин A (паратиреоидный секреторный белок 1)), IAPP (островковый амилоидный полипептид), RHO (родопсин), ENPP1 (эктонуклеотид пирофосфатаза/фосфодиэстераза 1), PTHLH (паратиреоидный гормон-родственный белок, NRG1 (нейрегулин 1), VEGFC (фактор роста эндотелия сосудов C), ENPEP (глутамил-аминопептидаза (аминопептидаза A)), CEBPB (CCAAT/энхансер-связывающий белок (C/EBP), бета), NAGLU (N-ацетилглюкозаминидаза, альфа-), F2RL3 (фактор свертывания крови II (тромбин) рецептороподобный 3), CX3CL1 (хемокин (монотив C-X3-C) 1), BDKRB1 (рецептор брадикинина B1), ADAMTS13 (ADAM-металлопептидаза с мотивом тромбоспондина типа 1, 13), ELANE (эластаза, экспрессируемая нейтрофилами), ENPP2 (эктонуклеотид пирофосфатаза/фосфодиэстераза 2), CISH (индуцируемый цитокинами SH2-содержащий белок), GAST (гастрин), MYOC (миоцилин, индуцируемый трабекулярной сетью глюкокортикоидный ответ), ATP1A2 (АТФаза, перенос Na +/K +, альфа2-полипептид), NF1 (нейрофибромин 1) GJB1 (белок щелевых контактов, бета 1, 32 кДа), MEF2A (фактор энхансера миоцитов 2A), VCL (винкулин), BMPR2 (рецептор костного морфогенетического белка, тип II (серин/треонинкиназа)), TUBB (тубулин, бета) CDC42 (белок клеточного цикла 42 (ГТФ-связывающий белок, 25 кДа)), KRT18 (кератин 18), HSF1 (фактор транскрипции белков теплового шока 1), MYB (v-myb гомолог вирусного онкогена миелобластоза v-myb (птичий)), PRKAA2 (протеинкиназа, AMФ-активируемая, альфа-2-каталитическая субъединица), ROCK2 (Rho-ассоциированная содержащая домен coiled-coil протеинкиназа 2), TFPI (ингибитор пути тканевого фактора (липопротеин-ассоциированный коагуляционный ингибитор)), PRKG1 (протеинкиназа, цГМФ-зависимая, тип I), BMP2 (костный морфогенетический белок 2), CTNND1 (катенин (ассоциированный с кадгерином белок), дельта 1), CTH (цистатионаза (цистатионин-гамма-лиаза)), CTSS (катепсин S), VAV2 (фактор обмена гуаниновых нуклеотидов vav 2), NPY2R (нейропептидный Y-рецептор Y2), IGFBP2 (белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 2, 36 кДа), CD28 (молекула CD28), GSTA1 (глутатион-S-трансфераза альфа 1), PP1A (пептидилпролилизомераза A (циклофилин A)), APOH (аполипопротеин H (бета-2-гликопротеин I)), S100A8 (S100 кальций-связывающий белок A8), IL11 (интерлейкин 11), ALOX15 (арахидонат-15-липоксигеназа), FBLN1 (фибулин 1), NR1H3 (подсемейство ядерных рецепторов 1, группа H, член 3), SCD (стеароил-CoA-десатураза (дельта-9-десатураза)), GIP (желудочный ингибиторный полипептид), CHGB (хромогранин В (секретогранин 1)), PRKCB (протеинкиназа C, бета), SRD5A1 (стероид-5-альфа-редуктаза, альфа-полипептид 1 (3-оксо-5-альфа-стероид- дельта-4-дегидрогеназа альфа 1)), HSD11B2 (гидроксистероид-(11-бета)-дегидроге аза 2), CALCRL (кальцитонин-рецептор-подобный), GALNT2 (UDP-N-ацетил-альфа-D-галактозамин: полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 2 (GalNAc-T2)), ANGPTL4 (ангиопоэтин-подобный 4), KCNN4 (кальций-активируемые калиевые каналы средней/малой проводимости, подсемейство N, член 4), PIK3C2A (фосфоинозитид-3-киназа, класс 2, альфа-полипептид), HBEGF (гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста-подобный фактор роста), CYP7A1 (цитохром P450, семейство 7, подсемейство A, полипептид 1), HLA-DRB5 (главный комплекс гистосовместимости, класс II, DR бета 5), BNIP3 (BCL2/аденовирус E1B 19 кДа-взаимодействующий белок 3), GCKR (регулятор глюкокиназы (гексокиназы 4)), S100A12 (S100 кальций-связывающий белок A12), PADI4 (пептидиларгининдеиминаза, тип IV), HSPA14 (70 кДа белок теплового шока 14), CXCR1 (хемокиновый (C-X-C-мотив) рецептор 1), H19 (H19, импринтируемый транскрипт, выраженный по материнской линии (небелковое кодирование)), KRTAP19-3 (связанный с кератином белок 19-3), IDDM2 (инсулинозависимый сахарный диабет 2), RAC2 (связанный с ras субстрат ботулотоксина C3 2 (семейство rho, небольшой ГТФ-связывающий белок Rac2)), RYR1 (рианодиновый рецептор 1 (скелетный)), CLOCK (clock-гомолог (мышь)), NGFR (рецептор фактора роста нервов (суперсемейство TNFR, член 16)), DBH (дофамин бета-гидроксилаза (дофамин бета-монооксигеназа)), CHRNA4 (холинергический рецептор, никотиновый, альфа 4), CACNA1C (потенциал-зависимый кальциевый канал, L-тип, альфа-1C-субъединица), PRKAG2 (протеинкиназа, AMФ-активируемая, некаталитическая субъединица гамма-2), CHAT (холин-ацетилтрансфераза), PTGDS (простагландин D2-синтаза 21 кДа (мозг)), NR1H2 (подсемейство ядерных рецепторов 1, группа H, член 2), ТЕК (ТЕК-тирозинкиназа, эндотелиальная), VEGFB (фактор роста эндотелия сосудов B), MEF2C (фактор-энхансера миоцитов 2C), MAPKAPK2 (митоген-активируемая протеинкиназа-активируемая протеинкиназа 2), TNFRSF11A (надсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 11a, активатор NFKB), HSPA9 (70 кДа белок теплового шока 9 (морталин)), CYSLTR1 (рецептор цистеинил-лейкотриена 1), MAT1A (метионин-аденозилтрансфераза I, альфа), OPRL1 (опиатный рецептор-подобный 1), IMPA1 (инозитол (мио)-1 (или 4)-монофосфатаза 1), CLCN2 (хлоридный канал 2), DLD (дигидролипамид-дегидрогеназа), PSMA6 (субъединица протеасомы (просома, макропоин), альфа-тип, 6), PSMB8 (субъединица протеасомы (просома, макропоин), бета-тип, 8 (большая многофункциональная пептидаза 7)), CHI3L1 (хитиназа 3-подобный белок 1 (хрящевой гликопротеин-39)), ALDH1B1 (семейство альдегиддегидрогеназ 1, член B1), PARP2 (поли (ADФ-рибоза) полимераза 2), STAR (стероидогенный острый регуляторный белок) LBP (липополисахарид-связывающий белок), ABCC6 (АТФ-связывающая кассета, подгруппа C (CFTR/MRP), член 6), RGS2 (регулятор G-белковой сигнализации 2, 24 кДа), EFNB2 (эфрин-B2), GJB6 (белок щелевых контактов, бета 6, 30 кДа), APOA2 (аполипопротеин A-II), AMPD1 (аденозинмонофосфатдезаминаза 1), DYSF (дисферлин, мышечная дистрофия поясов конечностей 2B (аутосомно-рецессивная)), FDFT1 (фарнезилдифосфат-фарнезилтрансфераза 1), EDN2 (эндотелин 2), CCR6 (хемокиновый (C-C мотив) рецептор 6), GJB3 (белок щелевого контакта, бета 3, 31 кДа), IL1RL1 (интерлейкин 1-рецептор-подобный белок 1), ENTPD1 (эктонуклеозидтрифосфат дифосфогидролазы 1), BBS4 (синдром Бардета-Бидля 4), CELSR2 (кадгерин, EGF LAG семипроходный рецептор G-типа 2 (гомолог фламинго, дрозофила)), F11R (F11-рецептор), RAPGEF3 (фактор обмена гуанинового нуклеотида (GEF) 3), HYAL1 (гиалуроноглюкозаминидаза 1), ZNF259 (белок цинкового пальца 259), ATOX1 (гомолог ATX1 антиоксидантного белка 1 (дрожжи)), ATF6 (фактор активации транскрипции 6) KHK (кетогексокиназа (фруктокиназа)), SAT1 (спермидин/спермин N1-ацетилтрансфераза 1), GGH (гамма-глутамилгидролаза (конъюгаза, фолилполигаммаглутамил-гидролаза)), TIMP4 (ингибитор металлопептидазы TIMP 4), SLC4A4 (семейство транспортеров растворенных веществ 4, натрий, бикарбонатный котранспортер, член 4), PDE2A (фосфодиэстераза 2A, стимулируема цГМФ), PDE3B (фосфодиэстераза 3B, ингибируемая цГМФ), FADS1 (десатураза жирных кислот 1), FADS2 (десатураза жирных кислот 2), TMSB4X (тимозин бета 4, X-связанный), TXNIP (тиоредоксин-взаимодействующий белок), LIMS1 (LIМ и антиген-подобные домены стареющих клеток 1), RHOB (семейство генов гомологии ras, член B), LY96 (лимфоцитарный антиген 96), FOXO1 (белок forkhead box O1), PNPLA2 (белок, содержащий пататин-подобный фосфолипазный домен 2), TRH (тиреотропин-рилизинг- гормон), GJC1 (белок щелевых контактов, гамма 1 45 кДа), SLC17A5 (семейство транспортеров растворенных вещест 17 (переносчик анионов/сахаров), член 5), FTO (ассоциированный с жировой массой и ожирением), GJD2 (белок щелевых контактов, дельта 2, 36 кДа), PSRC1 (пролин/серин-богатый домен coiled-coil 1), CASP12 (каспаза 12 (ген/псевдоген)), GPBAR1 (рецептор желчной кислоты, связанный с белками G 1), PXK (домен PX, содержащий серин/треонинкиназу), IL33 (интерлейкин 33), TRIB1 (гомолог tribbles 1 (дрозофила)), PBX4 (гомеобокс пре-B-клеток лейкемии 4), NUPRI (ядерный белок, регулятор транскрипции, 1), 15-Sep (15 кДа селенопротеин), CILP2 (белок промежуточного слоя хряща 2), TERC (компонент теломеразы РНК), GGT2 (гамма-глутамилтрансфераза 2), MT-CO1 (митохондриально кодируемая цитохромоксидаза с I) и UOX (уратоксидаза, псевдоген). Любая из этих последовательностей может быть мишенью для системы CRISPR-Cas, например, для устранения мутации.

[001232] В еще одном варианте осуществления хромосомная последовательность может дополнительно быть выбрана из Pon1 (параоксоназа 1), LDLR (рецептор LDL), ApoE (аполипопротеин E), Apo B-100 (аполипопротеин B-100), ApoA (аполипопротеин (а)), ApoA1 (аполипопротеин A1), CBS (цистатионB-синтаза), гликопротеина IIb/IIb, MTHRF (5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (НАДФH) и их комбинации. В одной итерации хромосомные последовательности и белки, кодируемые хромосомными последовательностями, участвующие в развитии сердечно-сосудистых заболеваний могут быть выбраны из CacnalC, Sodl, Pten, Ppar (alpha), Apo E, лептина и их комбинаций в качестве мишени или мишеней для системы CRISPR-Cas.

Лечение заболеваний печени и почек

[001233] Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas, описанной в настоящем описании, например, систем эффекторных белков C2c1 или C2c3, в печень и/или почку. Стратегии доставки, чтобы вызвать клеточное поглощение терапевтической нуклеиновой кислоты, включают физическую силу или векторные системы, такие как доставка на основе вирусов, липидов или комплексов или наноносители. Из изначальных приложений, обладающих меньшей клинической значимостью, когда нуклеиновые кислоты были доставлены в клетки почек при помощи систематического впрыскивания под высоким давлением (безыгольные инъекции), широкий диапазон генных терапевтических вирусных и невирусных носителей уже применяется для нацеливания на посттранскрипционные события в разных моделях болезней почек на животных in vivo (Csaba Revesz and Péter Hamar (2011). Delivery Methods to Target RNAs in the Kidney, Gene Therapy Applications, Prof. Chunsheng Kang (Ed,), ISBN:978-953-307-541-9, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/gene-therapy-a.pplications/delivery-methods-to-target-rnas-inthe-kidney) Способы доставки в почку могут включать способы, описанные в Yuan et al. (Am J Physiol Renal Physiol 295: F605-F617, 2008), которые исследовали, может ли до ставка in vivo малых интерферирующих РНК (миРНК), нацеленных на 12/15-липоксигеназный (12/15-LO) путь метаболизма арахидоновой кислоты, улучшить состояние при повреждениях почек и диабетической нефропатии (DN) на модели сахарного диабета типа I у мышей, которым инъецировали стрептозоцин. Для достижения большего доступа in vivo и экспрессии миРНК в почках Yuan et al. использовали двухцепочечны еолигонуклеотидые РНК 12/15-LO, конъюгированные с холестерином. Около 400 мкг миРНК вводили мышам подкожно. Способы Yuang et al. могут быть применены к системе CRISPR Cas согласно настоящему изобретению, предусматривается 1-2 г подкожной инъекции CRISPR Cas, конъюгированного с холестерином, человеку для доставки в почки.

[001234] Molitoris et al. (J AmSocNephrol 20: 1754-1764, 2009) использовали проксимальные канальцевые клетки (PTC) в качестве области реабсорбции олигонуклеотидов в почках, чтобы проверить эффективность миРНК, нацеленной на p53 - ключевой белок в апоптотическом пути, для предотвращения повреждения почек. Голая синтетическая миРНК к p53 вводится внутривенно через 4 часа после ишемического повреждения, и наиболее успешно защищает как PTC, так и функции почек. Данные Molitoris et al. показывают, что быстрая доставка миРНК в клетки проксимальных канальцев следует за внутривенным введением. Для получения кривой доза-ответ крысам вводили следующие дозы siP53, 0,33; 1, 3 или 5 мг/кг, в указанные промежутки времени, что приводило к кумулятивным дозам 1,32; 4, 12 и 20 мг/кг соответственно. Все испытуемые дозы миРНК дали эффект снижения SCr на первый день, при этом более высокие дозы оказались эффективны в течение примерно пяти дней по сравнению с контрольными крысами с ишемией, получавшими фосфатно-солевой буфер (PBS). Совокупные дозы 12 и 20 мг/кг обеспечивали лучший защитный эффект. Способы Molitoris et al. могут быть применены к системе нацеливания нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, предусматривающей совокупные дозы 12 и 20 мг/кг человеку для доставки в почки.

[001235] Thompson et al. (Nucleic Acid Therapeutics, Volume 22, Number 4, 2012) раскрывают токсикологические и фармакокинетические свойства синтетической малой интерферирующей РНК 15NP после внутривенного введения грызунам и нечеловеческим приматам. 15NP предназначен для воздействия на путь РНК-интерференции (РНК-i), чтобы временно ингибировать экспрессию проапоптотического белка р53 и разрабатывается для защиты клеток от острых ишемических/реперфузионных травм, таких как острая почечная травма, которые могут возникать во время базовой кардиохирургии и отсроченной функции трансплантата, которая может происходить после трансплантации почек. Дозы 800 мг/кг 15NP у грызунов и 1000 мг/кг 15NP у не являющихся человеком приматов должны были вызывать побочные эффекты, которые у обезьян привели к различным типам эффектов на кровь: субклиническая активация комплемента и несколько увеличенное время свертывания крови. У крыс никаких побочных эффектов не наблюдалось при введении крысиного аналога 15NP, что указывает на то, что эти эффекты, вероятно, представляют собой эффекты класса синтетических РНК-дуплексов, а не токсичность, связанную с предполагаемой фармакологической активностью 15NP. В совокупности эти данные подтверждают возможность прохождения клинических испытаний внутривенного введения 15NP для сохранения функции почек после острой ишемии/реперфузионного повреждения. Доза, не вызывающая наблюдаемых побочных эффектов (NOAEL), у обезьян составляла 500 мг/кг. Никаких эффектов на сердечно-сосудистые, респираторные и неврологические параметры не наблюдалось у обезьян после внутривенного введения при дозах до 25 мг/кг. Таким образом, подобная доза может быть предусмотрена для внутривенного введения CRISPR Cas в почки человека.

[001236] Shimizu et al. (JAmSocNephrol 21: 622-633, 2010) разработали систему для нацеливания доставки малых интерферирующих РНК (миРНК) в клубочки (гломерулы) с использованием поли (этилен-гликоль)-поли (L-лизин). Комплекс миРНК/наноноситель был приблизительно от 10 до 20 нм в диаметре, что который позволило бы ему перемещаться через фенестрированный эндотелий для доступа к мезангию после внутрибрюшинной инъекции флуоресцентных комплексов миРНК/наноноситель. Shimizu et al., наблюдали циркуляцию миРНК в кровотоке в течение длительного времени. Повторное внутрибрюшинное введение митоген-активированной протеинкиназы 1 (MAPK1) комплекса миРНК/наноноситель подавляло гломерулярную мРНК MAPK1 и экспрессию белка в мышиной модели гломерулонефрита. Для исследования накопления миРНК, меченых Cy5 миРНК в комплексе с PIC-наноносителями (0,5 мл, 5 нмоль содержания миРНК), голых Cy5-меченых миРНК (0,5 мл, 5 нмоль) или Cy5-меченых миРНК, инкапсулированных в HVJ-E (0,5 мл, 5 нмоль содержимого миРНК) вводили мышам BALBc. Способ Shimizu et al. может быть применен к системе нацеливания нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, предусматривающей дозу около 10-20 микромоль CRISPRCas в комплексе с нанопереносчиками в количестве примерно 1-2 литра для внутрибрюшинного введения и доставки в почки человека.

[001237] Способы доставки к почкам суммированы в следующей таблице:

[001238] Предусматривается нацеливание в клетки печени. Это может быть in vitro или in vivo. Предпочтительными являются гепатоциты. Доставка белка CRISPR, такого как C2c1 или C2c3, здесь может быть осуществлена посредством вирусных векторов, особенно векторов AAV (и, в частности, AAV2/6). Они могут вводиться внутривенно.

[001239] Предпочтительной мишенью для печени, будь то in vitro или in vivo, является ген альбумина. Это так называемая «безопасная гавань», поскольку альбумин экспрессируется на очень высоких уровнях, и поэтому допускается некоторое снижение синтеза альбумина после успешного редактирования гена. Также предпочтительно то, что высокие уровни экспрессии, наблюдаемые с помощью промотора/энхансера альбумина, позволяют получать подходящие уровни нормального или трансгенного синтеза (со вставленной матрицы донора), даже если отредактирована только небольшая часть гепатоцитов.

[001240] Wechsler et al. было показано (сообщение 57th Annual Meeting and Exposition of the American Society of Hematology - аннотация доступна в интернете по адресу https:.//ash.confex.com./ash/2015/webprogram/Paper86495.html и представлена 6 декабря 2015 года), что интрон 1 альбумина является подходящим участком-мишенью. В их работе были использованы цинковые пальцы для разрезания ДНК в данном участке-мишени и подходящие направляющие последовательности могут быть получены, чтобы направлять расщепление в том же месте с помощью белка CRISPR.

[001241] Использование мишеней в высоко экспрессируемых генах (гены с высокоактивными энхансерами/промоторами), таких как альбумин, также может позволить использование донорной матрицы без промотора, как было показано Wechsler et al., и это также широко применимо для других органов, кроме печени. Известны и другие примеры высоко экспрессируемых генов.

Ассоциированные с печенью заболевания крови, особенно гемофилия и в частности гемофилия В

[000019] Успешное редактирование генов гепатоцитов у мышей (как in vitro, так и in vivo) и у не являющихся человеком приматов (in vivo), показало, что лечение заболеваний крови посредством редактирования генов/генной инженерии в гепатоцитах возможно. В частности, показана экспрессия гена F9 (hF9) человека в гепатоцитах нечеловеческих приматов, что указывает и на возможность лечения гемофилии В у людей.

[000020] Wechsler et al. сообщили на 57th Annual Meeting and Exposition of the American Society of Hematology (аннотация представлена 6 декабря 2015 года и доступна в интернете по адресу https://ash.confex.com/ash/2015/webprogrammpaper86495.html), что они успешно экспрессировали человеческий F9 (hF9) из гепатоцитов у нечеловеческих приматов с помощью редактирования гена in vivo. Это было достигнуто с использованием 1) двух нуклеаз с цинковыми пальцами, нацеленных на интрон 1 локуса альбумина, и 2) конструкции донорной матрицы человеческого F9. Цинковые пальцы и донорная матрица были закодированы в отдельных гепатотропных серотипах ы 2/6 (AAV2/6) аденоассоциированного вируса, вводимых внутривенно, что приводило к целенаправленной вставке скорректированной копии гена hF9 в локус альбумина в части печеночных гепатоцитов.

[000021] Локус альбумина был выбран в качестве «безопасной гавани», поскольку производство этого наиболее распространенного белка плазмы превышает 10 г/день, а умеренное снижение этого уровня хорошо переносится. Гепатоциты с отредактированным геномом продуцировали в терапевтических количествах нормальный hFIX (hF9) в отличие от альбумина, который управляется высокоактивным энхансером/промотором альбумина. Показана целевая интеграция трансгена hF9 в локусе альбумина и сплайсинге этого гена в транскрипт альбумина.

[000022] Исследования на мышах: мышам C57BL/6 вводили средство доставки(n=20) или векторы AAV2/6 векторы (n=25), кодирующие мышиные суррогатные реагенты в количестве 1,0×10¹³ векторных геномов (вг)/кг путем инъекции в хвостовую вену. Анализ ELISA плазмы hFIX у обработанных мышей показал пиковые уровни в 50-1053 нг/мл, которые поддерживались на протяжении 6-месячного исследования. Анализ активности FIX на основе мышиной плазмы подтвердил биологическую активность, соизмеримую с уровнями экспрессии.

[000023] Исследования на нечеловеческих приматах: однократная внутривенная совместная инфузия векторов AAV2/6, кодирующих целевые альбумин специфические нуклеазы цинковых пальцев, нацеленные на NHP, и донорного человеческого F9 в количестве 1×10¹³вг/кг (n=5/группа) привела к > 50 нг/мл (> 1% от нормы) в этой большой животной модели. Использование более высоких доз AAV2/6 (до 1,5×10¹⁴ вг/кг) приводило к количеству hFIX в плазме до 1000 нг/мл (или 20% от нормы) у нескольких животных и до 2000 нг/мл (или 50% от нормального) у одного животного на протяжении всего исследования (3 месяца).

[000024] Лечение хорошо переносилось у мышей и нечеловеческих приматов без значительных токсикологических результатов, связанных с лечением AAV2/6 ZFN +донор у обоих видов в терапевтических дозах. Sangamo (Калифорния, США) с тех пор обратился к FDA и получил разрешение на проведение первого в мире клинического испытания на людях для применения в области редактирования генома in vivo. Это основывается на одобрении EMEA в отношении генной терапии Glybera при лечении дефицита липопротеиновой липазы.

[000025] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предпочтительно использовать любое или все из следующего:

* AAV (особенно AAV2/6) векторы, предпочтительно вводимые внутривенно;

* Альбумин в качестве мишени для редактирования генов/введения трансгена/матрицы - особенно в интроне 1 альбумина;

* донорная матрица человеческого F9; и/или «беспромоторная донорная матрица».

Гемофилия В.

[000026] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы настоящее изобретение использовалось для лечения гемофилии B. Как таковое, предпочтительно, чтобы была предусмотрена матрица и чтобы она являлась человеческим геном F9. Понятно, что шаблон hF9 содержит правильную или "верную" версию hF9, так чтобы лечение было эффективным.

[000027] В альтернативном варианте осуществления версия F9 гемофилии В может быть доставлена таким образом, чтобы создать модельный организм, клетку или клеточную линию (например, клетку, клеточную линию или модельный организм на основе мыши или нечеловеческого примата), модельный организм, клетку или клеточную линию, имеющие или несущие фенотип гемофилии В, т.е. неспособность продуцировать F9 дикого типа.

Гемофилия A

[000028] В некоторых вариантах осуществления ген F9 (фактор IX) может быть заменен геном F8 (фактор VIII), описанным выше, что приводит к лечению гемофилии A (посредством обеспечения правильного гена F8) и/или созданию модельного организма, клетки или клеточной линии с гемофилией А (путем предоставления неправильной версии гена F8 гемофилии A).

Гемофилия C

[001242] В некоторых вариантах осуществления ген F9 (фактор IX) может быть заменен геном F11 (фактор XI), описанным выше, что приводит к лечению гемофилии C (посредством обеспечения правильного гена F11) и/или созданию модельного организма, клетки или клеточной линии с гемофилией C(путем предоставления неправильной версии гена F11 гемофилии С).

Лечение заболеваний эпителия и легких

[001243] Настоящее изобретение предусматривает доставку систем CRISPR-Cas, описанных в настоящем описании, например, систем эффекторных белков C2c1 или C2c3, в одно или оба легких.

[001244] Хотя векторы на основе AAV-2 были первоначально предложены для доставки CFTR в воздухоносные пути CF, другие серотипы, такие как AAV-1, AAV-5, AAV-6 и AAV-9, демонстрируют улучшенную эффективность переноса генов во множестве моделей эпителия легкого (см., например, Li et al, Molecular Therapy, vol. 17 no. 12, 2067-2077 Dec 2009). Было продемонстрировано, что AAV-1 в 100 раз эффективнее, чем AAV-2 и AAV-5 при трансдуцировании эпителиальных клеток дыхательных путей человека in vitro, хотя AAV-1 трансдуцировал воздухоносный эпителий трахеи мыши in vivo с эффективностью, равной эффективности AAV -5. Другие исследования показали, что AAV-5 в 50 раз эффективнее AAV-2 при доставке генов в эпителий дыхательных путей человека (HAE) in vitro и значительно более эффективен в эпителии дыхательных путей мышей in vivo. Было также показано, что AAV-6 более эффективен, чем AAV-2 в эпителиальных клетках дыхательных путей человека in vitro и мышиных дыхательных путях in vivo. Более поздний изолят AAV-9 показал большую эффективность переноса генов, чем AAV-5 в носовом и альвеолярном эпителии мыши in vivo с экспрессией гена, обнаруженной по прошествии более 9 месяцев, позволяет предположить, что AAV может обеспечить долгосрочную экспрессию гена in vivo. Именно это является желательным свойством для вектора доставки гена CFTR. Кроме того, было продемонстрировано, что AAV-9 может быть введен в мышиное легкое без потери экспрессии CFTR и минимальных иммунных последствиях. CF и не-CF HAE-культуры могут быть инокулированы на апикальной поверхности с помощью 100 мл векторов AAV в течение нескольких часов (см., например, Liet al., Molecular Therapy, vol. 17 no, 12, 2067-2077 Dec 2009). MOI может варьироваться от 1×10³ до 4×10⁵ векторных геномов/клетка, в зависимости от концентрации вируса и целей экспериментов. Вышеупомянутые векторы предназначены для доставки и/или введения настоящего изобретения.

[001245] Zamora et al. (Am JRespirCritCareMed Vol. 183. pp. 531-538, 2011) описали пример применения РНК-интерференционной терапии для лечения инфекционного заболевания человека, а также рандомизированное исследование противовирусного препаратана инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом (RSV) реципиентов трансплантированного легкого. Zamora et al. провели рандомизированное двойное слепое исследование с использованием в качестве контроля эффекта плацебо у реципиентов LTX с инфекцией респираторных путей RSV. Пациентам было разрешено получать стандартное лечение при RSV. Аэрозольный ALN-RSV01 (0,6 мг/кг) или плацебо вводили ежедневно в течение 3 дней. Это исследование демонстрирует, что лечение на основе РНК-интерференции, нацеленное на RSV, можно безопасно проводить реципиентам LTX с инфекцией RSV. Три ежедневных дозы ALN-RSV01 не приводили к обострению симптомов респираторного тракта, ухудшению функции легких и проявлению системных воспалительных эффектов, таких как индукция цитокинов или CRP. Фармакокинетика показала только низкое временное системное воздействие после ингаляции, что согласуется с данными доклинических испытаний на животных, показывающими, что ALN-RSV01, вводимый внутривенно или путем ингаляции, быстро выводится из круга кровообращения посредством обработки экзонуклеазами и почечной экскреции. Способы Zamora et al. могут быть применены к системе нацеливания нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, и для настоящего изобретения может быть рассмотрен аэрозольный CRISPR Cas, например, с дозировкой 0,6 мг/кг.

[001246] Индивидуумы, получающие терапию при заболеваниях легких, могут, например, получать фармацевтически эффективное количество аэрозольной системы AAV-вектора на легкое, доставляемое эндобронхиально при спонтанном дыхании. Таким образом, аэрозольная доставка предпочтительна для доставки AAV в целом. Для доставки можно использовать аденовирус или AAV-частицу. Подходящие генные конструкции, каждая из которых функционально связана с одной или более регуляторными последовательностями, могут быть клонированы в вектор доставки. В этом случае в качестве примеров приводятся следующие конструкции: промотор Cbh или EF1a для Cas (C2c1 или C2c3), промотор U6 или H1 для направляющей РНК): Предпочтительно использование направляющей последовательности CFTRdelta508, матрицы восстановления для мутации deltaF508 и кодон-оптимизированного фермента C2c1 или C2c3, необязательно с одним или более сигналами или последовательностью ядерной локализации (NLS, например, двумя (2) NLS. Также предусматриваются конструкции без NLS.

Лечение заболеваний мышечной системы

[001247] Настоящее изобретение предполагает введение системы CRISPR-Cas, например, систем из эффекторных белков C2c1 or C2c3 в мышцы.

[001248] Bortolanza et al. (MolecularTherapyvol. 19 no. 11, 2055-2064 Nov. 2011) показали, что системная доставка кассет экспрессии для РНК-интерференции у мыши FRG1 после начала фасциально-мышечной дистрофии (FSHD) привела к дозозависимому длительному нокдауну FRG1 без признаков токсичности. Bortolanza et al. обнаружили, что однократная внутривенная инъекция 5×10¹² вг rAAV6-sh1FRG1 сохраняет мышечную гистопатологию и мышечную функцию FRG1у мышей. Аналогично, 200 мл, содержащих 2×10¹² или 5×10¹² вг вектора в физиологическом растворе, вводили в хвостовую вену с использованием шприца Terumo-25. Способ Bortolanza et al. может быть применен к AAV, экспрессирующему CRISPR Cas, и человеку может быть введена доза приблизительно 2×10¹⁵ или 2×10¹⁶ вг вектора.

[001249] Dumonceaux et al. (Molecular Therapy vol. 18 no. 5, 881-887 May 2010) ингибировали путь миостатина, используя способ РНК-интерференции, направленной против мРНК рецепторов остатина (sh-AcvRIIb) AcvRIIb. Восстановление квазидистрофина было опосредовано векторизованной методикой пропуска U7 (U7-DYS). Аденоассоциированные векторы, несущие либо только конструкцию sh-AcvrIIb, либо только конструкцию U7-DYS, либо комбинацию обеих конструкций, были введены в переднюю большеберцовую мышцу мышей mdx с дистрофией. Инъекции выполняли, используя 10¹¹ вирусных геномов AAV. Способ Dumonceaux et al. может быть применен к AAV, экспрессирующему CRISPR Cas, и введение человеку может быть осуществлено в дозе, например, от приблизительно 10¹⁴ до приблизительно 10¹⁵ вг вектора.

[001250] Kinouchi et al. (GeneTherapy (2008) 15, 1126-1130) сообщают об эффективности доставки малой интерферирующей РНК in vivo в скелетную мышечную ткань нормальных или больных мышей посредством образования наночастиц химически немодифицированных миРНК с ателоколлагеном (ATCOL). ATCOL-опосредованное местное применение миРНК, нацеленное на миостатин, отрицательный регулятор роста скелетных мышц, в мышиных скелетных мышцах или внутривенно, вызвало заметное увеличение мышечной массы в течение нескольких недель после применения. Эти результаты подразумевают, что ATCOL-опосредованное применение миРНК является мощным инструментом для будущего терапевтического использования при таких заболеваниях, как мышечная атрофия. Msts-миРНК (конечная концентрация, 10 мМ) смешивали с ATCOL (конечная концентрация для местного применения, 0,5%) (AteloGene, Kohken, Токио, Япония) в соответствии с инструкциями производителя. После анестезии мышей (20-недельный самец C57BL/6) с применением Nembutal (25 мг/кг, внутрибрюшинно), комплекс Mst-миРНК/ATCOL вводили в жевательную мышцу и двуглавую мышцу бедра. Метод Kinouchi et al. может быть применен к CRISPR Casс введением в организм человека, например, дозы от 500 до 1000 мл 40 мкМ раствора в мышцу. Hagstrom et al. (MolecularTherapy, т. 10, No 2, August 2004) описывают внутрисосудистую, невирусную методологию, которая обеспечивает эффективную и повторяемую доставку нуклеиновых кислот в мышечные клетки (миофибриллы) во всех мышцах конечностей млекопитающих. Процедура включает инъекцию голой плазмидной ДНК или миРНК в дистальную вену конечности, которая временно изолирована жгутом или манжетами для измерения кровяного давления. Доставка нуклеиновой кислоты в миофибриллы облегчается быстрой инъекцией в достаточном объеме, чтобы обеспечить экстравазацию раствора нуклеиновой кислоты в мышечную ткань. Высокие уровни экспрессии трансгена в скелетных мышцах достигались как у мелких, так и у крупных животных с минимальной токсичностью. Также было получено доказательство доставки миРНК в мышцы конечностей. Для внутривенной инъекции плазмидной ДНК у макак-резус, зажим из трех составляющих был соединен с двумя шприцевыми насосами (модель PHD 2000, HarvardInstruments), каждый из которых имелоднн шприц. Через пять минут после инъекции папаверина вводили пДНК (от 15,5 до 25,7 мг в 40-100 мл изотонического раствора) со скоростью 1,7 или 2,0 мл/с. Доза может быть увеличена для плазмидной ДНК, экспрессирующей CRISPR Cas согласно настоящему изобретению, с инъекцией от 300 до 500 мг в 800-2000 мл физиологического раствора для человека. Для инъекций аденовирусного вектора крысе 2×10⁹ инфекционных частиц были инъецированы в 3 мл нормального солевого раствора (NSS). Доза может быть увеличена для аденовирусного вектора, экспрессирующего CRISPR Cas согласно настоящему изобретению, с инъекцией около 1×10¹³ инфекционных частиц, инъецированных в 10 литрах NSS для человека. Для миРНК крысу инъецировали в большую подкожную вену 12,5 мкг миРНК, а приматов инъецировали в большую подкожную вену 750 мкг миРНК. Доза может быть увеличена для CRISPR Cas согласно настоящему изобретению, например, при инъекции от примерно 15 до 50 мг в большую подкожную вену человека.

[001251] См. также, например, WO2013163628 A2, "Genetic Correction of Mutated Genes", опубликованную заявку Duke University, описывающую попытки по исправлению, например, мутаций сдвига рамки считывания, которая вызывает преждевременное появление стоп-кодона и усеченный генный продукт, который может быть скорректирован с помощью опосредуемого нуклеазой негомологичного соединения концов, таких, как те, которые отвечают за мышечную дистрофию Дюшенна ("DMD"), рецессивное, смертельное, связанное с X-хромосомой заболевание, которое приводит к дегенерации мышц из-за мутаций в гене дистрофина. Большинство мутаций дистрофина, которые вызывают DMD, представляют делеции экзонов, которые нарушают рамку считывания и вызывают преждевременную терминацию трансляции в гене дистрофина. Дистрофин представляет собой цитоплазматический белок, который обеспечивает структурную стабильность дистрогликанового комплекса клеточной мембраны, который отвечает за регулирование целостности и функции мышечных клеток. Ген дистрофина или "ген DMD", используются в настоящем описании взаимозаменяемо, и представляет собой 2,2 млн п.н. в локусе Xp21. Первичная транскрипция составляет около 2400 т.п.н., а зрелая мРНК составляет около 14 т.п.н. 79 экзонов кодируют белок, который содержит более 3500 аминокислот. Эксон 51 часто примыкает к делециям, сдвигающим рамку считывания у пациентов с DMD и является целью клинических испытаний для исключения экзонов на основе олигонуклеотидов. Клиническое исследование исключающего экзон 51 соединения недавно сообщило о значительной функциональной пользе через 48 недель, причем дистрофин-положительных волокон было в среднем на 47% больше по сравнению с исходным уровнем. Мутации в экзоне 51 идеально подходят для постоянной коррекции путем редактирования генома на основе негомологичного соединения концов (NHEJ).

[001252] Способы, описанные в патентной публикации США № 20130145487, закрепленной за Cellectis, относятся к вариантам использования мегануклеазы для расщепления последовательности-мишени из гена дистрофина (DMD) человека, и также могут быть модифицированы для системы нацеливания на нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению.

[001253] Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas, описанной в настоящем описании, например, систем эффекторных белков, таких как C2c1 или C2c3, в кожу.

[001254] Hickerson et al. (MolecularTherapy-NucleicAcids (2013) 2, el29) описали моторизированное устройство с микроиголками для доставки самодоставляющейся (sd) миРНК в кожу человека или мыши. Основной проблемой перевода миРНК терапии кожи в клинику является разработка эффективных систем доставки. Значительные усилия были вложены в различные технологии доставки в кожу, но показали ограниченный успех. В клиническом исследовании, в котором кожа была обработана миРНК, боль, связанная с использованием мельчайших игл для подкожных инъекций, не позволила зарегистрировать дополнительных пациентов для исследования, что подчеркивает необходимость улучшения способов доставки, которые были бы ориентированы на пациента и вызывали небольшие болевые ощущения или вообще были безболезненными для пациента. Микроиглы представляют собой эффективный способ доставки больших заряженных соединений, включая миРНК, через первичный барьер, роговой слой, и обычно считаются менее болезненными, чем обычные иглы для подкожных инъекций. Было показано, что моторизованные устройства "штампующего" типа, в том числе устройство моторизированной микроиглы (MMNA), используемое Hickerson et al, безопасны. На безволосых мышах было показано, что использование таких устройств вызывает небольшую боль или отсутствие боли, о чем свидетельствует (i) широкое распространение использование в косметической промышленности и (ii) ограниченное тестирование, в котором почти все добровольцы обнаружили, что использование устройства было гораздо менее болезненным, чем прививка от гриппа, предполагая, что доставка миРНК с использованием этого устройства приведет к гораздо меньшей боли, чем это было в предыдущем клиническом исследовании при использовании игл для подкожных инъекций. Устройство MMNA (продаваемое как Triple-M или Tri-M от Bomtech Electronic Co, Сеул, Южная Корея) было адаптировано для доставки миРНК в кожу мыши и человека. Раствор самодоставляющихся миРНК (до 300 мкл 0,1 мг/мл РНК) вводили в камеру одноразовой кассеты Tri-M (Bomtech), которую устанавливали на глубину 0,1 мм. Для лечения кожи человека деидентифицированную кожу: (полученную сразу же после хирургических процедур) вручную растягивали и прикрепляли к пробковой платформе перед обработкой. Все внутрикожные инъекции проводились с использованием шприца для инсулина с иглой диаметром 0,5 дюйма 28 калибра. Устройство MMNA и способ Hickerson et al. могут быть использованы и/или адаптированы для доставки CRISPR Cas согласно настоящему изобретению, например, в дозе до 300 мкл 0,1 мг/мл CRISPR Cas в кожу.

[001255] Статья Leachman et al. (MolecularTherapy, vol. 18 no. 2, 442-446 Feb. 2010) относится к клиническому испытанию фазы Ib для лечения редкого расстройства кожи пахионии врожденной (pachyonychia congenita) (ПВ), аутосомно-доминантного синдрома, включающего пальмоплантарную кератодермию, приводящую к нетрудоспособности, при помощи малой интерферерующей РНК (миРНК). Эта миРНК, называемая TD101, специфически и эффективно нацелена на мутантную мРНК кератина 6a (K6a) N171K, не влияя на мРНК K6a дикого типа.

[001256] Zheng et al. (PNAS, 24 июля 2012 г., т. 109, № 30, 11975-11980) показывают, что сферические конъюгаты наночастиц нуклеиновой кислоты (SNA-NC), золотые сердцевины, окруженные плотной оболочкой в высокой степени ориентированной ковалентно иммобилизованной миРНК, свободно проникают почти в 100% кератиноцитов in vitro, в кожу мыши и эпидермиса человека в течение нескольких часов после применения. Zheng et al. продемонстрировали, что однократное применение 25 нМ SNA-NC для рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) в течение 60 ч демонстрирует эффективное разрушение этого гена в коже человека. Подобную дозу можно предусмотреть для CRISPR Cas, иммобилизованного в SNA-NC для введения в кожу.

Злокачественная опухоль

[001257] В некоторых вариантах осуществления изобретения предусматривается лечение, профилактика или диагностика злокачественной опухоли. Мишенью предпочтительно является один или более из генов FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC или TRBC. Злокачественная опухоль может представлять собой одну или более из лимфом, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), В-клеточного лимфобластного лейкоза (B-ALL), острого лимфобластного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, неходжкинской лимфомы (NHL), диффузной крупноклеточной лимфомы (DLCL), множественной миеломы, карциномы почек (RCC), нейробластомы, колоректального рака, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, саркомы, рака предстательной железы, легких, пищевода, гепатоцеллюлярной карциномы, рака поджелудочной железы, астроцитомы, мезотелиомы, рака головы и шеи и медуллобластомы. Это может быть реализовано с помощью сконструированного химерного антигена Т-клеточного рецептора (СAR). Это описано в WO2015161276, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки и описано в настоящем описании ниже.

[001258] Гены-мишени, подходящие для лечения или профилактики злокачественной опухоли, могут включать, в некоторых вариантах, те, которые описаны в WO 02015048577, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Синдром Ашера или пигментный ретинит-39

[001259] В некоторых вариантах осуществления предусматривается лечение, профилактика или диагностика синдрома Ашера или пигментного ретинита-39 (retinitis pigmentosa-39). Мишень предпочтительно представляет собой ген USH2A. В некоторых вариантах осуществления предусматривается коррекция G-делеции в позиции 2299 (2299delG). Это описано в WO2015134812A1, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Муковисцидоз (CF)

[001260] В некоторых вариантах осуществления предусматривается лечение, профилактика или диагностика муковисцидоза. Мишенью предпочтительно является SCNN1A или ген CFTR. Это описано в W02015157070, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

[001261] Schwank et al. (CellS:.emCell, 13: 653-58, 2013) использовали CRISPR-Cas9 для коррекции дефекта, связанного с муковисцидозом, в стволовых клетках человека. Мишенью группы был ген ионного канала, рецептор трансмембранного проводника муковисцидоза (CFTR). Делеция в CFTR приводит к неправильному сворачиванию белка у пациентов с муковисцидозом. Используя культивируемые кишечные стволовые клетки, полученные из образцов клеток у двух детей с муковисцидозом, Schwank et al. смогли исправить дефект, используя CRISPR вместе с донорской плазмидой, содержащей последовательность для репарации инсерции. Затем исследователи вырастили клетки в кишечные "органоиды" или миниатюрные кишки и показали, что они функционируют нормально. В этом случае примерно половина клоновых органоидов подвергалась надлежащей генетической коррекции.

ВИЧ и СПИД

[001262] В некоторых вариантах осуществления предусматривается лечение, профилактика или диагностика ВИЧ и СПИДа. Мишенью при ВИЧ предпочтительно является ген CCR5. Это описано в WO2015148670A1, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Бета-Талассемия

[001263] В некоторых вариантах осуществления предусматривается лечение, профилактика или диагностика бета-талассемии. Мишень предпочтительно представляет собой ген BCL11A. Это описано в WO2015148860, описание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Серповидноклеточная анемия

[001264] В некоторых вариантах осуществления предусматривается лечение, профилактика или диагностика серповидноклеточной анемии (SCD). Мишень предпочтительно представляет собой ген HBB или BCL11A. Это описано в WO2015148863, описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Вирус простого герпеса 1 и 2

[001265] В некоторых вариантах осуществления предоставляется лечение, профилактика или диагностика HSV-1 (вирус простого герпеса 1). Мишень предпочтительно представляет собой ген UL19, UL30, UL48 или UL50 в HSV-1. Это описано в WO2015153789, описание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

[001266] В других вариантах осуществления предусматривается лечение, профилактика или диагностика HSV-2 (вирус простого герпеса 2). Мишень предпочтительно представляет собой ген UL19, UL30, UL48 или UL50 в HSV-2. Это описано в изобретении WO2015153791, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

[001267] В некоторых вариантах осуществления предусматривается лечение, профилактика или диагностика первичной открытой угловой глаукомы (ПОАГ). Мишень предпочтительно представляет собой ген MYOC. Это описано в WO2015153780, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Адоптивная клеточная терапия

[001268] Настоящее изобретение также предполагает использование системы CRISPR-Cas, описанной в настоящем описании, например. C2c1 или C2c3, чтобы модифицировать клетки для адоптивной терапии. Соответственно, аспекты настоящего изобретения включают адоптивную передачу клеток иммунной системы, таких как T-клетки, специфичных для выбранных антигенов, таких как связанные с опухолью антигены (см. Maus et al., 2014, Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses, Annual Review of Immunology, Vol. 32: 189-225; Rosenberg and Restifo, 2015, Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancel, Science Vol, 348 no. 6230 pp. 62-68; and, Restifo et al., 2015, Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12(4): 269-281; and Jenson and Riddell, 2014, Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells. Immunol Rev. 257(1): 127-144). Например, можно использовать различные стратегии для генетической модификации Т-клеток путем изменения специфичности Т-клеточного рецептора (TCR), например, путем введения новых TCRα и β-цепей с выбранной пептидной специфичностью (см. патент США № 8697854; публикации патентных заявок РСТ: W02003020763, W02004033685, WQ2004044004, W02005114215, W02006000830, W02008038002, W02008074322, W02005113595, WO2006125962, WO2013166321, WO2013039889, WO2014018863, WO2014083173, патент США 8088379).

[001269] В качестве альтернативы или дополнения к модификации TCR, химерные рецепторы антигенов (CAR) могут быть использованы для получения иммуноположительных клеток, таких как Т-клетки, специфичных для выбранных мишеней, таких как злокачественные клетки, с широким спектром рецепторных химерных конструкций, описанных (см. 5843728, 5851828, 5912170, 6004811, 6284240, 6392013, 6410014, 6753162, 8211422 и публикацию PCT WO9215322). Альтернативные конструкции CAR могут быть охарактеризованы как принадлежащие к последующим поколениям. CAR первого поколения обычно состоят из одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела, специфичного к антигену, например, содержащего VL, связанного с VH специфического антитела, связанного гибким линкером, например, с помощью домена-петли CD8α и трансмембранного домена CD8α, с трансмембранным и внутриклеточным доменам сигнализации, такими как CD3cξ, так и FcRγ (sсFν-CD3ξ или scFv-FcRγ, см. патент США 7741465, патент США № 5912172, патент США № 5906936). CAR второго поколения включают внутриклеточные домены одной или более костимулирующих молекул, таких как CD28, OX40 (CD134) или 4-1BB (CD137) в эндодомене (например, scFv-CD28/OX4O/4-lBB-CD3Q, см. в патентах США №№ 8911993, 8916381, 8975071, 9017584, 9102760, 9102761), CAR третьего поколения включают комбинацию костимулирующих эндодоменов, таких как CD3ξ-цепь, CD97, CD11a-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB, или CD28 (например, scFv-CD28-4-1BB-CD3ξ или scFv-CD28-OX40-CD3ξ, см. патент США 8906682, патент США № 8399645, патент США № 5686281; публикацию РСТ № WO2014134165; публикацию PCT № W02012079000). Альтернативно, костимуляция может быть организована путем экспрессии CAR в антигенспецифических Т-клетках, выбранных таким образом, чтобы их можно было активировать и расширять после взаимодействия их нативного αβTCR, например, с антигеном на профессиональных антиген-представляющих клетках, с сопутствующей костимуляцией. Кроме того, могут быть предусмотрены дополнительные модифицированные рецепторы на иммуночувствительных клетках, например, для улучшения нацеливания Т-клеточной атаки и/или минимизации побочных эффектов.

[001270] Для трансформации иммуноположительных клеток-мишеней могут быть использованы альтернативные способы, такие как слияние протопластов, липофекция, трансфекция или электропорация. Можно использовать широкий спектр векторов, таких как ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, плазмиды или транспозоны, такие как транспозон Sleeping Beauty (см. патенты США №№ 6489458, 7148203, 7166682, 7985739; 8227432), для введения CAR, например, с использованием антиген-специфических CAR 2-го поколения, сигнализирующих посредством CD3ξ, и либо CD28, либо CD137. Вирусные векторы могут, например, включать векторы на основе ВИЧ, SV40, EBV, HSV или BPV.

[001271] Клетки, которые являются мишенями для последующей трансформации, могут, например, включать Т-клетки, естественные киллеры (NK), цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), регуляторные Т-клетки, эмбриональные стволовые клетки человека, опухолевые инфильтрационные лимфоциты (TIL) или плюрипотентную стволовую клетку, из которых могут быть дифференцированы лимфоидные клетки. Т-клетки, экспрессирующие желаемый CAR, могут быть отобраны, например, посредством cокультивирования с γ-облученными активируемыми и размножающимися клетками (AaPC), которые совместно экспрессируют антиген злокачественной опухоли и костимулирующие молекулы. Может быть осуществлено увеличение в количестве сконструированных CARТ-клеток, например, путем совместного культивирования на AaPC в присутствии растворимых факторов, таких как IL-2 и IL-21. Такое увеличение в количестве может быть выполнено, например, таким образом, чтобы обеспечить память CAR+ T-клеток (которые могут, например, анализироваться при помощи неферментативной цифровой матрицы и/или мультипанельной проточной цитометрии). Таким образом, могут быть предоставлены CARТ-клетки, которые обладают специфической цитотоксической активностью против антигенсвязывающих опухолей (необязательно в сочетании с получением желаемых хемокинов, таких как интерферон-γ). CAR Т-клетки такого типа могут, например, использоваться на моделях животных, например, для того, чтобы уничтожать опухолевые ксенотрансплантаты.

[001272] Следующие подходы могут быть адаптированы для обеспечения способов лечения и/или увеличения выживаемости индивидуума, имеющего заболевание, такого как новообразование, например, путем введения эффективного количества иммуноположительной клетки, содержащей рецептор, распознающий антиген, который связывает выбранный антиген, где связывание активирует иммунореактивную клетку, тем самым вылечивая или предотвращая болезнь (такую как новообразование, патогенная инфекция, аутоиммунное расстройство или реакция на аллогенный трансплантат). Дозировки в терапии с использованием Т-клеток могут, например, включать введение от 106 до 109 клеток/кг, с или без курса лимфодеплеции, например, с циклофосфамидом.

[001273] В одном варианте осуществления лечение можно проводить пациентам, проходящим иммуносупрессивное лечение. Клетки или популяция клеток могут быть устойчивыми по меньшей мере к одному иммунодепрессанту из-за инактивации гена, кодирующего рецептор для такого иммунодепрессанта. Не ограниченное только теорией иммунодепрессивное лечение должно способствовать выбору и расширению отвечающих за иммунный ответ Т-клеток в соответствии с изобретением внутри самого пациента.

[001274] Введение клеток или популяций клеток в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлено любым удобным способом, в том числе путем аэрозольной ингаляции, инъекции, приема внутрь, трансфузии, имплантации или трансплантации. Клетки или популяция клеток могут быть введены пациенту подкожно, внутрикожно, внутриопухольно, интраназально, интрамедуллярно, внутримышечно, путем внутривенной или интралимфатической инъекции или внутрибрюшинно. В одном варианте осуществления композиции клеток по настоящему изобретению. Предпочтительно вводят путем внутривенной инъекции.

[001275] Введение клеток или популяции клеток может состоять из введения 10⁴-10⁹ клеток на кг массы тела, предпочтительно от 10⁵ до 10⁶ клеток/кг массы тела, включая все целочисленные значения количества клеток в этих диапазонах. Дозирование в Т-клеточной CAR терапии может, например, включать введение от 10⁶ до 10⁹ клеток/кг, с или без курса деплеции клеток, например, при помощи циклофосфамида. Клетки или популяцию клеток можно вводить в виде одной или более доз. В другом варианте осуществления эффективное количество клеток вводят в виде разовой дозы. В другом варианте осуществления эффективное количество клеток вводят в виде более чем одной дозы в течение определенного периода времени. Сроки введения находятся в пределах компетенции лечащего врача и зависят от клинического состояния пациента. Клетки или популяция клеток могут быть получены из любого источника, такого как банк крови или донор. В то время как индивидуальные потребности различаются, определение оптимальных диапазонов эффективного количества данного типа клеток для конкретного заболевания или условий находится в пределах компетенции специалиста в данной области. Эффективное количество означает количество, которое обеспечивает терапевтическое или профилактическое преимущество. Назначенная дозировка будет зависеть от возраста, здоровья и веса получателя, вида одновременно получаемого лечения, если таковое имеется, частоты лечения и характера желаемого эффекта.

[001276] В другом варианте осуществления эффективное количество клеток или композиции, содержащей эти клетки, вводят парентерально. Введение может быть внутривенным. Введение может быть непосредственно произведено путем инъекции внутрь опухоли.

[001277] Для защиты от возможных побочных реакций искусственные иммуноположительные клетки могут быть оснащены трансгенным предохранительным переключателем в форме трансгена, который делает клетки уязвимыми для воздействия на конкретный сигнал. Например, можно использовать ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (TK), например, путем введения в аллогенные Т-лимфоциты, используемые в качестве инфузий донорных лимфоцитов после трансплантации стволовых клеток (Greco et al., Improving the safety of cell therapy with the TK-suicide gene. Front. Pharmacol. 2015: 6: 95). В таких клетках введение нуклеозидного пролекарства, такого как ганцикловир или ацикловир, вызывает гибель клеток. Альтернативные конструкции предохранительного выключателя включают индуцибельную каспазу, например, инициированную введением мелкомолекулярного димеризатора, который объединяет две нефункциональные молекулы icasp9 для образования активного фермента. Был описан широкий спектр альтернативных подходов к осуществлению контроля клеточной пролиферации (см. публикацию патента США № 20130071414, публикацию патентной заявки PCTWO2011146862, публикацию патентной заявки PCTWO2014011987, публикацию патентной заявки PCTWO2013040371, Zhou et al. BLOOD, 2014, 123/25: 3895-3905; Di Stasi et al, The New England Journal of Medicine 2011; 365: 1673-1683; Sadelain M, New England Journal of Medicine, 2011; 365: 1735-173; Ramos et al., Stem. Cells 28 (6): 1107-15 (2010)).

[001278] В дальнейшем усовершенствовании адоптивной терапии возможно редактирование генома с помощью системы CRISPR-Cas. Как описано в настоящем описании, для адаптации иммуноположительных клеток к альтернативным реализациям, например, для предоставления отредактированных CARТ-клеток (см. Poirot et al., 2015, Multiplex genome edited T-cell manufacturing platform. for "off-the-shelf" adoptive T-cell immunotherapies, CancerRes 75 (18); 3853). Например, иммуноположительные клетки могут быть удалены, для удаления экспрессии какого-либо или всего класса молекул HLA типа II и/или типа I или нокаута выбранных генов, которые могут ингибировать желаемый иммунный ответ, такой как ген PD1.

[001279] Клетки могут быть изменены с помощью любой системы CRISPR и способа ее применения, описанного в настоящей заявке. Системы CRISPR могут быть доставлены в иммунную клетку любым способом, описанным в настоящем описании. В предпочтительных вариантах осуществления клетки редактируются ex vivo и далее доставляются индивидууму, нуждающемуся в этом. Клетки иммунной системы, CARТ-клетки или любые клетки, используемые для переноса клеток для данного вида терапии, могут быть отредактированы. Редактирование может быть выполнено для устранения потенциальных аллореактивных Т-клеточных рецепторов (TCR), разрушения мишени химиотерапевтического агента, блокирования иммунной точки контроля, активации Т-клеток и/или усиления дифференцировки и/или пролиферации функционально истощенных или дисфункциональных CD8+ Т-клеток (см. публикации патентов PCT: WO2013176915, WO2014059173, WO2014172606, WO2014184744 и WO2014191128). Редактирование может привести к инактивации гена.

[001280] При инактивации гена, предполагается, что интересующий ген не экспрессируется в функциональной белковой форме. В конкретном варианте осуществления система CRISPR специфически катализирует расщепление в одном гене-мишени, тем самым инактивируя указанный ген. Вызываемые разрывы цепи нуклеиновой кислоты обычно восстанавливаются через различные механизмы гомологичной рекомбинации или не гомологичного соединения концов (NHEJ). Однако NHEJ является несовершенным процессом восстановления, который часто приводит к изменениям последовательности ДНК на месте расщепления. Восстановление через не гомологичное соединение концов (NHEJ) часто приводит к небольшим инсерциям или делециям (Indel) и может быть использовано для создания специфических нокаутов гена. Клетки, в которых произошел мутагенез, индуцированный расщеплением, могут быть идентифицированы и/или выбраны известными способами в данной области.

[001281] Т-клеточные рецепторы (TCR) являются рецепторами на поверхности клетки, которые участвуют в активации Т-клеток в ответ на появление антигена. TCR обычно состоит из двух цепей: α и β, которые собираются с последующим образованием гетеродимера и ассоциируется с CD3-трансдуцирующими субъединицами, с образованием комплекса рецептора Т-клеток, присутствующего на поверхности клетки. Каждая α и β цепочка TCR состоит из иммуноглобулиноподобной N-концевой переменной (V) и константной (C) области, гидрофобного трансмембранного домена и короткой цитоплазматической области. Что касается молекул иммуноглобулина, переменная область цепочек α и β генерируется V (D) J, создавая большое разнообразие антигенспецифических особенностей в популяции Т-клеток. Однако, в отличие от иммуноглобулинов, которые распознают интактный антиген, Т-клетки активируются обработанными пептидными фрагментами в сочетании с молекулой МНС, вводя дополнительное изменение в распознавание антигена Т-клетками, известное как МНС-рестрикция. Распознавание различий МНС между донором и реципиентом через рецептор Т-клеток приводит к пролиферации Т-клеток и потенциальному развитию болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD). Инактивация TCR может приводить к элиминации TCR с поверхности Т-клеток, предотвращающих распознавание аллоантигена и, таким образом, к развитию отторжения (GVHD). Однако нарушение TCR обычно приводит к элиминации составляющей сигнального компонента CD3 и изменяет путь дальнейшей экспансии Т-клеток.

[001282] Было показано, что аллогенные клетки быстро отвергаются иммунной системой хозяина. Было продемонстрировано, что аллогенные лейкоциты, присутствующие в необлученной крови, будут сохраняться в течение не более 5-6 дней (Boni, Muranski et al, 2008 Blood 1; H2 (12): 4746-54). Таким образом, чтобы предотвратить отторжение аллогенных клеток, иммунная система хозяина обычно должна быть в некоторой степени подавлена. Тем не менее, несмотря на простоту адоптивной передачи клеток, использование иммунодепрессантов также оказывает пагубное влияние и на вводимые терапевтические Т-клетки. Поэтому для эффективного использования подхода адоптивной иммунотерапии в этих условиях вводимые клетки должны быть устойчивыми к иммунодепрессивному лечению. Таким образом, в конкретном варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно включает стадию модификации Т-клеток, чтобы сделать их устойчивыми к иммунодепрессанту, предпочтительно путем инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего мишень иммунодепрессанта. Иммунодепрессивный агент является агентом, который подавляет иммунную функцию одним из нескольких механизмов действия. Иммунодепрессивный агент может быть, но не ограничен, ингибитором кальциневрина, мишенью рапамицина, блокатором α-цепи рецептора интерлейкина-2, ингибитором инозин-монофосфатдегидрогеназы, ингибитором дигидрофолиевой кислоты редуктазы, кортикостероидом или иммуносупрессивным антиметаболитом. Настоящее изобретение позволяет придавать иммунодепрессивную резистентность Т-клеткам для иммунотерапии путем инактивации мишени иммунодепрессанта в Т-клетках. В качестве неограничивающих примеров мишеней для иммуносупрессивного агента могут быть использованы рецепторы для иммуносупрессивного агента, такие как: CD52, глюкокортикоидный рецептор (GR), член семейства семейств FKBP и член семейства семейств циклофилина.

[001283] Иммунные точки контроля представляют собой ингибирующие пути, которые замедляют или останавливают иммунные реакции и предотвращают чрезмерное повреждение тканей при неконтролируемой активности иммунных клеток. В определенных вариантах осуществления целевым объектом иммунной контрольной точки является ген запрограммированной смерти 1 (PD-l или CD279) (PDCD1). В других вариантах осуществления иммунной точкой контроля является цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген (CTLA-4). В дополнительных вариантах осуществления являющейся мишенью иммунной точкой контроля является другой член суперсемейства CD28 и CTLA4 Ig, такой как BTLA, LAGS, ICOS, PDL1 или KIR. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения являющаяся мишенью иммунная точка контроля является членом надсемейства TNFR, таким как CD40, OX40, CD137, GITR, CD27 или TIM-3.

[001284] Дополнительные иммунные точки контроля включают содержащую домен Src-гомологии 2 тирозинфосфатазу 1 (SHP-1) (Watson HA, et al., SHP-1: the next checkpoint target for cancer immunotherapy? Biochem Soc Trans. 2016 Apr 15;44(2):356-62). SHP-1 является широко экспрессируемой ингибирующей белковой тирозинфосфатазой (PTP). В Т-клетках она является отрицательным регулятором антигензависимой активации и пролиферации. Она представляет собой цитозольный белок и, следовательно, не поддается способам, опосредованным антителами, но ее роль в активации и пролиферации делает его привлекательной мишенью для генетической манипуляции в стратегиях адаптивного переноса, таких как Т-клетки с химерным рецептором антигена (CAR). Иммунные контрольные точки могут также включать Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITEM (TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9) и VISTA (LeMercierI, et al., (2015) Beyond CTLA-4 and PD-1, the generation of negative checkpoint regulators. Front. Immunol. 6:418).

[001285] WO2014172606 относится к применению MT1 и/или ингибиторов MT1 для увеличения пролиферации и/или активности израсходованных CD8+ Т-клеток и для уменьшения выработки CD8+ Т-клеток (например, снижения функционально истощенных или невосприимчивых иммунных клеток CD8+). В некоторых вариантах осуществления металлотионеины нацелены на редактирование генов в адоптивно перенесенных Т-клетках.

[001286] В некоторых вариантах осуществления мишени для редактирования гена могут быть по меньшей мере одним локусом-мишенью, участвующим в экспрессии иммунного контрольного белка. Такие мишени могут включать, но не ограничиваются следующмими:CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, ICOS (CD278), PDL1, KIR, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD 160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIRI, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244 (2B4), TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRI1, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TG1F1, IL10BA, IL10RB, HM0X2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, VISTA, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCYIB3, MT1, MT2, CD40, OX40, CD137, GITR, CD27, SHP-l или TIM-3.В предпочтительных вариантах осуществления мишенью является локус гена, участвующий в экспрессии генов PD-1 или CTLA-4,. В других предпочтительных вариантах осуществления мишенью являются следущие комбинации генов, но ограничиваясь ими: PD-1 и TIGIT.

[001287] В других вариантах редактируются по меньшей мере два гена. Пары генов могут включать, но не ограничиваются ими: PD1 и TCRα, PD1 и TCRβ, CTLA-4 и TCRα, CTLA-4 и TCRβ, LAG3 и TCRα, LAG3 и TCRβ, Tim3 и TCRα, Tim3 и TCRβ, BTLA и TCRα, BTLA и TCRβ, BY55 и TCRα, BY55 и TCRβ, TIGIT и TCRα, TIGIT и TCRβ, B7H5 и TCRα, B7H5 и TCRβ, LAIRI и TCRα, LAIRI и TCRβ, SIGLEC10 и TCRα, SIGLEC10 и TCRβ, 2B4 и TCRα, 2B4 и TCRβ.

[001288] Независимо от того, до или после генетической модификации Т-клеток, Т-клетки могут быть активированы и проведена экспансия, как правило, с использованием способов, описанных, например в патентах США 6352694; 6534055; 6905680; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; и 7572631. Экспансия Т-клеток может быть проведена как in vitro так и in vivo.

[001289] Практика настоящего изобретения использует, если не указано иначе, общепринятые способы иммунологии, биохимии, химии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, геномики и рекомбинантных ДНК, которые входят в компетенции специалистов. См. Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F, M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Flames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

[001290] Практика настоящего изобретения использует, если не указано иначе, общепринятые методы создания поколения генетически модифицированных мышей. Sec Marten H. Hofker and Jan van Deursen, TRANSGENIC MOUSE METHODS AND PROTOCOLS, 2nd edition (2011).

Пусковые факторы генов

[001291] Настоящее изобретение также предполагает использование системы CRISPR-Cas, описанной в настоящем описании, например, эффекторного белка C2c1 или C2c3, системы для обеспечения пусковых факторов генов, управляемых РНК, например, в системах, аналогичных описанным элементам, запускающим экспрессию генов, например описанных в публикации патента PCT WO 2015/105928. Системы такого типа могут, например, обеспечивать способы изменения эукариотических клеток зародышевой линии путем введения в клетку последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ДНК-нуклеазу, нацеленную на РНК, и одну или более направляющих РНК. Направляющие РНК могут быть сконструированы так, чтобы быть комплементарными одному или более местам мишеней на геномной ДНК клетки зародышевой линии. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ДНК-нуклеазу, ориентированную на РНК, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую направляющие РНК, могут быть предоставлены на конструкциях между фланкирующими последовательностями с промоторами, расположенными так, что клетка зародышевой линии может экспрессировать ДНК-нуклеазу, нацеленную на РНК, и направляющие РНК вместе с любыми желаемыми последовательности кодирования необходимого продукта, которые также расположены между фланкирующими последовательностями. Фланкирующие последовательности, как правило, включают последовательность, которая идентична соответствующей последовательности на выбранной хромосоме-мишени, так что фланкирующие последовательности работают с компонентами, кодируемыми конструкцией, чтобы облегчить введение последовательностей конструкции посторонней нуклеиновой кислоты в геномную ДНК, чтобы разрезать представляющий интерес сайт с помощью таких механизмов, как гомологичная рекомбинация, чтобы сделать зародышевую клетку гомозиготной по отношению к чужой нуклеиновой кислоте. Таким образом, системы запуска генов способны интрогрессировать желаемые гены-грузы во всей размножающейся популяции (Gantz et al., 2015, Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles PNAS 2015, опубликованная до печати 23 ноября 2015 года, doi: 10.1073/pnas. 1521077112; Esvelt et al., 2014). В некоторых вариантах осуществления могут быть выбраны последовательности-мишени, которые имеют мало потенциальных участков нецелевого назначения в геноме. Ориентация нескольких сайтов в локусе-мишени с использованием нескольких направляющих РНК может увеличить частоту разрезания и затруднить эволюцию устойчивых к пусковым факторам аллелей. Укороченные направляющие РНК могут снижать нецелевое разрезание. Вместо одиночной нуклеазы можно использовать парные никазы для дальнейшего увеличения специфичности. Конструкции запуска генов могут включать последовательности грузов, кодирующие регуляторы транскрипции, например, для активации генов гомологичной рекомбинации и/или подавления негомологичного концевого соединения. Участки-мишени могут быть выбраны в пределах важного гена, так что события негомологичного соединения концов могут вызывать летальность, а не создавать резистентный к пусковому фактору аллель. Конструкции пусковых факторов генов могут быть спроектированы для работы в диапазоне температур Cho et al. 2013, Rapid and Tunable Control of Protein Stability in Caenorhabditis elegans Using a Small Molecule, PLoS ONE 8(8): e72393. doi: 10.1371 /journal.pone.0072393).

Ксенотрансплантация

[001292] Настоящее изобретение также предусматривает использование системы CRISPR-Cas, описанной в настоящем описании, например, C2c1 или C2c3, чтобы обеспечить РНК-направленные ДНК-нуклеазы, адаптированные для использования в модифицированных тканях для трансплантации. Например, нуклеазы ДНК, основанные на РНК, могут быть использованы для нокаута, нокдауна или разрушения выбранных генов у животного, такого как трансгенная свинья (например, линия свиней, трансгенных по гену гемоксигеназы-1 человека), например, нарушая экспрессию генов, которые кодируют эпитопы, распознаваемые иммунной системой человека, т.е. гены ксеноантигена. Гены-кандидаты свиньи для нарушения могут, например, включать гены α(1,3)-галактозилтрансферазы и гидроксилазы цитидин-монофосфат--N-ацетилнейраминовой кислоты (см. публикацию PCT WO 2014/066505). Кроме того, могут быть разрушены гены, кодирующие эндогенные ретровирусы, например гены, кодирующие все эндогенные ретровирусы свиней (см. Yang et al., 2015, Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs), Science 27 November 2015: Vol. 350 no. 6264 pp. 1101-1104). Кроме того, РНК-направленные ДНК-нуклеазы могут использоваться для нацеливания на сайт для интеграции дополнительных генов донорских животных ксенотрансплантата, таких как ген CD55 человека, для улучшения защиты от особенно острого отторжения.

Общие вопросы генной терапии

[001293] Примеры генов и полинуклеотидов, связанных с болезнями, а также конкретную информацию о болезнях можно получить в McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimor, Md.) и в National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, (Bethesda Md.)), которые доступны через интернет.

[001294] Мутации в этих генах и путях могут приводить к продукции неправильных белков или белков в неподходящих количествах, что влияет на функцию. Другие примеры генов, заболеваний представлены в предварительной заявке на патент США 61/736527, поданной 12 декабря 2012 года, включенной в качестве ссылки. Подобные гены, белки и пути могут быть подвергнуты нацеливанию полинуклеотидом комплекса CRISPR по настоящему изобретению. Примеры связанных с болезнями генов и полинуклеотидов перечислены в таблицах 1 и 2. Примеры генов и полинуклеотидов, связанных с сигнальными биохимическими каскадами, перечислены в таблице 3.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

[001295] Варианты осуществления изобретения также относятся к способам и конструкциям, связанным с нокаутом генов, амплификацией генов и исправлением конкретных мутаций, ассоциированных с нестабильностью повторов ДНК и неврологическими заболеваниям (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Second Edition, Academic Press, Oct 13, 2011-Medical). Было обнаружено, что конкретные аспекты последовательностей тандемных повторов ответственны более чем за двадцать заболеваний человека (New insights into repeat instability: role of RNA-DNA hybrids. Mclvor El, Polak U, Napierala M. RNA. Biol. 2010 Sep-Oct; 7(5):551-8). Указанные системы эффекторных белков могут быть использованы, чтобы корректировать эти дефекты геномной нестабильности.

[001296] Некоторые дальнейшие аспекты изобретения относятся к корректировке дефектов, связанных с широким диапазоном генетических заболеваний, которые далее описаны на сайте Национального института здоровья в тематическим подразделе "Генетические заболевания". Генетические заболевания головного мозга могут включать (но этим не ограничиваются) адренолейкодистрофию, агенез мозолистого тела, синдром Аикарди, болезнь Альперса, болезнь Альцгеймера, синдром Барта, болезнь Баттена, CADASIL, мозжечковую дегенерацию, болезнь Фабри, болезнь Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, болезнь Хантингтона и другие болезни триплетных повторов, болезнь Лея, синдром Леша-Нихена, болезнь Менкеса, митохондриальные миопатии, кольпоцефалия NINDS. Эти заболевания описаны далее на сайте Национального института здоровья в подразделе "Генетические заболевания".

Разработка и применение Cas9

[001297] Настоящее изобретение может быть дополнительно проиллюстрировано и расширено при помощи описания разработки и использования CRISPR-Cas9, и, в частности, с точки зрения доставки белкового комплекса CRISPR и использования эндонуклеазы, направляемой РНК, в клетках и организмах, как изложено в следующих статьях, включенных посредством ссылок:

> Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F. Science Feb 15;339(6121):819-23 (2013);

> RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol Mar;31(3):233-9 (2013);

> One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas- Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R. Cell May 9;153(4):910-8 (2013);

> Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RT Scott DA, Church GM, Zhang F. Nature. Aug 22;500 (7463):472-6. doi: 10.1G38/Naturel2466. Epub 2013 Aug 23 (2013);

> Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity, Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, JS., Konermann, S., Trevino, AE., Scott, DA., Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y., & Zhang, F. Cell Aug 28. pii: S0092- 8674(13)01015-5 (2013-A);

> DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi: 10.1038/nbt.2647 (2013);

> Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran, FA., Hsu, PD., Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA., Zhang, F. Nature Protocols Nov;8(l l):2281-308 (2013-B);

> Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science Dec 12. (2013). [Epub ahead of print];

- Crystal staicture of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI, Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, (), Cell Feb 27, 156(5):935-49 (2014);

- Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB, Cheng AW., Trevino AE, Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Bioteehnol. Apr 20. doi: 10. lQ38/nbt.2889 (2014);

- CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, Dahlman JE, Parnas G, Eisenhaure TM, Jovanovic M, Graham DB, Jhunjhunwala S, Heidenreich M, Xavier RJ, Danger R, Anderson DG, Hacohen N, Regev A, Feng G, Sharp PA, Zhang F. Cell 159(2): 440-455 DOI: 10.1016/j. cell.2014.09.014(2014);

- Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Hsu PD, Lander ES, Zhang F., Cell. Jun 5,157(6): 1262-78 (2014).

- Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system, Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES., Science. January 3; 343(6166): 80-84. doi: 10.1126/science. 1246981 (2014);

- Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation, Doench JG, Hartenian E, Graham DB, Tothova Z, Hegde M, Smith I, Sullender M, Ebert BL, Xavier RJ, Root DE., (published online 3 September 2014) Nat Bioteehnol. Dec;32(12): 1262-7 (2014);

- In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9, Swiech L, Heidenreich M, Banerjee A, Habib N, Li Y, Trombetta J, Sur M, Zhang F., (published online 19 October 2014) Nat Bioteehnol, Jan,33(1): 102-6 (2015);

- Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex, Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F., Nature. Jan 29;517(7536):583-8 (2015).

- A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation, Zetsche B, Volz SE, Zhang F., (published online 02 February 2015) Nat Bioteehnol. Feb;33(2): 139-42 (2015);

- Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis, Chen S, Sanjana NE, Zheng K, Shalem O, Lee K, Shi X, Scott DA, Song J, Pan JQ, Weissleder R, Lee H, Zhang F, Sharp PA. Cell 160, 1246-1260, March 12, 2015 (multiplex screen in mouse), and

- In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9, Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem Q, Wu X, Makarova KS, Koonin EV, Sharp PA, Zhang F., (published online 01 April 2015), Nature. Apr 9;520(7546): 186-91 (2015).

- Shalem et. al, "High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9," Nature Reviews Genetics 16, 299-311 (May 2015).

- Xu et al., "Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design," Genome Research 25, 1147-1157 (August 2015).

- Parnas et al., "A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks," Cell 162, 675-686 (July 30, 2015).

- Ramanan et al., CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis В virus," Scientific Reports 5:10833, doi: 10.1038/srepl0833 (June 2, 2015),

- Nishimasu et al., Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9," Cell 162, 1113-1126 (Aug, 27, 2015),

- BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis, Canver et al., Nature 527(7577): 192-7 (Nov. 12, 2015) doi: 10.1038/naturel5521. Epub 2015 Sep 16.

- Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Zetsche et al..Cell 163, 759-71 (Sep 25, 2015),

- Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems.Shmakov et al, Molecular Cell, 60(3), 385-397 doi: 10.1016/j.molcel.2015,10.008 Epub October 22, 2015.

- Rationally engineered Cash nucleases with improved specificity, Slaymaker et al., Science 2015 Dec 1. pii: aad5227. [Epub ahead of print],

каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки, может рассматриваться в практике настоящего изобретения и кратко обсуждается ниже:

- Cong et al. разработали системы CRISPR-Cas типа II для использования в эукариотических клетках на основе как Streptococcus thermophilus Cas9, так и Streptococcus pyogenes Cas9 и показали, что нуклеазы Cas9 могут быть направлены короткой РНК, чтобы индуцировать точное расщепление ДНК в клетках человека и мыши. Их исследование также показало, что Cas9, превращенный в создающий однонитевые разрывы фермент, может быть использован для облегчения гомологической репарации в эукариотических клетках с минимальной мутагенной активностью. Кроме того, их исследование показало, что несколько направляющих последовательностей могут быть закодированы в единую последовательность CRISPR, чтобы обеспечить одновременное редактирование нескольких участков на эндогенных геномных локусах в геноме млекопитающих, демонстрируя легкость в программировании и широкую применимость технологии нуклеазы, основанной на РНК. Эта возможность использовать РНК для программирования последовательность-специфичного расщепления ДНК в клетке определила новый класс инструментов для геномной инженерии. Эти исследования также показали, что другие локусы CRISPR, вероятно, могут быть трансплантированы в клетки млекопитающих для опосредования расщепления в целевых участках генома млекопитающих. Важно отметить, что в будущем некоторые аспекты системы CRISPR-Cas могут быть дополнительно улучшены для повышения ее эффективности и универсальности.

- Jiang et al. использовали короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами (CRISPR), связанные с эндонуклеазой Cas9, объединенные с двойными РНК, для введения точных мутаций в геномы Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli. Этот подход основан на двойной РНК: расщепление, направляемое Cas9, на целевом геномном участке уничтожает немутированные клетки и позволяет обойти необходимость выбора маркеров или систем отрицательного отбора. В исследовании сообщается о перепрограммировании специфики комплекса двойной РНК: Cas9 путем изменения последовательности короткой CRISPRРНК (cr-РНК) для внесения одно- и мультинуклеотидные изменений в матрицы редактирования. Исследование показало, что одновременное использование двух cr-РНК обеспечивало мультиплексный мутагенез. Кроме того, когда подход использовался в сочетании с рекомбинацией, у S. pneumoniae почти 100% клеток, которые были восстановлены с использованием описанного подхода, содержали желаемую мутацию, а в E.coli 65% клеток, которые были восстановлены, содержали мутацию.

- Wang et al., 2013 использовали систему CRISPR/Cas для одношаговой генерации мышей, несущих мутации в нескольких генах, которые традиционно генерировались на нескольких стадиях путем последовательной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках и/или трудоемким скрещиванием мышей с единственная мутация. Система CRISPR/Cas значительно ускорит исследование in vivo функционально избыточных генов и эпистатических генных взаимодействий.

- Konermann et al. (2013) рассмотрели необходимость в универсальных и надежных технологий для оптической и химической модуляции ДНК-связывающих доменов на основе фермента CRISPR Cas9, а также подобных эффекторам активаторов транскрипции (TALE).

- Ran et al. (2013-А) описали подход, в котором объединены никазный мутант Cas9 с парными направляющими РНК для введения целенаправленных двунитевых разрывов. Это касается нуклеазыCas9 из микробной системы CRISPR-Cas, которая нацелена на конкретные геномные локусы с помощью направляющей последовательности, которая может переносить определенные несоответствия с ДНК-мишенью и тем самым способствовать нежелательному нецелевому мутагенезу. Поскольку отдельные однонитевые разрывы в геноме восстанавливаются с высокой точностью, одновременное внесение однонитевых разрывов с помощью надлежащим образом смещенных направляющих РНК требуется для двухцепочечных разрывов и увеличивает количество специфично распознаваемых оснований для целевого расщепления. Авторы продемонстрировали, что использование парного внесения одноцепочечных разрывов может снизить нецелевую активность в 50-100 раз в клеточных линиях и облегчить нокаут генов у зигот мышей без ущерба для эффективности расщепления мишеней. Эта универсальная стратегия позволяет использовать широкий спектр приложений для редактирования генома, которые требуют высокой специфичности.

- Hsu et al. (2013) охарактеризовали специфичность нацеливания, осуществляемого SpCas9 в клетках человека, чтобы получить данные о выборе целевых сайтов и избегать нецелевого воздействия. В исследовании оценивали> 700 вариантов направляющей РНК и индуцированные SpCas9 уровни инсерции/делеции (indel-мутации)на > 100 предсказанных геномных нецелевых локусов в клетках 293T и 293FT. Авторы показали, что SpCas9 допускают несоответствия между направляющей РНК и ДНК-мишенью в разных положениях зависимым от последовательности образом, чувствительны к числу, положению и распределению несоответствий. Авторы также показали, что SpAas9-опосредованное расщепление не подвержено влиянию метилирования ДНК и что доза SpCas9 и одноцепочечной направляющей РНК (sgRNA) может быть титрована для минимизации нецелевой модификации. Кроме того, для облегчения применения приложений для инженерии генома млекопитающих авторы разработали программного обеспечения для выбора и проверки целевых последовательностей, а также нецелевого анализа.

- Ran et al. (2013-B) описали набор инструментов для Cas9-опосредованного редактирования генома путем негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологичной репарации (HDR) в клетках млекопитающих, а также создания модифицированных клеточных линий для последующих функциональных исследований. Для минимизации нецелевого расщепления, авторы описали стратегию внесения двойных одноцепочечных разрывов, использующую никазный мутант Cas9 с парными направляющими РНК. Протокол, предоставленный авторами, экспериментально выработал руководящие принципы для выбора целевых участков, оценки эффективности расщепления и анализа нецелевой активности. Исследования показали, что, начиная с разработки мишени, модификации генов могут быть достигнуты всего за 1-2 недели, а модифицированные клональные клеточные линии могут быть получены в течение 2-3 недель.

- Shalem et al. описали новый способ исследования функции гена в масштабе всего генома. Их исследования показали, что доставка полногеномной библиотеки нокаутов CRISPR-Cas9 (GeCKO), нацеленной на 18080 генов с 64751 уникальными направляющими последовательностями, позволила провести скрининг c помощью как отрицательного, так и положительного отбора в клетках человека. Во-первых, авторы показали использование библиотеки GeCKO для идентификации генов, необходимых для жизнеспособности клеток при раке и плюрипотентных стволовых клеток. Далее, в модели меланомы авторы провели скрининг для поиска генов, потеря которых связана с резистентностью к вемурафенибу, терапевтическому препарату, который ингибирует мутантную протеинкиназу ВRAF. Их исследования показали, что кандидаты высшего ранга включали ранее проверенные гены NF1 и MED12, а также новые: NF2, CUL3, TADA2B и TADA1. Авторы наблюдали высокий уровень согласованности между независимыми направляющими РНК, нацеленными на один и тот же ген, и высоким показателем подтверждения полученного результата, и, таким образом, продемонстрировали возможность скрининга целого генома с помощью Cas9.

- Nishimasu et al. исследовали кристаллической структуре Cas9 Streptococcus pyogenes в комплексе с одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК) и его ДНК-мишени при разрешении 2,5 A°. Обнаружена "двулопастная" архитектура структуры, состоящая из субъединицы для распознавания мишени и нуклеазной субъединицы, вмещающих гетеродуплекс sg-РНК:ДНК в положительно заряженном желобке на их поверхности. В то время как субъединица ("доля") для распознавания необходима для связывания sg-РНК и ДНК, нуклеазная субъединица ("доля") содержит домены HNH и RuvC-нуклеазы, которые должным образом расположены для расщепления комплементарных и не комплементарных цепей ДНК-мишени соответственно. Нуклеазная субъединица также содержит карбоксильный концевой домен, ответственный за взаимодействие с последовательностью, прилегающей к протоспейсеру (PAM). Эта структура с высоким разрешением и сопутствующие функциональные анализы выявили молекулярный механизм РНК-направленного нацеливания на ДНК, осуществляемого Cas9, таким образом прокладывая путь для рационального проектирования новых, универсальных технологий редактирования генома.

- Wu et al. картировали во всем геноме сайты связывания каталитически неактивного Cas9 (dCas9) из Streptococcus pyogenes, нагруженных одноцепочечными направляющими РНК (sg-РНК) в эмбриональных стволовых клетках мыши (mESC). Авторы показали, что каждая из четырех sg-РНК тестировала мишени dCas9 между десятками и тысячами геномных участков, часто характеризующихся 5-нуклеотидной областью-затравкой в sg-РНК и NGG-соседним мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM). Недоступность хроматина уменьшает связывание dCas9 с другими сайтами с соответствующими "seed"-последовательностями; таким образом, 70% нецелевых сайтов связаны с генами. Авторы показали, что целенаправленное секвенирование 295 сайтов связывания dCas9 в mESC, трансфицированных каталитически активным Cas9, выявило только один сайт, мутированный выше фоновых уровней. Авторы предложили модель с двумя состояниями для связывания и расщепления Cas9, в которой совпадение "seed"-последовательности вызывает связывание, но для расщепления требуется обширное спаривание оснований с ДНК-мишенью.

- Platt et al. создали Cre-зависимую мышь с нокином Cas9. Авторы продемонстрировали как in vivo, так и ex vivo редактирование генома с использованием аденоассоциированного вируса (AAV), лентивируса или опосредованной частицами доставки направляющей РНК в нейроны, иммунные клетки и эндотелиальные клетки.

- Hsu et al. (2014) - обзорная статья, в которой обсуждается история CRISPR-Cas9 от йогурта до редактирования генома, включая генетический скрининг клеток.

- Wang et al. (2014) относится к объединенному способу генетического скрининга, основанному на потере функциональности, подходящему как для положительного, так и для отрицательного отбора, который использует полногеномную лентивирусную библиотеку одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК).

- Doench et al. создали пул одноцепочечных направляющих РНК (sg-РНК), чередуя все возможные целевые сайты группы из шести эндогенных мышиных и трех эндогенных генов человека и количественно оценили их способность продуцировать нулевые аллели их целевого гена путем окрашивания антителом и проточной цитометрии. Авторы показали, что оптимизация PAM улучшила активность, а также предоставила интерактивный инструмент для разработки одноцепочечных направляющих sg-РНК.

- Swiech et al. продемонстрировали, что AAV-опосредованное редактирование генома с помощью SpCas9 может позволить провести ретроспективные генетические исследования функции гена в головном мозге.

- Konermann et al. (2015) обсуждают возможность присоединения нескольких эффекторных доменов, например активаторов транскрипции, функциональных и эпигеномных регуляторов в соответствующих положениях на направляющей молекуле, таких как шпилька или тетрапетля с линкерами и без них.

- Zetsche et al. демонстрируют, что фермент Cas9 можно разделить на два и, следовательно, можно контролировать сборку Cas9 для активации.

- Chen et al. c помощью мультиплексного полногеномного скрининга in vivo посредством CRISPR-Cas9 обнаружили у мышей гены, регулирующие метастазы в легкие.

- Ran et al. (2015) исследовали SaCas9 и его способность редактировать геномы и продемонстрировали, что нельзя экстраполировать биохимические анализы. Shalem et al. (2015) описаны способы использования каталитически неактивные слияния Cas9 (dCas9) для синтетического подавления (CRISPRi) или активации (CRISPRa) экспрессии и продемонстрированы преимущества использованияCas9 для полногеномного скрининга, включая упорядоченный и объединенные скрининг, нокаутные подходы, инактивирующие геномные локусы, и стратегии, модулирующие активность транскрипции.

Окончательные изменения

- Shalem et al. (2015) описали способы использования каталитически неактивные слияния Cas9 (dCas9) для синтетического подавления (CRISPRi) или активации (CRISPRa) экспрессии и продемонстрированы преимущества использования Cas9 для полногеномного скрининга, включая упорядоченный и объединенные скрининг, нокаутные подходы, инактивирующие геномные локусы, и стратегии, модулирующие активность транскрипции.

- Xu et al. (2015) оценили характеристики последовательности ДНК, которые способствуют эффективности одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК) в скрининге на основе CRISPR. Авторы исследовали эффективность нокаута CRISPR/Cas9 и предпочтение нуклеотидов на участке расщепления. Авторы также обнаружили, что предпочтительные последовательности для CRISPR-интерференции/CRISPR-активации (CRISPRi/a) существенно отличаются от таковых для нокаута CRISPR/Cas9.

- Paraas et al. (2015) ввели полногеномные объединенные библиотеки CRISPR-Cas9 в дендритные клетки для идентификации генов, контролирующих индукцию фактора некроза опухолей (Tnf) бактериальным липополисахаридом (LPS). Известные регуляторы сигналинга Tlr4 и ранее неизвестные кандидаты были идентифицированы и классифицированы на три функциональных модуля с явным влиянием на канонические ответы на LPS.

- Ramananetal (2015) продемонстрировали расщепление вирусной эписомальной ДНК (cccDNA) в инфицированных клетках. Геном HBV существует в ядрах инфицированных гепатоцитов в виде двухцепочечных эписомальных ДНК длиной 3,2 т.п.н., которые называются ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (cccDNA), которая является ключевым компонентом жизненного цикла HBV, репликация которого не ингибируется современной терапией. Авторы показали, что одноцепочечные направляющие молекулы РНК (sg-РНК), специально предназначенные для высококонсервативных областей HBV, эффективно подавляют репликацию вируса и обедненную cccDNA.

- Nishimasu et al. (2015) сообщили о кристаллических структурах SaCas9 в комплексе с одной направляющей РНК (sg-РНК) и ее двухцепочечными ДНК-мишенями, содержащими 5'-TTGAAT-3' PAM-последовательность и 5'-TTGGGT-3' PAM-последовательность. Структурное сравнение SaCas9 с SpCas9 выявило как консервативность структуры, так и расхождение, объяснив отчетливую специфичность их PAM и ортологическое распознавание sg-РНК.

- Canver et al. (2015) продемонстрировали функциональное исследование не кодирующих геномных элементов на основе CRISPR-Cas9. Авторы разработали объединенные библиотеки направляющей РНК CRISPR-Cas9 для насыщающего мутагенеза insitu энхансеров BCL11A человека и мыши, которые выявили важные особенности этих энхансеров.

- Zetsche et al. (2015) сообщили о характеристике Cpf1, нуклеазы класса 2 CRISPR из Francisellanovicida U112, имеющей особенности, отличные от Cas9. Cpf1 представляет собой единственную РНК-направляемую эндонуклеазу, не имеющую tracr-РНК, использующую T-богатый мотив, прилегающий к протоспейсеру, и расщепляющую ДНК путем ступенчатого двухцепочечного разрыва.

- Shmakov et al. (2015) сообщили о трех разных классах систем CRISPR-Cas. Два фермента системы CRISPR (C2c1 и C2c3) содержат RuvC-подобные эндонуклеазные домены, отдаленно связанные с Cpf1. В отличие от Cpf1, C2c1 зависит как от cr-РНК, так и от tracr-РНК для расщепления ДНК. Третий фермент (C2c2) содержит два предсказанных РНК-азных домена HEPN и является независимым от tracr-РНК.

- Slaymaker et al. (2016) сообщили об использовании структурной белковой инженерии для улучшения специфичностиCas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9). Авторы разработали варианты "расширенной специфичности" SpCas9 (eSpCas9), которые поддерживали устойчивое целевое расщепление с уменьшением нецелевых эффектов.

[001298] Кроме того, "Dimeric CRISPR RNA-guided Fok1 nucleases for highly specific genome editing", Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, CydKhayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J, Goodwin, Martin J, Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014), относится к димерным РНК-направленным Fok1-нуклеазам, которые распознают расширенные последовательности и могут редактировать эндогенные гены с высокой эффективностью в клетках человека.

[001299] Что касается общей информации о системах CRISPR-Cas, их компонентах и доставке таких компонентов, включаяс пособы, материалы, транспортные средства доставки, векторы, частицы, AAV, а также их изготовление и использование, в том числе что касается количества и формул, все полезное на практике для настоящего изобретения, приводится в настоящем описании в качестве ссылки на следующие номера патентов США: № 8999641, 8993233, 8945839, 8932814, 8906616, 8895308, 8889418, 8889356, 8871445, 8865406, 8795965, 8771945 и 8697359; публикация заявки на патент США US 2014-0310830 (US APP.Ser. No. 14/105031), US 2014-0287938 A1 (US App. Ser. No. 14/213991), US 2014- 0273234 A1 (U.S. App, Ser. No. 14/293674), US2014-0273232 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/290575), US 2014-0273231 (U.S. App. Ser. No. 14/259420), US 2014-0256046 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/226274), US 2014-0248702 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/258458), US 2014-0242700 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/222930), US 2014-0242699 A1 (U.S. App. Ser. No, 14/183512), US 2014-0242664 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/104990), US 2014-0234972 A1 (U.S, App. Ser. No. 14/183471), US 2014-0227787 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/256912), US 2014-0189896 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/105035), US 2014-0186958 (U.S. App. Ser. No. 14/105017), US 2014-0186919 Al (U.S. App. Ser. No. 14/104977), US 2014-0186843 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/104900), US 2014-0179770 A1 (US. App. Ser. No. 14/104837) и US 2014-0179006 A1 (US. App. Ser. No. 14/183,486), US 2014-0170753 (US App. Ser. No. 14/183429), US 2015-0184139 (US. App. Ser. No. 14/324960), 14/054414; Европейские патенты: EP 2 764 103 (EP13824232.6), EP 2 784 162 (EP14170383.5) и EP 2 771 468 (EP13818570.7); и публикации патентных заявок PCT: WO 2014/093661 (PCT/US2013/074743), WO 2014/093694 (PCT/US2013/074790), WO 2014/093595 (PCT/US2013/074611), WO 2014/093718 (PCTAJS2013/074825), WO 2014/093709 (PCT/US2013/074812), WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667), WO 2014/093635 (PCT/US2013/074691), WO 2014/093655 (PCT/US2013/07473 6), WO 2014/093712 (PCT/US2013/074819), WO 2014/093701 (PCT/US2013/074800), WO 2014/018423 (PCT/US2013/051418), WO 2014/204723 (PCT/US2014/041790), WO 2014/204724 (PCT/US2014/041800), WO 2014/204725 (PCTAJS2014/041803), WO 2014/204726 (PCT.AJS2014/041804), WO 2014/204727 (PCT/US2014/041806), WO 2014/204728 (PCT/US2014/041808), WO 2014/204729 (PCT/US2014/041809), WO 2015/089351 (PCT/US2014/069897), WO 2015/089354 (PCT/US2014/069902), WO 2015/089364 (PCT/US2014/069925), WO 2015/089427 (PCT7US2014/070068), WO 2015/089462 (PCT/US2014/070127), WO 2015/089419 (PCT/US2014/070057), WO 2015/089465 (PCT/US2014/070135), WO 2015/089486 (PCT/US2014/070175), PCT/US2015/051691, PCT/US2015/051830. Также упоминается предварительная патентная заявка США 61/758468; 61/802174; 61/806375; 61/814263; 61/819803 и 61/828130, поданная 30 января 2013 года; 15 марта 2013 года; 28 марта 2013 года; 20 апреля 2013 года; 6 мая 2013 года и 28 мая 2013 года соответственно. Также упоминается предварительная патентная заявка США 61/836123, поданная 17 июня 2013 года. См. Также дополнительные заявки на патент США 61/835931, 61/835936, 61/836127, 61/836101, 61/836080 и 61/835973, поданные 17 июня 2013 года. Дальнейшая ссылка делается на временные заявки на патент США 61/862468 и 61/862355, поданные 5 августа 2013 года, 61/871301, поданная 28 августа 2013 года, 61/960777, поданную 25 сентября 2013 года и 61/961980, поданную 28 октября 2013 года. Далее делается ссылка на: PCX/US2014/041803, PCT/US2014/041809, PCT/US2014/041804 и PCT/US2014/041806, каждый из которых подан 10 июня 2014 года; PCT/US2014/041808, поданную 11 июня 2014 года; и PCT/US2014/62558, поданную 28 октября 2014 года, и в патенты США №: 61/915148, 61/915150, 61/915153, 61/915203, 61/915251, 61/915301, 61/915267, 61/915260 и 61/915397, поданных 12 декабря 2013 года; 61/757972 и 61/768959, поданные 29 января 2013 года и 25 февраля 2013 года; 61/835936, 61/836127, 61/836101, 61/836080, 61/835973 и 61/835931, поданные 17 июня 2013 года; 62/010888 и 62/010879, поданные 11 июня 2014 года; 62/010329 и 62/010441, поданные 10 июня 2014 года; 61/939228 и 61/939242, каждая из которых была опубликована 12 февраля 2014 года, 61/980012, поданную 15 апреля 2010 года; 62/038358, поданную 17 августа 2014 года; 62/054490, 62/055484, 62/055460 и 62/055487, поданные 25 сентября 2014 года, и 62/069243, поданную 27 октября 2014 года. Ссылка делается на временную заявку США 61/930214, поданную 22 января 2014 года

[001300] Упоминается также заявка США 62/180 709, поданная 17 июня 2015 года, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); заявка США 62/091455, поданная 12 декабря 2014 года, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); заявка США 62/096708, поданная 24 декабря 2014 года, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); заявка США 62/091462, поданная 12 декабря 2014 года, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; заявка США 62/096324, поданная 23 декабря 2014 года, 62/180681, 17 июня 2015 года, и 62/237496, 5 октября 2015 года, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; заявка США 62/091456, 12 декабря 2014 года и 62/180692, 17 июля 2015 года, ESCORTED AND FUNCTIONALIZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS, заявка США 62/091461, 12 декабря 2014 года, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS (I ISC's); заявка США 62/094903, 19 декабря 2014 года, UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRAND BREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING; заявка США 62/096761, 24 декабря 2014 года, ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED ENZYME AND GUIDE FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; заявка США 62/087475, 4 декабря 2014 года, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; заявка США 62/055487, 25 сентября 2014 года, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; заявка США 62/087546, 4 декабря 2014 года, и 62/181687, MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYIFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; и заявка США 62/098285, 30 декабря 2014 года, CRISPR MEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS.

[001301] Упоминаются следующие заявки США 62/181659, 18 июня 2015 года, и 62/207318, 19 августа 2015 года, ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS, ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS OF CAS9 ORTHOLOGS AND VARIANTS FOR SEQUENCE MANIPULATION. Упоминаются заявки США 62/181675, 18 июня 2015 года и номер патентного реестра - 46783.01.2128, поданные 22 октября 2015 года, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, заявка США 62/232067, 24 сентября 2015 года, заявка США 62/205733, 16 августа 2015 года, заявка США 62/201542, 5 августа 2015 года, заявка США 62/193507, 16 июля 2015 года, и заявка США 62/181739, 18 июня 2015 года, каждая из которых озаглавлена NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, а также в заявке США 62/245270, 22 октября 2015 года, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS. Также упоминается заявка США 61/939256, 12 февраля 2014 года, и WO 2015/089473 (PCT/US2014/070152), 12 декабря 2014 года, каждая из которых озаглавлена ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED GUIDE COMPOSITIONS WITH NEW ARCHITECTURES FOR SEQUENCE MANIPULATION. Также упоминаются PCT.AJS2015/045504, 15 августа 2015 года, заявка США 62/180699, 17 июня 2015 года, и заявка США 62/038358, 17 августа 2014, каждая из которых озаглавлена GENOME EDITING USING CAS9 NICKASES.

[001302] Каждый из этих патентов, патентных публикаций и заявлений и всех документов, цитируемых в нем или во время их делопроизводства ("приложенные к делу документы"), и всех документов, цитируемых или упоминаемых в приведенных в данном приложении документах, вместе с любыми инструкциями, описаниями, спецификациями и технологическими картами продуктов для любых продуктов, упомянутых в нем или в любом документе и включенных в настоящее описание посредством ссылки, включены в настоящее описание в качестве ссылки и могут быть использованы в практике изобретения. Все документы (например, эти патенты, патентные публикации и заявки и приведенные в приложении документы) включены сюда путем отсылки так же как если бы каждый отдельный документ был специально и индивидуально указан для включения в качестве отсылки.

[001303] Кроме того, упоминается заявка PCT PCT/US14/70057, номер патентного реестра 47627.99.2060 и BI-2013/107, озаглавленная "DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS" (притязающая на приоритет по одной или более или всех предварительных заявок на патент США: 62/054490, поданная 24 сентября 2014 года, 62/010441, поданная 10 июня 2014 года, и 61/915118, 61/915215 и 61/915148, каждая из которых подана 12 декабря 2013 года) ("PCT для доставки частиц"), включенной в настоящее описание в качестве отсылки, в отношении способа получения sg-РНК и,tkrf Cas9, включающего смешивание смеси, содержащей sg-РНК и белок Cas9 (и необязательно матрицу HDR) со смесью, содержащей или состоящей только из или состоящей из поверхностно-активного вещества, фосфолипида, биоразлагаемого полимера, липопротеина и спирта; и частицы из такого процесса. Например, когда белок Cas9 и sg-РНК смешивали вместе при подходящем молярном соотношении, например, от 3:1 до 1:3 или от 2:1 до 1:2 или 1:1 при подходящей температуре, например 15-30°С, например, 20-25°C, например, комнатной температуре, в течение подходящего времени, например 15-45, например 30 минут, преимущественно в стерильном, свободном от нуклеазы буфере, например IX PBS. Отдельно компоненты частиц, такие как или содержащие: поверхностно-активное вещество, например, катионный липид, например, 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP); фосфолипид, например димиристоилфосфатидилхолин (DMPC); биодеградируемый полимер, такой как полимер этиленгликоля или PEG, или липопротеин, такой как липопротеин низкой плотности, например холестерин, были растворены в спирте, преимущественно C_1-6-алкиловом спирте, таком как метанол, этанол, изопропанол, например 100% этанол. Оба раствора смешивали вместе до образования частиц, содержащих комплексы Cas9-sg-РНК. Соответственно, sg-РНК может быть предварительно скомбинирована с белком Cas9 перед формированием всего комплекса в частице. Препараты могут быть получены с другим молярным соотношением различных компонентов, которые, как известно, способствуют доставке нуклеиновых кислот в клетки (например, 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP), 1,2-дитретраканоил-s-глицеро-3-фосфохолин (DMPC), полиэтиленгликоль (PEG) и холестерин). Например, vолярные соотношения DOTAP: DMPC: PEG: холестерина могут быть DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, холестерин 0; или DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, холестерин 0; или DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, холестерин 5. DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, холестерин 0. Настоящее описание соответственно охватывает смешение sg-РНК, белка Cas9 и компонентов, которые образуют частицу; а также частиц от такого смешивания. Варианты настоящего изобретения могут включать частицы; например, частицы, используемые в способе, аналогичном способу PCT доставки частиц, например, путем смешивания смеси, содержащей sg-РНК и/или Cas9, как в настоящем изобретении, и компонентов, которые образуют частицу, например, как в для PCT доставки частиц, образуют частицу и частицы из такой смеси (или, конечно, другие частицы, содержащие sg-РНК и/или Cas9, как в настоящем изобретении).

[001304] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах, которые приведены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом.

Пример 1: Происхождение и эволюция систем адаптивного иммунитета

[001305] Классификация и аннотация систем CRISPR-Cas в геномах архей и бактерий. Локусы CRISPR-Cas имеют более чем 50 семейств генов, при этом не существует строго универсальных генов, происходит быстрая эволюция и наблюдается значительное разнообразие архитектуры локусов. Поэтому не существует возможного древа и комплексный подход особенно необходим. Сейчас существует подробная идентификация cas-генов в рамках 395 профилей для 93 cas белков. Классификация включает профили экспрессии генов и профили архитектуры локусов

[001306] Последняя классификация систем CRISPR-Cas представлена на фиг.1. Класс l включает мультисубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cascade), а класс 2 включает односубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cas-9 типа). Фиг.2 представляет молекулярную организацию CRISPR-Cas. Фиг.3 демонстрирует структуры эффекторных комплексов I и III типов: они имеют общую структуру/ общую природу несмотря на значительные различия в последовательностях. Фиг.4 показывает CRISPR-Cas как систему, основанную на мотивах узнавания РНК (RRM). На фиг.5 представлена филогения cas1, где рекомбинация адаптационного и cr-РНК эффекторого модулей показывают основной аспект эволюции систем CRISPR-Cas. На фиг.6 представлен перечень систем CRISPR-Cas, в особенности распределение типов и подтипов CRISPR-Cas среди архей и бактерий.

[001307] Белок Сas1 не всегда связан только с системами CRISPR-Cas, поэтому возможно, что существуют две ветви отдельных "соло" Сas 1, что говорит о том, что возможны различия как в функционировании, так и в происхождении, а также возможно обнаружение новых мобильных элементов (см. Makarova, Krupovic, Koonin, Frontiers Genet 2014). Геномная организация трех семейств казпозонов может предоставить возможные ответы. Вдобавок к cas 1 и PolB, казпозоны имеют различные гены включая нуклеазы (Krupovic et al. BMC Biology 2014). Одно семейство имеет праймированную белком полимеразу, другое семейство имеет РНК-праймированную полимеразу. В добавок к представителям типов Euryarchaeota и Thaumarchaeota, казпозоны, обнаруженные в нескольких бактериях предполагают горизонтальный перенос генов. Казпозон Cas1 (транспозаза/интеграза) предполагает наличие общей базальной филогенетической группы в развитии Cas1.

[001308] Бактерии и археи используют CRISPR - систему для адаптивной иммунной защиты в клетках про- и эукариот посредством геномной манипуляции. Белок cas 1 представляет собой уже существующий способ геномной манипуляции. Существуют похожие механизмы интеграции в каcпозоны и CRISPR, в особенности репликационно-заваисимое приобретение посредством процессов копирования и вставки, а не вырезания и вставки (Krupovic et al. BMC Biology 2014). Cas1 - есть эталонный образец интегразы (Nunez JK, Lee AS, Engelman A, Doudna JA. Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity. Nature. 2015 Feb 18). Есть определенное сходство между терминальными обратными повторами каcпозонов и врожденным локусом иммунитета (Koonin, Kmpovic, Nature Rev Genet, 2015). Эволюция систем адаптивного иммунитета в прокариотах и животных возможно шла параллельными путями при помощи интеграции транспозонов в локусы врожденного иммунитета (Koonin, Krupovic, Nature Rev Genet, 2015). Транспозаза RAG1 (ключевой энзим V(D)J-рекомбинации позвоночных) возможно произошел из транспозонов класса Transib (Kapitonov VV, Jurka J.. RAG1 core and V(D)J recombination signal sequences were derived from Transib transposons.. PLoS Biol. 2005 Jun;3(6):el81), однако ни один из транспозонов класса Transibs не кодирует белок RAG2. RAG1 и RAG2 кодирующие транспозоны описаны в Kapitonov, Koonin, Biol Direct 2015 и филогения транспозазы класса Transib представлена в Kapitonov, Koonin, Biol Direct 2015. Защитное уничтожение ДНК в инфузориях эволюционировало из транспозона PiggyMAc, что вместе с РНК-i образуют врожденный иммунитет (Swart EC, Nowacki M. The eukaryotic way to defend and edit genomes by sRNA-targeted DNA deletion. Ann N Y Acad Sci. 2015).

[001309] Относительная стабильность классификации означает, что наиболее часто встречающиеся варианты CRISPR-Cas уже известны. Однако существование редких и до сих пор не включенных в классификацию вариантов также говорит о том, что дополнительные типы и подтипы все ждут своего описания (Makarova et al, 2015. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems and cas genes).

[001310] Транспозоны играют ключевую роль в эволюции адаптивного иммунитета и других систем, участвующих в изменении ДНК. Класс 1 CRISPR-Cas возник из транспозонов, однако это касается только адаптационного функционального модуля системы. Класс 2 CRISPR-Cas имеет и адаптационную и эффекторную функции, модули которых могут происходить из разных транспозонов.

Пример 2: Новые предсказанные системы CRISPR-Cas класса 2 и доказательства их независимого происхождения из транспозонов

[001311] Системы CRISPR-Cas адаптивного иммунитета бактерий и архей демонстрируют огромное разнообразие состава Cas белков, а также разновидной структурой геномных локусов. Однако эти системы разделяются в целом на два класса: класс 1, имеющий мульти-протеиновый (многоблоковый) эффекторный комплекс и Класс 2, где эффекторный комплекс состоит из одного большого белка (одноблоковый комплекс), например белка cas-9 (фиг.1А и 1В). Заявители разработали простую биоинформатическую методику (фиг.7) для обработки все время пополняемых геномных и метагеномных баз данных, сопровождающихся углублением понимания систем CRISPR-cas для поиска возможных кандидатов для системы CRISPR-Cas класса 2. Анализ базы данных полных (полностью отсеквенированных) геномов при помощи разработанной нами вычислительной методики привело к индентефикации трех новых вариантов, каждый из которых представлен в различных бактериях и имеет в своем составе гены cas1 и cas2, а также третий ген, кодирующий большой белок, который как предполагается функционирует как эффекторный модуль. В первом из этих локусов, возможный эффекторный белок (C2c1p) имеет похожий на RuvC науклеазный домен и напоминает ранее описанный белок Cpf1, предсказанный эффектор для типа V CRISPR -cas систем, соответственно новая предсказанная система классифицируется как подтип V-B. Всестороннее сравнение белковых последовательностей показало, что эффекторные белки Cas9 Cpf1 и C2Cip, содержащие домен RuvC, возникли из различных групп кодируемых транспозонами TnpB-белков. Вторая группа новых кандидатов для локусов CRISPR-Cas включает большой белок, содержащий два HEPN домена с предсказанной РНК-азной активностью. Учитывая новизну предсказанного эффекторного белка, эти локусы были причислены к новому VI типу CRISPR-Cas, который наиболее вероятно способен к нацеливанию на РНК. В целом, результаты анализа показывают, что системы CRISPR-Cas класса 2 возникли различными, часто не зависимыми друг от друга путями, путем соединения различных кодирующих Cas1-Cas2 адаптационных модулей с эффекторными белками, образованными от различных мобильных генетических элементов. Путь эволюции с наибольшей вероятностью привел к появлению различных вариантов систем класса 2, некоторые из которых еще не открыты.

[001312] Системы адаптивного иммунитета CRISPR-Cas присутствуют в геномах 45% бактерий и 90% архей и они демонстрируют значительное разнообразие в составе cas белков, их последовательности, а также архитектуры геномных локусов. Согласно архитектуре эффекторных комплексов cr-РНК, эти системы подразделяются на два класса: Класс 1 имеет мультисубъединичный эффекторный комплекс, а Класс 2 - единственный эффекторный белок (фиг.1A и 1B). Системы класса 1 встречаются намного чаще и более разнообразны, чем системы класса 2. В настоящей классификации Класс 1 представлен 12-ю отдельными подтипами, кодируемыми многочисленным геномами бактерий и архей, а то время как класс 2 включает 3 подтипа система 2 типа и возможный V тип, который в целом можно обнаружить в 10% отсеквенированных бактериальных геномах (вместе с единственным геномом архей включающим возможную систему данного типа). Системы класса 2 обычно содержат только три или четыре гена в опероне cas, а именно пару генов cas1 ~cas2, которые участвуют в адаптации, но не в интерференции, один многодоменный эффекторный белок, который отвечает за интерференцию, но также способствует процессингу и адаптации пре-cr-РНК. Также часто имеется и четвертый ген с еще неизвестными функциями, которые могут встречаться, по меньшей мере, в некоторых системах II типа. В большинстве случаев CRISPR кассета и ген для определенного типа РНК, известного как tracr-РНК (трансактивирующая небольшая cr-РНК), находятся рядом с оперонами класса 2 (Chylinski, 2014). Tracr-РНК частично гомологична повторам в соответствующей области CRISPR кассеты и имеет важное значение для процессинга пре-cr-РНК, которая катализируется RNAse III, распространенным ферментом бактерий, не связанным с локусами CRISPR-cas (Deltcheva, 2011)(Chylinski, 20I4;Chylinski, 2013).

[001313] Эффекторный белок второго типа систем CRISPR-Cas - Cas9 был изучен в мельчайших подробностях в отношении его функций и структуры. В различных бактериях, белки Cas9 включают от ~950 до более чем 1600 аминокислот, а размер варьируются от 950 до 1400 аминокислот. Он содержит два типа нуклеазных доменов, а именно RuvC подобный домен (РНК-аза H консервативный домен) и HNH (MrcA подобный консервативный домен) домен (Makarova, 2011). Кристаллическая структура cas9 показывает "двулопастную" организацию белка с явно выраженным участком узнавания и нуклеазной активности, при этом последний связывается и с RuvC и с HNH доменами (Nishimasu, 2014)(Jinek, 2014). Каждый из нуклеазных доменов Cas9 необходим для разрезания одной из цепочек ДНК-мишени (Jinek, 2012; Sapranauskas, 2011). Недавно было показано что Cas9 участвует во всех трех стадиях CRISPR иммунного ответа, то есть не только приводит к расщеплению ДНК-мишени (стадия интерференции) но также участвует в стадиях адаптации и процессинга пре-cr-РНК (Jinek, 2012). Более конкретно было показано, что определенный домен в участке, обладающем науклеазной активностью узнает и связывается с последовательностью, прилегающей к протоспейсеру (PAM) в вирусной ДНК на стадии адаптации (Nishimasu, 2014)(Jinek, 2014)(Heler, 2015; Wei, 2015). На стадии иммунного ответа CRISPR, Cas9 формирует комплекс с белками Cas l и Cas2, которые непосредственно участвуют в встраивании новых спейсеров во всех системах CRISPR-Cas (Heier, 2015; Wei, 2015).

[001314] Белок Cas9, соединенный с tracr-РНК недавно стал ключевым инструментом в создании нового поколения способов редактирования геномов и генной инженерии (Gasiunas, 2013; Mali, 2013; Sampson, 2014; Cong, 2015). Такая ценность Cas9 в генной инженерии основывается на том, что во втором типе CRISPR-Cas в отличие от других систем CRISPR-Cas все операции необходимые для узнавания ДНК-мишени и ее последующего расщепления сосредоточены в рамках одного, но большого мультидоменного белка. Эта особенность систем II типа значительно упрощает разработку эффективных инструментов манипуляции генома. Важно и то, что не все варианты cas9 похожи. На сегодняшний момент большая часть работы по искомому белку была выполнена на cas9 из Streptococcus pyogenes но и другие виды могут предложить существенные преимущества. Что касается рассматриваемого случая последние эксперименты с cas9, который на 300 аминокислот короче чем S. pyogenes позволили упаковать в адено-ассоциированный вирусный вектор, что привело к существенному улучшению возможностей использования системы CRISPR- Cas для редактирования генома in vivo (Ran, 2015).

[001315] Cистемы CRISPR-Cas второго типа в настоящее время подразделяются на три подтипа ((II-A, II-B и II-C) (Makarova, 2011) (Fonfara, 2014; Chylinski, 2013; Chylinski, 2014). Помимо генов cas1, cas2 и cas9, которые характерны для всех локусов II типа, подтип II-A характеризуется дополнительным геном, csn2, который кодирует инактивированную АТФазу (Nam, 2011, Koo, 2012, Lee, 2012), роль которой в приобретении новых спейсеров еще изучена слабо (Barrangou, 2007; Arslan, 2013) (Heler, 2015). В системах подтипа II-B отсутствует csn2, но вместо этого содержится ген cas4, который наоборот более типичен для систем типа I и кодирует 5'-3' экзонуклеазу семейства recB, которая способствует накоплению спейсеров путем генерации рекомбиногенных концов ДНК (Zhang, 2012) (Lemak, 2013, Lemak, 2014). Гены cas1 и cas2 подтипа II-B наиболее тесно связаны с соответствующими белками систем I типа CRISPR-Cas, что подразумевает рекомбинантное происхождение этого подтипа (Chylinski, 2014).

[001316] Подтип II-C систем CRISPR-Cas демонстрирует минимальное разнообразие и состоит только из генов Cas1, cas2 и cas9 (Chylinski, 2013; Koonin, 2013; Chylinski, 2014). Примечательно, однако, что в приобретении спейсера Campylobacter jejuni системами типа II-C требуется участие Cas4, кодируемого бактериофагом (Hooton, 2014). Другой отличительной особенностью подтипа II-C является образование некоторых cr-РНК посредством транскрипции, включая транскрипцию из внутренних альтернативных промоторов, что отличается от процессинга, наблюдаемого во всех других описанных экспериментально системах CRISPR-Cas (Zhang, 2013).

[001317] Cуществование типа V систем CRISPR-Cas было недавно предсказано путем сравнительного анализа бактериальных геномов. Эти предполагаемые новые системы CRISPR-Cas представлены в нескольких бактериальных геномах, в частности, из рода Francisella и одной археи Methanomethylophilus alvus (Vestergaard, 2014). Все предполагаемые локусы типа V включают Cas1, cas2, отдельный ген, обозначенный как cpf1, и CRISPR кассету (Schunder, 20I3) (Макарова, 2015). Cpf1 представляет собой большой белок (приблизительно 1300 аминокислот), который содержит RuvC-подобный нуклеазный домен, гомологичный соответствующему домену Cas9, а также аналог типичного богатого аргинином кластера Cas9. Однако Cpf1 не обладает нуклеазным доменом HNH, который присутствует во всех белках Cas9, и RuvC-подобный домен является прилегает к последовательности Cpf1, в отличие от Cas9, где он содержит длинные вставки, включая домен HNH (Chylinski, 2014; Makarova, 2015). Эти основные отличия в доменных архитектурах Cas9 и Cpf1 предполагают, что системы содержащие Cpf1, следует классифицировать как новый тип. Состав предполагаемых систем типа V подразумевает, что Cpf1 представляет собой одноблоковый эффекторный комплекс, и, соответственно, эти системы относятся ко второму классу систем CRISPR-Cas. Некоторые из предполагаемых локусов типа V кодируют Cas4 и соответственно напоминают подтипы П-В локусов, тогда как другие не имеют Cas4 и, следовательно, аналогичны подтипу II-C.

[001318] Недавно было показано, что самыми близкими гомологами белков Cas9 и Cpf1 являются белки TnpB, которые кодируются транспозонами семейства IS605 и содержат RuvC-подобный нуклеазный домен, а также домен цинкового пальца, который имеет аналог в Cpf1. Кроме того, были идентифицированы гомологи TnpB, которые содержат домен HNH, вставленный в RuvC-подобный домен и показывающий высокое сходство последовательностей с Cas9. Роль TnpB в транспозонах остается неопределенной, поскольку было показано, что этот белок не требуется для транспозиции.

[001319] Учитывая гомологию Cas9 и Cpf1 и белков, кодируемых транспозонами, заявители предположили, что системы CRISPR-Cas класса 2 могут возникать многократно в результате рекомбинации между транспозоном и локусом Cas1-cas2. Соответственно, заявители разработали простую вычислительную стратегию для идентификации геномных локусов, которые могут быть кандидатами для вариантов второго класса. Настоящей заявкой Заявители описывают первое применение этого подхода, в результате которого идентифицируются три группы таких кандидатов, два из которых кажутся принадлежащими к различным подтипам типа V, тогда как третий, по-видимому, подходит к VI типу. Новые варианты систем CRISPR-Cas класса 2 представляют очевидный интерес так как могут быть использованы в качестве инструментов для редактирования и регуляции экспрессии.

[001320]Стратегия поиска по базам данных для обнаружения новых кандидатов для CRISPR-Cas локуса класса 2. Заявители использовали простой биоинформатический подход для обнаружения новых претендентов для систем CRISPR-Cas класса 2 (фиг.7. схема). Поскольку подавляющее большинство локусов CRISPR-Cas включает ген cas1 (Makarova, 2011, Makarova, 2015) а последовательность Cas1 является наиболее консервативной для всех белков Cas (Takeuchi, 2012), Заявители предположили, что cas1 является лучшей из возможных зацепок для определения и поиска возможных новых локусов при помощи PSI-BLAST. После обнаружения всех контигов, кодирующих Cas1, путем поиска следующих баз данных WGS (содержащий весь геном) и NT (нуклеотидных) в NCBI, кодирующие белок гены были предсказаны с использованием GenemarkS в районе 20 т.п.н. вышележащих и нижележащих последовательностей от гена Cas1. Эти предсказанные гены были аннотированы с использованием профилей по базе данных NCBI Conserved Domain Database (CDD) и специфических Cas-белковых профилей (Makarova et al., 2015, Nat Rev Microbiol. 2015, doi: 10.1038/nrmiero3569), а CRISPR кассеты были предсказаны с использованием программы PILER- CR. Эта процедура дала возможность определения обнаруженных локусов CRISPR-Cas в рамках уже известных подтипов. Частичные и/или не поддающиеся классификации возможные локусы CRISPR-Cas, содержащие большие (> 500 ак) белки, были выбраны в качестве возможных кандидатов для новых систем класса 2 основываясь на характерном присутствии таких больших одноблоковых эффекторных белков в системах типов II и V (Cas9 и Cpf1, соответственно). Все 63 возможных локуса, обнаруженные с использованием этих критериев (перечислены в таблице, представленной на фиг.40A-D), анализировались далее каждый в отдельности с использованием программ PSI-BLAST и HHpred. Последовательности белка, кодированные в локусах-кандидатах, далее использовались в качестве запроса для поиска метагеномных баз данных для дополнительных гомологов, при этом обнаруженные длинные контиги анализировались, как указано выше. В этом вычислительном конвейере было получено в общей сложности 53 новых локуса (некоторые из первоначально идентифицированных 63 локусов-кандидатов были отброшены как ложные, в то время как несколько неполных локусов с отсутствующим cas1 были добавлены) с характерными особенностями CRISPR-Cas, систем класса 2 которые, основываясь на природе предсказанных эффекторных белков, могли бы быть классифицированы на три группы локусов (см. Фиг.8А и 8В, фиг.9, 14 и 15 и фиг.41А-В, 42А-В и 43А-В) Хотя и бактериофаги, заражающие бактерии, которые могли бы иметь недавно открытые системы CRISPR-Cas класса 2, на практике неизвестны, для каждой из этих систем авторы изобретения обнаружили спейсеры, которые соответствуют фагам или предсказанным профагам.

[001321] Используя вышеописанную вычислительную стратегию, Заявители обнаружили три новые системы CRISPR-Cas класса 2, а именно C2e1 и C2c3, которые классифицируются как подтипы ранее описанного предполагаемого типа V и C2c2, который Заявители приписывают новому предполагаемому VI типу. Заявители представляют несколько стратегий доказательства того, что эти локусы кодируют функциональные системы CRISPR-Cas. Основываясь на сравнении геномов, авторы изобретения определили фаго-специфические спейсеры для каждой из трех предполагаемых новых систем, а также показали, что наборы спейсеров полностью различаются даже в близкородственных бактериальных геномах, что указывает на активный, функционирующий иммунитет. Многие из этих новых систем встречаются в бактериальных геномах, которые не содержат других локусов CRISPR-Cas, что говорит о том, что системы типа V и типа VI могут функционировать автономно. Более того, даже когда другие системы CRISPR-Cas были идентифицированы в одних и тех же геномах, ассоциированные повторяющиеся структуры были явно отличны от других типов в типах V и VI, что свидетельствует об их независимой функциональности.

[001322] Предполагаемая система типа V-B. Первая группа возможных локусов, условно обозначенная как C2c1 (класс 2, кандидат 1), представлена в бактериальных геномах четырех основных таксонов, включая Bacilli, Verrucomicrobia, альфа-протеобактерии и дельта-протеобактерии (фиг.8A-B "Организация полных локусов систем класса 2" фиг.41А-В). Все локусы C2c1 кодируют слитый белок Cas1-Cas4, Cas2 и большой белок, обозначаемый Заявителями как C2c1p и, как правило, находятся рядом с CRISPR кассетой (фиг.9, окрестности C2c1, фиг.41A-B). В филогенетическом дереве Cas1, соответствующий белковый кластер соединяется с системой типа I-U (фиг.10A и 10B, фиг.10C-W, дерево Cas1) и является единственным, в котором обнаружено слияние Cas1-Cas4. Длина белков C2c1p, идентифицированных здесь, варьируется 1100 до 1500 аминокислот, например, может состоять примерно из 1200 аминокислот. HHpred поиск обнаруживает значительное сходство между С-концевой частью белков C2c1p и подмножеством белков TnpB закодированных в транспозонах семейства IS6G5 (фиг.13А и 13С). Напротив, не было обнаружено никакого существенного сходства между C2c1p и Cas9 или Cpf1, которые аналогичны другим группам белков TnpB (Chylinski, 2014) (Makarova, 2015; Makarova, 2015). Таким образом, доменная архитектура C2c1p аналогична домену Cpf1 и отличается от архитектуры Cas9 (фиг.13A), хотя все три белка Cas, по-видимому, эволюционировали из семейства TnpB (фиг.11 "Организация домена семейств 2-го класса"; фиг.13А). N-концевая область C2c1p не имеет существенного сходства с другими белками. Прогнозирование вторичной структуры указывает на то, что этот регион принимает преимущественно альфа-спиральную конформацию. Два сегмента сходства с TnpB охватывают три каталитических мотива типа нуклеазы, подобной RuvC, с диагностической сигнатурой D..E..D каталитических аминокислотных остатков (Aravind et al, 2000, Nucleic Acids Res, том 28, 3417-3432) (фиг.12, "Области гомологии TnpB в белках класса 2"); область, соответствующая мостиковой спирали (также известная как богатый аргинином кластер), который в белке Cas9 участвует в связывании cr-РНК; и небольшую область, которая, по-видимому, является аналогом цинкового пальца TnpB (однако в большинстве белков C2c1 отсутствуют Zn-связывающие цистеиновые остатки, что указывает на то, что такие белки не связывают цинк, более того, C2c1 содержит множественные вставки и делеции в этой области, что указывает на функциональную дивергенцию (фиг.13А,фиг.13D-H,фиг.131). Сохранение каталитических остатков (фиг.13А) явно указывает на то, что гомологичные домены RuvC всех этих белков являются активными нуклеазами. N-концевые области C2c1 не показывают значительного сходства с любыми известными белками. Предсказание вторичной структуры показывают, что N-концевые области белков C2c1 принимают смешанную α/β-конформацию (фиг.13D-H,фиг.1 131). Сходство доменных архитектур C2c1p и Cpf1 предполагает, что локусы C2c1 лучше всего классифицировать как подтип VB, при этом локусы кодирующие Cpf1 - как подтип VA.

[001323] Несмотря на то, что гены cas1, связанные с этой системой, очень похожи, повторы CRISPR в соответствующих кассетах являются сильно гетерогенными, хотя все они имеют длину 36-37 п. н. и могут быть классифицированы как неструктурированные (энергия фолдинга AG составляет -0,5-4,5 ккал/моль, тогда как высоко палиндромная CRISPR имеют АГ ниже -7 ккал/моль). Согласно схеме CRISPR (Lange, 2013) несколько повторов V-B подтипа имеют некоторую последовательность или структурное сходство с повторами II типа (фиг.41А-Т). Однако большинство повторов нельзя было отнести к известным семействам последовательностей или структур они могут быть отнесены к четырем из 6 суперклассов.

[001324] Рассматривая возможность того, что предположительные CRISPR-Cas подтипа V-B структурно аналогичны системам II типа, Заявители предприняли попытку идентифицировать tracr-РНК в соответствующих геномных локусах.

[001325] Сравнение спейсеров CRISPR кассет типа V-B с небезызбыточной базой данных нуклеотидных последовательностей привело к обнаружению нескольких совпадений с различными бактериальными геномами. В частности, один из спейсеров из Alicyclobacillus acidoterrestris и один из спейсеров от Brevibacillus agri соответствовали неопределенным генам в пределах прогнозируемых профагов, интегрированных в соответствующие бактериальные геномы (фиг.41А-L).

[001326] Предполагаемые системы типа VI. Вторая группа потенциальных локусов CRISPR-Cas, обозначенная как C2c2 (класса 2, кандидат 2), была обнаружена в геномах 5 основных бактериальных таксонов, включая альфа-протеобактерии, бациллы, клостридии, фузобактерии и бактероиды (фиг.8А-В. "Организация полных локусов систем 2 класса" на фиг.42А-В). Определенное число локусов C2c2 включают cas1 и cas2 гены, а также большой белок (C2c2p), который не демонстрирует сходства последовательностей с C2c1, Cpf1 или Cas9 и CRISPR кассетой; однако, в отличие от C2c1, C2c2p часто кодируется рядом с CRISPR кассетой, но не Cas1-cas2 (фиг.15, окрестности C2c2, фиг.42A-B). Хотя в вычислительной стратегии авторов изобретения изначально идентифицированные локусы C2c2 охватывали гены cas1 и cas2, последующие поиски показали, что большинство таких локусов может состоять только из гена c2c2 и CRISPR-кассеты. Такие, по-видимому, неполные локусы могут либо кодировать дефектные системы CRISPR-Cas, либо могут функционировать в купе с адаптационным модулем, закодированным в ином месте генома, как это было, к примеру обнаружено для некоторых систем типа III (Majumdar et al., 2015, RNA, vol. 21, 1147- 1158). В филогенетическом дереве Cas1 белки Cas1 из локусов C2c2 распределены среди двух клад. Первая клада включает Cas1 от Clostridia и расположена в поддереве II типа вместе с небольшой ветвью типа III-А (фиг.10А и 10B, фиг.10C-V, дерево Cas1). Второй клад состоит из белков Cas1 из локусов C2c2 Leptotrichia и расположен внутри смешанной ветви, которая в основном содержит белки Cas1 из систем CRISPR-Cas типа III-A. Поиск по базе данных с использованием HHpred и PSI-BLAST не обнаружил сходства последовательностей между C2c2p и другими белками. Тем не менее, проверка множественных выравниваний белковых последовательностей C2c2p привела к идентификации двух строго консервативных мотивов RxxxxH, которые характерны для доменов HEPN (нуклеотид-связывающий участок высших эукариотических и прокариотических организмов) (Anantharaman et al., 2013, Biol Direct, том 8, 15, Grynberg et al., 2003, Trends in biochemical sciences, vol 28, 224-226) (фиг.11 и фиг.13В, фиг.13J-N). Предсказание вторичной структуры белка указывает на то, что эти мотивы находятся в структурных контекстах, совместимых с доменной структурой HEPN, также как и в целом предсказание вторичной структуры для соответствующих части C2c2p. Домены HEPN представляют собой небольшие (-150 а/к) альфа-спиральные домены с различными последовательностями, но с крайне консервативными каталитическими мотивами, для которых была показана или предсказана РНК-азная активность, а также, что они часто связаны с различными системами защиты (Anantharaman, 2013) (фиг.13B и 16, Мотив HEPN RxxxxH в семействе C2c2). Последовательности доменов HEPN мало консервативны, за исключением каталитического мотива RxxxxH. Хотя последовательности двух предполагаемых HEPN-доменов C2c2 мало похожи на другие HEPN-домены, за исключением каталитических мотивов RxxxxH, тип домена в значительной степени подкрепляется предсказанием вторичной структуры, которые указывают на то, что каждый мотив находится в рамках совместимых структурных контекстов (фиг.13B, фиг.13J-N). Кроме того, предсказанная вторичная структура всей последовательности для каждого предполагаемого домена также согласуется с укладкой домена HEPN (фиг.13J-N). Таким образом, представляется вероятным, что C2c2p содержит два активных домена HEPN. Домен HEPN не является новым для систем CRISPR-Cas, поскольку он часто ассоциирован с доменом CARF (CRISPR-Associated Rossmann Fold) в белках Csm6 и Csx1, которые присутствуют во многих системах CRISPR-Cas типа III (Makarova, 2014). Эти белки не относятся ни к адаптационным модулям, ни к эффекторным комплексам, но предполагается, что они способны выполнять некоторые вспомогательные, но еще не охарактеризованные функции в родственных системах CRISPR, а именно, они могут быть компонентами связанного модуля иммунитета, который присутствует в большинстве систем CRISPR-Cas, и работает при запрограммированной гибели клеток (апоптозе), а также выполняет регулятивные функции во время CRISPR ответа (Koonin, 2013; Makarova, 2012; Makarova, 2013). Однако C2c2p отличается от Csmo и Csx1 тем, что этот больший белок является единственным общим белком, кодируемым в локусах C2c2, за исключением Cas1 и Cas2. Таким образом, представляется вероятным, что C2c2p является эффектором в предполагаемых новых системах CRISPR-Cas, а HEPN-домены соответственно являются их каталитическими остатками. Вне предсказанных доменов HEPN последовательность C2c2p не обнаруживала сходства с другими белками и, согласно прогнозам, принимала смешанную альфа/бета вторичную структуру без заметного сходства с любыми известными способами фолдинга белка (фиг.13J-N).

[001327] Кассеты CRISPR в локусах C2c2 весьма неоднородны, с длиной от 35 до 39 п.н. и неструктурированны (энергия фолдинга от -0,9 до 4,7 ккал/моль). Согласно картированию CRISPR (Lange, 2013), эти CRISPR не принадлежат ни к одному из установленных структурных классов и относятся к 3 из 6 суперклассов. Только CRISPR от Listeria seeligeri можно было приписать семейству последовательностей номер 24, которое обычно ассоциировано с системами типа II-C (фиг.42A-L).

[001328] Aнализ спейсеров локусов C2c2 идентифицировал одну 30 нуклеотидную область, идентичную геномной последовательности Listeria weihenstephanensis, и два неполных совпадения с геномами бактериофагов, в частности, спейсер из Listeria weihenstephanensis совпадал с хвостовым геном бактериофага Listeria (фиг.42A-L).

[001329] Учитывая уникальность предсказанного эффекторного комплекса C2c2, эти системы могут быть классифицированы как предположительный тип VI систем CRISPR-Cas. Более того, поскольку все экспериментально охарактеризованные и ферментативно активные HEPN-домены являются РНК-азами, системы типа VI вероятно, действуют на уровне РНК, таких как мРНК,

[001330] Предполагаемые системы типа V-С. Третья группа локусов-кандидатов включает исключительно метагеномные последовательности и, следовательно, не может быть отнесена к конкретным таксонам. Эти локусы включают только два кодирующих белок гена, которые кодируют Cas1 и большой белок, обозначенный C2c3 (класса 3, кандидат 3) (фиг.8A "Организация полных локусов систем 2 класса"; фиг.14, окрестности C2c3, фиг.44A-Б). Белки C2c3 находятся в том же диапазоне размеров, что и Cpf1 и C2c1, и аналогично содержат TnpB-гомологичный домен на своих C-концах, который, в отличие от соответствующего домена C2c1, продемонстрировал ограниченное, но значительное сходство с Cpf1 (фиг.13А и 13С). Области гомологичности TnpB C2c3 содержат три каталитических мотива типа RuvC-подобной нуклеазы, с диагностической триадой D..E..D каталитических аминокислотных остатков (Aravind et al., 2000, выше), область, соответствующую мостиковой спирали (также известную как богатый аргинином кластер), который участвует в cr-РНК-связывании в Cas9, и небольшую область, которая представляется соответствующей "цинковому пальцу" TnpB (Zn-связывающие остатки цистеина сохраняются в C2c3). Сохранение каталитических остатков явно свидетельствует о том, что гомологичные домены RuvC всех этих белков являются активными нуклеазами. N-концевые области C2c1 и C2c3 не демонстрируют существенного сходства друг с другом или с любыми известными белками. Предсказание вторичной структуры показывает, что N-концевые области белков C2c3 принимают смешанную конформацию cx/j3. Таким образом, общие архитектуры доменов C2c1 и C2c3 и, в частности, организация домена RuvC аналогичны областям Cpf1, но отличаются от архитектуры Cas9. Это говорит о том, что локусы C2c1 и C2c3 правильнее классифицировать как подтипы V-B (см. выше) и V-C, соответственно, с локусами кодирующими Cpf1 на настоящий момент обозначенными подтипом V-A,

[001331] Среди c2c3 локусов только один содержит CRISPR кассету с нехарактерно короткими спейсерами длиной 17-18 нуклеотидов. Повторы в кассетах имеют длину 25 п.н. и оказывается, что они неструктурированные и имеют энергию 1,6 ккал/моль (фиг.43A-F).

[001332] Спейсеры из единственного континга C2c3, содержащего CRISPR кассету, слишком коротки, чтобы иметь статистически значимые совпадения. Тем не менее, было обнаружено несколько совпадений с последовательностями из предсказанных профагов (Фиг.43 A-F).

[001333] Подтипы белков TnpB имеющие значительное сходство с известным (Cas9) и тремя описанными здесь предполагаемыми эффекторами класса 2 (Cpf1, C2c1 и C2c3) не совпадали (фиг.13А и 13С). Хотя расхождение в последовательности TnpB-подобных доменов слишком велико для обеспечения надежного филогенетического анализа, эти данные свидетельствуют о том, что четыре известных в настоящее время больших эффекторных белка класса 2, Cas9, Cpf1, C2c1 и C2c3 развивались независимо от генов различных мобильных генетических элементов.

[001334] Хотя большинство спейсеров в новых локусах CRISPR-Cas, описанных в настоящем описании, не были в значительной степени похожи на любые доступные последовательности, существование спейсеров, совпадающих с геномом фага, подразумевает, что эти локусы могут кодировать активные функциональные адаптивные системы иммунитета. Малая доля фаго-специфических спейсеров типична для систем CRISPR-Cas и, скорее всего, указывает на их динамическую эволюцию и малую долю вирусного разнообразия, которая представлена в современных базах данных последовательностей. Эта интерпретация соотносится с наблюдением, что близкородственные бактериальные штаммы, кодирующие гомологичные локусы CRISPR-Cas, обычно содержат несвязанные коллекции спейсеров, примером которых являются локусы C2c2 из Listeria weihemtephanensis и Listeria newyorkensis (фиг.45А-С).

[001335] Заявители применили простую и понятную вычислительную стратегию для прогнозирования новых CRISPR-cas систем класса 2. Ранее описанные системы класса 2, а именно тип II и предполагаемый тип V, состояли из генов cas1 и cas2 (а в некоторых случаях и cas4), содержащих адаптационный модуль и один большой белок, который составляет эффекторный модуль. Поэтому заявители предположили, что любой геномный локус, содержащий cas1 и большой белок, может быть потенциальным кандидатом на новую систему класса 2 и заслуживает тщательного исследования. Такой анализ с использованием чувствительных способов сравнения белковых последовательностей привел к идентификации трех наиболее вероятных кандидатов, два из которых являются отдельными подтипами ранее описанного предполагаемого типа V (подтипы VB и VC), тогда как третий может быть классифицирован как новый предполагаемый тип VI, в силу наличия нового предсказанного эффекторного белка. Многие из этих новых систем встречаются в бактериальных геномах, которые не содержат других локусов CRISPR-Cas (фиг.44А-E), что указывает на возможность автономного функционирования систем типа V и типа VI. Рассматриваемые в настоящем описании локусы-кандидаты были проверены с помощью функциональных способов, которые выявили экспрессию и процессинг соответствующих CRISPR-кассет, производящих зрелые cr-РНК, определили предполагаемую tracr-РНК (где возможно), продемонстрировали интерференцию при экспрессии в E.coli, определили PAM и выявили минимальные компонентов, необходимые для расщепления лизата.

[001336] Системы типа V кодируют предсказанные эффекторные белки, которые по общей доменной архитектуре напоминают Cas9, но, в отличие от Cas9, RuvC-подобные домены Cpf1, C2c1 и C2c3 являются соседними и не имеют вставок, характерных для Cas9, в частности домена нуклеазы HNH. Наличие одного вместо двух доменов нуклеазы указывает на то, что эффекторные белки типа V механически отличаются от Cas9, в которых домены HNH и RuvC отвечают за расщепление комплементарных и не комплементарных цепей ДНК-мишени соответственно (Chen et al., 2014, The Journal of biological chemistry7, vol. 289, 13284- 13294, Gasiunas et al., 2012, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 109, E2579-2586; Jinek et al., 2012, Science, vol. 337, 816-821). Предсказанные белки-эффекторы типа V могут образовывать димеры, в которых два домена, подобные RuvC, могут расщеплять противоположные цепи молекулы-мишени.

[001337] В основе предполагаемых систем CRISPR-Cas типа VI по-видимому лежит новый эффекторный белок, который содержит два предсказанных домена HEPN, которые, подобно ранее характеризованным доменам HEPN, могут обладать РНК-азной активностью, что системы типа VI могут быть нацелены на и расщеплять мРНК. Ранее сообщалось о нацеливании на мРНК для некоторых систем типа CRISPR-Cas типа III (Hale et al., 2014, Genes Dev, том 28, 2432-2443, Hale et al, 2009, Cell, vol. 139, 945-956, Peng et al., 2015, Nucleic acid research, vol. 43, 406-417). Альтернативная возможность заключается в том, что C2c2 является первой ДНК-азой в суперсемействе HEPN, возможно, с двумя доменами HEPN, каждый из которых расщепляет одну цепь ДНК. Таким образом, кажется возможным преобразование C2c1 и C2c2 в инструменты редактирования генома с различными классами целей.

[001338] Чтобы проверить функциональность этих систем CRISPR-Cas класса 2, заявители показали, что две C2c1 CRISPR-кассеты экспрессируются, процессируются в зрелые cr-РНК и способны к интерференции в случае экспрессии в E. coli. Эти эксперименты выявили более характеристик локуса C2c'l, включая: (i) процессируемые прямые повторы (DR) на 5'-конце cr-РНК, (ii) 5' PAM и (iii) наличие короткой РНК с гомологией повтор-антиповтор по отношению к процессируемому 5' DR, то есть предполагаемая tracr-РНК. Открытие процессируемых DR на 5'-конце cr-РНК и 5' PAM поддерживает такое развитие событий при котором C2c1 происходит из систем класса 1, потому что эти системы демонстрируют процессинг 5'-концов (I типа и III типа) и 5'-концевой последовательности PAM (I типа) (Mojica et al., 2009, Microbiology, vol. 155, 733-740; Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbioln, т. 9, 467-477). В данном случае для С2с1 идентифицирована AT-богатая последовательность PAM, в противоположность ГЦ-богатым последовательностям PAM хорошо охарактеризованных систем II класса. Для локусов C2c1, охарактеризованных в настоящем описании экспериментально, Заявители определили cr-РНК, которые обрабатываются до длины, при которой сохраняется возможность к связыванию и кофолдингу с предполагаемыми tracr-РНКs, что указывает на то, что tracr-РНКs могут быть вовлечены и, возможно, даже необходимы для образования комплексов. Затем авторы изобретения использовали экспрессию C2c1 в культуре клеток человека для экспериментальной верификации того, что в этих условиях участвовала tracr-РНК и была необходима для in vitro расщепления ДНК-мишени конкретной исследуемой нуклеазой C2c1.

[001339] Заявители также показали, что, когда C2c2 локус из L.seeligeri экспрессируется в E.coli, он процессируется в cr-РНК с прямым повтором (DR) на 5'-конце 29 нуклеотидов длиной, похожие результаты были получены для локуса C2c2 из L.shahii. В этом случае, вырожденный повтор находится в начале последовательности, а не в конце, как это типично для большинства CRISPR-последовательностей, и последовательность и гены cas транскрибируются сонаправленно. Заявители не обнаружили предполагаемую tracr-РНК в данных секвенирования РНК C2c2 РНК. Однако прогнозируемая вторичная структура прямого повтора (DR) 29 нуклеотидов длиной показывает стабильную "шпильку", которая может быть потенциально важной для образования комплекса с эффекторным белком C2c2.

[001340] В сочетании с результатами предыдущих анализов, (Chylinski, 2014; Makarova, 2011), идентификация новых систем CRISPR-Cas класса 2 обнаруживает главную тенденцию в развитии систем CRISPR-Cas класса 2. Эффекторные белки двух или трех типов в этом классе, по-видимому, эволюционировали из пула мобильные генетических элементов, которые кодируют белки TnpB, содержащие RuvC-подобный домен. Последовательности RuvC-подобных доменов TnpB и гомологичных доменов эффекторных белков класса 2 слишком сильно дивергировали для надежного филогенетического анализа. Тем не менее, для Cas9, эффекторного белка системы II Типа, специфичная группа предков, по-видимому, легко идентифицируется, а именно семейство TnpB-подобных белков, особенно обильных в цианобактериях, которые показывают относительно высокое сходство с Cas9 и разделяют с Cas9 всю доменную архитектуру, а именно RuvC-подобные домены, нуклеазные домены HNH и богатую аргинином мостиковую спираль (Chylinski, 2014) (Рисунок 11, Фиг.13A и 13B, "Доменная организация семейств 2 класса"; Рисунок 12, Фиг.13A и 13B, "области гомологии TnpB в белках 2 класса"). В отличии от Cas9, невозможно отнести Cpf1, C2c1, и C2c3 к определенному семейству, несмотря на сохранение всех мотивов, сконцентрированных в каталитических остатках RuvC-подобных нуклеаз, эти белки показывают только ограниченное сходство с родовыми профилями TnpB. Однако, учитывая, что C2сlp не показывает обнаружимого сходства последовательностей с Cpf1, что Cpf1, C2c1, и C2c3 содержат различные вставки между мотивами RuvC и явно неродственными N-концевыми областями, наиболее вероятно, что Cpf1, C2c1, и C2c3 возникли независимо из различных семейств в пуле кодирующих элементов TnpB.

[001341] Любопытно, что белки TnpB, во-видимому, "предопределены" для использования в эффекторных комплексах систем CRISPR-Cas класса 2, так что они, по-видимому, были рекрутированы во множестве разных случаев. По-видимому, такая полезность белков TnpB связана с их предсказанной способностью разрезать одноцепочечную ДНК, будучи связанными с молекулой РНК через R-богатую мостиковую спираль, которая, как это было показано, в Cas9 связывает cr-РНК (Jinek, 2014; Nishimasu, 2014; Anders et al., 2014, Nature, vol. 513, 569-573). Функции TnpB в жизненных циклах соответствующих транспозонов плохо изучены. Эти белки не нужны для транспозиции, и в одном случае было показано, что белок TnpB снижает транспозицию (Pasternak, 2013), но их механизм действия остается неизвестным. Экспериментальное исследование TnpB, вероятно, прольет свет на механические аспекты систем CRISPR-Cas класса 2. Стоит отметить, что механизмы Cpf1 и C2c1 могут быть похожими друг на друга, но они существенно отличаются от Cas9, так как в первых двух белках отсутствует домен HNH, который в Cas9 отвечает за разрыв одной из цепей ДНК-мишени (Gasiunas, 2012)(Jinek, 2012)(Chen, 2014). Соответственно, использование Cpf1 и C2c1 может привести к дополнительным возможностям редактирования генома.

[001342] С точки зрения эволюции поразительно, что системы CRISPR-Cas класса 2, по-видимому, полностью произошли из различных мобильных генетических элементов, учитывая недавние данные о вероятном возникновении генов cas1 из отдельного семейства транспозонов (Koonin, 2015, Krupovic, 2014). Более того, вероятное независимое происхождение эффекторных белков из разных семейств TnpB, наряду с различной филогенетической близостью соответствующих cas1 белков, настоятельно свидетельствует о том, что системы класса 2 развивались неоднократно посредством сочетания различных адаптационных модулей и полученных из транспозонов нуклеаз, что привело к появлению эффекторных белков. Этот способ эволюции, по-видимому, является окончательным проявлением модульности, характерной для эволюции системы CRISPR-Cas (Makarova, 2015), что подразумевает, что в природе могут существовать дополнительные комбинации адаптационного и эффекторного модулей.

[001343] Предсказанные системы CRISPR-Cas типа VI содержат предсказанный эффекторный белок, в составе которого присутствуют два предсказанных домена HEPN, которые, вероятно, обладают РНК-азной активностью. Эти домены HEPN не являются частями эффекторных комплексов в других системах CRISPR-Cas, но задействованы в осуществления различных защитных функций, включая прогнозируемую вспомогательную роль (Anantharaman, 2013) (Makarova, 2015) в различных системах CRISPR Cas. Присутствие HEPN-доменов в качестве каталитических единиц предсказанного эффекторного модуля подразумевает, что системы типа VI нацеливаются на и расщепляют мРНК. Ранее для систем CRISPR-Cas III Типа уже сообщалось о нацеливании на мРНК (Hale, 2014; Hale, 2009) (Peng, 2015). Несмотря на то, что домены HEPN до сих пор не были обнаружены в настоящих транспозонах, они характеризуются высокой горизонтальной подвижностью и являются неотъемлемой частью мобильных элементов, таких как системы токсин-антитоксин (Anantharaman, 2013). Таким образом, предполагаемые системы типа VI, похоже, соответствуют общей парадигме модульной эволюции CRISPR-Cas класса 2 от мобильных элементов, и ожидается, что новые варианты и новые типы систем будут обнаружены путем анализа данных геномики и метагеномики. Учитывая, что белок C2c2 не связан с другими эффекторами класса 2 (все они содержат RuvC-подобные домены, даже при условии, отдаленного родства), открытие типа VI можно считать подтверждением независимого происхождения других вариантов класса 2.

[001344] Учитывая вырисовывающийся сценарий эволюции систем класса 2 из мобильных элементов, представляется полезным изучить общую эволюцию локусов CRISPR-Cas и, в частности, вклад мобильных элементов в этот процесс (фиг.53). Предшественники адаптивной иммунной системы, скорее всего, возникли из-за вставки каспозона (транспозона, кодирующего Cas), примыкающего к локусу, который кодировал примитивную систему врожденного иммунитета (iKoonin и Krupovic, 2015, Nature reviews Genetics, vol. 16, 184-192; Krupovic et al., 2014, BMC Biology, vol. 12, 36). Важным результатом было также включение системы токсин-антитоксин, которая передавала ген cas2 и могла появиться либо в предковом каспазоне, либо в изменяющемся локусе адаптивного иммунитета (фиг.51).

[001345] Учитывая чрезвычайно широкое распространение систем класса 1 в археях и бактериях и распространение в них древних доменов RRM (мотив распознавания РНК, RNA Recognition Motif - RRM), не возникает сомнений, что предковая система принадлежала к классу 1 (фиг.51). Скорее всего, предковая архитектура напоминала существующий тип III и включала ферментативно активный белок Cas10 (Makarova et al, 2011, Biol Direct, том 6, 38; Makarova et al, 2013, Biochem Soc Trans, том 41, 1392-1400). Белок Cas10 представляет собой гомолог ДНК-полимераз семейства В и нуклеотидных циклаз семейства GGDEF, который показывает значительное сходство последовательностей с этими ферментами и сохраняет все каталитические аминокислотные остатки (Makarova et al., 2011, Biol Direct, том 6, 38, Makarova et al., 2006, Biol Direct, том 1, 7). Структурный анализ подтвердил наличие в Cas10 полимеразоциклазоподобного домена и дополнительно выявил второй, вырожденный и, по-видимому, неактивный домен этого семейства (Khachatryan et al., 2015, Phys Rev Lett, vol. 114, 051801; Shao et al., 2013, Structure, vol. 21, 376-384, Zhu and Ye, 2012, FEBS Lett, том 586, 939-945). Точный характер каталитической активности Cas10 остается неясным, но было показано, что каталитические остатки полимеразоциклазоподобного домена являются существенными для расщепления ДНК-мишени (Saniai et al., 2015, Cell, vol. 161, 1164-1174). Белки Cas8, присутствующие в системах типа CRISPR-Cas I Типа, сходны по размерам с Cas10 и занимают эквивалентные положения в эффекторных комплексах (Jackson et al., 2014, Science, vol. 345, 1473-1479; Jackson and Wiedenheft, 2015, Mol Cell, vol. 58, 722-728, Staals et al., 2014, Molecular cell, vol. 56, 518-530), что наводящий на размышления об эволюционном родстве между большими субъединицами эффекторных комплексов III Типа и I Типа. Более конкретно, белки Cas8, которые сильно расходятся в последовательности между подтипами I Типа, могут быть каталитически неактивными производными Cas10 (Makarova et al., 2011, Biol Direct, том 6, 38, Makarova et al., 2015). Этот сценарий предполагает правдоподобную направленность эволюции, от подобного типу III предкового системы класса 1 до систем типа I. Дивергенция систем типа III и типа I могла быть ускорена за счет получения гелиазы Cas3 во время возникновения типа I (фиг.53). Различные типы и подтипы класса 2 затем эволюционировали посредством множественных замещений блока гена, кодирующего эффекторные комплексы класса 1, путем введения транспозируемых элементов, кодирующих различные нуклеазы (фиг.53). Эта конкретная направленность эволюции вытекает из наблюдения того, что адаптационные модули разных вариантов класса 2 происходят из разных типов 1-го класса (фиг.10А и 10В).

[001346] Системы класса 2 CRISPR-Cas, по-видимому, полностью получены из разных мобильных элементов. В частности, по-видимому, было, по меньшей мере, два (в подтипе V-C), но обычно три или, в случае II Типа, даже четыре представителя мобильных элементов: (i) предковый каспозон, (ii) модуль токсин-антитоксин, который дал начало Cas 2 (iii) транспозируемый элемент, во многих случаях кодирующий TnpB, который был предком эффекторного комплекса класса 2, и (iv) в случае II Типа нуклеаза HNH могла быть пожертвована предковому транспозону с помощью самосплайсирующегося интрона группы I или группы II (Stoddard, 2005, Q Rev Biophys, vol. 38, 49-95) (фиг.53). Локусы предполагаемого типа V-C, описанные в настоящем описании, кодируют конечную минимальную систему CRISPR-Cas, единственную в настоящее время идентифицированную, которой не хватает Cas2; по-видимому, сильно расходящиеся подтипы V-C Cas1-белков способны самостоятельно формировать адаптационный комплекс без вспомогательной субъединицы Cas2. Многократное возникновение систем класса 2 из мобильных элементов представляет собой окончательное проявление модульности, характерное для эволюции CRISPR-Cas (Makarova et al., 2015).

[001347] Демонстрация того, что различные разновидности систем класса 2 CRISPR-Cas, независимо от того, что они эволюционировали из разных транспозонов, подразумевает, что дополнительные варианты и новые типы еще предстоит идентифицировать. Хотя большинство, если не все новые системы CRISPR-Cas, как ожидается, будут редкими, они могут использовать новые стратегии и молекулярные механизмы и могут стать важным ресурсом для новых, разнообразных приложений в области инженерии генома и биотехнологии.

[001348] Модульная эволюция является ключевой особенностью систем CRISPR-Cas. Этот способ эволюции, по-видимому, наиболее выражен в системах класса 2, которые развиваются благодаря сочетанию адаптационных модулей от различных других систем CRISPR-Cas с эффекторными белками, которые, как представляется, рекрутируются из мобильных элементов в нескольких независимых случаях. Учитывая экстремальное разнообразие мобильных элементов в бактериях, представляется вероятным, что эффекторные модули систем класса 2 CRISPR-Cas также очень разнообразны. Здесь заявители использовали простой вычислительный метод для определения трех новых вариантов систем CRISPR-Cas, но многие другие, вероятно, будут содержаться в бактериальных геномах, которые еще не были секвенированы. Хотя большинство, если не все из этих новых систем CRISPR-Cas, как ожидается, будут редкими, они могут использовать новые стратегии и молекулярные механизмы и станут важным ресурсом для новых приложений в области инженерии генома и биотехнологии.

[001349] Программа TBLASTN со значением отсечки 0,01 и отключенной фильтрацией низкой сложности была использована для поиска для профиля Cas1 (Makarova et al., 2015) в качестве запроса к базе данных NCSI WGS. Последовательности контигов или полных геномов, в которых был обнаружено попадание (результат с высокими баллами), были извлечены из той же базы данных. Область вокруг гена Cas1 (область 20 т.п.н. от начала гена Cas1 и 20 т.п.н. от конца гена Cas1) была извлечена и транслирована с использованием GeneMarkS (Besemer et al, 2001, выше). Для предсказанных белков каждой Cas1-кодирующей области производился поиск с использованием набора профилей из базы данных CDD (Marchler-Bauer, 2009) и конкретным профилям белков Cas (Makarova et al., 2015) с использованием программы RPS-BLAST (Marchler-Bauer et al, 2002, Nucleic Acids Res, том 30, 281-283). Процедура определения полноты локусов CRISPR и классификации систем CRISPR-Cas в существующие типы и подтипы (Makarova et al., 2015), разработанные ранее, были применены к каждому локусу.

[001350] CRISPRmap (Lange, 2013) использовался для повторной классификации.

[001351] Частичные и/или неклассифицированные локусы, которые охватывали белки размером более 500 аминокислот, анализировали на индивидуальной основе. В частности, для каждого предсказанного белка, кодируемый этими локусами, был произведен поиск с использованием итеративных поисков профилей с PSI-BLAST (Altschul, 1997), и композиционная статистика с отключенной фильтрацией низкой сложности для поиска удаленных аналогичных последовательностей против базы данных "безызбыточных" (NR) белков NCBF. Для каждого идентифицированного "безызбыточного" белка производился поиск в базе данных WGS с использованием программы TBLAST (Altschul, 1997). Программа HHpred использовалась с параметрами по умолчанию для идентификации сходства отдаленной последовательности (Soding, 2005), используя в качестве запросов все белки, идентифицированные в поисках BLAST. Множественные выравнивания последовательностей были построены с использованием MUSCLE (Edgar, 2004) и MAFFT (Katoh and Standiey, 2013, Mol Biol Evol, vol, 30, 772-780). Филогенетический анализ проводился с использованием программы FastTree с эволюционной моделью WAG и дискретной гамма-моделью с 20 категориями скоростей (Price et al., 2010, PLoS One, том 5, e9490). Вторичная структура белка была предсказана с использованием Jpred 4 (Drozdetskiy, 2015).

[001352] CRISPR-повторы были обнаружены при помощи PILER-CR (Edgar, 2007, выше) или для вырожденных повторов - CRISPRfinder (Grissa et al., 2007, Nucleic Acids Res, vol. 35, W52-57). Программа Mfold (Zukler, 2003, Nucleic Acids Res, vol 31, 3406-3415) были использованы для обнаружения наиболее стабильных структур для повторяющихся последовательностей.

[001353] Был выполнен поиск последовательностей спейсеров был выполнен по базам данных NCBI: NR and WGS database при помощи MEGABLAST (Morgulis et al., 2008, Bioinformatics, vol. 24, 1757-1764) с заданными параметрами по умолчанию за исключением того, что параметр wordsize был задан на 20

[001354] Выбранные кандидаты генов

[001355] ГенID: A; Тип гена:C2C1; Организм: 5. бактерия Opitutaceae TAV5; Длина спейсера - мода (диапазон): 34 (33-37);

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[001356] ID гена: B; Тип гена: C2C1; Организм: 7. Bacillus thermoamylovorans штамма B4166; Длина спейсера - мода (диапазон): 37 (35-38);

DR1:

DR2: нет; tracr-РНК1;

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[001357] ID гена: C; Тип гена: C2C1; Организм: 9. Bacillus sp. NSP2.1; Длина спейсера - мода (диапазон): 36 (35-42);

DR1:

DR2: нет; tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[001358] ID гена: D; Тип гена: C2C2; Организм: 4. Бактерия Lachnospiraceae NK4A144 G619; Длина спейсера - мода (диапазон): 35;

DR1:

DR2:

tracr-РНК1: нет; tracr-РНК2: нет; Последовательность белка:

[001359] ID гена: E; Тип гена: C2C2; Организм: 8. Listeria seeligeri серовар 1/2b штамм SLCC3954; Длина спейсера - мода (диапазон): 30;

DR1:

DR2: нет; tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет; Последовательность белка:

[001360] ID гена: F; Тип гена: C2C2;

Организм: 12. Leptotrichiawadei F0279;

Длина спейсера - мода(диапазон): 31;

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2:

Последовательность белка:

[001361] ID гена: G; Тип гена: C2C2;

Организм: l4. Leptotrichiashahii DSM 19757 B031;

Длина спейсера - мода (диапазон): 30 (30-32);

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[001362] ID гена: H;

Тип гена: Cpf1; Организм: Francisellaularensis subsp. novicida U112, Длина спейсера - мода (диапазон): 31;

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[001363] Гены для синтеза

[001364] Для генов от А-Н заявители оптимизируют гены для экспрессии в человеке и добавляют следующую последовательность ДНК в конец каждого гена. Обратите внимание, что эта последовательность ДНК содержит стоп-кодон (подчеркнутый), поэтому стоп-кодон не добавляется к последовательности, оптимизированной кодоном гена:

[001365] Для оптимизации избегайте следующих сайтов рестрикции: BamHI, EcoRI, HindIII, BsmBI, BsaI, BbsI, AgeI, XhoI, Ndel, NotI, Kpnl, BSrGI, SpeI, XbaI, NheI

[001366] Эти гены клонированы в простой экспрессирующий вектор млекопитающих:

[001367] A

[001368]

[001371] C

[001372]

[001373] D

[001374]

[001377] F

[001378]

[001379] G

[001380]

[001381] H

[001382]

[001383] Локусы от A до G клонированы и вставлены в плазмиду с низким количеством копий. Используется вектор, не содержащий имеет резистентности к Amp.

[01384] A-локус

[01385]

Пример 3: Дальнейшая оценка C2c2p и ассоциированных компонентов

Пример 3. Дальнейшая оценка C2c1 и связанных с ней компонентов

[001398] Заявители продемонстрировали в описанных экспериментах, что локусы 2 класса CRISPR-Cas экспрессируются с образованием зрелой cr-РНК и кодированием предполагаемых tracr-РНК и функциональных направленных на РНК нуклеаз.

[001399] Заявители проанализировали репрезентативный локус C2c1, то есть локус C2c1 Alticclobacillis acidoterrestris (AacC2c1) CRISPR, и провели РНК-секвенирование (RNA-seq) и нозерн-блоттинг, чтобы охарактеризовать его транскрипционную активность.

[001400] Для секвенирования РНК Alicyclobacillus acidoterrestris (ATCC 49025) культивировали с использованием суспензии ATCC Medium 1.655 при 50°C и 300 об/мин. E. coli, содержащие гетерологичные конструкции, культивировали в суспензии в среде Лурия с добавлением соответствующих антибиотиков при 37°C и 300 об/мин. Оба штамма выращивали в аэробных условиях и собирали в стационарной фазе роста.

[001401] Чтобы получить локус AacC2c1 для гетерологичной экспрессии, геномную ДНК выделили из Alicyclobacillus acidoterrestris с использованием Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit, а локус C2c1 амплифицировали ПЦР для клонирования в pACYC-184.

[001402] РНК была выделена из бактерий в стационарной фазе, сначала бактерии были ресуспендированы в TRIzol, а затем гомогенизированы с шариками циркония/кремния (BioSpec Products) в BeadBeater (BioSpec Products) в течение 7 одноминутных циклов. Общая РНК была очищена из гомогенизированных образцов с помощью протокола Miniprep Direct-Zol RNA (Zymo), обработаны ДНК-азой TURBO DNAase (Life Technologies), и 3'-дефосфорилирована T4-полинуклеотид-киназой (New England Biolabs). рРНК удаляли с помощью набора для удаления бактериальной рРНК Ribo-Zero (Illumina). Библиотеки секвенирования РНК были получены из рРНК-обедненной РНК с использованием модификации ранее описанного способа секвенирования cr-РНК (Heidriсh et al., 2015, Methods Mol Biol, vol. 1311, 1-21). Кратко, транскрипты получили поли-А-хвост с помощью поли-(A)-полимеразы E. coli (New England Biolabs), были лигированы с 5'-РНК-адаптерами с использованием T4 РНК-лигазы 1 (оцРНК-лигаза), высокой концентрации (High Concentration, New England Biolabs) и обратно транскрибированы многотемпературной обратной транскриптазой AffmityScript (Agilent Technologies). кДНК была амплифицирована ПЦР с помощью штрих-кодированных праймеров с использованием полимеразы Herculase II (Agilent Technologies).

[001403] Готовые библиотеки кДНК секвенировали на MiSeq (Alumina). Считывания из каждого образца были идентифицированы на основе ассоциированных с ними штрих-кодов и выровнены в соответствии с эталонным геномом RefSeq с использованием BWA (Li and Durbin, 2009, Bioinformatics, vol. 25, 1754-1760). Попарные выравнивания были использованы для выделения последовательностей целых транскриптов с помощью инструментов Picard (http://broadinstitute.github.io/picard) и эти последовательности были проанализированы с использованием Geneious 8.1.5.

[001404] Полнотранскриптомный анализ RNAseq Aac показал, что транскрипция массива CRISPR происходит в той же ориентации, что и у генов Cas (фиг.17). Избыточность отображения транскриптов, картируемых на массив CRISPR, снижалось в направлении от 5' к 3' (фиг.46A). Это согласуется с результатами нозерн-блоттинга заявителей. Массив CRISPR продемонститровал надежность процессинга cr-РНК длиной 34 нуклеотидов с 5'-прямым повтором из 14 нуклеотидов (DR) и спейсером из 20 нуклеотидов (фиг.46A).

[001405] Заявители идентифицировали избыточную малую РНК размером 79 нуклеотидов, закодированную между геном cas2 и массивом CRISPR, и транскрибируемую в той же ориентации, что и массив CRISPR (фиг.46А и В). Внутренняя область этой малой РНК содержит последовательность, которая является высококомплементарной процессированной повторяющейся последовательности CRISPR (антиповтору), позволяя предположить, что этот малый транскрипт является tracr-РНК. При со-сворачивании in silico процессированного повтора CRISPR из 14 нуклеотидов с этой предполагаемой tracr-РНК образуется стабильная предсказанная вторичная структура (фиг.46C).

[001406] Заявители также экспрессировали локус C2c1 Alicyclobacillus acidoterrestris (ATCC 49025) в E. coli и анализировали его экспрессию с использованием Нозерн-блоттинга. Процедура проводилась, по существу, как описано в Pougach and Severinov, 2012 (Methods Mol Biol, vol. 905, 73-86). Клетки E. coli BL21 AI трансформировали плазмидой pACYCduet-1, содержащей контролируемый T7-промотором оперон cas Alicyclobacillus acidoterrestris, и плазмидой pCDF-1b, содержащей минимальную кассету CRISPR с одним спейсером. Общая РНК была экстрагирована из 5 мл клеток E.coli, индуцированных 1 мМ арабинозы/0,2 мМ IPTG и выращенных до OD600 0,8-1,0. Клетки лизировали с помощью 5-минутной обработки с использованием Max Bacterial Enhancement Reagent с последующей очисткой РНК реагентом TRIzol (Thermo Fisher Scientific). 15 пг общей РНК разделяли в денатурирующей 8 М мочевине - 12% полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на мембрану Hybond-XL (GE Healthcare) с использованием Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad). Мембрану высушивали, а затем подвергали кросс-линкингу ультрафиолетовым излучением. Раствор для гибридизации ExpHyb (Clontech) использовали для гибридизации в соответствии с инструкциями производителя в течение 1 часа при 40°C с олигонуклеотидными зондами с 32P-мечеными концами.

[001407] Основываясь на наблюдении, что предполагаемая tracr-РНК в A. acidoterrestris содержит характерную последовательность антиповтора, заявители стремились предсказать потенциальные tracr-РНК для остальной части идентифицированных локусов C2c1, а также C2c2 и C2c3 путем поиска последовательностей анти-повторов в каждом локусе. Во многих локусах CRISPR-Cas повтор, расположенный на дальнем от промотора конце последовательности CRISPR, является вырожденным и имеет последовательность, которая явно отличается от остальных повторов (Biswas et al., 2014, Bioinformatics, vol. 30, 1805 -1813). Такие вырожденные повторы были обнаружены в нескольких системах C2c1 и C2c2 (фиг.9, 14 и 15), что позволило заявителям предсказать направление транскрипции последовательности. Интегрируя эту информацию, были идентифицированы предполагаемые tracr-РНК для 4 из 13 локусов C2c1 и 4 из 17 локусов C2c2 (фиг.9, 14 и 15, фиг.41A-M, фиг.42A-N). В некоторых подтипах II-В и II-С последовательности CRISPR транскрибируется в противоположном направлении, начиная с вырожденного повтора (Sampson et al., 2013, Nature, vol. 497, 254-257; Zhang et al, 2013, Mol Cell, vol. 50, 488-503). Соответственно, авторы изобретения попытались предсказать tracr-РНК в разных положениях по отношению к последовательности CRISPR, но не смогли идентифицировать дополнительные последовательности tracr-РНК-кандидатов. Разумеется, предсказание tracr-РНК для других локусов было затруднено из-за сочетания таких факторов, как неполная комплементарность повторов, отсутствие связанной последовательности CRISPR и/или потенциальная неполнота локусов. Кроме того, существует вероятность того, что не все системы CRISPR класса 2 требуют tracr-РНК.

[001408] Учитывая надежную экспрессию транскриптов в локусе Aac и идентификацию процессированной tracr-РНК и cr-РНК, заявители стремились проверить функциональность фермента AacC2c1. С этой целью был разработан интерференционный скрининг, чтобы определить, являются ли эти локусы активными, и идентифицировать необходимый соседний с протоспейсером мотив (PAM), который определяет, где эффекторный белок будет расщепляться в известных системах типа II (фиг.47А). Была сконструирована библиотека плазмид, дающих устойчивость к ампициллину и несущих протоспейсеры, фланкированный 7 случайными нуклеотидами нуклеотидов. Хотя наличие фрагмента DR на 5'-концевой стороне cr-РНК предполагает наличие 5'-PAM, были проанализированы отдельные библиотеки со случайными последовательностями длиной 7 нуклеотидов, расположенными вверху или внизу от протоспейсера. Более 10 колоний были объединены для представления всех 16384 возможных последовательностей PAM. Клетки E. coli, несущие либо плазмиду локуса AacC2c1 (фиг.46D), либо контрольную плазмиду (pACYC184), трансформировали 5'- или 3'-PAM-библиотеками.

[001409] В частности, рандомизированные библиотеки плазмид PAM были сконструированы с использованием синтезированных олигонуклеотидов (IDT), состоящих из 7 рандомизированных нуклеотидов либо выше, либо ниже от мишени спейсера 1. (22) Рандомизированные олигонуклеотиды одноцепочечной ДНК были сделаны двухцепочечными путем отжига со коротким праймером и с использованием большого Фрагмента Кленова для синтеза второй цепи. Продукт dsDNA собирали в линеаризованный PUC19 с использованием Gibson-клонирования. Stabl3 E. coli клетки трансформировали клонированными продуктами и собирали и собрали более 10⁷ клеток. Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора Qiagen maxi. 360 нг объединенной библиотеки трансформировали в клетки E. coli, трансформированные локусом AacC2c1, и pACYC-184. После трансформации клетки высевали на чашки с LB-агаром, дополненные ампициллином и хлорамфениколом, и выращивали при 37°C. После 16 часов роста > 4×10⁶ клеток и ДНК плазмиды выделяли с использованием набора Qiagen maxi-prep. Целевая область PAM была амплифицирована и секвенирована с помощью Illumina. MiSeq с одноконцевыми 150 циклами.

[001410] В рамках этой экспериментальной установки протоспейсеры с PAM, которые распознаются комплексом AacC2c1, будут уничтожены, что делает клетки чувствительными к ампициллину и, как ожидается, будет демонстрировать обеднение на экране. После ночного роста бактерий целевые плазмиды выделили и подвергли глубокому секвенированию. Эффективность каждого PAM определяли путем вычисления его относительного уровня в образце локуса AacC2c1 по сравнению с контрольным образцом.

[001411] В то время как скрининг PAM длиной 3 нуклеотида не показал значительного истощения PAM, скрининг библиотеки 5'-PAM привел к идентификации 364 PAM, уровень которые был значительно снижен; все эти PAM имели последовательность NNNNTTN (фиг.47B). Все же были несколько более предпочтительны основания, отличные от С, в 5'-положении, непосредственно прилегающем к протоспейсеру, эти результаты показывают, что 5-TTN-мотив распознается комплексом AacC2c1.

[001412] Предложенный PAM был проверен с использованием первого спейсера локуса AacC2c1 и всех четырех TTN PAM (РИС. 47C). Последовательности, соответствующие как PAM, так и не-PAM, клонировали в расщепленный pUC19 и лигировали с T4-лигазой (ферментами). Компетентную E. coli с плазмидой локуса AacC2c1 или плазмидой pACYCl84 трансформировали 20 г PAM-плазмиды и высевали на чашки с агаром LB, дополненным ампициллином и хлорамфениколом. Через 18 часов колонии подсчитывали с помощью OpenCFU (Geissmann 2013, PLoS ONE, vol 8, e54072). Результаты этого эксперимента подтверждают, что для интерференции требуется 5'TTN PAM, и эта интерференция несколько снижается в случае 5'TTC PAM (фиг. 47C).

[001413] Заявители затем попытались выяснить, можно ли экспрессировать C2c1-нуклеазу с использованием клеток человека и одновременно исследовать ее требования к tracr-РНК. С этой целью Заявители получили ДНК-конструкцию с кодон-оптимизированным AacC2c1 человека и собрали белковый лизат клеток HEK293, экспрессирующих белок. В частности, был разработан кодон-оптимизированный для экспрессии в клетке человека белок C2c1, несущий N-терминальный NLS. Последовательность белка была синтезирована и клонирована в экспрессионную плазмиду pcDNA3.1 Genscript. Используя реагент Lipofectamine 2000 (Life Technologies), 2000 нг экспрессионных плазмид трансфицировали в клетки HEK293FT (6-луночные планшеты при 90% конфлюэнтности). Через 48 часов клетки промывали DPBS (Life Technologies), лизировали с использованием буфера для лизиса (20 мМ Hepes pH 7,5, 100 мМ KC1, 5 мМ MgCL, 1 мМ DTT, 5% глицерина, 0,1% Triton X-100, IX cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (Roche)]. После обработки ультразвуком в течение 10 минут в ультразвуковых аппаратах Biorupter (Diagenod) (50%-ный рабочий цикл на высоком уровне) лизат центрифугировали и супернатант замораживали при -80°С для последующего использования в анализах на расщепление.

[001414] Основываясь на самом длинном транскрипте cr-РНК, наблюдаемом при секвенировании РНК, заявители разработали cr-РНК с прямым повторным (DR) длиной 20 нуклеотидов и спейсером длиной 22 нуклеотида, нацеленным на область локуса EMX1 размером 639-п.о., который был амплифицирован ПЦР из геномной ДНК человека. Так как A. acidoterrestris оптимально растет при 50°C (Chang and Kang, 2004, Crit Rev Microbiol, vol. 30, 55-7-4), заявители предположили, что белок AacC2c1 может лучше всего работать при этой температуре. Следовательно, расщепление проводили с использованием лизата млекопитающих из клеток, экспрессирующих белок C2c1, при 50°C, если не указано иное, в буфере для расщепления (NEBuffer 3, 5 мМ DTT) в течение 1 часа. В каждой реакции расщепления использовали 200 мкг ДНК-мишени и эквимолярное соотношение cr-РНК tracr-РНК (500 мкг кРНК). РНК предварительно отжигали нагреванием при 95°C и медленно охлаждали до 4°C. ДНК-мишень состояла либо из геномных ПЦР-ампликонов из гена EMX1, либо из первого протоспейсерного локуса AacC2c1, клонированного в pUC19. Реакционную смесь очищали с помощью ПЦР. (Qiagen) и прогоняли на 2% агарозных E-гелях (Life Technologies).

[001415] При 50°C заявители показали, что самая длинная экспрессируемая tracr-РНК, наблюдаемая в экспериментах RNAseq (151 нуклеотидов), необходима для расщепления ДНК при использовании лизата клеток C2c1 и что расщепление является специфичным к комплементарной области между кРНК и ДНК-мишенью (фиг.48A). Поскольку эксперименты с РНК-seq дали предполагаемые транскрипты tracr-РНК переменной длины (фиг.46A), авторы настоящего изобретения протестировали серию 3'-укороченных транскриптов tracr-РНК и обнаружили, что самая короткая tracr-РНК, обеспечивающая расщепление при использовании лизата C2c1 клеток, представляет собой последовательность из 78 нуклеотидов (фиг.48B). Используя эту минимальную tracr-РНК, авторы изобретения показали, что 50°C - действительно оптимальная температура расщепления, и показали отсутствие наблюдаемого расщепления при температуре ниже 40°C с использованием лизата клеток C2c1 (фиг.48C).

[001416] Чтобы дополнительно подтвердить требования к PAM для C2c1, Заявители разработали кРНК для конструкциями для валидации протоспейсера-1 РАМ, используемых в описанных выше экспериментах (фиг.47C) и продемонстрировали расщепление для TTT, TTA и TTC PAM, но не GGA с использованием tracr-РНК из 78-нуклеотидов (фиг.4DD).

[001417] Учитывая обнаружение специфичной для последовательности, перенаправляемой активности расщепления ДНК для нуклеазы AacC2c1, заявители предположили, что, подобно Cas9, дуплекс cr-РНК tracr-РНК C2RRRRRTRRANA может быть переработан в однонаправленную РНК (sg-РНК) путем присоединения 3' tracr-РНК из 78 нуклеотидов к 5'-концу cr-РНК (фиг.48E). Активность в отношении расщепления мишени, аналогичная полученной в случае дуплекса cr-РНК tracr-РНК, наблюдалась в случае sg-РНК как с плазмидными мишенями EMX1, так и с протоспейсером 1 (фиг.48F). Эти эксперименты показали, что лизат из клеток человека, экспрессирующих C2c1, может расщеплять ДНК-мишень, идентифицировали температурный оптимум фермента и продемонстрировали необходимость в дуплексе cr-РНК tracr-РНК или sg-РНК и 5'-PAM для активности нуклеазы AacC2c1.

[001418] В дальнейших экспериментах заявители изучают доменную структуру и организацию, а также экспрессию матрицы CRISPR в разных бактериальных штаммах, содержащих локусы CRISPR, обозначенные как подтип V-B, как, например, показано на фиг.8А и 8В. Заявители обладают оптимизированными методами для получения локусов C2c1 из других бактериальных штаммов.

[001419] В дальнейших экспериментах заявители разрабатывают клонирование pACYC из изолированных геномных бактериальных штаммов и выращенных бактериальных штаммов для проведения экспериментов по расщеплению ДНК/РНК в E. coli с эффекторными белками, кодируемыми локусами CRISPR.

[001420] В дальнейших экспериментах заявители разрабатывают библиотеки PAM приманки для оценки способности разрезания ДНК описанным здесь эффекторным белком C2c1p. Заявители разрабатывают эксперименты по разрезанию ДНК, основанные на разрезе транскрипта гена устойчивости.

[001421] В дальнейших экспериментах заявители тестируют функцию в клетках млекопитающих с использованием U6 ПЦР продуктов: спейсер (DR-спейсер-DR) (в некоторых аспектах спейсеры могут упоминаться как cr-РНК или направляющая РНК или как аналогичный термин, как описано в этой заявке) и tracr для указанных штаммов, указанных как подтип V-B на фиг.8А и 8В.

[001422] Пример 4: Дальнейшая оценка ортологоа локуса C2c1

Заявители также скринировали локус C2c1 из Bacillus thermoamylovorans (Bth): заявители экспрессировали локус B. Thermoamylovorans C2c1 (BthC2c1.) в E. coli и собирали данные РНК-Seq, демонстрирующие образование транскрипта. Локус BthC2c1 был синтезирован с помощью Genscript и клонирован в вектор pET-28. Клетки, содержащие плазмиды, были сделаны компетентными с использованием Z-компетентного набора (Zymo). E. coli, содержащие гетерологичные конструкции, культивировали в суспензии в среде Лурия с добавлением соответствующих антибиотиков при 37°C и 300 об/мин. Бактерии выращивали в аэробных условиях и собирали в стационарной фазе роста.

[001423] РНК была изолирована, и проведено РНК-секвенирование с помощью методов, изложенных в примере 3.

[001424] Полнотранскриптомное секвенирование синтезированного BthC2c1. локуса, клонированного в pET-28 в E. coli, выявило значительный процессинг обоих как спейсеров, а также экспрессию РНК длиной 91 нуклеотид (фиг.49А), которая обладает вторичной структурой и мотивом повтор-антиповтор-повтор, схожим с Aac tracr-РНК (фиг.49B). Предполагаемая последовательность tracr может быть tracr длиной ~91 нуклеотидов, имеющим следующую последовательность:

CGAGGUUCUGUCUUUUGGUCAGGACAACCGUCUAGCUAUAAGUGCUGCAGGGGU

GUGAGAAACUCCUAUUGCUGGACGAUGUCUCUUUUAU

[001425] В варианте исполнения изобретения последовательность прямого повтора (DR) может быть процессирована до полинуклеотида длиной 15 п.о., имеющего последовательность UACGAGGCAUUAGCAC.

[001426] Заявители определили консенсусный PAM для BthC2c1 из скрининга для обнаружения PAM. Заявители трансформировали библиотеку PAM с соответствующим спейсером в клетки E. coli, содержащие локус BthC2c1, и сравнили истощение с pET-28. Скрининг PAM осуществляли так же, как указано для скрининга AACC2c1 PAM, за исключением того, что после трансформации клетки высевали на чашки с LB-агаром, дополненным ампициллином и канамицином. Этот скрининг показал, что BthC2c1 использует 5' T-богатый PAM с консенсусной последовательностью ATTN (фиг.49C).

[001427] Заявители также экспрессировали локус C2c1 B. sp. в E. coli и получили данные RNAseq, демонстрирующие образование транскриптов. Стрелка на фиг.50 указывает предполагаемую tracr-РНК, связанную с локусом, в то время как показаны все риды. Предполагаемая последовательность tracr может быть tracr длиной 101 нуклеотид, имеющей следующую последовательность:

UCAGUCGCACGCUAUAGGCCAUAAGUCGACUUACAUAUCCGUGCGUGUGCAUUAU

GGGCCCAUCCACAGGUCUAUUCCCACGGAUAAUCACGACUUUCCAC

[001428] В одном из возможных вариантов осуществления изобретения последовательность прямого повтора (DR) может быть процессирована до 20 нуклеотидов, имеющих последовательность GAAAGCUUCGUGGUUAGCAC (фиг.51). Заявители также показали со-сворачивание DR и tracr-РНК, связанное с локусом C2c1 B. sp. (фиг.52)

Пример 5: Модули адаптации новых систем класса 2, вероятно, эволюционировали независимо от разных подразделений класса 1

[001429] Cas1, специализированная ДНК-аза и интеграза, которая играет центральную роль в адаптации CRISPR (Nunez et al., 2014, Nature, Nature structural & molecular biology, vol. 21, 528-534; Nunez et al., 2015, vol. 519, 193-8), является наиболее консервативным белком Cas (Takeuchi et al., 2012, J Bacteriol, vol. 194, 1216-1225) и единственным, для которого возможен комплексный филогенетический анализ (Makarova et al., 2011b, Nat; Rev Microbiol, vol.9, 467-477, Makarova et al., 2015). В филогенетическом дереве Cas1 предполагаемый подтип VB (C2c1) является в значительной степени монофилетической группой и кластеры с типом IU (фиг.10А и 10В, фиг.10C-V). Среди всех (предполагаемых) локусов CRISPR-Cas только типы I-U и C2c1 кодируют слияние белков Cas1 и Cas4. Вместе этот общую характеристику и филогенетическое сродство Cas1 настоятельно указывают на то, что модуль адаптации подтипа V-B происходит от адаптивного типа I-U. Тип V-C Cas1 является наиболее отличным вариантом последовательностей Cas1, обнаруженным на сегодняшний день, как показано длинной ветвью в филогенетическом дереве (фиг.10А и 10В). В дереве Cas1 ветвь V-C типа находится в подтипе I-B (фиг. 10A и 10B), хотя позиционирование такой быстро эволюционирующей группы должно приниматься с осторожностью. Белки типа VI Cas1 распределены между двумя кладами. Первая группа включает Cas1 из Leptotrichia и расположена в поддереве типа II вместе с небольшой ветвью типа III-A. Вторая группа включает белки Cas1 из локусов C2c2 Clostridia и относится к смешанной ветви, которая в основном содержит белки Cas1 из систем типа CRISPR-Cas типа III-A (фиг.10A и 10B).

[001430] Хотя Cas2 является небольшим и относительно малоконсервативным белком, для которого трудно получить надежную филогению, все имеющиеся данные указывают на эволюционную когерентность адаптационного модуля, то есть на коэволюцию генов cas1 и cas2 (Chylinsky et al., 2014), Nucleic Acids Res., Vol.42, 6091-105, Norais et al., 2013, RNA Biol, том 10, 659-670). Собрав все вместе и не ограничиваясь какой-либо гипотезой, эти данные показывают, что адаптационные модули новых систем класса 2 CRISPR-Cas исходят из разных вариантов класса 1.

[001431] Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были продемонстрированы и описаны в настоящем описании, специалистам в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления предоставляются только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены теперь могут быть разработаны специалистами в данной области без отступления от изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы вариантам осуществления изобретения, описанным в настоящем описании, могут быть использованы при осуществлении изобретения. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем изобретения и что способы и структуры, входящие в объем этих притязаний и их эквиваленты, будут охвачены таким образом.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> THE BROAD INSTITUTE INC.

MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY

PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE

RUTGERS, THE STATE UNIVERSITY OF NEW JERSEY

SKOLKOVO INNOVATION OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

<120> NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS

<130> 47627.99.2136

<140> US 15/842,073

<141> 2017-12-14

<150> PCT/US2016/038238

<151> 2016-06-17

<150> 62/245,264

<151> 2015-10-22

<150> 62/181,663

<151> 2015-06-18

<160> 1786

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Simian virus 40

<400> 1

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

Nucleoplasmin bipartite NLS sequence"

<400> 2

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

C-myc NLS sequence"

<400> 3

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

C-myc NLS sequence"

<400> 4

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro

20 25 30

Arg Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

IBB domain from importin-alpha sequence"

<400> 6

Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys

20 25 30

Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val

35 40

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

Myoma T protein sequence"

<400> 7

Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

Myoma T protein sequence"

<400> 8

Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu

1 5

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 11

Asp Arg Leu Arg Arg

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 12

Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Hepatitis delta virus

<400> 13

Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ser Lys Lys

20

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 17

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 18

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 19

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 20

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

<210> 21

<211> 60

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 23

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 25

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 26

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 26

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser

35

<210> 27

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 27

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40

<210> 28

<211> 50

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 28

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser

50

<210> 29

<211> 55

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Aminohexanoyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Aminohexanoyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Aminohexanoyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Aminohexanoyl

<400> 30

Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg

1 5 10

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 31

gagtccgagc agaagaagaa 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 32

gagtcctagc aggagaagaa 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33

gagtctaagc agaagaagaa 20

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 34

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 35

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

'LAGLIDADG' family motif peptide"

<400> 36

Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

'GGDEF' family motif peptide"

<400> 37

Gly Gly Asp Glu Phe

1 5

<210> 38

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 38

gccgcagcga augccguuuc acgaaucguc aggcgg 36

<210> 39

<211> 75

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 39

gcuggagacg uuuuuugaaa cggcgagugc ugcggauagc gaguuucucu uggggaggcg 60

cucgcggcca cuuuu 75

<210> 40

<211> 1388

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

Opitutaceae bacterium sequence"

<400> 40

Met Ser Leu Asn Arg Ile Tyr Gln Gly Arg Val Ala Ala Val Glu Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ala Leu Ala Lys Gly Asn Val Glu Trp Met Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Asp Glu Val Leu Trp Gln His His Glu Leu Phe Gln Ala Ala Ile

35 40 45

Asn Tyr Tyr Leu Val Ala Leu Leu Ala Leu Ala Asp Lys Asn Asn Pro

50 55 60

Val Leu Gly Pro Leu Ile Ser Gln Met Asp Asn Pro Gln Ser Pro Tyr

65 70 75 80

His Val Trp Gly Ser Phe Arg Arg Gln Gly Arg Gln Arg Thr Gly Leu

85 90 95

Ser Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ile Thr Pro Gly Asn Asn Ala Pro Thr

100 105 110

Leu Asp Glu Val Phe Arg Ser Ile Leu Ala Gly Asn Pro Thr Asp Arg

115 120 125

Ala Thr Leu Asp Ala Ala Leu Met Gln Leu Leu Lys Ala Cys Asp Gly

130 135 140

Ala Gly Ala Ile Gln Gln Glu Gly Arg Ser Tyr Trp Pro Lys Phe Cys

145 150 155 160

Asp Pro Asp Ser Thr Ala Asn Phe Ala Gly Asp Pro Ala Met Leu Arg

165 170 175

Arg Glu Gln His Arg Leu Leu Leu Pro Gln Val Leu His Asp Pro Ala

180 185 190

Ile Thr His Asp Ser Pro Ala Leu Gly Ser Phe Asp Thr Tyr Ser Ile

195 200 205

Ala Thr Pro Asp Thr Arg Thr Pro Gln Leu Thr Gly Pro Lys Ala Arg

210 215 220

Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ile Thr Leu Trp Arg Val Arg Leu Pro Glu

225 230 235 240

Ser Ala Ala Asp Phe Asp Arg Leu Ala Ser Ser Leu Lys Lys Ile Pro

245 250 255

Asp Asp Asp Ser Arg Leu Asn Leu Gln Gly Tyr Val Gly Ser Ser Ala

260 265 270

Lys Gly Glu Val Gln Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Arg His

275 280 285

Leu Glu Arg Ser Ser Phe Thr Leu Gly Leu Leu Arg Ser Ala Thr Pro

290 295 300

Pro Pro Lys Asn Ala Glu Thr Pro Pro Pro Ala Gly Val Pro Leu Pro

305 310 315 320

Ala Ala Ser Ala Ala Asp Pro Val Arg Ile Ala Arg Gly Lys Arg Ser

325 330 335

Phe Val Phe Arg Ala Phe Thr Ser Leu Pro Cys Trp His Gly Gly Asp

340 345 350

Asn Ile His Pro Thr Trp Lys Ser Phe Asp Ile Ala Ala Phe Lys Tyr

355 360 365

Ala Leu Thr Val Ile Asn Gln Ile Glu Glu Lys Thr Lys Glu Arg Gln

370 375 380

Lys Glu Cys Ala Glu Leu Glu Thr Asp Phe Asp Tyr Met His Gly Arg

385 390 395 400

Leu Ala Lys Ile Pro Val Lys Tyr Thr Thr Gly Glu Ala Glu Pro Pro

405 410 415

Pro Ile Leu Ala Asn Asp Leu Arg Ile Pro Leu Leu Arg Glu Leu Leu

420 425 430

Gln Asn Ile Lys Val Asp Thr Ala Leu Thr Asp Gly Glu Ala Val Ser

435 440 445

Tyr Gly Leu Gln Arg Arg Thr Ile Arg Gly Phe Arg Glu Leu Arg Arg

450 455 460

Ile Trp Arg Gly His Ala Pro Ala Gly Thr Val Phe Ser Ser Glu Leu

465 470 475 480

Lys Glu Lys Leu Ala Gly Glu Leu Arg Gln Phe Gln Thr Asp Asn Ser

485 490 495

Thr Thr Ile Gly Ser Val Gln Leu Phe Asn Glu Leu Ile Gln Asn Pro

500 505 510

Lys Tyr Trp Pro Ile Trp Gln Ala Pro Asp Val Glu Thr Ala Arg Gln

515 520 525

Trp Ala Asp Ala Gly Phe Ala Asp Asp Pro Leu Ala Ala Leu Val Gln

530 535 540

Glu Ala Glu Leu Gln Glu Asp Ile Asp Ala Leu Lys Ala Pro Val Lys

545 550 555 560

Leu Thr Pro Ala Asp Pro Glu Tyr Ser Arg Arg Gln Tyr Asp Phe Asn

565 570 575

Ala Val Ser Lys Phe Gly Ala Gly Ser Arg Ser Ala Asn Arg His Glu

580 585 590

Pro Gly Gln Thr Glu Arg Gly His Asn Thr Phe Thr Thr Glu Ile Ala

595 600 605

Ala Arg Asn Ala Ala Asp Gly Asn Arg Trp Arg Ala Thr His Val Arg

610 615 620

Ile His Tyr Ser Ala Pro Arg Leu Leu Arg Asp Gly Leu Arg Arg Pro

625 630 635 640

Asp Thr Asp Gly Asn Glu Ala Leu Glu Ala Val Pro Trp Leu Gln Pro

645 650 655

Met Met Glu Ala Leu Ala Pro Leu Pro Thr Leu Pro Gln Asp Leu Thr

660 665 670

Gly Met Pro Val Phe Leu Met Pro Asp Val Thr Leu Ser Gly Glu Arg

675 680 685

Arg Ile Leu Leu Asn Leu Pro Val Thr Leu Glu Pro Ala Ala Leu Val

690 695 700

Glu Gln Leu Gly Asn Ala Gly Arg Trp Gln Asn Gln Phe Phe Gly Ser

705 710 715 720

Arg Glu Asp Pro Phe Ala Leu Arg Trp Pro Ala Asp Gly Ala Val Lys

725 730 735

Thr Ala Lys Gly Lys Thr His Ile Pro Trp His Gln Asp Arg Asp His

740 745 750

Phe Thr Val Leu Gly Val Asp Leu Gly Thr Arg Asp Ala Gly Ala Leu

755 760 765

Ala Leu Leu Asn Val Thr Ala Gln Lys Pro Ala Lys Pro Val His Arg

770 775 780

Ile Ile Gly Glu Ala Asp Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Ser Leu Ala Asp

785 790 795 800

Ala Arg Met Ile Arg Leu Pro Gly Glu Asp Ala Arg Leu Phe Val Arg

805 810 815

Gly Lys Leu Val Gln Glu Pro Tyr Gly Glu Arg Gly Arg Asn Ala Ser

820 825 830

Leu Leu Glu Trp Glu Asp Ala Arg Asn Ile Ile Leu Arg Leu Gly Gln

835 840 845

Asn Pro Asp Glu Leu Leu Gly Ala Asp Pro Arg Arg His Ser Tyr Pro

850 855 860

Glu Ile Asn Asp Lys Leu Leu Val Ala Leu Arg Arg Ala Gln Ala Arg

865 870 875 880

Leu Ala Arg Leu Gln Asn Arg Ser Trp Arg Leu Arg Asp Leu Ala Glu

885 890 895

Ser Asp Lys Ala Leu Asp Glu Ile His Ala Glu Arg Ala Gly Glu Lys

900 905 910

Pro Ser Pro Leu Pro Pro Leu Ala Arg Asp Asp Ala Ile Lys Ser Thr

915 920 925

Asp Glu Ala Leu Leu Ser Gln Arg Asp Ile Ile Arg Arg Ser Phe Val

930 935 940

Gln Ile Ala Asn Leu Ile Leu Pro Leu Arg Gly Arg Arg Trp Glu Trp

945 950 955 960

Arg Pro His Val Glu Val Pro Asp Cys His Ile Leu Ala Gln Ser Asp

965 970 975

Pro Gly Thr Asp Asp Thr Lys Arg Leu Val Ala Gly Gln Arg Gly Ile

980 985 990

Ser His Glu Arg Ile Glu Gln Ile Glu Glu Leu Arg Arg Arg Cys Gln

995 1000 1005

Ser Leu Asn Arg Ala Leu Arg His Lys Pro Gly Glu Arg Pro Val

1010 1015 1020

Leu Gly Arg Pro Ala Lys Gly Glu Glu Ile Ala Asp Pro Cys Pro

1025 1030 1035

Ala Leu Leu Glu Lys Ile Asn Arg Leu Arg Asp Gln Arg Val Asp

1040 1045 1050

Gln Thr Ala His Ala Ile Leu Ala Ala Ala Leu Gly Val Arg Leu

1055 1060 1065

Arg Ala Pro Ser Lys Asp Arg Ala Glu Arg Arg His Arg Asp Ile

1070 1075 1080

His Gly Glu Tyr Glu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Asp Phe Val Val

1085 1090 1095

Ile Glu Asn Leu Ser Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Asp Arg Ala Arg

1100 1105 1110

Ser Glu Asn Thr Arg Leu Met Gln Trp Cys His Arg Gln Ile Val

1115 1120 1125

Gln Lys Leu Arg Gln Leu Cys Glu Thr Tyr Gly Ile Pro Val Leu

1130 1135 1140

Ala Val Pro Ala Ala Tyr Ser Ser Arg Phe Ser Ser Arg Asp Gly

1145 1150 1155

Ser Ala Gly Phe Arg Ala Val His Leu Thr Pro Asp His Arg His

1160 1165 1170

Arg Met Pro Trp Ser Arg Ile Leu Ala Arg Leu Lys Ala His Glu

1175 1180 1185

Glu Asp Gly Lys Arg Leu Glu Lys Thr Val Leu Asp Glu Ala Arg

1190 1195 1200

Ala Val Arg Gly Leu Phe Asp Arg Leu Asp Arg Phe Asn Ala Gly

1205 1210 1215

His Val Pro Gly Lys Pro Trp Arg Thr Leu Leu Ala Pro Leu Pro

1220 1225 1230

Gly Gly Pro Val Phe Val Pro Leu Gly Asp Ala Thr Pro Met Gln

1235 1240 1245

Ala Asp Leu Asn Ala Ala Ile Asn Ile Ala Leu Arg Gly Ile Ala

1250 1255 1260

Ala Pro Asp Arg His Asp Ile His His Arg Leu Arg Ala Glu Asn

1265 1270 1275

Lys Lys Arg Ile Leu Ser Leu Arg Leu Gly Thr Gln Arg Glu Lys

1280 1285 1290

Ala Arg Trp Pro Gly Gly Ala Pro Ala Val Thr Leu Ser Thr Pro

1295 1300 1305

Asn Asn Gly Ala Ser Pro Glu Asp Ser Asp Ala Leu Pro Glu Arg

1310 1315 1320

Val Ser Asn Leu Phe Val Asp Ile Ala Gly Val Ala Asn Phe Glu

1325 1330 1335

Arg Val Thr Ile Glu Gly Val Ser Gln Lys Phe Ala Thr Gly Arg

1340 1345 1350

Gly Leu Trp Ala Ser Val Lys Gln Arg Ala Trp Asn Arg Val Ala

1355 1360 1365

Arg Leu Asn Glu Thr Val Thr Asp Asn Asn Arg Asn Glu Glu Glu

1370 1375 1380

Asp Asp Ile Pro Met

1385

<210> 41

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 41

guccaagaaa aaagaaauga uacgaggcau uagcac 36

<210> 42

<211> 107

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide"

<400> 42

cuggacgaug ucucuuuuau uucuuuuuuc uuggaucuga guacgagcac ccacauugga 60

cauuucgcau ggugggugcu cguacuauag guaaaacaaa ccuuuuu 107

<210> 43

<211> 1108

<212> PRT

<213> Bacillus thermoamylovorans

<400> 43

Met Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val

1 5 10 15

Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala

20 25 30

Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu

35 40 45

His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu

50 55 60

Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn

65 70 75 80

Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Val Val Phe Asn Ile Leu Arg

85 90 95

Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu

100 105 110

Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn

115 120 125

Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp

130 135 140

Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys

145 150 155 160

Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly

165 170 175

Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Phe Thr Asp

180 185 190

Ser Asn Glu Pro Ile Val Lys Glu Ile Lys Trp Met Glu Lys Ser Arg

195 200 205

Asn Gln Ser Val Arg Arg Leu Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Leu

210 215 220

Glu Arg Phe Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Leu Lys Val Lys Glu Glu

225 230 235 240

Tyr Glu Lys Val Glu Lys Glu His Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ile Lys

245 250 255

Glu Asp Ile Gln Ala Phe Lys Ser Leu Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Arg

260 265 270

Gln Glu Gln Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asn Thr Asn Glu Tyr Arg Leu

275 280 285

Ser Lys Arg Gly Leu Arg Gly Trp Arg Glu Ile Ile Gln Lys Trp Leu

290 295 300

Lys Met Asp Glu Asn Glu Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Glu Val Phe Lys

305 310 315 320

Asp Tyr Gln Arg Lys His Pro Arg Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Val Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Asn His Phe Ile Trp Arg Asn His Pro

340 345 350

Glu Tyr Pro Tyr Leu Tyr Ala Thr Phe Cys Glu Ile Asp Lys Lys Lys

355 360 365

Lys Asp Ala Lys Gln Gln Ala Thr Phe Thr Leu Ala Asp Pro Ile Asn

370 375 380

His Pro Leu Trp Val Arg Phe Glu Glu Arg Ser Gly Ser Asn Leu Asn

385 390 395 400

Lys Tyr Arg Ile Leu Thr Glu Gln Leu His Thr Glu Lys Leu Lys Lys

405 410 415

Lys Leu Thr Val Gln Leu Asp Arg Leu Ile Tyr Pro Thr Glu Ser Gly

420 425 430

Gly Trp Glu Glu Lys Gly Lys Val Asp Ile Val Leu Leu Pro Ser Arg

435 440 445

Gln Phe Tyr Asn Gln Ile Phe Leu Asp Ile Glu Glu Lys Gly Lys His

450 455 460

Ala Phe Thr Tyr Lys Asp Glu Ser Ile Lys Phe Pro Leu Lys Gly Thr

465 470 475 480

Leu Gly Gly Ala Arg Val Gln Phe Asp Arg Asp His Leu Arg Arg Tyr

485 490 495

Pro His Lys Val Glu Ser Gly Asn Val Gly Arg Ile Tyr Phe Asn Met

500 505 510

Thr Val Asn Ile Glu Pro Thr Glu Ser Pro Val Ser Lys Ser Leu Lys

515 520 525

Ile His Arg Asp Asp Phe Pro Lys Phe Val Asn Phe Lys Pro Lys Glu

530 535 540

Leu Thr Glu Trp Ile Lys Asp Ser Lys Gly Lys Lys Leu Lys Ser Gly

545 550 555 560

Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gly Leu Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly

565 570 575

Gln Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ile Phe Glu Val Val Asp Gln Lys

580 585 590

Pro Asp Ile Glu Gly Lys Leu Phe Phe Pro Ile Lys Gly Thr Glu Leu

595 600 605

Tyr Ala Val His Arg Ala Ser Phe Asn Ile Lys Leu Pro Gly Glu Thr

610 615 620

Leu Val Lys Ser Arg Glu Val Leu Arg Lys Ala Arg Glu Asp Asn Leu

625 630 635 640

Lys Leu Met Asn Gln Lys Leu Asn Phe Leu Arg Asn Val Leu His Phe

645 650 655

Gln Gln Phe Glu Asp Ile Thr Glu Arg Glu Lys Arg Val Thr Lys Trp

660 665 670

Ile Ser Arg Gln Glu Asn Ser Asp Val Pro Leu Val Tyr Gln Asp Glu

675 680 685

Leu Ile Gln Ile Arg Glu Leu Met Tyr Lys Pro Tyr Lys Asp Trp Val

690 695 700

Ala Phe Leu Lys Gln Leu His Lys Arg Leu Glu Val Glu Ile Gly Lys

705 710 715 720

Glu Val Lys His Trp Arg Lys Ser Leu Ser Asp Gly Arg Lys Gly Leu

725 730 735

Tyr Gly Ile Ser Leu Lys Asn Ile Asp Glu Ile Asp Arg Thr Arg Lys

740 745 750

Phe Leu Leu Arg Trp Ser Leu Arg Pro Thr Glu Pro Gly Glu Val Arg

755 760 765

Arg Leu Glu Pro Gly Gln Arg Phe Ala Ile Asp Gln Leu Asn His Leu

770 775 780

Asn Ala Leu Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Met Ala Asn Thr Ile Ile

785 790 795 800

Met His Ala Leu Gly Tyr Cys Tyr Asp Val Arg Lys Lys Lys Trp Gln

805 810 815

Ala Lys Asn Pro Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ser Asn

820 825 830

Tyr Asn Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Phe Glu Asn Ser Lys Leu Met

835 840 845

Lys Trp Ser Arg Arg Glu Ile Pro Arg Gln Val Ala Leu Gln Gly Glu

850 855 860

Ile Tyr Gly Leu Gln Val Gly Glu Val Gly Ala Gln Phe Ser Ser Arg

865 870 875 880

Phe His Ala Lys Thr Gly Ser Pro Gly Ile Arg Cys Ser Val Val Thr

885 890 895

Lys Glu Lys Leu Gln Asp Asn Arg Phe Phe Lys Asn Leu Gln Arg Glu

900 905 910

Gly Arg Leu Thr Leu Asp Lys Ile Ala Val Leu Lys Glu Gly Asp Leu

915 920 925

Tyr Pro Asp Lys Gly Gly Glu Lys Phe Ile Ser Leu Ser Lys Asp Arg

930 935 940

Lys Leu Val Thr Thr His Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln

945 950 955 960

Lys Arg Phe Trp Thr Arg Thr His Gly Phe Tyr Lys Val Tyr Cys Lys

965 970 975

Ala Tyr Gln Val Asp Gly Gln Thr Val Tyr Ile Pro Glu Ser Lys Asp

980 985 990

Gln Lys Gln Lys Ile Ile Glu Glu Phe Gly Glu Gly Tyr Phe Ile Leu

995 1000 1005

Lys Asp Gly Val Tyr Glu Trp Gly Asn Ala Gly Lys Leu Lys Ile

1010 1015 1020

Lys Lys Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp Ser

1025 1030 1035

Asp Ile Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys Gly

1040 1045 1050

Glu Lys Leu Met Leu Tyr Arg Asp Pro Ser Gly Asn Val Phe Pro

1055 1060 1065

Ser Asp Lys Trp Met Ala Ala Gly Val Phe Phe Gly Lys Leu Glu

1070 1075 1080

Arg Ile Leu Ile Ser Lys Leu Thr Asn Gln Tyr Ser Ile Ser Thr

1085 1090 1095

Ile Glu Asp Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met

1100 1105

<210> 44

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 44

guucgaaagc uuaguggaaa gcuucguggu uagcac 36

<210> 45

<211> 69

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 45

cacggauaau cacgacuuuc cacuaagcuu ucgaauuuua ugaugcgagc auccucucag 60

gucaaaaaa 69

<210> 46

<211> 1108

<212> PRT

<213> Bacillus sp.

<400> 46

Met Ala Ile Arg Ser Ile Lys Leu Lys Leu Lys Thr His Thr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Ala Gln Asn Leu Arg Lys Gly Ile Trp Arg Thr His Arg Leu Leu

20 25 30

Asn Glu Gly Val Ala Tyr Tyr Met Lys Met Leu Leu Leu Phe Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Thr Gly Glu Arg Pro Lys Glu Glu Leu Gln Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Cys His Ile Arg Glu Gln Gln Gln Arg Asn Gln Ala Asp Lys Asn Thr

65 70 75 80

Gln Ala Leu Pro Leu Asp Lys Ala Leu Glu Ala Leu Arg Gln Leu Tyr

85 90 95

Glu Leu Leu Val Pro Ser Ser Val Gly Gln Ser Gly Asp Ala Gln Ile

100 105 110

Ile Ser Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu Val Asp Pro Asn Ser Glu Gly

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Ser Lys Ala Gly Ala Lys Pro Thr Trp Gln Lys Lys

130 135 140

Lys Glu Ala Asn Asp Pro Thr Trp Glu Gln Asp Tyr Glu Lys Trp Lys

145 150 155 160

Lys Arg Arg Glu Glu Asp Pro Thr Ala Ser Val Ile Thr Thr Leu Glu

165 170 175

Glu Tyr Gly Ile Arg Pro Ile Phe Pro Leu Tyr Thr Asn Thr Val Thr

180 185 190

Asp Ile Ala Trp Leu Pro Leu Gln Ser Asn Gln Phe Val Arg Thr Trp

195 200 205

Asp Arg Asp Met Leu Gln Gln Ala Ile Glu Arg Leu Leu Ser Trp Glu

210 215 220

Ser Trp Asn Lys Arg Val Gln Glu Glu Tyr Ala Lys Leu Lys Glu Lys

225 230 235 240

Met Ala Gln Leu Asn Glu Gln Leu Glu Gly Gly Gln Glu Trp Ile Ser

245 250 255

Leu Leu Glu Gln Tyr Glu Glu Asn Arg Glu Arg Glu Leu Arg Glu Asn

260 265 270

Met Thr Ala Ala Asn Asp Lys Tyr Arg Ile Thr Lys Arg Gln Met Lys

275 280 285

Gly Trp Asn Glu Leu Tyr Glu Leu Trp Ser Thr Phe Pro Ala Ser Ala

290 295 300

Ser His Glu Gln Tyr Lys Glu Ala Leu Lys Arg Val Gln Gln Arg Leu

305 310 315 320

Arg Gly Arg Phe Gly Asp Ala His Phe Phe Gln Tyr Leu Met Glu Glu

325 330 335

Lys Asn Arg Leu Ile Trp Lys Gly Asn Pro Gln Arg Ile His Tyr Phe

340 345 350

Val Ala Arg Asn Glu Leu Thr Lys Arg Leu Glu Glu Ala Lys Gln Ser

355 360 365

Ala Thr Met Thr Leu Pro Asn Ala Arg Lys His Pro Leu Trp Val Arg

370 375 380

Phe Asp Ala Arg Gly Gly Asn Leu Gln Asp Tyr Tyr Leu Thr Ala Glu

385 390 395 400

Ala Asp Lys Pro Arg Ser Arg Arg Phe Val Thr Phe Ser Gln Leu Ile

405 410 415

Trp Pro Ser Glu Ser Gly Trp Met Glu Lys Lys Asp Val Glu Val Glu

420 425 430

Leu Ala Leu Ser Arg Gln Phe Tyr Gln Gln Val Lys Leu Leu Lys Asn

435 440 445

Asp Lys Gly Lys Gln Lys Ile Glu Phe Lys Asp Lys Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Thr Phe Asn Gly His Leu Gly Gly Ala Lys Leu Gln Leu Glu Arg Gly

465 470 475 480

Asp Leu Glu Lys Glu Glu Lys Asn Phe Glu Asp Gly Glu Ile Gly Ser

485 490 495

Val Tyr Leu Asn Val Val Ile Asp Phe Glu Pro Leu Gln Glu Val Lys

500 505 510

Asn Gly Arg Val Gln Ala Pro Tyr Gly Gln Val Leu Gln Leu Ile Arg

515 520 525

Arg Pro Asn Glu Phe Pro Lys Val Thr Thr Tyr Lys Ser Glu Gln Leu

530 535 540

Val Glu Trp Ile Lys Ala Ser Pro Gln His Ser Ala Gly Val Glu Ser

545 550 555 560

Leu Ala Ser Gly Phe Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly Leu Arg Ala

565 570 575

Ala Ala Ala Thr Ser Ile Phe Ser Val Glu Glu Ser Ser Asp Lys Asn

580 585 590

Ala Ala Asp Phe Ser Tyr Trp Ile Glu Gly Thr Pro Leu Val Ala Val

595 600 605

His Gln Arg Ser Tyr Met Leu Arg Leu Pro Gly Glu Gln Val Glu Lys

610 615 620

Gln Val Met Glu Lys Arg Asp Glu Arg Phe Gln Leu His Gln Arg Val

625 630 635 640

Lys Phe Gln Ile Arg Val Leu Ala Gln Ile Met Arg Met Ala Asn Lys

645 650 655

Gln Tyr Gly Asp Arg Trp Asp Glu Leu Asp Ser Leu Lys Gln Ala Val

660 665 670

Glu Gln Lys Lys Ser Pro Leu Asp Gln Thr Asp Arg Thr Phe Trp Glu

675 680 685

Gly Ile Val Cys Asp Leu Thr Lys Val Leu Pro Arg Asn Glu Ala Asp

690 695 700

Trp Glu Gln Ala Val Val Gln Ile His Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Val

705 710 715 720

Gly Lys Ala Val Gln Ala Trp Arg Lys Arg Phe Ala Ala Asp Glu Arg

725 730 735

Lys Gly Ile Ala Gly Leu Ser Met Trp Asn Ile Glu Glu Leu Glu Gly

740 745 750

Leu Arg Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ser Arg Arg Thr Arg Asn Pro Gln

755 760 765

Glu Val Asn Arg Phe Glu Arg Gly His Thr Ser His Gln Arg Leu Leu

770 775 780

Thr His Ile Gln Asn Val Lys Glu Asp Arg Leu Lys Gln Leu Ser His

785 790 795 800

Ala Ile Val Met Thr Ala Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Glu Arg Lys Gln

805 810 815

Glu Trp Cys Ala Glu Tyr Pro Ala Cys Gln Val Ile Leu Phe Glu Asn

820 825 830

Leu Ser Gln Tyr Arg Ser Asn Leu Asp Arg Ser Thr Lys Glu Asn Ser

835 840 845

Thr Leu Met Lys Trp Ala His Arg Ser Ile Pro Lys Tyr Val His Met

850 855 860

Gln Ala Glu Pro Tyr Gly Ile Gln Ile Gly Asp Val Arg Ala Glu Tyr

865 870 875 880

Ser Ser Arg Phe Tyr Ala Lys Thr Gly Thr Pro Gly Ile Arg Cys Lys

885 890 895

Lys Val Arg Gly Gln Asp Leu Gln Gly Arg Arg Phe Glu Asn Leu Gln

900 905 910

Lys Arg Leu Val Asn Glu Gln Phe Leu Thr Glu Glu Gln Val Lys Gln

915 920 925

Leu Arg Pro Gly Asp Ile Val Pro Asp Asp Ser Gly Glu Leu Phe Met

930 935 940

Thr Leu Thr Asp Gly Ser Gly Ser Lys Glu Val Val Phe Leu Gln Ala

945 950 955 960

Asp Ile Asn Ala Ala His Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Gln Arg Tyr

965 970 975

Asn Glu Leu Phe Lys Val Ser Cys Arg Val Ile Val Arg Asp Glu Glu

980 985 990

Glu Tyr Leu Val Pro Lys Thr Lys Ser Val Gln Ala Lys Leu Gly Lys

995 1000 1005

Gly Leu Phe Val Lys Lys Ser Asp Thr Ala Trp Lys Asp Val Tyr

1010 1015 1020

Val Trp Asp Ser Gln Ala Lys Leu Lys Gly Lys Thr Thr Phe Thr

1025 1030 1035

Glu Glu Ser Glu Ser Pro Glu Gln Leu Glu Asp Phe Gln Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Glu Glu Ala Glu Glu Ala Lys Gly Thr Tyr Arg Thr Leu Phe

1055 1060 1065

Arg Asp Pro Ser Gly Val Phe Phe Pro Glu Ser Val Trp Tyr Pro

1070 1075 1080

Gln Lys Asp Phe Trp Gly Glu Val Lys Arg Lys Leu Tyr Gly Lys

1085 1090 1095

Leu Arg Glu Arg Phe Leu Thr Lys Ala Arg

1100 1105

<210> 47

<211> 35

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 47

guuuugagaa uagcccgaca uagagggcaa uagac 35

<210> 48

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 48

guuaugaaaa cagcccgaca uagagggcaa uagaca 36

<210> 49

<211> 1334

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

Lachnospiraceae bacterium sequence"

<400> 49

Met Lys Ile Ser Lys Val Asp His Thr Arg Met Ala Val Ala Lys Gly

1 5 10 15

Asn Gln His Arg Arg Asp Glu Ile Ser Gly Ile Leu Tyr Lys Asp Pro

20 25 30

Thr Lys Thr Gly Ser Ile Asp Phe Asp Glu Arg Phe Lys Lys Leu Asn

35 40 45

Cys Ser Ala Lys Ile Leu Tyr His Val Phe Asn Gly Ile Ala Glu Gly

50 55 60

Ser Asn Lys Tyr Lys Asn Ile Val Asp Lys Val Asn Asn Asn Leu Asp

65 70 75 80

Arg Val Leu Phe Thr Gly Lys Ser Tyr Asp Arg Lys Ser Ile Ile Asp

85 90 95

Ile Asp Thr Val Leu Arg Asn Val Glu Lys Ile Asn Ala Phe Asp Arg

100 105 110

Ile Ser Thr Glu Glu Arg Glu Gln Ile Ile Asp Asp Leu Leu Glu Ile

115 120 125

Gln Leu Arg Lys Gly Leu Arg Lys Gly Lys Ala Gly Leu Arg Glu Val

130 135 140

Leu Leu Ile Gly Ala Gly Val Ile Val Arg Thr Asp Lys Lys Gln Glu

145 150 155 160

Ile Ala Asp Phe Leu Glu Ile Leu Asp Glu Asp Phe Asn Lys Thr Asn

165 170 175

Gln Ala Lys Asn Ile Lys Leu Ser Ile Glu Asn Gln Gly Leu Val Val

180 185 190

Ser Pro Val Ser Arg Gly Glu Glu Arg Ile Phe Asp Val Ser Gly Ala

195 200 205

Gln Lys Gly Lys Ser Ser Lys Lys Ala Gln Glu Lys Glu Ala Leu Ser

210 215 220

Ala Phe Leu Leu Asp Tyr Ala Asp Leu Asp Lys Asn Val Arg Phe Glu

225 230 235 240

Tyr Leu Arg Lys Ile Arg Arg Leu Ile Asn Leu Tyr Phe Tyr Val Lys

245 250 255

Asn Asp Asp Val Met Ser Leu Thr Glu Ile Pro Ala Glu Val Asn Leu

260 265 270

Glu Lys Asp Phe Asp Ile Trp Arg Asp His Glu Gln Arg Lys Glu Glu

275 280 285

Asn Gly Asp Phe Val Gly Cys Pro Asp Ile Leu Leu Ala Asp Arg Asp

290 295 300

Val Lys Lys Ser Asn Ser Lys Gln Val Lys Ile Ala Glu Arg Gln Leu

305 310 315 320

Arg Glu Ser Ile Arg Glu Lys Asn Ile Lys Arg Tyr Arg Phe Ser Ile

325 330 335

Lys Thr Ile Glu Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Phe Phe Ala Asn Lys Gln

340 345 350

Ile Ser Val Phe Trp Ile His Arg Ile Glu Asn Ala Val Glu Arg Ile

355 360 365

Leu Gly Ser Ile Asn Asp Lys Lys Leu Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Tyr

370 375 380

Leu Gly Glu Lys Val Trp Lys Asp Ile Leu Asn Phe Leu Ser Ile Lys

385 390 395 400

Tyr Ile Ala Val Gly Lys Ala Val Phe Asn Phe Ala Met Asp Asp Leu

405 410 415

Gln Glu Lys Asp Arg Asp Ile Glu Pro Gly Lys Ile Ser Glu Asn Ala

420 425 430

Val Asn Gly Leu Thr Ser Phe Asp Tyr Glu Gln Ile Lys Ala Asp Glu

435 440 445

Met Leu Gln Arg Glu Val Ala Val Asn Val Ala Phe Ala Ala Asn Asn

450 455 460

Leu Ala Arg Val Thr Val Asp Ile Pro Gln Asn Gly Glu Lys Glu Asp

465 470 475 480

Ile Leu Leu Trp Asn Lys Ser Asp Ile Lys Lys Tyr Lys Lys Asn Ser

485 490 495

Lys Lys Gly Ile Leu Lys Ser Ile Leu Gln Phe Phe Gly Gly Ala Ser

500 505 510

Thr Trp Asn Met Lys Met Phe Glu Ile Ala Tyr His Asp Gln Pro Gly

515 520 525

Asp Tyr Glu Glu Asn Tyr Leu Tyr Asp Ile Ile Gln Ile Ile Tyr Ser

530 535 540

Leu Arg Asn Lys Ser Phe His Phe Lys Thr Tyr Asp His Gly Asp Lys

545 550 555 560

Asn Trp Asn Arg Glu Leu Ile Gly Lys Met Ile Glu His Asp Ala Glu

565 570 575

Arg Val Ile Ser Val Glu Arg Glu Lys Phe His Ser Asn Asn Leu Pro

580 585 590

Met Phe Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Lys Lys Ile Leu Asp Leu Leu Tyr

595 600 605

Ser Asp Tyr Ala Gly Arg Ala Ser Gln Val Pro Ala Phe Asn Thr Val

610 615 620

Leu Val Arg Lys Asn Phe Pro Glu Phe Leu Arg Lys Asp Met Gly Tyr

625 630 635 640

Lys Val His Phe Asn Asn Pro Glu Val Glu Asn Gln Trp His Ser Ala

645 650 655

Val Tyr Tyr Leu Tyr Lys Glu Ile Tyr Tyr Asn Leu Phe Leu Arg Asp

660 665 670

Lys Glu Val Lys Asn Leu Phe Tyr Thr Ser Leu Lys Asn Ile Arg Ser

675 680 685

Glu Val Ser Asp Lys Lys Gln Lys Leu Ala Ser Asp Asp Phe Ala Ser

690 695 700

Arg Cys Glu Glu Ile Glu Asp Arg Ser Leu Pro Glu Ile Cys Gln Ile

705 710 715 720

Ile Met Thr Glu Tyr Asn Ala Gln Asn Phe Gly Asn Arg Lys Val Lys

725 730 735

Ser Gln Arg Val Ile Glu Lys Asn Lys Asp Ile Phe Arg His Tyr Lys

740 745 750

Met Leu Leu Ile Lys Thr Leu Ala Gly Ala Phe Ser Leu Tyr Leu Lys

755 760 765

Gln Glu Arg Phe Ala Phe Ile Gly Lys Ala Thr Pro Ile Pro Tyr Glu

770 775 780

Thr Thr Asp Val Lys Asn Phe Leu Pro Glu Trp Lys Ser Gly Met Tyr

785 790 795 800

Ala Ser Phe Val Glu Glu Ile Lys Asn Asn Leu Asp Leu Gln Glu Trp

805 810 815

Tyr Ile Val Gly Arg Phe Leu Asn Gly Arg Met Leu Asn Gln Leu Ala

820 825 830

Gly Ser Leu Arg Ser Tyr Ile Gln Tyr Ala Glu Asp Ile Glu Arg Arg

835 840 845

Ala Ala Glu Asn Arg Asn Lys Leu Phe Ser Lys Pro Asp Glu Lys Ile

850 855 860

Glu Ala Cys Lys Lys Ala Val Arg Val Leu Asp Leu Cys Ile Lys Ile

865 870 875 880

Ser Thr Arg Ile Ser Ala Glu Phe Thr Asp Tyr Phe Asp Ser Glu Asp

885 890 895

Asp Tyr Ala Asp Tyr Leu Glu Lys Tyr Leu Lys Tyr Gln Asp Asp Ala

900 905 910

Ile Lys Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Ala Ala Leu Asp His Phe Cys

915 920 925

Asn Lys Asp Asp Leu Lys Phe Asp Ile Tyr Val Asn Ala Gly Gln Lys

930 935 940

Pro Ile Leu Gln Arg Asn Ile Val Met Ala Lys Leu Phe Gly Pro Asp

945 950 955 960

Asn Ile Leu Ser Glu Val Met Glu Lys Val Thr Glu Ser Ala Ile Arg

965 970 975

Glu Tyr Tyr Asp Tyr Leu Lys Lys Val Ser Gly Tyr Arg Val Arg Gly

980 985 990

Lys Cys Ser Thr Glu Lys Glu Gln Glu Asp Leu Leu Lys Phe Gln Arg

995 1000 1005

Leu Lys Asn Ala Val Glu Phe Arg Asp Val Thr Glu Tyr Ala Glu

1010 1015 1020

Val Ile Asn Glu Leu Leu Gly Gln Leu Ile Ser Trp Ser Tyr Leu

1025 1030 1035

Arg Glu Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly Phe His Tyr Met

1040 1045 1050

Cys Leu Lys Asn Lys Ser Phe Lys Pro Ala Glu Tyr Val Asp Ile

1055 1060 1065

Arg Arg Asn Asn Gly Thr Ile Ile His Asn Ala Ile Leu Tyr Gln

1070 1075 1080

Ile Val Ser Met Tyr Ile Asn Gly Leu Asp Phe Tyr Ser Cys Asp

1085 1090 1095

Lys Glu Gly Lys Thr Leu Lys Pro Ile Glu Thr Gly Lys Gly Val

1100 1105 1110

Gly Ser Lys Ile Gly Gln Phe Ile Lys Tyr Ser Gln Tyr Leu Tyr

1115 1120 1125

Asn Asp Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Ile Tyr Asn Ala Gly Leu Glu

1130 1135 1140

Val Phe Glu Asn Ile Asp Glu His Asp Asn Ile Thr Asp Leu Arg

1145 1150 1155

Lys Tyr Val Asp His Phe Lys Tyr Tyr Ala Tyr Gly Asn Lys Met

1160 1165 1170

Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Ser Glu Phe Phe Asp Arg Phe Phe Thr

1175 1180 1185

Tyr Asp Met Lys Tyr Gln Lys Asn Val Val Asn Val Leu Glu Asn

1190 1195 1200

Ile Leu Leu Arg His Phe Val Ile Phe Tyr Pro Lys Phe Gly Ser

1205 1210 1215

Gly Lys Lys Asp Val Gly Ile Arg Asp Cys Lys Lys Glu Arg Ala

1220 1225 1230

Gln Ile Glu Ile Ser Glu Gln Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Met

1235 1240 1245

Phe Lys Leu Asp Asp Lys Ala Gly Glu Glu Ala Lys Lys Phe Pro

1250 1255 1260

Ala Arg Asp Glu Arg Tyr Leu Gln Thr Ile Ala Lys Leu Leu Tyr

1265 1270 1275

Tyr Pro Asn Glu Ile Glu Asp Met Asn Arg Phe Met Lys Lys Gly

1280 1285 1290

Glu Thr Ile Asn Lys Lys Val Gln Phe Asn Arg Lys Lys Lys Ile

1295 1300 1305

Thr Arg Lys Gln Lys Asn Asn Ser Ser Asn Glu Val Leu Ser Ser

1310 1315 1320

Thr Met Gly Tyr Leu Phe Lys Asn Ile Lys Leu

1325 1330

<210> 50

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 50

guuuuagucc ucuuucauau agagguaguc ucuuac 36

<210> 51

<211> 99

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 51

augaaaagag gacuaaaacu gaaagaggac uaaaacacca gauguggaua acuauauuag 60

uggcuauuaa aaauucgucg auauuagaga ggaaacuuu 99

<210> 52

<211> 1120

<212> PRT

<213> Listeria seeligeri

<400> 52

Met Trp Ile Ser Ile Lys Thr Leu Ile His His Leu Gly Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Cys Asp Tyr Met Tyr Asn Arg Arg Glu Lys Lys Ile Ile Glu Val

20 25 30

Lys Thr Met Arg Ile Thr Lys Val Glu Val Asp Arg Lys Lys Val Leu

35 40 45

Ile Ser Arg Asp Lys Asn Gly Gly Lys Leu Val Tyr Glu Asn Glu Met

50 55 60

Gln Asp Asn Thr Glu Gln Ile Met His His Lys Lys Ser Ser Phe Tyr

65 70 75 80

Lys Ser Val Val Asn Lys Thr Ile Cys Arg Pro Glu Gln Lys Gln Met

85 90 95

Lys Lys Leu Val His Gly Leu Leu Gln Glu Asn Ser Gln Glu Lys Ile

100 105 110

Lys Val Ser Asp Val Thr Lys Leu Asn Ile Ser Asn Phe Leu Asn His

115 120 125

Arg Phe Lys Lys Ser Leu Tyr Tyr Phe Pro Glu Asn Ser Pro Asp Lys

130 135 140

Ser Glu Glu Tyr Arg Ile Glu Ile Asn Leu Ser Gln Leu Leu Glu Asp

145 150 155 160

Ser Leu Lys Lys Gln Gln Gly Thr Phe Ile Cys Trp Glu Ser Phe Ser

165 170 175

Lys Asp Met Glu Leu Tyr Ile Asn Trp Ala Glu Asn Tyr Ile Ser Ser

180 185 190

Lys Thr Lys Leu Ile Lys Lys Ser Ile Arg Asn Asn Arg Ile Gln Ser

195 200 205

Thr Glu Ser Arg Ser Gly Gln Leu Met Asp Arg Tyr Met Lys Asp Ile

210 215 220

Leu Asn Lys Asn Lys Pro Phe Asp Ile Gln Ser Val Ser Glu Lys Tyr

225 230 235 240

Gln Leu Glu Lys Leu Thr Ser Ala Leu Lys Ala Thr Phe Lys Glu Ala

245 250 255

Lys Lys Asn Asp Lys Glu Ile Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Thr Leu Gln

260 265 270

Asn His Glu Arg Gln Ile Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Ser Glu Leu

275 280 285

Asn Gln Phe Asn Ile Glu Ile Arg Lys His Leu Glu Thr Tyr Phe Pro

290 295 300

Ile Lys Lys Thr Asn Arg Lys Val Gly Asp Ile Arg Asn Leu Glu Ile

305 310 315 320

Gly Glu Ile Gln Lys Ile Val Asn His Arg Leu Lys Asn Lys Ile Val

325 330 335

Gln Arg Ile Leu Gln Glu Gly Lys Leu Ala Ser Tyr Glu Ile Glu Ser

340 345 350

Thr Val Asn Ser Asn Ser Leu Gln Lys Ile Lys Ile Glu Glu Ala Phe

355 360 365

Ala Leu Lys Phe Ile Asn Ala Cys Leu Phe Ala Ser Asn Asn Leu Arg

370 375 380

Asn Met Val Tyr Pro Val Cys Lys Lys Asp Ile Leu Met Ile Gly Glu

385 390 395 400

Phe Lys Asn Ser Phe Lys Glu Ile Lys His Lys Lys Phe Ile Arg Gln

405 410 415

Trp Ser Gln Phe Phe Ser Gln Glu Ile Thr Val Asp Asp Ile Glu Leu

420 425 430

Ala Ser Trp Gly Leu Arg Gly Ala Ile Ala Pro Ile Arg Asn Glu Ile

435 440 445

Ile His Leu Lys Lys His Ser Trp Lys Lys Phe Phe Asn Asn Pro Thr

450 455 460

Phe Lys Val Lys Lys Ser Lys Ile Ile Asn Gly Lys Thr Lys Asp Val

465 470 475 480

Thr Ser Glu Phe Leu Tyr Lys Glu Thr Leu Phe Lys Asp Tyr Phe Tyr

485 490 495

Ser Glu Leu Asp Ser Val Pro Glu Leu Ile Ile Asn Lys Met Glu Ser

500 505 510

Ser Lys Ile Leu Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Gln Leu Asn Gln Val Phe

515 520 525

Thr Ile Pro Asn Phe Glu Leu Ser Leu Leu Thr Ser Ala Val Pro Phe

530 535 540

Ala Pro Ser Phe Lys Arg Val Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Tyr Gln Asn

545 550 555 560

Gln Asp Glu Ala Gln Pro Asp Tyr Asn Leu Lys Leu Asn Ile Tyr Asn

565 570 575

Glu Lys Ala Phe Asn Ser Glu Ala Phe Gln Ala Gln Tyr Ser Leu Phe

580 585 590

Lys Met Val Tyr Tyr Gln Val Phe Leu Pro Gln Phe Thr Thr Asn Asn

595 600 605

Asp Leu Phe Lys Ser Ser Val Asp Phe Ile Leu Thr Leu Asn Lys Glu

610 615 620

Arg Lys Gly Tyr Ala Lys Ala Phe Gln Asp Ile Arg Lys Met Asn Lys

625 630 635 640

Asp Glu Lys Pro Ser Glu Tyr Met Ser Tyr Ile Gln Ser Gln Leu Met

645 650 655

Leu Tyr Gln Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Lys Ile Asn His Phe Glu

660 665 670

Lys Phe Ile Asn Gln Val Phe Ile Lys Gly Phe Asn Ser Phe Ile Glu

675 680 685

Lys Asn Arg Leu Thr Tyr Ile Cys His Pro Thr Lys Asn Thr Val Pro

690 695 700

Glu Asn Asp Asn Ile Glu Ile Pro Phe His Thr Asp Met Asp Asp Ser

705 710 715 720

Asn Ile Ala Phe Trp Leu Met Cys Lys Leu Leu Asp Ala Lys Gln Leu

725 730 735

Ser Glu Leu Arg Asn Glu Met Ile Lys Phe Ser Cys Ser Leu Gln Ser

740 745 750

Thr Glu Glu Ile Ser Thr Phe Thr Lys Ala Arg Glu Val Ile Gly Leu

755 760 765

Ala Leu Leu Asn Gly Glu Lys Gly Cys Asn Asp Trp Lys Glu Leu Phe

770 775 780

Asp Asp Lys Glu Ala Trp Lys Lys Asn Met Ser Leu Tyr Val Ser Glu

785 790 795 800

Glu Leu Leu Gln Ser Leu Pro Tyr Thr Gln Glu Asp Gly Gln Thr Pro

805 810 815

Val Ile Asn Arg Ser Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Gly Thr Glu Thr

820 825 830

Ile Leu Glu Lys Leu Phe Ser Ser Ser Asp Asp Tyr Lys Val Ser Ala

835 840 845

Lys Asp Ile Ala Lys Leu His Glu Tyr Asp Val Thr Glu Lys Ile Ala

850 855 860

Gln Gln Glu Ser Leu His Lys Gln Trp Ile Glu Lys Pro Gly Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asp Ser Ala Trp Thr Lys Lys Tyr Gln Asn Val Ile Asn Asp Ile

885 890 895

Ser Asn Tyr Gln Trp Ala Lys Thr Lys Val Glu Leu Thr Gln Val Arg

900 905 910

His Leu His Gln Leu Thr Ile Asp Leu Leu Ser Arg Leu Ala Gly Tyr

915 920 925

Met Ser Ile Ala Asp Arg Asp Phe Gln Phe Ser Ser Asn Tyr Ile Leu

930 935 940

Glu Arg Glu Asn Ser Glu Tyr Arg Val Thr Ser Trp Ile Leu Leu Ser

945 950 955 960

Glu Asn Lys Asn Lys Asn Lys Tyr Asn Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Leu

965 970 975

Lys Asn Ala Ser Ile Lys Val Ser Ser Lys Asn Asp Pro Gln Leu Lys

980 985 990

Val Asp Leu Lys Gln Leu Arg Leu Thr Leu Glu Tyr Leu Glu Leu Phe

995 1000 1005

Asp Asn Arg Leu Lys Glu Lys Arg Asn Asn Ile Ser His Phe Asn

1010 1015 1020

Tyr Leu Asn Gly Gln Leu Gly Asn Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asp

1025 1030 1035

Asp Ala Arg Asp Val Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala

1040 1045 1050

Val Ser Lys Ser Leu Lys Glu Ile Leu Ser Ser His Gly Met Glu

1055 1060 1065

Val Thr Phe Lys Pro Leu Tyr Gln Thr Asn His His Leu Lys Ile

1070 1075 1080

Asp Lys Leu Gln Pro Lys Lys Ile His His Leu Gly Glu Lys Ser

1085 1090 1095

Thr Val Ser Ser Asn Gln Val Ser Asn Glu Tyr Cys Gln Leu Val

1100 1105 1110

Arg Thr Leu Leu Thr Met Lys

1115 1120

<210> 53

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 53

guuuuagucc ccuucguuuu ugggguaguc uaaauc 36

<210> 54

<211> 113

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide"

<400> 54

gauuuagagc accccaaaag uaaugaaaau uugcaauuaa auaaggaaua uuaaaaaaau 60

gugauuuuaa aaaaauugaa gaaauuaaau gaaaaauugu ccaaguaaaa aaa 113

<210> 55

<211> 70

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 55

auuuagauua ccccuuuaau uuauuuuacc auauuuuucu cauaaugcaa acuaauauuc 60

caaaauuuuu 70

<210> 56

<211> 1389

<212> PRT

<213> Leptotrichia wadei

<400> 56

Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys

1 5 10 15

Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp

20 25 30

Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys

35 40 45

Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn

50 55 60

Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile

65 70 75 80

Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn

85 90 95

Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr

100 105 110

Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile

115 120 125

Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile

130 135 140

Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg

145 150 155 160

Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg

165 170 175

Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile

180 185 190

Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile

195 200 205

Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His

210 215 220

Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr

225 230 235 240

Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu

245 250 255

Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser

260 265 270

Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp

275 280 285

Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe

290 295 300

Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu

305 310 315 320

Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu

325 330 335

Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp

340 345 350

Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys

355 360 365

Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile

370 375 380

Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile

385 390 395 400

Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys

405 410 415

Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr

420 425 430

Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys

435 440 445

Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn

450 455 460

Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr

465 470 475 480

Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp

485 490 495

Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu

500 505 510

Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu

515 520 525

Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile

530 535 540

Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys

545 550 555 560

Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp

565 570 575

Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile

580 585 590

Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg

595 600 605

Asp Leu Gln Gly Thr Gln Asp Asp Tyr Asn Lys Val Ile Asn Ile Ile

610 615 620

Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu

625 630 635 640

Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp

645 650 655

Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser

660 665 670

Phe Ser Lys Val Leu Pro Glu Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Asn Asn Pro

675 680 685

Lys Asn Glu Pro Phe Asp Thr Ile Glu Thr Glu Lys Ile Val Leu Asn

690 695 700

Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu

705 710 715 720

Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu

725 730 735

Lys Lys Thr Leu Gly Asn Ile Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ile Ile Glu

740 745 750

Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys

755 760 765

Ala Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Lys Val Ile Glu Cys Tyr Ile Gly Tyr

770 775 780

Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met

785 790 795 800

Asn Ile Gln Glu Ile Lys Lys Gln Ile Lys Asp Ile Asn Asp Asn Lys

805 810 815

Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Val Lys Thr Ser Asp Lys Thr Ile Val Ile

820 825 830

Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser

835 840 845

Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val

850 855 860

Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu

865 870 875 880

Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp

885 890 895

Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys

900 905 910

Asp Phe Asp Asp Phe Lys Ile Gln Thr Lys Lys Glu Ile Phe Asn Asn

915 920 925

Tyr Tyr Glu Asp Ile Lys Asn Asn Ile Leu Thr Glu Phe Lys Asp Asp

930 935 940

Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile

945 950 955 960

Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu

965 970 975

Gln Asp Glu Gln Arg Lys Leu Ser Asn Ile Asn Lys Lys Asp Leu Lys

980 985 990

Lys Lys Val Asp Gln Tyr Ile Lys Asp Lys Asp Gln Glu Ile Lys Ser

995 1000 1005

Lys Ile Leu Cys Arg Ile Ile Phe Asn Ser Asp Phe Leu Lys Lys

1010 1015 1020

Tyr Lys Lys Glu Ile Asp Asn Leu Ile Glu Asp Met Glu Ser Glu

1025 1030 1035

Asn Glu Asn Lys Phe Gln Glu Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu Arg Lys

1040 1045 1050

Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly

1055 1060 1065

Asn Pro Asn Phe Asp Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Ser Asn Asp Ile

1070 1075 1080

Lys Met Ala Asp Ala Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn

1085 1090 1095

Ile Arg Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn

1100 1105 1110

Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Glu Tyr Lys Glu Lys

1115 1120 1125

Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn

1130 1135 1140

Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg

1145 1150 1155

Val Ser Glu Tyr Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr

1160 1165 1170

Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu

1175 1180 1185

Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val

1190 1195 1200

Asn Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn

1205 1210 1215

Thr Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly

1220 1225 1230

Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser

1235 1240 1245

Tyr Lys Lys Phe Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu

1250 1255 1260

Ser Glu Asn Ser Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg

1265 1270 1275

Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp

1280 1285 1290

Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser

1295 1300 1305

Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu

1310 1315 1320

Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys

1325 1330 1335

Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met

1340 1345 1350

Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser

1355 1360 1365

Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu

1370 1375 1380

Asn Thr Asn Asp Thr Leu

1385

<210> 57

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 57

guuuuagucc ccuucgauau uggggugguc uauauc 36

<210> 58

<211> 95

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 58

auugaugugg uauacuaaaa auggaaaauu guauuuuuga uuagaaagau guaaaauuga 60

uuuaauuuaa aaauauuuua uuagauuaaa guaga 95

<210> 59

<211> 1300

<212> PRT

<213> Leptotrichia shahii

<400> 59

Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys

20 25 30

Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys

35 40 45

Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys

85 90 95

Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr

100 105 110

Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile

115 120 125

Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln

130 135 140

Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr

145 150 155 160

Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr

165 170 175

Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser

180 185 190

Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu

195 200 205

Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg

245 250 255

Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr

260 265 270

Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile

290 295 300

Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met

340 345 350

Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys

355 360 365

Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln

370 375 380

Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr

385 390 395 400

Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala

405 410 415

Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn

420 425 430

Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala

435 440 445

Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn

450 455 460

Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala

465 470 475 480

Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys

485 490 495

Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys

500 505 510

Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp

515 520 525

Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His

530 535 540

Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His

545 550 555 560

Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val

565 570 575

Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser

580 585 590

Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly

595 600 605

Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys

610 615 620

Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile

625 630 635 640

Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys

645 650 655

Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val

660 665 670

Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile

675 680 685

Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln

690 695 700

Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe

705 710 715 720

Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp

725 730 735

Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu

740 745 750

Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn

755 760 765

Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr

770 775 780

Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg

785 790 795 800

Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn

805 810 815

Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr

820 825 830

Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala

835 840 845

Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu

850 855 860

Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe

865 870 875 880

His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe

885 890 895

Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His

900 905 910

Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu

915 920 925

Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile

930 935 940

Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile

945 950 955 960

Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn

965 970 975

Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile

980 985 990

Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu

995 1000 1005

Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val

1010 1015 1020

Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu

1025 1030 1035

Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg

1040 1045 1050

Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly

1055 1060 1065

Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser

1070 1075 1080

Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys

1085 1090 1095

Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp

1100 1105 1110

Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe

1115 1120 1125

Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr

1130 1135 1140

Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu

1160 1165 1170

Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly

1175 1180 1185

Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe

1190 1195 1200

Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg

1205 1210 1215

Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val

1220 1225 1230

Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys

1235 1240 1245

Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu

1265 1270 1275

Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu

1280 1285 1290

Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn

1295 1300

<210> 60

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 60

gucuaagaac uuuaaauaau uucuacuguu guagau 36

<210> 61

<211> 71

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 61

aucuacaaaa uuauaaacua aauaaagauu cuuauaauaa cuuuauauau aaucgaaaug 60

uagagaauuu u 71

<210> 62

<211> 1300

<212> PRT

<213> Francisella ularensis

<400> 62

Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys

20 25 30

Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys

35 40 45

Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys

85 90 95

Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr

100 105 110

Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile

115 120 125

Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln

130 135 140

Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr

145 150 155 160

Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr

165 170 175

Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser

180 185 190

Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu

195 200 205

Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg

245 250 255

Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr

260 265 270

Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile

290 295 300

Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met

340 345 350

Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys

355 360 365

Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln

370 375 380

Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr

385 390 395 400

Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala

405 410 415

Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn

420 425 430

Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala

435 440 445

Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn

450 455 460

Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala

465 470 475 480

Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys

485 490 495

Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys

500 505 510

Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp

515 520 525

Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His

530 535 540

Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His

545 550 555 560

Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val

565 570 575

Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser

580 585 590

Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly

595 600 605

Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys

610 615 620

Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile

625 630 635 640

Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys

645 650 655

Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val

660 665 670

Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile

675 680 685

Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln

690 695 700

Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe

705 710 715 720

Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp

725 730 735

Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu

740 745 750

Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn

755 760 765

Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr

770 775 780

Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg

785 790 795 800

Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn

805 810 815

Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr

820 825 830

Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala

835 840 845

Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu

850 855 860

Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe

865 870 875 880

His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe

885 890 895

Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His

900 905 910

Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu

915 920 925

Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile

930 935 940

Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile

945 950 955 960

Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn

965 970 975

Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile

980 985 990

Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu

995 1000 1005

Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val

1010 1015 1020

Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu

1025 1030 1035

Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg

1040 1045 1050

Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly

1055 1060 1065

Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser

1070 1075 1080

Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys

1085 1090 1095

Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp

1100 1105 1110

Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe

1115 1120 1125

Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr

1130 1135 1140

Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu

1160 1165 1170

Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly

1175 1180 1185

Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe

1190 1195 1200

Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg

1205 1210 1215

Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val

1220 1225 1230

Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys

1235 1240 1245

Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu

1265 1270 1275

Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu

1280 1285 1290

Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn

1295 1300

<210> 63

<211> 138

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide"

<400> 63

aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaaggg atcctaccca 60

tacgatgttc cagattacgc ttatccctac gacgtgcctg attatgcata cccatatgat 120

gtccccgact atgcctaa 138

<210> 64

<211> 1388

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 64

Met Ser Leu Asn Arg Ile Tyr Gln Gly Arg Val Ala Ala Val Glu Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ala Leu Ala Lys Gly Asn Val Glu Trp Met Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Asp Glu Val Leu Trp Gln His His Glu Leu Phe Gln Ala Ala Ile

35 40 45

Asn Tyr Tyr Leu Val Ala Leu Leu Ala Leu Ala Asp Lys Asn Asn Pro

50 55 60

Val Leu Gly Pro Leu Ile Ser Gln Met Asp Asn Pro Gln Ser Pro Tyr

65 70 75 80

His Val Trp Gly Ser Phe Arg Arg Gln Gly Arg Gln Arg Thr Gly Leu

85 90 95

Ser Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ile Thr Pro Gly Asn Asn Ala Pro Thr

100 105 110

Leu Asp Glu Val Phe Arg Ser Ile Leu Ala Gly Asn Pro Thr Asp Arg

115 120 125

Ala Thr Leu Asp Ala Ala Leu Met Gln Leu Leu Lys Ala Cys Asp Gly

130 135 140

Ala Gly Ala Ile Gln Gln Glu Gly Arg Ser Tyr Trp Pro Lys Phe Cys

145 150 155 160

Asp Pro Asp Ser Thr Ala Asn Phe Ala Gly Asp Pro Ala Met Leu Arg

165 170 175

Arg Glu Gln His Arg Leu Leu Leu Pro Gln Val Leu His Asp Pro Ala

180 185 190

Ile Thr His Asp Ser Pro Ala Leu Gly Ser Phe Asp Thr Tyr Ser Ile

195 200 205

Ala Thr Pro Asp Thr Arg Thr Pro Gln Leu Thr Gly Pro Lys Ala Arg

210 215 220

Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ile Thr Leu Trp Arg Val Arg Leu Pro Glu

225 230 235 240

Ser Ala Ala Asp Phe Asp Arg Leu Ala Ser Ser Leu Lys Lys Ile Pro

245 250 255

Asp Asp Asp Ser Arg Leu Asn Leu Gln Gly Tyr Val Gly Ser Ser Ala

260 265 270

Lys Gly Glu Val Gln Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Arg His

275 280 285

Leu Glu Arg Ser Ser Phe Thr Leu Gly Leu Leu Arg Ser Ala Thr Pro

290 295 300

Pro Pro Lys Asn Ala Glu Thr Pro Pro Pro Ala Gly Val Pro Leu Pro

305 310 315 320

Ala Ala Ser Ala Ala Asp Pro Val Arg Ile Ala Arg Gly Lys Arg Ser

325 330 335

Phe Val Phe Arg Ala Phe Thr Ser Leu Pro Cys Trp His Gly Gly Asp

340 345 350

Asn Ile His Pro Thr Trp Lys Ser Phe Asp Ile Ala Ala Phe Lys Tyr

355 360 365

Ala Leu Thr Val Ile Asn Gln Ile Glu Glu Lys Thr Lys Glu Arg Gln

370 375 380

Lys Glu Cys Ala Glu Leu Glu Thr Asp Phe Asp Tyr Met His Gly Arg

385 390 395 400

Leu Ala Lys Ile Pro Val Lys Tyr Thr Thr Gly Glu Ala Glu Pro Pro

405 410 415

Pro Ile Leu Ala Asn Asp Leu Arg Ile Pro Leu Leu Arg Glu Leu Leu

420 425 430

Gln Asn Ile Lys Val Asp Thr Ala Leu Thr Asp Gly Glu Ala Val Ser

435 440 445

Tyr Gly Leu Gln Arg Arg Thr Ile Arg Gly Phe Arg Glu Leu Arg Arg

450 455 460

Ile Trp Arg Gly His Ala Pro Ala Gly Thr Val Phe Ser Ser Glu Leu

465 470 475 480

Lys Glu Lys Leu Ala Gly Glu Leu Arg Gln Phe Gln Thr Asp Asn Ser

485 490 495

Thr Thr Ile Gly Ser Val Gln Leu Phe Asn Glu Leu Ile Gln Asn Pro

500 505 510

Lys Tyr Trp Pro Ile Trp Gln Ala Pro Asp Val Glu Thr Ala Arg Gln

515 520 525

Trp Ala Asp Ala Gly Phe Ala Asp Asp Pro Leu Ala Ala Leu Val Gln

530 535 540

Glu Ala Glu Leu Gln Glu Asp Ile Asp Ala Leu Lys Ala Pro Val Lys

545 550 555 560

Leu Thr Pro Ala Asp Pro Glu Tyr Ser Arg Arg Gln Tyr Asp Phe Asn

565 570 575

Ala Val Ser Lys Phe Gly Ala Gly Ser Arg Ser Ala Asn Arg His Glu

580 585 590

Pro Gly Gln Thr Glu Arg Gly His Asn Thr Phe Thr Thr Glu Ile Ala

595 600 605

Ala Arg Asn Ala Ala Asp Gly Asn Arg Trp Arg Ala Thr His Val Arg

610 615 620

Ile His Tyr Ser Ala Pro Arg Leu Leu Arg Asp Gly Leu Arg Arg Pro

625 630 635 640

Asp Thr Asp Gly Asn Glu Ala Leu Glu Ala Val Pro Trp Leu Gln Pro

645 650 655

Met Met Glu Ala Leu Ala Pro Leu Pro Thr Leu Pro Gln Asp Leu Thr

660 665 670

Gly Met Pro Val Phe Leu Met Pro Asp Val Thr Leu Ser Gly Glu Arg

675 680 685

Arg Ile Leu Leu Asn Leu Pro Val Thr Leu Glu Pro Ala Ala Leu Val

690 695 700

Glu Gln Leu Gly Asn Ala Gly Arg Trp Gln Asn Gln Phe Phe Gly Ser

705 710 715 720

Arg Glu Asp Pro Phe Ala Leu Arg Trp Pro Ala Asp Gly Ala Val Lys

725 730 735

Thr Ala Lys Gly Lys Thr His Ile Pro Trp His Gln Asp Arg Asp His

740 745 750

Phe Thr Val Leu Gly Val Asp Leu Gly Thr Arg Asp Ala Gly Ala Leu

755 760 765

Ala Leu Leu Asn Val Thr Ala Gln Lys Pro Ala Lys Pro Val His Arg

770 775 780

Ile Ile Gly Glu Ala Asp Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Ser Leu Ala Asp

785 790 795 800

Ala Arg Met Ile Arg Leu Pro Gly Glu Asp Ala Arg Leu Phe Val Arg

805 810 815

Gly Lys Leu Val Gln Glu Pro Tyr Gly Glu Arg Gly Arg Asn Ala Ser

820 825 830

Leu Leu Glu Trp Glu Asp Ala Arg Asn Ile Ile Leu Arg Leu Gly Gln

835 840 845

Asn Pro Asp Glu Leu Leu Gly Ala Asp Pro Arg Arg His Ser Tyr Pro

850 855 860

Glu Ile Asn Asp Lys Leu Leu Val Ala Leu Arg Arg Ala Gln Ala Arg

865 870 875 880

Leu Ala Arg Leu Gln Asn Arg Ser Trp Arg Leu Arg Asp Leu Ala Glu

885 890 895

Ser Asp Lys Ala Leu Asp Glu Ile His Ala Glu Arg Ala Gly Glu Lys

900 905 910

Pro Ser Pro Leu Pro Pro Leu Ala Arg Asp Asp Ala Ile Lys Ser Thr

915 920 925

Asp Glu Ala Leu Leu Ser Gln Arg Asp Ile Ile Arg Arg Ser Phe Val

930 935 940

Gln Ile Ala Asn Leu Ile Leu Pro Leu Arg Gly Arg Arg Trp Glu Trp

945 950 955 960

Arg Pro His Val Glu Val Pro Asp Cys His Ile Leu Ala Gln Ser Asp

965 970 975

Pro Gly Thr Asp Asp Thr Lys Arg Leu Val Ala Gly Gln Arg Gly Ile

980 985 990

Ser His Glu Arg Ile Glu Gln Ile Glu Glu Leu Arg Arg Arg Cys Gln

995 1000 1005

Ser Leu Asn Arg Ala Leu Arg His Lys Pro Gly Glu Arg Pro Val

1010 1015 1020

Leu Gly Arg Pro Ala Lys Gly Glu Glu Ile Ala Asp Pro Cys Pro

1025 1030 1035

Ala Leu Leu Glu Lys Ile Asn Arg Leu Arg Asp Gln Arg Val Asp

1040 1045 1050

Gln Thr Ala His Ala Ile Leu Ala Ala Ala Leu Gly Val Arg Leu

1055 1060 1065

Arg Ala Pro Ser Lys Asp Arg Ala Glu Arg Arg His Arg Asp Ile

1070 1075 1080

His Gly Glu Tyr Glu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Asp Phe Val Val

1085 1090 1095

Ile Glu Asn Leu Ser Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Asp Arg Ala Arg

1100 1105 1110

Ser Glu Asn Thr Arg Leu Met Gln Trp Cys His Arg Gln Ile Val

1115 1120 1125

Gln Lys Leu Arg Gln Leu Cys Glu Thr Tyr Gly Ile Pro Val Leu

1130 1135 1140

Ala Val Pro Ala Ala Tyr Ser Ser Arg Phe Ser Ser Arg Asp Gly

1145 1150 1155

Ser Ala Gly Phe Arg Ala Val His Leu Thr Pro Asp His Arg His

1160 1165 1170

Arg Met Pro Trp Ser Arg Ile Leu Ala Arg Leu Lys Ala His Glu

1175 1180 1185

Glu Asp Gly Lys Arg Leu Glu Lys Thr Val Leu Asp Glu Ala Arg

1190 1195 1200

Ala Val Arg Gly Leu Phe Asp Arg Leu Asp Arg Phe Asn Ala Gly

1205 1210 1215

His Val Pro Gly Lys Pro Trp Arg Thr Leu Leu Ala Pro Leu Pro

1220 1225 1230

Gly Gly Pro Val Phe Val Pro Leu Gly Asp Ala Thr Pro Met Gln

1235 1240 1245

Ala Asp Leu Asn Ala Ala Ile Asn Ile Ala Leu Arg Gly Ile Ala

1250 1255 1260

Ala Pro Asp Arg His Asp Ile His His Arg Leu Arg Ala Glu Asn

1265 1270 1275

Lys Lys Arg Ile Leu Ser Leu Arg Leu Gly Thr Gln Arg Glu Lys

1280 1285 1290

Ala Arg Trp Pro Gly Gly Ala Pro Ala Val Thr Leu Ser Thr Pro

1295 1300 1305

Asn Asn Gly Ala Ser Pro Glu Asp Ser Asp Ala Leu Pro Glu Arg

1310 1315 1320

Val Ser Asn Leu Phe Val Asp Ile Ala Gly Val Ala Asn Phe Glu

1325 1330 1335

Arg Val Thr Ile Glu Gly Val Ser Gln Lys Phe Ala Thr Gly Arg

1340 1345 1350

Gly Leu Trp Ala Ser Val Lys Gln Arg Ala Trp Asn Arg Val Ala

1355 1360 1365

Arg Leu Asn Glu Thr Val Thr Asp Asn Asn Arg Asn Glu Glu Glu

1370 1375 1380

Asp Asp Ile Pro Met

1385

<210> 65

<211> 1108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 65

Met Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val

1 5 10 15

Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala

20 25 30

Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu

35 40 45

His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu

50 55 60

Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn

65 70 75 80

Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Val Val Phe Asn Ile Leu Arg

85 90 95

Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu

100 105 110

Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn

115 120 125

Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp

130 135 140

Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys

145 150 155 160

Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly

165 170 175

Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Phe Thr Asp

180 185 190

Ser Asn Glu Pro Ile Val Lys Glu Ile Lys Trp Met Glu Lys Ser Arg

195 200 205

Asn Gln Ser Val Arg Arg Leu Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Leu

210 215 220

Glu Arg Phe Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Leu Lys Val Lys Glu Glu

225 230 235 240

Tyr Glu Lys Val Glu Lys Glu His Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ile Lys

245 250 255

Glu Asp Ile Gln Ala Phe Lys Ser Leu Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Arg

260 265 270

Gln Glu Gln Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asn Thr Asn Glu Tyr Arg Leu

275 280 285

Ser Lys Arg Gly Leu Arg Gly Trp Arg Glu Ile Ile Gln Lys Trp Leu

290 295 300

Lys Met Asp Glu Asn Glu Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Glu Val Phe Lys

305 310 315 320

Asp Tyr Gln Arg Lys His Pro Arg Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Val Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Asn His Phe Ile Trp Arg Asn His Pro

340 345 350

Glu Tyr Pro Tyr Leu Tyr Ala Thr Phe Cys Glu Ile Asp Lys Lys Lys

355 360 365

Lys Asp Ala Lys Gln Gln Ala Thr Phe Thr Leu Ala Asp Pro Ile Asn

370 375 380

His Pro Leu Trp Val Arg Phe Glu Glu Arg Ser Gly Ser Asn Leu Asn

385 390 395 400

Lys Tyr Arg Ile Leu Thr Glu Gln Leu His Thr Glu Lys Leu Lys Lys

405 410 415

Lys Leu Thr Val Gln Leu Asp Arg Leu Ile Tyr Pro Thr Glu Ser Gly

420 425 430

Gly Trp Glu Glu Lys Gly Lys Val Asp Ile Val Leu Leu Pro Ser Arg

435 440 445

Gln Phe Tyr Asn Gln Ile Phe Leu Asp Ile Glu Glu Lys Gly Lys His

450 455 460

Ala Phe Thr Tyr Lys Asp Glu Ser Ile Lys Phe Pro Leu Lys Gly Thr

465 470 475 480

Leu Gly Gly Ala Arg Val Gln Phe Asp Arg Asp His Leu Arg Arg Tyr

485 490 495

Pro His Lys Val Glu Ser Gly Asn Val Gly Arg Ile Tyr Phe Asn Met

500 505 510

Thr Val Asn Ile Glu Pro Thr Glu Ser Pro Val Ser Lys Ser Leu Lys

515 520 525

Ile His Arg Asp Asp Phe Pro Lys Phe Val Asn Phe Lys Pro Lys Glu

530 535 540

Leu Thr Glu Trp Ile Lys Asp Ser Lys Gly Lys Lys Leu Lys Ser Gly

545 550 555 560

Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gly Leu Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly

565 570 575

Gln Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ile Phe Glu Val Val Asp Gln Lys

580 585 590

Pro Asp Ile Glu Gly Lys Leu Phe Phe Pro Ile Lys Gly Thr Glu Leu

595 600 605

Tyr Ala Val His Arg Ala Ser Phe Asn Ile Lys Leu Pro Gly Glu Thr

610 615 620

Leu Val Lys Ser Arg Glu Val Leu Arg Lys Ala Arg Glu Asp Asn Leu

625 630 635 640

Lys Leu Met Asn Gln Lys Leu Asn Phe Leu Arg Asn Val Leu His Phe

645 650 655

Gln Gln Phe Glu Asp Ile Thr Glu Arg Glu Lys Arg Val Thr Lys Trp

660 665 670

Ile Ser Arg Gln Glu Asn Ser Asp Val Pro Leu Val Tyr Gln Asp Glu

675 680 685

Leu Ile Gln Ile Arg Glu Leu Met Tyr Lys Pro Tyr Lys Asp Trp Val

690 695 700

Ala Phe Leu Lys Gln Leu His Lys Arg Leu Glu Val Glu Ile Gly Lys

705 710 715 720

Glu Val Lys His Trp Arg Lys Ser Leu Ser Asp Gly Arg Lys Gly Leu

725 730 735

Tyr Gly Ile Ser Leu Lys Asn Ile Asp Glu Ile Asp Arg Thr Arg Lys

740 745 750

Phe Leu Leu Arg Trp Ser Leu Arg Pro Thr Glu Pro Gly Glu Val Arg

755 760 765

Arg Leu Glu Pro Gly Gln Arg Phe Ala Ile Asp Gln Leu Asn His Leu

770 775 780

Asn Ala Leu Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Met Ala Asn Thr Ile Ile

785 790 795 800

Met His Ala Leu Gly Tyr Cys Tyr Asp Val Arg Lys Lys Lys Trp Gln

805 810 815

Ala Lys Asn Pro Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ser Asn

820 825 830

Tyr Asn Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Phe Glu Asn Ser Lys Leu Met

835 840 845

Lys Trp Ser Arg Arg Glu Ile Pro Arg Gln Val Ala Leu Gln Gly Glu

850 855 860

Ile Tyr Gly Leu Gln Val Gly Glu Val Gly Ala Gln Phe Ser Ser Arg

865 870 875 880

Phe His Ala Lys Thr Gly Ser Pro Gly Ile Arg Cys Ser Val Val Thr

885 890 895

Lys Glu Lys Leu Gln Asp Asn Arg Phe Phe Lys Asn Leu Gln Arg Glu

900 905 910

Gly Arg Leu Thr Leu Asp Lys Ile Ala Val Leu Lys Glu Gly Asp Leu

915 920 925

Tyr Pro Asp Lys Gly Gly Glu Lys Phe Ile Ser Leu Ser Lys Asp Arg

930 935 940

Lys Leu Val Thr Thr His Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln

945 950 955 960

Lys Arg Phe Trp Thr Arg Thr His Gly Phe Tyr Lys Val Tyr Cys Lys

965 970 975

Ala Tyr Gln Val Asp Gly Gln Thr Val Tyr Ile Pro Glu Ser Lys Asp

980 985 990

Gln Lys Gln Lys Ile Ile Glu Glu Phe Gly Glu Gly Tyr Phe Ile Leu

995 1000 1005

Lys Asp Gly Val Tyr Glu Trp Gly Asn Ala Gly Lys Leu Lys Ile

1010 1015 1020

Lys Lys Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp Ser

1025 1030 1035

Asp Ile Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys Gly

1040 1045 1050

Glu Lys Leu Met Leu Tyr Arg Asp Pro Ser Gly Asn Val Phe Pro

1055 1060 1065

Ser Asp Lys Trp Met Ala Ala Gly Val Phe Phe Gly Lys Leu Glu

1070 1075 1080

Arg Ile Leu Ile Ser Lys Leu Thr Asn Gln Tyr Ser Ile Ser Thr

1085 1090 1095

Ile Glu Asp Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met

1100 1105

<210> 66

<211> 1108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 66

Met Ala Ile Arg Ser Ile Lys Leu Lys Leu Lys Thr His Thr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Ala Gln Asn Leu Arg Lys Gly Ile Trp Arg Thr His Arg Leu Leu

20 25 30

Asn Glu Gly Val Ala Tyr Tyr Met Lys Met Leu Leu Leu Phe Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Thr Gly Glu Arg Pro Lys Glu Glu Leu Gln Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Cys His Ile Arg Glu Gln Gln Gln Arg Asn Gln Ala Asp Lys Asn Thr

65 70 75 80

Gln Ala Leu Pro Leu Asp Lys Ala Leu Glu Ala Leu Arg Gln Leu Tyr

85 90 95

Glu Leu Leu Val Pro Ser Ser Val Gly Gln Ser Gly Asp Ala Gln Ile

100 105 110

Ile Ser Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu Val Asp Pro Asn Ser Glu Gly

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Ser Lys Ala Gly Ala Lys Pro Thr Trp Gln Lys Lys

130 135 140

Lys Glu Ala Asn Asp Pro Thr Trp Glu Gln Asp Tyr Glu Lys Trp Lys

145 150 155 160

Lys Arg Arg Glu Glu Asp Pro Thr Ala Ser Val Ile Thr Thr Leu Glu

165 170 175

Glu Tyr Gly Ile Arg Pro Ile Phe Pro Leu Tyr Thr Asn Thr Val Thr

180 185 190

Asp Ile Ala Trp Leu Pro Leu Gln Ser Asn Gln Phe Val Arg Thr Trp

195 200 205

Asp Arg Asp Met Leu Gln Gln Ala Ile Glu Arg Leu Leu Ser Trp Glu

210 215 220

Ser Trp Asn Lys Arg Val Gln Glu Glu Tyr Ala Lys Leu Lys Glu Lys

225 230 235 240

Met Ala Gln Leu Asn Glu Gln Leu Glu Gly Gly Gln Glu Trp Ile Ser

245 250 255

Leu Leu Glu Gln Tyr Glu Glu Asn Arg Glu Arg Glu Leu Arg Glu Asn

260 265 270

Met Thr Ala Ala Asn Asp Lys Tyr Arg Ile Thr Lys Arg Gln Met Lys

275 280 285

Gly Trp Asn Glu Leu Tyr Glu Leu Trp Ser Thr Phe Pro Ala Ser Ala

290 295 300

Ser His Glu Gln Tyr Lys Glu Ala Leu Lys Arg Val Gln Gln Arg Leu

305 310 315 320

Arg Gly Arg Phe Gly Asp Ala His Phe Phe Gln Tyr Leu Met Glu Glu

325 330 335

Lys Asn Arg Leu Ile Trp Lys Gly Asn Pro Gln Arg Ile His Tyr Phe

340 345 350

Val Ala Arg Asn Glu Leu Thr Lys Arg Leu Glu Glu Ala Lys Gln Ser

355 360 365

Ala Thr Met Thr Leu Pro Asn Ala Arg Lys His Pro Leu Trp Val Arg

370 375 380

Phe Asp Ala Arg Gly Gly Asn Leu Gln Asp Tyr Tyr Leu Thr Ala Glu

385 390 395 400

Ala Asp Lys Pro Arg Ser Arg Arg Phe Val Thr Phe Ser Gln Leu Ile

405 410 415

Trp Pro Ser Glu Ser Gly Trp Met Glu Lys Lys Asp Val Glu Val Glu

420 425 430

Leu Ala Leu Ser Arg Gln Phe Tyr Gln Gln Val Lys Leu Leu Lys Asn

435 440 445

Asp Lys Gly Lys Gln Lys Ile Glu Phe Lys Asp Lys Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Thr Phe Asn Gly His Leu Gly Gly Ala Lys Leu Gln Leu Glu Arg Gly

465 470 475 480

Asp Leu Glu Lys Glu Glu Lys Asn Phe Glu Asp Gly Glu Ile Gly Ser

485 490 495

Val Tyr Leu Asn Val Val Ile Asp Phe Glu Pro Leu Gln Glu Val Lys

500 505 510

Asn Gly Arg Val Gln Ala Pro Tyr Gly Gln Val Leu Gln Leu Ile Arg

515 520 525

Arg Pro Asn Glu Phe Pro Lys Val Thr Thr Tyr Lys Ser Glu Gln Leu

530 535 540

Val Glu Trp Ile Lys Ala Ser Pro Gln His Ser Ala Gly Val Glu Ser

545 550 555 560

Leu Ala Ser Gly Phe Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly Leu Arg Ala

565 570 575

Ala Ala Ala Thr Ser Ile Phe Ser Val Glu Glu Ser Ser Asp Lys Asn

580 585 590

Ala Ala Asp Phe Ser Tyr Trp Ile Glu Gly Thr Pro Leu Val Ala Val

595 600 605

His Gln Arg Ser Tyr Met Leu Arg Leu Pro Gly Glu Gln Val Glu Lys

610 615 620

Gln Val Met Glu Lys Arg Asp Glu Arg Phe Gln Leu His Gln Arg Val

625 630 635 640

Lys Phe Gln Ile Arg Val Leu Ala Gln Ile Met Arg Met Ala Asn Lys

645 650 655

Gln Tyr Gly Asp Arg Trp Asp Glu Leu Asp Ser Leu Lys Gln Ala Val

660 665 670

Glu Gln Lys Lys Ser Pro Leu Asp Gln Thr Asp Arg Thr Phe Trp Glu

675 680 685

Gly Ile Val Cys Asp Leu Thr Lys Val Leu Pro Arg Asn Glu Ala Asp

690 695 700

Trp Glu Gln Ala Val Val Gln Ile His Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Val

705 710 715 720

Gly Lys Ala Val Gln Ala Trp Arg Lys Arg Phe Ala Ala Asp Glu Arg

725 730 735

Lys Gly Ile Ala Gly Leu Ser Met Trp Asn Ile Glu Glu Leu Glu Gly

740 745 750

Leu Arg Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ser Arg Arg Thr Arg Asn Pro Gln

755 760 765

Glu Val Asn Arg Phe Glu Arg Gly His Thr Ser His Gln Arg Leu Leu

770 775 780

Thr His Ile Gln Asn Val Lys Glu Asp Arg Leu Lys Gln Leu Ser His

785 790 795 800

Ala Ile Val Met Thr Ala Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Glu Arg Lys Gln

805 810 815

Glu Trp Cys Ala Glu Tyr Pro Ala Cys Gln Val Ile Leu Phe Glu Asn

820 825 830

Leu Ser Gln Tyr Arg Ser Asn Leu Asp Arg Ser Thr Lys Glu Asn Ser

835 840 845

Thr Leu Met Lys Trp Ala His Arg Ser Ile Pro Lys Tyr Val His Met

850 855 860

Gln Ala Glu Pro Tyr Gly Ile Gln Ile Gly Asp Val Arg Ala Glu Tyr

865 870 875 880

Ser Ser Arg Phe Tyr Ala Lys Thr Gly Thr Pro Gly Ile Arg Cys Lys

885 890 895

Lys Val Arg Gly Gln Asp Leu Gln Gly Arg Arg Phe Glu Asn Leu Gln

900 905 910

Lys Arg Leu Val Asn Glu Gln Phe Leu Thr Glu Glu Gln Val Lys Gln

915 920 925

Leu Arg Pro Gly Asp Ile Val Pro Asp Asp Ser Gly Glu Leu Phe Met

930 935 940

Thr Leu Thr Asp Gly Ser Gly Ser Lys Glu Val Val Phe Leu Gln Ala

945 950 955 960

Asp Ile Asn Ala Ala His Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Gln Arg Tyr

965 970 975

Asn Glu Leu Phe Lys Val Ser Cys Arg Val Ile Val Arg Asp Glu Glu

980 985 990

Glu Tyr Leu Val Pro Lys Thr Lys Ser Val Gln Ala Lys Leu Gly Lys

995 1000 1005

Gly Leu Phe Val Lys Lys Ser Asp Thr Ala Trp Lys Asp Val Tyr

1010 1015 1020

Val Trp Asp Ser Gln Ala Lys Leu Lys Gly Lys Thr Thr Phe Thr

1025 1030 1035

Glu Glu Ser Glu Ser Pro Glu Gln Leu Glu Asp Phe Gln Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Glu Glu Ala Glu Glu Ala Lys Gly Thr Tyr Arg Thr Leu Phe

1055 1060 1065

Arg Asp Pro Ser Gly Val Phe Phe Pro Glu Ser Val Trp Tyr Pro

1070 1075 1080

Gln Lys Asp Phe Trp Gly Glu Val Lys Arg Lys Leu Tyr Gly Lys

1085 1090 1095

Leu Arg Glu Arg Phe Leu Thr Lys Ala Arg

1100 1105

<210> 67

<211> 1334

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 67

Met Lys Ile Ser Lys Val Asp His Thr Arg Met Ala Val Ala Lys Gly

1 5 10 15

Asn Gln His Arg Arg Asp Glu Ile Ser Gly Ile Leu Tyr Lys Asp Pro

20 25 30

Thr Lys Thr Gly Ser Ile Asp Phe Asp Glu Arg Phe Lys Lys Leu Asn

35 40 45

Cys Ser Ala Lys Ile Leu Tyr His Val Phe Asn Gly Ile Ala Glu Gly

50 55 60

Ser Asn Lys Tyr Lys Asn Ile Val Asp Lys Val Asn Asn Asn Leu Asp

65 70 75 80

Arg Val Leu Phe Thr Gly Lys Ser Tyr Asp Arg Lys Ser Ile Ile Asp

85 90 95

Ile Asp Thr Val Leu Arg Asn Val Glu Lys Ile Asn Ala Phe Asp Arg

100 105 110

Ile Ser Thr Glu Glu Arg Glu Gln Ile Ile Asp Asp Leu Leu Glu Ile

115 120 125

Gln Leu Arg Lys Gly Leu Arg Lys Gly Lys Ala Gly Leu Arg Glu Val

130 135 140

Leu Leu Ile Gly Ala Gly Val Ile Val Arg Thr Asp Lys Lys Gln Glu

145 150 155 160

Ile Ala Asp Phe Leu Glu Ile Leu Asp Glu Asp Phe Asn Lys Thr Asn

165 170 175

Gln Ala Lys Asn Ile Lys Leu Ser Ile Glu Asn Gln Gly Leu Val Val

180 185 190

Ser Pro Val Ser Arg Gly Glu Glu Arg Ile Phe Asp Val Ser Gly Ala

195 200 205

Gln Lys Gly Lys Ser Ser Lys Lys Ala Gln Glu Lys Glu Ala Leu Ser

210 215 220

Ala Phe Leu Leu Asp Tyr Ala Asp Leu Asp Lys Asn Val Arg Phe Glu

225 230 235 240

Tyr Leu Arg Lys Ile Arg Arg Leu Ile Asn Leu Tyr Phe Tyr Val Lys

245 250 255

Asn Asp Asp Val Met Ser Leu Thr Glu Ile Pro Ala Glu Val Asn Leu

260 265 270

Glu Lys Asp Phe Asp Ile Trp Arg Asp His Glu Gln Arg Lys Glu Glu

275 280 285

Asn Gly Asp Phe Val Gly Cys Pro Asp Ile Leu Leu Ala Asp Arg Asp

290 295 300

Val Lys Lys Ser Asn Ser Lys Gln Val Lys Ile Ala Glu Arg Gln Leu

305 310 315 320

Arg Glu Ser Ile Arg Glu Lys Asn Ile Lys Arg Tyr Arg Phe Ser Ile

325 330 335

Lys Thr Ile Glu Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Phe Phe Ala Asn Lys Gln

340 345 350

Ile Ser Val Phe Trp Ile His Arg Ile Glu Asn Ala Val Glu Arg Ile

355 360 365

Leu Gly Ser Ile Asn Asp Lys Lys Leu Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Tyr

370 375 380

Leu Gly Glu Lys Val Trp Lys Asp Ile Leu Asn Phe Leu Ser Ile Lys

385 390 395 400

Tyr Ile Ala Val Gly Lys Ala Val Phe Asn Phe Ala Met Asp Asp Leu

405 410 415

Gln Glu Lys Asp Arg Asp Ile Glu Pro Gly Lys Ile Ser Glu Asn Ala

420 425 430

Val Asn Gly Leu Thr Ser Phe Asp Tyr Glu Gln Ile Lys Ala Asp Glu

435 440 445

Met Leu Gln Arg Glu Val Ala Val Asn Val Ala Phe Ala Ala Asn Asn

450 455 460

Leu Ala Arg Val Thr Val Asp Ile Pro Gln Asn Gly Glu Lys Glu Asp

465 470 475 480

Ile Leu Leu Trp Asn Lys Ser Asp Ile Lys Lys Tyr Lys Lys Asn Ser

485 490 495

Lys Lys Gly Ile Leu Lys Ser Ile Leu Gln Phe Phe Gly Gly Ala Ser

500 505 510

Thr Trp Asn Met Lys Met Phe Glu Ile Ala Tyr His Asp Gln Pro Gly

515 520 525

Asp Tyr Glu Glu Asn Tyr Leu Tyr Asp Ile Ile Gln Ile Ile Tyr Ser

530 535 540

Leu Arg Asn Lys Ser Phe His Phe Lys Thr Tyr Asp His Gly Asp Lys

545 550 555 560

Asn Trp Asn Arg Glu Leu Ile Gly Lys Met Ile Glu His Asp Ala Glu

565 570 575

Arg Val Ile Ser Val Glu Arg Glu Lys Phe His Ser Asn Asn Leu Pro

580 585 590

Met Phe Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Lys Lys Ile Leu Asp Leu Leu Tyr

595 600 605

Ser Asp Tyr Ala Gly Arg Ala Ser Gln Val Pro Ala Phe Asn Thr Val

610 615 620

Leu Val Arg Lys Asn Phe Pro Glu Phe Leu Arg Lys Asp Met Gly Tyr

625 630 635 640

Lys Val His Phe Asn Asn Pro Glu Val Glu Asn Gln Trp His Ser Ala

645 650 655

Val Tyr Tyr Leu Tyr Lys Glu Ile Tyr Tyr Asn Leu Phe Leu Arg Asp

660 665 670

Lys Glu Val Lys Asn Leu Phe Tyr Thr Ser Leu Lys Asn Ile Arg Ser

675 680 685

Glu Val Ser Asp Lys Lys Gln Lys Leu Ala Ser Asp Asp Phe Ala Ser

690 695 700

Arg Cys Glu Glu Ile Glu Asp Arg Ser Leu Pro Glu Ile Cys Gln Ile

705 710 715 720

Ile Met Thr Glu Tyr Asn Ala Gln Asn Phe Gly Asn Arg Lys Val Lys

725 730 735

Ser Gln Arg Val Ile Glu Lys Asn Lys Asp Ile Phe Arg His Tyr Lys

740 745 750

Met Leu Leu Ile Lys Thr Leu Ala Gly Ala Phe Ser Leu Tyr Leu Lys

755 760 765

Gln Glu Arg Phe Ala Phe Ile Gly Lys Ala Thr Pro Ile Pro Tyr Glu

770 775 780

Thr Thr Asp Val Lys Asn Phe Leu Pro Glu Trp Lys Ser Gly Met Tyr

785 790 795 800

Ala Ser Phe Val Glu Glu Ile Lys Asn Asn Leu Asp Leu Gln Glu Trp

805 810 815

Tyr Ile Val Gly Arg Phe Leu Asn Gly Arg Met Leu Asn Gln Leu Ala

820 825 830

Gly Ser Leu Arg Ser Tyr Ile Gln Tyr Ala Glu Asp Ile Glu Arg Arg

835 840 845

Ala Ala Glu Asn Arg Asn Lys Leu Phe Ser Lys Pro Asp Glu Lys Ile

850 855 860

Glu Ala Cys Lys Lys Ala Val Arg Val Leu Asp Leu Cys Ile Lys Ile

865 870 875 880

Ser Thr Arg Ile Ser Ala Glu Phe Thr Asp Tyr Phe Asp Ser Glu Asp

885 890 895

Asp Tyr Ala Asp Tyr Leu Glu Lys Tyr Leu Lys Tyr Gln Asp Asp Ala

900 905 910

Ile Lys Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Ala Ala Leu Asp His Phe Cys

915 920 925

Asn Lys Asp Asp Leu Lys Phe Asp Ile Tyr Val Asn Ala Gly Gln Lys

930 935 940

Pro Ile Leu Gln Arg Asn Ile Val Met Ala Lys Leu Phe Gly Pro Asp

945 950 955 960

Asn Ile Leu Ser Glu Val Met Glu Lys Val Thr Glu Ser Ala Ile Arg

965 970 975

Glu Tyr Tyr Asp Tyr Leu Lys Lys Val Ser Gly Tyr Arg Val Arg Gly

980 985 990

Lys Cys Ser Thr Glu Lys Glu Gln Glu Asp Leu Leu Lys Phe Gln Arg

995 1000 1005

Leu Lys Asn Ala Val Glu Phe Arg Asp Val Thr Glu Tyr Ala Glu

1010 1015 1020

Val Ile Asn Glu Leu Leu Gly Gln Leu Ile Ser Trp Ser Tyr Leu

1025 1030 1035

Arg Glu Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly Phe His Tyr Met

1040 1045 1050

Cys Leu Lys Asn Lys Ser Phe Lys Pro Ala Glu Tyr Val Asp Ile

1055 1060 1065

Arg Arg Asn Asn Gly Thr Ile Ile His Asn Ala Ile Leu Tyr Gln

1070 1075 1080

Ile Val Ser Met Tyr Ile Asn Gly Leu Asp Phe Tyr Ser Cys Asp

1085 1090 1095

Lys Glu Gly Lys Thr Leu Lys Pro Ile Glu Thr Gly Lys Gly Val

1100 1105 1110

Gly Ser Lys Ile Gly Gln Phe Ile Lys Tyr Ser Gln Tyr Leu Tyr

1115 1120 1125

Asn Asp Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Ile Tyr Asn Ala Gly Leu Glu

1130 1135 1140

Val Phe Glu Asn Ile Asp Glu His Asp Asn Ile Thr Asp Leu Arg

1145 1150 1155

Lys Tyr Val Asp His Phe Lys Tyr Tyr Ala Tyr Gly Asn Lys Met

1160 1165 1170

Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Ser Glu Phe Phe Asp Arg Phe Phe Thr

1175 1180 1185

Tyr Asp Met Lys Tyr Gln Lys Asn Val Val Asn Val Leu Glu Asn

1190 1195 1200

Ile Leu Leu Arg His Phe Val Ile Phe Tyr Pro Lys Phe Gly Ser

1205 1210 1215

Gly Lys Lys Asp Val Gly Ile Arg Asp Cys Lys Lys Glu Arg Ala

1220 1225 1230

Gln Ile Glu Ile Ser Glu Gln Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Met

1235 1240 1245

Phe Lys Leu Asp Asp Lys Ala Gly Glu Glu Ala Lys Lys Phe Pro

1250 1255 1260

Ala Arg Asp Glu Arg Tyr Leu Gln Thr Ile Ala Lys Leu Leu Tyr

1265 1270 1275

Tyr Pro Asn Glu Ile Glu Asp Met Asn Arg Phe Met Lys Lys Gly

1280 1285 1290

Glu Thr Ile Asn Lys Lys Val Gln Phe Asn Arg Lys Lys Lys Ile

1295 1300 1305

Thr Arg Lys Gln Lys Asn Asn Ser Ser Asn Glu Val Leu Ser Ser

1310 1315 1320

Thr Met Gly Tyr Leu Phe Lys Asn Ile Lys Leu

1325 1330

<210> 68

<211> 1120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 68

Met Trp Ile Ser Ile Lys Thr Leu Ile His His Leu Gly Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Cys Asp Tyr Met Tyr Asn Arg Arg Glu Lys Lys Ile Ile Glu Val

20 25 30

Lys Thr Met Arg Ile Thr Lys Val Glu Val Asp Arg Lys Lys Val Leu

35 40 45

Ile Ser Arg Asp Lys Asn Gly Gly Lys Leu Val Tyr Glu Asn Glu Met

50 55 60

Gln Asp Asn Thr Glu Gln Ile Met His His Lys Lys Ser Ser Phe Tyr

65 70 75 80

Lys Ser Val Val Asn Lys Thr Ile Cys Arg Pro Glu Gln Lys Gln Met

85 90 95

Lys Lys Leu Val His Gly Leu Leu Gln Glu Asn Ser Gln Glu Lys Ile

100 105 110

Lys Val Ser Asp Val Thr Lys Leu Asn Ile Ser Asn Phe Leu Asn His

115 120 125

Arg Phe Lys Lys Ser Leu Tyr Tyr Phe Pro Glu Asn Ser Pro Asp Lys

130 135 140

Ser Glu Glu Tyr Arg Ile Glu Ile Asn Leu Ser Gln Leu Leu Glu Asp

145 150 155 160

Ser Leu Lys Lys Gln Gln Gly Thr Phe Ile Cys Trp Glu Ser Phe Ser

165 170 175

Lys Asp Met Glu Leu Tyr Ile Asn Trp Ala Glu Asn Tyr Ile Ser Ser

180 185 190

Lys Thr Lys Leu Ile Lys Lys Ser Ile Arg Asn Asn Arg Ile Gln Ser

195 200 205

Thr Glu Ser Arg Ser Gly Gln Leu Met Asp Arg Tyr Met Lys Asp Ile

210 215 220

Leu Asn Lys Asn Lys Pro Phe Asp Ile Gln Ser Val Ser Glu Lys Tyr

225 230 235 240

Gln Leu Glu Lys Leu Thr Ser Ala Leu Lys Ala Thr Phe Lys Glu Ala

245 250 255

Lys Lys Asn Asp Lys Glu Ile Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Thr Leu Gln

260 265 270

Asn His Glu Arg Gln Ile Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Ser Glu Leu

275 280 285

Asn Gln Phe Asn Ile Glu Ile Arg Lys His Leu Glu Thr Tyr Phe Pro

290 295 300

Ile Lys Lys Thr Asn Arg Lys Val Gly Asp Ile Arg Asn Leu Glu Ile

305 310 315 320

Gly Glu Ile Gln Lys Ile Val Asn His Arg Leu Lys Asn Lys Ile Val

325 330 335

Gln Arg Ile Leu Gln Glu Gly Lys Leu Ala Ser Tyr Glu Ile Glu Ser

340 345 350

Thr Val Asn Ser Asn Ser Leu Gln Lys Ile Lys Ile Glu Glu Ala Phe

355 360 365

Ala Leu Lys Phe Ile Asn Ala Cys Leu Phe Ala Ser Asn Asn Leu Arg

370 375 380

Asn Met Val Tyr Pro Val Cys Lys Lys Asp Ile Leu Met Ile Gly Glu

385 390 395 400

Phe Lys Asn Ser Phe Lys Glu Ile Lys His Lys Lys Phe Ile Arg Gln

405 410 415

Trp Ser Gln Phe Phe Ser Gln Glu Ile Thr Val Asp Asp Ile Glu Leu

420 425 430

Ala Ser Trp Gly Leu Arg Gly Ala Ile Ala Pro Ile Arg Asn Glu Ile

435 440 445

Ile His Leu Lys Lys His Ser Trp Lys Lys Phe Phe Asn Asn Pro Thr

450 455 460

Phe Lys Val Lys Lys Ser Lys Ile Ile Asn Gly Lys Thr Lys Asp Val

465 470 475 480

Thr Ser Glu Phe Leu Tyr Lys Glu Thr Leu Phe Lys Asp Tyr Phe Tyr

485 490 495

Ser Glu Leu Asp Ser Val Pro Glu Leu Ile Ile Asn Lys Met Glu Ser

500 505 510

Ser Lys Ile Leu Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Gln Leu Asn Gln Val Phe

515 520 525

Thr Ile Pro Asn Phe Glu Leu Ser Leu Leu Thr Ser Ala Val Pro Phe

530 535 540

Ala Pro Ser Phe Lys Arg Val Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Tyr Gln Asn

545 550 555 560

Gln Asp Glu Ala Gln Pro Asp Tyr Asn Leu Lys Leu Asn Ile Tyr Asn

565 570 575

Glu Lys Ala Phe Asn Ser Glu Ala Phe Gln Ala Gln Tyr Ser Leu Phe

580 585 590

Lys Met Val Tyr Tyr Gln Val Phe Leu Pro Gln Phe Thr Thr Asn Asn

595 600 605

Asp Leu Phe Lys Ser Ser Val Asp Phe Ile Leu Thr Leu Asn Lys Glu

610 615 620

Arg Lys Gly Tyr Ala Lys Ala Phe Gln Asp Ile Arg Lys Met Asn Lys

625 630 635 640

Asp Glu Lys Pro Ser Glu Tyr Met Ser Tyr Ile Gln Ser Gln Leu Met

645 650 655

Leu Tyr Gln Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Lys Ile Asn His Phe Glu

660 665 670

Lys Phe Ile Asn Gln Val Phe Ile Lys Gly Phe Asn Ser Phe Ile Glu

675 680 685

Lys Asn Arg Leu Thr Tyr Ile Cys His Pro Thr Lys Asn Thr Val Pro

690 695 700

Glu Asn Asp Asn Ile Glu Ile Pro Phe His Thr Asp Met Asp Asp Ser

705 710 715 720

Asn Ile Ala Phe Trp Leu Met Cys Lys Leu Leu Asp Ala Lys Gln Leu

725 730 735

Ser Glu Leu Arg Asn Glu Met Ile Lys Phe Ser Cys Ser Leu Gln Ser

740 745 750

Thr Glu Glu Ile Ser Thr Phe Thr Lys Ala Arg Glu Val Ile Gly Leu

755 760 765

Ala Leu Leu Asn Gly Glu Lys Gly Cys Asn Asp Trp Lys Glu Leu Phe

770 775 780

Asp Asp Lys Glu Ala Trp Lys Lys Asn Met Ser Leu Tyr Val Ser Glu

785 790 795 800

Glu Leu Leu Gln Ser Leu Pro Tyr Thr Gln Glu Asp Gly Gln Thr Pro

805 810 815

Val Ile Asn Arg Ser Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Gly Thr Glu Thr

820 825 830

Ile Leu Glu Lys Leu Phe Ser Ser Ser Asp Asp Tyr Lys Val Ser Ala

835 840 845

Lys Asp Ile Ala Lys Leu His Glu Tyr Asp Val Thr Glu Lys Ile Ala

850 855 860

Gln Gln Glu Ser Leu His Lys Gln Trp Ile Glu Lys Pro Gly Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asp Ser Ala Trp Thr Lys Lys Tyr Gln Asn Val Ile Asn Asp Ile

885 890 895

Ser Asn Tyr Gln Trp Ala Lys Thr Lys Val Glu Leu Thr Gln Val Arg

900 905 910

His Leu His Gln Leu Thr Ile Asp Leu Leu Ser Arg Leu Ala Gly Tyr

915 920 925

Met Ser Ile Ala Asp Arg Asp Phe Gln Phe Ser Ser Asn Tyr Ile Leu

930 935 940

Glu Arg Glu Asn Ser Glu Tyr Arg Val Thr Ser Trp Ile Leu Leu Ser

945 950 955 960

Glu Asn Lys Asn Lys Asn Lys Tyr Asn Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Leu

965 970 975

Lys Asn Ala Ser Ile Lys Val Ser Ser Lys Asn Asp Pro Gln Leu Lys

980 985 990

Val Asp Leu Lys Gln Leu Arg Leu Thr Leu Glu Tyr Leu Glu Leu Phe

995 1000 1005

Asp Asn Arg Leu Lys Glu Lys Arg Asn Asn Ile Ser His Phe Asn

1010 1015 1020

Tyr Leu Asn Gly Gln Leu Gly Asn Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asp

1025 1030 1035

Asp Ala Arg Asp Val Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala

1040 1045 1050

Val Ser Lys Ser Leu Lys Glu Ile Leu Ser Ser His Gly Met Glu

1055 1060 1065

Val Thr Phe Lys Pro Leu Tyr Gln Thr Asn His His Leu Lys Ile

1070 1075 1080

Asp Lys Leu Gln Pro Lys Lys Ile His His Leu Gly Glu Lys Ser

1085 1090 1095

Thr Val Ser Ser Asn Gln Val Ser Asn Glu Tyr Cys Gln Leu Val

1100 1105 1110

Arg Thr Leu Leu Thr Met Lys

1115 1120

<210> 69

<211> 1152

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<400> 69

Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu

1 5 10 15

Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu

20 25 30

Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn

35 40 45

Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr

85 90 95

Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe

100 105 110

Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn

130 135 140

Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile

145 150 155 160

Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile

165 170 175

Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn

180 185 190

Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu

195 200 205

Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys

210 215 220

Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu

225 230 235 240

Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile

245 250 255

Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser

260 265 270

Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys

275 280 285

Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln

290 295 300

Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp

305 310 315 320

Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu

325 330 335

Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys

340 345 350

Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile

355 360 365

Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val

370 375 380

Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn

385 390 395 400

Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn

405 410 415

Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn

420 425 430

Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser

435 440 445

Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala

450 455 460

Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe

465 470 475 480

Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala

485 490 495

Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys

500 505 510

Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe

515 520 525

Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys

530 535 540

Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys

545 550 555 560

Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp

565 570 575

Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu

580 585 590

Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser

595 600 605

Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln

610 615 620

Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile

625 630 635 640

Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu

645 650 655

Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe

660 665 670

Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn

675 680 685

Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile

690 695 700

Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys

705 710 715 720

Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His

725 730 735

Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys

740 745 750

Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Leu Asn

755 760 765

His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Ser

770 775 780

Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu Leu Glu Leu Ile Asn Leu

785 790 795 800

Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala

805 810 815

Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Glu Asn Lys Ile Lys Asp

820 825 830

Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly

835 840 845

Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly

850 855 860

Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile

865 870 875 880

Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu

885 890 895

Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala Arg Pro

900 905 910

Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys

915 920 925

Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Glu

930 935 940

Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Lys Ile Leu His

945 950 955 960

Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg

965 970 975

Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr Ile Glu Glu Ile Phe Asn

980 985 990

Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Glu

995 1000 1005

Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Asp Asn Val Glu

1010 1015 1020

Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys Lys Leu Lys Gln

1025 1030 1035

Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn

1040 1045 1050

Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn

1055 1060 1065

Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile

1070 1075 1080

Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala