Вид РИД
Изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной диагностике, и может быть использовано в пищевой промышленности для видовой идентификации рыб семейства тресковых (Gadidae) в пищевых продуктах и продовольственном сырье.
Cуществуют стандарты, регламентирующие видовую идентификацию рыб, в том числе семейства тресковых способами электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [ГОСТ Р 54414-2011 Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2013.], изоэлектрофокусировки [ГОСТ Р 52840-2007 Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2008.] и секвенирования [ГОСТ 34106-2017 Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции. Москва, Стандартинформ, 2017.].
Однако, эти способы по сравнению с ПЦР в режиме реального времени более трудоемки и времязатратны, требуют наличия у персонала специальных навыков, более сложного оборудования и наличия стандартных образцов для каждого вида рыб.
Известен подход к видовой идентификации тресковых рыб [Namikoshi, A., Takashima, Y., Iguchi, J., Yanagimoto, T., &Yamashita, M. (2011). Species identification of Alaska pollock, Gadus spp., and Micromesistius spp. in cod roe products using a PCR-based method.FisheriesScience, 77(4), 671-678.], основанный на детекции видоспецифической ДНК методом ПЦР. Тест-системы, описанные в этой научной работе, в качестве метода регистрации результата используют гель-электрофорез, что существенно усложняет анализ и увеличивает время, необходимое для его проведения.
Технической задачей настоящего изобретения является идентификация рыб семейства тресковых с помощью обнаружения специфических ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени».
Способ основан на выявлении специфических участков генапантофизина, NADH-дегидрогеназы, АТФазы 6 и родопсина с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов. Разработанные олигонуклеотиды имеют следующие последовательности:
|
Для проведения ПЦР используют геномную ДНК рыб. Для выделения ДНК используют готовые наборы реактивов, предназначенные для работы с пищевыми продуктами и продовольственным сырьем. Выделение ДНК осуществляют из кусочков филе рыб или образца продукта питания, не имевших контакта с внешней средой (с целью избежать возможной исходной контаминации чужеродной ДНК) в соответствии с протоколом (инструкцией по применению), рекомендованным производителем.
Оценку чистоты полученных препаратов ДНК производят спектрофотометрическим методом с помощью спектрофотометра, позволяющего измерять оптическую плотность при длинах волн 260 и 280 нм. Для анализа используют препараты ДНК с соотношением оптической плотности при длинах волн 260 нм и 280 нм (A260/A280) в пределах 1,8-2,0. Полученные препараты ДНК хранят в морозильной камере при −20°С до использования.
Для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени» используют амплификатор нуклеиновых кислот, позволяющий осуществлять термоциклирование и одновременную регистрацию флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» в формате микропробирок, микрочипов или микропланшетов.
Разработанный состав смеси для ПЦР и концентрации отдельных компонентов представлены в таблице.
|
Объем реакции может быть масштабирован в соответствии с типом используемого оборудования (амплификатора нуклеиновых кислот).
Для корректной работы тест-систем используется следующая программа термоциклирования:
Первичная денатурация - 120с при 94°С с последующим циклированием: денатурация - 5с при 94°С, отжиг праймеров и элонгация - 30с при 60°С (45 циклов). Регистрация сигнала осуществляется после прохождения этапа отжига праймеров и элонгации.
Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривойфлуоресценции с установленной пороговой линией (Threshold) и значения порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора, следующим образом:
1. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30.
2. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно выполняются следующие условия:
- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышают 30;
- в пробирках/реакторах с тест-системами для определения путассу (Micromesisteus poutassou) и сайды (Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30.
3. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают не обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышает 30.
4. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают не обнаруженной, если выполняется хотя бы одно из следующих условий:
- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышают 30;
- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) и сайды (Pollachius virens);
- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) и путассу (Micromesisteus poutassou).
Разработанный способ видовой идентификации тресковых рыб по сравнению с существующими методами обладает следующими преимуществами:
- возможность идентификации основных промысловых видов тресковых рыб;
- идентификация всех заявленных видов тресковых рыб в рамках одного анализа за счет оптимизированных последовательностей специфических олигонуклеотидов и унифицированной программы термоциклирования;
- ускоренное по сравнению с существующими способами получение результата анализа.
--->
Перечень последовательностей
<110> Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит"
<120> СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР
В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
<140> 2020133599
<141> 13.10.2020
<160> 21
<210> 1
<211> 26
<212>ДНК
<213>Gadus macrocephalus
<400> 1
atgtgtcagattataccagttaattc
<210>2
<211> 24
<212>ДНК
<213>Gadus macrocephalus
<400> 2
gttggttaaattgtataacaagga
<210>3
<211> 22
<212>ДНК
<213>Gadus macrocephalus
<400>3
tctgggcgtgacctcaacacta
<210> 4
<211> 24
<212>ДНК
<213>Gadus morhua
<400> 4
caatgttaatgtttctcctacttt
<210>5
<211> 20
<212>ДНК
<213>Gadus morhua
<400> 5
tgacgaagtgtagttgccaa
<210>6
<211> 24
<212>ДНК
<213>Gadus morhua
<400> 6
cagcatccttaccaagtccctacc
<210> 7
<211> 23
<212>ДНК
<213>Gadus chalcogrammus
<400> 7
gcaatgttaatgtttctcctact
<210>8
<211> 22
<212>ДНК
<213>Gadus chalcogrammus
<400> 8
agttagttgccaataaggaaag
<210> 9
<211> 25
<212>ДНК
<213>Gadus chalcogrammus
<400> 9
cagcattcttacacagtccctacct
<210> 10
<211> 20
<212>ДНК
<213>Melanogrammus aeglefinus
<400>10
aatttaggcttagctgttcc
<210>11
<211> 20
<212>ДНК
<213>Melanogrammus aeglefinus
<400>11
gaattagagctgtaggggtg
<210>12
<211> 27
<212>ДНК
<213>Melanogrammus aeglefinus
<400>12
tagcaactgttcttattggaatacgaa
<210>13
<211> 22
<212>ДНК
<213>Micromesisteus poutassou
<400>13
actctcctggttgattgatatt
<210>14
<211> 20
<212>ДНК
<213>Micromesisteus poutassou
<400>14
ctatacaggtgttggaagcc
<210>15
<211> 26
<212>ДНК
<213>Micromesisteus poutassou
<400> 15
cttgtttcttagattgatgcagcatt
<210>16
<211> 21
<212>ДНК
<213>Pollachius virens
<400> 16
gtttgtgctatcatacccatc
<210>17
<211> 20
<212>ДНК
<213>Pollachius virens
<400> 17
ggactttgtaagaatgctgc
<210>18
<211> 22
<212>ДНК
<213>Pollachius virens
<400> 18
ctcctaaatcgtggctggttga
<210>19
<211> 16
<212>ДНК
<213>Merlangius merlangus
<400>19
tacacccgcgctgagg
<210>20
<211> 20
<212>ДНК
<213>Merlangius merlangus
<400>20
gtagatggacgaggacttgg
<210>21
<211> 20
<212>ДНК
<213>Merlangius merlangus
<400>21
agatgggaccgaagacgctg
<---