Результат интеллектуальной деятельности: Способ стратификации резидуального воспалительного риска атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний по уровню мономерного С-реактивного белка

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии и лабораторной диагностике и может быть использовано при стратификации резидуального воспалительного риска атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний.

В настоящее время развивается концепция резидуального воспалительного сердечно-сосудистого риска, подразумевающая, что независимо от эффективности гиполипидемической терапии наличие усиленного воспалительного ответа является прогностическим фактором неблагоприятных исходов сердечно-сосудистых заболеваний и требует целенаправленного медикаментозного вмешательства. Развитие концепции резидуального воспалительного сердечно-сосудистого риска обуславливает необходимость измерения биомаркеров воспаления в обследовании пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Известен способ определения резидуального риска у пациентов путем определения уровня высокочувствительного С-реактивного белка (вчСРБ), и при уровне вчСРБ < 2 мг/л резидуальный воспалительный риск считается низким, при уровне вчСРБ ≥ 2 мг/л - высоким.

(Paul М Ridker, Clinician's Guide to Reducing Inflammation to Reduce Atherothrombotic Risk. - Journal of the American College of Cardiology. - vol. 72, №. 25, 2018: 3320-3331; так же опубликовано в интернет: https://www.sciencedirect.corn/science/article/pii/S07351097183886247via%3Dihub)

Недостатком способа является его низкая эффективность, так как результаты многочисленных исследований указывают на то, что уровень вчСРБ < 2 мг/л не позволяет достоверно определить резидуальный воспалительный риск как низкий.

Задачей изобретения является создание эффективного способа стратификации резидуального воспалительного риска атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний по уровню мономерного С-реактивного белка, позволяющего достоверно выявлять пациентов с истинно высоким риском для назначения адекватной терапии и снижения процента летальных исходов.

Технический результат заключается в повышении эффективности и достоверности способа.

Это достигается тем, что в заявляемом способе стратификации резидуального воспалительного риска атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний путем определения уровня высокочувствительного С-реактивного белка (вчСРБ), и при уровне вчСРБ < 2 мг/л резидуальный воспалительный риск считается низким, при уровне вчСРБ ≥ 2 мг/л - высоким, согласно изобретению, при определении уровня вчСРБ < 2 мг/л дополнительно определяют уровень мономерной формы С-реактивного белка (мСРБ) и при значении мСРБ < 7 мкг/л резидуальный воспалительный риск оценивается как истинно низкий, а при значении мСРБ ≥ 7 мкг/л риск оценивается как высокий.

С-реактивный белок (СРБ) является наиболее широко применяемым биомаркером воспаления. Измеряемые в клинической практике уровни высокочувствительного СРБ (вчСРБ) в плазме крови отражают концентрации нативной - пентамерной - формы СРБ, синтезируемой гепатоцитами при стимуляции провоспалительным интерлейкином-6. В месте локального воспаления нативный СРБ подвергается диссоциации на мембранах активированных, поврежденных и апоптотических клеток и их микрочастиц. В результате диссоциации образуется мономерная форма СРБ (мСРБ), которая представляет собой преимущественно тканевую форму СРБ с выраженными провоспалительными свойствами. После диссоциации мСРБ остается связанным с мембранами, поступает вместе с клетками в воспаленные ткани, и частично растворяется в плазме крови. Также, в небольших количествах мСРБ синтезируется моноцитами и макрофагами. мСРБ стимулирует экспрессию молекул клеточной адгезии, Е-селектина, моноцитарного хемотаксического протеина-1 эндотелиоцитами. мСРБ индуцирует активацию макрофагов по провоспалительному M1 фенотипу и стимулирует поглощение атерогенных липопротеидов макрофагами; стимулирует выделение ряда хемокинов нейтрофилами; активирует тромбоциты, способствуя их адгезии и агрегации; стимулирует неоангиогенез, накапливается в липидном ядре и местах скопления макрофагов в атеросклеротических бляшках.

Осуществление способа.

При выявлении у пациента уровня высокочувствительного С-реактивного белка (вчСРБ) < 2 мг/л, дополнительно определяют уровень мономерной формы С-реактивного белка (мСРБ).

Для выполнения исследования подготавливают планшет для иммуноферментного анализа (ИФА) или латексные микрочастицы, покрытые антителами к мСРБ. Известно антитело с высоким сродством к мСРБ клон 8С8 производства компании Sigma, США. Покрытие лунок планшета для ИФА антителами проводится согласно стандартной процедуре. Латексные микрочастицы берут одного размера, легко регистрируемого проточным цитофлуориметром (1-5 мкм). Процедуру ковалентного связывания антител с латексными микрочастицами выполняют согласно инструкции производителя. Калибровку чувствительности покрытых антителами к мСРБ планшета для ИФА или латексных микрочастиц выполняют при помощи серии разведений рекомбинантного мСРБ, взятого в известной концентрации или плазмы крови, содержащей мСРБ в известной концентрации.

Венозную кровь для измерения уровня мСРБ отбирают в пробирку объемом 3,4 или 4,3 мл с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении антикоагулянт/кровь 1:9. Обедненную тромбоцитами плазму получают центрифугированием крови при 2000g в течение 15 минут. Отбирают 50 мкл супернатанта и помещают в покрытую антителами к мСРБ лунку планшета для ИФА или пробирку с покрытыми антителами к мСРБ латексными микрочастицами. Инкубируют при комнатной температуре в темном месте в течение 30 минут.

Из лунки планшета для ИФА удаляют супернатант, промывают натрий-фосфатным буферным раствором. Проявляют антителом к мСРБ, конъюгированным с ферментной меткой. Исследуют в спектрофотометре. Концентрацию мСРБ определяют согласно калибровочной кривой, полученной на серии контрольных разведений мСРБ.

Латексные микрочастицы после инкубации с исследуемой плазмой крови проявляют антителом к мСРБ, конъюгированным с цитофлуорохромом. Для исследования на проточном цитофлуориметре добавляют 300 мкл фосфатно-буферного раствора и 1% раствора альбумина. Концентрацию мСРБ определяют согласно калибровочной кривой, полученной на серии контрольных разведений мСРБ.

При значении мСРБ < 7 мкг/л резидуальный воспалительный риск оценивается как истинно низкий, тогда как при значении мСРБ ≥ 7 мкг/л риск оценивается как высокий.

На Фиг. 1 показана схема стратификации резидуального воспалительного риска с помощью вчСРБ и мСРБ, согласно заявляемого способа.

Примеры применения способа.

Пример 1. Пациент Н. наблюдается по поводу ишемической болезни сердца. Пациенту подобрана гиполипидемическая терапия, достигнут целевой уровень холестерина ЛНП 1,4 ммоль/л, согласно клиническим рекомендациям. Врачом назначено определение вчСРБ для стратификации резидуального воспалительного риска, получен результат: 4,1 мг/л. Этот уровень выше 2 мг/л, в связи с чем пациент относится к категории высокого резидуального воспалительного риска. Дополнительного определения мСРБ не требуется, пациенту назначается противовоспалительная терапия.

Пример 2. Пациент Г. наблюдается по поводу бессимптомного атеросклероза брахиоцефальных артерий. Подобрана гиполипидемическая терапия, достигнут целевой уровень холестерина ЛНП 1,8 ммоль/л, согласно клиническим рекомендациям. Врачом назначено определение вчСРБ для стратификации резидуального воспалительного риска, получен результат: 1,7 мг/л. Этот уровень ниже 2 мг/л, в связи с чем врач назначает дополнительное исследование уровня мСРБ. Получен результат: 9,2 мкг/л. Этот уровень выше 7 мкг/л, в связи с чем пациент относится к категории высокого резидуального воспалительного риска. Пациенту назначается противовоспалительная терапия.

Пример 3. Пациент Ф. наблюдается по поводу атеросклероза нижних конечностей с перемежающейся хромотой. Пациенту подобрана гиполипидемическая терапия, достигнут целевой уровень холестерина ЛНП 1,4 ммоль/л, согласно клиническим рекомендациям. Врачом назначено определение вчСРБ для стратификации резидуального воспалительного риска, получен результат: 0,3 мг/л. Этот уровень ниже 2 мг/л, в связи с чем врач назначает дополнительное исследование уровня мСРБ. Получен результат: 4,3 мкг/л. Этот уровень ниже 7 мкг/л, в связи с чем пациент относится к категории низкого резидуального воспалительного риска. Дополнительной противовоспалительной терапии не требуется.

Результаты семилетнего наблюдения 80 пациентов с бессимптомным атеросклерозом брахиоцефальных артерий показали, что прогрессирование атеросклероза продолжалось у ряда пациентов с целевыми уровнями холестерина ЛНП и уровнем вчСРБ менее 2 мг/л (то есть находившихся в группах низкого холестеринового и воспалительного рисков). При определении мСРБ у этих пациентов было показано, что прогрессирование атеросклероза наблюдалось при уровне мСРБ более 7 мкг/л, тогда как при уровне мСРБ менее 7 мкг/л прогрессирования атеросклероза не происходило.

Таким образом, заявляемый способ является эффективным, так как позволяет достоверно выявлять пациентов с истинно высоким риском атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний для назначения адекватной терапии и снижения процента летальных исходов.