Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования прогрессирования сердечной недостаточности у больных с синдромом обструктивного апноэ

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии, терапии, реабилитологии для повышения точности прогноза прогрессирования хронической сердечной недостаточности у больных с синдромом обструктивного апноэ и, следовательно, снижения риска высокой преждевременной смертности у больных с социально значимой патологией с учетом генетических маркеров.

По данным литературы распространенность синдрома апноэ (СОАС) в когорте больных с ХСН достигает 18%, значительно превышая общепопуляционный уровень [1], при этом известно, что СОАС значительно усугубляет течение ХСН [2, 3]. Одной из причин быстрого прогрессирования ХСН при СОАС является схожесть патогенетических механизмов данных состояний: гиперсимпатикотония, оксидативный стресс на фоне периодической гипоксии и реоксигенации, хроническое субклиническое воспаление и их аддитивность при сочетании патологий [4]. Наиболее чувствительными аналитическими индикаторами, позволяющими на ранней стадии прогрессирования ХСН определить прогноз заболевания, являются лабораторные биомаркеры [5, 6].

В качестве одного из наиболее значимых медиаторов воспаления, активно участвующих в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время рассматриваются биомолекулы семейства матриксных протеиназ [7, 8]. К числу наиболее активных в этом отношении относят матриксную металлопротеиназу-9 (ММП-9) [9]. Многочисленные клинические исследования с определением уровня ММП-9 в крови больных, страдающих различными сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также лабораторные исследования на животных демонстрируют наибольший рост активности ММП-9 на фоне процессов, связанных с гипоксией и реоксигенацией [10].

Учитывая ключевую роль процессов гипоксии-реоксигенации в патогенезе СОАС, активность ММП-9 в последние годы активно исследуется у этой категории больных. В литературе описываются достоверные положительные корреляции активности данного фермента с выраженностью ночной гипоксемии при СОАС [11]. По данным ряда исследований активность ММП-9 у больных с СОАС ассоциировалась также с повышенным риском сердечно-сосудистых осложнений [12]. Отдельно в ряде работ изучались различные генетические полиморфизмы, отвечающие за экспрессию ММП-9 [13, 14, 15]. Результаты этих работ были достаточно противоречивы. Так, в работе китайских исследователей было показано преобладание полиморфизма 1562 С/Т у больных с выраженным СОАС и высоким риском сердечно-сосудистых осложнений [16]. Напротив, в публикации турецких авторов указывается на преобладание полиморфизма 1626 С/Т в этой когорте больных [17]. Информация о подобных исследованиях для российской популяции в доступных источниках не представлена.

В литературе представлен результат обсуждения возможности влияния генотипов матриксной металлопротеиназы-9 на развитие СОАС, сущность которого заключается в определении методом полимеразной цепной реакции полиморфизма гена MMP-9 для подтверждения взаимосвязи между MMP-9–15 62C > T и предрасположенностью к развитию самого заболевания – СОАС, при этом не удалось доказать наличие таковой [18]. Недостатками данного исследования является то, что полиморфизм гена MMP-9 определяли для оценки связи полиморфизмов данного гена с предрасположенностью к развитию заболевания, но не давали возможности оценки прогноза течения уже имеющегося заболевания и его осложнений, в частности, прогрессирования хронической сердечной недостаточности.

В проанализированной патентной и научной медицинской литературе адекватного прототипа не обнаружено.

Задачей изобретения является повышение точности прогноза прогрессирования хронической сердечной недостаточности у больных с синдромом обструктивного апноэ сна по анализу полиморфизма гена матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9).

Поставленная задача решается путем выделения ДНК из буккального эпителия посредством метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с последующим типированием аллелей гена матриксной металлопротеиназы-9 (полиморфный локус rs3918242) у больных с синдромом обструктивного апноэ. При выявлении у носителей полиморфного локуса rs3918242 гена матриксной металлопротеиназы-9 гетерозиготного генотипа прогнозируют высокий риск прогрессирования хронической сердечной недостаточности.

Новым в предлагаемом способе является то, что полиморфизм одного гена - гена ММП-9 (полиморфный локус rs3918242) - определяют для прогнозирования прогрессирования хронической сердечной недостаточности у больных с синдромом обструктивного апноэ сна.

Предложенный способ прогнозирования прогрессирования хронической сердечной недостаточности с использованием генетических маркеров риска основан на том, что в его основе лежит участие матриксных металлопротеиназ в протеолизе белков межклеточного матрикса и, следовательно, в ремоделировании ткани сердца и сосудов, поддержание ее

архитектоники и гомеостаза, в ангиогенезе, пролиферации, миграции и дифференциации клеток, программируемой гибели клеток, выбросе лигандов апоптоза, а также модуляции активности хемокинов и цитокинов, что потенцирует манифестацию и прогрессирование сердечной недостаточности (СН) и, в конечном итоге, приводит к летальному исходу по причине ее декомпенсации.

Данные нескольких исследований с определением уровня ММП-9 в крови больных, страдающих различными сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также лабораторные исследования на животных демонстрируют наибольший рост активности ММП-9 на фоне процессов, связанных с гипоксией и реоксигенацией [19]. Генерируемые макрофагами при этом в избытке активные радикалы кислорода являются основным активатором ММП-9 [20]. Учитывая ключевую роль процессов гипоксии-реоксигенации в патогенезе СОАС, активность ММП-9 в последние годы активно исследуется у этой категории больных [11], при этом приводятся данные о наличии положительной взаимосвязи между экспрессией этого биомаркера и степенью ночной гипоксемии при СОАС [12]. По данным других исследований у больных с СОАС активность ММП-9 ассоциируется с повышенным риском сердечно-сосудистых осложнений [21]. В экспериментах на животных были обнаружены ассоциации ММП-9 с уровнем ключевых провоспалительных цитокинов и выраженностью индукции кардиального фиброза [22].

Следовательно, определение генотипа ММП-9 может внести весомый вклад в улучшение стратификации риска развития апоптоза и ремоделирования миокарда, приводящего к прогрессированию хронической сердечной недостаточности и ее декомпенсации.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности прогноза заболевания.

Преимуществом предлагаемого изобретения является то, что способ позволяет:

- оценить персональный риск прогрессирования хронической сердечной недостаточности у больных с гипоксией/реоксигенацией, обусловленной синдромом обструктивного апноэ сна и назначить соответствующую персонифицированную терапию, направленную на ингибирование процессов ремоделирования миокарда;

- определить приоритетную группу больных с синдромом обструктивного апноэ сна для диспансерного наблюдения и оптимизации эффективных целевых профилактических мероприятий, направленных на профилактику прогрессирования сердечной дисфункции.

- снизить большие финансовые затраты здравоохранения, связанные с дорогостоящим лечением широко распространенной патологии трудоспособного населения государства.

Существенные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не очевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков в проанализированной литературе не обнаружено. Предлагаемое изобретение может быть использовано в здравоохранении.

Исходя из вышеизложенного, следует считать изобретение соответствующим условиям патентоспособности “Новизна”, “Изобретательский уровень”, “Промышленная применимость”.

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенной фигуры.

На фиг. 1 представлены результаты регрессионного анализа. Изображены расчётные величины отношения шансов, отражающие значимость влияния на течение и прогноз ХСН полиморфизма гена ММП-9 (rs3918242). По оси ординат представлены величины отношения шансов, по оси абсцисс – генотипы A/A, G/A и G/G гена ММП-9 (rs3918242). По данным анализа следует, что наличие генотипа G/A ассоциировано с ростом частоты прогрессирования ХСН в 5,34 раза (ОШ 5,34 (1,81-23,12), р=0,001).

Способ осуществляется следующим образом:

ДНК выделяют из клеток буккального эпителия, используя метод фенол-хлороформной экстракции [23]. Пробирки с клиническими образцами (буккальный эпителий) центрифугируют на 14 тыс. оборотов/мин, 15 минут. Осадок ресуспендируют в 300 мкл раствора №1 (100 мМ Tris HCl pH = 8,0; 10 мМ ЕДТА, 100мМ NaCl), затем добавляют 50 мкл раствора №2 (10% додецил сульфат натрия (SDS)) и 10 мкл протеиназы К (10 мг/мл), хорошо перемешивают и инкубируют 1 час при 55°С. Добавляют 200 мкл фенола, уравновешенного ТЕ и 200 мкл хлороформа. Интенсивно перемешивают и центрифугируют 10 мин на максимальной скорости (14 т.о./мин). Верхнюю фазу переносят в чистую пробирку, не трогая нижнюю и интерфазу. К ней добавляют 400 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют 5 мин на максимальной скорости (14 т.о./мин). Верхнюю фазу переносят в чистую пробирку. Добавлят 10 мкл ЛПААГ, 40 мкл 3М AcNa pH5.4, 800 мкл EtOH, тщательно перемешивают и инкубируют ночь при –200°С. Центрифугируют 15 мин на максимальной скорости (14 т.о./мин). Супернатант удаляют, а к осадку добавляют 400 мкл 75% EtOH. Инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Отбирают супернатант, следя за тем, чтобы осадок остался в пробирке. Сушат пробирки с открытыми крышками в термостате для микропробирок при 370°С в течение 15 мин. К осадку добавляют 100 мкл дистиллированной воды и прогревают при 650°С 10 минут.

Для анализа аллельных вариантов генов методом аллель-специфичной амплификация в режиме Real-time с использованием красителя SYBR Green I для индукции флюоресценции используют праймеры. Один из праймеров в паре является общим, два других отличаются 3’-концевым нуклеотидом: один из праймеров комплементарен последовательности ДНК дикого типа, другой – последовательности, содержащей однонуклеотидную замену. Каждый образец амплифицируют с использованием обеих пар праймеров. При полной комплементарности матрицы и праймера реакция амплификации идет с бóльшей эффективностью, чем в случае наличия неспаренного нуклеотида на 3’-конце праймера. Детекция результатов полимеразной цепной реакции проводится в режиме реального времени. Для этого в реакционную смесь добавляют флуоресцентный краситель SYBR Green I, который предтавляет собой интеркалирующий краситель, флюоресцирующий приблизительно в 200 раз интенсивнее, если связан с двуцепочечной молекулой ДНК. Продуктом ПЦР является двуцепочечный ДНК-фрагмент. Таким образом, интенсивность флюоресцентного сигнала прямо пропорциональна количеству образующегося продукта.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программ STATISTICA 10.0 и MedCalc 11.5.0.0. Характер распределения признаков оценивали с помощью критериев Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса, Шапиро-Вилка и визуально с помощью построения гистограмм. Однородность генеральных дисперсий оценивали с помощью теста Левена. Для проверки статистических гипотез при анализе количественных показателей использовали: критерий Манна-Уитни при сравнении двух независимых групп. При анализе качественных признаков проводили анализ таблиц сопряженности с использованием критерия χ² Пирсона. Если имелись ячейки с ожидаемой частотой меньше 5, то применяли двусторонний точный критерий Фишера или поправку Йетса (для таблиц 2×2).

Силу ассоциаций генотипических характеристик изученных генов с риском развития неблагоприятного исхода оценивали по значениям показателя отношения шансов (odds ratio, OR) и его 95% доверительного интервала (95% ДИ, C.I.). Вычисление показателя относительного риска неблагоприятного течения ХСН проводилось на основании расчета показателя соотношения шансов (odds ratio - OR) по формуле: OR=(a+0,5)(d+0,5)/(b+0,5)(c+0,5), где a – частота генотипа в выборке больных, b - частота генотипа в контрольной выборке, c=(1-а) – сумма частот остальных генотипов в выборке больных, d=(1-b) - сумма частот остальных генотипов в контрольной выборке. Параметр 0,5 в представленной формуле используется в том случаев, когда одно из чисел a, b, c, d равняется нулю или оказывается меньше трех. Величина OR=1 указывала на отсутствие ассоциаций, при OR>1 имело место положительная ассоциация генотипа с заболеванием («фактор риска»).

Обследовано 71 больных мужского пола со среднетяжелой и тяжелой формами СОАС (с индексом апноэ/гипопноэ (ИАГ) >15 в час) в среднем возрасте 47 [38,0; 55,0] лет с ХСН I-III функционального класса (по NYHA) (таблица 1).

Таблица 1 – Характеристика обследованных больных

Для диагностики СОАС у всех больных проводилось полисомнографическое исследование ночного сна с использованием диагностической системы Somnolab2PSG (Weinemann, Германия). Тяжесть обструктивных нарушений дыхания во сне оценивалась по индексу апноэ/гипопноэ (ИАГ), в исследование включались пациенты со средне-тяжелой (14<ИАГ<30 в час) и тяжелой (ИАГ≥30 в час) формами СОАС. Также по результатам полисомнографического исследования оценивался уровень средней ночной сатурации (SPO₂ср.), индекс десатурации, наличие нарушений сердечного ритма в ночной период времени.

Эхокардиография (ЭхоКГ) проводилась всем больным по стандартному протоколу на аппарате EPIQ (Philips Ultrasound, Inc., США), оценивались следующие параметры: размеры левых и правых камер сердца, ФВ ЛЖ (по Симпсону), индекс массы миокарда левого желудочка, толщина межжелудочковой перегородки, толщина стенок левого и правого желудочков, систолическое давление в легочной артерии (определялась расчетным методом по степени трикуспидальной регургитации с помощью непрерывно-волнового метода).

Физическую толерантность оценивали посредством теста 6-минутной ходьбы (ТШХ) на момент включения в исследование и через 12 месяцев проспективного наблюдения.

В качестве генетического маркера с помощью полимеразной цепной реакции оценивали полиморфизмы гена матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9, rs3918242).

На каждого больного заполнялась специально разработанная клиническая карта. Все пациенты давали свое письменное информированное согласие для участия в исследовании. Медикаментозная терапия АГ и ХСН, которую пациенты получали за период наблюдения, была оптимальной и соответствовала современным рекомендациям.

Через 12 месяцев наблюдения у 44 больных симптомов и признаков прогрессирования ХСН не было обнаружено (1 группа), у других больных (2 группа, n=32) по данным теста 6-минутной ходьбы зарегистрировано прогрессирование ХСН.

Анализ частоты встречаемости полиморфизмов гена ММП-9 (rs3918242) в зависимости в данных группах больных показал, что у больных с неблагоприятным течением ХСН преобладал генотип G/A (таблица 2).

Таблица 2 - Частота встречаемости полиморфизмов генов в зависимости развития прогрессирования ХСН по данным ТШХ (n,%)

Согласно данным регрессионного анализа, наличие генотипа G/A гена MMP-9 (rs3918242) было ассоциировано с увеличением риска прогрессирования ХСН в 5,34 раза (ОШ 5,34 (1,81-23,12), р=0,001). Следовательно, генотип G/A гена MMP-9 (rs3918242) обладает высокой способностью к активации транскрипции и экспрессии генов-мишеней в миокарде, через которые реализуется ремоделирование миокарда и прогрессирование ХСН у больных с СОАС.

Способ прогнозирования прогрессирования ХСН у больных, страдающих синдромом обструктивного апноэ сна, основанный но определении полиморфизма гена ММП-9 иллюстрируется следующими клиническими примерами, свидетельствующими о том, что определение G/A гена MMP-9 (rs3918242) обеспечивает объективную оценку риска развития неблагоприятного течения патологии.

Пример 1

Больной Т., 53 г. (ИМТ - 33,1 кг/м²). Поступил 06.06.2018 г. в кардиологическое отделение с жалобами на слабость и одышку при физической нагрузке (подъём на 3-й этаж, ходьба в обычном темпе на 300-400 м), дневную сонливость. При объективном исследовании: пульс - 96 уд/мин, АД 140/100 мм рт.ст., частота дыхания - 18 в минуту. При проведении полисомнографического исследования ночного сна диагностирована тяжелая форма синдрома обструктивного апноэ во сне: ИАГ - 44 в час. Уровень NT-proBNP в крови повышен - 425 пг/мл (таблица 3).

При генотипировании выявлен генотип G/G гена (rs3918242) гена ММП-9.

Клинический диагноз: Гипертоническая болезнь III стадии, Контролируемое течение, целевые уровни АД <140/90 мм рт.ст. Ожирение 1 ст. Риск 4 (очень высокий). ХСН 2А, ФК III (NYHA). Синдром обструктивного апноэ во сне. Тяжелая форма (ИАГ 44 в час).

На фоне проводимой медикаментозной терапии в соответствии с действующими клиническими рекомендациями было достигнуто клиническое улучшение состояния пациента – стабилизирована гемодинамика, перестала беспокоить одышка, разрешились отеки и улучшилась переносимость физических нагрузок. При выписке из стационара назначены: валсартан 320 мг в сутки, спиронолактон 25 мг в сутки, аторвастатин 40 мг в сутки. Пациент придерживался данных рекомендаций на амбулаторном этапе. Рекомендованную аппаратную СИПАП-терапию пациент не получал.

Таблица 3 - Основные клинико-инструментальные характеристики больного Т.

Примечание. Здесь и в таблице 5. ФК ХСН - функциональный класс хронической сердечной недостаточности, ТШХ - тест шестиминутной ходьбы, ФВ ЛЖ - фракция выброса левого желудочка, ЛП пр.р.- продольный диаметр левого предсердия, ЛП S – площадь левого предсердия, ИММЛЖ – индекс массы миокарда левого желудочка; МЖП – толщина межжелудочковой перегородки левого желудочка; СДПЖ – среднее давление в правом желудочке; КДР - конечно-диастолический размер, ИАГ – индекс апноэ/гипопноэ, SPO₂ср. – средняя ночная сатурация.

Через 12 мес. состояние больного клинически ухудшилось, жалоб активно не предъявлял. За медицинской помощью не обращался. Толерантность к нагрузке улучшилась на 23%. Объективно: кожные покровы чистые, обычной окраски, влажности. Язык влажный, чистый. АД 125/65 мм рт.ст., тоны сердца приглушенные, ритмичные 72 уд/мин. Дыхание везикулярное, проводится по всем отделам, частота дыхания 15 в минуту, Живот не увеличен, при пальпации мягкий, безболезненный, перистальтика выслушивается. Отеков нет. ФК ХСН – до I по NYHA. По данным Эхо-КГ - положительная динамика, выявлены признаки обратного ремоделирования миокарда.

Показано, что у больного с синдромом обструктивного апноэ сна, имеющего генотип G/G полиморфизма rs3918242 гена ММП-9, прогрессирования хронической сердечной недостаточности не отмечалось, а, напротив, имело место уменьшения тяжести ХСН.

Пример 2

Больной С., 49 л. (ИМТ - 40,4 кг/м²). Поступил 19.07.2018 г. в кардиологическое отделение с жалобами на одышку смешанного характера, учащенное сердцебиение при физической нагрузке: ходьба в обычном темпе на 300-400 м, подъем на 3-4 этаж, головную боль по утрам, дневную сонливость, нарушенный сон. При объективном исследовании: пульс - 84 уд/мин, АД - 160/100 мм рт.ст., частота дыхания 18 в минуту, умеренные отеки стоп. При проведении полисомнографического исследования ночного сна диагностирован синдром обструктивного апноэ во сне тяжелой степени (ИАГ - 54,2 в час). Уровень NT-proBNP в крови повышен - 346 пг/мл (таблица 4).

Таблица 4 - Основные клинико-инструментальные характеристики больного С.

Примечание: см. таблицу 3.

При генотипировании выявлен генотип G/A гена (rs3918242) гена ММП-9.

Клинический диагноз: Гипертоническая болезнь III стадии, контролируемое течение, целевые уровни <140/90 мм рт.ст. Ожирение 2 ст. Риск 4 (очень высокий). ХСН 2А, ФК II (NYHA). Синдром обструктивного апноэ во сне. Тяжелая форма (ИАГ 54,2 в час).

На фоне проводимой медикаментозной терапии в соответствии с действующими клиническими рекомендациями было достигнуто клиническое улучшение состояния пациента – стабилизирована гемодинамика, перестала беспокоить одышка, разрешились отеки и улучшилась переносимость физических нагрузок. При выписке из стационара назначены: азилсартан 40 мг в сутки, хлорталидон 12,5 мг в сутки, эплеренон 50 мг в сутки, аторвастатин 40 мг в сутки. Пациент придерживался данных рекомендаций на амбулаторном этапе. Рекомендованную аппаратную СИПАП-терапию пациент не получал.

Через 5 месяцев пациент поступил повторно в стационар по экстренным показаниям с жалобами на одышку, неритмичное сердцебиение. По ЭКГ зарегистрирована пароксизмальная форма фибрилляции предсердий, тахисистолический вариант (ЧСС 120 в мин). На фоне проводимой антиаритмической терапии (пропафенон 600 мг в сутки) нарушения сердечного ритма были купированы и восстановлен синусовый ритм. В соответствии с рекомендациями назначен дабигатран 300 мг в сутки и метопролола сукцинат 25 мг в сутки. Состояние пациента улучшилось, одышка в покое и при обычной нагрузке больше не беспокоила и он был выписан на амбулаторный этап.

В течение последующего периода амбулаторного наблюдения состояние пациента оставалось стабильным и он не обращался за медицинской помощью. Через 12 месяцев с момента первого визита при контрольном осмотре было отмечено снижение переносимости физической нагрузки (уменьшилась дистанция по ТШХ на 32%), масса тела увеличилась на 6 кг, эпизодически отмечалась пастозность стоп. ФК ХСН увеличился до III ФК по NYHA. По данным Эхо-КГ в динамике отмечены признаки ремоделирования миокарда: снижение ФВ ЛЖ, увеличение размеров левого предсердия.

Таким образом, продемонстрировано, что у больного с синдромом обструктивного апноэ сна, имеющего генотип G/A полиморфизма rs3918242 гена ММП-9, развивалось прогрессирование хронической сердечной недостаточности.

Предлагаемый способ применен у 71 больных с синдромом обструктивного апноэ сна и позволяет прогнозировать высокий риск прогрессирования хронической сердечной недостаточности по анализу полиморфизма гена матриксной металлопротеиназы-9 еще до начала лечения, что позволяет оценить персональный риск развития неблагоприятного течения патологии и назначить соответствующую персонифицированную терапию, направленную на ингибирование процессов ремоделирования миокарда; определить приоритетную группу больных для диспансерного наблюдения и оптимизации эффективных целевых профилактических мероприятий, направленных на профилактику прогрессирования сердечной дисфункции, уменьшив, таким образом, большие финансовые затраты здравоохранения, связанные с дорогостоящим лечением широко распространенной патологии трудоспособного населения государства.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Tobias, M. Obstructive sleep apnoea and heart failure / M. Tobias, S. Otto D, B. Marc [et al.] // Cardiovascular medicine – 2017. – Vol. 20. – P.9–16. – doi: 10.4414/cvm.2017.00452

1. Mentz, R. Sleep-disordered breathing in patients with heart failure / R. Mentz, M. Fiuzat // Heart Failure Clinics – 2014. – Vol. 10. – P.243–250. – doi: 10.1016/j.hfc.2013.10.001

2. Медведева, Е. Синдром обструктивного апноэ во сне при хронической сердечной недостаточности: взгляд кардиолога / Е.А. Медведева, Л.С. Коростовцева, Ю.В. Сазонова, [и др.] // Российский кардиологический журнал. – 2018. – No 1. – С.78-82. – doi: 10.15829/1560-4071-2018-1-78-82

3. Sozer, V. Changes in inflammatory mediators as a result of intermittent hypoxia in obstructive sleep apnea syndrome / V. Sozer, M. Kutnu, E. Atahan // The Clinical Respiratory Journal – 2018. – Vol. 12. – P.1615–1622. – doi: 10.1111/crj.12718

4. Chirinos, J. Multiple Plasma Biomarkers for Risk Stratification in Patients With Heart Failure and Preserved Ejection Fraction / J. Chirinos, A. Orlenko, L. Zhao [et al.] // Journal of the American College of Cardiology– 2020. – Vol. 75. – P.1281–1295. – DOI: 10.1016 / j.jacc.2019.12.069

5. Pan, W. Comparison of predictive value of NT-proBNP, sST2 and MMPs in heart failure patients with different ejection fractions / W. Pan, D. Yang, P. Yu [et al.] // BMC Cardiovascular Disorders. – 2020. – Vol. 20. – P.208–219. – DOI: 10.1186 / s12872-020-01493-2

6. Юлдашев С. Роль матриксных металлопротеиназ в развитии хронической сердечной недостаточности / С. Юлдашев, Г. Ахмедова, Э. Ибрагимова [и др.] // Вопросы науки и образования. – 2019. – No 35 (4). – С.175-185.

7. Ahmed, S. Matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of metalloproteinases: relationship between changes in proteolytic determinants of matrix composition and structural, functional, and clinical manifestations of hypertensive heart disease / S. Ahmed, L. Clark, W. Pennington [et al.] // Circulation – 2006. – Vol. 113. – P.2089–2096. – DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.105.573865

8. Шумаков, Д.В. Роль матриксной металлопротеиназы 9 в ремоделировании миокарда левого желудочка / Д.В. Шумаков, Д.И. Зыбин, М.А. Попов // РМЖ. – 2020. – No10. – С.17-19. URL: https://www.rmj.ru/upload/iblock/be7/17-19.pdf

9. Шадрина, А. Классификация, регуляция активности, генетический полиморфизм матриксных металлопротеиназ в норме и при патологии / А. Шадрина, Я. Плиева, Д. Кушлинский [и др.] // Альманах клинической медицины. – 2017. – No 45 (4). – С.266-279. – DOI:10.18786/2072-0505-2017-45-4-266-279

10. Franczak, A. Activity of serum matrix metalloproteinase 9 in patients with obstructive sleep apnea / A. Franczak, R. Skomro, I. Bil-Lula [et al.] // Polish Archives Of Internal Medicine– 2021. – Vol. 90. – P.131–136. – DOI: 10.20452/pamw.16014

11. Shuhui, W. Matrix Metalloproteinase-9 Is a Predictive Factor for Systematic Hypertension and Heart Dysfunction in Patients with Obstructive Sleep Apnea Syndrome. W. Shuhui, L. Shisheng, B. Wang [et al.] // Biomed Research International– 2018. – Vol. 2018. – P.8–19. – DOI: 10.1155 / 2018/1569701

12. Fang, X. Matrix metalloproteinase 9 (MMP9) level and MMP9 -1562C>T in patients with obstructive sleep apnea: a systematic review and meta-analysis of case-control studies / X. Fang, J. Chen, W. Wang[et al.] // Sleep Medicine. – 2020. – Vol. 67. – P.110–119. – DOI: 10.1016 / j.sleep.2019.11.1247

13. Watson, C. Investigation of association of genetic variant rs3918242 of matrix metalloproteinase-9 with hypertension, myocardial infarction and progression of ventricular dysfunction in Irish Caucasian patients with diabetes: a report from the STOP-HF follow-up programme / C. Watson, J. Spiers, M. Waterstone [et al.] // BMC Cardiovascular Disorders. – 2021. – Vol. 21. – P.87–97. – DOI: 10.1186/s12872-021-01860-7

14. Yuksel, М. Matrix Metalloproteinase-9 Level and Gene Polymorphism in Sleep Disordered Breathing Patients with or without Cardiovascular Disorders / M. Yukse, H. Kuzu-Okur, A. Velioglu-Ogunç [et al.] // Balkan medical journal. – 2013. – Vol. 30. – P.8–12. – DOI: 10.5152/balkanmedj.2012.068

15. Galis Z. Targeted Disruption of the Matrix Metalloproteinase-9 Gene Impairs Smooth Muscle Cell Migration and Geometrical Arterial Remodeling / Z. Galis, C. Johnson, D. Godin [et al.] // Circulation Research– 2002. – Vol. 91. – P.852–859. – DOI: 10.1161/01.res.0000041036.86977.14

16. Cao, C. Functional polymorphisms in the promoter region of MMP-2 and MMP-9 and susceptibility to obstructive sleep apnea / C. Cao, B. Wu, Y. Wu [et al.] // Scientific Reports – 2015. – Vol. 5. – P.152–159. – DOI: 10.1038/srep08966

17. Yalcınkaya M. Lack of association of matrix metalloproteinase-9 promoter gene polymorphism in obstructive sleep apnea syndrome / Yalcınkaya M., Erbek S.S., Babakurban S.T. et al. // Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery 43 (2015) 1099e1103 https://doi.org/10.1016/j.jcms.2015.06.014

18. Htoo, A. Activation of nuclear factor kappa-B in obstructive sleep apnea: a pathway leading to systemic inflammation / A. Htoo, H. Greenberg, S. Tongia [et al.] // Sleep and Breathing. – 2006. – Vol. 10. – P.43–50. – DOI: 10.1007/s11325-005-0046-6

19. Bond, M. Inhibition of transcription factor NFkappaB reduces matrix metalloproteinase-1, -3 and -9 production by vascular smooth muscle cells / M. Bond, A. Chase, A. Baker [et al.] // Cardiovascular Research. – 2001. – Vol. 50. – P.556–565. – DOI: 10.1016/S0008-6363(01)00220-6

20. Ramos, P. Atrial fibrosis in a chronic murine model of obstructive sleep apnea: mechanisms and prevention by mesenchymal stem cells / P. Ramos, C. Rubies, M. Torres [et al.] // Respiratory Research – 2014. – Vol. 15. – P.141–148. – DOI: 10.1186/1465-9921-15-54

21. Wang, W. Doxycycline attenuates chronic intermittent hypoxia-induced atrial fibrosis in rats / W. Wang, K. Zhang, X. Li [et al.] // Cardiovascular Therapeutic – 2018. – Vol. 36. – P.95–102. – DOI: 10.1111/1755-5922.12321

22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М: Мир 1984; 205 с.