Результат интеллектуальной деятельности: Способ контролируемой фрагментации ДНК

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для получения фрагментов геномной ДНК заданной длины.

Фрагментация геномной ДНК является одним из обязательных этапов при приготовлении NGS-библиотек для полногеномного секвенирования. От длины фрагментов и равномерности расщепления копий генома на короткие участки зависит качество и зачастую возможность последующего биоинформационного анализа. Так, при исследовании ранее неизвестных геномов или геномов с высокой нестабильностью (например, различные штаммы одного и того же вида бактерии) требуется проведение сборки генома из получаемых прочтений de novo, то есть без картирования на референсную последовательность. С одной стороны, чем больше длина фрагментов, тем больше повторяющихся участков генома удастся собрать в единую протяженную последовательность. С другой стороны, максимальная длина таких фрагментов также ограничена возможностями подходов, используемых при секвенировании. Ограничения накладывает и необходимость получения максимально узкого диапазона распределения длин, поскольку более широкое распределение будет приводить к перепредставленности коротких фрагментов и недопредставленности - более длинных. Таким образом, фрагментация ДНК является неотъемлемой частью полногеномного секвенирования, от которого зависит качество получаемых сырых данных.

Сегодня разработаны различные подходы к фрагментации ДНК: физическими методами [1-9] и с применением ферментов [10-13]. Наиболее распространенным методом физического разрыва молекул ДНК является обработка ультразвуком. Такая обработка может осуществляться как с добавлением физических объектов, концентрирующих передаваемую энергию ультразвука, так и без них. Однако, как указано в большинстве из приведенных патентов, такое добавление улучшает эффективность фрагментации.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что через раствор ДНК прокачивается газ под определенным давлением от 0.01 до 10 Мпа в зависимости от желаемой длины фрагментов [3]. Недостатком такого способа является необходимость использования газа под давлением, требующего нестандартного оборудования.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что для фрагментации ДНК используется пневматическая установка, которая вызывает формирование пузырьков в растворе ДНК, что и разрезает молекулы ДНК на фрагменты [4]. Недостатком такого способа является применение специфического оборудования, требующего создания определенного давления.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что фрагментируемая ДНК длиной не менее 10000 п.о. фрагментируется при помощи ультразвука до длины 1300 п.о. (или до 50-400 п.о. при определенных условиях), при этом частота ультразвука составляет от 28 до 80 кГц [7]. Недостатками такого способа является ограничения по получаемым длинам фрагментов и использование ультразвука с ограниченным диапазонов частот.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что для фрагментации ДНК используется небулайзер, который и описан в изобретении [8]. Недостатками такого способа является использование специфического оборудования, описанного в патенте.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что в ДНК вносятся случайным образом расположенные модификации, после чего эндонуклеазы, чувствительные к таким модификациям разрезают молекулы ДНК на фрагменты [10]. Недостатком такого способа является применение дополнительной стадии модификации и ферментов, что может приводить к неслучайной фрагментации ДНК, а также высокой чувствительности к различным ингибиторам.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что на подложке закрепляются молекулы различных транспозаз с улучшенными свойствами и соответствующие им олигонуклеотиды, после чего проводится случайная фрагментация ДНК транспозазами с одновременным включением адаптерных последовательностей [11, 14]. Недостатком такого способа является необходимость использования специфических ферментов, а также неравномерное распределение сайтов узнавания транспозазой в целевой ДНК. Кроме того, такие ферменты могут добавлять инсерции и делеции в исследуемую последовательность и имеют высокую чувствительность к GC-составу последовательностей [15, 16].

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что к раствору нуклеиновых кислот добавляют смесь различных комплексов транспозосом, состоящих из различных транспозаз, концевой последовательности первого транспозона и концевой последовательности второго транспозона. Причем обе концевые последовательности способны связываться с одной из транспозаз комплекса и содержат по крайней мере по одному нику, разрыву, апуриновому или апиримидиновому сайту [12]. Недостатками такого способа является также необходимость использования специфических ферментов, а также неравномерное распределение сайтов узнавания транспозазой в целевой ДНК и возможное добавление инсерций и делеций в исследуемую последовательность.

Наиболее близким к заявленному способу – прототипом - является способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что к очищенному образцу ДНК в пробирке добавляют магнитные или немагнитные монодисперсные частицы (стеклянные, кварцевые, металлические, из боросиликатного стекла, из натриевого стекла, из мочевины, из оксида металла, керамические или керамические, покрытые металлом) размером 0,1-100 мкм в количестве 0,1-20% от используемого раствора очищенного образца ДНК по массе [5]. Суспензия частиц также содержит менее 85% глицерина. Полученную смесь подвергают обработке ультразвуком с частотой 1,1 МГц в течение менее, чем 5 минут, что приводит к физическому разрыву двуцепочечных молекул ДНК на фрагменты 60-90 п.о.

Недостатками известного способа является необходимость использования оборудования, производящего ультразвук с частотой 1 МГц, неоптимальные размеры твердых частиц, составляющие 0,1-100 мкм и недостаточное их количество, добавляемое к раствору ДНК, составляющее 0,1-20% от используемого раствора образца ДНК по массе, что не позволяет провести контролируемую фрагментацию ДНК с получением широкого диапазона длин фрагментов ДНК.

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего проведение контролируемой фрагментации ДНК с получением широкого диапазона длин фрагментов ДНК.

Технический результат: упрощение способа и расширение диапазона получаемых средних длин фрагментов, снижение себестоимости полногеномного секвенирования.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Очищенные высокомолекулярные фрагменты ДНК, длиной более 3000 п.о., объемом 10-100 мкл, смешивают со стеклянными шариками размером 100-600 мкм в закрывающейся пластиковой пробирке (например, фирмы Eppendord, Axygen или другие) объемом 0,5-0,6 мл (или другого объема, но с предварительным подбором оптимальных условий фрагментации для решаемой задачи) и помещают в ультразвуковую ванну (например, BANDELIN RK 514 H, SONOREX SUPER или любые другие аналогичные). Температуру воды доводят до 5-10°C. Далее проводят обработку полученной смеси ультразвуком в ультразвуковой ванне с частотой ультразвука от 20 кГц до 1,1 МГц в течение 10-600 секунд. Например, это может быть сделано путём добавления в ванну льда. Варьируя время обработки и количество добавленных шариков, получают фрагменты ДНК с длиной от 50 до 1500 п.о.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

- в качестве частиц используют стеклянные шарики размером 100-600 мкм в количестве от 1 до 75% по массе от раствора фрагментируемой ДНК, что позволяет получать при заданном времени обработки необходимую среднюю длину фрагментов без применения дорогостоящего оборудования;

- обработку ультразвуком проводят с частотой от 20 кГц до 1,1 МГц, что позволяет получать фрагменты молекул ДНК с длиной от 50 до 1500 п.о., в зависимости от используемых условий.

Преимущественно время обработки раствора ДНК с частицами варьируют от 10 до 600 секунд, что позволяет получать различную среднюю длину фрагментов (от 50 до 1500 п.о.).

Применимость заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования изолятов бактерий (например, Escherichia coli).

Из чистой культуры бактерий или смеси бактерий, полученных, например, из образца почвы или клинического образца, выделяют ДНК с помощью набора ферментов, SDS, хлороформа, фенола и этанола [17] или специализированных коммерческих наборов или других аналогичных подходов к выделению ДНК из различных микроорганизмов. 100 мкл раствора выделенной ДНК в концентрации 1-50 нг/мкл помещают в пластиковую пробирку с крышкой объемом 0,6 мл, добавляют 0,06 г смесью стеклянных шариков диаметром 100-600 мкм, пробирку со смесью помещают в ультразвуковую ванну BANDELIN RK 514 H с заранее охлажденной до 5°C и проводят обработку ультразвуком с частотой 20 кГц в течение 50 секунд. Такая обработка позволяет получить фрагменты с нормальным распределением длин и средней величиной 1500 п.о. При фрагментации в течение 1 минуты и 30 секунд, средняя длина фрагментов составляет около 700 п.о. На фиг.1 представлено распределение длин фрагментов после фрагментации ДНК заявляемым способом.

Далее, у полученных фрагментов восстанавливают концы с помощью ДНК-полимеразы, добавляют на 3'-концы фрагментов аденозинмонофосфаты и присоединяют к ним с помощью лигазы адаптеры для секвенирования, содержащие 3'-выступающий dT. В случае использования петлевых адаптеров петлю разрезают с помощью смеси урацилгликозилазы и эндонуклеазы VIII. Далее полученную библиотеку ДНК амплифицируют и квантифицируют, после чего она может быть подвергнута высокопроизводительному секвенированию.

Пример 2. Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования образца ДНК человека

Все процедуры проводят таким же образом, как и в Примере 1, за исключением того, что ДНК выделяют из клеток человека, используя подходящие лабораторные методы, добавляют 0,075 г смеси стеклянных шариков диаметром 100-600 мкм, пробирку со смесью помещают в ультразвуковую ванну SONOREX SUPER с заранее охлажденной до 10°C и проводят обработку ультразвуком с частотой 20 кГц в течение 5 минут. В этом случае средняя длина получаемых фрагментов составляет 50 п.о.

Пример 3. Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования изолятов бактерий (например, Escherichia coli) с длиной вставки фрагмента 1500 п.о.

Все процедуры проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что добавляют 0,001 г смеси стеклянных шариков диаметром 100-600 мкм, пробирку со смесью помещают в ультразвуковую ванну SONOREX SUPER с заранее охлажденной до 10°C и проводят обработку ультразвуком с частотой 20 кГц в течение 50 секунд. ДНК фрагментируют в течение 1 минуты, используя ультразвуковую ванну. При этом получаемая средняя длина фрагментов составляет около 1500 п.о.

Пример 4. Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования изолятов бактерий (например, Escherichia coli) с длиной вставки фрагмента 1000 п.о. с использованием прибора Covaris

Все процедуры проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что ДНК фрагментируют в течение 30 секунд на приборе Covaris с частотой 1,1 МГц. При этом получаемая средняя длина фрагментов составляет около 1000 п.о.

Таким образом, разработанный новый способ позволяет упростить процедуру фрагментирования высокомолекулярной ДНК до заданной длины, поскольку не требует сложного, дорогостоящего, специфического оборудования и реактивов.

Источники информации

1. Laugharn JA, Khoja JH. Acoustic energy mediation of genetic fragmentation [Internet]. 2015. Available: https://patents.google.com/patent/US 20160102329

2. Pedregosa F, Varoquaux G, Gramfort A, Michel V, Thirion B, Grisel O, et al. Journal of machine learning research : JMLR. [Internet]. Journal of Machine Learning Research. MIT Press; 2000. Available: http://jmlr.csail.mit.edu/papers/v12/pedregosa11a.html

3. Shui L, Li L, Peng Y, Jin M, Zhou G. Dna fragmentation method and device for implementing same [Internet]. 2016. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2016177020 A1

4. Shui L, Li L, Peng Y, Jin M, Zhou G. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) fragmentation method and device for implementing same [Internet]. 2015. Available: https://patents.google.com/patent/CN 104862302 A

5. Bashkirov VI, Ulmanella U, Eason RG, Taft BJ. Methods and compositions for shearing of polymers by sonication [Internet]. 2009. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2009103068 A1

6. Bashkirov VI, Ulmanella U, Eason RG, Taft BJ. Methods and apparatuses for nucleic acid shearing by sonication [Internet]. 2009. Available: https://patents.google.com/patent/US 9127306

7. Poncelet D, Panteleeva I, Ito K, Allaer D. Method and apparatus for fragmenting dna sequences [Internet]. 2011. Available: https://patents.google.com/patent/US 20120264228

8. Surzycki SJ, Kityama M, Togasaki RK. Process and apparatus for fragmenting biomaterials [Internet]. 1991. Available: https://patents.google.com/patent/US 5610010

9. Vivek V, Hadimioglu B, Sharma S, DEV K. Apparatus and method for using ultrasonic radiation for controlled fragmentation of chains of nucleic acids [Internet]. 2012. Available: https://patents.google.com/patent/EP 2766188 B1

10. COGAN NOI, Shinozuka H. Method of nucleic acid fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2015024075 A1

11. Belyaev AS. Immobilized transposase complexes for dna fragmentation and tagging [Internet]. 2013. Available: https://patents.google.com/patent/US 20140093916

12. UKANIS M, Lubys A, TAMOSEVICIUS R, GAIDAMAUSKAS E. Method for controlled dna fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/US 20160177359

13. Ukanis M, Rubis A, Tamosevichus R, Gadamauskas E. For the method through controlling DNA fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/CN 106103713 A

14. Belyaev A. Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging [Internet]. 2013. Available: https://patents.google.com/patent/EP2712931 A1

15. Knierim E, Lucke B, Schwarz JM, Schuelke M, Seelow D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. PLoS One. 2011;6. doi:10.1371/journal.pone.0028240

16. Lan JH, Yin Y, Reed EF, Moua K, Thomas K, Zhang Q. Impact of three Illumina library construction methods on GC bias and HLA genotype calling. Hum Immunol. Hum Immunol; 2015;76: 166-75. doi:10.1016/j.humimm.2014.12.016

17. Wright MH, Adelskov J, Greene AC. Bacterial DNA Extraction Using Individual Enzymes and Phenol/Chloroform Separation. J Microbiol Biol Educ. American Society for Microbiology (ASM); 2017;18. doi:10.1128/jmbe.v18i2.1348