Результат интеллектуальной деятельности: КОНСОРЦИУМ ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ И СТИМУЛЯЦИИ РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, касается биологических средств для стимулирования роста и повышения урожайности растений и представляет собой консорциум штаммов Bacillus simplex 948 Р-1TS и Bacillus megaterium 312 TS.

Основу изобретения составляют психротолерантные штаммы бактерий Bacillus simplex 948 Р-1TS и Bacillus megaterium 312 TS, депонированные во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационными номерами B-12245 и И-12244 соответственно.

Важное значение для экологизации сельского хозяйства имеет биологическое земледелие. Одним из элементов биологического земледелия является применение микробных препаратов, созданных на основе микроорганизмов безопасных для человека, не загрязняющих окружающую среду, оздоравливающих почву и восстанавливающих ее плодородие, а также оказание полезного последействие для последующих в севообороте культур.

Известно и запатентовано множество различных штаммов микроорганизмов, предложенных для использования в производстве биопрепаратов в качестве основных действующих агентов биопестицидов и/или биоудобрений и биостимуляторов. Значительная часть таких микроорганизмов является представителями родов Bacillus и Pseudomonas. Кроме того, часть полезных бактерий, что доказано на примере бактерий рода Bacillus, закрепляются и зимуют в ризосфере растения, создавая положительный эффект последействия, проявляющийся в санации почвы и пожнивных остатков в отношении патогенных грибов и бактерий, а также обогащении микробиоценоза пашни полезной микрофлорой. Все иные препараты, как химической, так и биологической природы, действуют контактно. Иначе говоря, их эффективность зависит от химической формулы, времени и площади контакта со способными к взаимодействию, либо больными тканями растения, точности подбора концентрации действующих веществ.

С технологической точки зрения именно бактерии р. Bacillus являются перспективными для создания на их основе микробиологических препаратов, благодаря их спорообразующей способности, устойчивости к высушиванию (осмотолерантность), что позволяет получать стабильные продукты.

Известны штаммы Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 [Авторское свидетельство №1717156, опубл. 07.03.1992] и биопрепарат Фитоспорин, созданный на основе этого штамма [Патент РФ №2099947, заявл. 15.11.1996, опубл. 27.12.1997], В. subtilis №10, являющийся основой биопрепарата Алирин Б [Патент РФ №2081167, заявл. 08.04.1994, опубл. 10.06.1997], В. subtilis В-40 [Патент РФ №2094990, заявл. 08.07.1993, опубл. 10.11.1997], В. subtilis 11 В (ВКМ В-2218Д) [Патент РФ №2182172, заявл. 05.04.2001, опубл. 10.05.2002], Bacillus pumilus BKM CR-333Д [Патент РФ №1817875, опубл. 20.05.1995], В. pumilus А1.5 [Патент РФ №2551968, заявл. 01.08.2013, опубл. 10.06.2015], Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767 [Патент РФ №2242125, заявл. 12.03.2003, опубл. 20.12.2004], Bacillus atrophaeus ВКПМ-11474 [Патент РФ №2570624, заявл. 06.03.2014, опубл. 10.12.2015].

Недостатком всех вышеперечисленных штаммов является недостаточная биологическая активность, проявляющаяся в антагонизме к фитопатогенным и не только микроорганизмам и защите растений от некоторых заболеваний, при этом их влияние на урожайность растений остается неизвестным.

Известен штамм Bacillus subtilis M1 [Патент РФ №2307158, заявл. 31.08.2005, опубл. 27.09.2007]. Указанный микроорганизм повышает всхожесть семян яровой пшеницы, стимулирует рост проростков, повышает их массу, снижает пораженность проростков возбудителями корневых гнилей, но практически не способствует повышению урожайности.

Используемые штаммы в составе биопрепаратов являются мезофильными и работают при температуре +10 град. Что делает их неэффективными при использовании в осенне-весенний период.

Известен препарат для защиты растений от болезней на основе штамма Bacillus subtilis ИПМ-215 [Патент РФ №2019966, МПК A01N 63/00, заявл. 24.07.1991, опубл. 1994]. Недостатками данного препарата являются ограниченная область применения, отсутствие в доступных источниках информации данных об оздоравливающем эффекте на растения при бактериальном поражении, эффективном защитном действии против болезней в условиях открытого грунта и способности к азотфиксации и фосфатмобилизации. Кроме того, состав препарата многокомпонентен, технология получения препарата многостадийна и сложна.

Известен биопрепарат для осенней, весенней и летней обработок почвы, корневой и прикорневой подкормок в период вегетации растений, а также предпосевной обработки семян, представляющий собой смесь суспензий тринадцати различных штаммов: Agrobacterium tumefaciens B-4116, Agrobacterium radiobacter B-956, Azotobacter chroococcum B-2375, Bacillus thuringiensis B-2918, Bacillus subtilis B-6554, Bacillus subtilis B-4419, Bacillus megaterium B-4440, Bacillus megaterium B-200, Bradyrhizobium japonicum B-1978, Erwinia ananas B-5292, Lactobacillus casei B-3961, Pseudomonas fluorescens B-l138, Rhodopseudomonas palustris B-1620. [Патент РФ №2322061, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, заявл. 19.04.2006, опубл. 2008].

Существенным недостатком препаратов на основе нескольких штаммов бактерий различной таксономической принадлежности является многокомпонентность видового и родового состава микроорганизмов с различными питательными потребностями, требующих как отдельных условий культивирования, так и различных условий среды для максимального проявления свойств.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является создание эффективного микробного консорциума, способствующего биологической защите, а также стимулирующего рост и повышение урожайности сельскохозяйственных растений.

Технический результат достигается за счет использования консорциума бактериальных штаммов, включающего штаммы бактерий Bacillus simplex 948 Р-1TS ВКПМ В-12245 и Bacillus megaterium 312 TS ВКПМ B-12244. Предусмотрено что штаммы бактерий взяты в соотношении 1:1 и имеющий общий титр клеток не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Штаммы выделены из многолетнемерзлых пород в окрестностях г. Тарко-Сале, ЯНАО. Видовая принадлежность культуры определена на основании результатов секвенирования гена 16S рРНК в ФГУП ГосНИИГенетика посредством повторного секвенирования и идентификации с помощью видоспецифичных праймеров.

Свойства штаммов-продуцентов.

Заявленный штамм Bacillus simplex 948 Р-1TS депонирован во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-12245, имеет следующие характеристики. Клетки суточной культуры образуют эндоспоры. Оптимальные условия роста 20-25°С. На плотных питательных средах образуют колонии диаметром 3-4 мм, круглые, блестящие, с ровным краем, слегка выпуклые, полупрозрачные.

Bacillus megaterium 312 TS депонирован во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ B-12244 - клетки грамположительные, подвижные, спорообразующие палочки, одиночные или соединены в длинные цепочки; колонии округлые, гладкие, белые, выпуклые, жирно-блестящие, край волнисто-бахромчатый, оптимальная температура роста 20-25℃.

Для культивирования используют среду LB (Luria-Bertani). Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70°С или в лиофильно-высушенном состоянии.

Биохимические признаки.

Bacillus simplex 948 Р-1TS ферментирует L- лизин, мочевину, 5-бром-3-индоксилнонаноат.

Bacillus megaterium 312 TS ферментирует L-орнитин, L-аргинин, L-лизин, утилизирует галактурованую кислоту, калия 5-кетоглюконат, D-мальтозу, адонитол, палатинозу, D-глюкозу, L-арабинозу, D-арабит, L-рамнозу, инозит, D-целлобиозу.

Для получения консорциума монокультуры выращивали отдельно в течение суток, затем готовили суспензии монокультур с концентрацией клеток не меньше 10⁴ КОЕ/мл и смешивали их в равных соотношениях (1:1), затем выращивали методом глубинного культивирования при температуре 28°С, в течение 12-16 часов, при 200 об/мин. Контроль за ростом культуры проводили путем отбора проб через каждые 2 часа и определяли концентрацию микробных клеток на спектрофотометре Thermo при длине волны 540 нм. Полученная культуральная жидкость содержит не менее 10⁸ КОЕ/мл (60-100% спор) и вторичные метаболиты (антибиотические вещества, протеолитические ферменты, гормоны и пр.) за счет чего усиливается специфическая активность жидкого препарата на основе консорциума микроорганизмов.

Заявленный консорциум обладает ауксинпродуцирующей, хитиназной активностью, ростом при низких положительных температурах.

Фосфор является одним из важнейших минеральных элементов в жизни растений, которые способны его поглощать только в форме неорганических фосфат-анионов, преимущественно в виде H₂PO^4-. Несмотря на высокое содержание общего фосфора в почве, его биодоступность, как правило, является лимитирующим фактором для роста, развития и продуктивности растений. Одними из наиболее активных мобилизаторов фосфатов считаются представители родов Bacillus.

Активность мобилизации штаммами Bacillus simplex 948 Р-1TS и Bacillus megaterium 312 TS минеральных труднорастворимых фосфатов в жидкой среде NBRIP исследована в условиях стерильных опытов. Источником фосфора служил Ca₃(PO₄)2 который вносили в среду из расчета 5г/л. Исследования проводились в трехкратной повторяемости. Посевной материал готовили, выращивая бактерии в течение 24 часов в пробирках на агаризованной LB среде. Готовили водную суспензию бактерий и вносили в колбы с жидкой NBRIP средой. Бактерии Bacillus simplex 948 Р-1TS и Bacillus megaterium 312 TS культивировали в течение 10 суток при 15°С в периодических условиях на качалках (190 об/мин). После окончания культивирования опытные образцы центрифугировали в течение 10 минут при 6000 об/мин. Концентрацию растворимого фосфора (РО₄)-3 в фугате культуральной жидкости определяли калориметрически с использованием молибденово-кислого аммония. Содержание водорастворимого фосфора, накапливаемого штаммом Bacillus simplex 948 Р-1TS и Bacillus megaterium 312 TS, оценивали по калибровочной кривой, по разнице его концентрации в опытном (инокулированном) и контрольном (стерильном) вариантах. Результаты исследований свидетельствуют о том, Bacillus simplex 948 Р-1TS и Bacillus megaterium 312 TS активно мобилизует фосфаты из труднорастворимых неорганических (Са₃(PO₄)²) соединений. Выявлено, что в опытных образцах содержание растворимого фосфора колебалось в пределах мг/л, а в контроле - мг/л (таблица 1).

На следующем этапе исследований проведена оценка способности штаммов Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS продуцировать фитогормоны ауксин и гиббереллин.

Фитогормоны способствуют пробуждению и быстрому прорастанию семян, стимулируют рост верхушечной почки и тормозят развитие пазушных побегов. При высоких концентрациях ауксины повышают выработку фитогормона этилена, который тормозит процессы роста, но при этом переключает обмен веществ на выработку ферментов, которые активизируют защитные функции растительного организма и повышают его устойчивость к фитопатогенам. Гиббереллины активно влияют на цветение растений, образование и развитие завязей. Высокая концентрация этих фитогормонов придает растениям партенокарпические свойства (способность к самоопылению). Даже такой ярко-выраженный ингибитор роста растений, как абсцизовая кислота, играет положительную роль в онтогенезе озимых культур, вызывая своевременный переход растений в состояние покоя, постепенно останавливая все процессы роста, тем самым повышая устойчивость озимых к низким температурам морозных и малоснежных зим. Данные микроорганизмы Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS, потребляя растительные корневые экссудаты, в ответ выделяют гормоны роста, которые стимулируют корнеобразование и ростовые процессы растений.

Количественное определение фитогормонов было определено с помощью спектрофатометра. Штаммы культивировали в среде LB с добавлением L-триптофана (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в концентрации 1 г/л в качестве предшественника индол-3-уксусной кислоты (ИУК) (Индолил-3-уксусная кислота - химическая формула ауксина). Культивирование проводили в периодическом режиме при перемешивании со скоростью 140 об/мин при температуре 5 и 22 °С. Содержание ИУК в культуральной суспензии определяли с помощью реактива Сальковского. Все исследования были выполнены в трех повторениях. Результаты представлены в таб. 2 и таб. 3.

Антифунгальную активность заявляемого консорциума штаммов проверяли в отношении 4 фитопатогенных грибов: Alternaria sp., Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Fusarium graminearum (Schwabe), Microdochium nivale (Fr) Samuels и IC Hallet.

Бактерии высевали бактериологической петлей сплошным газоном на поверхность питательного агара и культивировали 24 часа при 28°C. В день проведения эксперимента на антифунгальную активность высевали сплошным газоном на картофельно-глюкозный агар штаммы фитопатогенных грибов. Затем, пробочным сверлом вырезали лунки и вносили по 100 мкл бактериальной суспензии - штаммы бактерий Bacillus simplex 948 Р-1TS ВКПМ В-12245 и Bacillus megaterium 312 TS ВКПМ B-12244 взятых в соотношении 1:1 и имеющий общий титр клеток не менее 108 КОЕ/мл. Одна чашка была оставлена с пустыми лунками как контрольный вариант. Все чашки культивировали в течение 72 ч при температуре 28°C. Антифунгальную активность определяли по зоне ингибирования роста фитопатогенного гриба вокруг лунок. Результаты измерений представлены таблице 4.

Синтез антифунгальных веществ (антибиотиков, гидролитических ферментов, токсинов) - один из наиболее распространенных эффектов микробного антагонизма.

Определение ферментативной активности штаммов Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS «бактерии-антагониста» осуществляли с использованием стандартных тестов на липазу, хитиназу и протеазу (табл.5).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для оценки ростостимулирующей активности суспензии консорциума Bacillus simplex 948 Р-1TS ВКПМ В-12245 и Bacillus megaterium 312 TS ВКПМ B-12244, взятых в соотношении 1:1 и имеющих общий титр клеток не менее 108 КОЕ/мл. на рост и развитие семян пшеницы (Triticum aestivum L.) были проведены лабораторные эксперименты, для сравнения сравнения брали коммерческий препарат Раксил Ультра (Bayer, Germany) и биопестицид - Фитоспорин-М Универсальный (НВП БашИнком, Россия). Эксперимент проводили как с монокультурами микроорганизмов, так и с консорциумом.

Перед посевом поверхность семян стерилизовали, затем инокулировали суспензиями в течение 2 часов и сушили на воздухе. Семена проращивали в рулонах фильтровальной бумаги при температуре 22 ° C. Контрольные семена, засеянные стерильной водой, служили отрицательным контролем. Коммерчески доступные препараты служили положительным контролем. Обрабатывали семена согласно инструкции производителя.

Длину (а) и биомассу (б) проростков пшеницы оценивали измерениями на 14-й день обработки. Обработки, не связанные одной и той же буквой в каждом столбце, значительно отличаются друг от друга (p  < 0,05; означает ± стандартное отклонение).

Результаты лабораторных экспериментов показали, что во всех опытных группах, за исключением Раксил-Ультра, обработка значительно увеличивала длину корня и побега по сравнению с контролем (рис.1). Таким образом, на длину побегов наиболее благоприятно повлияла обработка Bacillus simplex 948P-1 TS, в то время как обработка Раксил-Ультра снизила зарегистрированные значения более чем на 30%. Накопление корневой биомассы наиболее стимулировалось обработкой семян консорциумом Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS, в то время как биомасса побегов наиболее стимулировалась обработкой фитоспорином-M по сравнению с контрольной группой. (см. Рис.1. Влияние штаммов рода Bacillus spp. на морфометрические показатели проростков пшеницы (Triticum aestivum L.).

В целом следует отметить, что обработка семян заявляемым консорциумом бактерий приводит к увеличению основных параметров роста растений.

Пример 2. Оценка урожайности пшеницы в полевых условиях.

Обработку семян осуществляли по той же схеме как и в Примере 1. Эксперимент проводили как с монокультурами микроорганизмов, так и с консорциумом. Для оценки биологической эффективности семена озимой пшеницы обрабатывали суспензией консорциума штаммов Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS, взятых в соотношении 1:1 и имеющий общий титр клеток не менее 10⁸ КОЕ/мл. Семена пшеницы замачивали в бактериальной суспензии на 2 часа. Семена обрабатывали коммерческими препаратами Raxil Ultra (Bayer, Леверкузен, Северный Рейн-Вестфалия, Германия), представляющий собой фунгицид, содержащий тебуконазол и Фитоспорин-М (Российская Федерация), содержащий споры Bacillus subtilis 26D, согласно рекомендациям производителя. Контрольные семена замачивали в стерильной воде.

Посев проводили в третьей декаде августа. Полевой опыт закладывали на делянках с учетной площадью 1 м², расстояние между рядами 20 см. Норма высева 400 семян на делянку. Количество рядов посева - 4. Глубина заделки - 5 см.

Озимую пшеницу убирали в фазе полной спелости. Эффекты различных обработок оценивали после сбора урожая. Учитывались такие характеристики, как масса 1000 зерен, высота растений, количество продуктивных стеблей, длина главного колоса, количество зерен в колосе, масса зерна в колосе. Результаты представлены в таблице 6. Полученные результаты были статистически обработаны с использованием программного обеспечения Origin 2021 (OriginLab Corporation, Нортгемптон, Массачусетс, США).

Урожайность озимой пшеницы во многом определяется характером роста и развития растений в течение вегетационного периода. Значительный вклад в формирование урожая вносит стебель как фотосинтетически активный орган, а также орган временного запаса веществ.

Результаты исследования показали, что предпосевная обработка семян химическим фунгицидом Раксил Ультра, биопрепаратом Фитоспорин-М и консорциумом штаммов бактерий Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS по-разному влияла на урожайность озимой пшеницы.

Анализ урожайности зерна показал, что протравливание семян химическим фунгицидом «Раксил Ультра» существенно не повлияло на значения показателя (таблица 6). Интересно, что в группах «Фитоспорин-М», Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS урожай зерна был несколько ниже, чем в контроле. В свою очередь, прибавка урожая зафиксирована при обработке семян суспензией консорциума штаммов Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS, что позволило получить прибавку урожая 50,2 % по сравнению с контрольной группой ( таблица 6 ).

Звездочками показаны статистически значимые различия с контролем при p < 0,05 (n = 400).

Пример 3. Влияние предобработки семян консорциумом бактерий Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS на митотический индекс.

В данном эксперименте для оценки ростовых процессов на клеточном уровне применяли метод вычисления митотического индекса. Проводили оценку влияния консорциума бактерий Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus megaterium 312 TS, взятых в соотношении 1:1 и имеющий общий титр клеток не менее 108 КОЕ/мл.

Исследуемые штаммы бактерий культивировали при 5°С и 25°С в среде LB. Семена ячменя (n = 30) замачивали в бактериальной взвеси на 2 ч, затем помещали в стерильные чашки Петри (по 10 семян на чашку) на поверхность влажной фильтровальной бумаги в шахматном порядке с зародышами в одном направлении. Чашки Петри выдерживали при 20 ± 2 °С в течение 3 дней. Контрольные семена замачивали в дистиллированной воде. Кончики корней были зафиксированы в Раствор Карнуа [(этанол (99%): ледяная уксусная кислота (3:1)] в течение 24 ч и окрашивали ацетокарминовым красителем. Клетки растения оценивали под микроскопом и подсчитывали митотический индекс, фазовые индексы (I) делящихся клеток.

Митотический индекс (%), рассчитывали по формуле (1)

MI = (Количество делящихся клеток/Общее количество клеток) × 100 (1)

Влияние бактеризации семян на митотический индекс и частота митотических фаз приведены в таблице 7.

Примечание: N - общее число микроскопированных клеток; п - число исследованных фаз; MI ± m - митотический индекс. *различия с контролем достоверны при P<0,05

Обработка семян овса консорциумом Bacillus simplex 948P-1 TS и Bacillus mega-terium 312 TS выращенными при +5°С привело к максимальному повышению интенсивности клеточных делений особенно у Bacillus simplex 948P-1 TS (25,93%). Интенсивность клеточных делений по сравнению с контролем возросла в среднем в 1,5 раза.

Таким образом, выявлено достоверно положительное влияние при обработке семян бактериальными штаммами выращенных при 5 и 22°С на митотическую активность клеток апикальной меристемы корней проростков овса, что в свою очередь подтверждает ростостимулирующее и защитное действия консорциума на растение.

Изобретение позволяет увеличить урожайность сельскохозяйственных культур, их адаптивные возможности за счет стимуляции роста растений, а также стрессоустойчивость к абиотическим факторам среды.