Результат интеллектуальной деятельности: Способ количественного определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата и индометацина в плазме крови

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата и его метаболита - индометацина в плазме крови.

Производное индолуксусной кислоты - ментиловый эфир индометацина или, согласно номенклатуре ИЮПАК, 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетат является действующим веществом разрабатываемого противовоспалительного лекарственного средства.

2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетат является пролекарством и в организме подвергается ферментативному гидролизу с образованием активного вещества - индометацина и ментола:

Одной из актуальных задач при создании нового лекарственного средства является проведение исследований фармакокинетики для оценки его всасывания, распределения, метаболизма и экскреции. Для проведения исследований фармакокинетики требуется разработать биоаналитическую методику количественного определения лекарственного средства в биологических средах, в частности в плазме крови. Учитывая метаболизм исходного соединения, актуальна разработка способа одновременного количественного определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата и его метаболита - индометацина.

В настоящее время не существует способов количественного определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил) ацетата в биологических средах. Для поиска возможных прототипов проведен анализ сведений о методах определения индометацина.

Установлено, что современные методики количественного определения индометацина в биологических средах в основном базируются на ВЭЖХ и ВЭЖХ/МС анализе. В частности, в работе Wang X. и соавт. [1] описан метод жидкостной хроматографии с моноквадрупольным масс-спектрометрическим детектированием для количественного определения индометацина в плазме и моче людей. В работе Asiabi Н. и соавт. [2] описан модифицированный метод твердофазной экстракции с последующим определением индометацина в плазме крови и моче методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. Согласно разработанной методике пределы обнаружения варьировали от 70 до 800 нг/л с линейными ответами в диапазоне концентраций 0,9-500 мкг/л (в плазме крови).

В качестве прототипа использован предложенный Yuan Y. и соавт. [3] способ количественного определения индометацина и ацеметацина с использованием для пробоподготовки метода твердофазной экстракции, а для проведения анализа - метода ВЭЖХ с УФ-детектированием. Метод обеспечивал линейность определения индометацина в диапазоне концентрации 0,1-50 мкг/мл.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаемое изобретение решает задачу разработки нового способа количественного определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата и его метаболита - индометацина в плазме крови.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Поставленная задача решается способом количественного определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата и индометацина в плазме крови, включающем экстракцию определяемого вещества ацетонитрилом, с последующим определением его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием на колонке ProntoStL 75×2,0 мм, 5 мкм, в градиентном режимом элюирования с использованием в качестве подвижной фазы А 0,2 М раствора лития перхлората в растворе хлорной кислоты, а в качестве подвижной фазы Б - ацетонитрила.

Градиент формируется непосредственно во время хроматографического анализа путем смешения растворителей в узле смешения на стороне высокого давления.

Наиболее оптимальными, но не необходимыми хроматографическими условиями при этом являются:

Подвижная фаза - А: 0,2 М раствор лития перхлората в 0,005 М растворе хлорной кислоты;

- Б: ацетонирил;

Режим элюирования - градиентный:

Общее время анализа - 30 мин;

Температура колонки - 35°С;

Скорость потока - 0,10 мл/мин;

Детектор - спектрофотометрический, 320 нм;

Объем пробы - 48 мкл.

Отсутствие источников информации, содержащих ту же совокупность признаков, что и в разработанном способе, сообщает ему соответствие критерию «новизна».

Та же совокупность признаков позволяет получить новый непредсказуемый эффект - разработка высокочувствительного и селективного способа количественного определения в биологических средах нового лекарственного средства - 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата и его метаболита - индометацина и, таким образом, сообщает ему соответствие критерию «изобретательский уровень».

Проведение количественного определения нового лекарственного средства с использованием известного оборудования с помощью известных реактивов сообщает разработанному способу соответствие критерию «промышленная применимость».

Таким образом, разработанный способ соответствует всем 3 критериям охраноспособности изобретения и может быть квалифицирован как изобретение.

На Фиг. 1 представлена хроматограмма модельного раствора 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата (Ind-1) и индометацина (Ind-e) с концентрациями веществ 5000 нг/мл.

На Фиг. 2 представлена хроматограмма модельного раствора 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата (Ind-1) и индометацина (Ind-e) с концентрациями веществ 2500 нг/мл.

На Фиг. 3 представлена хроматограмма модельного раствора 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата (Ind-1) и индометацина (Ind-е) с концентрациями веществ 50 нг/мл.

Пример 1. Подбор условий извлечения определяемого вещества

В качестве экстрагента были использованы различные органические растворители: хлороформ, этилацетат, дихлорметан, четыреххлористый углерод и ацетонитрил. В 5 пластиковых центрифужных микропробирок типа «Эппендорф» вместимостью 2 мл помещали по 500 мкл раствора 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата с содержанием 1 мкг/мл, прибавляли 1,5 мл экстрагента и перемешивали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугировали при 16060g в течение 10 мин. Органический слой отбирали и упаривали под вакуумом при температуре 50°С до сухого остатка. К сухому остатку прибавили 500 мкл смеси ПФ А - ПФ Б в соотношении (1:1), перемешали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение)0 мин. Для определения степени извлечения полученные результаты сравнивали с аналитическим сигналом, полученным для раствора 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил) ацетата, с содержанием 1 мкг/мл. Результаты определения степени извлечения представлены в таблице).

Из таблицы 1 видно, что наибольшая степень извлечения достигается при экстракции ацетонитрилом. Таким образом, данный экстрагент можно использовать для экстракции 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата из плазмы крови.

Оптимальное время извлечения аналита из матрицы устанавливали экспериментально.

В 12 пластиковых центрифужных микропробирок типа «Эппендорф» вместимостью 2 мл помещали по 300 мкл раствора 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата из плазмы крови крыс, с содержанием 1 мкг/мл. Прибавляли 1,5 мл ацетонитрила и перемешивали на встряхивателе типа «Vortex» при 1500 об/мин в течение 5, 10, 15 и 20 мин. Центрифугировали при 16060g в течение 10 мин. Органический слой отбирали и упаривали под вакуумом при температуре 50°С до сухого остатка. К сухому остатку прибавили 500 мкл смеси ПФ А - ПФ Б в соотношении (1:1), перемешивали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин. Для определения степени извлечения полученные результаты сравнивали с аналитическим сигналом, полученным для раствора 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата из плазмы крови, с содержанием) мкг/мл. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что степень извлечения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата не зависит от времени экстрагирования.

Были проведены валидационные тесты, в ходе которых не обнаружено отклонений от установленных критериев приемлемости.

Пример 2. Подтверждение селективности.

Селективность - это способность биоаналитической методики измерять и различать исследуемые аналиты в присутствии компонентов, которые, как ожидается, содержатся в образце.

Селективность метода оценивается анализом не менее 6 образцов холостой плазмы крови, полученной из различных источников, и 6 образцов плазмы крови крыс, содержащих 2-изонропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетат и индометацин в концентрации, равной нижнему пределу количественного определения.

Критерий приемлемости:

- на хроматограммах холостых образцов плазмы крови не должно быть пиков веществ, совпадающих по времени удерживания с пиком анализируемых веществ. Результаты определения селективности представлены в таблицах 3 и 4.

На хроматограммах, полученных для образцов холостой плазмы, отсутствуют хроматографические пики совпадающие по времени удерживания с хроматографическими пиками 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата или индометацина. Таким образом, значения, полученные при определении селективности, отвечают критерию приемлемости.

Пример 3. Нижний предел количественного определения.

Нижний предел количественного определения - есть наименьшая концентрация аналита в образце, которая поддается надежному количественному определению с требуемой правильностью и прецизионностью.

Была установлена минимальная концентрация аналитов в плазме крови, которая может быть количественно определена в биологическом образце с требуемой правильностью и прецизионностью.

Критерии приемлемости:

- соотношение сигнал/шум должно составлять не менее 10/1;

- экспериментально рассчитанные концентрации должны лежать в пределах ±20%.

В таблицах 5 и 6 представлены результаты расчета соотношения сигнал/шум.

Как видно из таблиц 5 и 6. соотношение сигнал / шум для пика 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата в концентрации 50 нг/мл составляет 11,71/1; соотношение сигнал/шум для пика индометацина в концентрации 50 нг/мл составляет 46,03/1, что удовлетворяет критерию - отношение сигнал/шум не менее 10/1.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение позволяет получить необходимую и достоверную информацию о способе количественного определения 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-(1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетата и индометацина в плазме крови.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1 Wang X, Vernikovskaya DI, Nanovskaya TN, Rytting E, Hankins GDV, Ahmed MS A liquid chromatography method with single quadrupole mass spectrometry for quantitative determination of indomethacin in maternal plasma and urine of pregnant patients. J Pharm Biomed Anal V. 78, 2013, P. 123-128.

2 Hamid Asiabi. Yadollah Yamini, Shahram Seidi, Fazel Ghahramanifard (2013) Preparation and evaluation of a novel molecularty imprinted polymer coating for selective extraction of indomethacin from biological samples by electrochemically controlled in-tube solid phase microextraction. Analytica Chimica Acta, V. 913, 2016, P. 76-85.

3 Yuan Y. Sun N, Yan H, Han D, Row KH Determination of indometacin and acemetacin in human urine via reduced graphene oxide-based pipette tip solid-phase extraction coupled to HPLC. International Journal of Pharmaceutics, V. 495, Issue 1, 2015, P. 112-121.