Результат интеллектуальной деятельности: Способ исследования борьбы с биопленками Staphylococcus aureus препаратом на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида

Изобретение относится к областям медицины и ветеринарии и может быть использовано для разрушения биопленок.

В настоящее время антибактериальные препараты наиболее широко используются для лечения различных инфекционных заболеваний. Однако их активность снижается с каждым годом. Особенно устойчивыми к действию антибактериальных препаратов являются возбудители, способные к формированию бактериальных сообществ или биопленок. Установлено, что имеющие сложную структуру организованные сообщества патогенных бактерий могут формироваться практически на любых поверхностях и являются причиной многих проблем, в том числе и медицинских (О'Toole G.A. et al. Biofilm formation as microbial development // Ann Rev Microbiol 2000. P. 49-79; Hunt S.M. et al. Hypothesis for the role of nutrient starvation in biofilm detachment // Appl Environ Microbiol. 2004. P. 7418-25; Романова Ю.М. и др. «Биопленки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биопленками» // ВРАМН. 2011. №10. С.31-39). Сложная инфраструктура и иерархия бактерий в бактериальной биопленке, формирование ею специальных средств жизнеобеспечения и защиты в виде матрикса приводят к тому, что биопленки становятся практически неуязвимыми для антибиотиков.

Нарастание резистентности бактерий к уже имеющимся препаратам и дефицит структур, которые потенциально могли бы лечь в основу новых антибиотиков, поставили на повестку дня поиск альтернативных способов борьбы с патогенными микроорганизмами.

Известен способ фотодинамической терапии для инактивации бактерий и биопленок, в котором используют катионный пурпуринимид в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической инактивации бактериальных биопленок (патент РФ №2565450, опубл. 20.10.2015). К недостаткам этого способа фотодинамической терапии следует отнести низкий уровень фотостабильности используемой композиции, что приводит к коротким срокам хранения и к существенным ограничениям при проведении терапии. Другим ограничением при использовании вышеуказанной композиции является низкий уровень эффективности терапии очагов бактериального поражения, обусловленный низким уровнем биодоступности молекул. Кроме того, предлагаемые для аппликационного применения растворы химических агентов имеют значительную химическую активность, что приводит к их ускоренному выводу или инактивации.

Известен способ предотвращения образования биопленок на подложке, на которую нанесены частицы с локальным плазмонным резонансом (медь, серебро, золото, полупроводники, оксиды металлов) с плотностью 1-100 частиц/мкм (патент РФ №2650376, опубл. 11.04.2018). Предполагается, что при освещении поверхности поглощение и нагрев наночастиц предотвратят прикрепление микроорганизма к поверхности, ингибирование формирования биопленки и (или) разрушение уже сформированной биопленки. Недостатки данного способа заключаются в удалении наночастиц вследствие метаболизма, окисления и физико-химических процессов, сопровождающих нагревание в биосистемах (кипение, кавитация, флотация и т.п.).

Известен также способ разрушения биопленок прямым воздействием излучения фемтосекундного лазера (патент Украины №104321, 27.01.2014), предполагающий длительное (10-20 минут) высокоинтенсивное облучение ультрафиолетовыми лазерными импульсами варьируемой мощности и длины волны. К недостаткам способа можно отнести возможное повреждение здоровых клеток интенсивным ультрафиолетовым излучением лазера - вплоть до повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты и возникновения мутаций.

Возможен отрыв биопленки от поверхности, на которой она располагалась, под действием лазерного излучения в слое жидкости (заявка Японии №2004-275979, опубл. 07.10.2004). Хотя принцип действия не раскрывается, можно предположить, что в этом случае генерируются ударные волны, отрывающие биопленку от поверхности (Song, W.D., Hong, М.Н., Lukyanchuk, В., & Chong, Т.С. (2004). Laser-induced cavitation bubbles for cleaning of solid surfaces. Journal of applied physics 95(6), 2952-2956). Этот способ с определенными допущениями (по механической прочности) применим к абиотическим поверхностям, однако на поверхности тканей может вызывать разрушения клеток здоровой такни и микрососудов крови (Shen, N., Datta, D., Schaffer, СВ., LeDuc, P., Ingber, D.E., & Mazur, E. (2005). Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst, 2(1), 17-25.).

Наиболее близким аналогом является способ разрушения биопленок лазерным излучением с использованием композиции, содержащей серебро (публикация международной заявки WO 2014/089552, опубл. 12.06.2014). Разрушение биопленки на поверхности раны предполагается под действием локальной ударной волны, генерированной наносекундным лазерным излучением (длина волны 1064 нм) в слое серебросодержащей композиции на поверхности биопленки и вдавливающей бактерицидную композицию вглубь раны под действием последовательных лазерных импульсов. Основным недостатком метода является прямое лазерное воздействие на ткани, а также сложность оптимальной фокусировки, позволяющей под действием ударной волны обеспечить разрушение биопленки и транспорт композиции вглубь, но одновременно избежать разрушения компонент и целых клеток здоровой такни, а также микрососудов крови.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа исследования борьбы с биопленками Staphylococcus aureus препаратом на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида.

Поставленная задача достигается тем, что способ исследования борьбы с биопленками Staphylococcus aureus препаратом на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят равный объем 0,2 мл диметилсульфоксида с содержанием действующего вещества 1000 мг/мл, 0,2 мл мясопептонного бульона и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Staphylococcus aureus АТСС 25953 или изолята Staphylococcus aureus выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т = 37,5±0,5°С, результат исследования борьбы с биопленками, определяют по изменению интенсивности биопленкообразования, путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Результат исследования борьбы с биопленками Staphylococcus aureus препаратом, на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида определяли согласно методике (O'Toole G.A. et al. 2000). Использование данного способа исследования позволяет оценить способность препарата на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида препятствовать образованию биопленок у Staphylococcus aureus.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Препарат Арговит представляет собой комплекс высокодисперсных частиц кластерного серебра, поливинилпирролидона и водного раствора, полученного электронно-лучевой обработкой водного раствора. Препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных, спорообразующих и аспорогенных бактерий в виде монокультур и микробных ассоциаций (ООО НПЦ «Вектор-Вита», vectot-vita@ngs.ru).

Диметилсульфоксид (ДМСО) - это раствор действующего вещества, которого обладает выраженными противовоспалительными, анальгезирующими и антисептическими свойствами.

Пример 1

Способ исследования борьбы с биопленками Staphylococcus aureus препаратом на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида заключался следующим образом: в стерильный 96 луночный планшет вносят 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, 0,2 мл диметилсульфоксида с содержанием действующего вещества 1000 мг/мл, 0,2 мл мясопептонного бульона и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Staphylococcus aureus АТСС 25953 или изолята Staphylococcus aureus выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т = 37,5±0,5°С.

После инкубации, планктонные микроорганизмы из каждой лунки удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Затем в лунки вносят по 0,125 мл 0,1% раствора генциан фиолетового, окрашивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее раствор удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Планшет высушивают на воздухе и в каждую лунку вносят 0,2 мл 95% этилового спирта, инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, затем полученную спиртовую вытяжку в объеме 0,125 мл переносят в чистый 96 луночный планшет и замеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Пример 2

Способ исследования борьбы с биопленками Staphylococcus aureus препаратом на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида продемонстрирован в сравнении с действием антибактериального препарата лактобай на референтном штамме Staphylococcus aureus АТСС 25953 или изолята Staphylococcus aureus выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Применение лактобая вызывает рост биопленкообразования у изолята Staphylococcus aureus более чем в 2,1 раза с 1,01±0,01 до 2,151±0,01 усл. ед.

При изучении влияния препарата на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида на штамм Staphylococcus aureus АТСС 25953, установлено снижение процесса биопленкообразования с 0,982±0,02 до 0,753±0,01 усл. ед., что подтверждает исследование изолята Staphylococcus aureus, выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

При исследовании антибактериального препарата лактобай с референтным штаммом Staphylococcus aureus АТСС 25953, установлен рост процесса биопленкообразования с 0,982±0,02 до 1,352±0,02 усл. ед. Влияние препаратов различных фармакологических групп на процесс биопленкообразования Staphylococcus aureus, усл. ед представлены в таблице 1.

Проведенные исследования показали, что применение препарата на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида значительно снижали уровень биопленкообразования как у референтного штамма, так и у изолята Staphylococcus aureus.