Результат интеллектуальной деятельности: Способ лечения мастита у коров

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано для лечения мастита у коров.

Мастит - воспаление молочной железы, возникающее как следствие воздействия внешних (экзогенных) и внутренних (эндогенных) факторов, проявляется следующими клиническими признаками: гиперемией, отеком, болезненностью, повышением местной температуры и нарушением функции вымени. В зависимости от характера воспалительной реакции мастит разделяют на клинический с ярко выраженными признаками воспаления и скрытый (субклинический) без выраженных клинических симптомов заболевания.

Молочное скотоводство во всем мире несет огромные убытки. Экономический ущерб складывается из недополучения продукции, выбраковки молока в период лечения, затрат на лекарственные средства и ветеринарное обслуживание, вынужденного убоя и гибели животных. Серьезную хозяйственно-экономическую проблему представляет субклинический мастит, который встречается намного чаще, чем клинически выраженный [Филпот В.Н. Как победить мастит / В.Н. Филпот, Ш.С. Никерсон. GEA Farm Technologies. 2012. 239 с].

Независимо от причины, вызвавшей воспалительный процесс в молочной железе коров, мастит всегда протекает при активном участии микрофлоры. Кроме наиболее часто встречающихся стрептококков и стафилококков, мастит у коров вызывают колиформные микроорганизмы, коринебактерии, микоплазмы, микобактерии, грибы, вирусы и другие. В разных хозяйствах преобладают те или иные микроорганизмы, которые могут находиться в многочисленных ассоциациях [Париков В.А. Мастит коров / В.А. Париков, А.Г. Нежданов, В.И. Слободяник // Комплексная экологически безопасная система ветеринарной защиты здоровья животных (Методические рекомендации). М., 2002. С. 111-132].

В настоящее время для лечения больных маститом коров применяют разные методы и способы, при которых в качестве этиотропных средств используют антибиотики, сульфаниламиды и другие химиотерапевтические препараты. Однако они недостаточно эффективны из-за наличия в хозяйствах микроорганизмов или их ассоциаций, обладающих различной чувствительностью к антимикробным веществам, а также из-за появления полирезистентной микрофлоры. В связи с этим возникает необходимость поиска новых путей и разработки способов терапии мастита при помощи комплексных антимикробных препаратов широкого спектра действия, которые эффективны при разных формах мастита.

Известен способ лечения мастита у коров с использованием в качестве этиотропного средства препарата Триметосул^® 48% ("GENERA Inc.", Хорватия). В 1 мл суспензии для инъекций в качестве действующих веществ (ДВ) содержатся сульфадиазин (в форме натриевой соли) - 400 мг и триметоприм - 80 мг, а также вспомогательные вещества: гидроксид натрия - 64,4 мг и вода для инъекций - до 1 мл. Триметосул^® 48% назначают крупному рогатому скоту внутримышечно один раз в сутки в дозе 1 мл/30 кг массы животного в течение 2-5 дней [Инструкция по применению Триметосула® 48% для лечения сельскохозяйственных животных при болезнях бактериальной этиологии; номер регистрационного удостоверения 191-3-5.15-2673№ПВИ-3-2.0/03104; https://galen.vetrf.ru].

Недостатком данного способа лечения является то, что убой животных на мясо разрешается не ранее, чем через 28 суток после последнего применения препарата, а молоко дойных коров запрещается использовать в пищевых целях в течение 5 суток после последнего введения Триметосула® 48%, что приводит к браковке большого количества животноводческой продукции. Кроме того, суспензиям свойственна физическая неустойчивость (седиментация, агрегация и конденсация) из-за которой нарушается принцип однородности дозирования, что приводит к необходимости перед каждым применением интенсивно перемешивать препарат для восстановления однородного состояния.

Известен способ лечения мастита у коров, при котором в качестве лекарственного средства применяется препарат Зинаприм ("Industrial Veterinaria, S.A. "INVESA", Испания). В 1 мл раствора для инъекций в качестве действующих веществ содержатся сульфаметазин - 200 мг и триметоприм - 40 мг, а также вспомогательные вещества: лимонная кислота - 11,9 мг, метабисульфит натрия - 1 мг, соляная кислота - 1,2 мг, гидроксид натрия - 4,4 мг, натрия метил р-гидроксибензоат - 0,7 мг, натрия р-пропилгидроксибензоат - 0,01 мг и вода для инъекций - до 1 мл. Зинаприм назначают крупному рогатому скоту внутримышечно в дозе 1 мл/10 кг массы животного в течение 3-5 дней [Инструкция по применению Зинаприма для лечения бактериальных инфекций сельскохозяйственных животных; номер регистрационного удостоверения 724-3-27.12-1020№ПВИ-3-5.1/01029; https://galen.vetrf.ru].

Недостатком данного способа лечения является то, что препарат относится к 3 классу опасности (по ГОСТ 12.1.007-76). Убой животных на мясо разрешается не ранее, чем через 30 суток после последнего применения Зинаприма, а молоко дойных коров запрещается использовать в пищевых целях в течение 4 суток после последнего введения, что приводит к браковке большого количества животноводческой продукции.

Известен способ лечения мастита у коров с использованием в качестве этиотропного средства препарата Гентаприм ("Industrial Veterinaria, S.A. "INVESA", Испания). В 1 мл раствора для инъекций в качестве действующих веществ содержится гентамицина сульфат - 20 мг, сульфадиметоксин - 200 мг и триметоприм - 40 мг, а также вспомогательные вещества: поливинилпирролидон, моноэтаноламин, вода для инъекций и пропиленгликоль. Гентаприм назначают внутримышечно каждые 12-24 часа в дозе 1 мл/10 кг массы тела в течение 3-5 дней [Инструкция по применению препарата Гентаприм для лечения заболеваний бактериальной этиологии у крупного рогатого скота и свиней; номер регистрационного удостоверения 724-3-21.12-3542№ПВИ-3-3.5/01737; https://galen.vetrf.ru].

Недостатком данного способа лечения является то, что Гентаприм относится к 3 классу опасности (по ГОСТ 12.1.007-76). Симптомы передозировки могут проявляться угнетением животных, нарушением функции почек и желудочно-кишечного тракта, анемией. Убой животных на мясо разрешается не ранее, чем через 30 суток после последнего применения препарата, а молоко дойных коров запрещается использовать в пищевых целях в течение 4 суток после последнего введения Гентаприма, что приводит к браковке большого количества животноводческой продукции.

Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является способ лечения мастита у коров, при котором парентерально вводят препарат Бофлокс ("Industrial Veterinaria, S.A. "INVESA", Испания) [Schneider M., M., F., B. Pharmacokinetics of marbofloxacin in lactating cows after repeated intramuscular administrations and pharmacodynamics against mastitis isolated strains // J Dairy Sci. 2004. Jan; 87 (1). p. 202-211]. В 1 мл раствора для инъекций в качестве действующего вещества содержится марбофлоксацин - 100 мг, а также вспомогательные компоненты: ЭДТА - 0,1 мг, глюконовая кислота - 80 мг, моноглицерол - 1,0 мг, метакрезол - 2,0 мг и вода для инъекций - до 1 мл. Бофлокс крупному рогатому скоту вводят подкожно, внутримышечно или внутривенно один раз в сутки в дозе (по ДВ) 2 мг/кг массы животного в течение 3-5 дней [Инструкция по применению Бофлокса для лечения заболеваний бактериальной и микоплазменной этиологии у крупного рогатого скота и свиней; номер регистрационного удостоверения 724-3-2.15-2551№ПВИ-3-2.15/04514; https://galen.vetrf.ru].

Недостатком данного способа лечения является наличие в используемом препарате одного химиотерапевтического средства в качестве действующего вещества, что обусловливает его недостаточно высокую антимикробную активность и небольшую широту антибактериального спектра.

Технический результат изобретения - повышение эффективности терапии больных маститом коров и сокращение сроков лечения.

Технический результат достигается тем, что в способе лечения мастита у коров, включающем внутримышечное введение препарата, содержащего действующее вещество марбофлоксацин и вспомогательные вещества ЭДТА, метакрезол и воду, согласно изобретению, препарат дополнительно содержит действующее вещество триметоприм и вспомогательные вещества глюконолактон, маннитол, метилпирролидон, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Марбофлоксацин - 9,5-10,5

Триметоприм - 2,375-2,625

Глюконолактон - 7,6-8,4

Маннитол - 2,85-3,15

Метилпирролидон - 9,5-10,5

Метакрезол - 0,04-0,06

ЭДТА - 0,002-0,003

Вода для инъекций - до 100,

причем препарат вводят один раз в сутки в течение 2-4 дней в дозе 10 мл.

Используемый в изобретении в форме солей с полигидроксикарбоновыми кислотами марбофлоксацин - относительно новое антибактериальное вещество, созданное для применения в ветеринарии, которое относится к группе фторхинолонов. Он обладает широким спектром бактерицидного действия в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Механизм его действия заключается в ингибировании синтеза ДНК бактерий за счет подавления бактериальной ДНК-гиразы. Марбофлоксацин эффективен в отношении Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Morganella morganii, Proteus spp., Klebsiella spp., Shigella spp., Pasteurella spp., Hemophilus spp., Moraxella spp., Pseudomonas spp., Mycoplasma spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp.

После внутримышечного или подкожного введения крупному рогатому скоту марбофлоксацин быстро всасывается и достигает максимальной концентрации в плазме меньше чем за 1 час; слабо связывается с белками плазмы (до 30%), хорошо распределяется в большинстве тканей (печень, почки, кожа, легкие, матка), достигая большей концентрации, чем в плазме; медленно выводится (период полувыведения - 4-7 часов) в основном в активной форме с мочой и калом [The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Veterinary Medicines Evaluation Unit. EMEA/MRL/079/96-FINAL. Committee for veterinary medicinal products. Marbofloxacin. Summary report (1); The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Veterinary Medicines Evaluation Unit. EMEA/MRL/693/99-FINAL. Committee for veterinary medicinal products. Marbofloxacin. Summary report (2)].

Триметоприм - диаминопиримидиновое антимикробное средство, активное в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, включая кишечную палочку и некоторые виды клебсиелл, протеев и стафилококков. В основе механизма действия лежит ингибирование фермента дигидрофолатредуктазы, что препятствует образованию тетрагидрофолиевой кислоты в бактериальной клетке, и, следовательно, влияет на синтез ДНК. В ветеринарии триметоприм обычно применяют в сочетании с сульфаниламидами и, как правило, он хорошо переносится.

После введения триметоприм быстро всасывается. Стах определяется через 1-3 ч. Период полувыведения из плазмы составляет примерно 4,5 часа. Высокий уровень создается в легких, мочевыводящих путях, в месте введения. Метаболизируется в печени. Большая часть выводится в течение 2 дней (67% - с калом и 33% - с мочой). Единственными метаболитами, обладающими микробиологической активностью, являются дисметил- и α-гидроксиметаболиты, которые составляют не более 15% от общего количества остатков [The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Committee for veterinary medicinal products. Trimethoprim. Summary report (1); The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Veterinary Medicines Evaluation Unit. EMEA/MRL/255/97-FINAL. Committee for veterinary medicinal products. Trimethoprim. Summary report (2)].

Глюконолактон относится к полигидроксикислотам, которые оказывают во многом аналогичное АНА-кислотам (глюконовой, лимонной, яблочной, молочной кислотам) биологическое действие. В норме содержится в организме, является природным антиоксидантом, оказывает фотопротекторное действие, обладает противовоспалительным эффектом. Используется в качестве стабилизатора, регулятора кислотности, консерванта.

Маннитол (маннит или d-маннит) - насыщенный алифатический шестиатомный углеводородный спирт из группы Сахаров. Широко применяется в химической, косметической и пищевой промышленности. В медицине и фармацевтике используется для приготовления лекарств. Не токсичен, не вызывает аллергии.

Метилпирролидон - органическое соединение, относящееся к классу N-алкилированных лактамов, лактам 4-метиламино-масляной кислоты. Метилпирролидон полярная апротонная жидкость с низкой вязкостью, с хорошей растворяющей способностью для широкого спектра органических и неорганических соединений. В фармацевтике применяют для производства лекарственных средств, экстракции полезных веществ из сырья.

Метакрезол (3-метилфенол мета-крезол, 3-метилбензолол, 3-гидрокситолуол) - алкильное производное фенола. Используется как растворитель, является сильнодействующим антисептиком широкого спектра. В малых концентрациях применяется при производстве медицинских препаратов как консервант растворов для инъекций.

Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) - четырехосновная карбоновая кислота. ЭДТА натрий (ЭДТА-Na) - агент, хелатор, связывающий растворенные в воде ионы металлов, обеспечивает большую стабильность и улучшает пенообразование продуктов с ПАВ. ЭДТА усиливает действие консервантов и противовоспалительные свойства бактериостатиков. Наиболее широко применяется в качестве антиоксиданта и антикоагулянта.

Вода для инъекций используется в качестве растворителя, для приготовления инфузионных и инъекционных растворов.

По внешнему виду препарат для лечения мастита у коров представляет собой раствор для инъекций, расфасованный в герметично закрытые флаконы из темного стела, укупоренные резиновыми пробками и обкатанные алюминиевыми колпачками.

По степени воздействия на организм препарат для лечения мастита у коров относится к веществам малоопасным (4 класс опасности).

Инъекционный раствор препарата применяют для терапии субклинического, катарального и гнойно-катарального мастита у коров внутримышечно в дозе 10 мл один раз в сутки в течение 2-4 дней в зависимости от тяжести воспалительного процесса.

Молоко для пищевых целей можно использовать через 36 часов после последнего введения препарата, при условии отсутствия признаков мастита. Убой животных на мясо разрешается через 6 суток после курсового применения препарата.

Для выявления оптимального соотношения компонентов в препарате использовали три рецептуры (таблица 1).

Антимикробную активность различных рецептур сравнивали с активностью исходных действующих веществ - марбофлоксацином и триметопримом.

Изучение антимикробной активности каждой рецептуры препарата проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде. В качестве жидкой питательной среды применяли мясо-пептонный бульон. При определении чувствительности стрептококков к среде добавляли 1% раствор глюкозы. Основной раствор препарата готовили из расчета 1000 мкг/мл (по сумме ДВ).

Из основного раствора препарата готовили рабочий раствор. В 16 стерильных пробирок разливали по 4,5 мл мясо-пептонного бульона. В 1-ю пробирку добавляли 4,5 мл препарата и перемешивали, после чего 4,5 мл полученного раствора переносили в следующую пробирку, продолжая разведение до 15-й пробирки. В качестве контроля роста культуры использовали 16-ю пробирку, не содержащую препарат.

Суточные агаровые культуры смывали стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. По стандарту мутности определяли концентрацию 500 млн микробных клеток в 1 мл. Затем методом последовательных разведений получали концентрацию 5 млн микробных клеток. Для этой цели разведение культур осуществляли изотоническим раствором в 2 пробирках. В 1-ю пробирку, содержащую 9 мл изотонического раствора, вносили 1 мл культуры с концентрацией 500 млн микробных клеток в 1 мл, содержимое перемешивали и 1 мл переносили во 2-ю пробирку с 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, концентрация культуры составляла 5 млн микробных клеток. Во все 16 пробирок высевали по 0,5 мл приготовленной взвеси. В рабочих пробирках концентрация культуры составляла 250 тыс. микробных клеток.

Посевы инкубировали при 37°С в течение 18-20 часов. По истечении срока инкубации учитывали результат. Минимальной бактериостатической концентрацией (МБсК) считали наименьшую концентрацию, которая вызывает видимую задержку роста культуры (прозрачный бульон).

Для установления бактерицидного действия препарата из пробирок с прозрачной средой после осторожного взбалтывания проводили посевы на плотные питательные среды. Минимальной бактерицидной концентрацией (МБцК) считали наименьшую концентрацию, при которой отмечали полное угнетение роста культуры при пересеве на мясо-пептонный агар, не содержащий препарат.

Установлено, что оба компонента препарата проявляли высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов (таблица 2). МБсК марбофлоксацина по отношению к Staph, aureus 209Р составила 0,49 мкг/мл, а к Е. coli 866-0,98 мкг/мл, а МБсК триметоприма - 15,6 мкг/мл и 125,0 мкг/мл соответственно.

В отношении Е. coli МБсК рецептур №1 и №2 по сравнению с МБсК марбофлоксацина не изменилась, а у рецептуры №3 возросла в 2 раза. По сравнению с триметопримом МБсК рецептур №1 и №2 снизилась в 128 раз, а у рецептуры №3 - в 64 раза.

В отношении Staph, aureus 209Р МБсК рецептуры №1 по сравнению с МБсК марбофлоксацина не изменилась, а у рецептур №2 и №3 снизилась - в 2 раза. МБсК рецептуры №1 по сравнению с триметопримом снизилась в 32 раза, а рецептур №2 и №3 - в 62 раза.

Минимальная бактерицидная концентрация всех изученных рецептур препарата превышала бактериостатическую в 2-8 раз.

На основании полученных данных установлено, что совместное применение марбофлоксацина и триметоприма позволило снизить минимальную бактериостатическую концентрацию в отношении изученных культур, что свидетельствует о синергическом действии составляющих компонентов. В связи с тем, что наиболее выраженным антимикробным действием обладает рецептура №2, она была более детально изучена.

При проведении бактериологических исследований в качестве тест-культур использовали микроорганизмы, выделенные из секрета больных маститом коров, а также музейные штаммы.

Как следует из представленных данных (таблица 3), препарат обладает широким спектром и высоким антимикробным действием в отношении потенциальных возбудителей мастита. Его минимальная подавляющая концентрация для стафилококков составила 0,12-0,49 мкг/мл, в отношении стрептококков и энтерококков - 0,25-0,98 и 0,25-1,96 мкг/мл соответственно, а для эшерихий - 0,98-1,96 мкг/мл.

Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противомикробной активностью в отношении потенциальных возбудителей мастита у крупного рогатого скота.

Терапевтическая эффективность способа подтверждена для разных форм мастита.

Пример 1. Изучение эффективности лечения субклинического мастита у коров.

Научно-производственный опыт был проведен на базе ЗАО «Славянское» Верховского района Орловской области на 36 коровах, подобранных по принципу аналогов. Животные находились в одинаковых условиях кормления и содержания.

Диагноз на субклинический мастит ставили комплексно, с учетом анамнеза, клинического осмотра и результатов анализов молока. Проведение реакции с диагностическим реактивом осуществляли с использованием молочно-контрольной пластинки МКП-2. Для этой цели из каждой доли молочной железы выдаивали в соответствующие лунки по 1 мл молока, затем с помощью дозатора добавляли по 1 мл диагностического реактива Масттест, перемешивали путем вращения пластины в горизонтальной плоскости 10-15 секунд. Учет реакции проводили по степени образования желеобразного сгустка или изменению цвета смеси.

Животным контрольной группы (n=18) применяли Бофлокс согласно инструкции по применению. Больным животным опытной группы (n=18) внутримышечно в дозе 10 мл один раз в сутки в течение 2-3 дней (до получения отрицательной реакции с диагностикумом) вводили по заявляемому способу препарат, при следующем соотношении компонентов, мас. %: марбофлоксацин - 9,5-10,5; триметоприм - 2,375-2,625; глюконолактон - 7,6-8,4; маннитол - 2,85-3,15; метилпирролидон - 9,5-10,5; метакрезол - 0,04-0,06; ЭДТА - 0,002-0,003; вода для инъекций - до 100.

Ежедневно животных клинически обследовали, а секрет вымени исследовали при помощи Масттеста и пробы отстаивания.

Как следует из представленных данных (таблица 4), терапевтическая эффективность заявленного способа при субклиническом мастите составила 95,5%, что соответствовало контрольным значениям.

Пример 2. Изучение эффективности лечения катарального мастита у коров.

Научно-производственный опыт был проведен на базе ЗАО «Славянское» Верховского района Орловской области на 27 коровах, подобранных по принципу аналогов. Животные находились в одинаковых условиях кормления и содержания.

Диагноз на катаральный мастит ставили комплексно, с учетом данных анамнеза, клинического осмотра и анализа молока. Животным контрольной группы (n=13) применяли Бофлокс согласно инструкции по применению. Больным коровам опытной группы (n=14) внутримышечно в дозе 10 мл один раз в сутки в течение 2-4 дней вводили препарат, при следующем соотношении компонентов, мас. %: марбофлоксацин - 9,5-10,5; триметоприм - 2,375-2,625; глюконолактон - 7,6-8,4; маннитол - 2,85-3,15; метилпирролидон - 9,5-10,5; метакрезол - 0,04-0,06; ЭДТА - 0,002-0,003; вода для инъекций - до 100.

Ежедневно животных клинически обследовали, а секрет вымени исследовали при помощи Масттеста и пробы отстаивания.

Как следует из представленных данных (таблица 5), терапевтическая эффективность заявленного способа при катаральном мастите составила 93,8%, что выше, чем при применении Бофлокса на 7,1%.

Пример 3. Изучение эффективности лечения гнойно-катарального мастита у коров.

Научно-производственный опыт был проведен на базе ЗАО «Славянское» Верховского района Орловской области на 24 коровах, подобранных по принципу аналогов. Животные находились в одинаковых условиях кормления и содержания.

Диагноз на гнойно-катаральный мастит ставили комплексно, с учетом данных анамнеза, клинического осмотра и анализа молока. Животным контрольной группы (n=12) применяли Бофлокс согласно инструкции по применению. Больным коровам опытной группы (n=12) внутримышечно в дозе 10 мл один раз в сутки в течение 3-4 дней вводили препарат, при следующем соотношении компонентов, мас. %: марбофлоксацин - 9,5-10,5; триметоприм - 2,375-2,625; глюконолактон - 7,6-8,4; маннитол - 2,85-3,15; метилпирролидон - 9,5-10,5; метакрезол - 0,04-0,06; ЭДТА - 0,002-0,003; вода для инъекций - до 100.

Ежедневно животных клинически обследовали, а секрет вымени исследовали при помощи Масттеста и пробы отстаивания.

Как следует из представленных данных (таблица 6), терапевтическая эффективность заявленного способа при гнойно-катаральном мастите составила 84,6%, что выше, чем при применении Бофлокса на 7,7%.

Заявленный способ лечения мастита у коров, включающий внутримышечное введение препарата, содержащего марбофлоксацин (в форме солей с полиоксикарбоновыми кислотами) и триметоприм в качестве действующих веществ, а также вспомогательные компоненты, обладает высокой терапевтической эффективностью. Во всех клинических опытах выздоровление животных наступало быстрее, чем в контрольной группе. При этом препарат хорошо переносится животными, после его применения не регистрировали признаки токсикоза и других побочных эффектов. Данный способ может быть широко использован в производственных условиях животноводческих хозяйств для лечения мастита у коров.