Результат интеллектуальной деятельности: ГОМОДЕТНЫЕ ЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ, ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННО ВОЗДЕЙСТВУЮЩИЕ НА ИНТЕГРИН α4β7

РОДСТВЕННЫЕ 3АЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/504309, поданной 10 мая 2017 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ И3ОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к антагонистам интегрина α4β7 и, в частности, к циклическим пептидным антагонистам.

УРОВНЕНЬ ТЕХНИКИ

Интегрины представляют собой трансмембранные рецепторы, которые являются мостиками для взаимодействия клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс (ЕСМ). Целеноправленное воздействие на интегрины приводит к возникновению химических путей внутрь (трансдукция сигнала), например, химического состава и механического состояния ЕСМ.

Интегрины представляют собой облигатные гетеродимеры, имеющие две разные цепи: α (альфа) и β (бета) субъединицы.

Интегрин α4β7 экспрессируется на лимфоцитах и отвечает за хоминг Т-клеток в лимфоидные ткани, связанные с кишечником, посредством его связывания с молекулой клеточной адгезии типа «аддрессин» в слизистых оболочках (MAdCAM), которая присутствует в венах с высоким содержанием эндотелия слизистых лимфоидных органов.

Было показано, что ингибиторы специфических взаимодействий интегрин-лиганд эффективны в качестве противовоспалительных агентов для лечения различных аутоиммунных заболеваний. Например, мо но тональные антитела, проявляющие высокую аффинность связывания с α4β7, продемонстрировали терапевтические преимущества при желудочно-кишечных ауто-воспалительных/аутоиммунных заболеваниях, таких как болезнь Крона и язвенный колит.

Существует необходимость в разработке улучшенных антагонистов α4β7 для предотвращения или лечения воспалительных состояний и/или аутоиммунных заболеваний.

Некоторые способы получения циклических пептидов (нацеллинов) описаны в публикации РСТ, составленной заявителем, № WO 2010/105363. Нацеллиновые антагонисты интегрина α4β7 описаны в заявке на патент РСТ, составленной заявителем, № РСТ/СА 2016/000274. Мультимерные нацеллиновые антагонисты интегрина α4β7 описаны в предварительной заявке на патент США, составленной заявителем, №62/421117.

СУЩНОСТЬ И3ОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте предложено соединение формулы (I):

где

R¹ представляет собой Н; низший алкил; арил; гетероарил; алкенил; или гетероцикл; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей;

R² и R³ каждый независимо представляет собой аминокислотную цепь протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты, при условии, что R² и R³ могут быть ковалентно связаны друг с другом с образованием кольца или могут быть ковалентно связаны с R¹ с образованием циклического вторичного амина,

R⁴ представляет собой Н, низший алкил, бензил, алкенил, низший алкилокси; арил; гетероарил; гетероцикл; -C(O)R****, где R**** независимо выбран из алкила, арила, гетероарила, амино, аминоалкила, аминоарила, аминогетероарила, алкокси, арилокси, гетероарилокси; -CH2C(O)R; или -C(O)Rc; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей,

или вместе с R⁵ или R⁶, циклическую боковую цепь протеи но генной или непротеиногенной аминокислоты, имеющей N-конец, представляющий собой N-R⁴, при этом протеиногенная или непротеиногенная аминокислота может быть замещена подходящим заместителем;

R⁵ и R⁶ независимо выбраны из аминокислотных боковых цепей протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты, имеющей N-конец, представляющий собой N-R⁴, или могут образовывать циклическую боковую цепь с R⁴;

стереоцентры 1* и 2*, каждый, независимо выбраны из R и S; и

где Z представляет собой аминоконец аминокислоты; -С=O- смежный с L, представляет собой карбокси-конец аминокислоты; и L вместе с Z и -С=O- представляет собой пептид, имеющий следующую формулу:

X^y-X^z-X¹-Х²-Х³

где Х^у представляет собой протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту;

X^z отсутствует или представляет собой протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту;

X¹ представляет собой лейцин или трет-бутил-Ala;

X² представляет собой Asp; и

X³ представляет собой Thr, Ile, MeThr, alloThr, Abu, Thr(OBn), Val или аллоил.

В одном аспекте, предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение или мультимер, описанные в данном документе, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

В одном аспекте, предложен способ лечения воспаления или аутоиммунного заболевания у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе.

В одном аспекте, предложен способ лечения у пациента состояния, связанного с биологической функцией интегрина α4β7, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе.

В одном аспекте, предложен способ лечения у пациента заболевания или состояния, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе, при этом указанное заболевание или состояние представляет собой локальное или системное заражение вирусом или ретровирусом.

В одном аспекте, предложен способ лечения у пациента заболевания или состояния, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе, при этом заболевание или состояние представляет собой гепатит А, В или С, печеночную энцефалопатию, неалкогольный стеатогепатит, цирроз печени, варикозное кровотечение, гемохроматоз, болезнь Вильсона, тирозинемию, дефицит альфа-1-антитрипсина, гепатоклеточную карциному, рак печени, первичный билиарный холангит, первичный склероз желчных путей, болезнь желчных протоков или аутоиммунный гепатит.

В других аспектах предложено применение описанных в данном документе соединений или мультимеров для лечения или профилактики заболеваний и состояний, указанных выше.

В других аспектах предложено применение описанных в данном документе соединений или мультимеров для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и состояний, указанных выше.

В других аспектах предложены описанные в данном документе соединения или мультимеры для использования при лечении или профилактике заболеваний и состояний, указанных выше.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Эти и другие признаки предпочтительных вариантов осуществления изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания, в котором делается ссылка на прилагаемые графические материалы и таблицы, где:

На Фиг. 1 проиллюстрированы типичные соединения 1-6 по данной заявке.

На Фиг. 2 проиллюстрированы типичные соединения 7-12 по данной заявке.

На Фиг. 3 проиллюстрированы типичные соединения 13-15 по данной заявке.

На Фиг. 4 проиллюстрированы типичные мультимерные соединения 16-17 по данной заявке.

На Фиг. 5 проиллюстрированы типичные мультимерные соединения 18-19 по данной заявке.

На Фиг. 6 проиллюстрирована способность соединений ингибировать адгезию клеточных линий человека, экспрессирующих интегрин α4β7, на планшетах, покрытых MAdCAM-1. Кривые зависимости реакции от дозы для ингибирования адгезии клеток RPMI8866, экспрессирующих интегрин α4β7, с MAdCAM-1, нанесенным на планшеты. Столбики ошибок указывают стандартные отклонения.

На Фиг. 7 проиллюстрирована способность соединений ингибировать адгезию клеточных линий человека, экспрессирующих интегрин α4β7 на планшетах, покрытых VCAM-1. Кривые зависимости реакции от дозы для ингибирования адгезии клеток RAMOS, экспрессирующих интегрин α4β7, с VCAM-1, нанесенным на планшеты. Столбики ошибок указывают стандартные отклонения.

На Фиг. 8 проиллюстрирована занятость рецепторов (RO) соединения, измеренная с использованием анализа смещения лиганда цельной крови. Кривые зависимости реакции от дозы для ингибирования связывания MAdCAM с α4β7 Th клетками памяти в репрезентативном эксперименте. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение для дублирующих экспериментальных точек для соединения №16.

На Фиг. 9 проиллюстрирована занятость рецепторов (RO) соединения, измеренная с использованием анализа смещения лиганда цельной крови. Кривые зависимости реакции от дозы для ингибирования связывания MAdCAM с α4β7-негативными Th клетками памяти в репрезентативном эксперименте.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В нижеследующем описании изложены многочисленные конкретные подробности, чтобы обеспечить полное понимание данного изобретения. Однако понятно, что данное изобретение может быть осуществлено на практике без этих конкретных подробностей.

В одном аспекте предложено соединение формулы (I):

где

R¹ представляет собой Н; низший алкил; арил; гетероарил; алкенил; или гетероцикл; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей;

R² и R³ каждый независимо представляет собой аминокислотную цепь протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты,

при условии, что R² и R³ могут быть ковалентно связаны друг с другом с образованием кольца или могут быть ковалентно связаны с R¹ с образованием циклического вторичного амина,

R⁴ представляет собой Н, низший алкил, бензил, алкенил, низший алкилокси; арил; гетероарил; гетероцикл; -C(O)R****, где R**** независимо выбран из алкила, арила, гетероарила, амино, аминоалкила, аминоарила, аминогетероарила, алкокси, арилокси, гетероарилокси; -CH₂C(O)R; или -C(O)Rc; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей, или вместе с R⁵ или R⁶, циклическую боковую цепь протеиногенной или непротеиногенной аминокислоты, имеющей N-конец, представляющий собой N-R⁴, при этом протеиногенная или непротеиногенная аминокислота может быть замещена подходящим заместителем;

R⁵ и R⁶ независимо выбраны из аминокислотных боковых цепей протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты, имеющей N-конец, представляющий собой N-R⁴, или могут образовывать циклическую боковую цепь с R⁴;

стереоцентры 1* и 2*, каждый, независимо выбраны из R и S; и

где Z представляет собой аминоконец аминокислоты; -С=O- смежный с L, представляет собой карбокси-конец аминокислоты; и L вместе с Z и -С=O- представляет собой пептид, имеющий следующую формулу:

X^y-X^z-X¹-Х²-Х³

где Х^у представляет собой протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту;

X^z отсутствует или представляет собой протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту;

X¹ представляет собой лейцин или трет-бутил-Ala;

X² представляет собой Asp; и

X³ представляет собой Thr, Ile, MeThr, alloThr, Abu, Thr(OBn), Val или аллоил.

Используемый в данном документе термин «аминокислота» относится к молекулам, содержащим аминогруппу, группу карбоновой кислоты и боковую цепь, которая варьируется. Предполагается, что аминокислота включает в себя не только двадцать аминокислот, обычно встречающихся в белках, но также нестандартные аминокислоты и производные неприродных аминокислот, известные специалистам в данной области техники, и поэтому включает в себя, но не ограничивается ими, альфа, бета и гамма-аминокислоты. Пептиды представляют собой полимеры по меньшей мере из двух аминокислот и могут включать в себя стандартные, нестандартные и неприродные аминокислоты. Пептид представляет собой полимер из двух или большего количества аминокислот. В данном документе используются следующие сокращения:

Подразумевается, что термин «подходящий заместитель», используемый в контексте данного изобретения, включает в себя независимо друг от друга Н; гидроксил; циано; алкил, например, низший алкил, например, метил, этил, пропил, н-бутил, трет-бутил, гексил и аналогичные заместители; алкокси, например, низший алкокси, например, метокси, этокси и аналогичные заместители; арилокси, например, фенокси и аналогичные заместители; винил; алкенил, например, гексенил и аналогичные заместители; алкинил; формил; галоалкил, например, низший галоалкил, который включает в себя CF₃, CCl₃ и аналогичные заместители; галид; арил, например, фенил и нафтил; гетероарил, например, тиенил и фуранил, и аналогичные заместители; амид, например, C(O)NR_aR_b, где R_a и R_b независимо выбраны из низшего алкила, арила или бензила, и аналогичные заместители; ацил, например, С(O)-С₆Н₅ и аналогичные заместители; сложный эфир, например, -С(O)ОСН₃ и аналогичные заместители; простые эфиры и тиоэфиры, например, О-Bn и аналогичные заместители; тиоалкокси; фосфин; и -NR_aR_b, где R_a и R_b независимо выбраны из низшего алкила, арила или бензила, и аналогичные заместители. Следует понимать, что подходящий заместитель, используемый в контексте данного изобретения, предназначен для обозначения заместителя, который не препятствует образованию желаемого продукта способами по данному изобретению.

Используемый в контексте данного изобретения термин «низший алкил», используемый в данном документе отдельно либо в комбинации с другим заместителем, означает ациклический, прямой или разветвленный алкильный заместитель, содержащий от одного до шести атомов углерода, и включает в себя, например, метил, этил, 1-метилэтил, 1-метилпропил, 2-метилпропил и аналогичный заместитель. В отношении числа атомов углерода следует понимать аналогичное использование термина для «низшего алкокси», «низшего тиоалкила», «низшего алкенила» и аналогичного заместителя. Например, «низший алкокси», используемый в данном документе, включает в себя метокси, этокси, трет-бутокси.

Термин «алкил» охватывает низший алкил, а также включает в себя алкильные группы, имеющие более шести атомов углерода, например, ациклические, линейные или разветвленные алкильные заместители, имеющие от семи до десяти атомов углерода.

Используемый в данном документе термин «арил», отдельно либо в комбинации с другим заместителем, означает ароматическую моноциклическую систему или ароматическую полициклическую систему. Например, термин «арил» включает в себя фенильное или нафтильное кольцо и может также включать в себя более крупные ароматические полициклические системы, например, флуоресцентные (например, антраценовые) или радиоактивные метки и их производные.

Используемый в данном документе термин «гетероарил», отдельно либо в комбинации с другим заместителем, означает 5, 6 или 7-членный ненасыщенный гетероцикл, содержащий от одного до 4 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы, и которые образуют ароматическую систему. Термин «гетероарил» также включает в себя полициклическую ароматическую систему, содержащую 5, 6 или 7-членный ненасыщенный гетероцикл, содержащий от одного до 4 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы.

Используемый в данном документе термин «циклоалкил», отдельно или в комбинации с другим заместителем, означает циклоалкильный заместитель, который включает в себя, но не ограничивается ими: циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Используемый в данном документе термин «циклоалкил-алкил-» означает алкильный радикал, с которым непосредственно связан циклоалкильный радикал; и включает в себя, но не ограничивается ими: циклопропилметил, циклобутилметил, циклопентилметил, 1-циклопентилэтил, 2-циклопентилэтил, циклогексилметил, 1-циклогексилэтил и 2-циклогексилэтил. Аналогичное использование в данном документе терминов «алкил» или «низший алкил» следует понимать для арилалкила-, арил-низшего алкила- (например, бензила), низшего алкил-алкенила (например, аллила), гетероарил-алкила- и аналогичных заместителей. Например, термин «арил-алкил-» означает алкильный радикал, с которым связан арил. Примеры арил-алкилов- включают в себя, но не ограничиваются ими: бензил (фенилметил), 1-фенилэтил, 2-фенилэтил и фенилпропил.

Используемый в данном документе термин «гетероцикл», отдельно либо в комбинации с другим радикалом, означает одновалентный радикал, полученный посредством удаления водорода из трех- или семичленного насыщенного или ненасыщенного (включая ароматическое) циклического соединения, содержащего от одного до четырёх гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. Примеры таких гетероциклов включают в себя, но не ограничиваются ими: азиридин, эпоксид, азетидин, пирролидин, тетрагидрофуран, тиазолидин, пиррол, тиофен, гидантоин, диазепин, имидазол, изоксазол, тиазол, тетразол, пиперидин, пиперазин, гомопиперидин, гомопиперазин, 1,4-диоксан, 4-морфолин, 4-тиоморфолин, пиридин, пиридин-N-оксид или пиримидин и аналогичные гетероциклы.

Термин «алкенил», используемый в данном документе, отдельно либо в комбинации с другим радикалом, предназначен для обозначения ненасыщенного ациклического радикала с прямой цепью, содержащего два или большее количество атомов углерода, по меньшей мере два из которых связаны друг с другом двойной связью. Примеры таких радикалов включают в себя, но не ограничиваются ими: этенил (винил), 1-пропенил, 2-пропенил и 1-бутенил.

Используемый в данном документе термин «алкинил» предназначен для обозначения ненасыщенного ациклического радикала с прямой цепью, содержащего два или большее количество атомов углерода, по меньшей мере два из которых связаны друг с другом тройной связью. Примеры таких радикалов включают в себя, но не ограничиваются ими: этинил,1-пропинил, 2-пропинил и 1-бутинил.

Используемый в данном документе термин «алкокси», отдельно либо в комбинации с другим радикалом, означает радикал -O-(С_1-n)алкил, где алкил имеет значения, указанные выше, и содержит 1 или большее количество атомов углерода, и включает в себя, например, метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси и 1,1-диметилэтокси. В случае если n равен 1-6, термин «низший алкокси» применяется как отмечено выше, при этом термин «алкокси» охватывает «низший алкокси», а также алкоксигруппы, где n больше 6 (например, n=7-10). Термин «арилокси», используемый в данном документе отдельно либо в комбинации с другим радикалом, означает -О-арил, где арил имеет значения, указанные выше.

3ащитная группа представляет собой заместитель, введенный в молекулу для получения хемоселективности в последующей химической реакции. Многие защитные группы известны в данной области техники, и специалист в данной области техники должен понимать виды защитных групп, которые могут быть включены и могут быть использованы вместе со способами, описанными в данном документе. В «синтезе пептидов на основе защитных групп», как правило, в твердофазном синтезе пептидов, желаемый пептид получают посредством поэтапного добавления аминокислотных фрагментов к строящейся пептидной цепи. Два наиболее широко используемых протокола в твердофазном синтезе применяют трет-бутилоксикарбонил (Boc) или 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc) в качестве аминозащитных групп. Аминозащитные группы, в целом, защищают аминогруппу от нежелательных реакций в процессе методов синтеза и могут быть впоследствии удалены для обнаружения амина. Широко используемые аминозащитные группы описаны в Greene, Т. W. et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons (1999). Аминозащитные группы включают в себя ацильные группы, например, формил, ацетил, пропионил, пивалоил, трет-бутилацетил, 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, о-нитрофеноксиацетил, альфа-хлорбутирил, бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4-нитробензоил и аналогичные группы; сульфонильные группы, например, бензолсульфонил, п-толуолсульфонил и аналогичные группы; алкокси- или арилоксикарбонильные группы (которые образуют уретаны с защищенным амином), например, бензилоксикарбонил (Cbz), п-хлорбензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, 2-нитробензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, 2,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4-метоксибензилоксикарбонил, 2-нитро-4,5-диметоксибензилоксикарбонил, 3,4,5-триметоксибензилоксикарбонил, 1-(п-бифенилил)-1-метилэтоксикарбонил, альфа-, альфа-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, бензгидрилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил (Boc), диизопропилметоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этоксикарбонил, метоксикарбонил, аллилоксикарбонил (Alloc), 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, 2-триметилсилилэтилоксикарбонил (Теос), феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил, флуоренил-9-метоксикарбонил (Fmoc), циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, фенилтиокарбонил и аналогичные группы; аралкильные группы, например, бензил, трифенилметил, бензилоксиметил и аналогичные группы; а также силильные группы, например, триметилсилил и аналогичные группы. Аминозащитные группы также включают в себя циклические аминозащитные группы, например, фталоил и дитиосукцинимидил, которые включают аминный азот в гетероцикл. Как правило, аминозащитные группы включают в себя формил, ацетил, бензоил, пивалоил, трет-бутилацетил, фенилсульфонил, Alloc, Теос, бензил, Fmoc, Boc и Cbz. Обычный специалист может выбрать и использовать подходящую аминозащитную группу для выполнения задачи синтеза.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R¹ представляет собой Н. В других вариантах осуществления изобретения R² или R³ ковалентно связаны с R¹ с образованием пролина, имеющего NR¹ в качестве N-конца.

В некоторых вариантах осуществления изобретения как R², так и R³ не представляют собой Н.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R² и R³ каждый независимо выбран из группы, состоящей из аминокислотных цепей протеиногенных или непротеиногенных альфа-аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R² и R³ представляют собой Н и СН₃, соответственно, или в обратном порядке.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R² или R³ представляет собой -CH₂-S-R^s, где R^s выбран из низшего алкила; низшего аминоалкила; арила; гетероарила; алкенила; или гетероцикла; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей; предпочтительно R^s представляет собой фенил или фенил, замещенный низшим алкилом, галогеном; или низший аминоалкил.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R⁴ представляет собой Н. В других вариантах осуществления изобретения R⁴ и либо R⁵ либо R⁶ образуют кольцо, в результате чего остаток пролина имеет N-R⁴ в качестве N-конца.

В некоторых вариантах осуществления изобретения n равен 1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Z вместе с L и -С=O является таким, как показано в любом из соединений 1-19.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X¹ представляет собой Leu.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X² представляет собой Asp.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X³ представляет собой Thr.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X³ представляет собой Val.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X³ представляет собой Ile.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Х^у и X^z каждый независимо представляет собой протеиногенную или непротеиногенную альфа-аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X^z представляет собой протеиногенную или непротеиногенную бета-аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Х^у и X^z, каждый, представляет собой первичную аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Х^у представляет собой (1,2-цис-АСНС), (2,4-дихлор-MePhe), (2,4-дихлор-Phe), (2-аминометил-dPhe), (2-аминометил-Phe), (2-аза-Phe), (2-бром-Phe), (2-CF3-Phe), (2-хлор-Phe), (2-фтор-MePhe), (2-фтор-Phe), (2-йод-dPhe), (2-йод-Phe), (2-фенил-dPhe), (2-фенил-Phe), (3,3-дифенил-Ala), (3,4,5-трифтор-Phe), (3,4-диметокси-Phe), (3,5-дибром-Tyr), (3-аминометил-4-бромбензойную кислоту), (3-аминометил-4-морфолинилбензойную кислоту), (3-аминометил-4-пиперидинилбензойную кислоту), (3-аминометил-5-бромбензойную кислоту), (3-аминометил-6-бромбензойную кислоту), (3-аминометилбензойную кислоту), (3-аминометил-dPhe), (3-аминометил-Phe), (3-аза-dPhe), (3-аза-Phe), (3-бензотиенил-Ala), (3-бензотиенил-dAla), (3-йод-Phe), (3-фенил-dPhe), (3-фенил-Phe), (4-амино-dPhe), (4-аминометил-dPhe), (4-аминометил-Phe), (4-аминометил-Phe)-восстановленный, (4-амино-Phe), (4-аза-dPhe), (4-аза-Phe), (4-гуанидино-Phe), (4-йод-Phe), (N-бензил-3-аминометилбензойную кислоту), (N-бензил-Gly), (N-метил-3-аминометилбензойную кислоту), (пиперидин-4-амино-4-карбоновую кислоту), (винил-Br-Leu), [(2-пиперазинил-2-фенил)-Phe], [(2-пиперазинил-2-фенил)-Phe], [1-(S)-изоиндолинкарбоновую кислоту], [2-(2,5-диметилизоксазол)-dPhe], [2-(2,5-диметилизоксазол)-Phe], [2-(2,6-диметилфенил)-Phe], [2-(2-бром-3-пиридил)-Phe], [2-(2-хлор-6-метоксифенил)-Phe], [2-(2-метоксифенил)-Phe], [2-(2-пиридил)-4-тиазолил-Ala], [2-(2-трифторметоксифенил)-dPhe], [2-(3-бром-2-пиридил)-Phe], [2-(3-метоксифенил)-Phe], [2-(3-пиридил)-4-тиазолил-Ala], [2-(3-пиридил)-Phe], [2-(3-хинолинил)-Phe], [2-(4-метоксифенил)-Phe], [2-(4-пиридил)-4-тиазолил-Ala], [2-(4-пиридил)-Phe], [2-(4-хинолинил)-Phe], [2-(5-хинолинил)-Phe], [2-(5-хинолинил)-MePhe], [2-(5-хинолинил)-Phe], [2-(5-хинолинил)-Phe]-восстановленный, [2-(аминобензил)-4-тиазолил-Ala], [2-(бензотиазол-5-ил)-Phe], [2-[2,5-бис(трифторметил) фенил]-Phe], [2-[3-(1-пиперазинил)фенил]-Phe]-бетагомоLys, [2-[4-(1-пиперазинил)фенил]-Phe], [2-йод-Phe], [3-(2,6-диметоксифенил)-dPhe], [3-(2,6-диметоксифенил)-Phe], [3-(2,6-диметилфенил)-Phe], [3-(2-аминобензил-4-тиазолил)-Ala], [3-(2-хлор-6-метоксифенил)-Phe], [3-(2-метоксифенил)-dPhe], [3-(2-метоксифенил)-Phe], [3-(2-тиенил)-dAla, [3-(2-трифторметоксифенил)-Phe], [3-(2-трифторметоксифенил)-Phe], [3-(3,4-дифторфенил)-Phe], [3-(3'-пиридил)-Ala], [3-(4-хинолинил)-dPhe], [3-(4-тиазолил)-Ala], [3-(4-тиазолил)-Ala]-восстановленный, [3-(4-тиазолил)-dAla], [3-(5-хинолинил)-dPhe], [3-(бензотиазол-5-ил)-Phe], [3-(хинолин-4-ил)-Phe], [3-аминометил-(4-метилпиразол-3-ил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2,5-диметоксифенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2,5-диметил-изоксазол)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2-аминометилфенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2-фторпиридил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-аминометилфенил) бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-азафенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-CF3-фенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-N,N-диметиланилин)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-N,N-диметилдиариловый эфир)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-хинолинил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-тиофенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-аминометилфенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-азафенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-карбокси)-фенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-гидроксифенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-N,N-диметилкарбоксамидфенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-пиридил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-хинолинил)]-бензойную кислоту, [3-аминометил-4-(5-пиримидинил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(5-хинолинил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(N,N-диметил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(пиперонил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[(2,3,4-триметокси)-фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[2-(1-пиперазинил)фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[2-(3-(пиперидин-4-илметокси)) фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[3-(1-пиперазинил)фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[4-(1 -пиперазинил)фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[4-(1 -пиперазинил)-фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[4-(1-пиперазинил-4-AlexaFluor 647)фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[4-(1-пиперазинил-4-FITC) фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[5-(2,4-диметил)тиазол]-бензойную кислоту], [3-аминометил-5-(4-азафенил)-бензойную кислоту], [4-(2,6-диметилфенил)-Phe], [4-(2-хлор-6-метоксифенил)-Phe], [4-(2-метоксифенил)-Phe], [4-(2-трифторметоксифенил)-Phe], [N-метил-3-аминометил-4-(4-хинолинил)-бензойную кислоту], 1Nal, 2lgl, 2Nal, Aic, альфаМеPhe, Atc, бетагомоLys, бетаhomoMet, бетаНоmоPhe, Bip, Cha, Chg, циклоLeu, d2lgl, Dap(Cbz), dArg, dгомоPhe, dLys, dMet, dNle, dOrn, dOrn(диметил), dPip, dPro, dSer(OBn), dTic, dTiq, dTrp, dTyr, dTyr(ОАллил), dTyr(OBn), F, H, His(Bn), гомоPhe, Hyp, Hyp(OBn), Igl, K, M, MeMet, MePhe, метаY(Opr), MeTyr, Nva, Orn(ацетамид), Orn(бензамид), Orn(этилкарбамат), Orn(метансульфонамид), Orn(пентиламид), Р, Phe-восстановленный, Pip, R, Tic, Tyr(2-метоксидиариловый эфир), Tyr(2-толилдиариловый эфир), Tyr(3,4-дифтордиариловый эфир), Tyr(3,4-диметилдиариловый эфир), Tyr(3-CO2Me диариловый эфир), Tyr(3-фтордиариловый эфир), Tyr(3-метоксидиариловый эфир), Tyr(3-метилдиариловый эфир), Tyr(4-CF3 диариловый эфир), Tyr(4-CO2H диариловый эфир), Tyr(4-CO2Me диариловый эфир), Tyr(4-фтордиариловый эфир), Tyr(4-метоксидиариловый эфир), Tyr(ОАллил), Tyr(OPh), W или Y.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X^z представляет собой dThr, Р, dPro, Sar, циклоLeu, dLys, dArg, dSer, Pip, dTic, dPip, Hyp, dHyp, (цис-dHyp), dMeLys, dNle, dMeArg, G, A, dAla, dVal, dPro, Aze, бетагомоPro, 2Abz, бетагомоIlе, dбетагомоPro, бетагомоNle, MeбетагомоLys(Me)2, (3-аминометил-4-бромбензойную кислоту), [3-аминометил-4-(4-азафенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2,5-диметилизоксазол)-бензойную кислоту] или [3-аминометил-4-(3-аминометилфенил)-бензойную кислоту].

В некоторых вариантах осуществления изобретения X^z не является бетагомоLys.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X^z не является бета-аминокислотой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное соединение включает в себя 21-членное кольцо.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное соединение представляет собой любое из соединений 1-19.

В одном аспекте, предложен мультимер, содержащий множество соединений, описанных в данном документе, ковалентно связанных друг с другом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультимера все из множества соединений являются идентичными.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, мультимер представляет собой димер.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, мультимер представляет собой тример.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, мультимер представляет собой тетрамер.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, мультимер представляет собой пентамер.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультимера, соединения связаны линкером.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультимера, соединения связаны друг с другом при углероде, связанном с R⁴, R⁵/R⁶ или Х^у.

В одном аспекте, предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение или мультимер, описанные в данном документе, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Термин «фармацевтически приемлемая соль», используемый в данном документе, представляет собой соли или цвиттерионные формы соединений по данному изобретению, которые растворимы или диспергируемы в воде или масле и которые подходят для лечения заболеваний, не вызывая чрезмерную токсичность, раздражение и аллергический ответ; которые соразмерны с разумным соотношением выгод/рисков и эффективны для их предполагаемого использования. Соли могут быть получены в процессе окончательного выделения и очистки соединений или отдельно посредством обработки аминогруппы подходящей кислотой. Типичные кислотно-аддитивные соли включают в себя: ацетат, адипат, альгинат, цитрат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, диглюконат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, формиат, фумарат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат (изетионат), лактат, малеат, мезитиленсульфонат, метансульфонат, нафтиленсульфонат, никотинат, 2-нафталенсульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, трихлорацетат, трифторацетат, фосфатат, глутамат, бикарбонат, пара-толуолсульфонат и ундеканоат. Кроме того, аминогруппы в соединениях по данному изобретению могут быть кватернизованы метилом, этилом, пропилом и бутилхлоридами, бромидами и йодидами; диметилом, диэтилом, дибутилом и диамилсульфатами; децилом, лаурилом, миристилом и стерилхлоридами, бромидами и йодидами; а также бензилом и фенетилбромидами. Примеры кислот, которые могут быть использованы для образования терапевтически приемлемых солей присоединения, включают в себя неорганические кислоты, например, соляную, бромистоводородную, серную и фосфорную, и органические кислоты, например, щавелевую, малеиновую, янтарную и лимонную. В определенных вариантах осуществления изобретения любое из пептидных соединений, описанных в данном документе, представляет собой солевые формы, например, ацетатные соли.

Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и аналогичные агенты, которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают в себя один или большее количество из: воды, солевого раствора, физиологического раствора с фосфатным буфером, декстрозы, глицерина, этанола и аналогичных носителей, а также комбинации вышеуказанных. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, например, маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно включать в себя незначительные количества вспомогательных веществ, например, смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность фармакологического агента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция составлена для пероральной доставки, доставки при местном нанесении или парентеральной доставки.

В одном аспекте, предложен способ лечения воспаления или аутоиммунного заболевания у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, воспаление или аутоиммунное заболевание является желудочно-кишечным.

В одном аспекте, предложен способ лечения состояния у пациента, связанного с биологической функцией интегрина α4β7, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное состояние или заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (IBD), язвенный колит, болезнь Крона, целиакию (нетропическую спру), энтеропатию, связанную с серо негативны ми артропатиями, микроскопический колит, коллагенозный колит, эозинофильный гастроэнтерит, колит, связанный с лучевой терапией или химиотерапией, паучит, возникающий после проктоколэктомии и илеоанального анастомоза, рак желудочно-кишечного тракта, панкреатит, инсулинозависимый сахарный диабет, мастит, холецистит, холангит, перихолангит, хронический бронхит, хронический синусит, астму, первичный склерозирующий холангит, заражение вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) в желудочно-кишечном тракте, эозинофильную астму, эозинофильный эзофагит, гастрит, колит, микроскопический колит, болезнь «трансплантат против хозяина», колит, связанный с радио- или химиотерапией, колит, связанный с нарушениями врожденного иммунитета, например, дефицитом адгезии лейкоцитов-1, хроническую гранулематозную болезнь, болезнь накопления гликогена типа 1b, синдром Херманского-Пудлака, синдром Чедиака-Хигаши, синдром Вискотта-Олдрича, различные формы рака желудочно-кишечного тракта, остеопороз, артрит, рассеянный склероз, хроническую боль, набор лишнего веса или депрессию.

Предпочтительно, указанное состояние представляет собой воспалительное заболевание кишечника, более предпочтительно, язвенный колит или болезнь Крона.

В одном аспекте, предложен способ лечения заболевания или состояния у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе, при этом указанное заболевание или состояние представляет собой локальное или системное заражение вирусом или ретровирусом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, вирус или ретровирус представляет собой эховирус 1 и 8, эховирус 9/штамм Барти, вирусы папилломы человека, хантавирусы, ротавирусы, аденовирусы, вирус ящура, вирус Коксаки А9, пареховирус человека 1 или вирус иммунодефицита человека 1 типа.

В одном аспекте, предложен способ лечения заболевания или состояния у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе, при этом заболевание или состояние представляет собой гепатит А, В или С, печеночную энцефалопатию, неалкогольный стеатогепатит, цирроз печени, варикозное кровотечение, гемохроматоз, болезнь Вильсона, тирозинемию, дефицит альфа-1-антитрипсина, гепатоклеточную карциному, рак печени, первичный билиарный холангит, первичный склероз жёлчных путей, болезнь жёлчных протоков или аутоиммунный гепатит.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное соединение ингибирует связывание интегрина α4β7 с MAdCAM.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное соединение селективно ингибирует связывание интегрина α4β7 с MAdCAM.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пациентом является человек.

В других аспектах предложено применение описанных в данном документе соединений или мультимеров для лечения или профилактики заболеваний и состояний, указанных выше.

В других аспектах предложено применение описанных в данном документе соединений или мультимеров для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и состояний, указанных выше.

В других аспектах предложены описанные в данном документе соединения или мультимеры для использования при лечении или профилактике заболеваний и состояний, указанных выше.

Используемые в данном документе термины «заболевание», «расстройство» и «состояние» могут быть использованы взаимозаменяемо.

Используемые в данном документе термины «ингибирование», «средство для лечения», «лечение» и «улучшение» используются взаимозаменяемо и относятся, например, к застою симптомов, увеличению продолжительности жизни, частичному или полному ослаблению симптомов и частичному или полному устранению состояния, заболевания или расстройства у субъекта, например, млекопитающего.

Используемый в данном документе термин «предотвращать» или «профилактика» включает в себя (i) профилактику или приостановку заболевания, поражения или состояния у субъекта, например млекопитающего, в частности, когда такой субъект предрасположен к состоянию, но еще не было диагностировано, что оно имеется у субъекта; или (ii) снижение вероятности возникновения заболевания, поражения или состояния у субъекта.

Используемый в данном документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение определенного периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество фармакологического агента может варьироваться в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также способность фармакологического агента вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любое токсическое или вредное действие фармакологического агента перевешивается терапевтически полезным действием.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, соединение вводят в форме введения, выбранной из группы, состоящей из перорального, внутривенного, перитонеального, внутри кожного, подкожного, внутримышечного, интратекального, ингаляционного, вапоризационного, распылительного, сублингвального, буккального, парентерального, ректального, вагинального и наружного введения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение вводят в виде начальной дозы, за которой следуют одна или большее количество последующих доз, причем минимальный интервал между любыми двумя дозами представляет собой период, составляющий менее 1 дня, и при этом каждая из доз содержит эффективное количество соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, эффективное количество соединения представляет собой количество, достаточное для достижения по меньшей мере одного из следующего, выбранного из группы, состоящей из: а) насыщения сайтов связывания MAdCAM на молекулах интегрина α4β7 приблизительно на 50% или более; b) ингибирования экспрессии интегрина α4β7 на клеточной поверхности приблизительно на 50% или более; и с) насыщения сайтов связывания MAdCAM на молекулах α4β7 приблизительно на 50% или более и ингибирования экспрессии интегрина α4β7 на клеточной поверхности приблизительно на 50% или более, при этом i) насыщение сохраняется в течение периода, соответствующего частоте введения дозы, составляющей не более двух раз в день; ii) ингибирование сохраняется в течение периода, соответствующего частоте введения дозы, составляющей не более двух раз в день; или iii) насыщение и ингибирование, каждое, сохраняется в течение периода, соответствующего частоте введения дозы, составляющей не более двух раз в день.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, соединение вводят с интервалом, выбранным из группы, состоящей из: круглосуточного, ежечасного, каждые четыре часа, один раз в день, два раза в день, три раза в день, четыре раза в день, через день, еженедельного, раз в две недели и ежемесячного введения.

Предполагается, что приведенное выше описание вариантов осуществления изобретения также включает в себя любые и все комбинации различных вариантов осуществления изобретения. Преимущества данного изобретения дополнительно иллюстрируются приведенными ниже примерами. Приведенные в данном документе примеры и их конкретные подробности представлены только для иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничение формулы данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Способы и материалы

Общий синтез

Приведенные ниже примеры протоколов были использованы для синтеза каждого из соединений, описанных в данном документе. На схеме 1 изображен путь общего синтеза для получения соединения 8.

Синтез связанного со смолой линейного пептида А

К смеси, содержащей 2-хлортритильную смолу (0,1 ммоль, загрузка = 1,0 ммоль/г, 0,1 г) и Fmoc-Ala-OH (3 экв.), по каплям добавили DCM (10 мл), а затем DIEA (4,0 экв.). Смолу осторожно перемешивали в течение 1,5 часов. Добавили МеОН (0,1 мл), чтобы закрыть все оставшиеся реакционноспособные 2-хлортритильные группы, и смолу осторожно перемешивали в течение 30 минут, а затем слили. Fmoc-защищенную пептидную смолу обрабатывали 20% пиперидином в DMF в течение 30 минут. После удаления защитной группы Fmoc смолу слили и промыли DMF (5×5 мл). Стандартное твердофазное пептидное химическое вещество Fmoc использовали для установки Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-ОН и Fmoc-Leu-OH с использованием аминокислоты Fmoc (3 экв.), HATU (2,85 экв.) и DIPEA. (3 экв.) в DMF (1 мл) в течение 1 часа. Реакции сочетания контролировали посредством цветной реакции с нингидрином. Смолу обрабатывали Fmoc-3-аминометил-4-бромбензойной кислотой (1,5 экв., приготовленной в соответствии с РСТ № РСТ/СА 2016/000274), HATU (1,5 экв.) И DIPEA (3 экв.) в DMF (300 мл) в течение 1 часа. Fmoc-защищенную пептидную смолу обрабатывали 20% пиперидином в DMF в течение 30 минут. После удаления защитной группы Fmoc смолу слили и промыли DMF (5×5 мл). Для установки Fmoc-Pro-OH использовали стандартное твердофазное пептидное химическое вещество Fmoc с использованием аминокислоты Fmoc (3 экв.), HATU (2,85 экв.) и DIPEA (3 экв.) в DMF (1 мл) в течение 1 часа. После реакции сочетания смолу промыли DMF (5×100 мл). Fmoc-защищенную пептидную смолу обрабатывали 20% пиперидином в DMF в течение 30 минут. После удаления защитной группы Fmoc смолу слили и промыли DMF (5×5 мл). После последней стадии смолу промыли МеОН (3×100 мл) и высушили в вакууме.

Отщепление линейного пептида А от смолы

Пептидную смолу (10 г) обрабатывали коктейлем для расщепления (20% HFIP/80%DCM, 1 л) в течение 0,5 часа при осторожном перемешивании. Коктейль для расщепления собрали в колбу Эрленмейера объёмом 3 л. Смолу снова обрабатывали коктейлем для расщепления (20%HFIP/80%DCM, 1 л) в течение 0,5 часа при осторожном перемешивании. Коктейль для расщепления собрали в ту же колбу Эрленмейера объёмом 3 л. Объединенный раствор коктейля для расщепления концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить неочищенный линейный пептид А (4,5 г).

Циклизация

Сырой линейный пептид А (4,5 г) растворили в DCM (5 л) и обработали DIEA (4 экв.) И HATU (2 экв.). Смесь перемешивали в течение 0,5 часа при комнатной температуре. Конверсию линейного пептида контролировали методом ЖХМС. Летучие вещества концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить неочищенный циклический пептид, соединение А (5 г).

Реакция перекрестного сочетания Сузуки

Пять реакций были проведены параллельно. Смесь неочищенного соединения А (1 г 1,2 ммоль) и сложного эфира пинакола 4-(4-Вос-пиперазино)фенилбороновой кислоты (931 мг, 2,4 ммоль) объединили в сосуде микроволнового реактора и растворили в 1,2-диметоксиэтане (5,4 мл) и этаноле (1,2 мл) при комнатной температуре. К раствору добавили воду (1,2 мл), а затем Na₂CO₃ (254 мг, 2,4 ммоль). Реакционную колбу продували в течение 5-10 минут газообразным азотом и загрузили Pd(P(Ph)3)4 (277 мг, 0,24 ммоль). Пробирку закупорили и нагревали при 120°С в течение 10 мин в микроволновой печи. ЖХ-МС показала полное израсходование циклического пептида и один главный пик с желаемым m/z. Реакционную смесь отфильтровали через целитовую прокладку для удаления Pd(Р(Ph)₃)₄. Целитовую прокладку промыли THF, а растворители удалили в вакууме для получения сырого твердого вещества бледно-желтого цвета, соединения В

Гповальное снятие защиты

Неочищенное соединение В, полностью защищенное боковой цепью, обработали буфером для расщепления объемом 500 мл (TFA:DCM = 1:1) и перемешивали в течение 1 часа. Летучие вещества концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 8 (7 г) с полностью снятой защитой.

Очистка

Сырое соединение 8 подвергли препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в H₂O; В: ACN) с получением соли TFA очищенного циклического пептида. Второй обработкой препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (А: 1 ммоль/л NH₄HCO₃ в Н₂О; В: ACN) удалили все следы остаточной TFA и после лиофилизации получили «бессолевую» форму соединения 8 (800 мг) в виде белого твердого вещества.

Димеризация соединения 8: синтез соединения 16

Раствор дифеновой кислоты (12,1 мг, 0,05 ммоль, 1,0 экв) в безводном THF (1 мл) обработали оксалилхлоридом (10 мкл), а затем DMF (5 мкл). Полученную суспензию перемешивали при 25°С и она стала желтым раствором в течение 1 часа. Летучие вещества удалили, промыв колбу аргоном. Полученное желтое твердое вещество растворили в безводном DCM (3 мл) и обработали соединением 8 (95 мг, 0,12 ммоль, 2,4 экв; бессолевая форма). К смеси по каплям добавили DIPEA (1,6 мл, 1,25 ммоль, 25,0 экв.). Реакцию контролировали методом ЖХ-МС. Через 30 минут летучие вещества удалили в вакууме, а неочищенный материал очистили методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в Н₂О, В: ACN). Соединение 16 выделили в виде белого твердого вещества (9,4 мг).

Димеризация соединения 8: синтез соединения 18

Суспензию соединения 8 (120 мг, 0,13 ммоль, 2,7 экв; бессолевая форма), 1,3-бис(бромметил)бензол (12,8 мг, 0,05 ммоль, 1 экв) и DIPEA (0,1 мл) в ACN (1 мл) перемешивали при 25°С в течение 1 часа. Летучие вещества удалили в вакууме, а неочищенный материал очистили методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в Н₂О, В: ACN). Соединение 18 выделили в виде белого твердого вещества (4,2 мг).

Анализ конкурентного связывания ELISA интегрина α4β7 с MAdCAM-1

Ha 96-луночный планшет Microlon (Greiner, 655001) нанесли 100 мкл на лунку раствора 1 мкг/мл рекомбинантного интегрина α4β7 (R&D Systems, 5397-А3-050) в карбонатном буфере (50 мМ, рН 9,6). Планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. Раствор удалили и в каждую лунку добавили 250 мкл блокирующего буфера (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 1% BSA, 0,05% Tween). 3атем планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет трижды промыли промывочным буфером (50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 0,05% Tween). В каждую лунку добавили 50 мкл соединения, разведенного в аналитическом буфере, посредством переноса из планшета для серийного разведения соединения. В каждую лунку добавили 50 мкл рекомбинантного MAdCAM-Fc (R&D systems, 6056-МС-050) в концентрации 0,1 мкг/мл в аналитическом буфере (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 0,1% BSA, 0,05% Tween). Планшет инкубировали при комнатной температуре при встряхивании (300 об/мин) в течение 2 часов до достижения равновесия связывания. 3атем планшет трижды промыли в промывочном буфере и в каждую лунку добавили 100 мкл специфического к HRP человеческого антитела IgG Fc (Abcam, Ab97225), разведенного в аналитическом буфере в соотношении 1:2000. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании. 3атем планшет трижды промыли и после этого в каждую лунку добавили 100 мкл 1,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ, KPL 5120-0083). Реакцию остановили через 2 минуты инкубации посредством добавления 50 мкл 1М H₂SO₄ и считали оптическую спектральную поглощательную способность при 450 нМ.

Анализ конкурентного связывания ELISA интегрина α4β1 с VCAM-1

На 96-луночный планшет Microlon (Greiner, 655001) нанесли 100 мкл на лунку раствора 0,5 мкг/мл рекомбинантного интегрина α4β1 (R&D Systems, 5397-А3-050) в карбонатном буфере (50 мМ, рН 9,6). Планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. Раствор удалили и в каждую лунку добавили 250 мкл блокирующего буфера (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 1% BSA, 0,05% Tween). 3атем планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет трижды промыли промывочным буфером (50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 0,05% Tween). В каждую лунку добавили 50 мкл соединения, разведенного в аналитическом буфере, посредством переноса из планшета для серийного разведения соединения. В каждую лунку добавили 50 мкл рекомбинантного VCAM-Fc (R&D systems, 862-VC-100) в концентрации 0,1 мкг/мл в аналитическом буфере (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 0,1% BSA, 0,05% Tween). Планшет инкубировали при комнатной температуре при встряхивании (300 об/мин) в течение 2 часов до достижения равновесия связывания. 3атем планшет трижды промыли в промывочном буфере и в каждую лунку добавили 100 мкл специфического к HRP человеческого антитела IgG Fc (Abcam, Ab97225), разведенного в аналитическом буфере в соотношении 1:2000. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании. 3атем планшет трижды промыли и после этого в каждую лунку добавили 100 мкл 1,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ, (ТМВ, KPL 5120-0083). Реакцию остановили через 2 минуты инкубации посредством добавления 50 мкл 1М H₂SO₄ и считали оптическую спектральную поглощательную способность при 450 нМ.

Исследование адгезии интегрина α4β7 с клетками человека MAdCAM

Клетки человека RPMI8866 (Sigma №95041316) культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone SH30027.1), дополненной 10% FBS (Seradigm) и 1% пенициллин-стрептомицином. На 96-луночный планшет (Costar, 3603) нанесли 100 мкл/лунку раствора человеческого рекомбинантного MAdCAM-1 Fc Chimera (R&D Systems, 6056-MC-050) при 0,25 мкг/мл в покрывающем буфере (50 мМ карбоната натрия, рН 9,6). Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С и дважды промыли с использованием 150 мкл на лунку промывочного буфера (0,05% Tween 20 в PBS), блокировали с использованием 250 мкл на лунку блокирующего буфера (1% обезжиренного сухого молока в PBS) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. RPMI8866 клетки ресуспендировали при 10 миллионах клеток/мл в PBS, содержащем 5 мМ кальцеина и инкубировали при 37°С в течение 30 мин в 50 мл пробирке. Для наполнения пробирки добавили PBS, клетки отцентрифугировали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 до 2 млн/мл. Соединения разбавили посредством серийного разведения в буфере для связывания (1,5 мМ CaCl₂, 0,5 мМ MnCl₂, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5) до конечного объема, составляющего 50 мкл на лунку при 2х концентрации. Планшет промыли один раз 300 мкл PBS, 50 мкл соединения и 50 мкл клеток (100000 клеток) были перемещены в каждую лунку и планшет инкубировали в темноте при 37°С, 5% CO₂ в течение 45 минут, чтобы обеспечить адгезию клеток. Планшет опорожнили посредством переворачивания и промокания бумажными полотенцами и дважды промыли вручную с использованием PBS. 3атем в каждую лунку добавили 100 мкл PBS. Флуоресценцию считывали (Ex₄₉₅/Em₅₁₅) с использованием планшет-ридера (Tecan Infinite 1000). Чтобы рассчитать реакцию на дозу, значение флуоресценции контрольных лунок, не содержащих клеток, вычитали из каждой тестовой лунки.

Исследование адгезии интегрина α4β1 с клетками человека VCAM

Клетки человека RAMOS (АТСС CRL-1596) культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone SH30027.1), дополненной 10% FBS (Seradigm) и 1% пенициллин-стрептомицином. На 96-луночный планшет (Costar, 3603) нанесли 100 мкл/лунку раствора человеческого рекомбинантного VCAM-1 Fc Chimera (R&D Systems, 862-VC-100) при 0,25 мкг/мл в покрывающем буфере (50 мМ карбоната натрия, рН 9,6). Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С и дважды промыли с использованием 150 мкл на лунку промывочного буфера (0,05% Tween 20 в PBS), блокировали с использованием 250 мкл на лунку блокирующего буфера (1% обезжиренного сухого молока в PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. На стадии блокировки клетки RAMOS ресуспендировали при 10 миллионах клеток/мл в PBS, содержащем 5 мМ кальцеина и инкубировали при 37°С в течение 30 мин в 50 мл пробирке. Для наполнения пробирки добавили PBS, клетки отцентрифугировали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 до 2 млн/мл. Соединения разбавили посредством серийного разведения в буфере для связывания (1,5 мМ CaCl₂, 0,5 мМ MnCl₂, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5) до конечного объема, составляющего 50 мкл на лунку при 2х концентрации. Планшет промыли один раз 300 мкл PBS, 50 мкл соединения и 50 мкл клеток (100000 клеток) были перемещены в каждую лунку и планшет инкубировали в темноте при 37°С, 5% CO₂ в течение 45 минут, чтобы обеспечить адгезию клеток. Планшет опорожнили посредством переворачивания и промокания бумажными полотенцами и дважды промыли вручную с использованием PBS. После последней промывки в лунки добавили 100 мкл PBS и считывали флуоресценцию (Ex₄₉₅/Em₅₁₅) с использованием планшет-ридера (Tecan Infinite 1000). Чтобы рассчитать реакцию на дозу, значение флуоресценции контрольных лунок, не содержащих клеток, вычитали из каждой тестовой лунки.

Исследование адгезии интегрина α4β7 с мышиными клетками MAdCAM

Клеточные линии лимфомы Т-клеток мыши ТК-1 (АТСС CRL2396) культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone SH30027.1), дополненной 10% FBS (Seradigm) и 1% пенициллин-стрептомицином. На 96-луночный планшет (Costar, 3603) нанесли 100 мкл/лунку раствора мышиного рекомбинантного MAdCAM-1 Fc Chimera (R&D Systems, 993-MC-050) при 0,25 мкг/мл в покрывающем буфере (50 мМ карбоната натрия, рН 9,6). Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С и дважды промыли с использованием 150 мкл на лунку промывочного буфера (0,05% Tween 20 в PBS), блокировали с использованием 250 мкл на лунку блокирующего буфера (1 % обезжиренного сухого молока в PBS) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Клетки TK-1 ресуспендировали при 10 миллионах клеток/мл в PBS, содержащем 5 мМ кальцеина и инкубировали при 37°С в течение 30 мин в 50 мл пробирке. Добавили PBS для заполнения пробирки, клетки отцентрифугировали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 до 2 млн/мл. Соединения разбавили посредством серийного разведения в буфере для связывания (1,5 мМ CaCl₂, 0,5 мМ MnCl₂, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5) до конечного объема, составляющего 50 мкл на лунку при 2х концентрации. Планшет промыли один раз 300 мкл PBS, 50 мкл соединения и 50 мкл клеток (100000 клеток) были перемещены в каждую лунку и планшет инкубировали в темноте при 37°С, 5% С0₂ в течение 45 минут, чтобы обеспечить адгезию клеток. Планшет опорожнили посредством переворачивания и промокания бумажными полотенцами и дважды промыли вручную с использованием PBS. 3атем в каждую лунку добавили 100 мкл PBS. Флуоресценцию считывали (Ex₄₉₅/Em₅₁₅) с использованием планшет-ридера (Tecan Infinite 1000). Чтобы рассчитать реакцию на дозу, значение флуоресценции контрольных лунок, не содержащих клеток, вычитали из каждой тестовой лунки.

Анализ конкурентного связывания тестируемого аналита первичных CD4+ Т-клеток памяти человека с α₄+B₇-neqative интегрином

3анятость рецепторов (RO) в первичных клетках определили посредством измерения количества биотинилированного человеческого рекомбинантного MAdCAM-1-FC или человеческого рекомбинантного VCAM-1-Fc, связанного с выбранными популяциями клеток, с использованием проточной цитометрии. Человеческий рекомбинантный MAdCAM-1-FC или человеческий рекомбинантный VCAM-1-FC (R&D systems) биотинилировали с использованием коммерчески доступных реагентов и протокола (Pierce).

Цельную кровь собрали от доноров-людей в натриевые гепариновые пробирки. Кровь объемом 100 мкл инкубировали с соединением и 4 мМ MnCl₂ в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки дважды промыли 1 мл 1XDPBS свободного кальция-магния (CMF) (ThermoFisher Scientific) и ресуспендировали в 100 мкл DPBS CMF.

Биотинилированный человеческий рекомбинантный MAdCAM-1-Fc или VCAM-1-Fc добавили в насыщающей концентрации и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. 3атем добавили 2 мл 1XBD FACS Lyse (BD Biosciences) и смесь инкубировали в течение 8-12 минут при комнатной температуре в темноте для лизиса эритроцитов. Клетки промыли 1 мл окрашивающего буфера FBS (BD Biosciences) и ресуспендировали в 100 мкл окрашивающего буфера FBS (BD Biosciences), содержащего 4 мМ MnCl₂. Биотинилированный rhMAdCAM-1 нанесли в насыщающей концентрации, составляющей 1200 нг/мл, чтобы конкурировать со связыванием испытуемого препарата, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. 3атем клетки промыли 1 мл окрашивающего буфера FBS и ресуспендировали в 100 мкл окрашивающего буфера FBS. Клетки инкубировали в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре с 1 мкл стрептавидина АРС (BioLegend 0,2 мг/мл) и панелью антител для обнаружения Т-хелперов памяти a4b7-позитивных клеток подмножества. И каждое из следующих ниже антител были использованы в количестве 5,0 мкл; CD45 FITC (BioLegend 200 мкг/мл), CD29 АРС Су7 (BioLegend 100 мкг/мл), интегрин бета7 РЕ, (BioLegend в концентрации 50 мкг/мл), CD49d V421 (BioLegend 50 мкг/мл), CD3 V510 (BioLegend 30 мкг/мл), CD4 РЕСу7 (BioLegend 100 мкг/мл), CD45RO PerCP, BioLegend 200 мкг/мл). 3атем клетки промыли окрашивающим буфером FBS и ресуспендировали в 150 мкл окрашивающего буфера FBS для определения на проточном цитометре (проточный цитометр BD FACSCanto™ и программное обеспечение BDFACSDiva™). Данные FACS были получены методом электронного стробирования на основе прямого и бокового рассеяния. Цитометр был настроен на сбор 20000 событий в каждой пробирке. Клеточная популяция была определена с использованием следующих ниже маркеров, CD45+, CD3+, CD4+, CD45RO+, CD49d+, интегрина β7, биотинилированных лигандов.

Соединение RO определили как уменьшение числа клеток интегрина β₇+ или интегрина связывающих биотинилированные rhMAdCAM-1 или rhVCAM-1, соответственно.

3анятость рецепторов рассчитывали по следующему уравнению: 100-((% лиганд-позитивных клеток с соединением/% лиганд-позитивных клеток ДМСО)*100). Лиганды и соединения не конкурируют за антитела к интегрину и препятствуют обнаружению α4β7 положительных Т-клеток памяти.

Результаты и обсуждение результатов

Соединения, представленные на Фиг. 1-5, были синтезированы в соответствии с указанными выше способами. Выбор соединений был охарактеризован с использованием ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ЯМР (данные не показаны). В некоторых случаях соединения, выделенные из синтеза и очистки первого поколения (партия 1), давали множественные пики на хроматограмме ВЭЖХ. В некоторых из этих случаев был проведен синтез и очистка второго и/или третьего поколения, в результате чего были получены материалы партии 2 и/или партии 3, которые демонстрировали по существу одинарные пики на хроматограммах ВЭЖХ. Обозначения партии 1, партии 2 и партии 3 были отмечены в данных ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ЯМР (не показаны).

Анализы конкурентного связывания

Результаты по соединениям для двух анализов конкурентого связывания лигандов (MAdCAM-1/α4β7 и VCAM-1/α4β1) показаны в таблице 1.

Анализы конкурентного связывания клеточной адгезии

Результаты по соединениям в анализах конкурентного связывания клеточной адгезии RPMI8866, RAMOS и ТК-1 показаны в таблицах 1 и 2.

3анятость рецепторов

Результаты исследований соединений в анализах смещения лиганда цельной крови показаны в таблицах 1 и 3.

Связывающая аффинность и селективность соединений для интегрина α4β7 и α4β1

Мы измерили эффективность связывания мономерных и димерных соединений с интегрином α4β7 с использованием ряда биохимических, клеточных и ex vivo анализов. Мультимерные соединения были, в целом, более эффективны в биохимических и клеточных анализах по сравнению с составляющими их мономерами.

Мы измерили способность испытуемых препаратов предотвращать адгезию клеток RPMI8866, которые экспрессируют человеческий интегрин α4β7, с пластинками, покрытыми MAdCAM-1. Мультимерные соединения обладали, в целом, большей способностью ингибировать клеточную адгезию, чем составляющие их мономеры. Например, соединение №16 и соединение №8 имели значения IC₅₀, составляющие ~ 6 нМ и ~ 202 нМ, соответственно, в сопоставимых анализах на адгезию клеток RPMI8866 (Фиг. 6; таблицы 1 и 2). Мультимерные соединения, в целом, были также более селективными, чем составляющие их мономеры, в их способности ингибировать адгезию для клеток, экспрессирующих интегрин α4β7 (RPMI8866), по сравнению с клетками, экспрессирующими человеческий интегрин α4β1 (RAMOS; Фиг. 7; таблицы 1 и 2). Например, мультимерное соединение №16 ингибировало адгезию в клетках RPMI8866 со значением IC₅₀,

составляющим ~ 6 нМ и ингибировало адгезию в клетках RAMOS со значением IC₅₀, составляющим ~ 21 нМ (различие между анализами в 3,5 раза в пользу интегрина α4β7), при этом мономерное соединение №8 ингибировало адгезию в клетках RPMI8866 со значением IC₅₀, составляющим ~ 202 нМ и ингибировало адгезию в клетках RAMOS со значением IC₅₀, составляющим ~ 451 нМ (различие между анализами в 2,2 раза в пользу интегрина α4β7). Взятая в совокупности, мультимеризация мономера привела к усиленному ингибированию клеточной адгезии, а также к повышенной селективности в ингибировании клеточной адгезии в пользу интегрина α4β7 по сравнению с интегрином α4β1.

Интересно, что различия в сродстве связывания между мономерными и мультимерными соединениями не были такими выраженными в анализе связывания ELISA α4β7. Например, мономерное соединение №8 для ELISA α4β7 показало значение IC₅₀ ~ 24 нМ, при этом димерное соединение №16 для ELISA α4β7 показало значение IC₅₀ ~ 8 нМ (таблица 1). Возможно, что авидность увеличивает эффективность связывания мультимерных соединений в клетках.

Аналогичные результаты были получены в анализе конкурентного связывания лигандов с интегрином α4β7 в цельной крови человека (таблицы 1 и 3). 3анятость рецепторов соединениями определили посредством измерения доли α4β7+ Т-хелперных клеток памяти, способных связывать биотинилированный rhMAdCAM-1, с использованием проточной цитометрии. Мультимерные соединения были способны конкурировать с MAdCAM-1 на α4β7-позитивных первичных клетках с большей активностью, чем мономерные соединения. Было показано, что мультимеры, содержащие различные линкеры, конкурируют более эффективно, чем составляющий их мономер. Например, димерные соединения №№ 16, 18 и 19 показали значения IC₅₀ ~ 6, ~ 25 и ~ 260 нМ, при этом для соответствующего исходного мономерного соединения №8 была получена относительно слабая кривая концентрация-отклик (Фиг. 8; таблица 3). Это может быть результатом неспецифического связывания мономерного соединения с клеткой.

3анятость рецепторов, измеренная методом анализируемого «анализа конкурентного связывания» в первичных Т-клетках памяти CD4+ с интегрином человека, выявила мультимерные соединения, обладающие значительной активностью и способствующие селективности α4β7 по сравнению с α4β1, в цельной крови. Мономерное соединение №8 продемонстрировало относительно слабую RO на α4β7 (IC₅₀ > 4 мкМ) (Фиг. 8; таблицы 1 и 3) и отсутствие селективности по сравнению с α4β1. Аналогичные профили были зарегистрированы для мономерных соединений №№ 11 и 14. Напротив, мультимерное соединение №16, в частности, продемонстрировало сильную селективность α4β7 RO (IC₅₀ ~ 6 нМ) и сильную (~ 11-кратную разницу в IC₅₀ между анализами) селективность по сравнению с α4β1 (Фиг. 9; таблицы 1 и 3). Мультимерные соединения №№ 18 и 19 также продемонстрировали субмикромолярные α4β7 RO IC₅₀ значения, а также селективность по сравнению с α4β1.

Для оценки адгезии в клетках мыши, для сравнения с клетками человека, мы использовали мышиную клеточную линию ТК-1, которая экспрессирует мышиный интегрин α4β7 (таблица 1). Мономерное соединение № 8 продемонстрировало ~ 10-кратное различие в IC₅₀ между адгезией мышиных клеток, содержащих α4β7 (более слабая адгезия), и адгезией человеческих клеток, содержащих α4β7 (более сильная адгезия). Мультимерные соединения, в целом, демонстрируют более низкие расхождения между адгезией клеток мыши и человека по сравнению с мономерным соединением №8. Например, мультимерные соединения №№ 16, 17 и 18 продемонстрировали значения IC₅₀, составляющие ~ 28, ~ 97 и ~ 68 нМ для адгезии мышиных клеток, содержащих α4β7, но значения IC₅₀, составляющие ~ 6, ~ 19 и ~ 8 нМ для адгезии человеческих клеток, содержащих α4β7. Одним из исключений является мультимерное соединение № 19, которое продемонстрировало значение IC₅₀, составляющее 1,883 мкМ для адгезии мышиных клеток, содержащих α4β7, но значение IC₅₀, составляющее ~ 25 нМ для адгезии человеческих клеток, содержащих α4β7.

Хотя предпочтительные варианты осуществления изобретения были описаны в данном документе, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в них могут быть внесены изменения, не отступая от сущности изобретения или объема прилагаемой формулы изобретения. Все документы, описанные в данном документе, в том числе в следующем ниже перечне ссылок, включены посредством ссылки.

Таблица 1

В таблице 1 показаны гомодетные соединения, проявляющие аффинность, селективность и/или активность в отношении интегрина α4β7.

^a Все значения IC₅₀ для α4β7 ELISA определены в первом периоде, если не указано иное

^b Все значения IC₅₀ для α4β1 ELISA определены в первом периоде, если не указано иное

^с Все значения IC₅₀ адгезии α4β7 с человеческими клетками RPMI8866 определены в первом периоде, если не указано иное

^d 3начения IC₅₀ для α4β7 ELISA определены во втором периоде

^е 3начения IC₅₀ для α4β1 ELISA определены во втором периоде

^f 3начения IC₅₀ адгезии α4β7 с человеческими клетками RPMI8866 определены во втором периоде