Результат интеллектуальной деятельности: Функциональная вода с пробиотиками

Настоящее изобретение относится к пробиотической, улучшающей здоровье питьевой воде, которая содержит смесь микроорганизмов-пробиотиков, и может быть использовано в пищевой промышленности, биотехнологии и медицине.

Пробиотики - это живые культуры микроорганизмов, поступающие с пищей, а также напитками (водой) и благотворно влияющие на организм человека путем нормализующего воздействия на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма человека через стабилизацию и оптимизацию функции его нормальной микрофлоры.

Функциональная вода с пробиотиками позволяет использовать пробиотические микроорганизмы людям с непереносимостью лактозы и людям, которые по разным причинам не хотят употреблять молочные продукты и продукты с высоким содержанием красителей, ароматизаторов и подсластителей. Функциональная вода с микроорганизмами, обладающая пробиотической активностью оказывает благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и (или) повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника.

Известна функциональная питьевая вода (патент РФ №2625677, МПК A23L 2/38, опубл. 18.07.2017 г.), содержащая янтарную кислоту, сухой водорастворимый экстракт листьев мелиссы, йодсодержащий препарат «Йодинол», артезианскую воду, (г/дм³): янтарная кислота - 0,5-1,0; сухой водорастворимый экстракт листьев мелиссы - 0,001-0,0015; йодинол (в пересчете на йод) - 0,001-0,0015; артезианская вода - остальное. Питьевая вода, приготовленная по данной рецептуре, не содержит дополнительных вкусо-ароматических добавок, а композиция биологически активных компонентов благотворно влияет на организм в целом.

Однако данная функциональная питьевая вода не обладает пробиотическими свойствами.

Наибольшее количество публикаций касается питьевой воды с пробиотическими добавками для сельскохозяйственных и домашних животных (заявка США №2015250832, опубл. 10.09.2015 г.; заявка Китая № CN 104611257, опубл. 13.05.2015 г.; Европейский патент № ЕР 2385765, опубл. 16.11.2011 г.; патент Республики Корея №101106302, опубл. 18.01.2012 г.). Например, известна пробиотическая иммуностимулирующая добавка к питьевой воде для животных, содержащая смесь пробиотических микроорганизмов, по меньшей мере два микроорганизма, выбранных из группы, состоящей из Enterococcus faecium, DSM 16211, Lactobacillus reuteri, DSM 16350, и Lactobacillus salivarius ssp.salivarius, DSM 16351, Pediococcus acidilactici, DSM 16210, и Bifidobacterium animalis, DSM 16284 (Патент США №8101170, МПК А23К 1/00, опубл. 24.01.2012 г. ).

Однако указанные питьевые средства с использованием пробиотических добавок в основном предназначены для животных. Кроме того, такие питьевые средства приготавливают непосредственно перед применением (выпаиванием животным) вследствие того, что готовая вода для питья с пробиотиками имеет малый срок хранения.

Известна функциональная питьевая вода для человека, которая снабжена пробиотическими микроорганизмами и другими веществами (витамины, минералы, красители, ароматизаторы), размещенными в отдельной герметичной упаковке в крышке емкости для воды (патент Словении № SL 23411 МПК A23L 2/00, опубл. 31.01.2012 г.).

В одной упаковке пробиотической воды содержится пробиотических микроорганизмов в количестве которое варьируется от 10² микроорганизмов на миллилитр воды до 10⁹ микроорганизмов на миллилитр воды. Функциональную питьевую воду приготавливают перед употреблением путем разрушения герметичной упаковки с пробиотиком и другими веществами и смешиванием содержимого с питьевой водой. После смешения пробиотических микроорганизмов и других компонентов содержимого крышки с питьевой водой питьевой продукт готов для приема внутрь.

Недостатком указанной пробиотической воды, как указано в описании к патенту-прототипу, является малый срок хранения напитка после смешивания пробиотиков с питьевой водой вследствие быстрого разрушения клеток микроорганизмов в водной среде и потеря их активности (титра). Кроме того, такой питьевой продукт не обладает профилактическим противовирусным действием при регулярном приеме и недостаточным профилактическим антибактериальным действием.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является пищевой продукт в жидкой форме с длительным сроком хранения, содержащий пробиотические организмы в состоянии покоя, выбранный из группы состоящей из молочных продуктов, обладающих сроком хранения в неохлажденном состоянии более 12 дней, фруктовых соков, обладающих периодом хранения в неохлажденном состоянии от 13 до 26 недель, и напитков, содержащих фруктовые соки и обладающих периодом хранения в неохлажденном состоянии, по меньшей мере, 3 месяца (патент РФ №2494645, МПК A23L 1/30, опубл. 10.10.2013 г.). Пробиотические микроорганизмы выбирают из группы, состоящей из грибов, дрожжей и бактерий, способных к спорообразованию, предпочтительно из В. subtilis. Пищевой продукт с длительным сроком хранения является молочным продуктом, обладающим сроком хранения в неохлажденном состоянии 12-24 месяцев. Указанный продукт содержит как пробиотические споры, так и клетки, где клетки по сути выбирают из группы, состоящей из жизнеспособных клеток, нежизнеспособных клеток и их смесей. Продукт содержит 10⁴-10¹⁰ КОЕ пробиотических спор на ежедневную порцию пищевого продукта, предпочтительно 10⁵-10¹⁰ КОЕ, более предпочтительно 10⁶-10¹⁰ КОЕ, наиболее предпочтительно 10⁶-10¹⁰ КОЕ. В жидком продукте ограничивают: один или несколько витаминов, необходимых для вегетативного роста пробиотического организма; одно или несколько минеральных веществ, необходимых для вегетативного роста пробиотика; одну или несколько аминокислот, необходимых для вегетативного роста пробиотика; один или несколько углеводов, необходимых для вегетативного роста пробиотика, а также ограничивают свет, необходимый для вегетативного роста пробиотика и подбирают pH, ограничивающий вегетативный рост пробиотика. В продукте присутствует консервант, который ограничивает вегетативный рост пробиотика. Для обеспечения длительного хранения продукт подвергается обработке пастеризацией для длительного хранения, конкретно подвергается HHST или UHT- пастеризации. Продукт состоит из молочных продуктов, обладающих сроком хранения в неохлажденном состоянии более 12 дней, фруктовых соков, обладающих периодом хранения в неохлажденном состоянии от 13 до 26 недель, и напитков, содержащих фруктовые соки и обладающих периодом хранения в неохлажденном состоянии, по меньшей мере, 3 месяца.

Однако длительный срок хранения такого жидкого продукта-прототипа обеспечивается только за счет стерилизации и добавления химических консервантов.

Техническим результатом заявляемого технического решения является обеспечение возможности значительного увеличения срока хранения функциональной воды с пробиотиками до двух лет с длительным сохранением активности пробиотиков после смешения с водой за счет использования пробиотических бактерий в споровой форме и содержания в ней водорастворимых веществ, которые стимулируют спорообразование пробиотических бактерий рода Bacillus и ингибируют прорастание их спор.

Указанный технический результат достигается тем, что функциональная вода с пробиотиками, содержащая пробиотические бактерии рода Bacillus в споровой форме в состоянии покоя с титром 1×10²-1×10⁵ КОЕ/мл, а также витамины, минеральные вещества, аминокислоты и питьевую воду, согласно изобретения, пробиотики содержатся в виде суспендированной в питьевой воде биомассы, а минеральные вещества, витамины и аминокислоты выбраны из тех, которые являются водорастворимыми веществами и стимулируют спорообразование пробиотических бактерий рода Bacillus или ингибируют прорастание спор, причем в качестве аминокислот используют D-аланин и глицин, в качестве минеральных веществ - цитрат кальция, а в качестве витаминов - парааминобензойная кислота и фолиевая кислота при следующем количественном содержании компонентов в 1 мл:

В качестве водорастворимых солей кальция функциональная питьевая вода содержит цитрат кальция. В качестве пробиотических бактерий рода Bacillus функциональная питьевая вода содержит биомассу спор штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 депонирован в немецкой коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen № DSM 24613, обладающую бактерицидной и фунгицидной активностью, или биомассу спор штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 депонирован в немецкой коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen № DSM 24615, обладающую бактерицидной и фунгицидной активностью, или смесь в соотношении 1:1 биомасс спор штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen № DSM 24613) и штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen № DSM 24615).

В качестве питьевой воды функциональная питьевая вода содержит очищенную питьевую воду, или дистиллированную воду, или артезианскую воду, или ледниковую талую воду.

Питьевая вода расфасована в упаковку и хранится в светонепроницаемом помещении.

D-аланин является аминокислотой и в пищевой промышленности используется как подсластитель (http://t-pacient.ru/articles/6242/) или пищевая добавка (http://ru.foods-additive.com/category/L-D-DL-Alanine.htm).

Глицин - аминокислота, которая выполняет важные биологические функции в живых организмах, участвует в биосинтезе белка, отвечает за нормальную деятельность нервной системы и регулирует обменные процессы. Аминоуксусную кислоту, выведенную искусственным путем, используют в фармацевтике, медицине и пищевой промышленности. Пищевая добавка Е640 объединяет под одним маркировочным номером аминоуксусную кислоту (глицин) и его натриевую соль - соединения, которые применяют для оптимизации вкуса и аромата продуктов. Добавка безопасна и официально разрешена в большинстве стран мира (https://foodandhealth.ru/dobavki/glicin-i-ego-natrievava-sol-e640/).

Цитрат кальция является исключительной по своей эффективности и безопасности формой кальция. Во-первых, цитрат кальция полностью растворяется в воде. Во-вторых, кальций из цитрата усваивается независимо от приема пищи или кислотности желудочного сока (https://www.1vrach.ru/2014/11/15436097/). Суточная норма потребления кальция не более 1200 мг (http://mirbodrosti.com/sutochnaya-doza-kaltsiya-dlya-cheloveka-po-vozrastam/).

Парааминобензойная кислота (витамин В10) в организме человека не вырабатывается. ПАБК участвует в обменных процессах, влияет на синтез белка в организме, являясь предшественником фолиевой кислоты- способствует профилактике мегалобластной анемии. Парааминобензойная кислота необходима для нормальной пигментации волос, кожи, участвует в образовании загара за счет стимуляции выработки меланина, который защищает от проникновения в кожу вредных ультрафиолетовых лучей, вызывающих ожоги и возникновение меланом. Поэтому В10 нашел практическое применение в составе солнцезащитных средств. При внутривенном введении разжижает кровь и препятствует тромбообразованию, снижает риск возникновения инфарктов и инсультов. Во время грудного вскармливания усиливает прилив молока. Укрепляет волосы, снижает их ломкость и выпадение, препятствует возникновению седины. Поддерживает упругость, улучшает состояние кожи, предупреждает старение. Являясь фактором роста для бактерий, способствует поддержанию и восстановлению нормальной микрофлоры кишечника. (https://vitaminic.ru/vitaminy-i-mineralv/vitamin-b10). Необходимое количество ПАБК для человека не установлено. По разным источникам данные о потребности в этом витамине сильно разнятся и могут составлять от 0.1 мг до 1000 мг в сутки (https://medlibera.ru/vitaminy/vitamin-b10-pabk-paraaminobenzojnaya-kislota).

Фолиевая кислота (витамин В9) - водорастворимый витамин, необходимый для роста и развития кровеносной и иммунной систем. Наряду с фолиевой кислотой к витаминам относятся и ее производные, в том числе ди-, три-, полиглутаматы и другие. Все такие производные вместе с фолиевой кислотой объединяются под названием фолаты. Недостаток фолиевой кислоты может вызвать мегалобластную анемию у взрослых, а прием фолиевой кислоты во время беременности снижает риск развития дефектов нервной трубки плода. Верхний предел физиологической потребности - 1 мг в сутки (https://polzaili.ru/vitamin-b-9-folievaya-kislota-opisanie-vazhnye-svojstva/).

Авторами экспериментально установлено положительное влияние солей кальция на образование бактериальных спор бактерий рода Bacillus, в частности штаммов В. Subtilis, В. Licheniformis, В. Amyloliquefaciens. Авторы полагают, что их специфическое действие связано с активированием различных ферментативных систем. Значение таких элементов, как кальций заключается также и в том, что он способствует образованию разнообразных низкомолекулярных веществ в спорах, обеспечивающих их термостабильность.

Установлено заметное влияние на усиление образование спор таких витаминов как парааминобензойной и фолиевой кислот в заявленной концентрации.

Аминокислоты D-аланин и глицин в заявленных концентрациях угнетающе действуют на процесс прорастания спор бактерий рода Bacillus.

Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 депонирован в немецкой коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen № DSM 24613 и продуцирует биологически активные метаболиты, в том числе антибиотики и ферменты широкого спектра действия, подавляющие рост патогенной и условно - патогенной бактериальной и грибной микрофлоры.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 депонирован в немецкой коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen № DSM 24615 и продуцирует биологически активные метаболиты, в том числе антибиотики и ферменты широкого спектра действия, подавляющие рост патогенной и условно - патогенной бактериальной и грибной микрофлоры.

На основе заявляемых пробиотических штаммов компания ООО НПФ «Исследовательский центр» выпускает в Российской Федерации сертифицированные сухие формы пищевых биологически-активных добавок (БАД):

- БАД Ветом 1-1 (https://vetom.ru/index.php/bad-vetom-1-1);

- БАД Ветом 4 (http://vetom.ru/index.php/bad-vetom-4.

Вода очищенная может быть получена из питьевой воды методами дистилляции (дистиллированная вода), ионного обмена, обратного осмоса или электродиализа. Предпочтительными и наиболее экономичными методами получения очищенной воды является ионный обмен или обратный осмос.

- очищенная вода, практически не содержащая примесей и посторонних включений. Получают перегонкой в специальных аппаратах - дистилляторах.

Артезианские воды - напорные подземные воды, заключенные в водоносных пластах горных пород между водоупорными слоями. Обычно встречаются в пределах определенных геологических структур (впадин, мульд, флексур и др.), образуя артезианские бассейны.

Ледниковую талую воду получают при естественном таянии ледника в горах проходя сквозь твердые горные породы, насыщаясь при этом минералами и полезными микроэлементами.

Ниже приведены примеры 1-7 составов функциональной питьевой воды с количественным содержанием компонентов в 1 мл.

Соотношение минеральных веществ (солей кальция), аминокислот и витаминов сбалансировано и суммарно не превышает 17,6 мг/мл, что благоприятно воздействует на организм при употреблении. Заявляемая функциональная питьевая вода имеет приятный вкус.

Пример 1.

Пример 2.

Пример 3.

Пример 4.

Пример 5. Исследование антагонистической активности пробиотических штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 в функциональной питьевой воде.

Пробиотические штаммы бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 и Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 в питьевой воде характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Антагонистическую активность в отношении тест - культур проверяли методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-штаммов использовали Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Yersinia pseudotuberculosis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus spp.

Используемые тест - штаммы удовлетворяли следующим требованиям: находились в S - форме, имели типичные морфологические и ферментативные свойства.

Исследование антагонистической активности заявляемых штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 и Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 производили на мясо - пептонном агаре.

Рецептура мясо-пептонного агара на 1 дм³:

После смешивания компонентов среду разогревали до полного растворения агара и фильтровали через ватно-марлевый фильтр в колбы вместимостью 500 см³ по 300 см³. Колбы со средой закрывали ватно-марлевыми пробками, оборачивали горловину пергаментом и стерилизовали в автоклаве при давлении 0,15 Мпа в течение 40 мин. После остывания до температуры (45±1)°С среду разливали по стерильным чашкам Петри. Для контроля стерильности чашки с подсушенной средой помещали в термостат при температуре (37±1)°С на (24±2) часа. Нестерильные чашки отбраковывали.

Культуры патогенных микроорганизмов, указанные выше, выращивали на чашках Петри в течение (18±2) часов на мясо-пептонном агаре. В стерильные пробирки приливали по 1 мл физиологического раствора и готовили суспензии тест - штаммов с концентрацией микробных клеток (5,0±1,0)×10⁸ КОЕ/см³.

Для проведения испытания от каждой серии образцов препарата (заявляемой функциональной питьевой воды с пробиотиками) отбирали 3 пробы по 1 г. Далее 0,5 г препарата разводили в 0,5 см³. Полученную взвесь высевали штрихом с помощью микробиологической петли по диаметру чашки Петри с мясо-пептонным агаром. Посевы инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение (48±2) часов. Затем к выросшей в виде штриха культуре подсевали с помощью микробиологической петли суспензии патогенов методом перпендикулярных штрихов.

Учет результатов проводили через 8 часов инкубирования при (37±1)°С по величине зон угнетения роста тест - штаммов. Контролем роста культур патогенов служил их параллельный высев на чашки Петри с той же плотной средой (мясо-пептонным агаром) без исследуемой ассоциации антагонистов.

В результате исследования заявляемых пробиотических штаммов на антагонистическую активность установлено, что они проявляют высокую антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, частности штаммов Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Yersinia pseudotuberculosis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus spp., которая сохраняется после получения функциональной питьевой пробиотической воды и после хранения ее в течение 12 месяцев.

Пример 6. Технология культивирования бактерий Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens для получения микробной биомассы. Для получения биомассы спор бактерий штаммы Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 раздельно культивировали на жидкой питательной среде следующего состава: пептон мясной ферментативный - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 5,0 г; хлорид натрия - 5,0 г; дистиллированная вода - до общего объема 1 дм³, pH (7,2±0,2). На 1 дм³ ферментационной питательной среды использовали 10 см посевного материала с титром 10⁸ КОЕ/ см³. Процесс выращивания биомассы осуществляли в ферментере в течение (48±2) часов. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор (5-10)×10¹⁰ КОЕ/ см³.

Пример 7. Исследование прорастания спор с использованием заявляемых минеральных веществ, витаминов и аминокислот, стимулирующих и/или ингибирующих спорообразование пробиотических бактерий рода Bacillus.

Чтобы исследовать эффекты компонентов, ингибирующих прорастание спор, были подготовленные следующие группы образцов.

Контрольная группа №1 с составом питьевой воды по примеру 1, которая не подвергалась воздействию тепловой обработки.

Контрольная группа №2, с составом питьевой воды по примеру 1, в которой удалены заявленные минеральные вещества, витамины и аминокислоты, стимулирующие спорообразование пробиотических бактерий рода Bacillus и/или ингибирующие прорастание спор указанных бактерий.

Тестовые группы: №3 - с составом питьевой воды по примеру 1; №4 - с составом питьевой воды по примеру 2; №5 - составом питьевой воды по примеру 3; №6 - с составом питьевой воды по примеру 4.

Вышеуказанные образцы функциональной питьевой воды контрольной группы №2, тестовых групп №3, 4, 5 и 6 прогревали при 37°С в течение 3 часов и исследовали условия прорастания спор.

Мутность каждой испытуемой группы через 2 часа измеряли при 600 нм с использованием спектрофотометра. В контрольной группе №2, в которой отсутствовали вещества, стимулирующие спорообразование пробиотических бактерий рода Bacillus и/или ингибирующие прорастание спор, мутность суспензии спор заметно снизилась по сравнению с началом тепловой обработки, и было обнаружено значительное количество пророщенных спор (до 50%). В опытных группах образцов №3-6, в которых содержатся вещества, стимулирующие спорообразование пробиотических бактерий рода Bacillus и/или ингибирующие прорастание спор в заявленных концентрациях, мутность суспензии спор не изменялась с начала тепловой обработки, и прорастание спор не наблюдалось. В контрольной группе №1, содержащей вещества, стимулирующие спорообразование пробиотических бактерий рода Bacillus и/или ингибирующие прорастание спор и не подвергавшейся тепловой обработке, мутность суспензии спор не уменьшалась и всхожесть не наблюдалась, как в опытных группах 3-6.

Когда суспензию спор соответствующих испытуемых групп наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа, было обнаружено, что в контрольной группе №2 почти все споры в образцах были затемнены с потерей преломляющей способности света, то есть прорастали. Наоборот, в контрольной группе №1 и тестовых группах №3-6 не наблюдалось затемненной споры, и все споры обладали светоотражающей способностью, то есть прорастание спор не распознавалось. На основании приведенных выше результатов было подтверждено, что смесь заявляемых компонентов оказывает ингибирующее действие на прорастание спор бактерий.

Пример 8. Данные по хранению заявляемой функциональной питьевой воды на основе штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, ВКПМ В-10642.

Для установления срока годности при хранении заявляемой функциональной питьевой воды при температуре (+20±0,5)°С в светонепроницаемом помещении проведены соответствующие исследования, представленные в таблице.

Анализ таблицы показывает, что в течение 24 месяцев хранения заявляемой функциональной питьевой воды при температуре (+20±0,5)°С титр пробиотических бактерий не изменился. Антагонистическая активность (пример 5) пробиотических бактерий также не изменилась, что подтверждает высокую термостабильность питьевой воды с пробиотическими бактериями в споровой форме, обеспечивающую значительное упрощение технологии их применения в пищевой промышленности, медицине и ветеринарии.

Пример 9. Описание механизма действия функциональной питьевой пробиотической воды

При пероральном приеме функциональной пробиотической питьевой воды происходит поступление пробиотиков в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), где имеется мощное представительство симбиотической бактериальной флоры и иммунной системы организма человека (до 70% иммунокомпетентных клеток). В тонком и толстом кишечнике минеральные вещества, витамины и аминокислоты, стимулирующие спорообразование пробиотических бактерий рода Bacillus и ингибирующие прорастание спор бактерий-пробиотиков усваиваются организмом и не мешают переходу спор бактерий пробиотиков в вегетативную форму. Бактерии-пробиотики, являясь транзитной микрофлорой, активно размножаются и находятся в ЖКТ от 1 до 4 суток, а затем выводятся из организма. Причем, штамм бактерий-пробиотиков Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 функционирует в толстом кишечнике, а штамм бактерий-пробиотиков Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 - в тонком кишечнике, что расширяет оздоровительный профилактический эффект от применения заявляемой пробиотической питьевой воды.