Вид РИД
Изобретение
ВКЛЮЧЕНИЕ ПУТЕМ ССЫЛКИ НА ПРЕДШЕСТВУЮЩИЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет для по предварительной заявке США № 62/671816, поданной 15 мая 2018 года и № 62/788045, поданной 3 января 2019 года, каждая из которых полностью включена посредством ссылки.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ФОРМАТЕ
[0002] Настоящая заявка подается через EFS-Web вместе с электронным списком последовательностей в виде текстового файла ASCII. Электронный список последовательностей представлен в виде файла с названием ILLINC363WOSEQLIST.txt, который создан и сохранен в последний раз 10 мая 2019 года, и размер которого составляет 2806 байт. Информация в электронном списке последовательностей полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники, к которой относится изобретение
[0003] Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам получения матриц для секвенирования полинуклеотидов. В частности, изобретение относится к линеаризации кластеризованных полинуклеотидов при подготовке к секвенированию путем химического расщепления одной или нескольких первых цепей двухцепочечных полинуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке, в некоторых случаях путем реакции в присутствии комплекса переходного металла, такого как как палладиевый или никелевый комплекс. Кроме того, изобретение относится к химически опосредованному снятию защиты с модифицированных праймеров на твердой подложке.
[0004] В данной области техники известны различные способы секвенирования нуклеиновых кислот. В патенте США № 5302509 описан способ секвенирования полинуклеотидной матрицы, который включает проведение множественных реакций удлинения с использованием ДНК-полимеразы или ДНК-лигазы для последовательного включения меченых полинуклеотидов, комплементарных матричной цепи. В такой реакции «секвенирования путем синтеза» (SBS) новая полинуклеотидная цепь, спаренная основаниями с матричной цепью, синтезируется в направлении от 5' к 3' путем последовательного включения отдельных нуклеотидов, комплементарных матричной цепи. Субстратные нуклеозидтрифосфаты, используемые в реакции секвенирования, являются меченными в 3'-положении различными 3'-метками, что позволяет определять идентичность включенного нуклеотида по мере последовательного добавления нуклеотидов.
[0005] Чтобы максимизировать пропускную способность реакций секвенирования нуклеиновых кислот, целесообразно иметь возможность последовательного секвенирования нескольких матричных молекул. Параллельное секвенирование нескольких матриц может быть достигнуто с использованием технологии массива нуклеиновых кислот. Эти массивы обычно состоят из матрицы с высокой плотностью из полинуклеотидов, иммобилизованных на твердом носителе.
[0006] В данной области техники описаны различные способы изготовления массивов иммобилизованных нуклеиновых кислот. В WO 98/44151 и WO 00/18957 описаны способы амплификации нуклеиновых кислот, которые позволяют иммобилизовать продукты амплификации на твердой подложке для формирования массивов, состоящих из кластеров или «колоний», образованных множеством идентичных иммобилизованных цепей полинуклеотидов и множеством одинаковых иммобилизованных комплементарных цепей. Массивы этого типа указаны в данном документе как «кластерные массивы». Молекулы нуклеиновых кислот, присутствующие в колониях ДНК на кластерных массивах, полученных в соответствии с этими способами, могут предоставлять собой матрицы для реакций секвенирования, например, как описано в WO 98/44152. Продукты реакций твердофазной амплификации, такие как те, что описаны в WO 98/44151 и WO 00/18957, представляют собой так называемые «мостиковые» структуры, образованные отжигом пар иммобилизованных цепей полинуклеотидов и иммобилизованных комплементарных цепей, причем обе цепи присоединены к твердой подложке 5′-концами. Чтобы обеспечить более подходящие матрицы для секвенирования нуклеиновых кислот, предпочтительно удалить по существу всю или по меньшей мере участок одной из иммобилизованных цепей в «мостиковой» структуре, чтобы создать матрицу, которая является, по меньшей мере частично, одноцепочечной. Таким образом, часть матрицы, которая является одноцепочечной, будет доступна для гибридизации с праймером для секвенирования. Процесс удаления всей или части одной иммобилизованной цепи в «мостиковой» двухцепочечной структуре нуклеиновой кислоты называется «линеаризацией». Существуют различные способы линеаризации, включающие, но неограниченные этим, ферментативное расщепление, фотохимическое расщепление или химическое расщепление. Неограничивающие примеры способов линеаризации раскрыты в публикации РСТ № WO 2007/010251 и публикации патента США № 2009/0088327, а также в публикации патента США № 2009/0118128, которые полностью включены в данный документ путем ссылки.
[0007] Известно, что ферментативные способы обеспечивают эффективное сайт-специфическое расщепление олигонуклеотидов или полинуклеотидов для линеаризации двухцепочечных кластеров ДНК и для снятия защиты со связанных с поверхностью праймеров. В настоящее время ферменты широко используются в обоих этих типах реакций в различных вариантах секвенирования. Однако существуют определенные проблемы с ферментативными подходами, включая стабильность фермента, затраты на производство фермента, особые требования к хранению и обращению, различия в активности фермента и высокий фон при считывании последовательности. Поэтому, существует необходимость в разработке альтернативных способов линеаризации и снятия защиты для эффективного секвенирования ДНК. Однако существует много ограничений на типы реакций, которые могут применяться на стадиях линеаризации в этом контексте, поскольку реагенты, условия и побочные продукты: (а) должны быть совместимы с предшествующими и последующими реакциями, включая гибридизацию и дегибридизацию олигонуклеотидов, реакцию ПЦР-удлинения праймера и синтез ДНК; (b) должны демонстрировать хорошую стабильность в кислой, основной и окислительной среде; (c) должны обеспечивать быструю и чистую химическую реакцию; и (d) не должны мешать способам обнаружения нуклеотидов. В настоящем изобретении описаны стадии химического расщепления и снятия защиты, которые являются эффективными альтернативами, отвечающими ограничениям, описанным выше.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам линеаризации множества иммобилизованных двухцепочечных полинуклеотидов, включающим: обеспечение твердой подложки, содержащей двухцепочечные полинуклеотиды, где каждый двухцепочечный полинуклеотид содержит первую цепь и вторую цепь, где каждая первая цепь и вторая цепь иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами, и где каждая первая цепь содержит первый сайт расщепления, способный подвергаться химическому расщеплению в присутствии комплекса переходного металла, где комплекс переходного металла представляет собой палладиевый или никелевый комплекс; контактирование двухцепочечных полинуклеотидов с водным раствором комплекса переходного металла, в результате чего происходит расщепление одной или нескольких первых цепей в первом сайте расщепления и образование одной или нескольких отщепленных первых нуклеиновых кислот и расщепленных иммобилизованных первых цепей; и удаление отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки. В таких способах иммобилизованная вторая цепь остается на твердой подложке после удаления отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки и остается гибридизованной с отщепленной иммобилизованной первой цепью. В некоторых вариантах осуществления палладиевый комплекс (Pd) представляет собой комплекс Pd(0). В некоторых вариантах осуществления никелевый комплекс (Ni) представляет собой комплекс Ni(0). В некоторых вариантах осуществления первый сайт расщепления содержит аллильную функциональную группу. В некоторых других вариантах осуществления первый сайт расщепления дополнительно содержит фосфатную группу. В некоторых вариантах осуществления первый сайт расщепления представляет собой модифицированный нуклеозид или нуклеотид, содержащий аллилфосфатную группу.
[0009] Настоящее изобретение также относится к способам химического снятия защиты с олигонуклеотидов на твердой подложке, включающим обеспечение твердой подложки со множеством иммобилизованных на ней олигонуклеотидов, где каждый из олигонуклеотидов содержит защитную группу на 3'-гидроксильной группе, такой как модифицированный нуклеотид или нуклеозид, содержащий фосфатную группу, которая способна химически отщепляться со снятием защиты, или модифицированную 3'-концевую фосфатную группу, и взаимодействие олигонуклеотидов с реагентом для снятия защиты, за счет чего происходит отщепление защитной группы (такой как модифицированный 3'-концевой фосфатный фрагмент), дающее иммобилизованные олигонуклеотиды со свободной 3'-гидроксильной группой. В некоторых аспектах защитная группа представляет собой 3'-концевой фосфатный фрагмент со структурой с формулой (I):
(I)
где фосфатный фрагмент представляет собой фосфат на 3'-конце иммобилизованного олигонуклеотида;
R1 представляет собой -NH2, -OH, -NHC(O)ORa или -OCH2OSi(Rb)3;
где Ra представляет собой С1-4-алкил, трет-бутил, аллил, бензил или 9-флуоренилметил; и
каждый Rb независимо выбран из группы, состоящей из С1-4-алкила и фенила; и
R2 представляет собой Н, С1-4-алкил, необязательно замещенный тетрагидрофуран или нуклеотид.
[0010] В некоторых аспектах формулы (I) R1 представляет собой -NHC(O)ORa. В некоторых аспектах Ra представляет собой 9-флуоренилметил, бензил или аллил. В некоторых аспектах R1 представляет собой -OCH2OSi(Rb)3. В некоторых аспектах каждый Rb представляет собой изопропил. В некоторых аспектах каждый Rb независимо представляет собой метил, этил, трет-бутил или фенил.
[0011] В некоторых аспектах реагент для снятия защиты представляет собой фторид-ион (например, TBAF, HF или CsF) или слабое основание (например, гидроксид натрия). В некоторых аспектах иммобилизованные олигонуклеотиды являются отщепленными иммобилизованными первыми цепями, полученными в результате химического расщепления первых цепей, как описано в данном документе. Таким образом, в некоторых аспектах первые цепи содержат модифицированный нуклеотид, который присутствует в отщепленных иммобилизованных первых цепях после расщепления и удаления отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки. Способы, описанные в настоящем документе, включают удаление защитной группы с 3'-гидроксила у отщепленных иммобилизованных первых цепей после завершения Прочитывания 1. В некоторых вариантах осуществления отщепленные иммобилизованные первые цепи содержат концевые фосфатные группы. В других аспектах способы включают блокирование 3'-концевого фосфата отщепленных иммобилизованных первых цепей после отщепления и удаление отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки. В некоторых аспектах блокирование происходит путем взаимодействия 3'-концевого фосфата с блокирующей группой перед секвенированием иммобилизованных вторых цепей и удаления блокирующей группы после завершения Прочитывания 1 с образованием 3'-гидроксильной группы в соответствии со способами химического расщепления, описанными в данном документе. 3'-концы вторых цепей остаются гибридизованными с иммобилизованными отщепленными первыми цепями во время и после реакции снятия защиты.
[0012] В других аспектах 3-гидроксильная защитная группа представляет собой фосфатную группу или фрагмент, который присутствует в отщепленных иммобилизованных первых цепях после первого расщепления, и способы включают удаление фосфатной группы или фрагмента в присутствии дефосфорилирующего фермента, такого как T4PNK. 3'-концы вторых цепей остаются гибридизованными с иммобилизованными отщепленными первыми цепями во время и после реакции ферментативного снятия защиты.
[0013] В некоторых вариантах осуществления изобретения способы дополнительно включают секвенирование иммобилизованных вторых цепей после удаления отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки. В некоторых аспектах секвенирование включает последовательное включение меченых нуклеотидов, комплементарных иммобилизованным вторым цепям, и детекцию меченых нуклеотидов после каждого последовательного включения. При парном концевом секвенировании в конечном итоге секвенируются обе цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и в таких случаях секвенирование иммобилизованной второй цепи обозначается в данном документе как «Прочтение 1».
[0014] В других вариантах осуществления каждая иммобилизованная вторая цепь содержит второй сайт расщепления, способный подвергаться химическому расщеплению. В некоторых аспектах после секвенирования вторых цепей (Прочтение 1) и удаления защитной группы с 3'-гидроксила в иммобилизованных отщепленных первых цепях способы дополнительно включают синтез комплементарных цепей для иммобилизованных вторых цепей, чтобы создать производные двухцепочечные полинуклеотиды, где каждый производный двухцепочечный полинуклеотид содержит вторую цепь и производную первую цепь, причем каждая производная первая цепь и вторая цепь обе иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами. Способы изобретения включают в себя расщепление одной или нескольких вторых цепей во втором сайте расщепления, в результате чего генерируются одна или несколько отщепленных вторых нуклеиновых кислот и отщепленных иммобилизованных вторых цепей, и удаление отщепленных вторых нуклеиновых кислот с твердой подложки. В таких способах иммобилизованные производныеы первые цепи остаются на твердой подложке после удаления отщепленных вторых нуклеиновых кислот с твердой подложки и остаются гибридизованными с отщепленными иммобилизованными вторыми цепями.
[0015] В некоторых таких вариантах осуществления изобретения второй сайт расщепления на второй цепи способен подвергаться химическому расщеплению, а вторая цепь расщепляется посредством химической реакции. Например, второй сайт расщепления содержит одну или несколько вицинальных диольных связей (которые могут быть расщеплены окислением, таким как обработка периодатным реагентом), дисульфидных связей (расщепляемых, например, в восстановительных условиях, например, с помощью DTT или в присутствии фосфина), орто-нитробензильных групп (расщепляемых, например, фотолизом), азобензольных связей (расщепляемых, например, в присутствии Na2S2O4), алкил-селеновых связей (расщепляемых, например, окислением, например, с помощью перекиси водорода), силиловых эфирных связей (расщепляемых, например, с помощью фторидного иона, кислоты или основания) или аллилкарбаматных связей (расщепляемых, например, в присутствии комплекса палладия). В некоторых аспектах связь выбирают так, чтобы второе расщепление высвобождало гидроксильные фрагменты. В некоторых аспектах расщепление удаляет реакционноспособный сайт линкера (например, окисление вицинального диола оставляет два отдельных карбонильных соединения, и диол больше не присутствует). В некоторых аспектах второй сайт расщепления находится в любом положении на второй цепи, но предпочтительно присоединен к основной цепи рядом с 5'-концом второй цепи (например, рядом с прикреплением к твердой подложке). В некоторых вариантах осуществления условия химического расщепления для расщепления первой цепи и второй цепи различаются, и первая цепь и вторая цепь не могут быть расщеплены в одних условиях расщепления (например, сайты расщепления являются ортогональными). В некоторых аспектах обе стадии расщепления не обязательно должны быть стадиями химического расщепления. Например, первые цепи могут расщепляться в результате ферментативной реакции, тогда как вторые цепи расщепляются в результате химической реакции, или первые цепи могут расщепляться в результате химической реакции, тогда как вторые цепи расщепляются в результате ферментативной реакции.
[0016] Некоторые дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам линеаризации множества иммобилизованных двухцепочечных полинуклеотидов, включающим в себя: обеспечение твердой подложки, содержащей двухцепочечные полинуклеотиды, причем каждый двухцепочечный полинуклеотид содержит первую цепь и вторую цепь, где первая цепь и вторая цепь иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами, где каждая первая цепь содержит первый сайт расщепления, и где каждая вторая цепь содержит второй сайт расщепления, содержащий азобензольный линкер; расщепление одной или нескольких первых цепей в первом сайте расщепления и генерирование одной или нескольких отщепленных первых нуклеиновых кислот и отщепленных иммобилизованных первых цепей; удаление отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки; секвенирование иммобилизованных вторых цепей; ресинтезирование производных первых цепей, которые комплементарны вторым цепям; и расщепление одной или нескольких вторых цепей во втором сайте расщепления и генерирование одной или нескольких отщепленных вторых нуклеиновых кислот и отщепленных иммобилизованных вторых цепей. В некоторых аспектах таких способов иммобилизованные производные первые цепи остаются на твердой подложке после удаления отщепленных вторых нуклеиновых кислот с твердой подложки и остаются гибридизованными с отщепленными иммобилизованными вторыми цепями.
[0017] В некоторых аспектах способы дополнительно включают секвенирование иммобилизованных производных первых цепей после удаления отщепленных вторых нуклеиновых кислот с твердой подложки. В некоторых аспектах секвенирование включает последовательное включение меченых нуклеотидов, комплементарных иммобилизованным производным первым цепям, и детекцию меченых нуклеотидов после каждого последующего включения. При парном секвенировании концов в конечном итоге секвенируют обе цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и в таких случаях секвенирование иммобилизованной производной первой цепи обозначается в данном документе как «Прочтение 2».
[0018] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам получения 3'-блокирующего фрагмента, который может быть удален с помощью химической реакции в способе парного секвенирования концов (описанном в публикации патента США № 2009/0088327, которая полностью включена путем ссылки). Способы включают: обеспечение твердой подложки, содержащей двухцепочечные полинуклеотиды, причем каждый двухцепочечный полинуклеотид содержит первую цепь и вторую цепь, где первая цепь и вторая цепь иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами, и где каждая первая цепь содержит первый сайт расщепления; расщепление одной или нескольких первых цепей в первом сайте расщепления с образованием одной или нескольких отщепленных первых нуклеиновых кислот и отщепленных иммобилизованных первых цепей; и введение 3'-блокирующего фрагмента в 3'-конец отщепленных иммобилизованных первых цепей, причем 3'-блокирующий фрагмент может быть удален химической реакцией. В некоторых других вариантах осуществления вместо введения 3'-блокирующего фрагмента в 3'-конец отщепленных иммобилизованных первых цепей 3'-блокирующий фрагмент образуется из первого сайта расщепления после указанной стадии расщепления. В некоторых вариантах осуществления 3'-блокирующий фрагмент содержит модифицированный нуклеозид или нуклеотид, содержащий фосфатный фрагмент. В одном таком варианте осуществления 3'-блокирующий фрагмент содержит модифицированный нуклеозид, причем модифицированный нуклеозид содержит дополнительную -CH2OH группу или защищенную -CH2OH группу в 5'-положении нуклеозида. В другом таком варианте осуществления 3'-блокирующий фрагмент содержит модифицированный нуклеозид, причем модифицированный нуклеозид содержит дополнительную -CH2NH2 группу или защищенную -CH2NH2 группу в 5'-положении нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы дополнительно включают удаление 3'-блокирующего фрагмента с помощью химической реакции, например, в водном растворе, содержащем фторидный агент или основание.
[0019] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к твердой подложке, содержащей множество иммобилизованных на ней полинуклеотидов первой цепи, причем каждый полинуклеотид первой цепи содержит первый сайт расщепления, способный подвергаться химическому расщеплению комплексом палладия или комплексом никеля, где множество полинуклеотидов первой цепи иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка дополнительно содержит множество иммобилизованных на ней полинуклеотидов второй цепи, причем каждый полинуклеотид второй цепи содержит второй сайт расщепления, причем множество полинуклеотидов второй цепи иммобилизовано на твердой подложке своими 5'-концами. В некоторых вариантах осуществления комплекс палладия представляет собой комплекс палладия (0). В некоторых вариантах осуществления первый сайт расщепления содержит аллильную функциональную группу. В одном варианте осуществления первый сайт расщепления содержит аллил-dТ. В некоторых других вариантах осуществления первый сайт расщепления дополнительно содержит фосфатный фрагмент, который остается на отщепленной иммобилизованной первой цепи после химического расщепления. В одном варианте осуществления фосфатный фрагмент содержит структуру с формулой (I). В некоторых вариантах осуществления второй сайт расщепления может быть расщеплен способом, выбранным из группы, состоящей из химического расщепления, фоторасщепления, ферментативного расщепления или их комбинации. В одном варианте осуществления второй сайт расщепления расщепляется с помощью химической реакции. В некоторых таких вариантах осуществления второй сайт расщепления может содержать диольный линкер, имеющий формулы (VIII) или (VIIIa), или азобензольный линкер с формулой (X), как описано ниже.
[0020] Настоящее изобретение также относится к модифицированным нуклеозидам или нуклеотидам и олигонуклеотидам и способам получения таких соединений. В одном аспекте модифицированный нуклеозид или модифицированный нуклеотид содержит структуру с формулой (II):
(II),
где R представляет собой Н, ОН или OPG; R1 является H или PG; R2 представляет собой H, PG, или -OR2 представляет собой фосфатную группу; PG представляет собой защитную группу гидроксила; основание представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил или их производное. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, -PO4-). В одном аспекте модифицированный нуклеозид или нуклеотид имеет структуру с формулой (IIa):
(IIa).
[0021] В одном аспекте представлен модифицированный нуклеозид или нуклеотид, содержащий структуру с формулой (II'), когда модифицированный нуклеозид или нуклеотид с формулой (II) включен в олигонуклеотид или полинуклеотид, где 3'-кислород из аллил-модифицированного нуклеозида или нуклеотида ковалентно присоединен к 5'-концу другого нуклеотида (структура не показана):
(II'). В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, -PO4-).
[0022] В другом аспекте олигонуклеотид представляет собой аллильный нуклеозид или нуклеотид, где олигонуклеотид представляет собой соединение с формулой (III):
(III),
где каждое основание независимо представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил или их производное; и олигонуклеотид необязательно связан с твердой подложкой. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, -PO4-).
[0023] В некоторых аспектах 5'-конец олигонуклеотида (где звездочка) связан с твердой подложкой.
[0024] Дополнительно изобретение относится к химическому реагенту для включения аллильного нуклеотида в полинуклеотид, где химический реагент представляет собой соединение с формулой (IV):
(IV)
где PG представляет собой H или защитную группу гидроксила; а основание представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, или их производное.
[0025] В некоторых аспектах PG представляет собой защитную группу, которая отщепляется в мягких кислотных условиях. В некоторых аспектах PG представляет собой тритил или диметокситритил (DMT).
[0026] В некоторых аспектах предложен способ получения соединения с формулой (IV), включающий взаимодействие соединения с формулой A:
с виниловым реактивом Гриньяра (таким как винил-MgCl или винил-MgBr), необязательно при комнатной температуре, с образованием соединения с формулой B:
.
[0027] В некоторых аспектах способ включает окисление соединения с формулой C (необязательно, посредством окисления Пфитцнера-Моффата или с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) или N, N-дициклогексилкарбодиимида (DCC), дихлоруксусной кислоты (DCA) и DMSO):
с образованием соединения с формулой А.
[0028] В некоторых аспектах способ включает взаимодействие соединения, имеющего формулу D:
с TBDPSCl (трет-бутилдифенилсилилхлоридом) в присутствии основания (такого как имидазол) с последующей мягкой кислотой, такой как PTSA (п-толуолсульфоновая кислота), проводимое в одном реакционном сосуде без выделения бис-защищенного промежуточного соединения, с образованием соединения, имеющего формулу С.
[0029] В другом аспекте представлен нуклеозид или нуклеотид, содержащий 3'-блокирующий фрагмент со структурой с формулой (I):
(I)
где R1 представляет собой -NH2, -OH, -NHC(O)ORa или -OCH2OSi(Rb)3; Ra представляет собой C1-4-алкил, трет-бутил, аллил, бензил или 9-флуоренилметил; каждый Rb независимо выбран из группы, состоящей из C1-4-алкила и фенила; и R2 представляет собой Н, С1-4-алкил, необязательно замещенный тетрагидрофуран или нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, PO4-).
[0030] В другом аспекте представлен модифицированный 3'-фосфатом нуклеозид или нуклеотид, содержащий структуру с формулой (V):
(V)
где R1 представляет собой -NH2, -OH, -NHC(O)ORa или -OCH2OSi(Rb)3;
Ra представляет собой C1-4-алкил, трет-бутил, аллил, бензил или 9-флуоренилметил;
каждый Rb независимо выбран из группы, состоящей из C1-4-алкила и фенила; и
основание представляет собой необязательно защищенный аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, или их производное. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, PO4-). В некоторых вариантах осуществления соединение с формулой (V) может быть получено из соединения, имеющего формулу (V'):
где Х представляет собой О или NH; R1' представляет собой защищенный ОН (т.е. -O-TOM, -O-тритил, -O-TOM, -O-тритил, -O-DMT, -OTMS, -O-TBDMS, -O-TIPS, -OBz) или защищенную NH2-группу (то есть -NH-Boc, -NH-Fmoc, -NH-CBz, -NH-Alloc); а R1 представляет собой NH2 или OH.
[0031] В другом аспекте олигонуклеотид содержит 3'-фосфат-модифицированный нуклеотид с формулой (V), где олигонуклеотид представляет собой соединение, имеющее формулу (VI):
(VI)
где R1 представляет собой -NH2, -OH, -NHC(O)ORa или -OCH2OSi(Rb)3;
Ra представляет собой C1-4-алкил, трет-бутил, аллил, бензил или 9-флуоренилметил;
каждый Rb независимо выбран из группы, состоящей из С1-4-алкила и фенила;
каждое основание независимо представляет собой необязательно защищенный аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, или их производное. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид необязательно связан с твердой подложкой. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, PO4-). В некоторых вариантах осуществления соединение с формулой (VI) может быть получено из соединения, имеющего формулу (VI'):
где Х представляет собой О или NH; R1' представляет собой защищенный ОН (т.е. -O-TOM, -O-тритил, -O-TOM, -O-тритил, -O-DMT, -OTMS, -O-TBDMS, -O-TIPS, -OBz) или защищенную NH2-группу (то есть -NH-Boc, -NH-Fmoc, -NH-CBz, -NH-Alloc); а R1 представляет собой NH2 или OH.
[0032] В некоторых аспектах формулы (V) или (VI) R1 представляет собой -NHC(O)ORa. В некоторых аспектах Ra представляет собой 9-флуоренилметил, бензил или аллил. В некоторых аспектах R1 представляет собой -OCH2OSi(Rb)3. В некоторых аспектах каждый Rb представляет собой изопропил. В некоторых аспектах каждый Rb независимо представляет собой метил, этил, трет-бутил или фенил.
[0033] Настоящее изобретение также относится к химическому реагенту для введения 3'-фосфат-модифицированного нуклеотида в полинуклеотид, где химический реагент представляет собой соединение, имеющее формулу (VII):
(VII),
где R1 такой, как определено выше; PG представляет собой H или защитную группу гидроксила; а основание представляет собой необязательно защищенный аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, или их производное.
[0034] В некоторых аспектах формулы (VII) R1 представляет собой -NHC(O)ORa. В некоторых аспектах Ra представляет собой 9-флуоренилметил, бензил или аллил. В некоторых аспектах R1 представляет собой -OCH2OSi(Rb)3. В некоторых аспектах каждый Rb представляет собой изопропил. В некоторых аспектах каждый Rb независимо представляет собой метил, этил, трет-бутил или фенил.
[0035] Изобретение также относится к способам получения диольных линкеров для включения в полинуклеотиды. В некоторых аспектах диольный линкер представляет собой диольный линкер, описанный в патенте США № 8715966. В некоторых аспектах диольный линкер имеет структуру с формулой (VIII):
(VIII),
где r представляет собой 2, 3, 4, 5 или 6;
s представляет собой 2, 3, 4, 5 или 6;
«а» кислород представляет собой 3'-гидроксильный кислород первого нуклеотида; и
«b» кислород представляет собой 5'-гидроксильный кислород второго нуклеотида.
[0036] В некоторых аспектах диольный линкер имеет структуру с формулой (VIIIa):
(VIIIa)
где «а» и «b» определены выше.
[0037] Настоящее изобретение относится к способам получения химического реагента для включения линкера, имеющего формулы (VIII) или (VIIIa), в полинуклеотид, где химический реагент представляет собой соединение с формулой (IX):
(IX),
где r представляет собой 2, 3, 4, 5 или 6 (в некоторых аспектах r представляет собой 5);
s представляет собой 2, 3, 4, 5 или 6 (в некоторых аспектах s представляет собой 3); и
PG представляет собой защитную группу, удаляемую в слабокислых условиях (например, тритил или диметокситритил).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0038] На фиг.1 проиллюстрирован вариант осуществления схемы процесса секвенирования посредством синтеза (SBS) от Illumina.
[0039] На фиг.2А показаны полученные с помощью флуоресцентного сканера Typhoon изображения неструктурированной проточной ячейки с высокой плотностью праймеров до и после обработки комплексом Pd (0), где поверхность проточной ячейки покрыта аллилмодифицированными праймерами.
[0040] На фиг. 2B представлена гистограмма, демонстрирующая изменение плотности праймеров после обработки Pd (0), описанной на фиг. 2А, по сравнению с поверхностью проточной ячейки, которая покрыта контрольными праймерами без аллильной функциональной группы.
[0041] На фиг.3А представлена гистограмма, демонстрирующая результаты анализа контроля качества (QC) флуоресценции красителя TET на поверхности (TET-QC), полученные для проточной неструктурированной ячейки с высокой плотностью праймеров, покрытой аллил-модифицированными праймерами P5 и стандартными праймерами P7 (каналы 1-4), по сравнению с проточной ячейкой, прокрытой стандартными праймерами P5/P7 (каналы 5-8).
[0042] На фиг. 3B показано полученное с помощью флуоресцентного сканера Typhoon изображение поверхности проточной ячейки после TET-QC, описанного на фиг. 3A.
[0043] На фиг.4 показан процент ошибок в данных секвенирования на 2-канальном приборе Miseq® с использованием стандартной проточной ячейки и проточной ячейки нового типа.
[0044] На фиг. 5A проиллюстрирована активность расщепления P15 для составов, полученных из (Pd(C3H5)Cl)2 в присутствии от 1 до 10 эквивалентов THP (10 мг/мл, N=4 для каждого условия) по сравнению с составом, содержащим (Pd(C3H5)Cl)2 (6 мМ), THP (60 мМ) и аскорбат натрия (6 мМ) (N=2).
[0045] На фиг. 5B проиллюстрирована активность расщепления P15 для состава, содержащего [Pd(C3H5) (THP)2]Cl и 1 или более эквивалентов THP (12 мМ Pd, N=2 для каждого условия), по сравнению с составом, содержащим (Pd(C3H5)Cl)2 (6 мМ), THP (60 мМ) и аскорбат натрия (6 мМ) (N=2).
[0046] На фиг. 6А показана средняя интенсивность Прочтения 1 на NovaSeq™ для 10 мМ Pd(THM)4 по сравнению с реагентом Pd(0), генерируемым in situ.
[0047] На фиг. 6B показана средняя частота ошибок в геноме PhiX на NovaSeq™ для 10 мМ Pd(THM)4 по сравнению с реагентом Pd(0), генерируемым in situ.
[0048] На фиг.7 показана активность расщепления P15 составом Pd(THP)2-4 (10 мг/мл) по сравнению с составом, содержащим (Pd(C3H5)Cl)2 (6 мМ), THP (60 мМ) и аскорбат натрия (6 мМ). ).
[0049] На фиг. 8 представлена гистограмма интенсивности флуоресценции проточной ячейки, покрытой праймерами P15/P7, после обработки Pd-THP или Ni-THP.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Стратегии неферментативной химической линеаризации являются привлекательной альтернативой для расщепления мостиковых двухцепочечных полинуклеотидных структур перед каждым прочитыванием в секвенировании. В частности, химические вещества часто могут храниться в течение длительных периодов при комнатной температуре и являются относительно недорогими по сравнению с ферментами. Настоящая заявка относится к способам химической линеаризации кластеров двухцепочечных полинуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке для создания матрицы для секвенирования. Каждый двухцепочечный полинуклеотид содержит первую цепь и вторую цепь. Первая цепь создается путем удлинения первого удлиняющего праймера, иммобилизованного на твердой подложке, а вторая цепь создается путем удлинения второго удлиняющего праймера, иммобилизованного на твердой подложке. Каждая из первой и второй цепей содержит сайт расщепления. В некоторых вариантах осуществления первая цепь содержит сайт расщепления, который способен расщепляться комплексом палладия или комплексом никеля, например комплексом Pd(0) или комплексом Ni(0). В конкретном варианте осуществления сайт расщепления расположен в участке первого удлиняющего праймера первой цепи. В дополнительном варианте осуществления сайт расщепления содержит аналог тиминового нуклеозида или нуклеотида, имеющий аллильную функциональную группу. В некоторых вариантах осуществления вторая цепь содержит сайт расщепления, который включает азобензольный линкер, который способен расщепляться химическим реагентом, например Na2S2O4. В альтернативном варианте вторая цепь содержит сайт расщепления, который включает диольный линкер, который способен расщепляться периодатом, например, NaIO4. Способы, описанные в настоящем документе, могут использоваться как часть реакции секвенирования путем синтеза (SBS) в системе, такой как системы HiSeq®, MiSeq® или NextSeq® от Illumina (Сан-Диего, Калифорния).
[0051] На фиг. 1 описан вариант осуществления стандартного процесса SBS-секвенирования от Illumina. Сначала обеспечивается твердая подложка, содержащая множество праймеров Р5/Р7, иммобилизованных на поверхности твердой подложки. Каждый из праймеров P5 и P7 имеет в своей последовательности сайт расщепления. В одном варианте осуществления сайт расщепления на праймере Р5 представляет собой дезоксиуридин (U). В одном варианте осуществления сайт расщепления на праймере P7 представляет собой 8-оксо-гуаниновый нуклеотид (оксо-G). Набор молекул ДНК-мишеней для секвенирования гибридизуют с иммобилизованными праймерами P5/P7. После гибридизации исходные молекулы ДНК-мишени удаляют, оставляя только комплементарные копии удлиненных полинуклеотидов, содержащих праймеры P5/P7. Этот этап также известен как этап «засева». Затем удлиненные полинуклеотиды P5/P7 амплифицируют с помощью процесса, называемого «мостиковой амплификацией», с образованием двухцепочечных кластеров с обеими цепями, прикрепленными к твердой подложке на 5'-конце. После этапа «кластеризации» выполняется первая линеаризация для удаления части удлиненных полинуклеотидов, содержащих праймер P5. В одном варианте осуществления такое удаление обеспечивается ферментативным расщеплением с использованием фермента USER для расщепления по U-позиции в праймере P5. После первого раунда SBS (Прочтение 1) проводится повторный синтез для повторного образования двухцепочечных полинуклеотидов. Затем выполняется вторая линеаризация для удаления части удлиненных полинуклеотидов, содержащих праймер P7. В одном варианте осуществления такое удаление обеспечивается реакцией ферментативного расщепления с использованием фермента FPG для расщепления по оксо-G-позиции в праймере P7. Затем проводится второй раунд SBS (Прочтение 2) для секвенирования целевой ДНК.
[0052] Праймеры P5 и P7 используются на поверхности коммерческих проточных ячеек, продаваемых Illumina, Inc., для секвенирования на платформах HiSeq®, MiSeq®, NextSeq® и Genome Analyzer®. Последовательности праймеров описаны в патентной публикации США № 2011/0059865 А1, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.
[0053] Стандартные последовательности праймеров P5 и P7 для парного секвенирования концов включают нижеследующие последовательности:
P5: парное прочтение 5'→3′
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (SEQ ID NO: 1)
P7: парное прочтение 5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ ID NO: 2)
где G* представляет собой 8-оксо-гуанин.
[0054] Необязательно, один или оба праймера P5 и P7 могут включать в себя поли-T-хвост. Поли-T-хвост обычно расположен на 5'-конце вышеуказанных последовательностей, но в некоторых случаях может быть расположен на 3'-конце. Поли-Т-последовательность может включать любое количество Т-нуклеотидов, например, от 2 до 20.
[0055] Стандартные последовательности праймеров P5 и P7 с поли-T-спейсером, используемые в проточной ячейке с покрытием PAZAM, включают нижеследующие последовательности:
Праймер Р5 с поли-Т-спейсером:
5'-алкин-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (SEQ ID NO. 3)
Праймер Р7 с поли-Т-спейсером:
5'-алкин-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ ID NO: 4)
где G * представляет собой 8-оксо-гуанин.
Дополнительные последовательности праймеров включают набор праймеров P5 и P7 для SBS с одиночным прочтением:
P5: одиночное прочтение: 5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGA (SEQ ID NO: 7)
P7: одиночное прочтение 5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGA (SEQ ID NO: 8)
[0056] В настоящем изобретении, когда стандартные праймеры или олигонуклеотиды P5/P7 модифицируют для включения первого или второго сайта расщепления, который способен подвергаться химическому расщеплению, например, комплексом Pd или комплексом Ni, модификация праймеров P5/P7 могут относиться к замене или замещению существующего нуклеотида (или нуклеозида) в последовательности P5/P7 другим химическим веществом, например, модифицированным нуклеотидным или нуклеозидным аналогом со специфической функциональной группой, обеспечивающей сайт-специфическое химическое расщепление. Модификация может также относиться к вставке нового химического фрагмента в существующую последовательность P5/P7, где новый химический фрагмент способен подвергаться сайт-специфичному химическому расщеплению. В некоторых вариантах осуществления модифицированные праймеры P5/P7, указываемые как праймеры P15/P17, соответственно, включают нижеследующие последовательности:
Праймер Р15 5'→3'
5'-алкин-TTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC (SEQ ID NO: 5)
где X=аллил-Т-нуклеозид, как показано на схеме 1.
Праймер Р17 5'→3'
5'-алкин-TTTTTTYYYCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (SEQ ID NO: 6)
где Y представляет собой диольный линкер, подверженный химическому расщеплению, например, путем окисления реагентом, таким как периодат, как раскрыто в публикации США № 2012/0309634, которая полностью включена посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления диольный линкер имеет формулу (VIII) или (VIIIa), как описано в настоящем документе.
Определения
[0057] Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объект изобретения.
[0058] Если не указано иначе, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в данной области техники. Использование термина «включающий», а также других форм, таких как «включает», «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Использование термина «иметь», а также других форм, таких как «иметь», «имеет» и «имел», не является ограничивающим. Используемые в данном описании, будь то в переходной фразе или в тексте формулы изобретения, термины «содержит» и «содержащий» следует интерпретировать как имеющие открытое значение. То есть вышеприведенные термины должны интерпретироваться как синоним фраз «имеющий по меньшей мере» или «включающий по меньшей мере». Например, при использовании в контексте процесса термин «содержащий» означает, что процесс включает в себя по меньшей мере перечисленные стадии, но может включать в себя дополнительные стадии. При использовании в контексте соединения, композиции или устройства термин «содержащий» означает, что соединение, композиция или устройство включают в себя по меньшей мере перечисленные признаки или компоненты, но могут также включать дополнительные признаки или компоненты.
[0059] Используемые в настоящем документе общие органические сокращения определены следующим образом:
Ac -ацетил
Ac2O - уксусный ангидрид
Alloc - аллилоксикарбонил
Водн. - водный
BOC или Boc - трет-бутоксикарбонил
Bz - бензил
°C - температура в градусах Цельсия
Cbz - бензилоксикарбонил
CVD - химическое осаждение из газовой фазы
dATP - дезоксиаденозин трифосфат
dCTP - дезоксицитидин трифосфат
ДГТФ дезоксигуанозин трифосфат
dGTP - дезокситимидин трифосфат
ddNTP(s) - дидезоксинуклеотид(ы)
DCM - метиленхлорид
DMF - диметилформамид
DMT или DMTr - диметокситритил
EtOAc - этилацетат
FC - проточная ячейка
Fmoc - флуоренилметилоксикарбонил
г - граммы
h или hr - часы
IPA - изопропиловый спирт
LCMS - Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия
мл - миллилитры
Ni - никель
PE - петролейный эфир
PAZAM - сополимер (N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида (Azapa) и акриламида в любом соотношении акриламида и Azapa
Pd - палладий
rt - комнатная температура
SBS - секвенирование с помощью синтеза
TBAF - тетра-н-бутиламмонийфторид
TBDMS - трибутилдиметилсилил
TEA - триэтиламин
TFA - трифторуксусная кислота
Трет, т - третичный
THF - тетрагидрофуран
ТНМ - трис(гидроксиметил)фосфин
THP - трис(гидроксипропил)фосфин
TIPS -триизопропилсилил
ТСХ -тонкослойная хроматография
TMS - триметилсилил
ТОМ - триизопропилсилилоксиметил
Тритил - трифенилметил
мкл - микролитры
[0060] Используемый в настоящем документе термин «ковалентно присоединенный» или «ковалентно связанный» относится к образованию химической связи, которая характеризуется совместным использованием пар электронов между атомами. Например, ковалентно присоединенное полимерное покрытие относится к полимерному покрытию, которое образует химические связи с функционализированной поверхностью подложки по сравнению с прикреплением к поверхности с помощью других средств, например адгезии или электростатического взаимодействия.
[0061] Используемый в настоящем документе термин «удлиняющий праймер» относится к олигонуклеотиду или полинуклеотиду, иммобилизованному на твердой подложке, где олигонуклеотид или полинуклеотид способен специфически связываться с последовательностью молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени. После процесса гибридизации олигонуклеотид или полинуклеотид удлиняют, чтобы включать последовательность, которая является комплементарной молекуле нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых случаях термин «удлиняющий праймер» используется взаимозаменяемо с «амплифицирующим праймером».
[0062] Используемые в настоящем документе термины «нуклеиновая кислота» и «нуклеотид» предназначены для того, чтобы соответствовать их применению в данной области и включать встречающиеся в природе их виды или функциональные аналоги. Особенно подходящие функциональные аналоги нуклеиновых кислот способны гибридизоваться с нуклеиновой кислотой специфично к последовательности или могут использоваться в качестве матрицы для репликации конкретной нуклеотидной последовательности. Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты обычно имеют остов, содержащий фосфодиэфирные связи. Аналог структуры может иметь альтернативную остовную связь, включая любую из множества известных в данной области. Природные нуклеиновые кислоты обычно содержат дезоксирибозный сахар (например, найденный в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК)) или рибозный сахар (например, найденный в рибонуклеиновой кислоте (РНК)). Нуклеиновая кислота может содержать нуклеотиды, имеющие любой из множества аналогов этих сахарных фрагментов, которые известны в данной области. Нуклеиновая кислота может включать природные или неприродные нуклеотиды. В этом отношении природная дезоксирибонуклеиновая кислота может иметь одно или несколько оснований, выбранных из группы, состоящей из аденина, тимина, цитозина или гуанина, а рибонуклеиновая кислота может иметь одно или несколько оснований, выбранных из группы, состоящей из урацила, аденина, цитозина или гуанина. Подходящие неприродные основания, которые могут быть включены в нуклеиновую кислоту или нуклеотид, известны в данной области. Термины «зонд» или «мишень» при использовании в отношении нуклеиновой кислоты являются семантическими идентификаторами для нуклеиновой кислоты в контексте способа или композиции, изложенных в данном документе, и необязательно ограничивают структуру или функцию нуклеиновой кислоты за исключением того, что явно указано иначе. Термины «зонд» и «мишень» могут аналогичным образом применяться к другим анализируемым веществам, таким как белки, небольшие молекулы, клетки или т.п.
[0063] Используемый в настоящем документе термин «полинуклеотид» относится к нуклеиновым кислотам в целом, включая ДНК (например, геномную ДНК, кДНК), РНК (например, мРНК), синтетические олигонуклеотиды и аналоги синтетических нуклеиновых кислот. Полинуклеотиды могут включать природные или неприродные основания или их комбинации, а также природные или неприродные связи остова, например, фосфоротиоаты, PNA или 2'-O-метил-РНК или их комбинации. В некоторых случаях термины «полинуклеотид», «олигонуклеотид» или «олиго» используются взаимозаменяемо.
[0064] Используемый в настоящем документе термин «сайт расщепления» относится к положению на полинуклеотидной последовательности, где участок полинуклеотида может быть удален с помощью реакции расщепления. Положение сайта расщепления предпочтительно заранее определено, то есть место, где происходит реакция расщепления, определяется заранее, в отличие от расщепления в случайном месте, где его местоположение заранее неизвестно.
[0065] Используемый в настоящем документе термин «твердая подложка» относится к жесткой подложке, которая нерастворима в водной среде. Подложка может быть непористой или пористой. Субстрат необязательно может быть способным поглощать жидкость (например, из-за пористости), но, как правило, будет достаточно жестким, чтобы субстрат существенно не набухал при поглощении жидкости и по существу не сжимался при удалении жидкости при высушивании. Непористая твердая подложка обычно непроницаема для жидкостей или газов. Типичные твердые подложки включают, но не ограничиваются ими, стекло и модифицированное или функционализированное стекло, пластмассы (например, акрилы, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, тефлон, циклические олефины, полиимиды и т.д.), нейлон, керамику, смолы, Zeonor, диоксид кремния или материалы на основе диоксида кремния, включая кремний и модифицированный кремний, углерод, металлы, неорганическое стекло, пучки оптических волокон и полимеры. Особенно полезные твердые подложки для некоторых вариантов осуществления представляют собой компоненты проточной ячейки или расположены внутри проточной ячейки. Твердый носитель может иметь плоскую поверхность, например, как в проточной ячейке, или неплоскую поверхность, например, в случае шариков.
[0066] В тех случаях, когда заместитель представлен в виде дирадикала (то есть имеет две точки присоединения к остальной части молекулы), следует понимать, что заместитель может быть присоединен в любой направленной конфигурации, если не указано иное. Таким образом, например, заместитель, обозначенный как -AE- или включает заместитель, ориентированный таким образом, что A присоединен в крайней левой точке присоединения молекулы, а также что A присоединен в крайней правой точке молекулы.
Способы первой химической линеаризации с помощью палладия (Pd) или никеля (Ni)
[0067] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам линеаризации множества иммобилизованных двухцепочечных полинуклеотидов, включающим в себя: обеспечение твердой подложки, содержащей двухцепочечные полинуклеотиды, где каждый двухцепочечный полинуклеотид содержит первую цепь и вторую цепь, где каждая первая цепь и вторая цепь иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами, и где каждая первая цепь содержит первый сайт расщепления, способный подвергаться химическому расщеплению в присутствии расщепляющего реагента; контактирование двухцепочечных полинуклеотидов с расщепляющим реагентом, за счет чего происходит расщепление одной или нескольких первых цепей в первом сайте расщепления и образование одной или нескольких отщепленных первых нуклеиновых кислот и отщепленных иммобилизованных первых цепей; и удаление отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки. В некоторых аспектах сайт расщепления способен подвергаться расщеплению в присутствии комплекса Pd или комплекса Ni. В некоторых аспектах расщепляющий реагент представляет собой водный раствор комплекса Pd или комплекса Ni. В некоторых аспектах расщепляющий реагент получают in situ.
[0068] В некоторых вариантах осуществления способов линеаризации с использованием Pd/Ni, описанных в настоящем документе, каждая первая цепь продолжается от первого удлиняющего праймера, иммобилизованного на твердой подложке. В некоторых таких вариантах осуществления первый удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой последовательность P5 или P7, как описано в настоящем документе, или последовательность, которая комплементарна P5 или P7. В одном варианте осуществления первый удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность P5 (SEQ ID NO. 1). В дополнительном варианте осуществления первый удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность P5 с поли-Т-спейсером (SEQ ID NO. 3). В одном варианте осуществления первый удлиняющий праймер представляет собой праймер P5. В дополнительном варианте осуществления первый удлиняющий праймер представляет собой P5 с поли-Т-спейсером. В других вариантах осуществления первый удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой последовательность P5 или P7, как описано в настоящем документе, или последовательность, которая комплементарна P5 или P7, где один нуклеотид последовательности заменен модифицированным нуклеотидом, который чувствителен к расщеплению в присутствии палладиевого комплекса. В некоторых аспектах первый удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность Р15, как описано в настоящем документе (SEQ ID NO. 5).
[0069] В некоторых вариантах осуществления способов линеаризации Pd/Ni, описанных в данном документе, первый удлиняющий праймер содержит первый сайт расщепления. В некоторых других вариантах осуществления первый сайт расщепления содержит модифицированный нуклеотид или нуклеозид, который способен подвергаться химическому расщеплению, например, комплексом палладия. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеозид или нуклеотид имеет структуру с формулой (II):
(II)
где R представляет собой Н, ОН или OPG; R1 является H или PG; R2 представляет собой H, PG, или -OR2 представляет собой фосфатную группу; PG представляет собой защитную группу гидроксила; основание представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил или их производное. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, -PO4-). В одном аспекте модифицированный нуклеозид или нуклеотид имеет структуру с формулой (IIa):
(IIa).
[0070] В некоторых вариантах осуществления первый сайт расщепления, включающий модифицированный нуклеозидный или нуклеотидный фрагмент, включает структуру с формулой (II'), где 3'-кислород из аллил-модифицированного нуклеозида или нуклеотида ковалентно присоединен к 5'-концу другого нуклеотида (структура не показана):
(II'). В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, -PO4-).
[0071] В некоторых других вариантах осуществления модифицированный нуклеотид или нуклеозид может быть дополнительно помечен детектируемой меткой, например, флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид содержит винильный заместитель у 5'-углерода нуклеотида или нуклеозида, образуя таким образом аллильную часть относительно 5'-гидроксильной группы. В некоторых вариантах осуществления 5'-гидроксильная группа соединяется с 3'-фосфатом второго нуклеотида, так что динуклеотидное звено содержит сайт расщепления с аллилфосфатным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид или нуклеозид представляет собой аналог тиминового (Т) нуклеозида или нуклеотида. В некоторых других вариантах осуществления 3'-гидроксил-защитная (или блокирующая) группа, например, фосфатный фрагмент (как показано в формуле (II)), остается на отщепленных иммобилизованных первых цепях после химического расщепления первых цепей. В одном таком варианте 3'-фосфатный фрагмент второго нуклеотида ковалентно присоединен к 5'-углероду в модифицированного нуклеозидном аналоге (то есть фосфатная группа включает 5'-гидроксил модифицированного нуклеотида). В некоторых вариантах осуществления сайт расщепления расположен рядом с 3'-концом первого удлиняющего праймера, например, на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от 3'-конца первого удлиняющего праймера. В некоторых других вариантах осуществления сайт расщепления расположен рядом с 5'-концом первого удлиняющего праймера, например, на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от 5'-конца первого удлиняющего праймера. В некоторых случаях для обеспечения эффективного ресинтеза ДНК сайт расщепления предпочтительно располагается ближе к 3'-концу первого праймера, например, на расстоянии от 2 до 8, или от 3 до 7, или от 4 до 6 нуклеотидов. В одном варианте осуществления первый удлиняющий праймер представляет собой праймер P5, а первый сайт расщепления расположен в последовательности праймера P5 (например, модифицированный нуклеотид включен в последовательность праймера P5 путем добавления или замены одного нуклеотида). Следовательно, последовательность P5, раскрытая в данном документе (SEQ ID NO. 1 или SEQ ID NO. 3), модифицирована для включения первого сайта расщепления, который способен подвергаться химическому расщеплению комплексом Pd/Ni, образуя таким образом модифицированный праймер P5. В одном варианте осуществления модифицированный праймер P5 содержит или представляет собой праймер P15, раскрытый в настоящем документе (SEQ ID NO. 5).
Палладиевые реагенты
[0072] В некоторых вариантах осуществления способов линеаризации Pd, описанных в настоящем документе, комплекс Pd, используемый в способе химической линеаризации, является водорастворимым. В некоторых таких вариантах осуществления комплекс Pd представляет собой комплекс Pd(0). В некоторых случаях комплекс Pd(0) может быть получен in situ путем восстановления комплекса Pd(II) реагентами, такими как алкены, спирты, амины, фосфины или гидриды металлов. Подходящие источники палладия включают Na2PdCl4, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(OAc)2, Pd(Ph3)4, Pd(dba)2, and Pd(TFA)2. В одном таком варианте осуществления комплекс Pd(0) генерируется in situ из Na2PdCl4. В другом варианте осуществления источником палладия является димер хлорида аллилпалладия (II) [(PdCl(C3H5))2]. В некоторых вариантах осуществления комплекс Pd(0) образуется в водном растворе путем смешивания комплекса Pd(II) с фосфином. Подходящие фосфины включают водорастворимые фосфины, такие как трис(гидроксипропил)фосфин (THP), трис(гидроксиметил)фосфин (THM), 1,3,5-триаза-7-фосфаадамантан (PTA), калиевая соль бис(п-сульфонатофенил)фенилфосфина дигидрата, трис(карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР) и тринатриевая соль трифенилфосфин-3,3',3''-трисульфокислоты.
[0073] В некоторых вариантах осуществления Pd(0) получают смешиванием комплекса Pd(II) [(PdCl(C3H5))2] с THP in situ. Молярное соотношение комплекса Pd(II) и THP может составлять примерно 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10. В некоторых других вариантах осуществления может быть добавлен один или несколько восстановителей, таких как аскорбиновая кислота или ее соль (например, аскорбат натрия).
[0074] В некоторых вариантах осуществления Pd(0) получают смешиванием пре-катализатора Pd(II), такого как [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl с дополнительным ТНР. [Pd(C3H5)(THP)]Cl и [Pd(C3H5)(THP)2]Cl могут быть получены взаимодействием (PdCl(C3H5))2 с 1-5 эквивалентами THP, и они могут быть выделены перед использованием в реакции химической линеаризации.
[0075] В некоторых других вариантах осуществления комплекс Pd(0) представляет собой Pd(THM)4, Pd(THP)2, Pd(THP)3 или PD(THP)4, или их комбинации.
Никелевые реагенты
[0076] В некоторых вариантах осуществления способов линеаризации с использованием Ni, описанных в данном документе, комплекс Ni, используемый в способе химической линеаризации, является водорастворимым. В некоторых таких вариантах осуществления комплекс Ni представляет собой комплекс Ni(0). В некоторых случаях комплекс Ni может быть получен in situ путем восстановления соединения Ni(II) реагентами, такими как алкены, спирты, амины, фосфины или гидриды металлов. В некоторых вариантах осуществления соединение Ni(II) представляет собой NiCl2. Подходящие фосфины включают водорастворимые фосфины, такие как трис(гидроксипропил)фосфин (THP), трис(гидроксиметил)фосфин (THM), 1,3,5-триаза-7-фосфаадамантан (PTA), калиевая соль бис(п-сульфонатофенил)фенилфосфин дигидрата, трис(карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР) и тринатриевая соль трифенилфосфин-3,3',3''-трисульфокислоты. В одном варианте осуществления комплекс Ni получают путем смешивания NiCl2 с 1-10 эквивалентами THP.
[0077] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу линеаризации множества иммобилизованных двухцепочечных полинуклеотидов, включающему в себя: обеспечение твердой подложки, содержащей двухцепочечные полинуклеотиды, причем каждый двухцепочечный полинуклеотид содержит первую цепь и вторую цепь, где каждая первая цепь продолжается от модифицированного праймера P5, иммобилизованного на твердой подложке, каждая вторая цепь продолжается от праймера P7, иммобилизованного на твердой подложке, и первая и вторая цепи иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами, где каждый модифицированный праймер P5 содержит первый сайт расщепления, способный подвергаться химическому расщеплению комплексом Pd(0); контактирование двухцепочечных полинуклеотидов с водным раствором комплекса Pd(0), за счет чего происходит расщепление одной или нескольких первых цепей в первом сайте расщепления и образование одной или нескольких отщепленных первых нуклеиновых кислот и отщепленных иммобилизованных первых цепей; и удаление отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки. В некоторых вариантах осуществления первый сайт расщепления содержит модифицированный Т-нуклеозид или нуклеотид, имеющий аллильную функциональную группу. Сайт расщепления может дополнительно включать 3'-блокирующий фрагмент, например, фосфатный фрагмент, который остается на первой цепи после реакции расщепления с использованием Pd, чтобы блокировать 3'-ОН-группу отщепленных иммобилизованных первых цепей. В некоторых вариантах осуществления 3'-блокирующий фрагмент содержит модифицированный нуклеозид или нуклеотид, содержащий фосфатную группу, с которой можно снять защиту химической или ферментативной реакцией. В одном варианте осуществления модифицированный праймер P5 содержит или представляет собой P15.
Снятие защиты с 3'-конца
[0078] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу удаления 3'-концевой защитной группы из олигонуклеотида, включающему в себя: обеспечение твердой подложки, содержащей множество олигонуклеотидов, иммобилизованных на ней своими 5'-концами, где каждый из олигонуклеотидов содержит 3'-концевую защитную группу, имеющую структуру с формулой (I), описанной в настоящем документе; и контактирование олигонуклеотидов с реагентом для снятия защиты, в результате чего отщепляется 3'-концевая защитная группа с получением олигонуклеотидов, которые имеют свободную 3'-концевую гидроксильную группу. 3'-концевая модифицированная фосфатная группа имеет структуру с формулой (I):
(I)
где R1 представляет собой -NH2, -OH, -NHC(O)ORa или -OCH2OSi(Rb)3; где Ra представляет собой С1-4-алкил, трет-бутил, аллил, бензил или 9-флуоренилметил; каждый Rb независимо выбран из группы, состоящей из С1-4-алкила и фенила; и R2 представляет собой Н, С1-4-алкил, необязательно замещенный тетрагидрофуран или нуклеотид.
[0079] В некоторых дополнительных вариантах осуществления защитная группа включает структуру с формулой (V):
(V)
где основание представляет собой необязательно защищенный аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, или их производное. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа может быть заряжена отрицательно (например, PO4-).
[0080] В некоторых вариантах осуществления формулы (I) или (V) R1 представляет собой -NHC(O)ORa. В некоторых вариантах осуществления изобретения Ra представляет собой 9-флуоренилметил, аллил или бензил. В некоторых вариантах осуществления изобретения R1 представляет собой -OCH2OSi(Rb)3. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый Rb представляет собой изопропил. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый Rb независимо представляет собой метил, этил, трет-бутил или фенил.
[0081] В некоторых вариантах осуществления модифицированная фосфатная группа формулы (I) или (V) может быть удалена химическим реагентом для снятия защиты, таким как фторидсодержащий реагент или основание. Неограничивающие примеры включают тетра-н-бутиламмонийфторид (TBAF), HF, NH4F, CsF, NaOH и KOH и их комбинации
[0082] В некоторых вариантах осуществления способов линеаризации с использованием Pd/Ni, описанных в настоящем документе, после первой линеаризации оставшийся участок иммобилизованных первых цепей имеет незащищенную 3'-концевую гидроксильную группу, и способы дополнительно включают блокирование 3'-конца оставшегося участка расщепленных иммобилизованных первых цепей после реакции расщепления с использованием Pd/Ni. В одном таком варианте осуществления блокирование включает фосфорилирование 3'-концов отщепленных иммобилизованных первых цепей в качестве защиты 3'-гидроксильной группы. В некоторых других вариантах осуществления 3'-конец каждой отщепленной иммобилизованной первой цепи содержит защитную группу. В некоторых таких вариантах осуществления блокирующий эффект может быть достигнут с помощью фосфатного фрагмента или модифицированного фосфатного фрагмента, остающегося на отщепленных иммобилизованных первых цепях после реакции расщепления, который служит в качестве блокирующей группы для 3'-ОН-групп отщепленных иммобилизованных первых цепей. В некоторых вариантах осуществления модифицированный фосфатный фрагмент содержит структуру, имеющую формулы (I) или (V), как описано в настоящем документе.
[0083] Фосфатную группу или модифицированную фосфатную группу удаляют перед ресинтезом ДНК для получения производных первых цепей, которые комплементарны иммобилизованным вторым цепям. В некоторых вариантах осуществления 3'-концевая защитная группа представляет собой фосфатную группу, которая может быть удалена фосфатазой, такой как T4PNK. В некоторых других вариантах осуществления 3'-концевая защитная группа представляет собой модифицированную фосфатную группу с формулой (I) или (V), которая может быть удалена фторидсодержащим реагентом или основанием, таким как фторид тетра-н-бутиламмония (TBAF), HF, NH4F, CsF, NaOH или KOH, или их комбинация.
Способы второй линеаризации
[0084] В некоторых вариантах осуществления способов линеаризации Pd/Ni, описанных в настоящем документе, каждая вторая цепь продолжается от второго удлиняющего праймера, иммобилизованного на твердой подложке, и каждая вторая цепь содержит второй сайт расщепления. В некоторых таких вариантах осуществления второй удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательности P5 или P7, описанных в настоящем документе, или последовательности, которая комплементарна P5 или P7. В одном варианте осуществления второй удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность P7 (SEQ ID NO. 2). В дополнительном варианте осуществления второй удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность P7 с поли-Т-спейсером (SEQ ID NO. 4). В некоторых аспектах второй удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой P5 или P7, с включенным модифицированным нуклеотидом (добавляемым или замещающим основанием в последовательности, которое имеет 3'-гидроксил-защитную группу). В дополнительном варианте осуществления второй удлиняющий праймер содержит праймер P17 (SEQ ID NO: 6). В одном варианте осуществления второй удлиняющий праймер представляет собой праймер P7. В дополнительном варианте осуществления второй удлиняющий праймер представляет собой праймер P7 с поли-T-спейсером. В другом варианте осуществления второй удлиняющий праймер представляет собой праймер P17.
[0085] В некоторых вариантах осуществления способов линеаризации с использованием Pd/Ni, описанных в настоящем документе, второй удлиняющий праймер содержит второй сайт расщепления. В некоторых таких вариантах осуществления второй сайт расщепления не способен подвергаться химическому расщеплению комплексом палладия или комплексом никеля. В некоторых аспектах второй сайт расщепления может быть расщеплен способом, выбранным из группы, состоящей из химического расщепления, фоторасщепления, ферментативного расщепления или их комбинации. В одном варианте осуществления второй сайт расщепления может быть расщеплен с помощью ферментативной реакции. В одном варианте осуществления второй удлиняющий праймер представляет собой раскрытый в данном документе праймер P7 (SEQ ID NO. 2 или SEQ ID NO. 4), а второй сайт расщепления представляет собой оксо-G. В некоторых таких вариантах осуществления фермент, используемый для реакции расщепления, представляет собой FPG.
[0086] В некоторых других вариантах осуществления второй сайт расщепления может быть расщеплен с помощью химической реакции. В одном таком варианте осуществления второй удлиняющий праймер содержит или представляет собой праймер P7, модифицированный для включения модифицированного нуклеотида, который чувствителен к химическому расщеплению в соответствии с описанными в настоящем документе способами. В некоторых вариантах осуществления второй удлиняющий праймер включает или представляет собой праймер P17, раскрытый в данном документе (SEQ ID NO: 6), а второй сайт расщепления содержит одну или несколько диольных связей, которые могут быть расщеплены путем обработки периодатом, например, периодатом натрия. В некоторых таких вариантах осуществления диольный линкер включает структуру, имеющую формулу (VIII):
(VIII),
где r представляет собой 2, 3, 4, 5 или 6;
s представляет собой 2, 3, 4, 5 или 6;
«а» кислород представляет собой 3'-гидроксильный кислород первого нуклеотида; и
«b» кислород представляет собой 5'-гидроксильный кислород второго нуклеотида.
[0087] В некоторых вариантах осуществления диольный линкер имеет структуру с формулой (VIIIa):
(VIIIa)
где «а» и «b» определены выше.
[0088] В некоторых других вариантах осуществления второй сайт расщепления содержит азобензольный линкер, который может расщепляться химическим расщепления реагентом, например, Na2S2O4. В некоторых таких вариантах осуществления азобензольный линкер содержит структуру с формулой (X):
(X)
где R1 представляет собой H, гидроксил или защищенный гидроксил; R2 представляет собой H, C1-6-алкил или C1-6-алкокси-группу; каждый из R3 и R4 независимо представляет собой H, галоген, -C(O)OR5 или -C(O)NHR6; каждый из R5 и R6 независимо представляет собой H, C1-6-алкил или C6-10-арил; X представляет собой -C(O)-, -CH2- или -C(O)NH-; и каждый из m1, m2 и m3 представляет собой независимо 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых аспектах R1 представляет собой гидроксил. В некоторых других аспектах R1 представляет собой защищенный гидроксил, например, -OBz. В некоторых аспектах R3 представляет собой -C(O)OR5. В некоторых аспектах R3 представляет собой -C(O)NHR6. В некоторых таких аспектах R5 и R6 независимо представляют собой C1-6-алкил, такой как метил, этил, изопропил или т-бутил. В некоторых других аспектах R3 представляет собой H. В некоторых аспектах R2 представляет собой H. В некоторых аспектах R4 представляет собой H. В некоторых аспектах X представляет собой -CH2-. В некоторых других аспектах X представляет собой -C(O)NH-. В некоторых аспектах m1 представляет собой 2, 3 или 4. В некоторых аспектах m2 представляет собой 1, 2 или 3. В некоторых аспектах m3 представляет собой 1, 2 или 3.
[0089] В некоторых вариантах азобензольного линкера с формулой (X) один концевой атом кислорода дополнительно связан с фосфатной группой, например, имеет структуру с формулой (Xa) или формулой (Xb):
(Ха),
(Xb)
В некоторых аспектах «а» кислород представляет собой 3'-гидроксильный кислород первого нуклеотида. В некоторых аспектах «b» кислород является 5'-гидроксильным кислородом второго нуклеотида. В некоторых других аспектах «b» кислород является 3'-гидроксильным кислородом первого нуклеотида. В некоторых других аспектах «а» кислород представляет собой 5'-гидроксильный кислород второго нуклеотида.
[0090] Азобензольный линкер с формулой (Xa) или (Xb) может быть включен в олигонуклеотид или полинуклеотид с помощью химического реагента, где химический реагент представляет собой фосфорамидитное соединение с формулой (XIa) или (XIb):
(XIa),
(XIb)
где R1-R4, X, m1, m2 и m3 определены в (X); и
PG представляет собой защитную группу, удаляемую в слабокислых условиях (например, тритил или диметокситритил).
[0091] Некоторые дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу линеаризации множества иммобилизованных двухцепочечных полинуклеотидов, включающему в себя: обеспечение твердой подложки, содержащей двухцепочечные полинуклеотиды, причем каждый двухцепочечный полинуклеотид содержит первую цепь и вторую цепь, где первая цепь и вторая цепь иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами, где каждая первая цепь содержит первый сайт расщепления, и где каждая вторая цепь содержит второй сайт расщепления, содержащий азобензольный линкер; расщепление одной или нескольких первых цепей в первом сайте расщепления и генерирование одной или нескольких отщепленных первых нуклеиновых кислот и отщепленных иммобилизованных первых цепей; удаление отщепленных первых нуклеиновых кислот с твердой подложки; секвенирование иммобилизованных вторых цепей; ресинтезирование производных первых цепей, которые комплементарны вторым цепям; и расщепление одной или нескольких вторых цепей во втором сайте расщепления и генерирование одной или нескольких отщепленных вторых нуклеиновых кислот и отщепленных иммобилизованных вторых цепей. В некоторых вариантах осуществления таких способов каждая первая цепь продолжается от первого удлиняющего праймера, иммобилизованного на твердой подложке, и где первый удлиняющий праймер содержит первый сайт расщепления. В некоторых вариантах осуществления таких способов первый сайт расщепления может быть расщеплен способом, выбранным из группы, состоящей из химического расщепления, фоторасщепления, ферментативного расщепления и их комбинации, например, первый сайт расщепления может расщепляться с помощью способов с использованием Pd/Ni, описанных в настоящем документе, или ферментативным способом (например, с использованием UDG). В некоторых таких вариантах осуществления первый удлиняющий праймер содержит P5, модифицированный P5 или P15. В некоторых вариантах осуществления каждая вторая цепь продолжается от второго удлиняющего праймера, иммобилизованного на твердой подложке, и где второй удлиняющий праймер содержит второй сайт расщепления. В некоторых таких вариантах осуществления азобензольный линкер содержит структуру с формулами (X), (Xa) или (Xb), описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления азобензольный линкер расщепляется Na2S2O4. В некоторых вариантах осуществления секвенирование иммобилизованных вторых цепей включает последовательное включение меченых нуклеотидов, комплементарных иммобилизованным вторым цепям, и детекцию меченых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления 3'-конец каждой отщепленной иммобилизованной первой цепи содержит защитную группу, например, фосфатную группу или модифицированную фосфатную группу, содержащую структуру с формулой (I) или (V), как описано в настоящем документе. Защитная группа может быть удалена либо ферментативной реакцией (например, ферментом T4PNK), либо химическим снятием защиты, например, фторидсодержащим реагентом или основанием, как описано в настоящем документе, для снятия защиты с модифицированного фосфатного фрагмента, содержащего структуру с формулой (I) или (V). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление отщепленных вторых нуклеиновых кислот с твердой подложки и секвенирование производных первых цепей. В некоторых вариантах осуществления иммобилизованные производные первые цепи остаются на твердой подложке после удаления отщепленных вторых нуклеиновых кислот с твердой подложки и остаются гибридизованными с отщепленными иммобилизованными вторыми цепями.
[0092] В некоторых вариантах осуществления первого и второго способов линеаризации, описанных в настоящем документе, двухцепочечные полинуклеотиды иммобилизованы на твердой подложке посредством ковалентного связывания. В одном варианте осуществления двухцепочечные полинуклеотиды ковалентно связаны с гидрогелевым или полимерным покрытием на твердой подложке. В одном варианте осуществления гидрогелевое или полимерное покрытие содержит PAZAM. В некоторых вариантах осуществления гидрогелевое или полимерное покрытие также ковалентно связано с поверхностью твердой подложки, например, посредством реакции с функционализированным силаном, нанесенным на поверхность. В одном варианте осуществления функционализированный силан представляет собой силан, полученный из норборнена. Неограничивающие примеры гидрогелевых или полимерных покрытий на силанизированной твердом подложке и способы нанесения полинуклеотидов или праймеров на покрытую гидрогелем или полимером твердую подложку раскрыты в публикациях США №№ 2014/0079923 и 2015/0005447, которые в полном объема включены путем ссылки.
Покрытая твердая подложка для линеаризации с использованием Pd
[0093] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к твердой подложке, содержащей множество иммобилизованных на ней полинуклеотидов первой цепи, причем каждый полинуклеотид первой цепи содержит первый сайт расщепления, способный подвергаться химическому расщеплению (например, с помощью комплекса палладия или комплекса никеля, как описана в настоящем документе), где множество полинуклеотидов первой цепи иммобилизовано на твердой подложке своими 5'-концами.
[0094] В некоторых вариантах осуществления твердой подложки, описанной в данном документе, каждая первая цепь содержит или продолжается от первого удлиняющего праймера, иммобилизованного на твердой подложке. В некоторых таких вариантах осуществления первый удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательности P5 или P7, как описано в настоящем документе, или последовательности, которая комплементарна P5 или P7. В одном варианте осуществления первый удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность P5 (SEQ ID NO. 1). В дополнительном варианте осуществления первый удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность P5 с поли-Т-спейсером (SEQ ID NO. 3). В одном варианте осуществления первый удлиняющий праймер представляет собой праймер P5. В дополнительном варианте осуществления первый удлиняющий праймер представляет собой праймер P5 с поли-T-спейсером. В некоторых вариантах осуществления последовательность P5 или P7 модифицирована для включения модифицированного нуклеозида или нуклеотида, который образует по меньшей мере часть сайта расщепления.
[0095] В некоторых вариантах осуществления твердой подложки, описанной в данном документе, первый удлиняющий праймер содержит первый сайт расщепления. В некоторых других вариантах осуществления первый сайт расщепления содержит модифицированный нуклеотид или нуклеозид, который способен подвергаться химическому расщеплению, например, комплексом палладия или комплексом никеля. В некоторых таких вариантах осуществления модифицированный нуклеотид или нуклеозид представляет собой Т-нуклеозид или аналог нуклеотида. В одном таком варианте осуществления сайт расщепления содержит аналог Т-нуклеозида, содержащий аллильную функциональную группу, например, винильный заместитель у 5'-углерода аналога Т-нуклеозида, образуя таким образом аллильный фрагмент относительно 5'-гидроксильной группы. В некоторых таких вариантах осуществления модифицированный нуклеозид или нуклеотид содержит структуру с формулой (II), описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления 5'-гидроксильная группа соединена с 3'-фосфатом второго нуклеотида, так что динуклеотидное звено содержит сайт расщепления с аллилфосфатным фрагментом. В некоторых таких вариантах осуществления модифицированный нуклеозид или нуклеотид содержит структуру, имеющую формулу (II), описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления первый удлиняющий праймер содержит или представляет собой праймер P15. В некоторых других вариантах осуществления сайт расщепления также содержит 3'-защитный (или блокирующий) фрагмент, например, фосфатный фрагмент, на втором нуклеотиде. Блокирующий фрагмент остается на отщепленных иммобилизованных первых цепях после химического расщепления первых цепей. В одном варианте 3'-фосфатный фрагмент второго нуклеотида ковалентно присоединен к 5'-углероду модифицированного нуклеозидного аналога (то есть фосфатная группа включает 5'-гидроксил модифицированного нуклеотида). В некоторых вариантах осуществления блокирующая группа, остающаяся на отщепленных иммобилизованных первых цепях, содержит структуру, имеющую формулу (I) или (V), описанную в настоящем документе, которая может быть удалена с помощью химического реагента для снятия защиты, такого как фторидсодержащее соединение или основание. В некоторых вариантах осуществления блокирующая группа, остающаяся на отщепленных иммобилизованных первых цепях, представляет собой фосфатную группу, которая может быть удалена фосфатазой (например, T4PNK). В некоторых вариантах осуществления сайт расщепления расположен рядом с 3'-концом первого удлиняющего праймера, например, на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от 3'-конца первого удлиняющего праймера. В некоторых других вариантах осуществления сайт расщепления расположен рядом с 5'-концом первого удлиняющего праймера, например, на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от 5'-конца первого удлиняющего праймера. В некоторых случаях для обеспечения эффективного ресинтеза ДНК предпочтительно, чтобы сайт расщепления располагается близко к 3'-концу первого праймера, например, в пределах от 2 до 8, или от 3 до 7, или от 4 до 6 нуклеотидных остатков. В одном варианте осуществления первый удлиняющий праймер представляет собой праймер P5, и первый сайт расщепления расположен в последовательности праймера P5 (например, модифицированный нуклеотид включен в последовательность праймера P5 путем добавления или замены одного нуклеотида). Следовательно, последовательность P5, раскрытая в данном документе (SEQ ID NO. 1 или SEQ ID NO. 3), модифицирована для включения первого сайта расщепления, который способен подвергаться химическому расщеплению комплексом Pd/Ni, образуя таким образом модифицированный праймер P5. В одном варианте осуществления модифицированный праймер P5 содержит или представляет собой праймер P15, раскрытый в настоящем документе (SEQ ID NO. 5). В некоторых других вариантах осуществления модифицированный нуклеотид или нуклеозид может быть дополнительно помечен детектируемой меткой, например, флуоресцентной меткой. Детектируемая метка позволяет прямое количественно определение эффективности реакции присоединения праймеров сразу после ее завершения.
[0096] В некоторых вариантах твердого носителя, описанного в настоящем документе, комплекс Pd, используемый в способе химической линеаризации, является водорастворимым. В некоторых таких вариантах осуществления комплекс Pd представляет собой комплекс Pd(0). В некоторых случаях комплекс Pd(0) может быть получен in situ путем восстановления комплекса Pd(II) реагентами, такими как алкены, спирты, амины, фосфины или гидриды металлов. Подходящие источники палладия включают Na2PdCl4, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(Ph3)4, Pd(OAc)2, Pd(dba)2 и Pd(TFA)2. В одном таком варианте осуществления комплекс Pd(0) генерируется in situ из Na2PdCl4. В другом варианте осуществления источником палладия является димер хлорида аллилпалладия (II) [(PdCl(C3H5))2]. В некоторых вариантах осуществления комплекс Pd(0) образуется в водном растворе путем смешивания комплекса Pd(II) с фосфином. Подходящие фосфины включают водорастворимые фосфины, такие как трис(гидроксипропил)фосфин (THP), трис(гидроксиметил)фосфин (THM), 1,3,5-триаза-7-фосфаадамантан (PTA), калиевую соль бис(п-сульфонатофенил)фенилфосфин дигидрата, трис(карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР) и тринатриевую соль трифенилфосфин-3,3',3''-трисульфокислоты. В некоторых вариантах осуществления Pd(0) может быть получен путем смешивания [(PdCl(C3H5))2], [Pd(C3H5)(THP)]Cl или [Pd(C3H5)(THP)2]Cl с THP in situ. Может быть добавлен один или несколько восстановителей, таких как аскорбиновая кислота или ее соль (например, аскорбат натрия). В некоторых вариантах осуществления комплекс Pd(0) представляет собой Pd(THM)4, Pd(THP)2, Pd(THP)3 или PD(THP)4, или их комбинации.
[0097] В некоторых вариантах твердой подложки, описанной в настоящем документе, комплекс Ni, используемый в химической линеаризации, является водорастворимым. В некоторых таких вариантах осуществления комплекс Ni представляет собой комплекс Ni(0). В некоторых случаях комплекс Ni может быть получен in situ путем восстановления соединения Ni(II) (такого как NiCl2) с помощью реагентов, аналогичных тем, которые используются при восстановлении Pd(II) до Pd(0), как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления комплекс Ni получают путем смешивания NiCl2 с 1-10 эквивалентами THP.
[0098] В некоторых вариантах твердой подложки, описанной в настоящем документе, твердая подложка дополнительно содержит множество полинуклеотидов второй цепи, иммобилизованных на ней, причем каждый полинуклеотид второй цепи включает второй сайт расщепления, где множество полинуклеотидов второй цепи иммобилизовано в твердой подложке своими 5'-концами. В некоторых таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид второй цепи содержит или продолжается от второго удлиняющего праймера, иммобилизованного на твердой подложке. В некоторых таких вариантах осуществления второй удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательности P5 или P7, описанных в настоящем документе, или последовательности, которая комплементарна P5 или P7. В одном варианте осуществления второй удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность P7 (SEQ ID NO. 2). В дополнительном варианте осуществления второй удлиняющий праймер содержит нуклеотидную последовательность P7 с поли-Т-спейсером (SEQ ID NO. 4). В другом варианте осуществления второй удлиняющий праймер содержит последовательность P15 (SEQ ID NO: 6). В одном варианте осуществления второй удлиняющий праймер представляет собой праймер P7. В дополнительном варианте осуществления второй удлиняющий праймер представляет собой праймер P7 с поли-Т-спейсером. В некоторых вариантах осуществления праймер P7 или праймер P7 с поли-Т-спейсером модифицируют для удаления 8-оксо-гуанина и вставки химически расщепляемого линкера, например, одного или нескольких диольных звеньев. В еще одном варианте осуществления второй удлиняющий праймер представляет собой праймер P17. В некоторых вариантах осуществления второй удлиняющий праймер содержит второй сайт расщепления. В некоторых таких вариантах осуществления последовательности P5, P7 или P17 модифицированы для включения модифицированного нуклеотида с расщепляемым линкером. В некоторых других вариантах осуществления второй сайт расщепления не способен подвергаться химическому расщеплению комплексом палладия или комплексом никеля, используемым в первой реакции химической линеаризации. Второй сайт расщепления может быть расщеплен способом, выбранным из группы, состоящей из химического расщепления, фотохимического расщепления, ферментативного расщепления или их комбинации. В одном варианте осуществления второй сайт расщепления может быть расщеплен с помощью ферментативной реакции. В одном таком варианте осуществления второй удлиняющий праймер представляет собой раскрытый в настоящем документе праймер P7 (SEQ ID NO. 2 или SEQ ID NO. 4), а второй сайт расщепления представляет собой оксо-G. В другом варианте осуществления второй сайт расщепления может быть расщеплен с помощью химической реакции. Например, второй сайт расщепления может включать одну или несколько вицинальных диольных связей (которые могут быть расщеплены окислением, таким как обработка периодатным реагентом), дисульфидных связей (расщепляемых, например, в восстановительных условиях, например, с помощью DTT или в присутствии фосфина), орто-нитробензильных групп (расщепляемых, например, фотолизом), азобензольных связей (расщепляемых, например, в присутствии Na2S2O4), алкил-селеновых связей (расщепляемых, например, окислением, например, с помощью перекиси водорода), силиловых эфирных связей (расщепляемых, например, с помощью фторидного иона, кислоты или основания) или аллилкарбаматных связей (расщепляемых, например, в присутствии комплекса палладия). Эти связи способны генерировать по меньшей мере одну свободную гидроксильную группу после химического расщепления. В одном таком варианте осуществления второй удлиняющий праймер содержит или представляет собой праймер P17, раскрытый в настоящем документе (SEQ ID NO: 6), а второй сайт расщепления содержит одну или несколько диольных связей, которые могут быть расщеплены окислением, например, обработкой периодатом натрия. В некоторых вариантах осуществления диольный линкер содержит структуру, имеющую формулу (VIII) или (VIIIa), как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления азобензольный линкер содержит структуру, имеющую формулу (X), (Xa) или (Xb), как описано в настоящем документе.
[0099] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к твердой подложке, содержащей множество полинуклеотидов первой цепи и множество иммобилизованных на ней полинуклеотидов второй цепи, причем каждый полинуклеотид первой цепи продолжается от модифицированного праймера Р5, иммобилизованного на твердой подложке, причем модифицированный праймер Р5 содержит первый сайт расщепления; каждый полинуклеотид второй цепи продолжается от праймера Р7, иммобилизованного на твердой подложке, причем праймер Р5 содержит второй сайт расщепления; где полинуклеотиды первой и второй цепи иммобилизованы на твердой подложке своими 5'-концами, и где первый сайт расщепления способен подвергаться химическому расщеплению с помощью комплекса Pd или комплекса Ni, такого как комплекс Pd(0) или комплекс Ni(0). В некоторых вариантах осуществления первый сайт расщепления содержит модифицированный Т-нуклеозид, имеющий аллильную функциональную группу, как описано в настоящем документе. Сайт расщепления может дополнительно включать фрагмент, который может служить в качестве 3'-концевого фрагмента, например, фосфатный или модифицированный фосфатный фрагмент, который остается на полинуклеотидах первой цепи после реакции расщепления с использованием Pd/Ni, чтобы блокировать 3'-ОН в отщепленных иммобилизованных полинуклеотидах первой цепи.
[0100] В некоторых вариантах твердой подложки, описанной в настоящем документе, полинуклеотиды первой и второй цепей иммобилизованы на твердой подложке посредством ковалентного связывания с полимерным или гидрогелевым покрытием на поверхности твердой подложки. В одном варианте осуществления гидрогелевое или полимерное покрытие содержит PAZAM. В некоторых вариантах осуществления гидрогелевое или полимерное покрытие также ковалентно связано с поверхностью твердой подложки, например, в результате реакции с функционализированным силаном, нанесенным на поверхность. В одном варианте осуществления функционализированный силан представляет собой силан, полученный из норборнена. В одном варианте осуществления твердая подложка содержит или представляет собой проточную ячейку.
Поверхность твердой подложки
[0101] В некоторых вариантах осуществления поверхность твердой подложки перед покрытием праймерами содержит как области, покрытые функционализированными молекулами, так и инертные области без покрытия. В некоторых таких вариантах осуществления покрытие функционализированными молекулами представляют собой покрытие гидрогелем или полимером. Области с покрытием могут содержать реакционноспособные участки и, таким образом, могут использоваться для присоединения молекул посредством химической связи или других молекулярных взаимодействий, таких как гибридизация или ковалентная реакция. В некоторых вариантах осуществления области с покрытием (например, реакционноспособные элементы, каналы, пластины, шарики или лунки) и инертные области (называемые промежуточными областями) могут чередоваться, образуя рисунок или сетку. Такая структурированность может быть создана в одном или двух измерениях. В некоторых вариантах осуществления инертные области могут быть выбраны из областей из стекла, областей из металла, экранирующих областей или промежуточных областей, или их комбинаций. В альтернативном варианте эти материалы могут образовывать реакционноспособные области. Инертность или реакционная способность будут зависеть от химических реакций и процессов, используемых на подложке. В одном варианте осуществления поверхность твердой подложки содержит стеклянные области. В другом варианте осуществления поверхность содержит металлические области.
[0102] В некоторых вариантах осуществления описанная в настоящем документе твердая подложка образует по меньшей мере часть проточной ячейки или расположена в проточной ячейке. В некоторых таких вариантах осуществления проточные ячейки дополнительно содержат полинуклеотиды, прикрепленные к поверхности твердой подложки через покрытие функционализированными молекулами, например, полимерное или гидрогелевое покрытие. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды присутствуют в проточных ячейках в полинуклеотидных кластерах, где полинуклеотиды в полинуклеотидных кластерах прикреплены к поверхности проточной ячейки через гидрогелевое или полимерное покрытие. В таких вариантах осуществления поверхность тела проточной ячейки, к которой прикреплены полинуклеотиды, считается твердой подложкой. В других вариантах осуществления отдельная твердая подложка, имеющая покрытую гидрогелем или полимером поверхность, вставляется в корпус проточной ячейки. В предпочтительных вариантах осуществления проточная ячейка представляет собой проточную камеру, которая разделена на множество дорожек или множество секторов, причем одна или несколько из множества дорожек или множества секторов содержат поверхность, которая покрыта ковалентно присоединенным гидрогелем или полимером, описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах проточных ячеек, описанных в настоящем документе, присоединенные полинуклеотиды в пределах одного полинуклеотидного кластера имеют одинаковую или сходную нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах проточных ячеек, описанных в настоящем документе, присоединенные полинуклеотиды разных полинуклеотидных кластеров имеют разные или неодинаковые нуклеотидные последовательности. Типичные проточные ячейки и субстраты для изготовления проточных ячеек, которые можно использовать в способе или композиции, изложенных в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, те, которые коммерчески доступны от Illumina, Inc. (Сан-Диего, Калифорния) или описаны в публикациях США №№ 2010/0111768 А1 и 2012/0270305, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки.
PAZAM
[0103] Один вариант гидрогелевого или полимерного покрытия поверхности твердой подложки содержит PAZAM, полиакриламидный сополимер, содержащий следующие два повторяющихся звена:
.
[0104] В некоторых вариантах осуществления изобретения PAZAM представляет собой линейный полимер. В некоторых других вариантах осуществления PAZAM имеет небольшой процент перекрестных сшивок. PAZAM может быть функционализирован или модифицирован для использования в композиции или способе, изложенных в настоящем документе. Получение PAZAM и его аналогов раскрыто в патенте США № 9012022, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
3′-блокирующие группы
[0105] Во время циклов SBS, чтобы гарантировать, что происходит только одно включение, добавляется структурная модификация («защитная группа») к каждому меченому нуклеотиду, который добавляется в растущую цепь, чтобы гарантировать, что включен только один нуклеотид. После добавления нуклеотида с защитной группой защитную группу затем удаляют в условиях реакции, которые не влияют на целостность секвенируемой ДНК. Цикл секвенирования может затем продолжаться с включением следующего защищенного меченого нуклеотида.
[0106] Чтобы подходить для секвенирования ДНК, нуклеотидам и, более часто, нуклеотидтрифосфатам, обычно требуется защитная группа на 3'-гидроксиле, чтобы предотвратить после добавления основания на нуклеотид продолжение репликации цепи полимеразой, используемой для их включения в полинуклеотидную цепь. Существует много ограничений для типов защитных групп, которые могут быть добавлены к нуклеотиду и все еще оставаться пригодными. Защитная группа должна предотвращать добавление дополнительных нуклеотидных молекул к полинуклеотидной цепи, одновременно будучи легко удаляемой из сахарного фрагмента, не вызывая повреждения полинуклеотидной цепи. Кроме того, модифицированный нуклеотид должен переноситься с помощью полимеразы или другого подходящего фермента, используемого для включения его в полинуклеотидную цепь. Таким образом, идеальная защитная группа проявляет долговременную стабильность, эффективно включается ферментом полимеразой, вызывает блокирование вторичного или дополнительного включения нуклеотидов и обладает способностью удаляться в мягких условиях, которые не вызывают повреждения полинуклеотидной структуры, предпочтительно, в водных условиях.
[0107] Об обратимых защитных группах сообщалось ранее. Например, в статье Metzker et al., (Nucleic Acids Research, 22 (20): 4259-4267, 1994) раскрыт синтез и использование восьми 3'-модифицированных 2-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов (3'-модифицированных dNTP) и тестирование на двух матрицах ДНК по активности включения. В WO 2002/029003 описан способ секвенирования, который может включать использование аллильной защитной группы для защиты 3'-OH-группы на растущей цепи ДНК в полимеразной реакции. Другие обратимые защитные группы и способы снятия защиты с них в условиях, совместимых с ДНК, включают азидометил или модифицированную азидометильную группу, которые раскрыты в публикациях международных заявок №№ WO 2004/018497 и WO 2014/139596, и тем самым в полном объеме включены посредством ссылки.
[0108] Один вариант блокирующей группы для 3'-ОН, описанной в данном документе, представляет собой фосфатную группу, которая может быть удалена фосфатазой.
Детектируемые метки
[0109] Некоторые варианты осуществления, описанные в данном документе, относятся к использованию детектируемых меток. Детекция может быть осуществлена любым подходящим способом, включая флуоресцентную спектроскопию, или другими оптическими средствами. Предпочтительной меткой является флуорофор, который после поглощения энергии испускает излучение с определенной длиной волны. Известно множество подходящих флуоресцентных меток. Например, в статье Welch et al. (Chem. Eur. J. 5 (3): 951-960, 1999) раскрыты функционализированные дансилом флуоресцентные фрагменты, которые можно использовать в настоящем изобретении. В статье Zhu et al. (Cytometry 28: 206-211, 1997) описано использование флуоресцентных меток Cy3 и Cy5, которые также могут быть использованы в настоящем изобретении. Подходящие для применения метки также раскрыты в Prober et al. (Science 238:336-341, 1987); Connell et al. (BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge et al. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) и Smith et al. (Nature 321:674, 1986). Другие коммерчески доступные флуоресцентные метки включают, но не ограничиваются ими, флуоресцеин, Alexa, Bodipy, акридин, кумарин, пирен, бензантрацен и цианины.
[0110] В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка может быть использована в первом сайте расщепления полинуклеотида, который способен подвергаться расщеплению с использованием Pd в способах и на твердой подложке, описанных в данном документе. В частности, первый сайт расщепления может содержать меченый модифицированный нуклеотид или нуклеозид. Этот подход может еще больше упростить производственный процесс Illumina. В одном варианте осуществления аллил-модифицированный праймер P5, описанный в данном документе, может быть модифицирован для включения флуоресцентной метки, которая обеспечивает прямое количественное определение прохождения реакции посадки праймеров сразу после ее завершения, устраняя необходимость отдельного гибридизационного анализа для выполнения такой стадии количественного определения.
Линкеры для детектируемой метки
[0111] В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, нуклеиновое основание модифицированного нуклеотида или нуклеозида может быть связано с детектируемой меткой, описанной выше. В некоторых таких вариантах осуществления используемые линкеры являются расщепляемыми. Использование расщепляемого линкера гарантирует, что метка при необходимости может быть удалена после обнаружения, таким образом позволяя избежать любого интерферирующего сигнала с любым меченым нуклеотидом или нуклеозидом, включенным впоследствии.
[0112] В некоторых других вариантах осуществления используемые линкеры не расщепляются. Поскольку в каждом случае, когда включен меченый нуклеотид по изобретению, нет необходимости включать нуклеотиды впоследствии, и, таким образом, нет необходимости удалять метку с нуклеотида.
[0113] Расщепляемые линкеры известны в данной области, и для присоединения линкера к нуклеотидному основанию и метке могут использоваться общепринятые химические реакции. Линкер может быть расщеплен любым подходящим способом, включая воздействие кислот, оснований, нуклеофилов, электрофилов, радикалов, металлов, восстановителей или окислителей, света, температуры, ферментов и т.д. Линкер, как обсуждается в настоящем документе, также может быть расщеплен тем же самым катализатором, который используется для отщепления 3'-O-защитной группы. Подходящие линкеры могут быть подобраны из стандартных химических защитных групп, как описано в Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons. Другие подходящие расщепляемые линкеры, используемые в твердофазном синтезе, описаны в Guillier et al. (Chem. Rev. 100: 2092-2157, 2000).
[0114] Использование термина «расщепляемый линкер» не означает, что весь линкер необходимо удалить с, например, нуклеотидного основания. Если детектируемая метка присоединена к основанию, сайт отщепления нуклеозида может быть расположен на линкере так, чтобы гарантировать, что часть линкера остается прикрепленной к нуклеотидному основанию после отщепления.
[0115] Когда детектируемая метка присоединена к основанию, линкер может быть присоединен в любом положении на нуклеотидном основании при условии, что все еще может осуществляться образование основаниями пар Уотсона-Крика. В контексте пуриновых оснований предпочтительно, чтобы линкер был присоединен через положение 7 пурина или для предпочтительного аналога деазапурина через 8-модифицированный пурин через N-6 модифицированный аденозин или N-2 модифицированный гуанин. Для пиримидинов присоединение предпочтительно осуществляется через положение 5 на цитозине, тимидине или урациле и положение N-4 на цитозине.
[0116] В некоторых вариантах осуществления линкер может состоять из функциональных групп, аналогичных защитной группе 3'-ОН. Это сделает снятия защиты и процессы снятия защиты более эффективными, поскольку для удаления как метки, так и защитной группы потребуется только одна обработка. Особенно предпочтительными линкерами являются расщепляемые фосфином азидсодержащие линкеры.
Способы расщепления
[0117] Различные способы расщепления могут быть использованы для расщепления одной или обеих цепей двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты на стадии линеаризации, например, для расщепления полинуклеотидов второй цепи, описанных в настоящем документе. Предпочтительные, но не ограниченные варианты осуществления подходящих способов расщепления обсуждены более подробно ниже.
А) Химическое расщепление
[0118] Термин «химическое расщепление» охватывает любой способ, в котором используются ненуклеиновая кислота и неферментативный химический реагент для стимулирования/достижения расщепления одной или обеих цепей двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Если требуется, одна или обе цепи двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты могут включать одну или несколько ненуклеотидных химических групп и/или неприродных нуклеотидов и/или неприродных связей в основной цепи, чтобы позволить возможность химического расщепления по специфическому сайту расщепления, предпочтительно, заданному сайту расщепления. В одном неограничивающем варианте осуществления одна цепь двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты может включать диольную связь, которая позволяет расщепляться путем обработки периодатом (например, периодатом натрия). Диольная связь может быть расположена в месте расщепления, точное местоположение которого может быть выбрано пользователем. Понятно, что в сайт расщепления может быть включено более одного диола.
[0119] Диольные линкерные звенья, основанные на фосфорамидитной химии, подходящие для включения в полинуклеотидные цепи, коммерчески доступны от Fidelity Systems, Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Одно или несколько диольных звеньев могут быть включены в полинуклеотид с использованием стандартных методов автоматического химического синтеза ДНК. Чтобы расположить диольный линкер на оптимальном расстоянии от твердой подложки, одна или несколько спейсерных молекул могут быть включены между диольным линкером и местом прикрепления к твердой подложке. Молекула спейсера может быть ненуклеотидным химическим фрагментом. Подходящие спейсерные звенья, основанные на фосфорамидитной химии, для использования в сочетании с диольными линкерами также поставляются Fidelity Systems, Inc. Диольный линкер расщепляется при обработке «расщепляющим агентом», который может представлять собой любое вещество, которое способствует расщеплению диола. Предпочтительным расщепляющим агентом является периодат, предпочтительно водный периодат натрия (NaIO4). После обработки расщепляющим агентом (например, периодатом) для расщепления диола расщепленный продукт может быть обработан «кэпирующим агентом» для нейтрализации реакционноспособных частиц, образующихся в реакции расщепления. Подходящие кэпирующие агенты для этой цели включают амины, такие как этаноламин. Преимущественно, кэпирующий агент (например, этаноламин) может быть включен в смесь с отщепляющим агентом (например, периодатом), так что реакционноспособные частицы кэпируются, как только они образуются.
[0120] Комбинация диольной связи и расщепляющего агента (например, периодата) для расщепления одной цепи двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты является предпочтительной для линеаризации молекул нуклеиновой кислоты на полиакриламидных гидрогелях на твердой подложке, поскольку обработка периодатом совместима с целостностью нуклеиновой кислоты и с химией поверхности гидрогеля. Однако диольный способ также может быть использован для линеаризации нуклеиновых кислот, иммобилизованных на других поверхностях, включая подложки, покрытые функционализированными силанами.
[0121] В дополнительном варианте осуществления цепь, которая должна быть расщеплена (или амплифицирующий праймер, с которого получена эта цепь, если она получена твердофазной амплификацией), может включать дисульфидную группу, которая позволяет расщепляться с помощью химического восстановителя, например, трис(2-карбоксиэтил)фосфат гидрохлорида (ТСЕР).
В) Расщепление сайтов, лишенных азотистых оснований, в двухцепочечной молекуле
[0122] «Лишенный азотистого основания сайт» определяют как положение нуклеозида в полинуклеотидной цепи, в котором удалено его основание. Лишенные азотистых оснований сайты могут встречаться в природе в ДНК в физиологических условиях в результате гидролиза нуклеозидных остатков, но также могут генерироваться химически в искусственных условиях или под действием ферментов. После образования лишенные азотистых оснований сайты можно расщеплять (например, эндонуклеазой или другим одноцепочечным расщепляющим ферментом, воздействием тепла или щелочи), обеспечивая средства для сайт-специфического расщепления полинуклеотидной цепи.
[0123] В неограничивающем варианте осуществления лишенный азотистого основания сайт может быть создан в заданном положении на одной цепи двухцепочечного полинуклеотида и затем расщеплен путем, во-первых, включения дезоксиуридина (U) в заданный сайт расщепления в двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты. Это может быть достигнуто, например, включением U в один из праймеров, используемых для получения молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты путем твердофазной ПЦР-амплификации. Затем фермент урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) может быть использована для удаления основания урацила, создавая лишенный азотистого основания сайт на одной цепи. Полинуклеотидную цепь, включающую лишенный азотистого основания сайт, можно затем расщепить в лишенном азотистого основания сайте путем обработки эндонуклеазой (например, эндонуклеазой EndoIV, AP-лиазой, FPG-гликозилазой/AP-лиазой, EndoVIII-гликозилазой/AP-лиазой), нагреванием или щелочью.
[0124] Лишенные азотистых оснований сайты могут быть использованы для создания свободного 3'-гидроксильного фрагмента, действующего в качестве праймера для секвенирования. Если оба праймера для амплификации модифицированы таким образом, что они могут быть последовательно отщеплены, второе расщепление можно использовать для отщепления первой цепи от поверхности. Первый (или второй) праймер может содержать урациловое основание, которое может расщепляться одним ферментом (UDG), а второй (или первый) праймер может содержать 8-оксо-гуаниновое основание, которое может отщепляться вторым, ортогональным ферментом, FPG-гликозилазой. Второе расщепление по лишенному азотистого основания сайту может быть использовано для того, чтобы оставить праймер для секвенирования прикрепленным к поверхности, так что основание G включается в качестве первого цикла секвенирования, или расщепленные дуплексные цепи могут быть денатурированы, чтобы обеспечить гибридизацию праймера для секвенирования в растворе.
С) Расщепление рибонуклеотидов
[0125] Включение одного или нескольких рибонуклеотидов в полинуклеотидную цепь, которая в противном случае состоит из дезоксирибонуклеотидов (с или без дополнительных ненуклеотидных химических фрагментов, неприродных оснований или неприродных связей в основной цепи), может обеспечить сайт для расщепления с использованием химического агента, способного селективно расщеплять фосфодиэфирную связь между дезоксирибонуклеотидом и рибонуклеотидом или с использованием рибонуклеазы (РНКазы). Следовательно, изобретение также охватывает получение матриц для секвенирования путем расщепления одной цепи (в молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты) в сайте, содержащем один или несколько последовательных рибонуклеотидов, с использованием такого химического расщепляющие агента или РНКазы. Предпочтительно, чтобы нить, подлежащая расщеплению, содержала один рибонуклеотид, чтобы обеспечить заданный сайт для химического расщепления.
[0126] Подходящие химические расщепляющие агенты, способные селективно расщеплять фосфодиэфирную связь между дезоксирибонуклеотидом и рибонуклеотидом, включают ионы металлов, например ионы редкоземельных металлов (особенно La3+, в частности, Tm3+, Yb3+ или Lu3+ (Chen et al., Biotechniques, 2002, 32: 518-520; Komiyama et al. Chem. Commun. 1999, 1443-1511)), Fe(3) или Cu(3), или воздействие повышенного pH, например, обработка основанием, таким как гидроксид натрия. Под «селективным расщеплением фосфодиэфирной связи между дезоксирибонуклеотидом и рибонуклеотидом» подразумевается, что химический расщепляющий агент не способен расщеплять фосфодиэфирную связь между двумя дезоксирибонуклеотидами в тех же условиях. Азотистое основание рибонуклеотида(ов), как правило, не является важным, но может быть выбрано для оптимизации химического (или ферментативного) расщепления. Например, rUMP или rCMP, как правило, являются предпочтительными, если расщепление должно осуществляться путем воздействия ионов металлов, особенно ионов редкоземельных металлов.
[0127] Рибонуклеотид(ы), как правило, будут включены в одну цепь двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты и могут быть расположены в ее области, которая является одноцепочечной, когда две комплементарные цепи двухцепочечной молекулы отожжены (то есть в 5'-выступающей части). В частности, если двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты получают твердофазной амплификацией ПЦР с использованием прямого и обратного амплифицирующих праймеров, один из которых содержит по меньшей мере один рибонуклеотид, стандартные ДНК-полимеразы, используемые для амплификации ПЦР, не способны копировать рибонуклеотидную матрицу. Следовательно, продукты твердофазной ПЦР-реакции будут содержать выступающую 5'-область, содержащую рибонуклеотид(ы) и любой остаток амплифицирующего праймера выше рибонуклеотида(ов).
[0128] Фосфодиэфирная связь между рибонуклеотидом и дезоксирибонуклеотидом или между двумя рибонуклеотидами также может быть расщеплена с помощью РНКазы. Любая эндорибонуклеаза с соответствующей субстратной специфичностью может быть использована для этой цели. Если рибонуклеотид(ы) присутствуют в области, которая является одноцепочечной, когда две комплементарные цепи двухцепочечной молекулы отожжены (то есть в 5'-выступающей части), тогда РНКаза будет эндонуклеазой, которая обладает специфичностью к одиночным цепям, содержащим рибонуклеотиды. Для расщепления рибонуклеазой предпочтительно включать два или несколько последовательных рибонуклеотидов, предпочтительно от 2 до 10 или от 5 до 10 последовательных рибонуклеотидов. Точная последовательность рибонуклеотидов, как правило, не является существенной, за исключением того, что некоторые РНКазы обладают специфичностью к расщеплению после определенных остатков. Подходящие РНКазы включают, например, РНКазу А, которая расщепляет после остатков С и U. Следовательно, при расщеплении с помощью РНКазы А сайт расщепления должен включать по меньшей мере один рибонуклеотид, который представляет собой С или U.
[0129] Полинуклеотиды, содержащие один или несколько рибонуклеотидов, могут быть легко синтезированы с использованием стандартных методик химического синтеза олигонуклеотидов с подходящими предшественниками рибонуклеотидов. Если двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты получена твердофазной амплификацией нуклеиновой кислоты, тогда удобно включить один или несколько рибонуклеотидов в один из праймеров, которые будут использоваться для реакции амплификации.
D) Фотохимическое расщепление
[0130] Термин «фоторасщепление» или «фотохимическое расщепление» охватывает любой способ, в котором используется световая энергия для достижения расщепления одной или обеих цепей молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Заданный сайт для фотохимического расщепления может быть обеспечен ненуклеотидным химическим спейсерным звеном в одной из цепей двухцепочечной молекулы. Подходящие фотохимически расщепляемые спейсеры включают в себя спейсерный фосфорамидит (4-(4,4'-диметокситритилокси)бутирамидометил)-1-(2-нитрофенил)этил]-2-цианоэтил-(N, N-диизопропил)-фосфорамидит), поставляемый Glen Research, Стерлинг, Вирджиния, США. Спейсер может отщепляться при воздействии источника ультрафиолетового излучения. Это спейсерное звено может быть присоединено к 5'-концу полинуклеотида вместе с тиофосфатной группой, которая позволяет прикрепляться к твердой поверхности с использованием стандартных методик химического синтеза олигонуклеотидов. Удобно, чтобы этот спейсерный блок мог быть включен в амплифицирущий прямой или обратной праймер, который будет использоваться для синтеза фоторасщепляемой молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты путем твердофазной амплификации.
E) ПЦР-стопоры
[0131] В другом варианте осуществления двухцепочечная нуклеиновая кислота может быть получена твердофазной амплификацией с использованием прямого и обратного праймеров, один из которых содержит «ПЦР-стопоры». «ПЦР-стопор» представляет собой любую часть (нуклеотидную или ненуклеотидную), которая предотвращает дальнейшее считывание цепи полимеразой, используемой для амплификации, так что она не может копировать цепьы после этой точки. В результате амплифицированные цепи, полученные удлинением праймера, содержащего ПЦР-стопор, будут содержать 5'-выступающую часть. Этот 5'-выступ (кроме самого ПЦР-стопора) может состоять из природных дезоксирибонуклеотидов с преимущественно природными связями в основной цепи, то есть это может быть просто отрезок одноцепочечной ДНК. Затем молекула может быть расщеплена в 5'-выступающей области с использованием расщепляющего реагента (например, фермента), который является селективным в отношении расщепления одноцепочечной ДНК, но не двухцепочечной ДНК, например нуклеаза из золотистой фасоли.
[0132] ПЦР-стопор может быть по существу любым фрагментом, который предотвращает дальнейшее считывание цепи полимеразой, используемой для реакции амплификации. Подходящие ПЦР-стопоры включают, но не ограничиваются ими, гексаэтиленгликоль (HEG), лишенные оснований сайты и любой неприродный или модифицированный нуклеотид, который предотвращает дальнейшее считывание цепи полимеразой, включая аналоги ДНК, такие как пептидная нуклеиновая кислота (PNA).
[0133] Стабильные лишенные оснований сайты могут быть введены во время химического синтеза олигонуклеотидов с использованием соответствующих спейсерных звеньев, содержащих стабильный лишенный азотистого основания сайт. Например, лишенный азотистых оснований фурановые (5'-O-диметокситритил-1',2'-дидезоксирибоза-3'-[(2-цианоэтил)-(N, N-диизопропил)]-фосфорамидитные) спейсеры, коммерчески доступные от Glen Research Стерлинг, Вирджиния, США, могут быть включены во время химического синтеза олигонуклеотидов для введения лишенного азотистого основания участка. Таким образом, такой сайт может быть легко введен в олигонуклеотидный праймер для использования в твердофазной амплификации. Если лишенный азотистого основания сайт включен в прямой или обратной амплифицирующий праймер, полученный продукт амплификации будет иметь 5'-выступна одной цепи, который будет включать лишенный азотистого основания сайт (в одноцепочечной форме). Затем одноцепочечный лишенный азотистого основания сайт может быть расщеплен действием подходящего химического агента (например, воздействие щелочи) или фермента (например, AP-эндонуклеазой VI, Shida el al., Nucleic Acids Research, 1996, Vol.24, 4572-4576).
F) Расщепление пептидных линкеров
[0134] Сайт расщепления также может быть введен в одну цепь двухцепочечной нуклеиновой молекулы путем получения конъюгированной структуры, в которой пептидная молекула связана с одной цепью молекулы нуклеиновой кислоты. Впоследствии пептидная молекула может быть расщеплена пептидазным ферментом с соответствующей специфичностью или любым другим подходящим способом неферментативного химического или фотохимического расщепления. Как правило, конъюгат между пептидом и нуклеиновой кислотой будет образован путем ковалентного связывания пептида только с одной цепью двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, причем пептидный участок конъюгирован с 5'-концом этой цепи, рядом с точкой прикрепления к твердой поверхности. Если двухцепочечную нуклеиновую кислоту получают твердофазной амплификацией, пептидный конъюгат может быть включен на 5'-конце одного из амплифицирующих праймеров. Очевидно, что пептидный компонент этого праймера не будет копироваться во время ПЦР-амплификации; таким образом, продукт «мостиковой» амплификации будет включать в себя расщепляемый 5'-пептидный «выступ» на одной цепи.
[0134] Конъюгаты между пептидами и нуклеиновыми кислотами, в которых пептид конъюгирован с 5'-концом нуклеиновой кислоты, могут быть получены с использованием методик, общеизвестных в данной области. В одном таком методе пептидные и нуклеиновые компоненты желаемой аминокислотной и нуклеотидной последовательности могут быть синтезированы отдельно, например, стандартными автоматизированными методами химического синтеза, а затем конъюгированы в водном/органическом растворе. В качестве примера, система OPeC™, коммерчески доступная от Glen Research, основана на «нативном лигировании» тиоэфир-функционализированного на N-конце пептида с 5'-цистеинилолигонуклеотидом. Пентафторфенил-S-бензилтиосукцинат используют на стадии конечной реакции сочетания в стандартноом твердофазном Fmoc-синтезе пептидов. Снятие защиты трифторуксусной кислотой приводит к образованию в растворе пептидов, замещенных N-концевой S-бензилтиосукцинильной группой. O-транс-4-(N-a-Fmoc-S-трет-бутилсульфенил-1-цистеинил)-аминоциклогексил-O-2-цианоэтил-N, N-диизопропилфосфорамидит используется на стадии конечной реакции сочетания в стандартном фосфорамидитном твердофазном синтезе олигонуклеотидов. Снятие защиты с использованием водного раствора аммиака приводит к образованию 5'-S-трет-бутилсульфенил-L-цистеинил-функционализированных олигонуклеотидов. Тиобензильный конец модифицированного пептида превращается в тиофенильный аналог с использованием тиофенола, тогда как модифицированный олигонуклеотид восстанавливается с использованием трис(карбоксиэтил)фосфина. Сочетание этих двух промежуточных соединений с последующей стадией «нативного лигирования» приводит к образованию олигонуклеотид-пептидного конъюгата.
[0136] Цепь конъюгата, содержащая пептид и нуклеиновую кислоту, может быть ковалентно присоединена к твердой подложке с использованием любого подходящего метода образования ковалентной связи, известного в данной области техники, который совместим с выбранной поверхностью. Например, ковалентное присоединение к поверхности полиакриламидного гидрогеля на твердой подложке может быть достигнуто путем включения тиофосфатной группы на «свободном» конце пептидного компонента (то есть конце, не конъюгированном с нуклеиновой кислотой). Если структура конъюгата пептида с нуклеиновой кислотой является праймером для амплификации, который используется в твердофазной ПЦР-амплификации, прикрепление к твердой подложке должно оставлять свободный 3'-конец нуклеиновой кислоты.
[0137] Пептидный компонент может быть подобран таким образом, чтобы расщепляться любой выбранной пептидазой, многие из которых известны в данной области. Природа пептидазы конкретно не ограничена, необходимо только, чтобы пептидаза осуществляла расщепление где-либо в пептидном компоненте. Аналогичным образом, длина и аминокислотная последовательность пептидного компонента конкретно не ограничены, за исключением необходимости быть «расщепляемой» выбранной пептидазой.
[0138] Длина и точная последовательность нуклеиновой кислоты также конкретно не ограничены, она может иметь любую желаемую последовательность. Если нуклеиновая кислота должна функционировать в качестве праймера в твердофазной ПЦР, то ее длина и нуклеотидная последовательность будут выбраны, чтобы обеспечить отжиг на матрице, которая будет амплифицироваться.
Денатурация
[0139] В любых вариантах осуществления способа, используемого для расщепления, продукт реакции расщепления может быть подвергнут денатурации для удаления участка (участков) расщепленной цепи (цепей), которые не прикреплены к твердой подложке. Подходящие денатурирующие условия будут очевидны для квалифицированного читателя со ссылкой на стандартные протоколы молекулярной биологии Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds., Ausubel et al.). Денатурация (и последующий повторный отжиг отщепленных цепей) приводят к получению матрицы для секвенирования, который является частично или по существу одноцепочечной. Реакцию секвенирования можно затем инициировать гибридизацией праймера для секвенирования с одноцепочечным участком матрицы.
[0140] В других вариантах осуществления секвенирование может быть начато непосредственно после стадии расщепления без необходимости денатурации для удаления участка расщепленной цепи (цепей). Если стадия расщепления генерирует свободную 3'-гидроксильную группу на одной расщепленной цепи, все еще гибридизованной с комплементарной цепью, то секвенирование может начинаться с этой точки с использованием полимеразы с замещающей активностью без необходимости в исходной стадии денатурации. В частности, секвенирование с замещением цепи можно использовать в сочетании с образованием матрицы путем расщепления с помощью вносящих одноцепочечные разрывы эндонуклеаз или путем гидролиза лишенного азотистого основания сайта с помощью эндонуклеазы, термической или щелочной обработки.
Способы секвенирования
[0141] В некоторых вариантах осуществления твердую подложку и способы, описанные в настоящем документе, можно использовать для определения нуклеотидной последовательности полинуклеотида. В таких вариантах осуществления способ может включать стадии: (а) контактирования полинуклеотидполимеразы с линеаризованными кластерами полинуклеотидов, прикрепленными к поверхности субстрата (например, через любое одно из полимерных или гелевых покрытий, описанных в настоящем документе); (b) подачу нуклеотидов на поверхность субстрата таким образом, что генерируется детектируемый сигнал, когда один или несколько нуклеотидов используются полинуклеотидполимеразой; (c) обнаружение сигналов на одном или нескольких прикрепленных полинуклеотидах (или на одном или нескольких кластерах, полученных из прикрепленных полинуклеотидов); и (d) повторения стадий (b) и (c), в результате чего определяется нуклеотидную последовательность присоединенного к субстрату полинуклеотида.
[0142] Секвенирование нуклеиновой кислоты можно использовать для определения нуклеотидной последовательности полинуклеотида с помощью различных процессов, известных в данной области. В предпочтительном способе используют секвенирование путем синтеза (SBS) для определения нуклеотидной последовательности полинуклеотида, прикрепленного к поверхности субстрата (например, через любое одно из полимерных покрытий, описанных в настоящем документе). В таком способе один или несколько нуклеотидов добавляют к матричному полинуклеотиду, который ассоциирован с полинуклеотидполимеразой. Полинуклеотидполимераза включает один или несколько нуклеотидов в новосинтезированную цепь нуклеиновой кислоты, которая комплементарна полинуклеотидной матрице. Синтез инициируется олигонуклеотидным праймером, который комплементарен участку матричного полинуклеотида или участку универсальной или неизменяемой нуклеиновой кислоты, которая ковалентно связана с одним концом матричного полинуклеотида. Поскольку нуклеотиды включаются в зависимости от последовательности матричного полинуклеотида, то генерируется детектируемый сигнал, который позволяет определить, какой нуклеотид был включен во время каждой стадии процесса секвенирования. Таким образом, может быть получена последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарная по меньшей мере участку матричного полинуклеотида, что позволяет определить нуклеотидную последовательность по меньшей мере участка матричного полинуклеотида.
[0143] Проточные ячейки обеспечивают удобный формат для размещения массива, который получен способами по настоящему изобретению, и который секвенируют путем синтеаза (SBS) или используют в другой методике обнаружения, которая включает повторяющуюся доставку реагентов в циклах. Например, чтобы инициировать первый цикл SBS, один или несколько меченых нуклеотидов, ДНК-полимераза и т.д. могут входить в/проходить через проточную ячейку, в которой находится массив нуклеиновых кислот, созданный способами, изложенными в настоящем документе. Те сайты массива, в которых удлинение праймера вызывает включение меченого нуклеотида, могут быть детектированы. Необязательно, нуклеотиды могут дополнительно включать обратимое свойство терминации, которое прекращает дальнейшее удлинение праймера после добавления нуклеотида к праймеру. Например, нуклеотидный аналог, имеющий обратимый терминаторный фрагмент, может быть добавлен к праймеру так, что последующее удлинение не может происходить до тех пор, пока не будет доставлен деблокирующий агент для удаления фрагмента. Таким образом, для вариантов осуществления, в которых используется обратимая терминация, деблокирующий реагент может быть доставлен в проточную ячейку (до или после обнаружения). Промывки могут проводиться между различными стадиями доставки. Затем цикл можно повторить n раз, чтобы удлинить праймер на n нуклеотидов, тем самым обнаруживая последовательность длиной n. Примеры процедур SBS, жидкостных систем и платформ детекции, которые могут быть легко адаптированы для использования с массивом, полученным способами настоящего изобретения, описаны, например, в Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7292992; US 7211414; US 7315019; US 7405281 и US 2008/0108082, каждый из которых полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
[0144] В некоторых вариантах осуществления вышеописанного способа, в которых используется проточная ячейка, в проточной ячейке присутствует только один тип нуклеотида на протяжении одной «проточной» стадии. В таких вариантах осуществления нуклеотид может быть выбран из группы, состоящей из dATP, dCTP, dGTP, dTTP и их аналогов. В других вариантах осуществления описанного выше способа, в которых используется проточная ячейка, в проточной ячейке присутствует множество различных типов нуклеотидов на протяжении одной «проточной» стадии. В таких способах нуклеотиды могут быть выбраны из dATP, dCTP, dGTP, dTTP и их аналогов.
[0145] Определение нуклеотида или нуклеотидов, включенных во время каждой проточной стадии, для одного или нескольких полинуклеотидов, связанных с полимерным покрытием на поверхности субстрата, присутствующего в проточной ячейке, достигается путем детекции сигнала, генерируемого на или рядом с полинуклеотидной матрицей. В некоторых вариантах осуществления вышеописанных способов детектируемый сигнал включает оптический сигнал. В других вариантах осуществления детектируемый сигнал включает неоптический сигнал. В таких вариантах осуществления неоптический сигнал включает изменение рН на одной или нескольких полинуклеотидных матрицах или вблизи них.
[0146] Варианты приложения и применения субстратов по настоящему изобретению были проиллюстрированы в настоящем документе в отношении нуклеиновых кислот. Однако будет понятно, что другие анализируемые вещества могут быть присоединены к подложке, изложенной в настоящем документе, и проанализированы. Один или несколько анализируемых веществ могут присутствовать в или на подложке по настоящему изобретению. Субстраты по настоящему изобретению особенно полезны для обнаружения анализируемых веществ или для проведения синтетических реакций с анализируемыми веществам. Таким образом, любой из множества анализируемых вещества, которые должны быть обнаружены, охарактеризованы, модифицированы, синтезированы и т.п., может присутствовать в или на подложке по настоящему изобретению. Типичные анализируемые вещества включают, но не ограничиваются ими, нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК или их аналоги), белки, полисахариды, клетки, антитела, эпитопы, рецепторы, лиганды, ферменты (например, киназы, фосфатазы или полимеразы), низкомолекулярные соединения, являющиеся потенциальными лекарственными соединениями, и т.п. Субстрат может включать несколько различных видов из библиотеки анализируемых соединений. Например, они могут представлять собой различные антитела из библиотеки антител, имеющие различные последовательности нуклеиновые кислоты из библиотеки нуклеиновых кислот, имеющие различную структуру и/или функцию белки из белковой библиотеки, потенциальные лекарственные средства из комбинаторной библиотеки низкомолекулярных соединений и т.п.
[0147] В некоторых вариантах осуществления анализируемые соединения могут быть распределены по элементам на подложке, так что их можно индивидуально определять. Например, одна молекула каждого анализируемого вещества может присутствовать в каждом элементе. В альтернативном варианте анализируемые вещества могут присутствовать в виде колоний или популяций, так что отдельные молекулы не обязательно разделяются. Колонии или популяции могут быть однородными в отношении содержания только одного вида анализируемого вещества (хотя и в нескольких копиях). Взяв за основу нуклеиновые кислоты, каждый элемент на субстрате может включать колонию или популяцию нуклеиновых кислот, и каждая нуклеиновая кислота в колонии или популяции может иметь одинаковую нуклеотидную последовательность (одноцепочечную или двухцепочечную). Такие колонии могут быть созданы с помощью кластерной амплификации или мостиковой амплификации, как изложено ранее в настоящем документе. Множественные повторы последовательности-мишени могут присутствовать в одной молекуле нуклеиновой кислоты, такой как конкатемер, созданный с использованием процедуры амплификации по принципу катящегося кольца. Таким образом, элемент на подложке может содержать несколько копий одного вида анализируемого вещества. В альтернативном варианте колония или популяция анализируемых веществ, которые находятся в одном элементе, могут включать два или несколько разных видов. Например, одна или несколько лунок на подложке могут содержать смешанную колонию, имеющую два или несколько различных видов нуклеиновых кислот (то есть молекулы нуклеиновых кислот с разными последовательностями). Два или несколько видов нуклеиновых кислот в смешанной колонии могут присутствовать в незначительных количествах, например, позволяя обнаруживать более одной нуклеиновой кислоты в смешанной колонии.
ПРИМЕРЫ
[0148] Дополнительные варианты осуществления изобретения раскрыты более подробно в нижеследующих примерах, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема формулы изобретения.
Общий протокол подготовки поверхности
Силанизация очищенных проточных ячеек HiSeq ®
[0149] Функционализированные норборненом проточные ячейки получают способом химического осаждения из газовой фазы (CVD) с использованием или камеры для силанизации YES (Yield Engineering Systems) или эксикатора. Процесс CVD обычно проводится при температуре 60°С в течение 1-24 часа.
Ковалентное покрытие поверхности ячейки сополимером PAZAM
[0150] Для покрытия силанизированной проточной ячейки различными соединениями могут использоваться несколько вариантов инструментов. Например, для выполнения этих операций может использоваться полностью автоматизированная система cBot для генерации клональных кластеров для секвенирования Illumina (доступная от Illumina). В типичной процедуре проточную ячейку сначала промывают IPA/H2O (1:1; 100 мкл/мин, 2 мин). Затем через каналы промывают деионизированной водой (100 мкл/мин, 2 мин). Готовят аликвоту 0,5%-го раствора PAZAM (водн.) (достаточно для 8 каналов). Полимер поступает в каналы (100 мкл/мин, 2 мин). Стадия покрытия и пришивки PAZAM завершается в течение 1 часа при 60°C. После завершения этого этапа каналы промывают водой, подготавливая их к стадии последующего покрытия. После завершения стадий покрытия полимером проточную ячейку можно хранить при 4°C в буфере (например, в цитратно-солевом буфере (SSC)). В качестве альтернативы, стадия покрытия полимером может быть завершена сразу после нанесения покрытия PAZAM.
Ковалентная сшивка с поверхностью проточных ячеек с нанесенным покрытием PAZAM и контроль качества (QC)
[0151] В этом протоколе описана процедура ковалентной сшивки с поверхностью проточной ячейки HiSeq® с использованием системы cBot (ILMN). Процедура ковалентной сшивки позволяет получить проточную ячейку с поверхностью, у которой аллил-модифицированный олигопраймер с последовательностью P5 и диол-модифицированный секвенсовый праймер с последовательностью P7 ковалентно присоединены к покрытию PAZAM в соотношении приблизительно 1:1. Типичную смесь для ковалентной сшивки приготавливают в соответствии со стандартной процедурой Illumina, и ее приготовление зависит от используемой концентрации праймеров. Типичная используемая концентрация праймеров составляет около 1-20 мкМ, при этом плотность праймеров составляет 20-250000 единиц (сигналов флуоресценции). Стадию контроля (QC) выполняет в соответствии со стандартной процедурой Illumina с использованием системы cBot перед тем, как получить изображения на приборе Typhoon (флуоресцентный планшетный сканер).
[0152] После QC каналы проточной ячейки промывают 5x SSC-буфером (60 мкл/мин, общий объем составляет по 300 мкл на проточную ячейку), чтобы удалить гидроксид натрия (используемый для проведения стадии дегибридизации).
[0153] Затем проточную ячейку с ковалентно пришитыми праймерами хранят при 4°С до использования в последующих биохимических процессах (кластеризации, секвенировании).
ПРИМЕР 1
[0154] В этом примере модифицированный олигонуклеотид, содержащий модифицированный аналог нуклеозида тимина, использовали в качестве специфического сайта для эффективного расщепления химическими реагентами в биосовместимых условиях, не влияя на свойства спаривания дуплексов и свойства удлинения с помощью ПЦР.
[0155] В частности, олигонуклеотид содержит один модифицированный Т-нуклеозид с винильной группой, присоединенной в положении 5'-С. При обработке раствором Na2PdCl4 или (PdAllylCl)2 и THP в водном буфере (in situ с образованием комплекса палладия (0)) олигонуклеотид расщепляется по позиции модифицированного Т с получением в результате более короткого олигонуклеотида, содержащего фосфатную группу на 3'-конце. Эта реакция проиллюстрирована на схеме 1 ниже, где Nu обозначает нуклеофил.
Схема 1.
[0156] Синтез модифицированного Т-нуклеозид-фосфорамидита описан на схеме 2. Исходное вещество является коммерчески доступным. Большинство стадий реакции давали выход более 70%. Сообщалось также об отличном выходе конечного ДНК-олигонуклеотида, содержащего модифицированный Т-нуклеозид.
Схема 2.
[0157] 5'-O-диметокситритилтимидин-3'-O-TBDPS (2). 5'-O-диметокситритилтимидин (1) (15 г, 1 экв., 27,54 ммоль) сушили в высоком вакууме в течение 1 часа. Безводный DCM (300 мл) добавляли в атмосфере азота. К этому раствору добавляли сначала имидазол (4,69 г, 2,5 экв., 69 ммоль) в виде твердого вещества, затем трет-бутилдифенилсилилхлорид (9,1 мл, 1,3 экв., 35,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 1 часа. Завершение реакции проверяли с помощью ТСХ. Реакцию гасили насыщ. раствором NaHCO3 (100 мл) и перемешивали в течение 5 минут. DCM (100 мл) добавляли к реакционной смеси, и водный слой экстрагировали DCM 2 раза. Органическую фазу промывали насыщ. NaHCO3 (200 мл), затем насыщ. солевым раствором (200 мл). После сушки объединенных органических фаз над MgSO4 растворитель удаляли в вакууме, и осадок очень хорошо высушивали в вакууме, получая соединение 2 в виде белой/светло-желтой пены. Соединение 2 использовали неочищенным в следующей стадии. LC-MS (ES и CI): (-ve) m/z 782 (M-H+), (-ve) m/z 817 (M+Cl-). 1H ЯМР (CDCl3) δ 0,99 (с, 9H, tBu), 1,27 (с, 3H, Me), 1,96-2,06 (м, 1H, H-2'), 2,25-2,35 (м, 1H, H-2'). ), 2,80 (дд, J=4, 12 Гц, 1H, H-5'), 3,15 (дд, J=4, 12 Гц, 1H, H-5'), 3,71 (с, 6H, OMe), 3,96-4,01 (м, 1H, H-4'), 4,45-4,50 (м, 1H, H-3'), 6,42 (дд, J=8, 12 Гц, 1H, H-1'), 6,79-6,72 (м, 4H ароматика), 7,68-7,00 (м, 24H, ароматика+CH), 8,01 (с, 1H, NH).
[0158] 3'-O-TBDPS-тимидин (3). Неочищенный 5'-O-диметокситритилтимидин-3'-O-TBDPS (2) (максимум 27,54 ммоль) растворяли в безводном МеОН (300 мл) в атмосфере азота. Добавляли TFA (10 об.%, 30 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 2 часов 30 минут. Завершение реакции подтверждали ТСХ. Реакцию гасили насыщ. NaHCO3 (200 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. МеОН удаляли в вакууме. Остаточную смесь разбавляли DCM (300 мл) и отделяли от насыщ. NaHCO3. Водную фазу дважды экстрагировали DCM, затем органические фазы промывали насыщ. NaHCO3, сушили над MgSO4 и концентрировали в вакууме. Неочищенный материал очищали на колонке (Biotage, 100 г Ultra-Si, PE/EtOAc), получая соединение 3 в виде белой пены (13,15 г, 99%). LC-MS (ES и CI): (-ve) m/z 479 (M-H+), (+ve) m/z 481 (M+H+). 1H ЯМР (d6 DMSO) δ 1,46 (с, 9H, tBu), 2,15 (с, 3H, Me), 2,35-2,53 (м, 2H, H2'), 3,57-3,67 (м, 1H, H5'), 3,77-3,87 (м, 1H, H5'), 4,30-4,36 (м, 1H, H4'), 4,80-4,86 (м, 1H, H3'), 5,41 (т, J=5,2 Гц, 1H), 6,72 (дд J=8,7, 5,7 Гц, 1Н), 7,82-7,94 (м, 6Н, ароматика+СН), 8,00-8,05 (м, 5Н, ароматика), 11,73 (с, 1Н, NH).
[0159] Альтернативный синтез Соединения (3). 5'-O-диметокситритилтимидин (1,40 г, 73,4 ммоль) обрабатывали TBDPSCl (1,3 экв.) и имидазолом (2,5 экв.) в DCM (0,127 М) при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем PTSA (3 экв.) в метаноле (0,097 М) в течение 1 часа, получая соединение (3) со 100%-м выходом, в одном реакционном сосуде. Никакой обработки не требовалось после этапа силилирования, стадии выпаривания растворителя и сушки в течение ночи были исключены, и реакцию проводили в воздушной среде. Использование PTSA вместо TFA уменьшало катализируемую кислотой перегруппировку рибозы в тимидиновом нуклеозида.
[0160] 3'-O-TBDPS-5'-альдегид-тимидин (4). 3'-O-TBDPS-тимидин (3) (5,16 г, 1 экв., 10,75 ммоль) сушили в высоком вакууме в течение ночи, а также c 4 MS (молекулярное сито 4
). Затем к соединению 3 и 4
MS в атмосфере азота добавляли безводный DCM (250 мл) и затем охлаждали до 4°C на льду. Периодан Десса-Мартина добавляли порциями в атмосфере азота (3 раза по 1,823 г, 1,2 экв., 12,9 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при 4°C в атмосфере азота в течение 1 часа 30 минут. Реакцию проверяли с помощью LC-MS. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры, и реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 4 часов или до завершения реакции. После завершения к реакционной смеси добавляли раствор Na2SO3 (100 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. 2 фазы разделяли, и водную фазу экстрагировали 2 раза с помощью DCM. Органическую фазу затем промывали Na2CO3 и насыщ. Na2CO3, сушили над MgSO4 и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество сушили в высоком вакууме в течение ночи, получая продукт, готовый к следующей стадии. Для лучшего осушения можно провести со испарение с толуолом. LC-MS (ES и CI): (-ve) m/z 477 (M-H+), (-ve) m/z 513 (M+Cl-), (+ve) m/z 479 (M+H+), (+ve) m/z 501 (М+Na+); (-ve) m/z 495 (гидрат-H+), (+ve) m/z 519 (гидрат+Na+).
[0161] Альтернативный синтез альдегида (4). Соединение (3, 0,5 г) обрабатывали EDC (3 экв.) и DCA (0,5 экв.) в DMSO при комнатной температуре в течение 6 часов, чтобы получить соединение (4) посредством окисления Пфитцнера-Моффата, без чрезмерного окисления до карбоновой кислоты, которое наблюдалось при способе с периодинаном Десса-Мартина (и требовало добавления большого избытка реагента Гриньяра на последующей стадии, чтобы погасить примесь карбоновой кислоты).
[0162] 3'-O-TBDPS-5'-винилтимидин (5). 3'-O-TBDPS-5'-альдегид-тимидин (4) (5,16 г, 1 экв., 10,75 ммоль) сушили в высоком вакууме в течение ночи, а также c 4 MS. Затем к соединению 3 и 4
MS в атмосфере азота добавляли безводный THF (150 мл). Раствор 1М винилбромида магния в THF (21,5 мл, 2 экв., 21,5 ммоль) добавляли очень медленно при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 2 часов и проверяли с помощью LC-MS. При необходимости можно добавить по каплям немного дополнительного винилбромида магния (0,3 экв., 3,22 мл), и реакционную смесь перемешивали еще 1 час. После завершения к реакционной смеси добавляли 1 М раствор АсОН в воде (60 мл, рН=6) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Реакционную смесь разбавляли DCM и разделяли две фазы. Водную фазу экстрагировали 2 раза DCM. Органические фазы затем промывали 2 раза насыщ. NaHCO3, сушили над MgSO4 и концентрировали в вакууме. Остаток очищали на колонке (Biotage, 100 г kpSi, PE/EtOAc), получая соединение 5 в виде кремовой пены (2,01 г, 37% за 2 этапа). LC-MS (ES и CI): (-ve) m/z 505 (M-H+), (-ve) m/z 541 (M+Cl-), (+ve) m/z 507 (M+H+). 1H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ 1,01 (д, J=10,1 Гц, 9H, tBu), 1,80 (с, 3H, Me), 2,02-2,22 (м, 2H, H2'), 3,48-3,54 (м, 0,6Н, Н5'), 3,81 (т, J=2,2 Гц, 0,6Н, Н4'), 3,97-4,02 (м, 0,4Н, Н4'), 4,13-4,22 (м, 0,4Н, Н5'), 4,33-4,50 (дм, 1H, H3'), 4,82-5,17 (м, 2H, CH2=CH-), 5,24-5,43 (м, 0,4H, CH2=CH-), 5,52-5,75 (м, 0,6H), CH2=CH-), 6,04-6,29 (ддд, J=21,2, 8,3, 6,0 Гц, 1H, H1'), 7,26-7,46 (м, 7H, аром.+CH), 7,50-7,66 (м, 4H, аром.) 8,23 (с, 1Н, NH).
[0163] Альтернативный синтез аллилового спирта (5). Альдегид (4) обрабатывали винилхлоридом магния (2,5 экв.) в THF при комнатной температуре с получением соединения (5). Использование хлористого реагента вместо бромида уменьшало производство бромированного аналога желаемого продукта (14% по вышеуказанному способу) без введения хлоридного варианта желаемого продукта.
[0164] 3'-O-TBDPS-5'-винил-5'DMT-тимидин (6). 3'-O-TBDPS-5'-винилтимидин (5) (2,01 г, 1 экв., 3,97 ммоль) сушили в высоком вакууме в течение ночи. Добавляли AgNO3, и твердое вещество сушили в высоком вакууме в течение еще 30 минут. К реакционной смеси добавляли безводный DCM в атмосфере азота, затем коллидин (1,05 мл, 2 экв., 7,94 ммоль) и, наконец, DMT-Cl (2,02 г, 1,5 экв., 5,96 ммоль) в виде твердого вещества. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 3 часов; завершение проверяли с помощью ТСХ (PE/EtOAc, 6:4+1% NEt3). Затем реакционную смесь разбавляли DCM и фильтровали на целите, а твердое вещество промывали дополнительным количеством DCM. Затем раствор разделяли с использованием с 1% H2SO4 (60 мл) и экстрагировали DCM. Органические фазы промывали 2 раза насыщ. NaHCO3, сушили над MgSO4 и концентрировали Его использовали без дальнейшей очистки на следующем этапе. LC-MS (ES и CI): (-ve) m/z 807 (M-H+), (+ve) m/z 809 (M+H+).
[0165] Альтернативная методика. Раствор соединения (5) (6,7 г, 13,2 ммоль) и 2,3,5-коллидина в безводном DCM сушили в течение 30 мин на молекулярном сите. Затем полученный раствор добавляли в колбу, содержащую 4,4'-диметокситрифенилметилхлорид (6,7 г) и молекулярное сито. Добавляли AgNO3, и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Полученную смесь разбавляли DCM (40 мл) и фильтровали через диатомит, промывая DCM (3×40 мл). К фильтрату добавляли МеОН (240 мл), и смесь перемешивали в течение 10 мин, затем переносили в делительную воронку, промывали насыщ. водн. NaHCO3 (2×400 мл), сушили (Na2SO4) и концентрировали в вакууме, получая неочищенный продукт в виде желтой пены.
[0166] 5'-Винил-5'DMT-тимидин (7). 3'-O-TBDPS-5'аллил-5'DMT-тимидин (6) (1 экв., 3,97 ммоль из предыдущего этапа) высушивали в высоком вакууме. Безводный THF (12 мл) добавляли в атмосфере азота и охлаждали до 4°С. Раствор 1М TBAF в THF (4,37 мл, 1,1 экв., 4,37 ммоль) добавляли по каплям при 4°С. Через 5 минут при 4°С реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в атмосфере азота в течение 3 часов. За завершением реакции следили с помощью ТСХ (PE/EtOAc, 3: 7+1% NEt3). Реакционную смесь разбавляли EtOAc и разделяли с насыщ. NaHCO3. Водную фазу экстрагировали EtOAc, затем органическую фазу промывали насыщ. NaHCO3, затем насыщ. солевым раствором, сушили над MgSO4 и концентрировали в вакууме. Остаток очищали на колонке (Biotage, 25 г KpSi, PE/EtOAc+1% NEt3), получая соединение 7 в виде белой пены (1,81 г, 80% за 2 стадии). LC-MS (ES и CI): (-ve) m/z 569 (M-H+), (+ve) m/z 571 (M+H+). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,46 (с, 1H, Me), 1,65 (с, 2H, Me), 1,97-2,13 (м, 2H, H2'), 3,64 (м, 1H, H4') 3,85 (дд, J=8,0, 4 Гц, 0,4H, H5'), 3,92 (дд, J=8,0, 4 Гц, 0,6H, H5'), 4,31-4,45 (м, 1H, H3'), 4,55-4,86 (м, 2H, CH=CH2-), 5,27 (дд, J=7,4, 4,8 Гц, 1H, OH), 5,52-5,71 (м, 1H, CH=CH2-), 6,11 (дт, J=8,1, 5,8 Гц, 1H, H1'), 6,86 (дд, J=8, 4 Гц, 4H, аром.), 7,13-7,35 (м, 7H, аром.+CH), 7,40-7,50 (м, 3H, аром.), 11,35 (с, 1Н).
[0167] 5'-Винил-5'-DMT-тимидин-фосфорамидит (8). 5'-Винил-5'-DMT-тимидин (800 мг, 1,4 ммоль) сушили в высоком вакууме. Безводный DCM (7 мл) добавляли в атмосфере азота и перемешивали с молекулярным ситом в течение 10 минут при комнатной температуре. К раствору добавляли основание Хунига (0,74 мл, 4,2 ммоль) и затем 2-цианоэтил-N, N-диизопропилхлорфосфорамидит (407 мкл, 0,52 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 3 часов. За завершением реакции следили с помощью ТСХ (PE/EtOAc, 4:6). Реакцию концентрировали в вакууме. Остаток очищали на колонке (Biotage, 25 г KpSi, PE/EtOAc+1% NEt3), получая соединение 8 в виде белой пены (930 мг). LC-MS (ES и CI): (-ve) m/z 770 (M-H+), (+ve) m/z 771 (M+H+). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,96-1,27 (м, 21H), 1,50 (д, J=5,9 Гц, 1H), 1,66 (с, 3H), 2,02-2,37 (м, 3H), 2,58-2,74 (м, 2H), 2,78 (тд, J=5,8, 3,9 Гц, 1H), 3,46-3,69 (м, 6H), 3,76-3,93 (м, 2H), 3,96-4,10 (м, 2H), 4,61 (ддд, J=17,5, 14,2, 8,6 Гц, 2H), 4,68-4,98 (м, 3H), 5,43-5,79 (м, 1H), 6,04 (дт, J=9,6, 5,1 Гц, 1H), 6,13 (дт, J=10,7, 6,9 Гц, 0H), 6,85 (ддт, J=8,2, 5,2, 2,4 Гц, 6H), 7,09-7,34 (м, 11H), 7,34-7,50 (м, 4H), 11,37 (д, J=6,1 Гц, 1H). 31P ЯМР (162 МГц, DMSO) δ 147,94, 147,16, 147,03.
Анализ эффективности расщепления
[0168] Эффективность расщепления оценивали на поверхности PAZAM с высокой плотностью праймеров (40-60 тыс.). Проточную ячейку HiSeq® (неструктурированную) получали в соответствии со стандартными процедурами, описанными в настоящем документе. Силан, полученный из норборнена, наносили на поверхность подложки с использованием способа CVD, после чего проводили клик-реакцию сочетания полимера (PAZAM) с поверхностью подложки, после чего следовала вторая клик-реакция сочетания, чтобы покрыть поверхность полимера модифицированными олигонуклеотидами P7, содержащими аллил T-нуклеозидный аналог (5'-алкин-TTTTTTTTTXCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT, где X указывает сайт, где был включен модифицированный Т-нуклеозид, описанный выше).
[0169] Модифицированными олигонуклеотидами P7 покрывали проточную ячейку PAZAM с плотностью, сходной таковой для стандартных олигонуклеотидов P7. Эффективность реакции для модифицированных олигонуклеотидов P7 также была аналогична таковой для стандартных 5'-функционализированных олигонуклеотидов P5 и P7. Поверхность проточной кюветы обрабатывали 1 мМ Na2PdCl4, 10 мМ THF в 1x EA-смеси для включения (содержащей 50 мМ этаноламин-HCl (рН 9,9), 50 мМ NaCl и 0,05% Chaps) при 60°C в течение 10 минут. TET-QC-анализ использовали для демонстрации успешного отщепления аллил-Т-модифицированных олигонуклеотидов P5 с поверхности после обработки генерированным in situ комплексом Pd(0).
[0170] На фиг.2А приведены полученные с помощью флуоресцентного сканера Typhoon изображения поверхности проточной ячейки до и после обработки Pd(0). На фиг.2B показано изменение плотности праймеров до и после обработки Pd(0), для сравнения поверхности проточной ячейки, обработанной модифицированными олигонуклеотидами P5, со стандартным контролем. Как при низкой плотности праймеров, так и при высокой плотности праймеров, для обработанной Pd(0) поверхности проточной ячейки, покрытой модифицированными олигонуклеотидами P5, было показано существенное изменение интенсивности флуоресценции. Результаты показали очень эффективное расщепление (~95%, по флуоресцентному анализу) с использованием этого способа. Для сравнения, стандартная поверхность проточной ячейки с олигонуклеотидом P5 не показала значительных изменений интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что стандартные олигонуклеотиды P5 не расщеплялись комплексом Pd(0).
Анализ результатов после проведения секвенирования
[0171] Способность вышеописанного модифицированного аллил-T-нуклеозида подвергаться эффективному расщеплению дополнительно анализировали путем проведения короткого цикла секвенирования. В этом эксперименте проточные ячейки были изготовлены в соответствии с способом, аналогичным описанному выше. Таким образом, проточные ячейки, покрытые PAZAM, были покрыты аллил-Т-модифицированными Р5-алкил-олигонуклеотидами и стандартными Р7-алкин-олигонуклеотидами при различной плотности праймеров на поверхности. Чтобы обеспечить эффективный повторный синтез, положение аллильной модификации было смещено дальше к 3'-концу модифицированного олигонуклеотида P5. Последовательность покрывающих праймеров, используемых для изготовления проточной ячейки для SBS, приведена ниже:
P5: 5'-алкин-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC
P7: 5'-алкин-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-oxo G)AT
Х=аллильная модификация, описанная на схеме 1.
[0172] Типичные условия расщепления включают инкубацию поверхности, покрытой аллил-P5, с раствором Na2PdCl4/THP при 60°C в течение 10 минут. Обработанные Pd(0) PAZAM-поверхности были стабильны в этих условиях и могут выдерживать несколько сотен циклов секвенирования. Кроме того, не было обнаружено никаких других побочных реакций, и последующее расщепление олигонуклеотидов Р7, которое косвенно определяется посредством РЕТ-ресинтеза, остается неизменным, подтверждая ортогональность и специфичность аллильного подхода.
[0173] На фиг.3А представлена гистограмма, демонстрирующая результаты QC-анализа флуоресценции красителя TET на поверхности (TET-QC), полученные для проточной неструктурированной ячейки с высокой плотностью праймеров. В каналах 1-4 поверхность была покрыта аллилмодифицированными олигонуклеотидами P5 и стандартными олигонуклеотидами P7. В каналах 5-8 поверхность была покрыта стандартными олигонуклеотидами P5/P7. Результаты были сопоставимы для модифицированных и стандартных олигонуклеотидов P5. На фиг.3B приведены полученные с помощью флуоресцентного сканера Typhoon изображения поверхности проточной ячейки после TET-QC, описанного на фиг.3A. Также не было обнаружено видимой разницы между каналами, так как оба не показали детектируемого сигнала. Предварительные данные позволили предположить, что между модифицированными олигонуклеотидами P5 и стандартными олигонуклеотидами P5 нет особых различий с точки зрения плотности кластеров.
[0174] Было также отмечено, что раствор для расщепления, содержащий Na2PdCl4/THP, был стабильным при хранении при комнатной температуре в течение нескольких дней, и старые смеси все еще могут использоваться для расщепления аллил-модифицированных олигонуклеотидов P5.
ПРИМЕР 2
[0175] В этом примере способ линеаризации с использованием Pd(0) и метод расщепления диолов, описанные в настоящем документе, были протестированы на проточной ячейке нового типа, покрытой праймерами P15/P17, и данные секвенирования с MiSeq® (сконфигурированном как 2-канальный прибор) собирали и сравнивали с данными для стандартной проточной ячейки, покрытой праймерами P5/P7, и использовали ферментативную линеаризацию, описанную на фиг.1. Новая проточная ячейка и стандартная проточная ячейка были покрыты полимером PAZAM, и плотность праймеров на поверхности должна была составлять около 200 тыс. для обоих типов праймеров.
[0176] Секвенирование проводили для обеих проточных ячеек со смесью для включения NovaSeq™, и визуализацию выполняли при 20°C. Перед каждым шагом линеаризации (Прочтение 1 и Прочтение 2) проточные ячейки обрабатывали экзонуклеазой для удаления любого избытка неиспользованных поверхностных праймеров. Для стандартных поверхностных праймеров (P5/P7) линеаризацию проводили в Прочтении 1 с использованием фермента USER (LMX1) при 38°C в течение 20-минутной инкубации и в Прочтении 2 с использованием фермента FpG при 40°C в течение 20-минутной инкубации. Для новых поверхностных праймеров P15/P17 линеаризацию проводили в Прочтении 1 с использованием палладиевой смеси, содержащей THP и аскорбат натрия (6 мМ/60 мМ/6 мМ) при 60°C в течение 2-минутной инкубации, и в Прочтении 2 с использованием смеси периодата натрия при 20°С в течение 10 минут. Секвенированная библиотека, представленная в этих данных, представляет собой библиотеку из фага PhiX, и количество прогонов составляло 2×151 циклов. Результаты секвенирования приведены в таблице ниже.
[0177] Данные секвенирования показывают, что химическая линеаризация с помощью Pd(0) хорошо работала при секвенировании, и первичные показатели очень похожи по сравнению со стандартными. Данные по кластерам, прошедшим фильтр (% PF), эмпирической фазировке/пре-фазировке (Ph/Pph) прочтений 1 и 2 (R1 и R2), % выравнивания для R1 и R2 были равными для поверхностных праймеров P5/P7 и P15/P17. Частота ошибки была немного выше в Прочтении 1 для проточной ячейки, покрытой P15/P17, но все еще была достаточно хорошей (как показано на фиг.4), и, кроме того, возможна вариабельность между проточными ячейками. Процент ошибок в Прочтении 2 был сопоставимым. Кроме того, при использовании проточной ячейки нового типа время, необходимое для линеаризации, уменьшается в 2 раза для Прочтения 2 и в 10 раз для Прочтения 1.
ПРИМЕР 3
[0178] В этом примере аллил-T-нуклеозид, описанный в примере 1, может быть дополнительно помечен детектируемой меткой (то есть флуоресцентной меткой), чтобы дополнительно оптимизировать текущий рабочий процесс производства Illumina. Как только меченный красителем аллил-T-нуклеозид включается в олигонуклеотид P5, он дает возможность прямого количественного определения реакции покрытия сразу после завершения. В текущем процессе этот этап выполняется как отдельный гибридизационный анализ.
[0179] Реакция расщепления с помощью Pd(0) с использованием меченного красителем модифицированного T-нуклеотида проиллюстрирована на схеме 3 с использованием способов синтеза, аналогичных тем, которые описаны в предыдущих примерах.
Схема 3
ПРИМЕР 4
[0180] В этом примере реагент на основе диольного линкера получали, как показано на схеме 4. Способ улучшает синтез, описанный в патенте США № 8715966.
Схема 4
[0181] Диол-1. В данном способе исключен DMF в качестве растворителя при синтезе диола-1. DMF усложняет водную экстракцию из-за образования эмульсий и нежелательного распределения продукта в водной фазе, и в ранее описанном процессе его удаление до обработки занимало много времени. Предыдущую смесь DMF/DCM заменяли EtOAc, что сокращало время процесса с 3 до 1-2 дней (включая хроматографию). Кроме того, образование бис-тритилированного побочного продукта снижало выход по предшествующему способу. Изменение порядка добавления реагентов от порционного добавления твердого DMTr-Cl к смеси гександиол/DIPEA на капельное добавление жидкого DIPEA к смеси гександиол/DMTr-Cl улучшило селективность реакции для желаемого продукта примерно на 10%. В некоторых вариантах осуществления продукт этой реакции может использоваться неочищенным без хроматографии для удаления DMTr-OH и бис-тритилированного побочного продукта.
[0182] Диол-3. Предшествующий способ окисления с использованием TPAP/кат. NMO приводил к переокислению до соответствующей карбоновой кислоты и требовал до 3-4 дней. В настоящем документе TPAP/NMO были заменены на TEMPO/гипохлорит натрия водн. в двухфазной смеси DCM и водн. NaHCO3. Водн. гипохлорит натрия добавляли по каплям к смеси оставшихся реагентов, и реакция была завершена после завершения добавления гипохлорита натрия. Продукт выделяли водной экстракцией с минимальным переокислением и выходами 66-92% и более быстрым общим процессом (1,5 дня). В других вариантах осуществления синтез диола-3 и диола-4 можно сократить для удаления стадии промежуточной хроматографии. Избыток tBuOK может потребоваться для нейтрализации остаточной карбоновой кислоты в исходном веществе.
[0183] Диол-2. Предыдущий способ синтеза диола-2 включал кипячение с обратным холодильником в течение 48 часов с некоторыми манипуляциями в течение 36 часов для обеспечения полной реакции. Увеличение концентрации реакции позволило сократить время кипячения с обратным холодильником с 48 до 12-24 часов. В предыдущем протоколе неочищенный диол-2 экстрагировали водой. Требовалось удаление воды (поскольку последующий этап чувствителен к влаге), что занимало много времени при масштабировании процесса. Данная стадия была улучшена за счет экстракции диола-2 в DCM и промывки водн. NaHCO3 для удаления остаточной уксусной кислоты и минимизации времени удаления растворителя. Общее время процесса сократилось с 3 дней до 2 дней. Продукт хранили в виде исходного раствора в DCM. Раствор хранили над молекулярным ситом 3А в течение ночи до реакции получения диола-4.
[0184] В альтернативном варианте, диол-2 может быть гидролизован до соответствующего спирта для упрощения очистки. Затем спирт будет использоваться на последующем этапе для непосредственного получения диола-4.
[0185] Диол-5. Стадия хроматографической очистки была удалена, что позволило сэкономить 1 день в продолжительности процесса. Кроме того, DMF может быть изменен на DCM для повышения эффективности процесса за счет уменьшения объемов растворителя/промывающего раствора во время обработки водой.
[0186] Диол-6. Стадия хроматографической очистки может быть удалена.
[0187] Диол-7. Синтез диола-7 включает два сокращаемых процесса: этерификацию и десилилирование с использованием TBAF. В ранее описанном процессе значительная миграция 1,4-ацетила наблюдалась во время десилилирования с использованием TBAF, что приводило к образованию значительных количеств нежелательного побочного продукта, диола-7М:
.
[0188] Это вещество снижало общий выход и чистоту диола-7. Кроме того, перенос диола-7М в последующую стадию приводит к образованию диола-8М с фосфорамидитом на вторичном, а не на первичном спирте. Включение в праймер приведет к нерасщепляемому линкеру. В настоящем способе стадия с TBAF была забуферена добавлением AcOH для удаления нежелательного NaOH из коммерческих партий TBAF. Слишком много AcOH приводит к потере защитной группы DMTr. Реакцию проводили с 1,75 экв. AcOH и смешивали TBAF и AcOH перед добавлением к стартовому веществу. Кроме того, предыдущий способ включал выпаривание THF перед последующими стадиями; в нынешнем способе эта стадия выпаривания была исключена, а включена тщательная нейтрализация водной фазы до рН 7, чтобы уменьшить вызванную основанием деградацию продукта. Наконец, была удалена хроматографическая очистка после стадии этерификации.
[0189] В альтернативном варианте могут быть сокращены процедуры синтеза от диола-5 до диола-7, удаляя дополнительные стадии хроматографии. В целом, процесс можно проводить с тремя стадиями хроматографии, а не шестью, и неочищенное вещество будет проходить очистку в стадиях получения диола-4, диола-7 и диола-8.
ПРИМЕР 5
[0190] В этом примере описан синтез мономера A-TOM, модифицированного 3'-фосфатного фрагмента, который служит в качестве защитной группы для 3'-гидроксила. (ТОМ - три-изопропилсилоксиметил)
Стадия 1. Бензоилирование DMT-аденозина (A-OBz).
[0191] N6-бензоил-2'-дезокси-5'-ODMT-D-аденозин (11,2 г, 17 ммоль) и растворитель (смесь пиридин/DCM в соотношении 1:3, 11 мл пиридина, 33 мл DCM) смешивали при комнатной температуре, получая раствор. Реакционную колбу охлаждали до 0°C, и в нее добавляли DMAP (0,41 г, 3,41 ммоль) и бензоилхлорид (3,9 г (3,2 мл), 34,1 ммоль). Перемешивали при нагревании до комнатной температуры в течение ночи (за ходом реакции следили с помощью ТСХ), в результате чего получали бледно-оранжевую смесь с небольшим количеством белого твердого осадка. Растворитель удаляли в вакууме при температуре <40°С. Остаток разбавляли AcOEt (~500 мл), дважды промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2х250 мл), водой (250 мл) и сушили над MgSO4. После выпаривания растворителей и совместного выпаривания с толуолом получали белую пену и высушивали в вакууме до постоянного веса. Вещество использовали в следующей стадии без очистки.
Стадия 2. Детритилирование (A-OH).
[0192] A-OBz (13,69 г, неочищенный, 17 ммоль) растворяли в смеси дихлорметан/метанол (1:1, 300 мл) и охлаждали до 0°C в атмосфере азота. Трифторуксусную кислоту (2,75 мл, 36 ммоль) добавляли с помощью шприца. Реакционную смесь перемешивали при нагревании до комнатной температуры в течение одного часа. Ход реакции контролировали по ТСХ. Реакцию гасили при 0°С добавлением твердого NaHCO3 (3 г, 36 ммоль). Растворитель удаляли в вакууме при температуре <40°C, и остаток разбавляли AcOEt (~800 мл) и промывали пять раз водой (5х250 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и сушили в вакууме, получая белую пену. Очистка колоночной хроматографией (градиентное элюирование смесью 1:1 петролейный эфир/этилацетат до этилацетата) давала целевой продукт в виде белого порошка. (5,0 г, 60% выход (2 стадии), Rf=0,35 в 100% этилацетате), 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,25 (с, 1H), 8,78 (с, 1H), 8,75 (с, 1H), 8,07 (ддт, J=10,1, 7,0, 1,4 Гц, 4H), 7,75-7,68 (м, 1H), 7,68-7,62 (м, 1H), 7,62-7,51 (м, 4H), 6,64 (дд, J=8,6, 5,9 Гц, 1H), 5,68 (дт, J=6,1, 1,9 Гц, 1H), 5,28 (т, J=5,7 Гц, 1H), 4,31 (тд, J=4,4, 1,8 Гц, 1H), 3,72 (тдд, J=11,8, 6,4, 4,7 Гц, 2H), 3,19 (ддд, J=14,4, 8,7, 6,1 Гц, 1H), 2,75 (ддд, J=14,1, 5,9, 1,8 Гц, 1H).
Стадия 3. Окисление.
[0193] Раствор A-OH (1,0 г, 2,18 ммоль) в дихлорметане (50 мл), содержащий молекулярное сито (4), охлаждали до 0°C в атмосфере газообразного азота. В отдельной колбе периодинан Десса-Мартина (1,11 г, 2,61 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл) над молекулярном ситом. Раствор Десса-Мартина добавляли к A-OH и давали нагреться до комнатной температуры. Реакцию контролировали с помощью LC-MS, и через час реакцию гасили насыщенным раствором бикарбоната натрия. Погашенную смесь разбавляли дихлорметаном (~250 мл) и промывали раствором бикарбоната натрия (100 мл) и водой (2х100 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и сушили в вакууме, получая белую пену, которую использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.
Стадия 4. Реакция Виттига (A-CH=CH2).
[0194] Метилтрифенилфосфонийбромид (5,83 г, 16 ммоль) смешивали с сухим THF (40 мл) в высушенной в печи двухгорлой круглодонной колбе, имеющей мешалку, молекулярное сито и подачу азота. Одна горловина колбы содержала трет-бутоксид калия в пробирке для добавления твердого вещества. Раствор охлаждали до 0°С. Трет-бутоксид калия добавляли, поворачивая трубку для добавления в колене, позволяя твердому веществу попадать в перемешиваемый раствор без воздействия воздуха или открытия системы. Раствор превращался из мутно-белого в желтый. Перемешивали раствор при 0°С в течение часа. Примечание: все твердые реагенты для этой стадии сушили в высоком вакууме в течение ночи в присутствии пятиокиси фосфора. Шприцы, иглы, мешалки, активированные молекулярные сита также сушили в том же резервуаре.
[0195] Желтое твердое вещество добавляли к раствору A-CHO (2,5 г, 5,44 ммоль) в THF (15 мл) при 0°C с помощью иглы большого диаметра и шприца. Цвет изменялся с желтого на оранжевый. Реакцию перемешивали при 0°С в течение трех часов и контролировали с помощью LC-MS.
[0196] Реакционную смесь обрабатывали, выливая реакционную смесь в колбу, содержащую воду (300 мл) и AcOEt (300 мл) в химический стакан емкостью 1 л при 0°C. Перемешивали в течение десяти минут перед переносом в делительную воронку. Органический слой промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (3х100 мл) и насыщ. солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и сушили в вакууме, получая коричнево-желтую пену. Очистка колоночной хроматографией (градиентное элюирование дихлорметаном до 5% метанол/DCM) давала целевой продукт в виде кремово-желтой пены. (2,59 г, Rf=0,53 в 5% MeOH/DCM), 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,21 (с, 1H), 8,77 (с, 1H), 8,66 (с, 1H), 8,05 (д, J=7,2 Гц, 2H), 7,65 (т, J=7,4 Гц, 1H), 7,57 (кв, J=7,9, 7,3 Гц, 3H), 6,50 (т, J=6,7 Гц, 1H), 6,06 (ддд, J=17,2, 10,4, 6,7 Гц, 1H), 5,55 (д, J=4,4 Гц, 1H), 5,29-5,10 (м, 2H), 4,42 (р, J=4,2 Гц, 1H), 4,30 (дд, J=6,7, 3,6 Гц, 1H), 2,94 (дт, J=13,1, 6,4 Гц, 1H), 2,40 (ддд, J=13,3, 6,5, 4,3 Гц, 1H).
Стадия 5. Окисление диола (A-OHOH).
[0197] Раствор A-CH2CH2 (0,68 г, 1,49 ммоль) в THF (7 мл) помещали в колбу, снабженную мешалкой и в атмосфере азота. N-оксид 4-метилморфолина (0,262 г, 2,235 ммоль) взвешивали в виде твердого вещества и добавляли в реакционную колбу. Также добавляли води (7 мл). В реакционную колбу добавляли тетроксид осмия (4% раствор в воде, 285 мкл, 0,045 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 40°С в течение ночи. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ и LC-MS. Реакцию гасили, добавляя тиосульфат натрия в виде твердого вещества. Смесь перемешивали в течение 30 минут перед обработкой этилацетатом (150 мл) и раствором бикарбоната натрия. Органический слой трижды промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (3×100 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и сушили в вакууме, получая не совсем белое медленно кристаллизующееся твердое вещество. Очистка колоночной хроматографией (градиентное элюирование дихлорметаном до 10% метанол/DCM) давала целевой продукт в виде бесцветного масла. (0,13 г, 19% выход, Rf=0,28 в 5% MeOH/DCM), 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,25 (с, 1H), 8,78 (с, 1H), 8,73 (с, 1H), 8,07 (ддт, J=9,6, 7,2, 1,4 Гц, 4H), 7,74-7,68 (м, 1H), 7,68-7,62 (м, 1H), 7,62-7,47 (м, 5H), 6,62 (дд, J=8,9, 5,8 Гц, 1H), 5,82 (дт, J=5,8, 1,5 Гц, 1H), 5,48 (д, J=5,1 Гц, 1H), 4,69 (т, J=5,5 Гц, 1H), 4,31 (дд, J=5,0, 1,5 Гц, 1H), 3,81 (р, J=5,3 Гц, 1H), 3,48 (дд, J=22,3, 5,5 Гц, 2H), 3,18 (ддд, J=14,4, 9,0, 5,9 Гц, 1H) 2,70 (ддд, J=14,4, 6,0, 1,5 Гц, 1H).
Стадия 6. Силилирование (A-OHTOM).
[0198] Раствор A-OHOH (0,128 г, 0,262 ммоль) в DCM растворяли в DCM (1,5 мл) в колбе, имеющей мешалку и подключение тока азота. Добавляли дихлорид ди-трет-бутил олова (80 мг, 0,262 ммоль) и N, N-диизопропилэтиламин (182 мкл, 1,05 ммоль) при комнатной температуре в течение 30 минут. Триизопропилсилилоксиметилхлорид (TOM-Cl, 79 мкл, 0,341 ммоль) добавляли с помощью микропипетки. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ и LC-MS. Реакцию оставляли на ночь при комнатной температуре. Обработку реакции проводили в этилацетате (200 мл). Промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (3х100 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и сушили в вакууме, получая желтое/коричневое масло. Очистка колоночной хроматографией (градиентное элюирование дихлорметаном до 8% метанол/DCM) давала целевой продукт в виде желто-белой пены (0,14 г, выход 79%, Rf=0,5 в 5% MeOH/DCM), 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,25 (с, 1H), 8,76 (с, 1H), 8,73-8,65 (м, 1H), 8,06 (тт, J=7,5, 1,4 Гц, 4H), 7,76-7,62 (м, 2H) 7,62-7,46 (м, 4H), 6,61 (дд, J=8,9, 5,7 Гц, 1H), 5,82 (д, J=5,7 Гц, 1H), 5,65 (д, J=5,3 Гц, 1H), 4,84 ( с, 2H), 4,27 (дд, J=5,4, 1,5 Гц, 1H), 4,06-3,93 (м, 1H), 3,62 (ддд, J=42,1, 10,3, 5,2 Гц, 2H), 3,22 (ддд, J=14,7, 9,1, 5,8 Гц, 1H), 2,74-2,65 (м, 1H), 0,94 (м, 21H, TOM).
Стадия 7. Тритилирование (A-TOM-DMT).
[0199] Сухой A-OHTOM (0,14 г, 0,207 ммоль), (4,4'-диметокситрифенилметилхлорид (DMT-Cl, 0,105 г, 0,311 ммоль) и нитрат серебра (53 мг, 0,311 ммоль) помещали в колбу с сухим DCM (1,5 мл) и коллидин (2,4,6-триметилпиридин) (55 мкл, 0,414 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение трех часов. ТСХ и LCMS-мониторинг хода реакции. Реакционную смесь разбавляли DCM (100 мл) и фильтровали через воронку из спеченного стекла. Раствор DCM промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (5х100 мл). Слой DCM сушили над MgSO4, фильтровали и сушили в вакууме, получая желтое/коричневое масло. Очистка колоночной хроматографией (градиентное элюирование дихлорметаном до 10% метанол/DCM) позволяла получить целевой продукт в виде вязкого желтого масла (0,17 г, 85% выход, Rf=0,46 в 5% MeOH/DCM).
Стадия 8 (A-3'OH).
[0200] Раствор A-TOM-DMT (56 мг, 56 мкмоль) в смеси метанола и THF (4:5, всего 0,9 мл) охлаждали до 0°C. Добавляли гидроксид натрия (4М, 0,1 мл, избыток) и перемешивали при 0°С в течение 15 минут. Реакцию контролировали по ТСХ и LC-MS. Реакцию гасили, используя уксусную кислоту (1М, 0,5 мл), следя, что рН не опустился ниже 8. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (ЕА, 100 мл) и промывали раствор насыщенным раствором бикарбоната натрия (3х50 мл). Слой EA сушили над MgSO4, фильтровали и сушили в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией (градиентное элюирование с помощью ЕА/петролейного эфира (25%) до 100% ЕА), получая белую пену (0,02 г, выход 40%, Rf=0,38 в 100% ЕА).
Стадия 9. Образование фосфорамидита (мономер ATOM).
[0201] A-3'OH (92 мг, 105 мкмоль) помещали в колбу, содержащую молекулярное сито и магнитную мешалку, перед добавлением THF (сухой, 0,2 мл) при комнатной температуре в атмосфере газообразного азота. К раствору THF добавляли N, N-диизопропилэтиламин (110 мкл, 630 мкмоль). Наконец, через микропипетку добавляли 2-цианоэтил N, N-диизопропилхлорфосфорамидит (38 мкл, 169 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота. Реакцию контролировали с помощью ТСХ. Когда реакция была завершена, растворитель удаляли в вакууме. Остаток промывали петролейным эфиром (3х20 мл) при комнатной температуре. Затем остаток растворяли в DCM и фильтровали для удаления молекулярного сита. Высушивали в вакууме еще раз перед очисткой с помощью колоночной хроматографиеи (градиентное элюирование EA в петролейном эфире (20%) до 75% EA), дающей вязкое бесцветное масло (80 мг, выход 70%), 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,17 (с, 1H), 8,57 (с, 1H), 8,39 (с, 1H), 8,06-7,99 (м, 2H), 7,64 (тд, J=7,1, 1,2 Гц, 1H), 7,58-7,46 (м, 4H ), 7,36 (ддд, J=15,4, 9,0, 2,8 Гц, 4H), 7,29 (т, J=7,4 Гц, 2H), 7,27-7,17 (м, 1H), 6,92-6,83 (м, 4H), 6,34 ( дд, J=9,0, 5,9 Гц, 1H), 4,78-4,71 (м, 1H), 4,68 (кв, J=6,6, 4,6 Гц, 1H), 4,52 (дд, J=8,5, 4,9 Гц, 1H), 4,27 (д, J=7,1 Гц, 1H), 3,85-3,69 (м, 8H), 3,62 (дп, J=10,4, 6,7 Гц, 1H), 3,34-3,22 (м, 1H), 2,78 (тд, J=5,8, 1,9 Гц, 2H), 2,64 (тд, J=8,8, 4,7 Гц, 1H), 2,26-2,16 (м, 1H), 2,08 (д, J=0,7 Гц, 6H), 1,21 (дд, J=15,4, 5,6 Гц, 9H), 1,12 (д, J=6,7 Гц, 6H), 0,99-0,88 (м, 2H), 0,83 (дд, J=6,3, 4,5 Гц, 18H).
ПРИМЕР 6
Синтез модельного динуклеотида (C-Tom-A).
[0202] Соединения C-амидит (125 мг, 0,15 ммоль) и A-OH-Tom (64 мг, 0,1 ммоль) сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи и растворяли в безводном ацетонитриле (1 мл). Под азотом добавляли этилтиотетразол (ETT, 32,5 мг, 0,25 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. ТСХ и LC-MS показали полное израсходование исходного вещества A-OH-Tom. Раствор t-BuOOH в декане (5 М, 0,1 мл) и DCM (1 мл) добавляли к реакционной смеси и перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре. Реакционную смесь выливали в водн. NaHCO3 и водн. фазу экстрагировали EtOAc. Объединенную органическую фазу выпаривали и обрабатывали NaOH (0,1 М, 1 мл в смеси H2O/THF/MeOH=1/4/5 об./об.) при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем смесь обрабатывали HCl (1 М) в THF/МеОН (5 мл/4 мл) в течение 0,5 часа. Реакционную смесь концентрировали и разделяли в H2O и EtOAc. Желаемый продукт извлекали из водной фазы и затем очищали ОФ-ВЭЖХ (TEAB 0,1M/CH3CN).
Исследование расщепления на модельном соединении C-TOM-A.
[0203] Исходный раствор C-TOM-A обрабатывали в различных условиях снятия защиты. Ход реакции контролировали с помощью ОФ-ВЭЖХ. Промежуточное соединение C-A представляет собой соединение, в котором группа TOM была удалена из C-TOM-A, но фосфатная связь не была разорвана. В таблице 1 ниже суммированы результаты снятия защиты при различных реакционных условиях и реагентах для снятия защиты.
Таблица 1.
|
ПРИМЕР 7
[0204] В этом примере описаны альтернативные способы получения комплекса Pd(0), и химическая активность расщепления полученных комплексов сравнивалась с образующимся in situ комплексом Pd(0) из димера хлорида аллилпалладия (II) (Pd(C3H5)Cl)2 и THF, описанным в примере 1. В отличие от комплекса Pd(0), полученного in situ, некоторые палладиевые (II) пре-катализаторы были приготовлены и выделены перед использованием в реакции химической линеаризации, например химического расщепления праймера Р15. Эти пре-катализаторы Pd(II) неактивны в выделенной форме, но их удобно восстанавливать до активного Pd(0) in situ в присутствии THP. Эти альтернативные пре-катализаторы Pd могут улучшить стабильность продукта и увеличить срок его годности.
Способ изготовления
[0205] (Pd(C3H5)Cl)2 растворяли в сухом дегазированном тетрагидрофуране в атмосфере азота и обрабатывали 1-10 эквивалентами THP, добавленными в виде раствора в тетрагидрофуране. Наблюдали выделение масла, и масло отделяли путем декантирования надосадочной жидкости. Вещество высушивали в вакууме, получая вязкие масла от желтого до коричневого или оранжевого цвета. Эти вещества были хорошо растворимы в воде. При добавлении 1-2 эквивалентов THP выделяли смесь [Pd(C3H5)(THP)]Cl и [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, оба из которых представляют собой комплексы Pd(II). Когда добавляли 5 эквивалентов THP, получали чистый образец [Pd(C3H5)(THP)2]Cl. Эти два комплекса Pd(II) были выделены и охарактеризованы. При добавлении 10 эквивалентов THP было получено вещество Pd(0), которое активно в отношении линеаризации P15.
[0206] [Pd(C3H5)(THP)]Cl: 31P ЯМР (162 МГц, D2O): д 14 (с) м.д. 13C ЯМР (101 МГц, D2O): д 118,7 (д, J=5,0 Гц), 81,7 (д, J=29 Гц), 62,1 (д, J=15 Гц), 26,5 (с), 20,5 (д, J)=25,0 Гц) м.д. LC-MS: [аллил-Pd (THP)] +; ожидаемая масса: 355 Да, найденная масса: 355 Да.
[0207] [Pd(C3H5)(THP)2]Cl: 31P ЯМР (162 МГц, D2O): д 10 (с) м.д. 13C ЯМР (101 МГц, D2O): д 122,7 (т, J=5,3 Гц), 71,2 (т, J=14 Гц), 61,8 (т, J=7,6 Гц), 26,7 (с), 22,1 (т, J=13 Гц) м.д. LC-MS: [аллил-Pd (THP) 2] +; ожидаемая масса: 563 Да, найденная масса: 563 Да.
Использование для расщепления Р15
[0208] Вещества, выделенные после обработки (Pd(C3H5)Cl)2 1, 2, 5 и 10 эквивалентами THP, были растворены в водном буфере с концентрацией 10 мг/мл. Активность этих составов в отношении расщепления Р15 оценивали с использованием анализа на основе ВЭЖХ. В этом анализе раствор праймера Р15 (10 мкМ) обрабатывали 10% об./об. каждого состава, инкубировали в течение 10 минут при 38°С, затем гасили путем разбавления и пропускания через колонку при центрифугировании, и анализировали с помощью ВЭЖХ. Процент расщепления рассчитывается из соотношения площадей пиков P15 и продукта расщепления.
[0209] Водные составы [Pd(C3H5)(THP)]Cl и [Pd(C3H5)(THP)2]Cl (полученные путем смешивания (Pd(C3H5)Cl)2 с 1-5 эквивалентами THP) были неактивными в отношении расщепления Р15 при отсутствии других добавок. Однако водные составы вещества, выделенного из смеси (Pd(C3H5)Cl)2 с 10 эквивалентами THP, обеспечивают сравнимую активность расщепления P15 со смесью Pd, полученной in situ из (Pd(C3H5)Cl)2 (6 мМ), THP (60 мМ) и аскорбата натрия (6 мМ). Результаты показаны на фиг.5A. Было отмечено, что пре-катализаторы Pd(II) - [Pd(C3H5)(THP)]Cl и [Pd(C3H5)(THP)2]Cl легко активировались in situ либо во время изготовления, либо при их применении путем обработки дополнительным водным раствором THP. Было показано, что [Pd(C3H5)(THP)2]Cl становится активным при обработке 1 или большим количеством эквивалентов THP при приготовлении в водном растворе (12 мМ Pd). Эффективность расщепления P15 превысила показатель эталонного образца - смеси Pd(0), приготовленной in situ из смеси (Pd(C3H5)Cl)2 (6 мМ), THP (60 мМ) и аскорбата натрия (6 мМ) (фиг.5В).
ПРИМЕР 8
[0210] В этом примере альтернативный выделяемый комплекс Pd(0), Pd(THM)4, был изготовлен с использованием фосфинового лиганда, трис(гидроксиметил)фосфина (THM). Его расщепляющую активность сравнивали с образующимся in situ комплексом Pd(0) из димера хлорида аллилпалладия (II) (Pd(C3H5)Cl)2 и THP, описанного в примере 1.
[0211] Изготовление: Pd(THM)4 приготавливали и выделяли с использованием протокола, описанного Ellis, et al., Inorg. Chem., 1992, 31, 14. Водный раствор был приготовлен при концентрации 10 мМ, и его эффективность оценивали относительно Pd(0), генерируемого in situ, с использованием (Pd(C3H5)Cl)2 (10 мМ) и THP (100 мМ).
[0212] Для демонстрации Pd(0)-индуцированной линеаризации секвенирование проводили на приборе NovaSeq™ с использованием проточной ячейки S4, поверхность которой покрыта праймерами P15/P7 (2х151 с двойными циклами индексации). Рабочий процесс Xp использовали с нанобиблиотеками (дорожки 1 и 3) и библиотеками без использования ПЦР (дорожки 2 и 4) (вставки по 450 п.н.). Перед проведением химических реакций SBS Прочтения 1 (R1) была проведена линеаризация с использованием смеси Pd, состоящей из (Pd(C3H5)Cl)2 (10 мМ), THP (100 мМ) и аскорбата натрия (10 мМ) [на дорожках 1-2]; или водного раствора Pd(THM)4 (10 мМ) [на дорожках 3-4]. Линеаризацию для Прочтения 2 (R2) проводили с использованием реагента, содержащего фермент FpG. Было отмечено, что показатели секвенирования в целом были сопоставимы для обоих методов линеаризации Pd. Высокая интенсивность Прочтения 1 и процент ресинтеза с Pd(THM)4 показали, что была достигнута успешная линеаризация (фиг.6A). Частота ошибок в библиотеке человека и фага PhiX была сопоставимой для обоих способов (фиг.6B). Результаты секвенирования приведены в таблице ниже (таблица 2).
Таблица 2.
|
ПРИМЕР 9
[0213] В этом примере описан альтернативный способ получения активного комплекса Pd(0). Pd(THP)2-4 получали и выделяли взаимодействием Pd(PPh3)4 с THP в реакции лигандного обмена. Его расщепляющую активность сравнивали с образующимся in situ комплексом Pd(0) из димера хлорида аллилпалладия (II) (Pd(C3H5)Cl)2 и THP, описанного в примере 1.
Способ изготовления
[0214] В атмосфере азота Pd(PPh3)4 растворяли в сухом дегазированном дихлорметане, получая желтый раствор. Добавляли водный раствор THP (4,1 эквивалента) для получения двухфазной смеси, которую перемешивали в течение 2,5 часов. Желтый цвет перемещался из органического в водный слой. Реакцию обрабатывали, отсасывая органический слой и промывая водную фазу дополнительным количеством DCM. Водную фазу высушивали при пониженном давлении и выпаривали вместе с тетрагидрофураном, а полученное оранжевое масло сушили в высоком вакууме. Выход был почти количественным. Анализ LC-MS продукта показал наличие Pd(THP)2 [Pd(THP)]2+ H+; ожидаемая масса: 523 Да, найденная масса: 523 Да.
Применение для линеаризации P15
[0215] Pd(THP)2-4 приготавливали в водном буфере в концентрации 10 мг/мл, и его активность расщепления P15 оценивали с использованием анализа в планшетах. В этом анализе используется 96-луночный планшет с поверхностью, покрытой праймерами P15/P17. Для количественного определения двухцепочечной ДНК используется интеркалирующий флуоресцентный краситель, присутствующей до и после линеаризации Прочтения 1; процент расщепления можно рассчитать по количеству оставшейся двухцепочечной ДНК. Для составов Pd(THP)2-4 активность расщепления P15 была сопоставима со смесью Pd, приготовленной in situ из (Pd(C3H5)Cl)2 (6 мМ), THP (60 мМ) и аскорбата натрия (6 мМ) (фиг.7). Было отмечено, что оба способа имели сравнимую эффективность расщепления.
ПРИМЕР 10
[0126] В этом примере альтернативный реагент на основе никеля для химического расщепления был приготовлен и испытан на расщеплении аллил-dT-нуклеотид-содержащей цепи ДНК.
[0217] Во-первых, как THP-, так и THM-фосфиновые лиганды, были использованы в различных эквивалентах для взаимодействия с NiCl2 при получении никелевых комплексов. Ni-THP (в соотношение 1:4 или 1:10) дает тот же продукт расщепления, что и реагент, содержащий палладий, описанный в примере 1. Интересно, что Ni-THM, где фосфиновый лиганд имеет более короткую алкильную цепь (таким образом, меньший угол конуса), не демонстрирует ту же активность расщепления в комплексе с никелем.
[0218] Расщепляющая активность Ni-THP на поверхности была проверена и сравнена с активностью Pd-THP. Эксперимент проводили в проточной кювете HiSeq™, покрытой праймерами P15/P7 и трейсерными олигонуклеотидами. У олигонуклеотидные трейсеры имеют четыре группы аллил-dT в последовательности и 3´'-флуоресцентную метку. После расщепления аллил-dT комплексами Ni-THP или Pd-THP флуоресцентный сигнал от проточной ячейки будет исчезать. Проточную ячейку покрывали с использованием 1,1 мкМ P15/P7 и дополнительными 5%-40% трейсерными олигонуклеотидами, затем сканировали на Typhoon, чтобы подтвердить успешное покрытие. Химическую линеаризацию проводили при 60°С в течение 10 мин. Дорожки 1-4 обрабатывали комплексом Pd-THP (генерированным in situ из (Pd(C3H5)Cl)2 (10 мМ), THP (100 мМ) и аскорбата натрия (10 мМ)) в качестве контроля, дорожки 5-8 обрабатывали 10 мМ комплексом Ni-THP (1:10). Интенсивность флуоресценции затем измеряли на Typhoon для оценки степени химической линеаризации. Расположение дорожек: 5%-й трейсер=55 нМ (дорожки 1, 5); 10%-й трейсер=110 нМ (дорожки 2, 6); 20%-й трейсер=220 нМ (дорожки 3, 7); 40%-й трейсер=440 нМ (дорожки 4, 8). На фиг.8 показана нормализованная средняя интенсивность флуоресценции до и после расщепления, и Ni-THP продемонстрировал эффективную активность расщепления, которая была сравнима с таковой у Pd-THP.
ПРИМЕР 11
[0219] В этом примере описан альтернативный линкер на основе азоарена в качестве биоортогонального расщепляемого линкера для химической линеаризации водным раствором дитионита натрия (Na2S2O4).
Схемы 5 и 6 иллюстрируют получение азофосфорамидитов 1 и 2 соответственно.
Схема 5
[0221] Соединение 5. Под азотом суспензию метил 2-амино-5-йодбензоата (4) (2,77 г, 10 ммоль), Pd(PPh3)4 (1,159 мг, 1 ммоль), CuI (381 мг, 2 ммоль), Et3N (4,2 мл, 30 ммоль) и пропаргилового спирта (1,75 мл, 30 ммоль) в DMF (20 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Анализ ТСХ (петролейный эфир:этилацетат 1:1) показал полное израсходование исходного вещества. Реакцию гасили с помощью 200 мл насыщ. раствора NaCl. К смеси добавляли этилацетат:петролейный эфир 1:1 (200 мл), и водный слой трижды экстрагировали смесью этилацетат:петролейный эфир 1:1. После сушки объединенных органических слоев над MgSO4, раствор концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат 80:20 до этилацетата), получая соединение 5 в виде желтого масла (1,88 г, 92%). 1H ЯМР (CDCl3) δ 3,78 (с, 3Н), 4,25 (с, 2Н, ≡CCH2), 7,27-7,36 (м, 2Н, аром. Н), 7,58-7,65 (м, 1Н, аром. Н).
[0222] Соединение 6. Под азотом к раствору соединения 5 (1,88 мг, 9,2 ммоль) и имидазола (1,83 г, 27,6 ммоль) в сухом DMF (25 мл) добавляли т-бутилдифенилсилилхлорид (1,06 г, 12 ммоль). Прохождение реакции контролировали по ТСХ, и она завершалась после перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакцию гасили насыщ. NaHCO3 и экстрагировали смесью этилацетат:петролейный эфир 1:1 (2х). После сушки объединенного органического слоя над MgSO4 растворитель удаляли в вакууме. Затем неочищенную смесь растворяли в EtOH и обрабатывали EtSiH и Pd-C (10%). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником под азотом в течение 16 часов. Анализ ТСХ (петролейный эфир:этилацетат 8:2) показал полное израсходование исходного вещества. Реакционную смесь фильтровали, концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир до петролейный эфир:этилацетат 1:1), получая соединение 6 в виде желтого масла (3,37 г, 82%). 1Н ЯМР (CDCl3) δ 1,04 (с, 9Н, 3хСН3), 1,70-1,77 (м, 2Н, СН2), 2,56 (т, 2Н, СН2), 3,58 (т, 2Н, ОСН2), 3,60 (с, 3Н, ОСН3), 6,62-6,65 (м, 1Н, аром. Н), 7,03-7,06 (м, 1Н, аром.), 7,27-7,63 (м, 11Н, аром. Н).
[0223] Соединение 8. К суспензии резорцина (2,2 г, 20 ммоль) и K2CO3 (2,76 г, 20 ммоль) в DMF (40 мл) добавляли трет-бутил-4-бромбутаноат (2,2 г, 10 ммоль) под азотом. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Анализ ТСХ (петролейный эфир:этилацетат 7:3) показал 90%-е израсходование исходного резорцина. Реакцию гасили с помощью 300 мл насыщ. раствора NaCl. К реакционной смеси добавляли этилацетат:петролейный эфир 1:1 (300 мл), и водный слой трижды экстрагировали смесью этилацетат:петролейный эфир 1:1. После сушки объединенных органических слоев над MgSO4 раствор концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир - петролейный эфир:этилацетат 50:50), получая соединение 8 в виде желтого масла (2,2 г, 88%). 1H ЯМР (CDCl3) δ 1,27 (с, 9Н), 1,91-1,98 (м, 2Н, СН2), 2,22 (т, 2Н, СН2), 3,27 (т, 2Н, ОСН2), 6,36-6,46 (м, 3 аром. H), 7,09 (т, 1 аром. H)
[0224] Соединение 9. Соединение 5 (450 мг, 1 ммоль) растворяли в растворе ацетона в воде (1:1) (2,5 мл). Смесь охлаждали до 0°С и добавляли концентрированную HCl (0,5 мл). Через 5 минут по каплям добавляли нитрит натрия (93 мг, 1,2 ммоль) в воде (1 мл), и смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°C. В то же время солюбилизировали соединение 8 (252 мг, 1 ммоль), Na2CO3 (210 мг, 2 ммоль) и NaOH (160 мг, 4 ммоль) в растворе ацетон/вода (1:1) (3 мл). Первый раствор добавляли по каплям во второй при 0°С. После того, как добавления первого раствора смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение еще одного часа. Реакционную смесь нейтрализовали 1 М HCl и затем экстрагировали DCM (3х по 50 мл). Органическую фазу сушили над MgSO4, концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир - петролейный эфир:этилацетат 1:1). Соединение 9 получали в виде оранжево-красного масла (400 мг, 56%). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,02 (с, 9Н, 3×СН3), 1,27 (с, 9Н), 1,69-1,76 (м, СН2), 1,91-1,97 (м, 2Н, СН2), 2,20 ( т, 2Н, СН2), 2,53 (т, 2Н, СН2), 3,34 (т, 2Н, ОСН2), 3,54 (т, 2Н, ОСН2), 3,62 (с, 3Н, ОСН3), 6,36-6,46 (м, 4 аром. H), 7,00-7,06 (м, 1H, аром. H), 7,09 (т, 1 ароматика), 7,27-7,63 (м, 11H, аром. H).
[0225] Соединение 11. Соединение 9 (3,55 г, 5 ммоль) растворяли в DCM (50 мл). Раствор обрабатывали TFA (10 мл) при комнатной температуре и перемешивали в течение ночи. Затем TFA удаляли при пониженном давлении и выпаривали совместно с толуолом. Остаток разделяли между NaCl и DCM. Водный слой экстрагировали DCM 3 раза. Объединенный органический слой сушили над MgSO4 и концентрировали. Неочищенный продукт растворяли в THF (15 мл) и обрабатывали TBAF (1М, 5 мл). Реакцию контролировали с помощью ТСХ (DCM/MeOH 90:10). Растворитель удаляли при пониженном давлении, и остаток разделяли между NaCl и DCM (+10% МеОН). Водный слой экстрагировали DCM (+10% MeOH) 3 раза. Объединенный органический слой сушили над MgSO4 и концентрировали. Остаток выпаривали совместно с пиридином 3 раза. Остаток растворяли в Py/CH3CN (10/10 мл) и добавляли основание Хунига (3,7 мл, 15 ммоль), DMT-Cl (5,07 г, 15 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. ТСХ (DCM:MeOH 95:5) указывала на завершение реакции. Смесь концентрировали, растворяли в DCM и промывали Na2CO3. Объединенный органический слой сушили над MgSO4, концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат от 8:2 до этилацетата+1% NEt3). Соединение 11 получали в виде оранжево-красного масла (2,37 г, 66%). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,70-1,79 (м, 2Н, СН2), 1,90-1,97 (м, 2Н, СН2), 2,24 (т, 2Н, СН2), 2,54 (т, 2Н, СН2) 3,26 (т, 2Н, ОСН2), 3,58 (т, 2Н, ОСН2), 3,63 (с, 3Н, ОСН3), 3,71 (с, 6Н, ОМе), 6,79-6,89 (м, 4Н, ароматика), 7,03-7,06 (м, 1Н, аром. Н), 7,10 (т, 1 аром. Н), 7,13-7,63 (м, 13Н, аром. Н).
[0226] Соединение 12. Соединение 11 (1,05 г, 1,46 ммоль) и DMAP (18 мг, 0,15 ммоль) растворяли в 7 мл безводного пиридина под азотом. Затем реакционную смесь охлаждали до 0°С и по каплям добавляли бензоилхлорид (0,5 мл, 4,4 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение одного часа, в течение которого раствор становился мутным. Анализ ТСХ показал полное израсходование исходного вещества. Реакцию гасили насыщ. раствором NaHCO3. Водный слой экстрагировали DCM 3 раза. Объединенный органический слой сушили над MgSO4, концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат 8:2 до этилацетата+1% NEt3), получая соединение 12 в виде желтого масла (930 мг, 78%). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,69-1,76 (м, 2Н, СН2), 1,91-1,97 (м, 2Н, СН2), 2,20 (т, 2Н, СН2), 2,53 (т, 2Н, СН2) 3,24 (т, 2Н, ОСН2), 3,54 (т, 2Н, ОСН2), 3,62 (с, 3Н, ОСН3), 3,71 (с, 6Н, ОМе), 6,79-6,86 (м, 4Н, ароматика), 7,01 (т, 1 аром. H), 7,04-7,11 (м, 3H, аром. H), 7,13-7,63 (м, 13H, аром. H), 7,94-8,36 (м, 3H, аром. H).
[0227] Соединение 13. Соединение 12 (340 мг, 0,5 ммоль) растворяли в 3 мл безводного DMF под азотом, и добавляли основание Хунига (0,26 мл, 1,5 ммоль). Затем реакционную смесь обрабатывали TSTU (196 мг, 0,65 ммоль) и оставляли при комнатной температуре. Через 30 мин анализ ТСХ (EtOAc) показал, что реакция завершилась. Затем к реакционной смеси добавляли 3-аминопропанол (38 мкл, 0,5 моль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Анализ ТСХ показал полное израсходование исходного вещества. Реакцию гасили насыщ. раствором NaHCO3. Водный слой экстрагировали DCM 3 раза. Объединенный органический слой сушили над MgSO4, концентрировали, упаривали совместно с ксилолом (3х) и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат 8:2 до этилацетата+1% NEt3), получая соединение 13 в виде оранжевого масла. (320 мг, 73%). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,67-1,79 (м, 4Н, СН2), 1,91-1,97 (м, 2Н, СН2), 2,20 (т, 2Н, СН2), 2,53 (т, 2Н, СН2) 3,24 (т, 2Н, ОСН2), 3,45 (т, 2Н, ОСН2), 3,51 (т, 2Н, NCH2), 3,54 (т, 2Н, ОСН2), 3,69 (с, 3Н, ОСН3), 3,71 (с, 6H, OMe), 6,79-6,86 (м, 4H, ароматика), 7,01 (т, 1 аром. H), 7,04-7,11 (м, 3H, аром. H), 7,13-7,69 (м, 13H, аром. H) 7,94-8,40 (м, 3H, аром. H).
[0228] Соединение 1. Соединение 13 (320 мг, 0,36 ммоль) сушили в высоком вакууме. Безводный DCM (2 мл) добавляли под азотом и перемешивали с молекулярным ситом в течение 10 минут при комнатной температуре. К раствору добавляли основание Хунига (0,19 мл, 1,1 ммоль) и затем 2-цианоэтил-N, N-диизопропилхлорфосфорамидит (102 мг, 0,43 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 3 часов. За реакцией следили с помощью ТСХ (РЕ/EtOAc, 8:2). Реакционную смесь концентрировали до сиропа в вакууме. Остаток очищали на колонке (петролейный эфир:этилацетат 8:2 до этилацетата, PE/EtOAc+1% NEt3), получая соединение 1 в виде оранжевого масла (190 мг, 50%). Продукт частично деградировал на колонке. 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,96-1,27 (м, 12H), 1,68-1,79 (м, 4H, CH2), 1,91-1,97 (м, 2H, CH2), 2,20 (т, 2H, CH2) 2,53 (т, 2Н, CH2), 2,58-2,74 (м, 2Н, CH2CN), 3,24 (т, 2Н, ОCH2), 2,93 (м, 2Н, NCH), 3,44 (т, 2Н, NCH2), 3,42- 3,54 (м, 4Н, ОCH2), 3,69 (с, 3Н, ОСН3), 3,71 (с, 6Н, ОМе), 6,79-7,01 (м, 5Н, ароматика), 7,04-7,11 (м, 3Н, аром. Н), 7,13-7,69 (м, 13H, аром. H), 7,94-8,40 (м, 3H, аром. H).
Схема 6
[0229] Соединение 15. Под азотом к раствору соединения 14 (3,6 г, 20 ммоль) и имидазола (3,72 г, 60 ммоль) в сухом DMF (25 мл) добавляли т-бутилдифенилсилилхлорид (2,3 г, 26 ммоль). Прохождение реакции контролировали по ТСХ, и она завершалась после перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакцию гасили насыщ. NaHCO3 и экстрагировали смесью этилацетат:петролейный эфир 1:1 (2х). После сушки объединенного органического слоя над MgSO4 реакционную смесь фильтровали, концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир - петролейный эфир:этилацетат 1:1), получая соединение 15 в виде желтоватого масла (7,19 г, 86%). 1H ЯМР (DMSO-d6) δ 0,99 (с, 9Н, 3хСН3), 3,38-3,46 (м, 2Н, NCH2), 3,92 (т, 2Н, ОСН2), 5,59 (с, 2Н, NH2), 6,50-6,54 (d, 2H, аром. H), 7,37-7,66 (м, 13H, аром. H), 8,05 (д, 1H, NH).
[0230] Соединение 16. Под азотом к раствору Соединения 15 (840 мг, 2 ммоль) в сухом DCM (10 мл) добавляли нитрозилтетрафторборат (234 мг, 2 ммоль) при 0°C. За реакцией следили с помощью ТСХ, и исходное вещество исчезало после перемешивания в течение 1 часа при 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли соединение 8 (756 мг, 3 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 4 часов. За реакцией следили по ТСХ. По завершении реакцию гасили с помощью насыщ. NaHCO3 и экстрагировали DCM (2х). После сушки объединенного органического слоя над MgSO4 реакционную смесь фильтровали, концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир - петролейный эфир:этилацетат 1:1), получая соединение 16 в виде оранжевого масла (1,12 г, 82%). 1Н ЯМР (DMSO-d6) δ 0,99 (с, 9Н, 3хСН3), 1,27 (с, 9Н, 3хСН3), 1,91-1,98 (м, 2Н, СН2), 2,22 (т, 2Н, СН2), 3,27 (т, 2H, OСН2), 3,38-3,46 (м, 2H, NСН2), 3,92 (т, 2H, OСН2), 6,36-6,46 (м, 3 ар. H), 6,50-6,56 (д, 2H, аром. H), 7,10 (т, 1 аром. H), 7,37-7,66 (м, 13H, аром. H), 8,06 (д, 1H, NH).
[0231] Соединение 17. Соединение 16 (1,1 г, 1,64 ммоль) и DMAP (20 мг, 0,16 ммоль) растворяли в 8 мл безводного пиридина под азотом. Затем реакционную смесь охлаждали до 0°С и по каплям добавляли бензоилхлорид (0,17 мл, 1,5 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение одного часа, за который раствор становился мутным. Анализ ТСХ показал полное израсходование исходного вещества. Реакцию гасили насыщ. раствором NaHCO3. Водный слой экстрагировали 3 раза DCM. Объединенный органический слой промывали H2SO4, сушили над MgSO4 и концентрировали. Полученную неочищенную смесь растворяли в DCM (14 мл). Раствор обрабатывали TFA (1,4 мл) при комнатной температуре и перемешивали в течение ночи. Реакцию контролировали с помощью ТСХ (петролейный эфир:этилацетат 1:1). TFA удаляли при пониженном давлении и совместно упаривали с толуолом. Остаток разделяли между NaCl и DCM. Водный слой экстрагировали DCM 3 раза. Объединенный органический слой сушили над MgSO4 и концентрировали. Неочищенный продукт растворяли в THF (8 мл) и обрабатывали TBAF (1М, 1,6 мл). Реакцию контролировали с помощью ТСХ (DCM/MeOH 9:11). Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток разделяли между NaCl и DCM (+10% МеОН). Водный слой экстрагировали DCM (+10% MeOH) 3 раза. Объединенный органический слой сушили над MgSO4, концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (DCM - DCM:MeOH 9:1). Соединение 17 получали в виде оранжево-красного масла (515 г, 64%). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,56-1,64 (м, 2Н, СН2), 2,01 (т, 2Н, СН2), 3,24 (т, 2Н, NCH2), 3,52 (т, 2Н, ОСН2), 4,25 (т, 2Н, ОСН2), 6,79-6,89 (м, 1Н, аром. Н), 7,03-7,06 (м, 1Н, аром. Н), 7,13-7,63 (м, 10Н, аром. Н), 8,56 (т, 1Н, NH).
[0232] Соединение 18. Соединение 17 (500 мг, 1 ммоль) растворяли в Py/CH3CN (5/5 мл) и добавляли основание Хунига (0,87 мл, 5 ммоль), DMT-Cl (1 г, 3 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. TCL (DCM: MeOH 95: 5) указывала на завершение реакции. Смесь концентрировали, растворяли в DCM и промывали Na2CO3. Объединенный органический слой сушили над MgSO4, концентрировали и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат 8:2 до этилацетата+1% NEt3). Соединение 18 получали в виде оранжево-красного масла (653 мг, 83%). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,16-1,24 (м, 2Н, СН2), 2,01 (т, 2Н, СН2), 3,24 (т, 2Н, NCH2), 3,52 (т, 2Н, ОСН2), 3,69 (с, 6H, OMe), 4,25 (т, 2H, ОСН2), 6,76-6,89 (м, 4H, аром. H), 7,03-8,23 (м, 21H, аром. H), 8,86 (т, 1H, NH).
[0233] Соединение 19. Соединение 18 (350 мг, 0,5 ммоль) растворяли в 3 мл безводного DMF под азотом и добавляли основание Хунига (0,26 мл, 1,5 ммоль). Затем реакционную смесь обрабатывали TSTU (196 мг, 0,65 ммоль) и оставляли при комнатной температуре. Через 30 мин анализ ТСХ (петролейный эфир: EtOAc 2: 8) показал, что реакция завершилась. Затем к реакционной смеси добавляли 3-аминопропанол (38 мкл, 0,5 моль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Анализ ТСХ показал полное израсходование исходного вещества. Реакцию гасили насыщ. раствором NaHCO3. Водный слой экстрагировали 3 раза DCM. Объединенный органический слой сушили над MgSO4, концентрировали, совместно выпаривали с ксилолом (3х) и очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат 8:2 до этилацетата+1% NEt3), получая соединение 19 в виде оранжевого масла. (223 мг, 52%). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,67-1,79 (м, 4Н, СН2), 1,91-1,97 (м, 2Н, СН2), 2,05 (т, 2Н, СН2), 2,53 (т, 2Н, СН2) 3,24 (т, 2Н, ОСН2), 3,45 (т, 2Н, ОСН2), 3,51 (т, 2Н, NCH2), 3,57 (т, 2Н, ОСН2)), 3,71 (с, 6Н, ОМе), 6,79-6,86 ( м, 4Н, ароматика), 7,01 (т, 1 аром. Н), 7,04-7,11 (м, 3Н, аром. Н), 7,13-7,69 (м, 13Н, аром. Н), 7,74-8,40 (м, 4H, аром. H), 8,76 (т, 1H, NH).
[0234] Соединение 2. Соединение 19 (223 мг, 0,26 ммоль) сушили в высоком вакууме. Безводный DCM (1,5 мл) добавляли под азотом и перемешивали с молекулярным ситом в течение 10 минут при комнатной температуре. К раствору добавляли основание Хунига (0,14 мл, 0,78 ммоль), а затем 2-цианоэтил-N, N-диизопропилхлорфосфорамидит (76 мкл, 0,34 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре под азотом в течение 3 часов. За реакцией следили с помощью ТСХ (РЕ/EtOAc, 2:8). Реакционную смесь концентрировали до сиропа в вакууме. Остаток очищали на колонке (петролейный эфир:этилацетат 8:2 до этилацетата+1% NEt3), получая соединение 2 в виде оранжевого масла (152 мг, 56%). Продукт частично разлагался на колонке. 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,96-1,27 (м, 12H), 1,68-1,79 (м, 4H, CH2), 1,91-1,97 (м, 2H, CH2), 2,19-2,22 (м, 2H, CH2), 2,51-2,54 (м, 2Н, CH2), 2,58-2,74 (м, 2Н, CH2CN), 3,22-3,26 (м, 2Н, ОСН2), 2,93 (м, 2Н, NCH), 3,44 (т, 2Н, NCH2), 3,42-3,54 (м, 4Н, ОСН2), 3,71 (с, 6Н, ОМе), 6,79-7,01 (м, 5Н, ароматика), 7,04-7,11 (м, 3Н, аром. Н), 7,13-7,69 (м, 13H, аром. H), 7,94-8,40 (м, 3H, аром. H), 8,76 (т, 1H, NH).
[0235] Затем были синтезированы два коротких олигонуклеотида (олиго-азо-1 и олиго-азо-2), включающие два азофосфорамидитных соединения 1 и 2, соответственно, для оценки эффективности расщепления. Олигонуклеотид азо-1 имеет поглощение при 450 нм и оранжевый цвет. После расщепления азосвязь разрывается и приводит к потере оранжевого цвета. После добавления 0,1 М раствора Na2S2O4 при комнатной температуре оранжевый цвет раствора олигонуклеотидов мгновенно исчезал, что указывало на очень эффективное расщепление азосвязи. ВЭЖХ-анализ олиго-азо-1 и продуктов расщепления также подтвердил тот же результат. ВЭЖХ-анализ после теста на расщепление олиго-азо-2 показал чистое и мгновенное разрушение азосвязи после обработки 0,1 М раствором Na2S2O4 при комнатной температуре.
[0236] Олиго-азо-1: 5'-GAX1CTA-3'
X1=
[0237] Олиго-азо-2: 5'-GAX2CTA-3'
X2=
[0238] Кроме того, была также проверена совместимость олиго-азо-1 с реагентами для секвенирования методом SBS. Сначала 10 мкМ олиго-азо-1 (10 мкл) инкубировали в 90 мкл смеси для включения (IMX), смеси для расщепления (CMS) и смеси для сканирования (USM) при 60°C в течение 60 минут. ВЭЖХ-анализ показал, что олиго-азо-1 был полностью стабилен в IMX, 90% олиго-азо-1 разлагалось в CMS, и 50% олиго-азо-1 оставалось в USM. Небольшое улучшение наблюдалось для олиго-азо-2. У олиго-азо-2 деградация снижалась до 44% по сравнению с деградацией олиго-азо-1 до 66%, когда оба олигонуклеотида инкубировали при 60°С в течение 60 минут в растворе CMS (10 мкл).
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Illumina, Inc.; Illumina Cambridge Limited
<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ХИМИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ И СНЯТИЯ ЗАЩИТЫ ДЛЯ СВЯЗАННЫХ С ПОВЕРХНОСТЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
<130> ILLINC.363WO/IP-1644-PCT
<150> US 62/788,045
<151> 2019-01-03
<150> US 62/671,816
<151> 2018-05-15
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический; P5: спаренный конец
<220>
<221> прочие признаки
<222> (23)..(23)
<223> n = u
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga ganctacac 29
<210> 2
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический; P7: спаренный конец
<220>
<221> прочие признаки
<222> (22)..(22)
<223> n = 8-оксо-гуанин
<400> 2
caagcagaag acggcatacg anat 24
<210> 3
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический; праймер P5 с поли-Т-спейсером
<220>
<221> прочие признаки
<222> (1)..(1)
<223> 5'-алкин
<220>
<221> прочие признаки
<222> (33)..(33)
<223> n = u
<400> 3
tttttttttt aatgatacgg cgaccaccga ganctacac 39
<210> 4
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический; праймер P7 с поли-Т-спейсером
<220>
<221> прочие признаки
<222> (1)..(1)
<223> 5'-алкин
<220>
<221> прочие признаки
<222> (32)..(32)
<223> n = 8-оксо-гуанин
<400> 4
tttttttttt caagcagaag acggcatacg anat 34
<210> 5
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический; праймер P15
<220>
<221> прочие признаки
<222> (1)..(1)
<223> 5'-алкин
<220>
<221> прочие признаки
<222> (29)..(29)
<223> n = аллил-Т-нуклеозид
<400> 5
ttttttaatg atacggcgac caccgaganc tacac 35
<210> 6
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический; праймер P17
<220>
<221> прочие признаки
<222> (1)..(1)
<223> 5'-алкин
<220>
<221> прочие признаки
<222> (7)..(7)
<223> диольный линкер
<220>
<221> прочие признаки
<222> (8)..(8)
<223> диольный линкер
<220>
<221> прочие признаки
<222> (9)..(9)
<223> диольный линкер
<400> 6
ttttttnnnc aagcagaaga cggcatacga gat 33
<210> 7
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический; P5: одно прочтение
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 8
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический; P7: одно прочтение
<400> 8
caagcagaag acggcatacg a 21
<---