Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики хронического активного лимфоцитарного миокарда у пациентов с "идиопатической" формой фибрилляции предсердий

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано в диагностике хронического активного лимфоцитарного миокардита у пациентов с «идиопатической» фибрилляцией предсердий (ФП).

ФП - наджелудочковая аритмия, которая характеризуется высокочастотными (400-600 в минуту), нерегулярными и нескоординированными сокращениями предсердий. ФП - одна из самых распространенных аритмий, которая регистрируется у 1,5% населения [1].

Этиология и патогенез ФП остается не до конца изученными. Аритмия является либо симптомом, либо осложнением основного заболевания. Наиболее распространенными заболеваниями, которые могут привести к возникновению ФП в настоящее время принято считать гипертоническую болезнь, ишемическую болезнь сердца (ИБС), заболевания щитовидной железы, врожденные и приобретенные клапанные пороки сердца, структурные генетические заболевания сердца (гипертрофическая, дилатационная кардиомиопатия), ревматизм. Помимо вышеуказанных заболеваний, так же имеются факторы риска (ожирение, сахарный диабет, апноэ во сне, хроническая болезнь почек), которые в совокупности могут привести к развитию ФП [2]. Но, к сожалению, у части пациентов с наличием ФП не удается установить основное заболевание, которое могло бы привести к развитию аритмии, поэтому она называется «идиопатическая» [3]. Согласно современным рекомендациям, данный термин является условным, так как для выявления возможной причины требуется тщательное обследование пациентов.

Одной из возможных причин развития ФП вследствие повреждения кардиомиоцитов и дальнейшим развитием фиброзных изменений является воспаление, вызываемое как вирусными, так и другими агентами (бактерии, грибковая инфекция и др.), которое приводит к повреждению миокарда за счет прямого цитопатического действия, либо опосредовано за счет образования антител с перекрестной реакцией к структурам миокарда, что впоследствии приводит к развитию распространенного фиброза миокарда [4]. Миокардит - воспалительное поражение миокарда, вызванное инфекционными, токсическими или аллергическими воздействиями, определяемое по установленным гистологическим, иммунологическим и иммуногистохимическим критериям [5]. Единственным достоверным способом диагностики гистологических изменений, в том числе воспалительного характера, является ЭМБ [6], но показания для проведения данного исследования строго ограничены, а проведение самой процедуры, при отсутствии достаточного опыта, сопряжено с высоким риском развития осложнений [7]. Поэтому требуется разработка неинвазивного и точного способа диагностики воспалительных изменений в миокарде.

Компонентом сократительной структуры, на который может воздействовать воспалительный процесс, и повреждение которого приводит к нарушению функции кардиомиоцита, что в свою очередь может приводить к развитию и поддержанию ФП, является сердечный миозин-связывающий белок С (С-белок). На сегодняшний день у него обнаружено три изоформы в поперечно-полосатой мышечной ткани: две в скелетной мышечной ткани, в быстрых и медленных волокнах, соответственно, и одна изоформа в сердечной мышце. Сегодня С-белок изучается при различных патологиях сердечно-судистой системы [8]. С-белок рассматривается в качестве потенциального диагностического биомаркера инфаркта миокарда и прогностического маркера сердечной недостаточности [9]. В то же время данный биохимический показатель может быть исследован в рамках определения наличия воспалительного процесса, так как он является компонентом сократительной структуры миокарда и при повреждении миокарда в результате протекающего воспалительного процесса возможно ожидать увеличения данного показателя.

Другим показателем воспаления, протекающего в миокарде, является стимулирующий фактор роста 2 (ST2). ST2 экспрессируется многими клетками, участвующими в иммунном ответе организма (базофилы, фибробласты, макрофаги и т.д.), в ходе каскада реакций, в том числе и в процессе активации комплимента, который является в свою очередь неотъемлемой частью гуморального и клеточного иммунного ответа. В ответ здоровой сердечной ткани на повреждение или механический стресс происходит высвобождение ST2 из иммунокомпетентных клеток и запускает кардиопротективный сигнальный каскад реакций, направленных на предотвращение развитие фиброзирования и ремоделирования сердца [10].

Известен способ топической диагностики воспаления в сердце [11], основанный на выполнении однофотонной эмиссионной компьютерной томографии. Способ обеспечивает высокую чувствительность и точность определения наличия и местонахождения воспалительных очагов в сердце, с исключением погрешностей при наложении изображений при визуализации всех камер сердца, сокращение времени исследования, уменьшение лучевой нагрузки на пациента. Недостатками данного способа является то, что метод является высокоспециализированный, имеет сложность технического исполнения и является оператор-зависимым.

В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе адекватного прототипа не обнаружено. Однако наиболее близким по значению способом является способ диагностики острого миокардита [12]. Способ позволяет повысить специфичность и точность диагностики острого миокардита. Недостатком данного способа является то, что его можно использовать лишь для диагностики острого миокардита, но не хронического латентного.

Основной причиной предложения данного способа является поиск возможностей комбинированного применения отдельных показателей уровней биохимических маркеров воспаления для повышения точности неинвазивной диагностики воспалительных заболеваний сердца и разработка объективного высокоинформативного способа определения хронического лимфоцитарного миокардита.

Задача изобретения - разработка объективного высокоинформативного способа неинвазивной диагностики хронического лимфоцитарного миокардита у пациентов с «идиопатической» формой ФП.

Поставленную задачу решают следующим образом:

У пациентов проводят забор периферической крови с целью количественного определения в сыворотке крови уровней биохимических маркеров воспаления (сердечный миозин-связывающий белок С (MYBPC3), стимулирующий фактор роста 2 (ST2)) посредством твердофазного иммуноферментного анализа. Затем проводится статистический расчет пороговых значений показателей с использованием ROC-анализа, определение чувствительности и специфичности для определенных значений. Если уровень ST2 более 22,06 нг/мл и MYBPC3 более 0,218 нг/мл прогнозируют наличие хронического активного миокардита.

Техническим результатом является возможность неинвазивной диагностики хронического лимфоцитарного миокардита у пациентов с «идиопатической» формой ФП.

Существенные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не очевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков в проанализированной литературе не обнаружено. Предлагаемое изобретение может быть использовано в здравоохранении.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему фигур. На фиг. 1 изображена ROC-кривая прогностического коэффициента по результатам анализа уровня ST2 с площадью под кривой 0,719, уровнем достоверности 0,012. Чувствительность данной модели составила 86,36, при специфичности 58,82.

На фиг. 2 изображена ROC-кривая прогностического коэффициента по результатам уровня MYBPC3 с площадью под кривой 0,725, уровнем достоверности 0,007. Чувствительность данной модели составила 100,0, при специфичности 44,44.

Способ осуществляют следующим образом.

У пациентов проводят забор периферической крови с целью количественного определения в сыворотке крови уровней биохимических маркеров воспаления (сердечный миозин-связывающий белок С (MYBPC3), стимулирующий фактор роста 2 (ST2)).

Определение уровня миозин-связывающего белка MYBPC3 в сыворотке крови проводится методом твердофазного иммуноферментного анализа. Используется коммерческая тест-система фирмы «Cloud-Clone Corp.» (США).

Используемый материал: сыворотка крови.

Сбор и хранение образцов: Забор крови проводится натощак из локтевой вены методом венопункции в специальную стерильную вакуумную систему с активатором свертывания.

Образцам крови дают свернуться в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С, а затем центрифугируют 20 минут при скорости приблизительно 1000 g при комнатной температуре. Анализируют немедленно или хранят аликвоты образцов при -20°С - 80°С.

Протокол анализа:

1. Определяют необходимое для текущей постановки количество лунок, с учетом приготовленных разведений стандарта, контрольных материалов и образцов. Анализируемые образцы сыворотки крови разводят специальным буфером в соотношении 1:5. Приготавливают 7 лунок для стандартов, 1 лунку для бланка.

2. Вносят по 100 мкл каждого разведения стандарта, бланка и образцов в соответствующие лунки. Закрывают микропланшет крышкой. Инкубируют 1 ч при 37°С.

3. Снимают крышку, удаляют жидкость из лунок, не промывают.

4. Вносят по 100 мкл рабочего раствора детектирующего реагента А в каждую лунку. Закрывают микропланшет. Инкубируют 1 час при 37°С.

5. Аспирируют жидкость из лунок и промывают планшет, внося по 350 мкл готового буфера для промывок в каждую лунку, с помощью сжимаемой бутыли, многоканальной пипетки, ручного диспенсера или автоматического промывочного устройства, и оставляют не менее чем на - 1-2 минуты. Удаляют жидкость из всех лунок и тщательно осушают лунки, постучав перевернутым микропланшетом по фильтровальной бумаге. Повторяют процедуру в общей сложности 3 раза. После последней промывки удаляют из лунок всю жидкость полностью аспирацией или декантированием, переворачивают микропланшет и стучат им по чистой фильтровальной бумаге.

6. Вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл детектирующего реагента В. Накрывают планшет и инкубируют в течение 30 минут при 37°С.

7. Повторяют процедуру аспирации/промывки 5 раз, как описано в шаге 4.

8. Вносят по 90 мкл субстратного раствора ТМБ в каждую лунку. Закрывают новой крышкой. Инкубируют в течение 10-20 минут при температуре 37°С (но не более 30 минут) в защищенном от солнечных лучей месте. При добавлении раствора субстрата цвет жидкости поменяется на голубой.

9. Вносят по 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Аккуратно перемешивают жидкость в лунках, постучав по краю микропланшета. При этом цвет жидкости в лунках изменяется на желтый.

10. Удаляют любые капли жидкости и отпечатки пальцев с наружной стороны дна микропланшета. Затем немедленно выполняют измерения с помощью микропланшетного ридера при длине волны 450 нм.

Определение уровня ST2 (стимулирующий фактор роста, экспрессирующийся геном 2) в сыворотке крови проводится методом твердофазного иммуноферментного анализа. Используется коммерческая тест-система фирмы «Critical Diagnostics)) (США).

Используемый материал: сыворотка крови.

Сбор и хранение образцов: Забор крови проводится натощак из локтевой вены методом венопункции в специальную стерильную вакуумную систему с активатором свертывания. Полученные образцы крови инкубируют при комнатной температуре 30 - 45 минут, после чего в течение 15 минут центрифугируют при скорости 3000 об/мин. при комнатной температуре. Полученную сыворотку декантируют в одноразовые пластиковые пробирки и подвергают заморозке и хранению в температурных условиях при -20°С или ниже.

Протокол анализа:

1. Определяют необходимое для текущей постановки количество лунок, с учетом приготовленных разведений стандарта, контрольных материалов и образцов. Анализируемые образцы сыворотки крови разводят специальным буфером в соотношении 1:50.

2. Вносят по 100 мкл стандартных растворов, контрольных сывороток и предварительно разведенных образцов. Инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре на микропланшетном шейкере со скоростью 750 оборотов/мин.

3. Аспирируют жидкость из лунок и промывают планшет, внося по 350 мкл готового буфера для промывок. Удаляют жидкость из всех лунок и тщательно осушают лунки, постучав перевернутым микропланшетом по фильтровальной бумаге. Повторяют процедуру в общей сложности 3 раза. После последней промывки удаляют из лунок всю жидкость полностью аспирацией или декантированием, переворачивают микропланшет и стучат им по чистой фильтровальной бумаге.

4. В каждую лунку вносят 100 мкл реагента с биотинилированными антителами, инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре на микропланшетном шейкере со скоростью 750 оборотов/мин.

5. Повторяют процедуру аспирации/промывки 3 раза, как описано в шаге 3.

6. Вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл пероксидазы хрена со стрептавидином. Накрывают планшет и инкубируют на шейкере в течение 30 минут при комнатной температуре на микропланшетном шейкере со скоростью 750 оборотов/мин.

7. Повторяют процедуру аспирации/промывки 3 раза, как описано в шаге 3.

8. Вносят по 100 мкл раствора субстратного раствора ТМБ в каждую лунку. Инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре на микропланшетном шейкере со скоростью 750 оборотов/мин. в защищенном от солнечных лучей месте. При добавлении раствора субстрата цвет жидкости поменяется на голубой.

9. Вносят по 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Перемешивают в течение 30 секунд. При этом цвет жидкости в лунках изменяется на желтый. Аккуратно перемешивают жидкость в лунках, постучав по краю микропланшета.

10. Выполняют измерение с помощью микропланшетного иммуноферментного анализатора при длине волны 450 нм с использованием референсной длины волны 620 нм.

Если уровень ST2 более 22,06 нг/мл и MYBPC3 более 0,218 нг/мл, прогнозируют наличие хронического активного миокардита.

Клинические примеры

Пример 1. Пациент К., 28 лет, находился на обследовании и лечении в НИИ Кардиологии в отделении Хирургического лечения сложных нарушений ритма сердца и электрокардиостимуляции с диагнозом: Идиопатическое нарушение ритма сердца. Длительно-персистирующая форма фибрилляции предсердий. Из данных анамнеза было выявлено, что пациент страдает аритмией более 1 года. Так же известно, что перед началом заболевания перенес ОРЗ. В ходе обследования выявлены показания для проведения оперативного лечения в объеме РЧА фибрилляции предсердий. По предлагаемому способу первым этапом выполнен забор периферической крови для проведения иммуноферментного анализа с целью определения уровней биохимических маркеров воспаления ST2 и MYBPC3. Согласно проведенному анализу уровень ST2 составил 60,414 нг/мл, MYBPC3 - 0,413 нг/мл. Таким образом была предположена высокая вероятность наличия хронического активного лимфоцитарного миокардита. Пациенту проведено оперативное лечение в объеме РЧА фибрилляции предсердий, взята биопсия миокарда из правого желудочка из трех позиций: верхушка правого желудочка, межжелудочковая перегородка и выводной отдел правого желудочка. По результатам гистологического и иммуногистохимического исследования у пациента был подтвержден активный лимфоцитарный миокардит, активность 3.

Пример 2. Пациент С., 32 года, находился на обследовании и лечении в НИИ Кардиологии в отделении Хирургического лечения сложных нарушений ритма сердца и электрокардиостимуляции с диагнозом: Идиопатическое нарушение ритма сердца. Персистирующая форма фибрилляции предсердий. Из данных анамнеза было выявлено, что пациент страдает аритмией более 2 года. Связь с инфекцией не установлена. В ходе обследования выявлены показания для проведения оперативного лечения в объеме РЧА фибрилляции предсердий. По предлагаемому способу первым этапом выполнен забор периферической крови для проведения иммуноферментного анализа с целью определения уровней биохимических маркеров воспаления ST2 и MYBPC3. Согласно проведенному анализу уровень ST2 составил 55,385 нг/мл, MYBPC3 - 0,287 нг/мл. Таким образом была предположена высокая вероятность наличия хронического активного лимфоцитарного миокардита. Пациенту проведено оперативное лечение в объеме РЧА фибрилляции предсердий, взята биопсия миокарда из правого желудочка из трех позиций: верхушка правого желудочка, межжелудочковая перегородка и выводной отдел правого желудочка. По результатам гистологического и иммуногистохимического исследования у пациента был подтвержден активный лимфоцитарный миокардит, активность 1.

Пример 3. Пациент Ш., 57 лет, находился на обследовании и лечении в НИИ Кардиологии в отделении Хирургического лечения сложных нарушений ритма сердца и электрокардиостимуляции с диагнозом: Идиопатическое нарушение ритма сердца. Персистирующая форма фибрилляции предсердий. Из данных анамнеза было выявлено, что пациент страдает аритмией в течение 5 лет. Так же известно, что перед началом заболевания перенес ОРЗ. В ходе обследования выявлены показания для проведения оперативного лечения в объеме РЧА фибрилляции предсердий. По предлагаемому способу первым этапом выполнен забор периферической крови для проведения иммуноферментного анализа с целью определения уровней биохимических маркеров воспаления ST2 и MYBPC3. Согласно проведенному анализу уровень ST2 составил 33,559 нг/мл, MYBPC3 - 0,415 нг/мл. Таким образом была предположена средняя вероятность наличия хронического активного лимфоцитарного миокардита. Пациенту проведено оперативное лечение в объеме РЧА фибрилляции предсердий, взята биопсия миокарда из правого желудочка из трех позиций: верхушка правого желудочка, межжелудочковая перегородка и выводной отдел правого желудочка. По результатам гистологического и иммуногистохимического исследования у пациента был подтвержден активный лимфоцитарный миокардит, активность 4.

Пример 4. Пациент Т., 30 лет, находился на обследовании и лечении в НИИ Кардиологии в отделении Хирургического лечения сложных нарушений ритма сердца и электрокардиостимуляции с диагнозом: Идиопатическое нарушение ритма сердца. Пароксизмальная форма фибрилляции предсердий. Из данных анамнеза было выявлено, что пациент страдает аритмией в течение 1 года. Связь с инфекцией не установлена. В ходе обследования выявлены показания для проведения оперативного лечения в объеме РЧА фибрилляции предсердий. По предлагаемому способу первым этапом выполнен забор периферической крови для проведения иммуноферментного анализа с целью определения уровней биохимических маркеров воспаления ST2 и MYBPC3. Согласно проведенному анализу уровень ST2 составил 16,388 нг/мл, MYBPC3 - 0,137 нг/мл. Так как значения всех показателей были ниже пороговых коэффициентов, была предположена крайне низкая вероятность наличия хронического активного лимфоцитарного миокардита. Пациенту проведено оперативное лечение в объеме РЧА фибрилляции предсердий, взята биопсия миокарда из правого желудочка из трех позиций: верхушка правого желудочка, межжелудочковая перегородка и выводной отдел правого желудочка. По результатам гистологического и иммуногистохимического исследования у пациента активный лимфоцитарный миокардит не подтвержден.

Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0, StatSoft, USA. Для оценки нормальности распределения признака использовали критерий Шапиро-Уилка. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни для независимых выборок. Для оценки корреляционных связей между парами количественных признаков использовали ранговый непараметрический коэффициент Спирмена. Для сравнительной оценки информативности неинвазивных методов диагностики проводился метод ROC-анализа с помощью пакета программ MedCalc stastical software. Рассчитана логистическая регрессия для исследуемых параметров. При уровне значимости р меньше 0,05 считалось, что исследуемый показатель в сравниваемых группах имел статистически значимые различия.

Предлагаемый способ апробирован у 39 пациентов, у которых выявлена «идиопатическая» форма фибрилляции предсердий и определены показания к проведению оперативного лечения в объеме РЧА фибрилляции предсердий. Клиническая характеристика и результаты инструментальных методов обследования пациентов представлена в таблице 1.

Все пациенты живы. Осложнений в раннем и позднем послеоперационном периоде не было.

Рандомизация пациентов

Была проведена ЭМБ из правого желудочка в соответствии со стандартом процедуры забора биоптатов из трех отделов. Затем проводится гистологическое и иммуногистохимическое исследования в соответствии со стандартизированной процедурой анализа биопсийного материала. Диагноз активного лимфоцитарного миокардита устанавливался при наличии в биоптате CD3+ Т-лимфоцитов более 7 клеток/мм², активность воспалительного процесса определялась в соответствии с критериями С. Basso (таблица 2).

Источники информации

1. S.S. Chugh, R.Havmoeller, К. Narayanan et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a Global Burden of Disease 2010 Study / Circulation. 2014. Vol. 129; N 8: 837-847. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA. 113.005119

2. S. Levy, M. Maarek, P. Coumel et al. Characterization of different subsets of atrial fibrillation in general practice in France: the ALFA study / Circulation. 1999. Vol. 99; 3028-3035. doi: 10.1161/01.cir.99.23.3028

3. Wyse DG, Van Gelder 1С, Ellinor PT, et al. Lone atrial fibrillation: does it exist?. J Am Coll Cardiol. 2014;63(17):1715-1723. doi:10.1016/j.jacc.2014.01

4. Носкова, M.B. Воспаление и инфекция - нераспознанные причины возникновения фибрилляции предсердий / М.В. Носкова // Анналы аритмологии. 2006. №2; 47-52.

5. Richardson P., McKenna W., Bristow М. et al. Report of the 1995 World Health Organization/International Society and Federation of Cardiology Task Force on the Definition and Classification of cardiomyopathies/ Circulation 1996; 93: 841-842. doi: 10.1161/01.cir.93.5.841

6. Cooper L.T., Baughman K.L., Feldman A.M et al. The Role of Endomyocardial Biopsy in the Management of Cardiovascular Disease: A Scientific Statement From the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology. J of the American College of Cardiology 2007; 50 (19): 1914-1931. Doi: 10.1016/j.jacc.2007.09.008

7. Deckers J.W., Hare J.M., Baughman K.M. Complications of transvenous right ventricular endomyocardial biopsy in adult patients with cardiomyopathy: a seven-year survey of 546 consecutive diagnostic procedures in a tertiary referral center. J Am Coll Card. 1992; 19:43-47. Doi: 10.1016/0735-1097(92)90049-s

8. S. Sadayappan, P.P. de Tombe. Cardiac myosin binding protein-C as a central target of cardiac sarcomere signaling: a special mini review series / Pflugers Arch. 2014. Vol. 466; 195-200. Doi: 10.1007/s00424-013-1396-8

9. S. Govindan, A. McElligott, S. Muthusamy et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction / J. Mol. Cell Cardiol. 2012. Vol. 52; 154-164. Doi: 10.1016/j.yjmcc.2011.09.011

10. R.V. Shah, J.L. Januzzi. ST2: a novel remodeling biomarker in acute and chronic heart failure / Curr. Heart Fail. Rep.2010. Vol. 7; 9. Doi: 10.1007/sl 1897-010-0005-9

11. Пат. №2612527, Российская Федерация, МПК А61В /03, «Способ топической диагностики в сердце» [Текст]/ Сазонова С.И., Ильюшенкова Ю.Н., Лишманов Ю.Б., Завадовский К.В.; заявитель и правообладатель: «Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт кардиологии" (RU) - №2015153555; заявл. 14.12.2015; опубл. 09.03.2017, Бюл. №7.

12. Пат. №2612527, Российская Федерация, МПК G01N 33/573, «Способ диагностики острого миокардита» [Текст]/ Корюкина И.П., Сюзева Е.Л., Зубов Е.В.; заявитель и правообладатель: «Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия Министерства Здравоохранения Российской Федерации» (RU) - №2003132778/15; заявл. 10.11.2003; опубл. 27.01.2005, Бюл. №3.