Результат интеллектуальной деятельности: ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ГЕПАТИТА, ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ И ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ СЛИТЫЕ БЕЛКИ

Область техники, к которой относится изобретение

[1] Настоящее изобретение относится к композиции для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени. В частности, настоящее изобретение относится к слитому белку, включающему биологически активный белок и мутантный белок FGF21; и фармацевтической композиции, содержащей слитый белок, которая является эффективной для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.

Уровень техники

[2] Существуют различные причины заболеваний печени, такие как вирусные или бактериальные инфекции, алкоголь или токсические вещества, избыточное накопление жира или тяжелых металлов, аномальные иммунные ответы и т.д. Эти причинами может быть вирусный гепатит, алкогольная болезнь печени, неалкогольная жировая болезнь печени, токсический гепатит, аутоиммунные заболевания печени и т.д. Кроме того, некоторые заболевания печени могут прогрессировать с развитием цирроза печени, фиброза печени и рака печени в результате хронического прогрессирования.

[3] Острое заболевание печени, такое как острый вирусный гепатит или токсический гепатит, вызывает сильную усталость, плохой аппетит, желтуху и т.д., и может иногда прогрессировать до острой печеночной недостаточности, которая может привести к смерти, если не сделать пересадку печени. С другой стороны, хронические заболевания печени, которые медленно прогрессируют, такие как хронический вирусный гепатит и жировая болезнь печени, в основном протекают бессимптомно, и пациенты могут не испытывать значительных неудобств в повседневной жизни, однако может развиваться фиброз печени, и хронические заболевания печени могут прогрессировать до цирроза печени и рака печени, хотя пациенты могут не знать об этом. Согласно статистическим данным по распространенности цирроза печени в Корее, распространенность цирроза печени у взрослых составляет 0,5%, а у людей в возрасте 65 лет и старше - около 1,0%. Это результат опроса, проведенного на основе сведений о диагностированных случаях заболевания в медицинских учреждениях, поэтому реальная распространенность цирроза печени, вероятно, будет более высокой. Наиболее частой причиной цирроза печени в Корее является вирусный гепатит, а второй наиболее частой причиной является алкогольная болезнь печени.

[4] Если повреждение печени постоянно повторяется по какой-либо причине, существует большой риск развития цирроза печени, фиброза печени и рака печени, независимо от присутствия или отсутствия симптомов. При развитии цирроза печени уплотненную печень сложно восстановить до ее первоначального состояния даже при лечении.

[5] Глюкагоноподобный пептид 1 (ГПП-1) является инкретиновым гормоном, состоящим из 31 аминокислоты, который секретируют L-клетки в кишечнике при стимуляции пищей и т.д. Его биологические эффекты возникают в результате внутриклеточной сигнализации через рецептор ГПП-1, сопряженный с G-белком рецептор, который экспрессируется в тканях-мишенях, таких как β-клетках в поджелудочной железе, головном мозге и т.д. ГПП-1, секретируемый в кровь, имеет очень короткий полупериод существования меньше 2 минут, что обусловлено потерей активности вследствие расщепления аминокислот на N-конце ферментом дипептидилпептидазой-4 (DPP-4). Поскольку ГПП-1 стимулирует секрецию инсулина в β-клетках поджелудочной железы в зависимости от уровня глюкозы в крови, он оказывает сильное действие на снижение уровня глюкозы в крови, не вызывая гипогликемии. Кроме того, введение ГПП-1 приводит к снижению массы тела в различных моделях на животных и у людей, что, как известно, вызвано снижением потребления пищи из-за его воздействия на подавление аппетита. ГПП-1 индуцирует пролиферацию β-клеток и повышает жизнеспособность β-клеток, ингибируя гибель клеток, вызванную токсичностью гликолипидов, через рецептор ГПП-1, экспрессируемый в β-клетках поджелудочной железы. Избыточная секреция глюкагона повышает уровень глюкозы в крови, что, как известно, является одной из причин гипергликемии у больных диабетом. Кроме того, известно, что ГПП-1 действует на α-клетки поджелудочной железы, ингибируя повышение уровня глюкозы в крови натощак посредством ингибирования секреции глюкагона, специфичного в отношении протеинкиназы A (PKA).

[6] Эксендин-4 является клинически важным агонистом рецептора ГПП-1. Эксендин-4 представляет собой полипептид из 39 аминокислотных остатков и обычно вырабатывается в слюнных железах ящерицы аризонского ядозуба. Известно, что эксендин-4 обладает гомологией 52% с аминокислотной последовательностей ГПП-1 и взаимодействует с рецептором ГПП-1 у млекопитающих (Thorens et al. (1993) Diabetes 42:1678-1682). Эксендин-4, как было показано, стимулировал секрецию инсулина в инсулин-продуцирующих клетках in vitro, при этом индукция секреции инсулина инсулинпродуцирующими клетками более сильная, чем у ГПП-1 при эквимолярных условиях. Хотя эксендин-4 сильно стимулирует секрецию инсулина, снижая уровни глюкозы в крови, как у грызунов, так и у людей, с более длительным действием, чем в случае ГПП-1, эксендин-4 демонстрирует антигенность у млекопитающих, лишенных ГПП-1, поскольку он содержит незнакомые эпитопы для таких животных.

[7] Способность аналогов ГПП-1 и эксендина-4 (например, лираглутида и эксенатида) улучшать контроль глюкозы у людей была подтверждена клинически. Сообщали, что ГПП-1 увеличивает β-клеточную массу путем ингибирования апоптоза и индуцированной пролиферации. Кроме того, также сообщали, что ГПП-1 действует в качестве кишечного гормона, ингибируя секрецию желудочного сока и опорожнение желудка, одновременно усиливая сигналы насыщения, снижая, таким образом, аппетит. Такое действие ГПП-1 может объяснять потерю веса, наблюдаемую при введении аналогов ГПП-1 пациентам с диабетом 2-го типа. Кроме того, ГПП-1 проявляет кардиозащитное действие после ишемии у грызунов.

[8] Предпринимали различные попытки создать аналоги ГПП-1 длительного действия. Клинически подтвержденные аналоги ГПП-1 длительного действия включают в себя дулаглутид (WO 2005/000892) и альбиглутид (WO 2003/059934). Дулаглутид является слитым с Fc-фрагментом аналогом ГПП-1, а альбиглутид является слитым с альбумином аналогом ГПП-1, при этом оба из них имеют фармакокинетические профили, позволяющие вводить их один раз в неделю. Оба лекарственных средства оказывают превосходное воздействие на снижение уровня глюкозы в крови и снижение массы тела при введении один раз в неделю, а также значительно обеспечивают значительно большее удобство лечения по сравнению с эксенатидом и лираглутидом.

[9] Между тем, фактор роста фибробластов 21 (FGF21), синтезируемый в печени, является гормоном, который, как известно, играет важную роль в гомеостазе глюкозы и липидов. FGF21 проявляет фармакологическое действие на печень, адипоциты, β-клетки поджелудочной железы, гипоталамус в головном мозге и мышечные ткани, где экспрессируются как FGF21-специфический рецептор, то есть рецептор FGF, так и β-Klotho комплекс. Сообщали, что в моделях различных диабетических и метаболических заболеваний на неотносящихся к человеку приматах и мышах FGF21 может снижать уровни глюкозы в крови инсулиннезависимым образом, снижать массу тела и снижать концентрации триглицеридов и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в крови. Кроме того, известно, что FGF21 также обладает действием, улучшающим чувствительность к инсулину, и, таким образом, он обладает высоким потенциалом в качестве мишени для нового противодиабетического средства или лекарственного средства против ожирения (WO 2003/011213).

[10] Таким образом, для создания нового противодиабетического средства на основе FGF21 были предприняты попытки повысить его биологическую активность и стабильность in vivo путем конструирования мутантов FGF21 на основе последовательности FGF21 дикого типа посредством замены, вставки и делеции некоторых аминокислот (см. WO 2010/065439). Однако, поскольку FGF21 имеет очень короткий полупериод существования, оказалось проблематичным использовать его непосредственно в качестве биотерапевтического средства (Kharitonenkov, A. et al., Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635, 2005). Полупериод существования FGF21 in vivo составляет от 1 до 2 часов у мышей и от 2,5 до 3 часов у обезьян. Следовательно, для применения FGF21 в его нынешней форме в качестве терапевтического средства для лечения диабета требуется ежедневное введение.

[11] Сообщали о различных подходах в попытке увеличить полупериод существования in vivo рекомбинантных белков FGF21. Одним из таких примеров является связывание полиэтиленгликоля (ПЭГ), то есть полимерного материала, с FGF21 для увеличения его молекулярной массы, ингибируя, таким образом, почечную экскрецию и увеличивая время удерживания in vivo (см. WO 2012/066075). В другом подходе пытались увеличить полупериод существования путем его слияния с жирной кислотой, которая связывается с человеческим альбумином (см. WO 2012/010553). В дополнительном примере предпринята попытка увеличить полупериод существования с сохранением фармакологической активности, эквивалентной активности FGF21 дикого типа, путем создания агонистического антитела, которое специфично связывается с рецептором FGF человека отдельно или в виде комплекса с β-klotho (см. WO 2012/170438). В другом примере полупериод существования был увеличен путем получения слитых белков длительного действия, в которых Fc-область IgG связывается с молекулой FGF21 (см. WO 2013/188181).

[12] Среди различных технологий, доступных для создания лекарственных средств длительного действия, широко применяется технология слияния с Fc-фрагментом, поскольку она имеет меньше недостатков, наблюдаемых в случае других подходов, таких как индукция иммунного ответа или токсическое действие при увеличении полупериода существования in vivo. Для создания Fc-слитого белка FGF21 в качестве лекарственного средства длительного действия должны быть выполнены следующие условия.

[13] Во-первых, снижение активности in vitro, вызванное слиянием, должно быть сведено к минимуму. Как N-конец, так и С-конец FGF21 вносят вклад в активность FGF21. В этом отношении известно, что активность слитых белков FGF21 значительно изменяется в зависимости от положения слияния. Соответственно, активность Fc-слитых белков FGF21, в которых мутации введены в FGF21, может изменяться в зависимости от присутствия/отсутствия или положения слияния. Во-вторых, фармакокинетический профиль, позволяющий производить введения людям с интервалом один раз в неделю, должен быть реализован путем увеличения полупериода существования in vivo посредством слияния. В-третьих, с учетом того, что иммуногенность можно ожидать у большинства пациентов после введения биофармацевтических средств, риск иммуногенности из-за слитого линкера или мутации должен быть сведен к минимуму. В-четвертых, не должно быть никаких проблем со стабильностью, связанных с положением слияния или введением мутации. В-пятых, поскольку нежелательные иммунные ответы могут возникать в зависимости от изотипов слитого иммуноглобулина, необходимо решение, которое позволит предотвратить такие ответы.

[14] Уже сообщали о попытке создать слитый белок длительного действия путем связывания Fc-области иммуноглобулина G (IgG) с молекулой FGF21 (см. WO 2013/188181). В случае одной структуры Fc-FGF21, где Fc слит с N-концом FGF21 дикого типа, хотя отсутствует явное различие в активности in vitro по сравнению с FGF21 дикого типа, полупериод существования, как известно, очень короткий вследствие расщепления белка in vivo. Чтобы решить эту проблему, была предпринята попытка увеличить полупериод существования in vivo путем введения нескольких мутаций в определенные участки FGF21, чтобы предотвратить расщепление белка. Однако при введении множественных мутаций риск иммуногенности может возрастать. Напротив, в случае структуры FGF21-Fc, где Fc слит с C-концом молекулы FGF21, известно, что наблюдается значительное снижение активности, вызванное слиянием в этом участке, по сравнению со структурой Fc-FGF21.

[15] Комбинированное введение ГПП-1 и FGF21 может оказывать синергический эффект по сравнению с отдельным введением в зависимости от механизмов действия и тканей-мишеней в организме, при этом можно ожидать превосходную противодиабетическую эффективность и дополнительные преимущества. Эффекты от комбинированного введения ГПП-1 и FGF21 или ГПП-1/слитого белка FGF21 уже были исследованы и описаны (см. WO 2010/142665 и WO 2011/020319).

[16] Для создания слитого белка, содержащего ГПП-1 и FGF21, необходимо решить различные проблемы. Поскольку ГПП-1 дикого типа и FGF21 дикого типа имеют очень короткий полупериод существования in vivo, их необходимо вводить по меньшей мере один раз в день, даже если они разработаны в качестве лекарственных средств. Таким образом, технологии получения препаратов длительного действия, такие как слияние с Fc-фрагментом, необходимы для создания слитого белка длительного действия в целях повышения удобства для пациентов. В лекарственном средстве двойной функции для двух мишеней ГПП-1 и FGF21 введение мутации(й) является существенным условием для сохранения активности и стабильности лекарственного средства in vivo, и проблемы, связанные с изменениями активности, структуры или стабильности, вызванные каждой мутацией, должны быть решены. Лекарственное действие для двух мишеней ГПП-1 и FGF21 должно быть хорошо сбалансировано, и для этой цели требуется создание лекарственных средств с учетом их активности in vitro, фармакокинетических профилей, фармакологической эффективности в моделях на животных и даже клинической оценки эффективности у людей. Слитый белок имеет структуру, которая не может существовать в организме человека, и является структурно сложным по сравнению со слитым белком к одной мишени. Кроме того, поскольку инженерия мутаций или линкеров необходима для баланса двух мишеней, может возрастат вероятность образования агрегатных комплексов, и для предотвращения этого может потребоваться дополнительная белковая инженерия. Кроме того, потенциальная иммуногенность может возрастать из-за появления новых мутационных последовательносткй или сложных структур, что следует учитывать или избегать.

[17] Авторы настоящего изобретения приложили усилия для решения вышеуказанных проблем и в результате разработали слитый белок, эффективный для лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, и выполнили настоящее изобретение.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

[18] Цель настоящего изобретения состоит в предоставлении фармацевтической композиции для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.

Решение задачи

[19] В соответствии с одним объектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, содержащая в качестве эффективного компонента слитый белок, содержащий мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(7):

[20] (1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 68);

[21] (2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 69);

[22] (3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 70);

[23] (4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[24] (5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[25] (6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E, в сочетании с одной или более мутациями (1)-(5) выше; и

[26] (7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.

[27] Кроме того, в соответствии с другим объектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, содержащая в качестве эффективного компонента слитый белок, включающий мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок или мутантный белок или его фрагмент; и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(7):

[28] (1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 68);

[29] (2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 69);

[30] (3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 70);

[31] (4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[32] (5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[33] (6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E, в сочетании с одной или более мутациями (1)-(5) выше; и

[34] (7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.

[35] Кроме того, в соответствии с другим объектом настоящего изобретения предложено применение фармацевтической композиции настоящего изобретения для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени

[36] Кроме того, в соответствии с другим объектом настоящего изобретения предложено применение фармацевтической композиции настоящего изобретения для получения композиции для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.

[37] Кроме того, в соответствии с другим объектом настоящего изобретения предложен способ предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, который включает этап введения слитого белка настоящего изобретения субъекту.

Полезные эффекты изобретения

[38] Фармацевтическая композиция настоящего изобретения для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, содержащая в качестве эффективного компонента слитый белок, включающий мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); и Fc-область иммуноглобулина ингибирует пролиферацию воспалительных клеток и фибробластов, и, таким образом, может эффективно применяться в качестве композиции для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.

Краткое описание чертежей

[39] Фиг. 1A является графиком, на котором показаны in vitro активности DFD4, DFD5, DFD6, DFD7, DFD9 и DFD13 в качестве слитых белков, включающих мутантные белки FGF21 (в дальнейшем "слитый мутантный белок FGF21"), с использованием клеточной линии HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека. Слитые мутантные белки FGF21 не демонстрировали значимого снижения активности из-за введения мутации.

[40] Фиг. 1B является графиком, на котором показаны in vitro активности DFD6, DFD13, DFD18, DFD72, DFD73 и DFD74 в качестве слитых белков, включающих слитые мутантные белки FGF21, с использованием клеточной линии HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека. Слитые мутантные белки FGF21 не демонстрировали значимого снижения активности из-за введения мутации.

[41] Фиг. 1C является графиком, на котором показаны in vitro активности DFD6 и DFD6 (E. coli) в качестве слитых белков, включающих слитые мутантные белки FGF21, с использованием клеточной линии HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека. Слитые мутантные белки FGF21 не демонстрировали значимого снижения активности из-за введения мутации.

[42] Фиг. 2A является графиком, на котором показаны in vitro активности DFD3 и DFD4 в качестве слитых мутантных белков FGF21, в которые был введен линкер, соединяющий N-конец FGF21 и Fc-область, с использованием клеточной линии HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека. Слитый мутантный белок FGF21 не демонстрировал значимого снижения активности, хотя было показано небольшое различие в активности в зависимости от последовательности линкера.

[43] Фиг. 2B является графиком, на котором показаны in vitro активности DFD1 и DFD13 в качестве слитых мутантных белков FGF21, в которые был введен линкер, соединяющий N-конец FGF21 и Fc-область, с использованием клеточной линии HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека. Слитый мутантный белок FGF21 не демонстрировал значимого снижения активности, хотя было показано небольшое различие в активности в зависимости от последовательности линкера.

[44] Фиг. 3 является графиком, на котором показаны in vitro активности RGE (Amgen), Fc-FGF21 (Lilly) и DFD1 с использованием клеточной линии HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека. DFD1 и RGE (Amgen) обладали подобными активностями, тогда как Fc-FGF21 (Lilly) обладал в два раза более высокой in vitro активностью, чем остальные белки.

[45] Фиг. 4A представляет собой результат анализа с помощью эксклюзионной хроматографии DFD4, слитого мутантного белка FGF21.

[46] Фиг. 4B представляет собой результат анализа с помощью эксклюзионной хроматографии DFD13, слитого мутантного белка FGF21, в который была введена мутация EIRP.

[47] Фиг. 4C является графиком, на котором сравнивают предполагаемое содержание агрегатов высокой молекулярной массы (% HMW) DFD4 и DFD13 с использованием эксклюзионной хроматографии, чтобы проверить влияние мутации EIRP в FGF21 на стабильность слитого белка. Было подтверждено, что DFD13 был ассоциирован с более низким процентом агрегатов высокой молекулярной массы (% HMW) на начальной стадии и в момент времени больше чем через 2 недели по сравнению с DFD4, что указывает на то, что введение мутации EIRP повышает стабильность слитого мутантного белка FGF21, значительно уменьшая, таким образом, % HMW.

[48] На Фиг. 5 показана концентрация каждого белка в крови в зависимости от времени, в течение 96 часов после подкожного введения слитых мутантных белков FGF21. Данные представлены как средние значения и стандартное отклонение.

[49] Фиг. 6A является графиком, на котором показаны изменения массы тела, выраженной в граммах, после однократного введения DFD18 в модели на мышах с алиментарным ожирением от момента введения до дня 14. DFD18 продемонстрировал превосходный эффект снижения массы тела. Данные представлены как средние значения и среднеквадратические отклонения среднего.

[50] Фиг. 6B является графиком, на котором показаны изменения массы тела, выраженной в %, после однократного введения DFD18 в модели на мышах с алиментарным ожирением от момента введения до дня 14. DFD18 продемонстрировал превосходный эффект снижения массы тела. Данные представлены как средние значения и среднеквадратические отклонения среднего.

[51] Фиг. 7 является графиком, на котором показаны in vitro активности слитых белков ГПП-1 в зависимости от шарниров, которые связывают C-конец мутантов ГПП-1 и ГПП-1 с Fc-областью, с использованием клеточной линии CHO с оверэкспрессией человеческого рецептора ГПП-1. Как правило, слитый белок (DFD23), включающий последовательность ГПП-1 (A2G), демонстрировал в 2-3 раза более низкую активность, чем другие слитые белки, включающие другие мутантные последовательности ГПП-1. Не было показано значимого различия в активности ГПП-1 между слитыми белками, включающими мутантные последовательности, отличные от последовательности ГПП-1 (A2G).

[52] Фиг. 8A является графиком, на котором показаны ГПП-1 активности DFD59, DFD69, DFD112 и DFD114. ГПП-1 активности in vitro трех слитых белков (DFD69, DFD112 и DFD114) и Fc-слитого мутанта ГПП-1, не включающего FGF21, измеряли при использовании клеточной линии CHO с оверэкспрессией человеческого рецептора ГПП-1. Три слитых белка показали аналогичные значения EC₅₀, а Fc-слитый мутант ГПП-1 (DFD59) показал приблизительно в 2 раза более высокую активность, чем остальные слитые белки.

[53] Фиг. 8B является графиком, на котором показана FGF21 активность DFD69, DFD112 и DFD114. Активности in vitro слитых белков в зависимости от мутантов FGF21 измеряли с использованием клеточной линии HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека. Было подтверждено, что активности in vitro части FGF21 у трех слитых белков были аналогичными.

[54] Фиг. 9A является графиком, на котором показаны концентрации лекарственного средства в сыворотке в зависимости от времени после подкожного введения части FGF21 слитых белков DFD69, DFD112 и DFD114. Данные представлены как средние значения и стандартное отклонение.

[55] Фиг. 9B является графиком, на котором показаны концентрации лекарственного средства в сыворотке в зависимости от времени после подкожного введения части ГПП-1 слитых белков DFD59, DFD69, DFD112 и DFD114. Данные представлены как средние значения и стандартное отклонение.

[56] Фиг. 10A является графиком, на котором показаны изменения уровней триглицеридов (ТГ) в сыворотке после многократного подкожного введения DFD114, DFD112, DFD74 или DFD72 в модели на мышах с алиментарным ожирением с интервалом 4 дня в течение 2 недель. Введение слитого белка и слитого мутантного белка FGF21 продемонстрировало гиполипидемические эффекты в сыворотке по сравнению с контрольной группой. Данные представлены как средние значения и среднеквадратические отклонения среднего. Статистический анализ проводили с использованием критерия Даннета для множественных сравнений после однофакторного дисперсионного анализа (***: p<0,001 в сравнении с контролем растворителем).

[57] Фиг. 10B является графиком, на котором показаны изменения уровня общего холестерина (ОХС) в сыворотке после многократного подкожного введения DFD114, DFD112, DFD74 или DFD72 в модели на мышах с алиментарным ожирением с интервалом 4 дня в течение 2 недель. Введение слитого белка и слитого мутантного белка FGF21 продемонстрировало гиполипидемические эффекты в сыворотке по сравнению с контрольной группой (***: p<0,001 в сравнении с контролем растворителем).

[58] Фиг. 1°C является графиком, на котором показаны изменения уровней триглицеридов (ТГ) в печени после многократного подкожного введения DFD114, DFD112, DFD74 или DFD72 в модели на мышах с алиментарным ожирением с интервалом 4 дня в течение 2 недель. Введение слитого мутантного белка FGF21 продемонстрировало гиполипидемические эффекты в печени по сравнению с контрольной группой (*: p<0,05, ***: p<0,001 в сравнении с контролем растворителем).

[59] На Фиг. 11 показаны патогистологические фотоснимки печени, полученные при многократном подкожном введении DFD114 или DFD112 в модели на мышах с алиментарным ожирением с интервалом 4 дня в течение 2 недель. Введение слитого белка продемонстрировало эффект снижения стеатоза печени по сравнению с контрольной группой.

[60] Фиг. 12A является графиком, на котором показаны изменения уровней АЛТ после многократного подкожного введения DFD112 и DFD72 с интервалом 2 дня в течение 4 недель в модели на мышах с неалкогольным стеатогепатитом, вызванным метионин-холин дефицитной (MCD) диетой. Уровни АЛТ снижались дозозависимо в группах, получавших слитый белок, по сравнению с контрольной группой, и уровни АЛТ также снижались в группе, получавшей слитый белок FGF21. Данные представлены как средние значения и среднеквадратические отклонения среднего. Статистический анализ проводили с использованием критерия Даннета для множественных сравнений после однофакторного дисперсионного анализа (###: p<0,001 в сравнении с контролем MCS, **: p<0,01, ***: p<0,001 в сравнении с контролем MCD).

[61] Фиг. 12B является графиком, на котором показаны изменения уровней АСТ после многократного подкожного введения DFD112 и DFD72 с интервалом 2 дня в течение 4 недель в модели на мышах с неалкогольным стеатогепатитом, вызванным метионин-холин дефицитной (MCD) диетой. Уровни АСТ снижались дозозависимо в группах, получавших слитый белок, по сравнению с контрольной группой, и уровни АСТ также снижались в группе, получавшей слитый мутантный белок FGF21 (###: p<0,001 в сравнении с контролем MCS, **: p<0,01 в сравнении с контролем MCD).

[62] Фиг. 12C является графиком, на котором показаны изменения уровней воспаления после многократного подкожного введения DFD112 и DFD72 с интервалом 2 дня в течение 4 недель в модели на мышах с неалкогольным стеатогепатитом, вызванным метионин-холин дефицитной (MCD) диетой. Уровни воспаления снижались дозозависимо в группах, получавших слитый белок, по сравнению с контрольной группой, и уровни воспаления также снижались в группе, получавшей слитый мутантный белок FGF21 (###: p<0,001 в сравнении с контролем MCS, ***: p<0,001 в сравнении с контролем MCD).

[63] Фиг. 13A является графиком, на котором показаны изменения альфа-актина гладких мышц (α-SMA), связанного с фиброзом индикатора в печени, после многократного подкожного введения DFD112 и DFD72 с интервалом 2 дня в течение 4 недель в модели на мышах с неалкогольным стеатогепатитом, вызванным MCD диетой. Экспрессия α-SMA была повышена в контрольной группе MCD по сравнению с метионин-холин стандартной (MCS) контрольной группой. С другой стороны, уровни α-SMA в группах, получавших слитый белок, и в группе, получавшей слитый мутантный белок FGF21, снижались по сравнению с контрольной группой. Данные представлены как средние значения и среднеквадратические отклонения среднего. Статистический анализ проводили с использованием критерия Даннета для множественных сравнений после однофакторного дисперсионного анализа (###: p<0,001 в сравнении с контролем MCS, ***: p<0,001 в сравнении с контролем MCD).

[64] Фиг. 13B является графиком, на котором показаны изменения трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), связанного с фиброзом индикатора в печени, после многократного подкожного введения DFD112 и DFD72 с интервалом 2 дня в течение 4 недель в модели на мышах с неалкогольным стеатогепатитом, вызванным MCD диетой. Экспрессия TGF-β была повышена в контрольной группе MCD по сравнению с контрольной группой MCS. С другой стороны, уровни TGF-β в группах, получавших слитый белок, и в группе, получавшей слитый мутантный белок FGF21, снижались по сравнению с контрольной группой (###: p<0,001 в сравнении с контролем MCS, ***: p<0,001 в сравнении с контролем MCD).

[65] Фиг. 13C является графиком, на котором показан результат окрашивания пикросириусом красным, связанного с фиброзом индикатора в печени, после многократного подкожного введения DFD112 и DFD72 с интервалом 2 дня в течение 4 недель в модели на мышах с неалкогольным стеатогепатитом, вызванным MCD диетой. Количество коллагена возрастало в контрольной группе MCD по сравнению с контрольной группой MCS. С другой стороны, уровни пикросириуса красного в группах, получавших слитый белок, и в группе, получавшей слитый мутантный белок FGF21, снижались по сравнению с контрольной группой (###: p<0,001 в сравнении с контролем MCS, **: p<0,01 в сравнении с контролем MCD).

[66] На Фиг. 14 показаны патогистологические фотоснимки печени. Количество жира в тканях печени значительно уменьшилось.

[67] Фиг. 15A является графиком, на котором показаны изменения уровня АЛТ, биохимического показателя крови, после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели на мышах с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом. При введении слитого белка наблюдали эффект снижения АЛТ в сыворотке по сравнению с контрольной группой. Данные представлены как средние значения и среднеквадратические отклонения среднего. Статистический анализ проводили с использованием критерия Даннета для множественных сравнений после однофакторного дисперсионного анализа (***: p<0,001).

[68] Фиг. 15B является графиком, на котором показаны изменения уровней АСТ после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели на мышах с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом. При введении слитого белка наблюдали эффект снижения АСТ в сыворотке по сравнению с контрольной группой (***: p<0,001).

[69] Фиг. 15C является графиком, на котором показаны изменения уровня ТГ после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели на мышах с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом. При введении слитого белка наблюдали эффект снижения ТГ в сыворотке по сравнению с контрольной группой (*: p<0,05, ***: p<0,001).

[70] Фиг. 15D является графиком, на котором показаны изменения уровней ОХС после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели на мышах с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом. При введении слитого белка наблюдали эффект снижения ОХС в сыворотке по сравнению с контрольной группой (***: p<0,001).

[71] На Фиг. 16A представлены графики, на которых показаны изменения оценок активности НЖБП (NAS) в период до и после введения в печени после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели на мышах с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом. При введении слитого белка оценка активности НЖБП после введения снизилась по сравнению с оценкой до введения.

[72] На Фиг. 16B представлены графики, на которых показаны изменения оценок фиброза печени в период до и после введения в печени после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели на мышах с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом. При введении слитого белка оценка фиброза печени после введения снизилась по сравнению с оценкой до введения.

[73] Фиг. 17A является графиком, на котором показаны изменения уровней ЩФ, биохимического показателя крови, после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели индуцированного тиоацетамидом (TAA) фиброза печени на крысах. При введении слитого белка наблюдали эффект снижения ЩФ в сыворотке по сравнению с контрольной группой TAA. Данные представлены как средние значения и среднеквадратические отклонения среднего. Статистический анализ проводили с использованием критерия Даннета для множественных сравнений после однофакторного дисперсионного анализа (###: p<0,001 в сравнении со здоровым контролем, **: p<0,01 в сравнении с контролем TAA).

[74] Фиг. 17B является графиком, на котором показаны изменения уровней ГГТ, биохимического показателя крови, после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели индуцированного тиоацетамидом (TAA) фиброза печени на крысах. При введении слитого белка наблюдали эффект снижения ГГТ в сыворотке по сравнению с контрольной группой TAA (###: p<0,001 в сравнении со здоровым контролем, *: p<0,05 в сравнении с контролем TAA).

[75] Фиг. 17C является графиком, на котором показаны изменения уровней ОБил, биохимического показателя крови, после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели индуцированного тиоацетамидом (TAA) фиброза печени на крысах. При введении слитого белка наблюдали эффект снижения ОБил в сыворотке по сравнению с контрольной группой (##: p<0,01 в сравнении со здоровым контролем, *: p<0,05 в сравнении с контролем TAA).

[76] Фиг. 17D является графиком, на котором показаны изменения площади пораженных фиброзом участков в печени после многократного подкожного введения DFD112 с интервалом 2 дня в течение 8 недель в модели индуцированного тиоацетамидом (TAA) фиброза печени на крысах. При введении слитого белка наблюдали эффект уменьшения площади фиброза по сравнению с контрольной группой (###: p<0,001 в сравнении со здоровым контролем, ***: p<0,001 в сравнении с контролем TAA).

Наилучший вариант осуществления изобретение

[77] Далее настоящее изобретение описано более подробно.

[78] Слитый белок, содержащийся в качестве действующего компонента в композиции для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени согласно настоящему изобретению, включает мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(7):

[79] (1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 68);

[80] (2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 69);

[81] (3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 70);

[82] (4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[83] (5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[84] (6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E, в сочетании с одной или более мутациями (1)-(5) выше; и

[85] (7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.

[86] Слитый белок может дополнительно включать биологически активный белок или его мутант или фрагмент.

[87] В частности, слитый белок, содержащийся в качестве действующего компонента в композиции для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени согласно настоящему изобретению, включает мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок или его мутант или фрагмент; и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(7):

[88] (1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 68);

[89] (2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 69);

[90] (3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 70);

[91] (4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[92] (5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[93] (6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E, в сочетании с одной или более мутациями (1)-(5) выше; и

[94] (7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.

[95] Белок FGF21 дикого типа представляет собой гормон, который, как известно, играет важную роль в гомеостазе глюкозы и жиров, может быть получен от млекопитающего, такого как человек, мышь, свинья или обезьяна и т.д., предпочтительно человека. Более предпочтительно белок FGF21 дикого типа может быть человеческим белком FGF21 дикого типа, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1.

[96] Мутация, включенная в мутантные белки FGF21, предпочтительно может быть любой из мутаций EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N; комбинацией любой из мутаций TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутации EIRP; комбинацией любой из мутаций EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутации A180E; или комбинацией любой из мутаций TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N, мутации EIRP и мутации A180E. Кроме того, мутантные белки FGF21 могут иметь конформацию, в которой 1-10 аминокислот на N-конце или C-конце удалены по сравнению с белком FGF21 дикого типа. Более предпочтительно мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 6-23. Еще более предпочтительно мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 6-23, и дополнительно имеют конформацию, в которой 1-10 аминокислот на N-конце или C-конце удалены по сравнению с белком FGF21 дикого типа.

[97] В слитом белке остаток аспарагина (N), введенный в результате мутации мутантного белка FGF21, может быть гликозилирован.

[98] Биологически активный белок может быть белком, выбранным из группы, состоящей из инсулина, C-пептида, лептина, глюкагона, гастрина, желудочного ингибиторного полипептида (ЖИП), амилина, кальцитонина, холецистокинина, пептида YY, нейропептида Y, костного морфогенетического белка 6 (BMP-6), костного морфогенетического белка 9 (BMP-9), оксинтомодулина, окситоцина, глюкагоноподобного пептида 1 (ГПП-1), глюкагоноподобного пептида 2 (ГПП-2), ирисина, содержащего домен фибронектина III типа белка 5 (FNDC5), апелина, адипонектина, родственного C1q и фактору некроза опухоли белка (семейства CTRP), резистина, висфатина, оментина, ретинолсвязывающего белка 4 (RBP-4), глицентина, ангиопоэтина, интерлейкина 22 (IL-22), эксендина-4 и гормона роста. Предпочтительно, биологически активный белок может быть белком, выбранным из ГПП-1, его мутанта и эксендина-4. В частности, слитый белок может одновременно демонстрировать действие ГПП-1 и действие белка FGF21.

[99] При использовании в настоящем документе термин "инсулин" относится к белку, синтезируемому и секретируемому бета-клетками поджелудочной железы, который является гормоном, играющим важную роль в поддержании постоянного уровня глюкозы в крови. Инсулин секретируется, если уровень глюкозы в крови высокий, что позволяет глюкозе в крови поступать в клетки для хранения в форме гликогена и ингибирует продукцию глюкозы в гепатоцитах. Он также способствует окислению глюкозы и превращению в жирные кислоты в жировых тканях. В мышцах он способствует абсорбции аминокислот для синтеза белков. Эпинефрин и глюкагон действуют как антагонисты инсулина, повышая уровень глюкозы в крови.

[100] При использовании в настоящем документе термин "C-пептид" относится к пептиду, который соединяет A и B цепи проинсулина. C-пептид секретируется вместе с инсулином секреторными гранулами клеток поджелудочной железы, но не расщепляет в крови, таким образом, он используется в качестве показателя инсулин-секретирующей функции поджелудочной железы.

[101] При использовании в настоящем документе термин "лептин" относится к гормону, который поддерживает массу телесного жира, секретируемого жировыми тканями, на постоянном уровне. Лептин, секретируемый жировой тканью, воздействует на головной мозг, подавляя аппетит и активируя обмен веществ в организме, снижая, таким образом, массу тела.

[102] При использовании в настоящем документе термин "глюкагон" относится к белку, синтезируемому и секретируемому поджелудочной железой, который является гормоном, секретируемым в ответ на сниженный уровень сахара в крови, играющим важную роль повышения уровня сахара в крови. Глюкагон состоит из 29 аминокислотных остатков и секретируется α-клетками островков Лангерганса.

[103] При использовании в настоящем документе термин "гастрин" относится к гормону, секретируемому в дистальном отделе желудка, который вызывает секрецию желудочного сока и выработку панкреатического сока, и вызывает сокращения желудка, тонкой кишки и толстой кишки.

[104] При использовании в настоящем документе термин "гастрин-ингибирующий полипептид" относится к линейному полипептиду, который ингибирует всю желудочную секрецию.

[105] При использовании в настоящем документе термин "амилин" относится к гормону, синтезируемому и секретируемому бета-клетками поджелудочной железы, который регулирует метаболизм глюкозы, как инсулин.

[106] При использовании в настоящем документе термин "кальцитонин" относится к гормону щитовидной железы, который регулирует уровень кальция в крови. Кальцитонин представляет собой полипептид, состоящий из 32 аминокислот, секретируемый C-клетками щитовидной железы.

[107] При использовании в настоящем документе термин "холецистокинин" относится к гормону, состоящему из 33 аминокислот, вырабатываемому I-клетками двенадцатиперстной кишки и тощей кишки. Холецистокинин ускоряет сокращение селезенки, способствует секреции ферментов поджелудочной железы и ингибирует секрецию желудочного сока.

[108] При использовании в настоящем документе термин "пептид YY" является сокращением от пептида тирозин-тирозин, который относится к полипептиду, состоящему из 36 аминокислот, секретируемому клетками толстой кишки и подвздошной кишки в ответ на пищу.

[109] При использовании в настоящем документе термин "нейропептид Y" относится к биологически активному пептиду, состоящему из 36 аминокислот, C-конец которого аминирован. Нейропептид Y широко представлен в центральной и периферической нервной системе позвоночных животных и регулирует артериальное давление в симпатической нервной системе, а также участвует в эндокринной или автономной нервной регуляции, пищевом поведении, памяти и циркадианном ритме в центральной нервной системе позвоночных животных.

[110] При использовании в настоящем документе термин "остеогенный белок 6", также называемый BMP-6, относится к белку, непосредственно участвующему в остеогенезе.

[111] При использовании в настоящем документе термин "остеогенный белок 9", также называемый BMP-9, относится к белку, непосредственно участвующему в остеогенезе.

[112] При использовании в настоящем документе термин "оксинтомодулин" относится к полипептиду, состоящему из 37 аминокислот, секретируемому муральными клетками слизистой оболочки. Оксинтомодулин оказывает сильное анорексигенное действие.

[113] При использовании в настоящем документе термин "окситоцин" относится к гормону, состоящему из 9 аминокислот, который вызывает сокращение матки при введении и способствует секреции молока во время кормления грудью.

[114] При использовании в настоящем документе термин "ГПП-1" относится к инкретиновому гормону, состоящему из 31 аминокислоты, секретируемому в L-клетках кишечника при стимуляции пищей и т.п. Например, белок ГПП-1 может быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42.

[115] Мутант ГПП-1 может быть представлен, например, аминокислотной последовательностью любого из SEQ ID NO: 43-46.

[116] При использовании в настоящем документе термин "ирисин" относится к гормону, секретируемому мышцами при физической нагрузке и достигающему адипоцитов с током крови, расщепляя жиры, например, при конверсии белых адипоцитов в бурые адипоциты. Ирисин состоит из 112 аминокислот и является усеченным фрагментом мембранного белка, называемого FNDC5.

[117] При использовании в настоящем документе термин "FNDC5" является сокращением для белка содержащего домен типа III Фибронектин 5 и относится к сущности предшественника диафрагмирования.

[118] При использовании в настоящем документе, термин "апелин" относится к пептиду, кодируемому геном APLN. Апелин синтезируется и секретируется в жировых тканях и имеет такую же функцию, как инсулин.

[119] При использовании в настоящем документе термин "адипонектин" относится к белку, секретируемому адипоцитами, который повышает инсулинорезистентность.

[120] При использовании в настоящем документе термин "семейство CTRP" относится к родственному C1q и фактору некроза опухоли белку, который является одним из представителей семейства адипокинов и главным образом действует на печень и мышечные ткани, регулируя обмен глюкозы и липидов, и т.д.

[121] При использовании в настоящем документе термин "резистин" относится к недавно обнаруженному адипокину, секретируемому адипоцитами, который является белком, состоящим из 108 аминокислот, и известен в качестве вещества, повышенного при дифференцировке жировой ткани и способного к ингибированию дифференцировки адипоцитов.

[122] При использовании в настоящем документе термин "висфатин" относится к одному из адипокинов, вырабатываемых и секретируемых жировыми тканями, который является белком массой 52 кДа.

[123] При использовании в настоящем документе термин "оментин" относится к одному из адипокинов, вырабатываемых и секретируемых жировыми тканями, который является белком, имеющим противовоспалительное действие.

[124] При использовании в настоящем документе термин "ретинолсвязывающий белок 4" относится к белку, секретируемому адипоцитами, который несет витамин A, который повышает инсулинорезистентность.

[125] При использовании в настоящем документе термин "глицетин" относится к основному энтероглюкагону в пищеварительном тракте, который состоит из 69 аминокислот, включающих все 29 аминокислот глюкагона между аминокислотами в положениях 33-66.

[126] При использовании в настоящем документе термин "ангиопоэтин", также называемый ANG, относится к белку, который действует во время роста кровеносных сосудов или эндотелиальных клеток сосудов или во время заживления ран в организме.

[127] При использовании в настоящем документе термин "IL-22", также называемый IL-TIF, относится к белку, кодируемому геном IL-22. IL-22 секретируется NK-клетками или T-клетками, активированными в ответ на бактериальные антигены в эпителиальных клетках.

[128] При использовании в настоящем документе термин "Fc-область", "Fc-фрагмент" или "Fc" относится к белку, который включает константную область тяжелой цепи 1 (CH1), константную область тяжелой цепи 2 (CH2) и константную область тяжелой цепи 3 (CH3) иммуноглобулина, но не включает вариабельные области тяжелой и легкой цепей и константную область легкой цепи 1 (CL1) иммуноглобулина. Кроме того, при использовании в настоящем документе термин "мутант Fc-области" относится к мутанту, полученному при замене части аминокислот Fc-области или комбинировании Fc-областей различных типов.

[129] Fc-область иммуноглобулина может быть полноразмерной Fc-областью, составляющей антитело, ее фрагментом или мутантом Fc-области. Кроме того, Fc-область включает молекулу в форме мономера или мультимера и может дополнительно включать шарнирную область константной области тяжелой цепи. Мутант Fc-области может быть модифицирован для предотвращения расщепления в шарнирной области. Кроме того, шарнирная последовательность Fc может иметь замену в некоторых аминокислотных последовательностях для снижения антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Кроме того, часть аминокислотной последовательности Fc-шарнирной последовательности может быть заменена для ингибирования перестройки Fab-области. Лизин (K) на С-конце Fc-области может быть удален.

[130] Предпочтительно, Fc-область иммуноглобулина может быть любой из Fc-областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgD; или гибридным Fc, который является их комбинацией. Кроме того, гибридный Fc может включать область IgG4 и область IgD. Кроме того, гибридная Fc-область может включать часть шарнирной последовательности и CH2 Fc-области IgD, а также CH2 и CH3 последовательности Fc-области IgG4.

[131] Кроме того, Fc-фрагмент согласно настоящему изобретению может находиться в форме гликозилированной цепи дикого типа, более гликозилированной цепи, чем цепь дикого типа, менее гликозилированной цепи, чем цепь дикого типа. Увеличение, уменьшение или удаление гликозилированной цепи может быть выполнено с помощью стандартного способа, известного в данной области, такого как химический способ, ферментативный способ и генно-инженерный способ с использованием микроорганизмов.

[132] Предпочтительно, Fc-область иммуноглобулина может быть представлена аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 24-26, 47 и 48.

[133] Слитый белок может включать биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Кроме того, слитый белок может включать мутантный белок FGF21, Fc-область иммуноглобулина и биологически активный белок, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Предпочтительно, слитый белок может включать биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу.

[134] Кроме того, слитый белок может включать мутантный белок ГПП-1, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Кроме того, слитый белок может включать мутантный белок FGF21, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок ГПП-1, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Предпочтительно, слитый белок может включать мутантный белок ГПП-1, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу.

[135] Кроме того, слитый белок может дополнительно включать линкер.

[136] Слитый белок может находиться в форме, в которой мутантный белок FGF21 непосредственно соединен с N-концом или C-концом Fc-области иммуноглобулина, или мутантный белок FGF21 соединен с Fc-областью иммуноглобулина через линкер.

[137] В таком случае линкер может быть соединен с N-концом, C-концом или свободным радикалом Fc-фрагмента, а также может быть связан с N-концом, C-концом или свободным радикалом мутантного белка FGF21. В случае, когда линкер является пептидным линкером, соединение может происходить в любой области. Например, линкер может быть соединен с C-концом Fc-области иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21, с образованием слитого белка Fc-области иммуноглобулина и мутантного белка FGF21.

[138] Кроме того, слитый белок согласно настоящему изобретению может находиться в форме, в которой биологически активный белок связан с N-концом Fc-области иммуноглобулина слитого белка.

[139] Если линкер и Fc экспрессированы отдельно, а затем соединены, линкер может быть сшивающим агентом, известным в данной области техники. Примеры сшивающего агента могут включать 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаровый альдегид, имидоэфиры, в том числе сложный эфир N-гидроксисукцинимида, такой как 4-азидосалициловую кислоту, и дисукцинимидиловые сложные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан, но не ограничиваются ими.

[140] Кроме того, линкер может быть пептидом. Предпочтительно, линкер может быть пептидом, состоящим из 10-30 аминокислотных остатков.

[141] Кроме того, аланин может быть дополнительно присоединен к концу линкера. Предпочтительно, линкер может быть пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 2-5.

[142] Слитый белок может находиться в форме, в которой димер или мультимер мутантных белков FGF21, в котором связаны друг с другом один или более мутантных белков FGF21, соединен с Fc-областью иммуноглобулина. Кроме того, слитый белок может находиться в форме димера или мультимера, в котором связаны две или более Fc-областей иммуноглобулина, где с Fc-областями иммуноглобулина связан мутантный белок FGF21.

[143] Кроме того, в частности, слитый белок может быть представлен аминокислотной последовательностью любого из SEQ ID NO: 36-39. Более конкретно, он может быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36, 37 или 39.

[144] Кроме того, слитый белок может быть пептидом, который предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 58-67. Более предпочтительно, слитый белок может быть пептидом, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 65, 66 или 67.

[145] Мутантный белок FGF21 может дополнительно включать мутацию 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа. Иммуногенность может быть предсказана с помощью стандартного способа, известного из уровня техники. Например, скрининг на потенциальную иммуногенность белка может быть выполнен с помощью, например, методов iTope™ и TCED™.

[146] Кроме того, мутация для уменьшения иммуногенности может быть введена с помощью стандартного способа, известного из уровня техники. Например, если иммуногенность наблюдается при выполнении анализа EpiScreen™ для оценки потенциальной иммуногенности, аминокислотные последовательности, вызывающие иммуногенность, могут быть определены путем картирования T-клеточных эпитопов, и мутанты с минимизированной иммуногенностью могут быть созданы с помощью предсказания in silico.

[147] Слитый белок может применяться для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.

[148] В частности, гепатит может быть острым вирусным гепатитом, хроническим гепатитом, алкогольным гепатитом, аутоиммунным гепатитом, фульминантным гепатитом или неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ). В частности, цирроз печени может быть алкогольным циррозом печени или первичным билиарным циррозом.

[149] Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтический носитель. Фармацевтический носитель может быть любым носителем при условии, что он является нетоксичным материалом, подходящим для доставки антител пациентам. Например, дистиллированная вода, спирт, жиры, воски и неактивные твердые вещества могут быть включены в качестве носителя. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества (буферные вещества, дисперсанты) могут быть также включены в фармацевтическую композицию. В таких композициях концентрация слитого белка может сильно изменяться.

[150] В частности, фармацевтическая композиция может содержать различные добавки для изменения, поддержания или сохранения pH, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или проницаемости композиции. Для подходящего состава она может дополнительно включать аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, сульфит натрия или бисульфит натрия), буферные вещества (например, борат, бикарбонаты, трис-HCl, цитрат, фосфат или другие органические кислоты), объемообразующие вещества (например, маннит или глицин), хелатообразующие вещества (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА)), комплексообразующие вещества (например, кофеин, поливинилпирролидион, β-циклодекстрин или гидроксипропил-β-циклодекстрин), наполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (например, глюкозу, маннозу или декстрин), белки (например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулин), красители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, гидрофильные полимеры (например, поливинилпирролидон), низкомолекулярные полипептиды, солеобразующие противоионы (например, натрий), консерванты (например, хлорид бензалкония, бензойную кислоту, салициловую кислоту, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновую кислоту или перекись водорода), растворители (например, глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахароспирты (например, маннит или сорбит), суспендирующие вещества, поверхностно-активные вещества или увлажнители (например, плюроники; ПЭГ; сложный эфир сорбитана; полисорбат, например полисорбат 20 или полисорбат 80; тритон; трометамин; лецитин; холестерин или тилоксапол), добавки, повышающие стабильность (например, сахарозу или сорбит), добавки, улучшающие рост (например, галогениды щелочных металлов, предпочтительно хлорид натрия или хлорид калия, или маннит, сорбит), носители для доставки, разбавители, вспомогательные вещества и/или фармацевтические адъюванты, но не ограничивается этим.

[151] Кроме того, в настоящем изобретении также предложен способ предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, который включает введение фармацевтической композиции согласно изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении. Такой способ может включать введение эффективного количества слитого белка согласно настоящему изобретению млекопитающему, имеющему симптом гепатита, такого как острый вирусный гепатит, хронический гепатит, алкогольный гепатит, аутоиммунный гепатит, фульминантный гепатит, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ). Он также может включать введение эффективного количества слитого белка согласно настоящему изобретению млекопитающему, имеющему симптом цирроза печени, например, алкогольного цирроза печени, первичного билиарного цирроза и фиброза печени.

[152] Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена любым путем. Композиция согласно настоящему изобретению может быть предоставлена животному непосредственно (например, наружно, при введении в области ткани путем инъекции, трансплантации или наружного применения) или системно (например, путем перорального или парентерального введения) любым подходящим способом. В случае, когда композицию согласно настоящему изобретению вводят парентерально путем внутривенного, подкожного, глазного, внутрибрюшинного, внутримышечного, перорального, ректального, интраорбитального, интрацеребрального, внутричерепного, интраспинального, интравентрикулярного, интратекального, интрацистернального, интракапсулярного, интраназального или аэрозольного введения, композиция предпочтительно является водной или может включать часть биологически применимой для организма жидкой суспензии или раствора. Соответственно, носитель или растворитель может быть добавлен в композицию и доставлен пациенту, поскольку он является биологически применимым. Таким образом, биологически пригодный физиологический раствор обычно может быть включен в качестве носителя, как физиологическая жидкость для лекарственных форм.

[153] Кроме того, частота введения может изменяться в зависимости от фармакокинетических параметров слитого белка в используемых композициях. Обычно врачи вводят композицию до тех пор, пока не будет достигнута вводимая доза, требуемая для достижения нужного эффекта. Таким образом, композицию можно вводить в виде единичной дозы, по меньшей мере двух доз с временными интервалами (которые могут содержать или не содержать одинаковое количество целевого слитого белка) или вводить путем непрерывной инъекции через устройство для трансплантации или катетер. Точность добавления подходящей вводимой дозы может быть стандартно обеспечена специалистами в данной области техники и соответствует объему работы, которую они обычно выполняют.

[154] Кроме того, предпочтительная единичная доза слитого белка в случае медицинского применения может находиться в диапазоне от 0,01 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела и более предпочтительно от 1 мкг/кг до 10 мг/кг массы тела. Хотя это количество является оптимальным, стандартная доза может изменяться в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, или присутствия/отсутствия побочных эффектов. Тем не менее, оптимальная вводимая доза может быть определена с помощью проведения стандартного эксперимента. Введение слитого белка может быть выполнено путем периодической болюсной инъекции, внешнего резервуара (например, пакета для внутривенной инфузии) или непрерывного внутривенного, подкожного или внутрибрюшинного введения из внутреннего источника (например, биоразлагаемого имплантата).

[155] Кроме того, слитый белок согласно настоящему изобретению могут вводить соответствующему реципиенту в сочетании с другими биологически активными молекулами. Оптимальная комбинация слитого белка и другой молекулы (молекул), лекарственных форм и оптимальных доз может быть определена с помощью стандартного эксперимента, известного в данной области.

[156] В настоящем изобретении предложено применение фармацевтической композиции согласно изобретению, содержащей слитый белок в качестве эффективного компонента для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.

[157] В настоящем изобретении предложено применение фармацевтической композиции согласно изобретению, содержащей слитый белок в качестве эффективного компонента для получения композиции для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.

[158] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть выбрана из группы, состоящей из ДНК, РНК и мРНК, и, в частности, она может быть ДНК.

[159] В таком случае выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитый белок, могут иметь последовательности, отличающиеся друг от друга из-за избыточности кодонов. Кроме того, в случае, если выделенная нуклеиновая кислота может давать слитый белок, выделенная нуклеиновая кислота может быть соответствующим образом модифицирована, или нуклеотид может быть добавлен на N-конец или С-конец выделенной нуклеиновой кислоты в соответствии с требуемыми целями.

[160] Выделенные молекулы нуклеиновых кислот могут включать, например, нуклеотидную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 71-80.

[161] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен вектор экспрессии, включающий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты.

[162] При использовании в настоящем документе термин "вектор экспрессии" относится к вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, которая подходит для трансформации клетки-хозяина и направляет или контролирует экспрессию встроенной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты. Вектор экспрессии включает линейную нуклеиновую кислоту, плазмиду, фагмиду, космиду, РНК вектор, вирусный вектор и их аналоги. Примеры вирусного вектора включают ретровирус, аденовирус и аденоассоциированный вирус, но не ограничены ими.

[163] При использовании в настоящем документе термин "экспрессия гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты" или "экспрессия" целевого белка относится к транскрипции встроенной последовательности ДНК, трансляции мРНК транскрипта и продукции Fc-слитого белкового продукта, антитела или фрагмента антитела.

[164] Пригодным вектором экспрессии может быть RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) или его мутант. Пригодный вектор экспрессии может включать промотор цитомегаловируса человека (ЦМВ) для стимуляции непрерывной транскрипции гена-мишени в клетке млекопитающего и сигнальную последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста для повышения уровня посттранскрипционной стабильности РНК. В примере осуществления настоящего изобретения вектором экспрессии является pAD15, который является модифицированным вектором RcCMV.

[165] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, включающая вектор экспрессии.

[166] При использовании в настоящем документе термин "клетка-хозяин" относится к прокариотической клетке или эукариотической клетке, в которую может быть введен рекомбинантный вектор экспрессии. При использовании в настоящем документе термин "трансформированный" или "трансфицированный" относится к введению нуклеиновой кислоты (например, вектора) в клетку с помощью различных технологий, известных в уровне техники.

[167] Подходящая клетка-хозяин может быть трансформирована или трансфицирована последовательностью ДНК настоящего изобретения и может применяться для экспрессии и/или секреции целевого белка. Примеры подходящей клетки-хозяина, которая может применяться в настоящем изобретении, включают иммортализованные клетки гибридом, клетки миеломы NS/0, клетки 293, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки CAP (человеческие клетки, полученные из амниотической жидкости) и клетки COS.

Вариант осуществления изобретения

[168] В дальнейшем примеры осуществления настоящего изобретения будут подробно описаны со ссылкой на примеры. Однако эти примеры в соответствии с настоящим изобретением могут быть изменены во многих различных формах, при этом не следует считать, что объем настоящего изобретения ограничен примерами, представленными в настоящем документе.

[169] Пример получения 1. Получение и очистка слитого белка, содержащего мутантный белок FGF21

[170] Пример получения 1-1. Получение векторов экспрессии для экспрессии мутантных белков FGF21

[171] Для улучшения стабильности, активности и фармакокинетических профилей FGF21 в структуре Fc-FGF21, были проведены мутационные исследования FGF21.

[172] В частности, мутантный белок был создан для области LLLE (аминокислоты в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 SEQ ID NO: 1) и области GPSQG (аминокислоты в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 SEQ ID NO: 1), и области A180, которые, как ожидали, значительно повлияют на активность белка на основе 3-мерного структурного анализа белков FGF21.

[173] Положение, информация о последовательности, цель и ожидаемый эффект каждой мутации, введенной в белок FGF21, перечислены в Таблице 1 ниже. В Таблице 1, N представляет собой гликозилированный аспарагин (N).

[174] [Таблица 1]

[175] Кроме того, мутантные белки FGF21, включающие мутации, описанные в Таблице 1, перечислены в Таблице 2 ниже.

[176] [Таблица 2]

[177] Нуклеотиды, кодирующие аминокислоты, вводили в вектор экспрессии таким образом, чтобы в порядке от N-конца к C-концу экспрессировались слитый носитель, линкер и мутантный белок FGF21. Код каждого слитого мутантного белка FGF21, последовательность мутации, введенной в FGF21, последовательность слитого носителя и линкерная последовательность перечислены в Таблице 3 ниже. В Таблице 3, N представляет собой гликозилированный аспарагин (N).

[178] [Таблица 3]

[179] Для получения слитых мутантных белков FGF21, нуклеотидные последовательности, кодирующие каждый из мутантных белков FGF21, синтезировали при консультациях с Bioneer Corporation (Korea) по аминокислотной последовательности каждого белка. Последовательности сайтов эндонуклеаз рестрикции NheI и NotI добавляли на 5'-конец и 3'-конец нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый из мутантных белков FGF21, и инициаторный кодон для трансляции белка и лидерную последовательность (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA), способную вызывать секрецию экспрессируемого белка из клетки, встраивали рядом с последовательностью сайта рестрикции на 5'-конце. Терминирующий кодон встраивали рядом с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует каждый из слитых мутантных белков FGF21. Нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из слитых мутантных белков FGF21, клонировали в пустой вектор экспрессии pTrans при использовании двух рестриктаз NheI и NotI. Пустой вектор экспрессии pTrans, который имеет простую структуру, содержащую промотор ЦМВ, точку начала репликации из pUC, точку начала репликации из SV40 и ген устойчивости к ампициллину, был приобретен в CEVEC Pharmaceuticals (Germany).

[180] В то же время, в случае DFD6 (экспрессия в E. coli) и Fc-FGF21 слитого белка RGE (Amgen), нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый слитый белок, встраивали в вектор экспрессии pET30a для экспрессии в E. coli.

[181] Пример получения 1-2. Конструкция плазмидной ДНК для экспрессии слитых мутантных белков FGF21

[182] E. coli трансформировали каждым из векторов экспрессии, сконструированных в Примере получения 1-1 для получения большого количества плазмидной ДНК, которую предполагали использовать для экспрессии. Клетки E. coli, клеточные стенки которых были ослаблены, трансформировали каждым вектором экспрессии посредством теплового шока, и транформанты сеяли на чашки с LB для получения колоний. Колонии, полученные таким образом, инокулировали в среду LB, культивировали при 37°C в течение 16 часов, и каждую культуру E. coli, содержащую каждый вектор экспрессии, получали в объеме 100 мл. Полученные таким образом клетки E. coli центрифугировали для удаления культуральной среды, а затем добавляли растворы P1, P2, P3 (QIAGEN, номер по кат.:12963) для разрушения клеточных стенок, получив в результате суспензию ДНК, в которой белки и ДНК были отделены. Плазмидную ДНК очищали из полученной таким образом суспензии ДНК при испоьзовании колонки для очистки ДНК Qiagen. Элюированную плазмидную ДНК исследовали с помощью электрофореза в агарозном геле, и концентрации и чистоту измеряли при помощи спектрофотометра NanoDrop (Thermo scientific, Nanodrop Lite). ДНК, полученную таким образом, использовали для экспрессии.

[183] Пример получения 1-3. Экспрессия слитых белков в CAP-T клетках

[184] Линии клеток человека трансфицировали каждым типом плазмидной ДНК, полученной в Примере получения 1-2. Каждый тип плазмидной ДНК трансдуцировали в клетки CAP-T (CEVEC), которые культивировали в среде PEM (Life technologies), при использовании раствора PEI (Polyplus, номер по кат.:101-10N). Смешанный раствор ДНК и раствора PEI смешивали с суспензией клеток при использовании экспрессионной среды Freestyle293 (Invitrogen), культивировали при 37°C в течение 5 часов и добавляли среду PEM. После культивирования при 37°C в течение 5-7 дней, культуру центрифугировали для удаления клеток и получали супернатант, содержащий слитые мутантные белки FGF21.

[185] Пример получения 1-4. Экспрессия и очистка слитых мутантных белков FGF21 в E. coli

[186] Штамм E. coli BL21 (DE3) трансформировали каждой плазмидной ДНК, экспрессирующей слитые белки DFD6 (E. coli) и RGE (Amgen). Трансформированные клетки E. coli, экспрессирующие каждый слитый белок, инокулировали в 20 мл мреды LB, культивировали при 37°C в течение 15 часов с качанием, и затем часть культуральной среды инокулировали в 100 мл среды LB и культивировали при 37°C в течение 16 часов с качанием. После завершения культивирования культуру центрифугировали с получением осадков E. coli, и затем клетки разрушали при использовании клеточного дезинтегратора высокого давления с получением телец включения.

[187] Полученные тельца включения очищали путем промывки и элюции с последующим процессом рефолдинга белка. В частности, полученные тельца включения промывали 2-3 раза буферным раствором (pH 8,0), содержащим 0,5% Triton X-100, 50 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА и 0,1 М NaCl для удаления бактериального белка, и затем ресуспендировали в буфере, содержащем 8 М мочевины, 50 мМ Трис и 1 мМ DTT. Поскольку белки в буфере с 8 М мочевины были полностью денатурированы, процесс рефолдинга белка проводили следующим образом.

[188] Сначала мочевину удаляли из буфера с 8 М мочевины путем постепенного разбавления 20 мМ глициновым буфером, pH 9,0. С 2 М мочевины добавляли сульфат меди (CuSO₄) до концентрации 80 мкМ, чтобы вызвать стабильное структурное сворачивание белка. Белок после завершения процесса рефолдинга суспендировали в буферном растворе PBS (pH 7,4), фильтровали суспендию через фильтр с порами 0,22 мкм для удаления примесей, а затем наносили в колонку для афинной хроматографии с белком A. Колонку промывали 1× буферным раствором PBS (pH 7,4), и затем белки элюировали при использовании 100 мМ глицинового буферного раствора (pH 3,0) с получением слитого белка DFD6 (E. coli).

[189] В случае слитого белка RGE (Amgen), белок после завершения процесса рефолдинга суспендировали в 50 мМ Трис буферном растворе (pH 8,0), суспендию фильтровали через фильтр с порами 0,22 мкм для удаления примесей, а затем наносили на колонку с анионообменной смолой (POROS® HQ 50 μm, Thermo Fisher Scientific). Колонку промывали 50 мМ Трис буферным раствором (pH 8,0) и затем 50 мМ Трис буферный раствор (pH 8,0) вводили в градиенте концентраций с элюированием слитого белка RGE (Amgen). Слитый белок RGE (Amgen), полученный при использовании анионообменной смолы, смешивали с сульфатом аммония до концентрации 1 М, и затем очищали при использовании колонки для хроматографии гидрофобного взаимодействия (фенилсефароза FF, GE Healthcare). В частности, колонку промывали 50 мМ Трис буферным раствором (pH 8,0), содержащим 1 М сульфата аммония, 50 мМ Трис буферный раствор (pH 8,0) вводили в градиенте концентраций, и элюированные фракции анализировали с помощью электрофореза в 10% Трис-глициновом геле. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим R, с мягким качанием, и фракции, содержащие слитый мутантный белок FGF21 с высокой чистотой, собирали и затем диализировали в течение ночи при 4°C с использованием конечного буферного раствора (1× PBS, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4). После завершения диализа полученный стоковый раствор белка концентрировали при 3000 об/мин с использованием центрифужного фильтра с отсечкой по мол. массе 30000 при 4°C. Концентрацию слитого мутантного белка FGF21 измеряли с помощью количественного анализа BCA.

[190] Пример получения 1-5. Очистка слитых мутантных белков FGF21

[191] Колонку для афинной хроматографии с белком A (GE Healthcare) уравновешивали 1× буферным раствором PBS (pH 7,4). Супернатант культуры, включающий каждый слитый мутантный белок FGF21, полученный в Примере получения 1-3, фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм, а затем наносили на колонку для афинной хроматографии с белком A. Колонку промывали 1× буферным раствором PBS (pH 7,4), а затем элюировали белки при использовании 100 мМ глицинового буферного раствора (pH 3,0). Слитые белки, полученные с помощью афинной хроматографии, очищали при использовании колонки с анионообменной смолой (POROS® HQ 50 μm, Thermo Fisher Scientific). Колонку с анионообменной смолой уравновешивали 50 мМ Трис буферным раствором (pH 8,0), после чего слитые мутантные белки FGF21 элюировали с колонки. В частности, после промывки колонки 50 мМ Трис буферным раствором (pH 8,0), 50 мМ Трис буферный раствор (pH 8,0) вводили в градиенте концентраций и анализировали элюированные фракции. Каждую элюированную фракцию анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭВЭЖХ) и собирали фракции, содержащие слитые мутантные белки FGF21 с высокой чистотой. Концентрирование и количественный анализ проводили в соответствии с методами, описанными в Примере получения 1-4.

[192] Экспериментальный пример 1. Активности слитых белков in vitro

[193] Экспериментальный пример 1-1. Влияние мутаций FGF21 на активность белка

[194] Измеряли активность in vitro слитых белков DFD4, DFD5, DFD6, DFD6 (E. coli), DFD7, DFD9, DFD13, DFD18, DFD72, DFD73 и DFD74, полученных в Примере получения 1.

[195] В частности, активности in vitro слитых белков FGF21 оценивали с использованием клеточной линии HEK293 (Yuhan Corporation, Korea), которая была модифицирована для оверэкспрессии человеческого β-klotho, корецептора FGF21. Для оценки активности концентраты, содержащие слитые белки, полученные в Примерах получения 1-4 и 1-5, подвергали 3-кратному серийному разведению при концентрации 3 мкМ. После культивирования в условиях дефицита сыворотки в течение 5 часов, линию клеток с повышенной экспрессией β-klotho человека обрабатывали разведенными слитыми белками в течение 20 минут, и затем подвергали лизису при добавлении цитолитического буфера (Cisbio/номер по кат. 64ERKPEG) с перемешиванием при 60 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре. Раствор лизата клеток смешивали с антителами (Cisbio/номер по кат. 64ERKPEG), которые могут детектировать регулируемую внеклеточным сигналом киназу (ERK) и фосфорилированную ERK, и выдерживали смесь при комнатной температуре в течение 2 часов. Флуоресценцию обнаруживали при помощи флуориметрического детектора (TECAN/GENiosPro). Активности слитых белков измеряли при сравнении их значений EC₅₀. Результаты показаны на Фиг. 1А-1C.

[196] Как показано на Фиг. 1А-1C, было подтверждено, что активности in vitro слитых белков, полученных при введении мутационных последовательностей в белок FGF21 дикого типа, не были ингибированы, причем активности каждого слитого белка были подобны друг другу. Также было подтверждено, что в образце DFD6 (E. coli), экспрессированном в E. coli, и в образце DFD6, экспрессированном в клетках животных, активности in vitro слитых белков, полученных при введении мутации N-гликозилирования в белок FGF21 дикого типа, не были ингибированы.

[197] Экспериментальный пример 1-2. Влияние линкерной последовательности на активность белка

[198] Измеряли активности in vitro слитых белков DFD1, DFD3, DFD4 и DFD13, полученных в Примере получения 1.

[199] В частности, активности FGF21 слитых белков измеряли при использовании концентратов, содержащих слитые белки, полученных в Примере получения 1-5, в соответствии с методами, описанными в Экспериментальном примере 1-1. Результаты показаны на Фиг. 2A и 2B.

[200] Было подтверждено, что слитый мутантный белок FGF21 не демонстрировал значимого снижения активности, хотя было показано небольшое различие в активности в зависимости от линкерной последовательности, как показано на Фиг. 2А и 2B.

[201] Экспериментальный пример 1-3. Результаты эксперимента для DFD1, RGE (Amgen) и Fc-FGF21 (Lilly)

[202] Измеряли активности in vitro слитого белка DFD1, полученного в Примере получения 1, и контрольных белков RGE (Amgen) и Fc-FGF21 (Lilly).

[203] В частности, активности FGF21 слитых белков измеряли при использовании концентратов, содержащих слитые белки, полученных в Примере получения 1-5, и контрольных белков в соответствии с методами, описанными в Экспериментальном примере 1-1. Результаты показаны на Фиг. 3.

[204] Было подтверждено, что DFD1 и RGE (Amgen) имели подобную активность in vitro, тогда как Fc-FGF21 (Lilly) имел in vitro активность в два раза выше, чем у других белков, как показано на Фиг. 3.

[205] Экспериментальный пример 2. Оценка стабильности слитых белков

[206] Экспериментальный пример 2-1. Экспериментальный метод оценки стабильности

[207] Для измерения количества белковых агрегатов в начальной стадии подготовки образца, агрегаты высокой молекулярной массы (%HMW) количественно определяли при помощи метода эксклюзионной хроматографии (ЭВЭЖХ). Результаты показаны на Фиг. 4А-4C.

[208] В частности, в методе ЭВЭЖХ использовали колонку TosoHaas модели TSK-GEL G3000SW_XL. Колонку уравновешивали, пропуская буферный раствор (1× PBS, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4) при скорости потока 1 мл/мин. Стоковые растворы белков DFD4 и DFD13, полученные в Примерах получения 1-5, концентрировали до целевой концентрации 20 мг/мл или выше при 3000 об/мин с использованием центрифужного фильтра с отсечкой по мол. массе 30000 при 4°C. После измерения концентрации каждого образца с помощью количественного BCA анализа образцы разбавляли буферным раствором (1× PBS, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4) до конечной концентрации 20 мг/мл. Для измерения начального % HMW DFD4 и DFD13, образец с концентрацией 20 мг/мл разбавляли до концентрации 1 мг/мл 1× PBS, 1 мМ ЭДТА при pH 7,4. Затем по 100 мкл разбавленных образцов вводили в колонку ЭВЭЖХ и анализировали. Для оценки стабильности каждого образца, %HMW образцов измеряли при использовании метода ЭВЭЖХ, на 4-й, 8-й и 14-й дни, при их хранении при 5°C, 25°C и 37°C в течение двух недель.

[209] Как показано на Фиг. 4А-4C, было подтверждено, что DFD13 содержал более низкое количество агрегатов высокой молекулярной массы (% HMW) в начальной стадии и до точки 2 недели по сравнению с DFD4, что указывает на то, что введение мутации EIRP повышает стабильность слитого мутантного белка FGF21, значительно уменьшая, таким образом, % HMW.

[210] Экспериментальный пример 2-2. Результаты оценки стабильности

[211] Для исследования влияния мутации EIRP, введенной в исходную последовательность LLLE (98-101) FGF21, на стабильность, стабильность DFD4 (SEQ ID NO: 29) и DFD13 (SEQ ID NO: 35) измеряли в соответствии с методами, описанными в Экспериментальном примере 2-1. Результаты анализа образца нулевой точки (начальная стадия; день 0) и образцов DFD4 и DFD13 после хранения 4, 8 и 14 дней приведены в Таблице 4 ниже (в Таблице 4 ND означает "не обнаружено").

[212] [Таблица 4]

Стабильность DFD4 и DFD13 в течение 2 недель при концентрации 20 мг/мл (%HMW)

[213] Как показано в Таблице 4, количество %HMW в начальной стадии (День 0) составляло 0,91% для DFD4 и 0,56% для DFD13. Через 2 недели количество %HMW увеличилось до 8,83% для DFD4, но этого не наблюдали в DFD13 в условиях хранения при 25°C. Как было показано, DFD13 имел более низкий уровень %HMW в начальной стадии и через 2 недели по сравнению с DFD4. Было обнаружено, что при введении мутации EIRP, отношение % HMW мутантного слитого белка FGF21 было сильно снижено.

[214] Экспериментальный пример 3: Измерение фармакокинетики слитого белка

[215] Экспериментальный пример 3-1. Экспериментальный метод измерения фармакокинетики

[216] Самцов мышей ICR возрастом шесть недель, приобретенных в Orient BIO Co. (Korea), делили на группы (n=3 на каждую временную точку забора крови) таким образом, чтобы средние показатели массы тела были подобными за один день до введения лекарственного средства. После этого тестируемые вещества вводили в однократной подкожной дозе 1 мг/кг (2 мг/кг в случае RGE), соответственно. Затем образцы крови собирали через 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после инъекции, соответственно. Концентрацию интактного полноразмерного белка FGF21 в крови измеряли при использовании набора для ИФА интактного человеческого FGF21 (F1231-K01, Eagle Biosciences, USA), который обладает иммунореактивностью к N-концу и C-концу белка FGF21. Концентрации образцов в крови, собранной до момента 96 часов после подкожной инъекции каждого слитого белка мышам, измеряли и вычисляли фармакокинетические параметры каждого вещества.

[217] Экспериментальный пример 3-2. Результаты измерений фармакокинетической активности

[218] Фармакокинетические параметры вычисляли на основе графика, но котором показаны концентрации каждого белка в крови в зависимости от времени после подкожного введения слитых белков у мышей (Фиг. 5). Данные показаны в Таблице 5 ниже.

[219] [Таблица 5]

[220] Фармакокинетические профили слитых белков сравнивали и оценивали по площади под кривой (AUC), которая указывает на уровень экспозиции лекарственного средства.

[221] Как показано в Таблице 5, при сравнении DFD4 с DFD13 и DFD6 с DFD73 было определено, что введение последовательности EIRP привело приблизительно к 10% увеличению значения AUC. При сравнении DFD9 с DFD4, введение TGLEAV привело приблизительно к 6-кратному увеличению значения AUC.

[222] Кроме того, мутанты TGLEAN, G170N и G174N были разработаны с целью улучшения персистирования посредством N-гликозилирования в C-концевой части FGF21, который, как известно, подвергается протеолизу in vivo на C-конце FGF21. Проверяли увеличение AUC при N-гликозилировании по сравнению с каждым из контрольных веществ. Фактически, для проверки эффекта улучшения AUC при N-гликозилировании, выполняли сравнение с DFD6 (E. coli), который является веществом, продуцированным в E. coli без гликозилирования. В данном случае было обнаружено, что DFD6, полученный в линии клеток человека, показал уровень AUC, который был в 3 или более раз выше, чем DFD6, полученный в E. coli, что указывает на то, что в результате гликозилирования фармакокинетический профиль был улучшен.

[223] Мутация A180E, раскрытая в патенте Amgen Co. (WO 2009/149171), была введена в мутанты, в которые были введены TGLEAV или G170N, такие как DFD13 и DFD73, с получением DFD18 и DFD74. В данном случае было обнаружено дополнительное увеличение AUC приблизительно в 2-3 раза.

[224] Обобщая представленные выше результаты, введение различных мутантов и их комбинаций привело к улучшению фармакокинетических параметров по сравнению со слитым белком с FGF21 дикого типа, DFD9. Слитым белком, продемонстрировавшим наибольшее значение AUC, являлся DFD74, в который были введены EIRP, G170N и A180E, показав примерно в 45 раз более высокое значение AUC, чем DFD9. Также было обнаружено, что DFD74 обеспечивает улучшенную экспозицию лекарственного средства, чем RGE Amgen, с учетом вводимой дозы RGE, то есть 2 мг/кг. Общие эффекты улучшения фармакокинетики мутационными последовательностями представлены в Таблице 6.

[225] [Таблица 6]

[226] Экспериментальный пример 4. Активность слитых белков у мышей с алиментарным ожирением

[227] Экспериментальный пример 4-1. Экспериментальный метод оценки активности у мышей с алиментарным ожирением

[228] Эффект снижения массы тела DFD18, мутантного FGF21 слитого белка, оценивали на мышах с алиментарным ожирением. Для модели алиментарного ожирения, мышей C57BL/6J приобретали в Central Lab. Animal Inc. и содержали на диете с высоким содержанием жира, содержащей 60 ккал % жира (Диета в исследовании) в течение 8-12 недель. Мышей делили на группы (n=8/группа) так, чтобы они имели одинаковое среднее значение массы тела за один день до введения лекарственного средства (день 0), и затем один раз подкожно вводили 30 нмоль/кг образцов. Затем производили однократное подкожное введение в дозе 30 нмоль/кг с последующим наблюдением изменения массы тела по сравнению с фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) в качестве растворителя.

[229] Экспериментальный пример 4-2. Активность белка у мышей с алиментарным ожирением

[230] Что касается изменений массы тела в зависимости от времени в модели алиментарного ожирения на мышах после однократного введения 30 нмоль/кг DFD18, было подтверждено, что эффект снижения массы тела сохранялся до 10 дня после введения, и максимальное снижение массы тела (около 18%) регистрировали на 11-й день после введения, которое сохранялось до 14-го дня (Фиг. 6А и 6В).

[231] Пример получения 2. Получение и очистка слитых белков

[232] Пример получения 2-1. Получение векторов экспрессии для экспрессии слитых белков

[233] Для определения влияния последовательности мутантного белка ГПП-1 и последовательности слитого с ним Fc-шарнира на активность in vitro, фармакокинетические профили и фармакологическую эффективность, были сконструированы последовательности Fc-слитых мутантных белков ГПП-1. Последовательности мутантных белков ГПП-1 перечислены в Таблице 7 ниже.

[234] [Таблица 7]

[235] Кроме того, последовательности Fc-слитых мутантов ГПП-1 перечислены в Таблице 8.

[236] [Таблица 8]

[237] В таблице 8 HyFc5 относится к SEQ ID NO: 47, а HyFc40 относится к SEQ ID NO: 48. Для исследования эффектов последовательностей мутантных белков ГПП-1 и мутантных белков FGF21, последовательности Fc-шарнира, слитой с мутантами ГПП-1, последовательности линкера, связанной между FGF21 мутантными белками и Fc, на активность in vitro, фармакокинетические профили и фармакологическую эффективность, были созданы различные последовательности слитых белков. Последовательности слитых белков, включающие мутантные белки ГПП-1 и мутантные белки FGF21, перечислены в Таблице 9 ниже. Каждый слитый белок содержит мутантный белок ГПП-1, Fc-область иммуноглобулина, линкер и мутантный белок FGF21, соединенные в таком порядке от N-конца к С-концу.

[238] [Таблица 9]

[239] В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие каждый из слитых белков, были синтезированы после консультации с Bioneer Corporation (Korea) на основе аминокислотной последовательности каждого белка. Последовательности сайтов эндонуклеаз рестрикции NheI и NotI добавляли на 5'-конец и 3'-конец нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый из гибридных белков, а также инициирующий кодон для трансляции белка и лидерную последовательность (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA), обеспечивающую секрецию экспрессируемого белка из клетки встраивали рядом с последовательностью сайта рестрикции на 5'-конце. Терминирующий кодон встраивали рядом с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует каждый из слитых белков. Нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из слитых белков, клонировали в пустой вектор экспрессии pTrans при использовании двух рестриктаз, NheI и NotI. Пустой вектор экспрессии pTrans, который имеет простую структуру, включающую промотор ЦМВ, точку начала репликации из pUC, точку начала репликации из SV40 и ген устойчивости к ампициллину, был приобретен в CEVEC Pharmaceuticals (Germany).

[240] Пример получения 2-2. Конструирование плазмидной ДНК для экспрессии Fc-слитого мутанта ГПП-1 и слитых белков

[241] E. coli трансформировали каждым из векторов экспрессии, сконструированных в Примере получения 2-1, для получения большого количества плазмидной ДНК, которую предполагали использовать для экспрессии. Клетки E. coli с ослабленными после теплового шока клеточными стенками трансформировали каждым вектором экспрессии, и транформанты сеяли на чашку LB с получением колоний. Колонии, полученные таким образом, инокулировали в среду LB, культивировали при 37°C в течение 16 часов и каждую культуру E. coli, содержащую каждый вектор экспрессии, получали в объеме 100 мл. Полученные после этого клетки E. coli центрифугировали для удаления культуральной среды, и затем растворы P1, P2, P3 (QIAGEN, номер по кат.:12963) добавляли для разрушения клеточных стенок, получив в результате суспензию ДНК, в которой белки и ДНК были отделены. Плазмидную ДНК очищали из суспензии ДНК, полученной таким образом, при использовании колонки для очистки ДНК Qiagen. Элюированную плазмидную ДНК анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, и концентрацию и чистоту измеряли при использовании спектрофотометра NanoDrop (Thermo Scientific, Nanodrop Lite). ДНК, полученную таким образом, использовали для экспрессии.

[242] Пример получения 2-3. Экспрессия Fc-слитых мутантов ГПП-1 и слитых белков в клетках CAP-T

[243] Линии клеток человека трансформировали каждой плазмидной ДНК, полученной в Примере получения 2-2. Каждый тип плазмидной ДНК трансдуцировали в клетки CAP-T (CEVEC), которые культивировали в среде PEM (Life Technologies), при использовании раствора PEI (Polyplus, номер по кат.:101-10N). Смешанный раствор ДНК и раствор PEI смешивали с суспензией клеток при использовании экспрессионной среды Freestyle293 (Invitrogen), культивировали при 37°C в течение 5 часов и добавляли среду PEM. После культивирования при 37°C в течение 5-7 дней культуру центрифугировали для удаления клеток и получали супернатант, содержащий каждый белок.

[244] Пример получения 2-4. Очистка Fc-слитых мутантов ГПП-1 и слитых белков

[245] Колонку для аффинной хроматографии с белком А (GE Healthcare) уравновешивали 1× буферным раствором PBS (рН 7,4). Супернатант культуры, включающий каждый из Fc-слитых мутантов ГПП-1 и слитых белков, полученных в Примере получения 2-3, фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм и затем наносили на колонку для аффинной хроматографии с белком А. Колонку промывали 1× буферным раствором PBS (pH 7,4), а затем белки элюировали при использовании 100 мМ глицинового буферного раствора (pH 3,0). Белки, полученные с помощью аффинной хроматографии, очищали при использовании колонки с анионообменной смолой (POROS® HQ 50 μm, Thermo Fisher Scientific). Колонку с анионообменной смолой уравновешивали 50 мМ Трис-буферным раствором (рН 8,0), после чего на нее наносили белки, элюированные после аффинной хроматографии.

[246] После промывки колонки 50 мМ Трис-буферным раствором (рН 8,0), 50 мМ Трис-буферный раствор (рН 8,0) вводили в градиенте концентрации и анализировали элюированные фракции. Каждую элюированную фракцию анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭВЭЖХ) и фракции, содержащие Fc-слитые мутанты ГПП-1 и слитые белки с высокой чистотой, собирали и диализировали в течение ночи при 4°C при использовании конечного буферного раствора (1× PBS, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4). После завершения диализа полученный стоковый раствор белка концентрировали при 3000 об/мин с использованием центрифужного фильтра с отсечкой по мол. массе 30000 при 4°C. Концентрацию каждого белка измеряли с помощью количественного анализа BCA.

[247] Экспериментальный пример 5. Активность слитых белков in vitro

[248] Экспериментальный пример 5-1. Активность DFD23, DFD24, DFD25, DFD26, DFD27, DFD28 и DFD29

[249] Измеряли ГПП-1 активности слитых белков DFD23, DFD24, DFD25, DFD26, DFD27, DFD28 и DFD29 in vitro. В частности, линию клеток CHO (Eurofins, HTS163C2) с оверэкспрессией человеческого рецептора ГПП-1 приобретали и использовали для оценки ГПП-1 активности слитых белков. Для оценки активности образцы, содержащие слитые белки (стоковые растворы белков, полученные в Примере получения 2-4; в дальнейшем "образец"), подвергали 4-кратному серийному разведению при концентрации 25 нМ. После обработки в течение 30 минут линии клеток СНО с оверэкспрессией человеческого рецептора ГПП-1 измеряли образовавшийся внутриклеточный цАМФ (Cisbio, 62AM4PEB). Активность каждого белка оценивали путем сравнения значений ЕС₅₀.

[250] Как показано на Фиг. 7, слитый белок, содержащий последовательность ГПП-1(A2G), показал активность приблизительно в 2~3 раза ниже, чем у слитых белков, содержащих другие мутантные последовательности ГПП-1. Никакого значимого различия в активности ГПП-1 не наблюдали у слитых белков, содержащих мутантные последовательности, кроме последовательности ГПП-1(A2G).

[251] Экспериментальный пример 5-2. Активности DFD59, DFD69, DFD112 и DFD114

[252] Измеряли ГПП-1 активности in vitro слитых белков DFD69, DFD112 и DFD114, полученных в Примере получения 2, и DFD59 (Fc-слитого мутанта ГПП-1). В частности, линию клеток CHO (Eurofins, HTS163C2) с оверэкспрессией человеческого рецептора ГПП-1 приобретали и использовали для оценки ГПП-1 активности слитых белков. Для оценки активности образец, содержащий каждый из слитых белков, подвергали 4-кратному серийному разведению при концентрации 25 нМ. После обработки в течение 30 минут линии клеток СНО с оверэкспрессией человеческого рецептора ГПП-1 измеряли образовавшийся внутриклеточный цАМФ (Cisbio, 62AM4PEB).

[253] Как показано на Фиг. 8А и 8B, активность каждого белка оценивали путем сравнения значения EC₅₀. Три слитых белка показали подобные значения EC₅₀, а DFD59 (не содержащий мутантный FGF21) показал активность приблизительно в 2 раза выше, чем у слитых белков.

[254] Затем измеряли активности in vitro части FGF21 в DFD69, DFD112 и DFD114. В частности, активности in vitro части FGF21 в слитых белках оценивали при использовании линии клеток HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека (корецептора FGF21). Для оценки активности образцы, содержащие каждый из слитых белков, подвергали 3-кратному серийному разведению при концентрации 3 мкМ. После культивирования в условиях дефицита сыворотки в течение 5 часов, линию клеток HEK293 с оверэкспрессией β-klotho человека обрабатывали в течение 20 минут, после чего клетки лизировали при добавлении цитолитического буфера (Cisbio/номер по кат. 64ERKPEG) с перемешиванием при 60 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре. Раствор клеточного лизата смешивали с антителами, которые могут обнаруживать ERK и фосфорилированную ERK, и смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов. Флуоресценцию детектировали при использовании флуориметрического детектора (TECAN/GENiosPro). Активности измеряли при сравнении их значений EC₅₀.

[255] Было подтверждено, что активности in vitro части FGF21 слитых белков DFD69, DFD112 и DFD114 были аналогичными, как показано на Фиг. 8А и 8B.

[256] Экспериментальный пример 6. Оценка фармакокинетики слитых белков

[257] Экспериментальный пример 6-1. Экспериментальный метод оценки фармакокинетики

[258] Шестинедельных самцов мышей ICR, приобретенных в Orient BIO (Korea), делили на группы (n=3/время забора крови) для получения аналогичного среднего значения массы тела за один день до введения лекарственного средства, и подкожно вводили один раз соответствующий образец в объеме 1 мг/кг. Образцы крови собирали через 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 и 240 часов после инъекции соответственно. Концентрацию каждого слитого белка в крови измеряли на основе части FGF21 и части ГПП-1-Fc отдельно. Концентрацию интактной полноразмерной части FGF21 слитого белка в крови измеряли с использованием набора для ИФА интактного человеческого FGF21 (F1231-K01, Eagle Biosciences, USA), который обладает иммунореактивностью к N-концу и C-концу белка FGF21. Кроме того, концентрацию активной части ГПП-1-Fc слитого белка в крови измеряли при использовании антитела, которое обладает иммунореактивностью к N-концу ГПП-1 и Fc, как определяли с помощью анализа ИФА. Концентрации частей FGF21 и ГПП-1-Fc каждого белка в образцах крови, собранных до 240 часов после однократного подкожного введения каждого белка мышам, измеряли и вычисляли фармакокинетические параметры каждого белка.

[259] Экспериментальный пример 6-2. Результаты фармакокинетической активности

[260] На основе концентрации каждого активного вещества в крови в зависимости от времени после однократного подкожного введения каждого белка у мышей (Фиг. 9А и 9B) вычисляли фармакокинетические параметры для частей FGF21 и ГПП-1-Fc слитых белков. Данные показаны в Таблице 10 ниже.

[261] [Таблица 10]

[262] Фармакокинетический профиль каждого слитого белка сравнивали и оценивали по Площади под кривой (AUC), которая указывает уровень экспозиции лекарственного средства.

[263] Как показано в Таблице 10, в отношении фармакокинетических параметров части FGF21, DFD114 показал наибольшую степень экспозиции лекарственного средства (AUC) и полупериод существования, и DFD112 показал следующее по величине значение AUC, затем DFD69. DFD114 продемонстрировал увеличение значения AUC приблизительно в 2 или более раз по сравнению с DFD69. Что касается фармакокинетики части ГПП-1-Fc, четыре белка (DFD59, DFD69, DFD112 и DFD114), содержащие одну и ту же мутантную последовательность ГПП-1 показали подобные значения AUC.

[264] Экспериментальный пример 7. Оценка активности слитого белка при неалкогольном стеатогепатите у мышей с алиментарным ожирением

[265] Экспериментальный пример 7-1. Способ оценки активности при неалкогольном стеатогепатите у мышей с алиментарным ожирением

[266] Эффекты улучшения стеатогепатита и липидов слитых белков DFD114 и DFD112 и слитых FGF21 мутантных белков DFD74 и DFD72 оценивали в модели на мышах с алиментарным ожирением.

[267] Чтобы вызвать вызванное диетой ожирение, мыши C57BL/6J питались диетой с высоким содержанием жира (Диета исследования) содержащий жир % на 60 ккал в течение приблизительно 37 недель, чтобы подготовить модель мыши ожирения, имеющую стеатогепатит. Мыши были разделены на группы (n=6/group) таким образом, что средние массы тела были подобны в один день до медикаментозного лечения. После того DFD114, DFD112, DFD74 и DFD72 были применены 3 раза в дозе 3 или 10 нмоль/кг в 4-дневном интервале в течение 2 недель.

[268] Контрольной группе подкожно вводили растворитель (фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко, DPBS, Gibco, USA), используемый для приготовления тестируемого лекарственного средства, тем же самым способом. Через 4 дня после последнего введения животные в течение ночи не получали корм, после чего у них забирали кровь из посткавальной вены и ткани печени извлекали после ингаляционной анестезии и лапаротомии. Биохимические анализы крови выполняли с образцами сыворотки, выделенными из собранных образцов крови, а из фиксированных тканей печени изготавливали препраты посредством обрезки, обезвоживания, заливки в парафин, нарезания и т.д. Затем изготовленные препараты окрашивали гематоксилином и эозином (Г-Э) и наблюдали патогистологические изменения при помощи оптического микроскопа (Olympus, ECLIPSE E600).

[269] Экспериментальный пример 7-2. Результаты оценки активности при неалкогольном стеатогепатите у мышей с алиментарным ожирением

[270] Для оценки эффектов улучшения стеатогепатита и липидов слитых белков и слитого FGF21 мутантного белка, DFD114, DFD112, DFD74 и DFD72 многократно вводили в дозе 3 или 10 нмоль/кг с интервалом 4 дня в течение 2 недель в модели на мышах с алиментарным ожирением. Затем исследовали изменения липидов в сыворотке и ткани печени, и наблюдали патогистологические изменения.

[271] Как показано на Фиг. 10А-10C, триглицериды (ТГ) и общий холестерин (ОХС) в сыворотке измеряли после многократного подкожного введения слитых белков DFD114 и DFD112 и слитых FGF21 мутантных белков DFD74 и DFD72. В результате уровни триглицеридов и общего холестерина в сыворотке снизились, и уровни триглицеридов в ткани печени также снизились по сравнению с контрольной группой, получавшей растворитель.

[272] Как показано на Фиг. 11, патогистологическое исследование, проведенное после многократного подкожного введения слитых белков DFD114 и DFD112, показало, что липид в ткани печени значительно снизился по сравнению с контрольной группой, получавшей растворитель.

[273] Экспериментальный пример 8. Оценка активности слитых белков у мышей с MCD-индуцированным неалкогольным стеатогепатитом

[274] Экспериментальный пример 8-1. Способ оценки активности у мышей с MCD-индуцированным неалкогольным стеатогепатитом

[275] Для оценки эффектов уменьшения воспаления и фиброза слитых белков и слитых мутантных белков FGF21 в модели неалкогольного стеатогепатита оценивали эффекты DFD112 и DFD72 в модели MCD.

[276] Модель неалкогольной болезни печени, вызванной у животных диетой с недостаточным содержанием метионина и холина (MCD), является одной из широко используемых моделей для оценки неалкогольного стеатогепатита. Стеатогепатит с фиброзом печени индуцировали диетой с недостаточным содержанием метионина и холина, которые играют важную роль в бета-окислении и синтезе липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП). Эта модель, как известно, подобна модели патологии при стеатогепатите у человека. Для индукции модели стеатогепатита, диету MCD и диету со стандартным содержанием метионина и холина (MCS) предоставляли без ограничения поочередно, в течение 17 недель, в качестве корма мышам C57BL/6 в виде диеты MCD в течение 10 дней и затем диеты MCS в течение 4 дней.

[277] Животных взвешивали перед введением тестируемого вещества и рандомизированно распределяли в группы таким образом, чтобы средняя масса тела в каждой группе была распределена максимально равномерно. После распределения 10 мышей в каждую группу, 3, 10 и 30 нмоль/кг DFD112 и 10 нмоль/кг DFD72 подкожно вводили с интервалом 2 дня в течение 4 недель. В контрольной группе MSC и контрольной группе на диете MCD мышам подкожно вводили растворитель (фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко, DPBS, Gibco, USA), используемый для приготовления тестируемого вещества, с интервалом 2 дня в течение 4 недель, таким же способом.

[278] После многократного введения тестируемого вещества в течение 4 недель, мыши не получали корм в течение ночи, после чего кровь забирали из посткавальной вены и извлекали ткани печени после ингаляционной анестезии и лапаротомии. Биохимические анализы крови выполняли с образцами сыворотки, выделенными из собранных образцов крови, и изготавливали фиксированные ткани печени в виде препаратов посредством общих процессов обработки тканей. Затем проводили окрашивание гематоксилином и эозином (Г-Э) и иммуногистохимическое окрашивание, и патогистологические изменения наблюдали с помощью оптического микроскопа (Olympus, BX53).

[279] Экспериментальный пример 8-2. Результаты оценки активности у мышей с MCD-индуцированным неалкогольным стеатогепатитом

[280] 3, 10 и 30 нмоль/кг слитого белка DFD112 и 10 нмоль/кг слитого FGF21 мутантного белка DFD72 многократно вводили с интервалом 2 дня в течение 4 недель мышам с MCD-индуцированным неалкогольным стеатогепатитом. Затем выполняли биохимический анализ крови и патогистологическое исследование для оценки эффектов в отношении неалкогольного стеатогепатита.

[281] Как показано на Фиг. 12А-12C, контрольная группа MCD, в которой индуцировали неалкогольный стеатогепатит, показала значительно более высокие значения аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартаттрансаминазы (АСТ) (p<0,001), индикаторов повреждения печени, по сравнению с контрольной группой MCS, получавшей стандартный рацион. Уровни АСТ и АЛТ в сыворотке снижались дозозависимо в группе, получавшей DFD112, по сравнению с контрольной группой MCD. Кроме того, контрольная группа MCD показала значительно более высокий уровень воспаления по сравнению с контрольной группой MCS при патогистологическом исследовании (p<0,01). При введении DFD112 уровень воспаления снижался дозозависимо по сравнению с контрольной группой MCD.

[282] Как показано на Фиг. 13А-13C и Фиг. 14, для оценки воздействия слитого белка на фиброз печени, альфа-актин гладких мышц (α-SMA) и трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) в ткани печени, в качестве индикаторов фиброза печени, окрашивали при использовании иммуногистохимического окрашивания и определяли количественно с помощью анализа изображения. Уровни экспрессии α-SMA и TGF-β в контрольной группе MCD по сравнению с контрольной группой MCS были повышены (p<0,001). При введении DFD112 и DFD72 экспрессия α-SMA и TGF-β была снижена по сравнению с контрольной группой MCD. Кроме того, коллаген в ткани печени окрашивали при использовании окрашивания пикросириусом красным и определяли количественно с помощью анализа изображения. В результате количество коллагена в контрольной группе MCD было выше, чем в контрольной группе MCS (p<0,001), и при введении DFD112 и DFD72 наблюдали тенденцию к снижению коллагена в ткани печени по сравнению с контрольной группой MCD.

[283] Экспериментальный пример 9. Оценка активности слитых белков у мышей с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом

[284] Экспериментальный пример 9-1. Способ оценки активности слитых белков у мышей с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом

[285] Для оценки эффектов уменьшения воспаления и фиброза слитых белков в модели неалкогольного стеатогепатита, эффект DFD112 оценивали в модели алиментарного ожирения и неалкогольного стеатогепатита на мышах.

[286] Модель ожирения и неалкогольного стеатогепатита на мышах получали при кормлении мышей C57BL/6 диетой с высоким содержанием жиров (Диета в исследовании), содержащей 40% жиров, 40% углеводов и 2% холестерина, в течение приблизительно 30 недель. Патогистологическое исследование ткани печени проводили приблизительно за 3 недели до начала лечения лекарственным средством, и уровни АЛТ и АСТ и массу тела измеряли перед введением. Подопытных животных подбирали таким образом, чтобы степени индукции неалкогольного стеатогепатита и масса тела были распределены равномерно, и делили на группы. В каждую группу распределяли по 12 мышей, и DFD112 многократно вводили подкожно в дозе 3 или 10 нмоль/кг, с интервалом 2 дня в течение 8 недель. В контрольной группе растворитель, используемый для приготовления тестируемого вещества (фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко, DPBS, Gibco, USA), вводили таким же способом.

[287] После последнего введения мышам не давали корм в течение ночи и забирали кровь из посткавальной вены, и извлекали ткани печени после ингаляционной анестезии и лапаротомии. Биохимические анализы крови проводили с образцами сыворотки, выделенными из собранных образцов крови. Фиксированные ткани печени изготавливали в виде препаратов, и полученные препараты окрашивали гематоксилином и эозином (Г-Э) или пикросириусом красным и наблюдали патогистологические изменения.

[288] Экспериментальный пример 9-2. Результаты оценки активности слитых белков у мышей с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом

[289] Мышам с алиментарным ожирением и неалкогольным стеатогепатитом многократно вводили DFD112 в дозе 3 или 10 нмоль/кг с интервалом 2 дня в течение 8 недель. Затем проводили биохимический анализ крови и патогистологическое исследование для оценки эффекта при неалкогольном стеатогепатите.

[290] Как показано на Фиг. 15А-15D, уровни в сыворотке АЛТ и АСТ, индикаторов повреждения печени, снизились до нормального значения (p<0,001) в группе, получавшей DFD112. Уровни триглицеридов (ТГ) и общего холестерина (ОХС) в сыворотке также значительно снизились по сравнению с контрольной группой, получавшей растворитель (p<0,05 или p<0,001).

[291] Как показано на Фиг. 16А-16B, результаты патогистологического исследования до и после введения показали, что оценка активности НЖБП (NAS) после введения, как показатель классификации степени неалкогольного стеатогепатита, увеличивалась или сохранялась в контрольной группе, получавшей растворитель, при многократном введении в течение 8 недель, по сравнению с оценкой до введения. С другой стороны, оценка активности НЖБП значительно снизилась у всех субъектов в группе введения DFD112 по сравнению с оценкой до введения. Кроме того, при оценке степени фиброза, степень фиброза сохранялась или ухудшалась в контрольной группе по сравнению со степенью до введения, тогда как в группе введения DFD112 наблюдали значимый эффект улучшения (p<0,05).

[292] Экспериментальный пример 10. Оценка активности слитого белка у крыс с TAA-индуцированным фиброзом печени

[293] Экспериментальный пример 10-1. Способ оценки активности слитого белка у крыс с TAA-индуцированным фиброзом печени

[294] Эффект DFD112 оценивали в модели на крысах, в которой фиброз печени был вызван питьевой водой, чтобы оценить эффект уменьшения фиброза печени при введении слитых белков.

[295] Модель фиброза печени получали, предоставляя крысам линии Wistar питьевую воду, содержащую тиоацетамид (TAA), в течение приблизительно 14 недель. Животных взвешивали перед введением тестируемого вещества и рандомизированно распределяли в группы таким образом, чтобы средняя масса тела в каждой группе имела максимально равномерное распределение. После распределения 8 крыс в каждую группу, 30 нмоль/кг DFD112 многократно подкожно вводили с интервалом 2 дня в течение 8 недель. Питьевую воду с TAA постоянно предоставляли до конца введения. Нормальная контрольная группа получала обычную питьевую воду с начала исследования до конца введения, и контрольная группа TAA получала питьевую воду с TAA с начала исследования до конца введения.

[296] После завершения введения мышам не давали корм в течение ночи и забирали кровь из посткавальной вены, а ткани печени извлекали после ингаляционной анестезии и лапаротомии. Биохимические анализы крови выполняли с образцами сыворотки, выделенными из собранных образцов крови, и фиксированные ткани печени изготавливали в виде препаратов и окрашивали пикросириусом красным, и наблюдали патогистологические изменения для сравнения степени фиброза паренхимы печени.

[297] Экспериментальный пример 10-2. Способ оценки активности слитого белка у крыс с TAA-индуцированным фиброзом печени

[298] 30 нмоль/кг слитого белка DFD112 многократно вводили крысам с TAA-индуцированным фиброзом печени с интервалом 2 дня в течение 8 недель и влияние на фиброз печени оценивали посредством биохимических анализов крови и патогистологических исследований.

[299] Как показано на Фиг. 17a-17d, контрольная группа TAA, в которой был вызван фиброз печени, показала значительно более высокие уровни щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) и общего билирубина (ОБил) (p<0,01 или p<0,001), индикаторов повреждения печени, по сравнению с контрольной группой, которая получала обычную питьевую воду.

[300] Было отмечено, что уровни АЛТ, ГГТ и ОБил значительно снизились при введении DFD112 по сравнению с контрольной группой TAA. Патогистологическое исследование показало, что доля площади фиброза печени, положительно окрашенная пикросириусом красным, была значительно увеличена в контрольной группе TAA по сравнению с нормальной контрольной группой. Кроме того, было отмечено, что доля площади фиброза печени значительно уменьшалась при введении DFD112 по сравнению с контрольной группой TAA (p<0,001).

[301]

[302]

--->

<110> YUHAN CORPORATION

<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ

ГЕПАТИТА, ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ И ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ СЛИТЫЕ БЕЛКИ

<130> PCB709047YUH

<150> KR 2016/149866

<151> 2016-11-10

<160> 80

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> человеческий FGF21

<400> 1

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 2

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 2

Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly

1. 5 10 15

Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu

20 25 30

<210> 3

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 3

Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly

1. 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5 10 15

<210> 5

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala

1. 5 10 15

<210> 6

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 6

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 7

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 7

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 8

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 8

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 9

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 9

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 10

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 10

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 11

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 11

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 12

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 12

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 13

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 13

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 14

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 14

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 15

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 15

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 16

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 16

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 17

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 17

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 18

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 18

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 19

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 19

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 20

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 20

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 21

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 21

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 22

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 22

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 23

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 23

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1. 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 24

<211> 229

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий IgG4 Fc

<400> 24

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1. 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 25

<211> 228

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант человеческого IgG4 Fc

<400> 25

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1. 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly

225

<210> 26

<211> 223

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибридный вариант Fc

<400> 26

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 27

<211> 435

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 27

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala

210 215 220

Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu His Pro Ile

245 250 255

Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg

260 265 270

Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile

275 280 285

Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser

290 295 300

Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly

305 310 315 320

Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr

325 330 335

Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile

340 345 350

Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro

355 360 365

Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg

370 375 380

Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro

385 390 395 400

Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser

405 410 415

Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser

420 425 430

Tyr Ala Ser

435

<210> 28

<211> 422

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 28

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala

210 215 220

Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly

225 230 235 240

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

245 250 255

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

260 265 270

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

275 280 285

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

290 295 300

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

305 310 315 320

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

325 330 335

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

340 345 350

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

355 360 365

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

370 375 380

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

385 390 395 400

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

405 410 415

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 29

<211> 420

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 29

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 30

<211> 420

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 30

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 31

<211> 419

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 31

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 32

<211> 419

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 32

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 33

<211> 419

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 33

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 34

<211> 419

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 34

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 35

<211> 420

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 35

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 36

<211> 420

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 36

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Glu Ser

420

<210> 37

<211> 420

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 37

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Glu Ser

420

<210> 38

<211> 419

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 38

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 39

<211> 419

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридным Fc

<400> 39

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1. 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Glu Ser

<210> 40

<211> 423

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> REG(Amgen)

<400> 40

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1. 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly

245 250 255

Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu

260 265 270

Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp

275 280 285

Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val

290 295 300

Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro

305 310 315 320

Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser

325 330 335

Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu

340 345 350

Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg

355 360 365

Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu

370 375 380

Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro

385 390 395 400

Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gly Ser Gln Gly

405 410 415

Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

420

<210> 41

<211> 424

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FGF21, соединенный с Fc(lilly)

<400> 41

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1. 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ser Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe

245 250 255

Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln

260 265 270

Thr Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala

275 280 285

Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro

290 295 300

Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln

305 310 315 320

Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala

325 330 335

Cys Ser Phe Arg Glu Asp Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln

340 345 350

Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asp Lys Ser Pro

355 360 365

His Arg Lys Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro

370 375 380

Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln

385 390 395 400

Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Arg Leu Val Glu Pro Ser

405 410 415

Gln Leu Arg Ser Pro Ser Phe Glu

420

<210> 42

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП-1

<400> 42

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 43

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1

<400> 43

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 44

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1

<400> 44

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 45

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1

<400> 45

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 46

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1

<400> 46

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 47

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибридный Fc5

<400> 47

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys

1. 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 48

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибридный Fc40

<400> 48

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

1. 5 10 15

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

65 70 75 80

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

85 90 95

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

100 105 110

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

130 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

225 230

<210> 49

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1, соединенный с гибридным Fc5

<400> 49

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 50

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1, соединенный с гибридным Fc40

<400> 50

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 51

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1, соединенный с гибридным Fc5

<400> 51

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 52

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1, соединенный с гибридным Fc40

<400> 52

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 53

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1, соединенный с гибридным Fc5

<400> 53

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 54

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1, соединенный с гибридным Fc40

<400> 54

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 55

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1, соединенный с гибридным Fc5

<400> 55

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 56

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант ГПП-1, соединенный с гибридным Fc40

<400> 56

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 57

<211> 275

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Дулаглутид

<400> 57

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly

275

<210> 58

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(A2G)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 58

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 59

<211> 473

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GE)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 59

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 60

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GE)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 60

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 61

<211> 473

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GG)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 61

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 62

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 62

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 63

<211> 473

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GEG)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 63

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 64

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 64

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 65

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E)

<400> 65

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 66

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E)

<400> 66

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 67

<211> 460

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ГПП1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, G170N, A180E)

<400> 67

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1. 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 68

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 68

Glu Ile Arg Pro

1

<210> 69

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 69

Thr Gly Leu Glu Ala Val

1. 5

<210> 70

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 70

Thr Gly Leu Glu Ala Asn

1. 5

<210> 71

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD23

<400> 71

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttatc tggaaggaca ggccgctaag 60

gagtttatcg catggctcgt caaaggcaga ggcgaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380

tcc 1383

<210> 72

<211> 1419

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD24

<400> 72

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaaga gggaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120

aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180

cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240

atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300

gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360

cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420

gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480

atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540

cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600

ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660

aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720

gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780

ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840

agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900

ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960

gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020

gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080

actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140

cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200

gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260

cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320

cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380

acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419

<210> 73

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD25

<400> 73

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaaga ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380

tcc 1383

<210> 74

<211> 1419

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD26

<400> 74

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttatc tggaaggaca ggccgctaag 60

gagtttatcg catggctcgt caaaggcggc ggcaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120

aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180

cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240

atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300

gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360

cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420

gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480

atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540

cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600

ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660

aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720

gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780

ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840

agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900

ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960

gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020

gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080

actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140

cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200

gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260

cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320

cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380

acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419

<210> 75

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD27

<400> 75

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttatc tggaaggaca ggccgctaag 60

gagtttatcg catggctcgt caaaggcggc ggcgaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380

tcc 1383

<210> 76

<211> 1419

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD28

<400> 76

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc gggaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120

aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180

cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240

atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300

gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360

cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420

gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480

atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540

cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600

ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660

aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720

gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780

ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840

agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900

ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960

gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020

gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080

actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140

cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200

gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260

cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320

cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380

acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419

<210> 77

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD29

<400> 77

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380

tcc 1383

<210> 78

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD69

<400> 78

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgag 1380

tcc 1383

<210> 79

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD112

<400> 79

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggcca acagaagccc cagctacgag 1380

tcc 1383

<210> 80

<211> 1380

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей DFD114

<400> 80

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgaaccct tcccagggca gaagccccag ctacgagtcc 1380

1380

<---