Вид РИД
Изобретение
Области техники
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению рекомбинантного В30-дезтреонин инсулин для получения инсулинового аналога инсулинадеглудек и может быть использовано для приготовления лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета.
Краткое описание изобретения
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии. Данное изобретение может быть использовано для получения В30-дезтреонин-инсулина (проинсулинадеглудек), имеющего в своем составе цепь B с делецией треонина B30, С- пептид и цепь А. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, содержащая гибридный tac-промотор, терминатор рибосомного оперона Е. coli, искусственный ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящий из короткой лидерной последовательности фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, пептидного линкера GlyHis6GlySerArg, сайтапротеолиза «Арг», цепи B с делецией треонина B30, сайта протеолиза «АргАрг», С-пептида, сайт протеолиза «Арг» и цепи А. Более подробно, предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pF882, кодирующая гибридный полипептид,
в котором последовательность MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А,
с молекулярной массой 1,4 МДа (4534 п.о.),
содержащая:
- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину; участок инициации репликации (ori);
- ROP ген, регулирующий копийностьплазмиды;
- XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;
- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg, с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина;
- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора,
- уникальные сайты узнавания рестрикционнымиэндонуклеазами со следующими координатами: EcoRI - 115, BamHI – 176, SpeI – 435, HindIII – 441, BglII – 1869, NdeI – 2473, AatII – 4465.
Также предложен штамм Escherichiacoli - продуцента гибридного полипептида с последовательностью В30-дезтреонин-инсулина (проинсулина деглудек). При этом, биосинтез гибридного полипептида индуцируется изопропилтиогалактопиранозидом, уровень его биосинтеза составляет не ниже 4% от массы влажного осадка клеточной биомассы.
Настоящее изобретение позволяет получать гибридный полипептид с высокой долей инсулина деглудек (49,5%) и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг0-А-(В30-дезтреонин-инсулин). Изобретение направлено на получение высокопродуктивного бактериального штамма – продуцента полипептиднойчасти инсулинового аналога деглудек.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время сахарный диабет представляет собой серьезнейшую медицинскую и социально-экономическую проблему во всем мире. В связи с этим разработка и внедрение современных методов терапии сахарного диабета является одним из наиболее приоритетных направлений медицины и фармацевтической промышленности (1).
Эффективная заместительная инсулинотерапия как основной способ терапии инсулинозависимого сахарного диабета, имеет, в связи с этим, особое значение. Природные и рекомбинантные инсулины уже не способны в полной мере удовлетворить потребности клиницистов и пациентов. Сегодняшняя медицина требует использования более современных противодиабетических препаратов, таких как аналоги человеческого инсулина короткого и пролонгированного действия (2-5).
У здоровых людей пики выделения инсулина непосредственно связаны с приемом пищи. Между приемами пищи уровень эндогенного инсулина снижается до базального уровня. У здорового человека приблизительно 50% выделяемого за сутки инсулина является базальным (6). Подобный профиль лучше всего может быть воспроизведен путем применения пролонгированного инсулина в сочетании с инсулином короткого действия. Постпрандиальные пики активности эндогенного инсулина могут быть имитированы путем введения препаратов инсулина короткого действия, тогда как для воссоздания базального уровня инсулина используют инсулины в комплексе с нейтральным протамином Хагедорна (инсулин НПХ) или аналоги человеческого инсулина пролонгированного действия (7).
Одним из аналогов человеческого инсулина длительного действия является инсулин деглудек (Tresiba, «NovoNordisk»). Инсулин деглудек является человеческим инсулином, у которого удалена аминокислота треонин в положении B30, а к лизину в положени B29 присоединен остаток пальмитиновой кислоты. Ацилированиежирнокислотным хвостом по лизину B29 приводит к обратимому связыванию с альбумином, циркулирующим в крови и увеличивает длительность действия гормона (8-10).
В составе лекарственной формы присутствует фенол и цинк, что приводит к тмоу, что инсулин деглудек находится в стабильной дигексамерной форме, при этом жирные кислоты расположены между гексамерами(10, 11). Олигомерная структура инсулина деглудек детерминирует продолжительность действия, в то время как сродство с альбумином плазмы, предположительно, обеспечивает эффект амортизации и уменьшает изменчивость профиля действия за счет более равномерного поглощения в кровоток (8, 10).
Клиническая оценка применения в терапии инсулина деглудек показала эффект снижения глюкозы, который сохраняется до 42 часов с одновременным снижением эпизодов ночной гипогликемии по сравнению с применением другого инсулина пролонгированного действия гларгин(10, 12).При этом, число пациентов с сахарным диабетом 1 типа, которым необходим аналог инсулина, в частности, инсулин деглудек, растет с каждым годом.
Таким образом, разработка способов получения гибридного полипептида, входящего в состав инсулинового аналога деглудек, является актуальной медицинской задачей.
В настоящее время наиболее перспективной является технология получения инсулина и инсулиновых аналогов с использованием методологии экспрессии гена проинсулина человека в клетках Escherichiacoli в составе гибридных белков в виде нерастворимых "телец включения" (13). Структура одноцепочечного предшественника (гибридного полипептида), экспрессируемого в известных штаммах продуцентах инсулина человеческого, представляет собой лидерный пептид, сайт протеолиза «Арг» или «Лиз» или «Лиз Арг», цепь B, сайт протеолиза «АргАрг», С-пептид, сайт протеолиза «Лиз Арг», цепь А (Фиг. 2).
Необходимость включать лидерные пептиды в состав гибридного полипептида связана с низкой стабильностью проинсулина в клетках Escherichiacoli, время полужизни которого составляет 2 минуты (4). В качестве лидерных последовательностей, защищающих проинсулин от протеолитической деградации, используют глутатион-трансферазу(14), иммуноглобулин, связывающий (IgG) домен белка А из S.aureus X(15), интерлейкин-2 (16) и др.
Технологическая схема получения инсулина и инсулиновых аналогов из гибридного полипептида характеризуется следующими этапами: наращивание биомассы клеток штамма-продуцента, выделение телец включения, денатурация гибридного полипептида, ренатурация гибридного полипептида. Следующим этапом технологического процесса является ферментативный гидролиз с использованием смеси двух ферментов: трипсина и карбоксипептидазы B. Трипсин осуществляет гидролиз пептидной связи преимущественно после аргинина, карбоксипептидаза B отщепляет положительно заряженные аминокислоты с C-конца (лизин и аргинин). В результате совместного гидролиза трипсином и карбоксипептидазой B образуется нативный инсулин.
К недостаткам использованных ранее генетических конструкций для экспрессии гибридного полипептида относятся:
1. Низкая доля конечного продукта - инсулина. Это связанно с тем, что лидерные пептиды представляют собой достаточно протяженные аминокислотные последовательности и составляют от 40 до 60% массы гибридного полипептида.
2. Образование близкородственной примеси Арг0-А-(В30-дезтреонин-инсулин)-инс в результате гидролиза трипсином пептидной связи после а.к. лизин между С-пептидом и А-цепью (фиг. 2).
Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому изобретению являются рекомбинантные плазмиды ДНК pPINS07 и pHINS11, обеспечивающие синтез гибридных полипептидов, имеющих в своем составе IgG-связывающий домен стафилококкового белка А (17) и N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (18), соответственно.
Патент РФ №2144957 описывает штамм E.coli JM109/pPINS07, обеспечивающий синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 25-30%. Плазмида pPINS07 детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором единственный IgG-связывающий домен стафилококкового белка А соединен через пептидный линкер His6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека. Преимущества предложенного конструкта заключаются в высоком уровне экспрессии гибридного полипептида и в его эффективной ренатурации (рефолдинге) и, как следствие, высоком выходе правильно свернутого полипептида. Существенным недостатком данной рекомбинантной плазмидной ДНК pPINS07 является то, что она кодирует полипептид с низкой долей инсулина, составляющего около 33% (17).
Патент РФ №2354702 описывает рекомбинантную плазмидную ДНК pHINS11 и штамм E.coli JM109/ pHINS11. Данная плазмида детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека соединен через пептидный линкер HisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека и обеспечивает его высокую экспрессию. Использование этих конструкций в технологическом процессе позволяет получать высокоочищенный инсулин человека с чистотой не ниже 98% и активностью не менее 27,5 МЕ/мг. Для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза гибридного полипептида и более высокая доля инсулина в гибридном полипептиде (38%) по сравнения с рекомбинантной плазмидой pPINS07 (33%), однако стадия ренатурации продуцируемого гибридного полипептида недостаточно эффективна (18).
Общим недостатком гибридных полипептидов в описанных патентах является сайт протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью, допускающий образование близкородственной примеси Арг0-А-(В30-дезтреонин-инсулин).
Задачей предлагаемого изобретения является конструирование плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень индуцируемой экспрессии гибридного полипептида с высокой долей полипептидной части инсулина деглудек и модифицированным сайтом протеолиза между С-пептидом и
А-цепью с целью предотвращения возможности образования близкородственной примеси Арг0-А-(В30-дезтреонин-инсулин) при ферментативном гидролизе гибридного полипептида.
Поставленная задача решается конструированием рекомбинантной плазмидной ДНК pF882 и штамма Escherichiacoli BL21/pF882, обеспечивающего синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 4% от сырого веса клеточной биомассы.
Описание фигур
На Фиг. 1 показана молекулярная структура инсулина деглудек (9).
На Фиг. 2 представлена структура одноцепочечного предшественника (гибридного полипептида) в штаммах продуцентах инсулина.
На Фиг. 3 показана структура последовательности ДНК, полученной методом химического синтеза.
На Фиг. 4 показано Расположение праймеров на плазмиде pF173 для сайт-направленного мутагенеза сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью.
На Фиг. 5 Первичная структура EcoRI/HindIII-фрагмента плазмиды pF882, кодирующая гибридный полипептид. Подчеркнуты инициирующий и терминирующие кодоны, обозначены сайты узнавания рестриктаз.
На Фиг. 6 Физическая карта рекомбинантной плазмиды pF882. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции, pBR322 ori - участок инициации репликации плазмиды, Ptac - гибридный промотор транскрипции, rrnB - терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, Лидерный пептид - MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, фрагмент человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы (TKS), и пептидный линкер GlyHis6GlySerArg, Продеглудек - В30-дезтреонин-инсулина (проинсулин деглудек), LacI - транскрипционный репрессор, регулирующий транскрипцию Tac-промотора, а также праймеры Pr033 и Pr039.
Подробное описание изобретения
Согласно изобретению, предложена рРекомбинантнаяплазмидная ДНК pF882, кодирующая гибридный полипептид,
в котором последовательность MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А,
с молекулярной массой 1,4 МДа (4534 п.о.),
содержащая:
- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину; участок инициации репликации (ori);
- ROP ген, регулирующий копийностьплазмиды;
- XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;
- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg, с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина;
- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора,
- уникальные сайты узнавания рестрикционнымиэндонуклеазами со следующими координатами: EcoRI- 115, BamHI – 176, SpeI – 435, HindIII – 441, BglII – 1869, NdeI – 2473, AatII – 4465.
Также предложен штамм Escherichiacoli BL21/pF882 - продуцент гибридного полипептида с последовательностью В30-дезтреонин-инсулина (проинсулина деглудек), трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению.Кроме того, предложен гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg, с последовательностью В30-дезтреонин-инсулина человека, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, полученный с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению.
Авторы настоящего изобретению установили, что при существенном сокращении размера гибридного полипептида за счет использования короткой лидерной последовательности, состоящей из 31 аминокислоты и изменении сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью на «Арг» можно достичь высоких выходов целевого пептида.
В составе лидерного пептида имеется короткая последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, образующая выраженную пространственную структуру типа «альфа-спираль». Наличие N-концевого альфа-спирального участка в гибридном полипептиде положительно влияет на уровень ренатурации гибридного полипептида.
Настоящее изобретение позволяет увеличить долю полипептидной части инсулинадеглудек в гибридном полипептиде до 49,5% и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг0-А-(В30-дезтреонин-инсулин). Изобретение направлено на получение высокопродуктивного бактериального штамма – продуцента полипептидной части инсулинового аналога деглудек.
Исходной плазмидой для создания экспрессионного вектора pF265 послужила плазмида pF019, представляющая собой рекомбинантный вектор pBR322 (8), в которой методами молекулярного клонирования полностью удалили ген устойчивости к тетрациклину (пример 1).
На следующем этапе синтезировали фрагмент ДНК размером 1,6 кб, содержащий следующие элементы и сайты рестрикции (Фиг. 2):
- Tacпромотер и Lac оператор для контроля экспрессии гибридного полипептида (9), фланкированный сайтами рестрикции XhoI и EcoRI.
- Терминатор транскрипции rnnB оперона штамма K-12 ER3413 (REGION: 4143199..4143361), перед которым расположен сайт рестрикции HindIII.
- LacI ген штамма K-12 ER3413 (REGION: 365804 to 367006) с сайтом рестрикции BglII на 3’-конце. Введение LacI гена в экспрессионную конструкции решает задачу контроля экспрессии гибридного полипептида при использовании широкого круга штаммов-хозяев, включая BL21, характеризующийся повышенной стабильностью рекомбинантных полипептидов за счет удаления клеточных протеаз lon иompT.
Синтезированный фрагмент ДНК и плазмиду pF019 инкубировали с эндонуклеазами рестрикции XhoI и BglII в течение 3-х часов при 37оС. Соответствующие ДНК-фрагменты выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорации XL1-Blue штамма E.coliвыделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью методов ПЦР и секвенирования.
Таким образом, получали экспрессионный вектор pF20 на основе плазмидной ДНК pBR322, содержащий Таспромотер, rnnB терминатор и LacI ген, кодирующий транскрипционный репрессор Таспромотера, а также сайты рестрикции EcoRI и HindIII для последующей вставки гена, кодирующего гибридный полипептид.
ДНК последовательность гибридного полипептида, содержащую в качестве лидерного пептида IgG-связывающий домен белка А из Staphylococcusaureus, пептидный линкер His6GlySerArg и проинсулина человека, вырезали из плазмидной ДНК pPIN07 (6) с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI / HindIII и вставляли по соответствующим сайтам рестрикции в экспрессионный вектор pF20 описанным выше способом, при этом в получаемом векторе появлялся сайт рестрикции BamHI, образованный кодирующей последовательностью двух аминокислот пептидного линкера GlySer (GGATCC). В результате получали рекомбинантнуюплазмидную ДНК pF100.
На следующим этапе получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF173 после замены ДНК последовательности IgG-связывающего домена белка А из StaphylococcusaureusДНК последовательностью, кодирующей более короткий лидерный пептид MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, представляющий собой фрагмент человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы (TKS), регулируемой фактором роста гепатоцитов (пример 2). Аминокислотная последовательность LeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp локализована в альфа-спиральном участке белка TKS (№ 3D структуры в базе данных PDB: 3F1I). Наличие альфа-спирального участка в способствует эффективной ренатурации гибридного полипептида.
Методом сайт-направленного мутагенеза в рекомбинантнойплазмидной ДНКpF173 удаляли кодон «aag» в положении 373-375, соответствующий аминокислоте лизин сайта протеолиза«Лиз Арг» между С-пептидом и
А-цепью проинсулина (пример 3). Описанным способомполучали рекомбинантнуюплазмидную ДНК pF265 для экспрессии проинсулина в составе гибридного полипептида.
На последнем этапе методом сайт-направленного мутагенеза в рекомбинантнойплазмидной ДНК pF265удаляли кодон «acc», соответствующий треонинуB30 (пример 4). В результате получали рекомбинантнуюплазмидную ДНК pF882, кодирующую гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина (проинсулина деглудек) и характеризующаяся следующими признаками:
имеет молекулярную массу 1,4 МДа (4534п.о.);
состоит из следующих структурных элементов (Фиг.6):
BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину; участок инициации репликации (ori);
ROP ген, регулирующий копийностьплазмиды;
XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;
EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген следующего состава:
последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, пептидный линкер GlyHis6GlySerArg, цепь B инсулина с делецией треонина B30, сайт протеолиза «АргАрг», С-пептид, сайт протеолиза «Арг», цепь А инсулина;
HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, а также транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора;
содержит уникальные сайты узнавания рестрикционнымиэндонуклеазами, имеющими следующие координаты: EcoRI - 115,BamHI – 176, SpeI – 438, HindIII – 444, BglII – 1872, NdeI – 2476, AatII– 4468.
Преимуществами предложенной плазмидной ДНК конструкции являются высокая доля полипептидной части инсулинадеглудек в гибридном полипептиде (49,5%), наличие в составе лидерного пептида последовательности, образующей пространственную структуру типа «альфа-спирали» для улучшения эффективности ренатурации гибридного полипептида, модификация сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью, исключающая образование близкородственной примеси Арг0-А-(В30-дезтреонин-инсулин) при ферментативном гидролизе гибридного полипептида.
Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида с В30-дезтреонин-инсулина (проинсулином деглудек)электрокомпетентные клетки штамма реципиента Escherichiacoli BL21 трансформировали рекомбинантной плазмидной ДНК pF882 методом электропорации согласно описанной методике (21) и высевали на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина.
Полученный штамм-продуцент Escherichiacoli BL21/pF882 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки: Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1x3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного полипептида.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые; край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.
Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°С, при оптимальном рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.
Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование промежуточной генетической конструкции pF019.
ПЦР-продукт размером 2.8 кб, полученный в результате амплификации плазмиды pBR322 с праймерами Pr033 (5’ – ccaacgtaacagatct(BglII) aacagctcgaactcgag(XhoI) ttgaagacgaaagggcctcg – 3’) и Pr039 (5’– ccaaccgtaacagatct(BglII) ctgtggaacacctacatctg- 3’), вырезали из геля, очищали с использованием набора Qiagen. После инкубации с эндонуклеазой рестрикции BglIIв течение 3-х часов при 37оС очищенный ДНК-фрагмент лигировали с помощью T4 ДНК лигазы и использовали для трансформации XL1-Blue штамма E.coli(AgilentTechnology, 200249) методом электропорации(10). Корректность плазмидной ДНК, выделенной из колоний, выросших на среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) подтверждали секвенированием. Описанным выше способом получали плазмиду pF019, представляющую собой фрагмент плазмиды pBR322 с полной делецией гена устойчивости к тетрациклину.
Пример 2. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pF173.
Для введения в состав проинсулина короткого лидерного пептида синтезировалипраймеры pr096 (tcaacgtaacgaattctatgctgtattatgaaggcctgcaggacggcagcagccaccaccatcatcatcatggatcccg) и pr130 (tgcctggcggcagtagcgcg). Праймер pr096 имеет в своем составе сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции EcoRI; область, кодирующую аминокислотную последовательность лидерного пептида; последовательность, соответствующую пептидному линкеру His6GlySerArg конструкции pF100.
В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:
- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,
- 0,1 нгплазмидной ДНК pF100,
- 1 мкл смеси 10 мМdNTP,
- 0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),
- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,
- 2 ед. TaqДНК полимеразы.
ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 ThermalCycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96оС (5 мин), 30 циклов – 96оС (15 сек), 55оС
(15 сек), 72оС (30 сек).
Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру 600 п.о., вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA RecoveryKit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBE(Трис-борат-ЭДТА)c использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400.
Вырезанный из геля ПЦР-продукт и плазмиду pF100 инкубировались с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и HindIII в течение 3-х часов при 37оС. Соответствующие ДНК-фрагменты (330 п.о. и 4,2 кб) выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорации XL1-Blue штамма E.coliвыделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью методов ПЦР и секвенирования.
Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pF265 с помощью сайт-направленного мутагенеза плазмиды pF173.
Для модификации сайта протеолиза«Лиз Арг» между С-пептидом и
А-цепью проинсулина синтезировалиолигонуклеотидыPr237 (cgtggtatcgttgaacagtg) и Pr238 (ctgcagagaaccttccagag), содержащие фосфатную группу с 5’- конца (Фиг. 4).
В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:
- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,
- 0,1 нгплазмидной ДНК pF173,
- 1 мкл смеси 10 мМdNTP,
- 0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),
- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,
- 2 ед. TaqДНК полимеразы.
ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 ThermalCycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96оС (5 мин), 30 циклов – 96оС (15 сек), 55оС (15 сек), 72оС (3 мин).
Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру плазмиде pF173 (4,5 кБ), вырезали из геля и очищался с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA RecoveryKit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBEc использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400.
Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pF265 концы выделенного из геля ПЦР-продукта лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Лигирующую смесь (10 мкл) использовали для трансформации штамма BL21 методом электропорации(10).После трансформации отбирали колонии, выращенные на среде с ампициллином, из них выделяли плазмиды и анализировали с помощью секвенирования последовательности гибридного полипептида. В результате получали рекомбинантнуюплазмиднуюДНК pF265, экспрессирующую проинсулин в составе гибридного полипептида.
Пример 4. Получение конечной генетической конструкции рекомбинантной плазмидной ДНК pF882.
Для делециикодона «acc», соответсвующеготреонинуB30,синтезировалиолигонуклеотиды:
Tyr Thr Pro Lys ArgArg
c tacaccccgaagcgtcgt
1) Pr1266, 3' - g atgtggggcttcgcagcattccttccgaggagattgttg - 5';
Glu Ala Glu Asp Leu Gln
2) Pr1267, 5'- ttccatcgaggagaaccaaaggtgaagctgaagacctgcag- 3',
жирным шрифтом отмечены сайты узнавания для эндонуклеазы рестрикции BseRI;
3) Pr23 (ccacctgacgtctaagaaacc);
4) Pr166 (cataccgcgaaaggttttgcg);
5) Pr130 (tgcctggcggcagtagcgcg).
В состав реакционной смеси 1 (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:
- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,
- 0,1 нгплазмидной ДНК pF265,
- 1 мклсмеси 10 мМdNTP,
- 0,5 мкл каждого праймераPr1266 и Pr23 (10 мкМ),
- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,
- 2 ед. TaqДНК полимеразы.
В состав реакционной смеси 2 (100 мкл) входили следующие компоненты:
- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,
- 0,1 нгплазмидной ДНК pF265,
- 1 мкл смеси 10 мМdNTP,
- 0,5 мкл каждого праймераPr1267 и Pr166 (10 мкМ),
- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,
- 2 ед. TaqДНК полимеразы.
ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 ThermalCycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96оС (5 мин), 30 циклов – 96оС (15 сек), 55оС
(15 сек), 72оС (30 сек).
Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBEc использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400. ПЦР-продукты реакционных смесей 1 и 2, соответствующиеразмерам 378 и 416 п.о., вырезались из геля и очищались с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA RecoveryKit.
После инкубации с эндонуклеазой рестрикции BseRIв течение 3-х часов при 37оС очищенные ДНК-фрагменты лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Лигирующую смесь (1 мкл) использовали как матрицу для ПЦР с праймерами Pr23 и Pr130 (0,5 мкл каждого праймераc концентрацией10 мкМ). В состав реакционной смеси 3 (100 мкл) также входили: 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы, 1 мкл смеси 10 мМdNTP, 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы, 2 ед. TaqДНК полимеразы.
ПЦР-продукт реакционной смеси 3, соответствующий размеру 756 п.о., вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA RecoveryKit.Вырезанный из геля ПЦР-продукт и плазмиду pF265 инкубировали с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и HindIII в течение 3-х часов при 37оС. Соответствующие ДНК-фрагменты (326 п.о. и 4,2 кб) выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорацииС2523 (NEB) штамма E.coliвыделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью методов ПЦР и секвенирования.
В результате получали рекомбинантнуюплазмидную ДНК pF882, экспрессирующую гибридный полипептид, имеющий в своем составе:
цепь B с делецией треонина B30,
сайт протеолиза «АргАрг» между цепью B и С-пептидом,
сайт протеолиза «Арг» между С-пептидом и цепью А.
Пример 5. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного полипептида.
Индивидуальную колонию клеток штамма E. coli BL21, содержащуюрекомбинантную плазмидную ДНК pF882,инокулировали2 мл LB среды, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, растили в термошейкере при 37ºС в течение 22 часов при перемешивании (170 об./мин). После измерения оптической плотности OD600 ночной культуры засевали 40 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина (ODстартовая600 = 0,1) и растили 1-2 часа при 37°С на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) до достижения оптической плотности OD600 = (0,8 ± 0,2). 20 мл культуры переносили в другую колбу (контроль без индукции), к оставшимся 20 мл добавляли 10 мкл 1М ИПТГ (изопропил-бета-галактопиранозид) (конечная концентрация ИПТГ – 0,5 мМ). После 4 часов инкубирования на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) клеточные культуры центрифугировали (15 мин, 3000 rpm), определяли массу влажного осадка клеток, замораживали.Содержание гибридного полипептида в % от массы влажного осадка измеряли методом капиллярного электрофореза.Уровень экспрессии составил не ниже 4% от сырого веса клеточной биомассы.
Источникиинформации:
|
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
|
|
|
|
|
LeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|