Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 в тканях глаза кролика Oryctolagus cuniculus, и набор для его определения

Изобретение относится к области медицины, а именно, иммунологии и молекулярной биологии, и касается способа определения уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 в тканях глаза кролика (Oryctolagus cuniculus), с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени и может быть использовано в экспериментальной офтальмологии для определения характера воспалительной реакции, а также на этапе доклинических исследований, в частности, при тестировании противовоспалительных препаратов.

CCL-2 (С-С motif ligand 2) или МСР-1 (Monocyte Chemoattractant Protein 1) - моноцитарный хемотаттрактантный протеин-1 относится к СС-хемокинам, является индуцибельным белком, оказывает мощное хемотаксическое и активирующее действие на моноциты/макрофаги, рекрутируя их в очаг воспаления. Помимо моноцитов и макрофагов, к продукции CCL-2 способны многие типы клеток, в том числе и оболочек глаза: периваскулярные макрофаги хориоидеи, ретинальный погментный эпителий, глиальные элементы сетчатки. Синтез МСР-1 индуцируют липополисахариды, интерлейкин -1β (IL-1β), фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерферон-γ (IFNγ) [Satish L. Deshmane, Sergey Kremlev, Shohreh Amini, Bassel E. Sawayal. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. // J. of interferon & cytokine research. - 2009. - Vol. 29. - №6. - P. 3313-326.]. Гиперпродукция МСР-1 приводит к поражению клеток провоспалительными цитокинами и свободными радикалами, что способствует апоптозу, некрозу, воспалению. Показано, что выраженность некровоспалительных изменений гистологически прямо коррелирует с уровнем экспрессии МСР-1.

Метод ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) один из самых востребованных методов молекулярной биологии, позволивший не только исследовать геном РНК- содержащих микроорганизмов, изучить их роль в развитии инфекционных болезней, но и определять уровень экспрессии генов экспериментальных животных и человека, что обеспечило возможность молекулярной оценки состояния органов и тканей. [Reverse-transcription PCR (RT-PCR) - Bachman J. - Methods Enzymol. 2013;530:67-74. doi: 10.1016/В978-0-12-420037-1.00002-6]. В настоящее время исследования уровней транскрипции индуцибельных генов, кодирующих цитокины, факторы роста, хемоаттрактантные белки, гормоны применяется в различных областях медицины, ветеринарии и молекулярной биологии и является перспективным направлением ПЦР-диагностики.

ДНК большинства организмов наряду с экзонами - участками, кодирующими аминокислотную последовательность белков, содержит интроны, которые не несут информации о строении белков и удаляются в процессе сплайсинга из зрелой матричной РНК (мРНК) после транскрипции. Использование мРНК как матрицы в реакции ОТ-ПЦР и синтез праймеров к ее участкам, кодирующим определенный белок, лежит в основе метода экспрессии гена и позволяет оценить цитокиновый статус исследуемой ткани.

Постановка ОТ-ПЦР включает несколько основных этапов: выделение молекул мРНК из биоматериала, обработку ДНКазой проб с мРНК, синтез молекул кДНК при помощи обратной транскриптазы, определение уровня экспрессии исследуемого гена методом ПЦР, проверку специфичности ПЦР-продукта с помощью электрофореза и анализ полученных результатов.

Количество кДНК в анализируемой пробе зависит от наличия веществ, ингибирующих обратную транскрипцию, скорости разрушения мРНК и др. Для учета всех факторов и их влияния на ход реакции требуется параллельное измерение уровня экспрессии конститутивных генов или генов домашнего хозяйства (housekeeping gene), обычно используемых для нормализации, из которых наиболее стабильной экспрессией обладают гены гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT), глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), b- актина [Foss D.L., Baarsch Μ. J., Murtaugh M.P. Regulation of hypoxanthine phosphoribosyl transferase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and beta-actin mRNA expression in porcine immune cells and tissues. // Anim Biotechnol. - 1998. - N1. - P. 67-78.], а так же субъединицы А сукцинатдегидрогеназы [Nachar W., Busseuil D., Shi Y., Mihalache-Avram Т., Mecteau M., Rheaume E., Tardif J.C. Optimisation of reference genes for gene-expression analysis in a rabbit model of left ventricular diastolic dysfunction. PLoS One. 2014 Feb 18; 9(2)].

Способ оценки уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 в тканях аорты кроликов описан в работе Optimized RT-PCR method for assaying expression of monocyte chemotactic protein type 1 (MCP -1) in rabbit aorta [Sekalska B, Ciechanowicz A, Dolegowska B, Naruszewicz M. Biochem Genet. 2006 Apr;44(3-4): 133-43. Epub 2006 Jun 20]. Авторы исследования изучают роль CCL-2 в рекрутинге клеток иммунной системы в сосудистую стенку с последующим формированием атеросклеротической бляшки. В этой работе для оценки результатов ПНР используется метод электрофореза в 3% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием - более старый, трудоемкий и менее информативный способ, чем ПЦР в реальном времени. На одну реакцию авторы предлагают тратить 10 мкл кДНК, что является нерациональным в случае работы с малыми объемами биоматериала, получаемого от мелких лабораторных животных.

Известен способ определения уровня экспрессии CCL-2 в культуре клеток роговицы кролика

[Quiescent keratocytes fail to repair MMC induced DNA damage leading to the long-terminhibition of myofibroblast differentiation and wound healing.Jester JV, Nien CJ, Vasiliou V, Brown DJ. Mol Vis. 2012;18:1828-39. Epub 2012 Jul 4.], в котором для постановки ОТ-ПЦР используется коммерческая тест система - QuantiTect Syber Green reagents (Qiagen), упрощающая проведение реакции, но увеличивающая ее стоимость. Авторами представлены нуклеотидные последовательности праймеров исследуемого и нескольких референсных генов, что подразумевает постановку мультиплексной ПЦР, требующей синтеза гибридизационных зондов, меченных флуорохромом и расчета «нормировочного коэффициента». Выяснение уровня экспрессии всех нормировочных генов требует многократной постановки ОТ-ПЦР, большого количества реагентов, а главное больших объемов биоматериала, что не всегда рационально, а иногда и невозможно, особенно, когда проведение исследования планируется в малом объеме биологического материала.

Известен способ оценки уровня экспрессии CCL-2 на модели переднего увеита у крыс [Expression of СС chemokines and their receptors in the eye in autoimmune anterior uveitisassociated with EAE. Adamus G, Manczak M, Machnicki M. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Nov; 42(12):2894-903]. Авторами представлен полный протокол исследования, нуклеотидные последовательности исследуемого и референсного генов, подробно описаны этапы ступенчатой ПЦР, однако метод детекции - электрофорез в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, более трудоемкий и менее точный, чем ПЦР в реальном времени. Использование крыс для моделирования опыта в офтальмологии широко распространено, однако ввиду малого размера глазного яблока, в сравнении, например, с кроликом, едва ли позволяет точно дифференцировать разные ткани и отрезки глаза необходимые для анализа. Известно, что глаза кроликов - одна из лучших моделей для офтальмологических опытов, так как они, помимо достаточно крупных размеров, меньше смачиваются секретом слезной железы, что позволяет лучше визуализировать эффект опыта [Statistics of Scientific Procedures on Living Animals Great - Britain, 2004].

Задачей настоящего изобретения является разработка простого, доступного, легко воспроизводимого и экономичного способа оценки экспрессии гена CCL-2 в малом объеме биологического материала кроликов.

Техническим результатом является получение протокола пробоподготовки, постановки и расчетов результатов ОТ-ПЦР с оптимально подобранным для этого комплектом реагентов, позволяющих с высокой точностью воспроизвести реакцию в условиях ПЦР-лабораторий, для дальнейшего использования в экспериментальной офтальмологии, в доклинических исследованиях медицинских изделий и, в частности, при испытании противовоспалительных лекарственных средств. Технический результат достигается за счет:

1) Подбора оригинальных пар праймеров для CCL-2 и GAPDH, обеспечивающих специфическую амплификацию без образования побочных структур.

2) Определения компонентов реакционной смеси - концентраций пары прямого и обратного праймеров, установки оптимальных температур элонгации, денатурации и отжига (методом градиента) и количества циклов амплификации.

3) Использования одного нормировочного гена GAPDH, как наиболее универсального, стабильно экспрессируемого практически всеми клетками организма.

4) Подбора наиболее доступных и экономичных реагентов, их минимального количества без потери эффективности реакции.

5) Снижения временных затрат для каждого этапа постановки.

При выборе пар праймеров в электронной базе данных NCBI Gen Bank с использованием программного обеспечения: Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator и Standard Nucleotide BLAST отбирались наиболее перспективные последовательности олигонуклеотидов для исследуемых генов. Выбранные последовательности праймеров синтезировались на автоматическом синтезаторе ДНК («Евроген»). В результате были получены 2 пары олигонуклеотидов для измерения экспрессии GAPDH и 2 пары олигонуклеотидов для измерения экспрессии CCL-2.

Заданные параметры конструкции (последовательность и молекулярная масса) праймеров требуют индивидуального подбора количества вспомогательных компонентов реакции, а также определения параметров постановки амплификации на всех этапах реакции (элонгация, отжиг и т.д.).

Для определения оптимальных условий проведения реакции осуществлялся ряд постановок с разной компоновкой реагентов по концентрации и объему, позволившим в итоге опытным путем выбрать наиболее удачный и эффективный вариант. Температура отжига олигонуклеотидных праймеров и продолжительность этапов реакции определялись в режиме выполнения температурного градиента, где ряд пробирок с одинаковым содержимым подвергался одновременной амплификации, но с индивидуальной температурой отжига для каждой пробы, отличающихся между собой на 0,5°С.

Для проведения ОТ-ПЦР использовался термоциклер с оптическим блоком для детекции флуоресценции в режиме реального времени (амплификатор) CFX96 Touch (Bio-Rad). Реакция проводилась в течение 2 часов, одновременно фиксировался флуоресцентный сигнал, полученные данные, обработанные в программе Bio-Rad CFX Manager, в дальнейшем представлялись в таблицах и графиках.

Эффективность реакции амплификации определялась построением калибровочной кривой.

Изобретение осуществляется следующим образом.

С помощью программного обеспечения Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator и Standard Nucleotide BLAST подобраны 2 пары праймеров для измерения экспрессии GAPDH и одна пара олигонуклеотидов для измерения экспрессии CCL-2. Ткани кролика О. cuniculus гомогенизируют в течение 90 секунд при скорости 45000 об./мин., с последующим выделением мРНК из образцов. В пробы с полученной мРНК добавляют 1 мкл ингибитора РНКаз, а затем синтезируют кДНК методом обратной транскрипции.

Для амплификации исследуемого и референсного генов при помощи ПЦР в режиме реального времени используют следующие пары праймеров:

GAPDHF-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3'

GAPDH_R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'

CCL2_1F-5'-ATGAAGGTCTCTGCAACGCT-3'

CCL2_1R-5'-CCCTTGGCCAGTTTGGTCAT-3'

Реакционная смесь для амплификации гена CCL- 2 содержит:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер CCL-2_F (концентрация 1 мкМ; Mw 60,98 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер CCL-2_R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,56 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)

Реакционная смесь для амплификации гена GAPDH содержит:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер GAPDH F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер GAPDH R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)

Протокол реакции амплификации генов CCL-2 и GAPDH, включает:

- первичная денатурация- 3 минуты 95°С

- амплификационный цикл (х45)

- денатурация - 15 секунд 95°С

- отжиг праймеров - 20 секунд 56,2°С

- элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 секунд 72°С

Эффективность реакции ОТ-ПЦР определяется уравнением калибровочной кривой, построенной при амплификации образца с известной концентрацией ДНК пятикратно разведенного в 4 раза. Значение эффективности используется в формуле расчета нормированной экспрессии исследуемого гена.

Пример.

Материал исследования - 16 образцов тканевого комплекса сетчатка -хориоидея кроликов, 12 из которых были получены при моделировании атрофии ретинального пигментного эпителия. Образцы забираются в чистые эппендорфы и замораживаются в камере глубокой заморозки при температуре -70°С.

Для получения мРНК замороженная ткань глаза предварительно доводится до однородного дисперсного состояния на гомогенизаторе (например, Silent Crusher S (Heidolph) в течение 90 секунд при скорости 45000 об./мин. мРНК из образцов ткани выделяется по протоколу (Part 1) коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Затем к образцам добавляется 1 мкл ингибитора РНКаз RNase Inhibitor (Qiagen) и обрабатывается ДНКазой DNase Max Kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя.

Контроль количества полученной мРНК осуществлялся при помощи спектрофотометра длине волны 260 нм; в нашем случае - мультирежимный имиджер марки Cytation 5 imaging reader (Biotek). Набор iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) используется для следующего этапа - синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции. Для этого в эппендорф вносятся и смешиваются: 9 мкл воды свободной от нуклеаз (Nuclease-free water); 4 мкл 5х iScript Reaction Mix; 1 мкл iScript Reverse Transcriptase; 5 мкл мРНК; 1 мкл RNase Inhibitor (Qiagen).

Общий объем смеси (20 мкл) обрабатывается по протоколу производителя набора iScript cDNA Synthesis Kit на амплификаторе, в нашем случае используется CFX96 Touch (Bio-Rad).

Амплификация кДНК гена CCL-2 проводится так же с помощью термоциклера. Флуоресценция регистрируется за счет добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя SYBR Green I (Евроген).

Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл содержит:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер CCL-2F (концентрация 1 мкМ; Mw 60,98 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер CCL-2_R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,56 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)

Для амплификации используются праймеры CCL-2

F - 5'-ATGAAGGTCTCTGCAACGCT-3'

R - 5'-CCCTTGGCCAGTTTGGTCAT-3'

Амплификация кДНК гена GAPDH проводится в объеме 15 мкл, реакционная смесь содержит:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер GAPDH_1F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер GAPDH1R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)

Для амплификации используются олигонуклеотиды GAPDH

F-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3'

R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'

Протокол реакции:

- первичная денатурация- 3 минуты 95°С

- амплификационный цикл (х45)

- денатурация - 15 секунд 95°С

- отжиг праймеров - 20 секунд 56,2°С

- элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 секунд 72°С

Дополнительный контроль амплификации осуществляют методом электрофореза в 2% агарозном геле, куда вносят 10 мкл ампликонов смешанных с 6-кратным буфером для загрузки.

Анализ результатов ОТ-ПЦР.

Для каждой из тест-проб при помощи программы Bio-Rad CFX Manager определяется пороговый цикл (Q), при котором количество кДНК во всех реакционных пробирках достигало одинаковой пороговой величины (задавалась программным обеспечением). Воспроизводимость реакции амплификации исследуемого и референсного гена оценивалась постановкой каждой пробы в тройном повторе, где разница между пороговыми циклами составляет не более 0,5 цикла.

Для определения реакционной эффективности праймеров репрезентативный образец пятикратно последовательно разводился в 4 раза, с последующим измерением количества кДНК при каждом разведении на спектрофотометре (например, Cytation 5 imaging reader (Biotek) (фиг. 1 Концентрация кДНК (нг/мкл) в репрезентативной пробе пятикратно последовательно разведенной в 4 раза) при длине волны 260 нм. Эффективность амплификации образцов, отраженная в калибровочной кривой, рассчитывалась в программе Bio-Rad CFX Manager согласно формулам:

Е%=(Е-1)×100%, где Ε - эффективность, m - наклон стандартной кривой.

Уравнение калибровочной кривой представляет логарифмическую зависимость значения показателя порогового цикла (Q) пяти образцов разведения репрезентативной пробы от количества кДНК в каждом образце. На фиг. 2 приведены график калибровочной кривой, который показывает зависимость значений C_t; полученных при амплификации пяти стандартных образцов, и значений lg (Х₀) этих образцов (А) и график изменения интенсивности свечения репрезентативной пробы при амплификации гена CCL-2 для 5 образцов с последовательно уменьшающейся в 4 раза концентрацией кДНК (Б).

Анализ результатов исследования выполнен методом расчета относительной величины (АС) исследуемого образца (CCL-2) по формуле:

Где:

Е - эффективность набора праймеров и зондов. Q (контроля) - среднее значение C_t для нормировочного гена (GAPDH) Q (образца) - среднее значение Q исследуемого образца (CCL-2) Нормированная экспрессия (ААС) - относительная величина экспрессии исследуемого гена нормированная к величине экспрессии референсного гена в образце биоматериала, вычислялась по формуле:

Полученное в ходе расчетов значение ААС использовано для оценки экспрессии гена CCL-2.

Таким образом, предложенный способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 кролика Oryctolagus cuniculus методом ПЦР в режиме реального времени и набор для определения позволяют при помощи доступных и экономичных реагентов, используя один референсный ген, сделать вывод о характере экспрессируемого профиля CCL-2 в исследуемой ткани.