Результат интеллектуальной деятельности: Способ превентивной генной терапии для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к методам генной терапии и касается способов профилактики ишемического инсульта головного мозга с помощью прямой и клеточно-опосредованной генной терапии средством для сдерживания гибели нейронов, содержащего генетический материал, и которые могут быть использованы в медицинских учреждениях для повышения жизнеспособности нейронов головного мозга при угрозе наступления ишемического инсульта и, как следствие, к сдерживанию гибели нейронов в случае наступления инсульта.

Инсульт головного мозга является одной из основных причин смертности и инвалидности, как в России, так и за рубежом. Ежегодно 125 человек из 100 тысяч населения умирает по причине инсульта головного мозга [Скворцова В.И. Анализ медико-организационных мероприятий по профилактике инсультов и реабилитации постинсультных состояний на современном этапе / В.И. Скворцова, Г.С. Алексеева, Н.Ю. Трифонова // Социальные аспекты здоровья населения. - 2013. - № 1. - С.2]. Пациенты, выжившие после инсульта, подвержены риску инвалидности и имеют высокую частоту рецидива. К факторам риска ишемического инсульта мозга, относятся: перенесенные транзиторные ишемические атаки, артериальная гипертензия, мерцательная аритмия, нарушения липидного обмена с высоким уровнем холестерина, сахарный диабет. Несомненно, превентивная терапия, направленная на предупреждение ишемического инсульта у пациентов из группы риска позволит предотвратить сосудистую катастрофу головного мозга, или улучшить исход заболевания.

Используемые в практической медицине лекарственные препараты направлены на восстановление мозгового кровообращения после наступления ишемического инсульта и не эффективны в отношении сдерживания гибели нервных клеток в зоне «ишемической полутени», что приводит обширному увеличению объема инфаркта мозга. В связи с этим возникает необходимость в разработке новых способов, как для повышения жизнеспособности нейронов головного мозга при угрозе наступления ишемического инсульта, так и сдерживания гибели нейронов в области «ишемической полутени» в 3-6 часовой период «терапевтического окна» в случае наступления инсульта.

В последнее время активно проводятся испытания новых методов лечения ишемического инсульта с применением генных и клеточных технологий для преодоления последствий инсульта мозга. Среди активно разрабатываемых в этом направлении стратегий наиболее перспективной представляется генная терапия. Она основана на доставке в очаг ишемии рекомбинантной ДНК, кодирующей терапевтические молекулы с нейропротекторным действием. В качестве таких терапевтических молекул, доказавших свою эффективность в экспериментах, наиболее перспективными представляются нейротрофические факторы, такие как: мозговой нейротрофический фактор (англ. Brain derived neurotrophic factor, BDNF), фактор роста нервов (англ. Nerve growth factor, NGF), глиальный нейротрофический фактор (англ. Glial derived neurotrophic factor, GDNF), инсулиноподобный фактор роста (англ. Insulin-like growth factor, IGF), основной фактор роста фибробластов (англ. Fibroblast growth factor 2, FGF2) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (англ.Vascular endothelial growth factor, VEGF) [Rhim T. Et al. Targeted delivery of growth factors in ischemic stroke animal models. 2016. Vol. 13, №5, p. 709-723].

На сегодняшний день ведутся активные исследования различных способов доставки рекомбинантной ДНК, кодирующей молекулы стимуляторы нейрорегенерации в головной мозг, например, с помощью вирусных векторов. Положительный эффект генной терапии при ишемическом инсульте установлен в многочисленных экспериментах на лабораторных животных. Для доставки терапевтических генов в мозг преимущественно применяются инъекции вирусных векторов, несущих целевые гены, в желудочки мозга или в зону инфаркта. Генетические вектора на основе Сендай вируса, содержащие гены GDNF или NGF, вводят через 30 мин после моделирования инсульта [Shirakura М. et al. Postischemic administration of Sendai virus vector carrying neurotrophic factor genes prevents delayed neuronal death in gerbils. // Gene Ther. 2004. Vol. 11, №9, p. 784-790]. Ген GDNF в составе аденоассоциированного вирусного вектора вводят через 2-е суток после моделирования инсульта [Mätluk K. et al. AAV-mediated targeting of gene expression to the peri-infarct region in rat cortical stroke model. // J. Neurosci Methods. 2014. Vol. 236, p. 107-113].

В других исследованиях вирусные вектора, несущие терапевтические
гены, доставляют до моделирования инсульта. Известен способ локальной
доставки в мозг гена GDNF или гена CNTF за 7 дней до инсульта с помощью аденовирусного вектора [Hermann DM. et al. Adenovirus-mediated GDNF and CNTF pretreatment protects against striatal injury following transient middle cerebral artery occlusion in mice. // Neurobiol. Dis. 2001. Vol. 8, №4, p. 655-666] или гена BDNF с помощью аденоассоциированного вирусного вектора за 2 недели [Zhang, J. et al. rAAV-mediated delivery of brain-derived neurotrophic factor promotes neurite outgrowth and protects neurodegeneration in focal ischemic model. // Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2011. Vol. 4, №5, p. 496-504], гена GDNF за 4 недели [Arvidsson A. et al. Elevated GDNF levels following viral vector-mediated gene transfer can increase neuronal death after stroke in rats. // Neurobiol Dis. 2003. Vol. 14, №3, p. 542-556] или генов NGF и BDNF за 4-5 недель до моделирования инсульта [Andsberg G. et al. Neuropathological and behavioral consequences of adeno-associated viral vector-mediated continuous intrastriatal neurotrophin delivery in a focal ischemia model in rats. // Neurobiol Dis. 2002. Vol. 9, №2, p. 187-204].

Большинство работ по поиску способов преодоления негативных последствий ишемического инсульта выполнено в эксперименте с целью терапии инсульта после его возникновения. При этом недостаточно представлены способы, направленные на повышение жизнеспособности нейронов при угрозе наступления ишемического инсульта, и как следствие, оказывающие нейропротекторное действие в области «ишемической полутени» в период 3-6 часового «терапевтического окна».

Способы превентивной генной терапии для предупреждения гибели нейронов средством для сдерживания гибели нейронов в области «ишемической полутени» в 3-6 часовой период «терапевтического окна» в случае наступления ишемического инсульта головного мозга в настоящее время не известны.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ генной терапии ишемического инсульта средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга, заключающийся в том, что терапевтическую эффективную дозу средства сдерживания гибели нейронов, представляющего собой генетический материал, состоящий из гена сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, гена глиального нейротрофического фактора GDNF и гена нейрональной молекулы адгезии NCAM (англ. Neural cell adhesion molecule 1, NCAM1), непосредственно вводят путем интратекальной инъекции через 4 часа после наступления ишемического инсульта головного мозга [патент РФ № 2676701, МПК А61К31/7088, опубл. 10.01.2019, БИ №1].

Целью заявленного изобретения является способ превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов, которое вводят при угрозе ишемического инсульта головного мозга для повышения жизнеспособности нейронов и, таким образом, сдерживания их гибели в период 3-6 часового «терапевтического окна» в области «ишемической полутени» в случае наступления инсульта.

Поставленная цель достигается способом превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга для предупреждения гибели нейронов средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга, представляющего собой генетический материал, состоящий из гена сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, гена глиального нейротрофического фактора GDNF и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии NCAM, в котором при высоком риске ишемического инсульта терапевтическую эффективную дозу средства для сдерживания гибели нейронов непосредственно вводят путем интратекальной инъекции до наступления инсульта в составе аденовирусных векторов или на клеточных носителях. Терапевтическую эффективную дозу средства сдерживания гибели нейронов вводят в составе аденовирусных векторов Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM в соотношении Ad5-VEGF - 1/3, Ad5-GDNF - 1/3, Ad5-NCAM - 1/3, соответственно, или на клеточных носителях (мононуклеарных клетках крови пуповины человека - МККП) МККП+Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM в соотношении Ad5-VEGF - 1/3, Ad5-GDNF - 1/3, Ad5-NCAM - 1/3, соответственно.

Сущность предполагаемого изобретения иллюстрируется примерами превентивной прямой генной терапии и превентивной клеточно-опосредованной генной терапии при угрозе ишемического инсульта с помощью средства сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте, состоящего из гена сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, гена глиального нейротрофического фактора GDNF и гена нейрональной молекулы адгезии NCAM.

Пример 1. Превентивная прямая генная терапия при угрозе ишемического инсульта.

Первый этап. Получение средства для сдерживания гибели нейронов, состоящего из комбинации трех аденовирусных векторов, несущих рекомбинантные гены VEGF165, GDNF и NCAM1 [препарат: Аd5-VEGF + Аd5-GDNF + Аd5-NCAM].

Рекомбинантные репликативно-дефектные вирусные векторы созданы на основе аденовируса человека 5 серотипа (Аd5) в Национальном исследовательском центре эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Москва), как было описано ранее [Islamov R.R. et al. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuro-protective factor and a neur // Curr. GeneTher. 2015. Vol. 15, №3, p. 266-276]. В данном исследовании были использованы три аденовирусных вектора в комбинации Аd5-VEGF + Аd5-GDNF + Аd5-NCAM в равном соотношении каждого вектора Аd5-VEGF (1/3), Аd5-GDNF (1/3), Аd5-NCАМ (1/3).

Второй этап. Способ превентивной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга для предотвращения гибели нейронов в очаге ишемии у крыс после дистальной окклюзии средней мозговой артерии. Животным в глубоком наркозе производили ламинэктомию на уровне L4-L5 и интратекально вводили 2х10⁷ вирусных частиц Аd5-VEGF + Аd5-GDNF + Аd5-NCAM в 20 мкл физиологического раствора (0,9% NаСl). Контрольным животным интратекально вводили 20 мкл физиологического раствора.

Третий этап. Моделирование ишемического инсульта. Через 4 суток после превентивной прямой генной терапии у крыс моделировали инсульт головного мозга. Ишемический инсульт головного мозга вызывали методом дистальной окклюзии средней мозговой артерии, как было описано ранее [Sokolov М. et al. Triple-Gene Therapy for Stroke: A Proof-of-Concept in Vivo Study in Rats // Frontiers in Pharmacology. 2018. Vol. 9, p. 111].

Четвертый этап. Оценка эффективности превентивной прямой генной терапии при наступлении ишемического инсульта головного мозга.

Морфометрический анализ объемов инфаркта головного мозга на 21-е сутки после моделирования инсульта показал, что у крыс после превентивной прямой генной терапии объём инфаркта составил [0.18 (0.16; 0.20)] мм³ и был достоверно меньше по сравнению с контрольными животными [0.6 (0.57; 0.76)] мм³ (р<0.05). Иммунофлуоресцентный анализ головного мозга в периинфарктной области обнаружил, что количество клеток, вступивших в апоптоз (Сaspase3-позитивных клеток), было значительно меньше у крыс после превентивной прямой генной терапии [12.0 (9.0; 13.0)], при сравнении с животными из контрольной группой [25.0 (22.0; 27.0)] (р<0.05). При этом уровень экспрессии белка клеточного стресса (Нsр70) в клетках мозга у крыс на фоне прямой превентивной генной терапии [20.42 (18.51; 22.95)] был значительно ниже, чем у крыс из контрольной группы [27.38 (24.94; 28.65)] (р<0.05).

Таким образом, пример 1 свидетельствует, что преимущество заявленного способа предупреждения негативных последствий ишемического инсульта от известных в мире на дату подачи заявки заключается в способе превентивной прямой генной терапии методом интратекального введения комбинации репликативно-дефектных аденовирусных векторов, несущих терапевтические гены, пациентам с высоким риском (при угрозе) ишемического инсульта головного мозга. Такой способ обеспечивает продукцию в клетках головного мозга терапевтических рекомбинантных молекул, которые при наступлении инсульта, смогут оказать нейропротекторное действие и предупредить гибель нервных клеток в очаге инсульта в 3-6 часовой период «терапевтического окна».

Пример 2. Превентивная клеточно-опосредованная генная терапия ишемического инсульта.

Первый этап. Получение генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП), одновременно сверхэкспрессирующих рекомбинантные гены VEGF165, GDNF и NCAM1 [препарат: МККП + Аd5-VEGF + Аd5-GDNF + Аd5-NCAM].

Заготовку крови пуповины производили по инструкции Банка стволовых клеток КГМУ. Выделение мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП) проводили в градиенте плотности фиколла по стандартной методике [Islamov R.R. et al. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuro-protective factor and a neur // Curr. GeneTher. 2015. Vol. 15, №3, p. 266-276.]. Сразу после выделения МККП высевали на 6 см культуральный планшет из расчета 2 млн. клеток/лунка и одновременно трансдуцировали тремя аденовирусными векторами (см. Первый этап в Примере 1) в комбинации Аd5-VEGF + Аd5-GDNF + Аd5-NСАМ в равном соотношении каждого вектора Аd5-VEGF (1/3), Аd5-GDNF (1/3), Аd5-NСАМ (1/3), где МOI (multiplicity of infection - множественность инфицирования) был равен 10. Через 12 часов культивирования генетически модифицированные МККП собирали и концентрировали в стерильном физиологическом растворе из расчета 2х10⁶ клеток в 20 мкл. Полученные генетически модифицированные МККП являются лекарственным препаратом (МККП + Аd5-VEGF + Аd5-GDNF + Аd5-NСАМ), содержащим генетический материал для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга.

Второй этап. Способ превентивной клеточно-опосредованной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга для предотвращения гибели нейронов в очаге ишемии у крыс после дистальной окклюзии средней мозговой артерии.

Животным в глубоком наркозе производили ламинэктомию на уровне L4-L5 и интратекально вводили 2х10⁶ генетически модифицированные МККП (МККП + Аd5-VEGF + Аd5-GDNF + Аd5-NСАМ) в 20 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl). Контрольным животным интратекально вводили 20 мкл физиологического раствора.

Третий этап. Моделирование ишемического инсульта. Через 3 суток после превентивной клеточно-опосредованной генной терапии у крыс моделировали инсульт головного мозга (см. Третий этап в Примере 1).

Четвертый этап. Оценка эффективности превентивной клеточно-опосредованной генной терапии при наступлении ишемического инсульта головного мозга.

Морфометрический анализ объемов инфаркта головного мозга на 21-е сутки после моделирования инсульта показал, что у крыс после превентивной клеточно-опосредованная генной терапии объём инфаркта составил [0.07 (0.01; 0.25)] мм³ и был достоверно меньше по сравнению с контрольными животными [0.6 (0.57; 0.76)] мм³ (р<0.05). Количество вступивших в апоптоз клеток (Саsраsе3-позитивных клеток) было значительно меньше у крыс после клеточно-опосредованной генной терапии [9 (7.5; 9.00)], при сравнении с контрольными животными [25.0 (22.0; 27.0)] (р<0.05). При этом уровень экспрессии белка клеточного стресса (Нsр70) в клетках мозга у крыс на фоне клеточно-опосредованной генной терапии [18.17 (17.46; 18.96)] был значительно ниже, чем у крыс из контрольной группы [27.38 (24.94; 28.65)] (р<0.05).

Таким образом, Пример 2 свидетельствует, что преимущество заявленного способа предупреждения последствий ишемического инсульта от известных в мире на дату подачи заявки заключается в способе превентивной клеточно-опосредованной генной терапии методом интратекального введения генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, несущих комбинацию терапевтических генов, пациентам с высоким риском (при угрозе) ишемического инсульта головного мозга. Такой способ обеспечивает миграцию в головной мозг генетически модифицированных МККП и продукцию ими терапевтических молекул, которые при наступлении инсульта смогут оказать нейропротекторное действие и предупредить гибель нервных клеток в очаге инсульта в 3-6 часовой период «терапевтического окна».

Заявляемые способы превентивной прямой генной терапии и превентивной клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга могут быть использованы в лечебных целях по конкретному назначению, например — путем интратекального введения пациенту с высоким риском возникновения ишемического инсульта головного мозга. Оба способа, а именно, превентивная прямая генная терапия и превентивная клеточно-опосредованная генная терапия ишемического инсульта средством сдерживания гибели нейронов являются эффективными в одинаковой мере, а использование того, или иного способа определяется индивидуально для пациента в зависимости от доступности клеточного материала, иммунного статуса пациента и политики лечебного учреждения.

Приведенные примеры использования заявляемого изобретения показывают его полезность в неврологии для лечения пациентов с ишемическим инсультом. Заявляемое изобретение способствует внедрению в практическую медицину лекарственного препарата с лечебным свойством сдерживания гибели нервных клеток у пациентов с высоким риском (при угрозе) ишемического инсульта головного мозга при наступлении ишемического инсульта головного мозга.