Результат интеллектуальной деятельности: 2-Бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония для фотометрического определения флавоноидов в лекарственных препаратах

Изобретение относится к соединениям диазония, которые могут быть использованы в качестве реагента для фотометрического определения фенольных соединений, а именно к новому 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазонию формулы

Это соединение может быть использовано в качестве реагента для фотометрического определения флавоноидов, а именно рутина и кверцетина.

Содержание полифенольных соединений в сырье и лекарственных препаратах можно определять различными методами физико-химического анализа, среди которых отдельно следует выделить спектрофотометрический метод, характеризующийся высокой точностью, чувствительностью, селективностью, экспрессностью, надежностью и простотой. Известно, что соли диазония (например, диазотированная сульфаниловая кислота, тетрафтороборат 4-нитрофенилдиазония, 4-(2-пиридилазо)резорцин, диазотированный пенополиуретан и др.) способны вступать в реакцию азосочетания с фенольными соединениями с образованием ярко окрашенных азосоединений (азокрасителей), которые можно с легкостью количественно определить спектрофотометрическим методом. Однако, зачастую, большинство солей диазония являются не стабильными при хранении и склонны к разложению в растворах, что сдерживает их применение в фотометрии.

Известен метод синтеза тетрафторобората 4-нитрофенилдиазония и его применение в качестве реагента для спектрофотометрического определения флавоноидов. В щелочной среде реагент вступает в реакцию с кверцетином, нарингенином, хризином, морином, рутином и нарингином (Кудринская В.А., Дмитренко С.Г., Золотов Ю.А. Спектрофотометрическое определение флавоноидов по реакции азосочетания с тетрафтороборатом 4-нитрофенилдиазония // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. 2010. Т. 51. №4. С. 296-301). Недостатком данного способа является непродолжительная устойчивость образующегося азосоединения в водном растворе.

Наиболее близким к заявленному является синтез солей арилдиазония, содержащих анион 1,1,2,3,3-пентацианопропенида с использованием хлоридов арилдиазония и 1,1,2,3,3-пентацианопропенида пиридиния, путем обменной реакции в водном растворе (A.V. Kachanov, O.Y. Slabko, V.A. Kaminskii / A method for the synthesis of stable aryldiazonium salts possessing a 1,1,2,3,3-pentacyanopropenide anion // Tetrahedron Letters. Volume 53, Issue 43, 24 October 2012, Pages 5807-5808).

Недостатком данных солей диазония является их нестабильность при хранении и склонность к разложению в растворах, и как следствие невозможность применения в фотометрии.

Использование 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония в качестве реагента для фотометрического определения флавоноидов ранее не описано.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением - разработка способа получения 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенида фенилдиазония, который может быть использован в для фотометрического определения флавоноидов, совершенствование фотометрического определения фенольных соединений, характеризующегося высокой точностью, чувствительностью, селективностью, экспрессностью, надежностью и простотой.

Технический результат заключается в повышении стабильности соединения фенилдиазония, как в индивидуальном состоянии, так и в водных и водно-спиртовых растворах, используемого в фотометрическом анализе.

Технический результат достигается тем, что, в качестве устойчивого реагента для фотометрического определения фенольных соединений, согласно изобретению, применяют 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония.

Изобретение осуществляется следующим образом:

Для получения 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония 1 г 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенида растворяют в небольшом количестве воды, затем полученный раствор добавляют в раствор хлорида фенилдиазония, предварительно охлажденный до 0°С; далее полученный осадок отфильтровывают на воронке Шотта и промывают последовательно сначала водой, а затем этиловым спиртом.

2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония представляет собой кристаллическое вещество зеленовато-коричневого цвета, хорошо растворимое в органических растворителях; устойчив как в сухом виде, так и в растворе. Полученный реактив хранят в эксикаторе в темном месте. Исходные вещества для синтеза 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония синтезировали из 3-бензоилциклопропан-1,1,2,2-тетракарбонитрила, а хлорид фенилдиазония - из анилина. Выход 0,94 г (76%), т.пл. 60°С. Строение 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония подтверждено методом ЯМР ¹Н-спектроскопии. Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 6.75 д (2Н, С₆Н₅, J 8.0 Гц), 7.15 т (1Н, С₆Н₅, J 8.2 Гц), 7.63 т (2Н, С₆Н₅, J 7.8 Гц), 7.78 т (1Н, С₆Н₅, J 7.4 Гц), 7.93 д (2Н, С₆Н₅, J 8.1 Гц).

В табл. 1 приведены данные по устойчивости 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония в различных средах.

Для спектрофотометрического определения фенольных соединений готовят насыщенный водно-спиртовый раствор реагента 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония и стандартный раствор рутина с концентрацией 0,5 мг/мл. Реакцию азосочетания между 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония и флавоноидами проводят в слабощелочной среде в присутствии гидроксида натрия.

В качестве объектов исследования для определения флавоноидов были выбраны лекарственный препарат «Аскорутин» производства ОАО «МАРБИОФАРМ», содержащий равное количество аскорбиновой кислоты и флавоноида рутина в качестве основных веществ и капсулы «Natural Factors С Extra с кверцетином», содержащие кверцетин и аскорбиновую кислоту в массовом соотношении 1 к 2, соответственно, производства «Natural Factors» (Канада). Для количественного определения рутина в препарате растирают в ступке до порошкообразного состояния 10 таблеток «Аскорутина»; затем навеску, соответствующую массе одной таблетки (100 мг) растворяют в этиловом спирте в мерной колбе вместимостью 50 см³. Объем аликвотной части, отобранной для получения фотометрируемой формы, составляет 1,00 см³. Аналогично готовят образцы кверцетина из капсул «Natural Factors С Extra с кверцетином».

Реакция рутина с 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония (ЦПФД) протекает по схеме:

где

Предварительно нами были подобраны оптимальные условия фотометрического определения флавоноидов по реакции азосочетания с 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония. Для этого были получены спектры поглощения водно-спиртового раствора 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония и продукта его азосочетания с рутином в слабощелочной среде. Экспериментально установлено, что максимум поглощения реагента 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония наблюдается при 390 нм, а для продукта азосочетания - при 430 нм.

Результаты исследований поясняются рисунками.

Рис. 1. График зависимости оптической плотности продукта азосочетания рутина с 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония от содержания рутина.

Рис. 2. Градуировочный график для фотометрического определения рутина с 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Авторами было изучено изменение оптической плотности азокрасителя от содержания рутина при длине волны 430 нм и получена линейная зависимость, которая представлена на рис. 1.

На основе полученных данных был рассчитан условный молярный коэффициент светопоглощения, который равен 3,3⋅10³ [л/(моль⋅см)]. Предел обнаружения фенольных соединений в пересчете на рутин составляет 3⋅10^-6 моль/л.

Известно, что практически во всех растительных объектах полифенолы присутствуют совместно с аскорбиновой кислотой. Для исключения возможного влияния аскорбиновой кислоты на реакцию азосочетания с 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония были изучены спектры поглощения реагента в присутствии аскорбиновой кислоты. Как показывают экспериментальные данные, внесение аскорбиновой кислоты в водно-спиртовый раствор 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония не влияет на вид спектра поглощения реагента. Однако на практике было замечено, что при добавлении аскорбиновой кислоты в раствор азокрасителя 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония с рутином происходит усиление окраски растворов. Поэтому при получении исследуемых фотометрируемых форм азокрасителя в каждую колбу добавляют раствор аскорбиновой кислоты концентрацией 1 мг/мл в таком объеме, чтобы и в холостой, и в контрольной пробе аскорбиновая кислота была в одинаковом количестве.

Градуировочный график для определения рутина в присутствии аскорбиновой кислоты представлен на рис. 2.

Полученный график используют для количественного определения рутина в таблетках «Аскорутин». Результаты представлены в табл. 2. Статистическую обработку результатов проводили для трех измерений при доверительной вероятности 0.95. Результаты представляли в виде Х±ΔХ, где X - среднее значение содержания полифенолов в пробе, ΔХ - доверительный интервал.

Здесь Sr - относительное отклонение, С_ст - концентрация стандартного раствора, А_х+ст - оптическая плотность раствора после внесения добавки.

Как показали экспериментальные исследования при спектрофотометрии с использованием в качестве реагента 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония, содержание рутина в препарате «Аскорутин» в одной таблетке составляет (46,32±2,40) мг, а содержание кверцетина в препарате «Natural Factors С Extra с кверцетином» - (48,55±1,43) мг; достоверность определения была подтверждена также методом «добавок». Следовательно, 2-бензоил-1,1,3,3-тетрацианопропенид фенилдиазония можно использовать в качестве устойчивого реагента для фотометрического определения фенольных соединений в различных лекарственных объектах по реакции азосочетания.