Результат интеллектуальной деятельности: Способ моделирования панкреатита путем нанесения механической травмы с последующей аппликацией дефекта аутологичной лейкоцитарной массой

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной медицине, ветеринарии и описывает методику моделирования острого деструктивного панкреатита (ОДП).

Острый панкреатит - полиэтиологическое заболевание поджелудочной железы воспалительно-деструктивной природы, ведущими звеньями которого являются процессы ферментативного аутолиза, некроза и эндогенного инфицирования с вовлечением в процесс тканей забрюшинного пространства, брюшной полости и систем экстраперитониальной локализации. [1]

Несмотря на достижения в диагностике и лечении ОДП, по данным литературы, заболеваемость из года в год растет и по-прежнему является актуальной проблемой ургентной хирургии. Распространенность острого панкреатита составляет до 389 человек на 1 млн. населения, смертность от этого заболевания колеблется от 6 до 12 человек на 1 млн. населения [2]. Высокая распространенность заболевания и смертность свидетельствует о необходимости детального изучения механизмов развития заболевания, атак же поиска новых методов патогенетического лечения.

С целью оптимизации временных и финансовых затрат требуется быстрый, простой, дешевый и эффективный метод моделирования острого панкреатита.

Согласно современным знаниям о этиопатогенезе острого панкреатита, методы моделирования рационально разделить на неинвазивные и инвазивные [3].

Из неинвазивных широко известны алкоголь индуцированные модели [4, 5]. Известна методика, предложенная коллективом авторов под руководством O.J. Ramo et all. [5]. Животным опытной группы, на протяжении 12 недель в питьевую воду добавляли 15% этиловый спирт, по истечению срока моделирования получали повышение активности липазы и амилазы крови. В гистологических образцах описывается воспалительная инфильтрация, кровоизлияние и некроз паренхиматозных клеток. Значимыми недостатками описанного и других, алкоголь индуцированных методов, являются длительный период моделирования, плохая воспроизводимость, невозможность регулировать площадь панкреонекроза, а так же влияние алкоголя на другие органы и системы.

Известна модель ОП, инициированная диетой с добавлением в корм лабораторным мышам этионина [6]. Он основан на нарушении процессов обмена веществ в панкреас, путем ингибирования включения в состав ферментных молекул аминокислот метионина и глицина. Низкие дозы этионина приводят к изменению функции железы по гипосекреторному типу, а более высокие вызывают острый геморрагический панкреатит с системными проявлениями, такими как паротит, жировая дистрофия печени, которые затрудняют изучение системных проявлений связанных с ОДП. Так же, данная методика приводит к высокой смертности животных за счет тяжелого нарушения метаболизма. Патогенетический механизм развития ОДП разнится с таковым в клинической практике, что не позволяет использовать описанную модель для апробации новых лекарственных средств.

Известны иммунологические методы моделирования, основанные на феномене Артюса, результатом которых является повреждение микроциркуляторного русла поджелудочной железы иммунными комплексами [7]. Эти методы не получили широкого применения из-за своей сложности воспроизведения, дороговизны и недостаточной экстраполяции экспериментального процесса на реальную клиническую практику, в которой токсико-аллергический этиопатогенез является большой редкостью.

Наиболее часто используются инвазивные методы, подразумевающие интраоперационное моделирование.

Существует масса химиоиндуцированных методик создания острого панкреатита. Например, Вискунов В.Г. с соавторами [12] макроскопически исследовали морфологические изменения, происходившие на протяжении 90 минут после введения одной группе крыс раствора трипсина, другой группе животных - яда гадюки в билиопанкреатический проток. У выживших на следующий день животных, процент которых составил в первой группе 28,6%, во второй группе 19,1%, производили гистологическое исследование аутопсийного материала. Данная модель имеет низкую выживаемость животных, невозможность регулировать площадь повреждения, чрезмерно выраженное токсическое действие на другие органы и системы, что позволяет ее использовать для изучения механизмов развития полиорганной недостаточности при ОДП, но не дает возможности более детального изучения патогенеза ОП и апробировать новые методы терапии.

Существуют методики с перевязкой билиопанкреатического протока и дальнейшим введением других агрессивных агентов. Например, ретроградное введения желчи, перманганата калия [13], хенодеоксихолевой кислоты (патент РФ №2553940С2), поверхностно-активного соединения тритона-Х100 (патент РФ №2286608), скипидара, кислот, солей, масла и др. Недостатками данных методов является их быстропрогрессирующий панкреонекроз с исходом в фиброз. Введение в общий желчный проток токсических веществ, требует регулировки объема и скорости их подачи для создания внутрипротоковой гипертензии, что приводит к трудной воспроизводимости данных моделей и невозможности управлять тяжестью заболевания и площадью некроза. Кроме того, создаваемая данными способами модель ОДП неадекватна с точки зрения современного представления о патогенезе панкреатита. Теория "общего канала", выдвинутая Е.L. Opie в 1901 г., является устаревшей, поскольку не нашла своего подтверждения в практике.

Широко известны механические способы моделирования, например криомоделирование. Они основаны на образовании кристаллов льда из воды, что ведет к увеличению внутриклеточной жидкости на 10% и механическому разрыву мембраны панкреатоцита [10]. Например, Андреева С.Д. [8], моделирует криодеструкцию железы на поросятах, аппликационным методом, аэрозолем «КриоФарма» с экспозицией в 20 секунд, проводимое на поросятах. Высокая летальность, несоответствие этиопатогенеза ОДП с таковым в клинической практике, основные недостатки метода.

Другой моделью ОП является апробированное на кроликах механическое сдавливание дистальной части железы зажимом на протяжении 3 см, в трех разных местах с дальнейшим введением 1 мл бактериальной взвеси, содержащей E.Coli и протеи. После моделирования животным рассекали париетальную брюшину и формировали карман в забрюшинной клетчатке, куда помещали травмированную железу, с целью экстраполяции анатомического положения панкреас с кролика на человека [11]. Стоит отметить большой объем оперативных вмешательств, неоправданную травму и инфицирование брюшины и забрюшинного пространства, высокий уровень смертности животных. Данная методика будет предпочтительной при изучении гнойно-некротической формы панкреатита и его системных осложнений, однако не подходит для изучения асептического ОДП. Кроме того, удобнее проводить эксперимент на крысах, так как они имеют схожую с человеком пищеварительную систему и схожий тип питания, не требуют больших затрат на приобретение, содержание.

Технической задачей нашего изобретения является создание простой, быстрой, легко воспроизводимой модели, морфологически и патогенетически адекватной изменениям, происходящим при ОДП в клинике.

Моделирование острого деструктивного панкреатита производилось на 17 половозрелых крысах, самках линии Вистар, массой 215±20 грамм, содержащихся в стандартных условиях вивария. При проведении оперативных вмешательств соблюдаются правила асептики и антисептики, а так же правила, предусмотренные Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов. Для анестезии используется раствор рометара и 2% раствор лидокаина (согласно инструкции). После обработки операционного поля проводится верхнесрединная лапаротомия по белой линии живота. В рану выводится желудок, панкреас и петля двенадцатиперстной кишки. По поверхности паренхимы железы, иглой от инсулинового шприца, на глубину среза иглы, наносятся две параллельные надсечки длинной по 1 см. На поврежденные ткани наносится аппликационным методом от 0,1 до 0,2 мл аутологичной лейкоцитарной массы. Объем выбирается империческим методом. Основное условие - смачивание зоны повреждения в железе. Лейкоциты из лейкомассы продуцируют цитокины, обладающие провоспалительным действием, усиливающие механизмы воспаления (9). После моделирования органы погружаются в брюшную полость, которая наглухо ушивается узловыми шелковыми швами. Рана обрабатывается 0,02% раствором фурациллина. Животные находятся в условиях свободного доступа к воде и пище. Экспозиция моделирования составляет 7 дней. По завершении моделирования забираются ткани поджелудочной железы для морфологического исследования.

Положительными сторонами предложенного метода является:

1) С патогенетической точки зрения методика отражает последствия воздействий различных повреждающих этиологических и триггерных факторов на железу, имеющих место в клинике и, приводящих к развитию воспаления, расстройству микроциркуляции, экссудации, нарушению оттока протеолитических соков, аутолизу железы и, в конечном счете, к деструкции клеток [9].

2) Усиление интенсивности воспаления путем аппликации поджелудочной железы лейкоцитарной массой, содержащей цитокины, оказывающие провоспалительное действие. Метод может быть использован для испытания лекарственных препаратов при панкреатите.

2) Техническая простота способа, дающая возможность в максимально короткие сроки проводить моделирование.

3) Не требует использования дорогостоящего оборудования, реагентов и большого опыта экспериментатора в проведении оперативных вмешательств.

4) Метод дает морфологически верифицированную картина ОДП у всех животных опытной группы (которая составляет 17 экспериментальных крыс), что говорит о его высокой эффективности и воспроизводимости.

6) Низкие показатели летальности животных, позволяют проводить лечебно-диагностические вмешательства на протяжении семи и более суток.

Примеры конкретного выполнения:

Пример 1.

Половозрелой самке крысы линии «Вистар» №1, массой 207 грамм, под анестезией рометаром и лидокаином, произвели верхнюю срединную лапаротомию, с применением правил асептики и антисептики. В операционную рану вывели часть желудка и двенадцатиперстную кишку с поджелудочной железой, после чего на глубину среза иглы от инсулинового шприца произвели 2 параллельные надсечки длиной по 1 см. После моделирования органы погрузили обратно в брюшную полость и послойно ушили переднюю брюшную стенку узловыми шелковыми швами. По истечению срока эксперимента, через 7 суток, крыс повторно наркотизировали, производили забор тканей для морфологического исследования. В описанном патоморфологическом образце №1, спустя 7 суток от начала моделирования, определяется морфологическая картина острого воспаления. Так при окраске тканей гематоксилин-эозином отмечается умеренно выраженное полнокровие сосудов интерстиция, с очаговым разволокнением стенок сосудов, умеренно выраженным отеком и умеренной воспалительной инфильтрацией эозинофилами, макрофагами, лимфоцитами. Имеются очаговые дистрофические изменения клеток ацинусов.

В образце №2, полученного от крысы №2, массой 245 г, которой под анестезией рометаром и лидокаином (согласно инструкции) произвели верхнюю срединную лапаротомию, с применением правил асептики и антисептики. В операционную рану вывели часть желудка и двенадцатиперстную кишку с поджелудочной железой, после чего на глубину среза иглы от инсулинового шприца произвели 2 параллельные надсечки длиной по 1 см. На поврежденные ткани нанесли аппликационным методом 0,2 мл аутологичной лейкоцитарной массы. После моделирования органы погрузили обратно в брюшную полость и послойно ушили переднюю брюшную стенку узловыми шелковыми швами. По истечению срока эксперимента, через 7 суток, крыс повторно наркотизировали, производили забор тканей для морфологического исследования. В описанном патоморфологическом образце №2, спустя 7 суток от начала моделирования, определяется морфологическая картина более выраженного воспаления. Это проявляется выраженным полнокровием капилляров и вену л, выраженным отеком, умеренно выраженной инфильтрацией эозинофилами, нейтрофильными лейкоцитами, макрофагами лимфоцитами, очаговым лейкопедезом и гибелью экзокриноцитов.

Пример 2.

Половозрелой самке крысы линии «Вистар» №3, массой 189 грамм, под анестезией, произвели верхнюю срединную лапаротомию, с применением правил асептики и антисептики. Крысе №4, массой 207 г под анестезией рометаром и лидокаином (согласно инструкции) в операционную рану вывели часть желудка и двенадцатиперстную кишку с поджелудочной железой, после чего на глубину среза иглы от инсулинового шприца произвели 2 параллельные надсечки длиной по 1 см. Крысе №4 на дефект железы нанесли аппликационным методом 0,15 мл лейкоцитарной массы. После моделирования органы погрузили обратно в брюшную полость и послойно ушили переднюю брюшную стенку узловыми шелковыми швами. По истечению срока эксперимента, через 7 суток, крыс повторно наркотизировали, производили забор тканей для морфологического исследования. В описанном патоморфологическом образце №3, спустя 7 суток от начала моделирования, определяется морфологическая картина острого воспаления. Отмечается умеренно выраженное полнокровие капилляров и венул, очаговый отек, очаговая умеренно выраженная периваскулярная воспалительная инфильтрация макрофагами, эозинофилами, нейтрофилами, лимфоцитами

В патоморфологическом образце №4 на фоне применения лейкоцитарной массы определяется выраженное полнокровие сосудов: капилляров и венул, очаговый отек, выраженная инфильтрация нейтрофилами, эозинофилами, макрофагами, лимфоцитами, очаговый лейкопедез и гибель экзокриноцитов.

Пример 3.

Половозрелым самкам крыс линии «Вистар» №5, №6, массой 173 г и 217 г под анестезией, произвели верхнюю срединную лапаротомию, с применением правил асептики и антисептики. В операционную рану вывели часть желудка и двенадцатиперстную кишку с поджелудочной железой, после чего на глубину среза иглы от инсулинового шприца произвели 2 параллельные надсечки длиной по 1 см. Кроме того, крысе №6 на зону повреждения нанесли аппликационным методом 0,15 мл лейкоцитарной массы. После моделирования органы погрузили обратно в брюшную полость и послойно ушили переднюю брюшную стенку узловыми шелковыми швами. По истечению срока эксперимента, через 7 суток, крыс повторно наркотизировали, производили забор тканей для морфологического исследования. В описанном патоморфологическом образце №5, спустя 7 суток от начала моделирования, определяется морфологическая картина острого воспаления. Отмечается умеренное полнокровие капилляров и венул, очаговый отек, очаговое кровоизлияние, очаговая воспалительная инфильтрация макрофагами, эозинофилами, нейтрофилами, лимфоцитами

В патоморфологическом образце №6 выявляется выраженное полнокровие сосудов: капилляров и венул, очагово-диффузные кровоизлияния, очагово-диффузная и выраженная инфильтрация нейтрофилами, эозинофилами, макрофагами, лимфоцитами, очаговый диапедез и гибель экзокриноцитов.

Анализ полученных данных показывает, что предлагаемая модель позволяет эффективно моделировать панкреатит, при этом применение лейкоцитарной массы приводит к появлению более выраженных морфологических признаков оценки воспаления в поджелудочной железе.

ЛИТЕРАТУРА

1. Воробьева А.С., Наумова О.Н., Стяжкина С.Н. Острый панкреатит- проблема 21 века [Acute pankreatitis - the problem of the 21st century] // LII International Scientific Review of the Problems and Prospects of Modern Science and Education. Paris, France - 18 December, 2018 c. 42.

2. Кубышкин B.A., Затевахин И.И., Багненко С.Ф. и др. Национальные клинические рекомендации по острому панкреатиту. Российское общество хирургов. Официальный сайт «Российское общество хирургов». 2015. 38 с.

3. Агапов М.А., Горский В.А., Петров В.А., Поливода М.Д., Кравченко А.Ю., и др. Способы моделирования острого панкреатита (обзор литературы). / Вестник Российского государственного медицинского университета. 2014. №3. С. 25-29.

4. Andrzewska A., Plugosz J.W., Jurkiwska G., The effekt of antecedent acute ethanol ingestion on the pankreas ultrastructure taurochlate pancreatitis in rats // Experimental and Molecular Pathology. Volume 65, Issue 2, October 1998, P. 64-77.

5. O.J. Rämö, O. Juhani & Schröder, Tom & Mäkelä, Anu & Jalovaara, Pekka. The effect of long-term ethanol ingestion on pancreatic lipolytic enzymes and their behaviour in acute experimental pancreatitis in rats. // Surgical Research Communications. 1987. №2. P. 143-148.

6. Lombardi В., Influence of dietary factors on the pancreatotoxicity of ethionine // Am J Pathol. 1976. V. 84. №3. P 633.

7. Thai A., Studies on II.Acute pancreatic necroses producted experementallyny the arthus sensitization reaction // Surgery. 1955. V. 37(6). P. 911.

8. Андреева С.Д., Моделирование острого панкреатита у свиней и цитохимическая характеристика лейкоцитов // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2013 №2 (18). С. 17.

9. Адо А.Д., Адо М.А., Пыцкий В.И. / Патологическая физиология. Триада - X. 2000. - 573 с.

10. С.И. Иващук, О.Я. Стойко, Р.Р. Коваль, О.В. Бесединская Способ моделирования дискретных форм острого панкреатита с использованием локального криоинфлюенса // Клiнiчна анатомiя та оперативна хiрургiя 2017 Т. 16. №1. С. 103.

11. А.Л Ушкевич, К.Н. Жандаров, Н.И. Прокопчик Моделирование острого деструктивного панкреатита, парапанкреатита в эксперименте // Новости хирургии. 2010. Т. №2 18. С. 8-14.

12. Вискунов В.Г., Пупышев А.Б., Проценко С.И., Надеев А.П., Синицына М.А., Фещенко A.M., Чубенидзе З.Ю. Моделирование острого панкреатита у крыс введением трипсина и змеиного яда. // Бюллетень СО РАМН. 2008. №6 (134). С. 18-21.

13. Шалимов С.А., Радзиховской А.П. и Кейсевич Л.В. / Руководство по экспериментальной хирургии. М.: Медицина. 1989. с. 190-199.