Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ВЫСОКОГО ОНКОГЕННОГО РИСКА

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано в дифференциальной диагностике цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН) иммунологическими методами. Изобретение позволяет повысить точность диагностики ЦИН I, II, III степени, ассоциированных с вирусом папилломы человека (ВИЧ) высокого онкогенного риска, тем самым усовершенствовать подходы к лечению пациенток с тяжелой дисплазией, сохранить у данной категории репродуктивную функцию.

Цервикальная интраэпителиальная неоплазия (ЦИН), ассоциированная с персистенцией вируса папилломы человека высокого онкогенного риска, относится к патологиям, диагностика которых представляет серьезные трудности. В первую очередь, это связано с тем, что ЦИН возникает в зоне трансформации, эндоцервикальных криптах, а также может существовать за пределами видимой части зоны трансформации, в частности, в цервикальном канале, причем, характер и степень поражения зон могут существенно различаться. Кроме того, начальные формы неоплазий часто имеют фокальный характер, протекают клинически бессимптомно, маскируются фоновыми заболеваниями. В таких случаях результаты ограниченных и даже многофокусных биопсий, как правило, не приводят к адекватному забору биоматериала и, как следствие, правильной диагностике степени неоплазий. Поскольку в 99% случаев развитие рака шейки матки ассоциировано с ВПЧ высокого онкогенного риска и трансформацией тяжелой дисплазии в инвазивный рак, важным этапом является ранняя диагностика ЦИН и дифференциация ее степени прогрессии. В настоящее время с целью верификации патологического процесса в шейке матки используют различные методы и технологии, как инвазивные, так и неинвазивные.

Основным методом диагностики предраковых состояний шейки матки является гистологическое исследование патологически измененных участков шейки матки. Тем не менее, при всей своей информативности оно не может применяться многократно. Цитологический метод позволяет осуществлять скрининговые исследования. Специфичность метода по данным разных авторов составляет порядка 60-70%, чувствительность - 65-85%, что связано с необходимостью частого выполнения повторных скрининговых тестов. Кольпоскопическое исследование рассматривается как чувствительный метод определения предраковых и раковых заболеваний шейки матки (80-90%), однако специфичность данного метода составляет всего 25-60% [1].

Известен метод диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (патент РФ №2464570, дата публикации 20.10.2012 г.) [2], заключающийся в заборе исследуемого материала из шейки матки путем соскоба с последующим анализом экспрессии мРНК р16 (INK4a) как маркера потенциальной прогрессии диспластических процессов шейки матки с использованием количественной ПЦР, а также анализ концентрации мРНК гена гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT-1). При этом оценивают уровень относительной экспрессии мРНК гена р16 (INK4a) к уровню экспрессии мРНК HPRT-1. Отношение уровня экспрессии мРНК гена р16 (INK4a) к мРНК HPRT-1 свыше 93 отн. ед. соответствует CIN III (рак in situ), а его значение более 201 отн. ед. соответствует плоскоклеточному раку. Данный способ позволяет повысить эффективность диагностики предраковых процессов шейки матки.

Основной причиной, препятствующей достижению указанного ниже технического результата при применении известного способа, является то, что он не позволяет дифференцировать степень развития цервикальных интраэпителиальных неоплазий, т.е. обладает низкой специфичностью к диагностике ЦИН I и НИН II.

Известен способ дифференциальной диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазий III степени и преинвазивного рака шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека (патент РФ 2506892, дата публикации 20.02.2014 г.) [3], в котором определяют содержание CD10×10⁹/л, CD20×10⁹/л, CD25×10⁹/л лимфоцитов периферической крови, функциональный резерв нейтрофилов цервикальной слизи, уровень ИЛ-10 крови и уровни ИНФ-γ крови и ФНО-α цервикальной слизи. На основании полученных данных вычисляют показатель, по значению которого диагностируют карциному in situ или ЦИН III степени.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при применении данного способа относятся обязательное использование двух вариантов биоматериала пациенток (венозная кровь и цервикальная слизь), а также невозможность дифференциального разделения ЦИН I, ЦИН II и ЦИН III.

Известен способ ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий на основе изучения метаболических маркеров (патент РФ №2629632, дата публикации 30.08.2017 г.) [4], в котором после выявления патологии шейки матки определяют уровень экспрессии маркеров-предикторов с помощью вестерн-блот анализа с детекцией хемилюминисценции и ПНР в реальном времени. При значениях уровней экспрессии HIF1alpha 0,029, GLUT1 782,9±156,5, IGFBP-3 0,0380±0,0076, HK2 36,4, VDAC1 70 диагностируют ЦИН I (LSIL); при значениях уровней экспрессии HIF1alpha 0,03, GLUT1 1154,2±88,7, IGFBP-3 0,020±0,005, HK2 44,9, VDAC1 87 диагностируют ЦИН II-III (HSIL). Изобретение обеспечивает эффективную диагностику ЦИН на ранних этапах.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при применении известного способа относятся низкая функциональная связанность определяемых показателей со степенью развития ЦИН, невозможность использования способа в дифференциальной диагностике ЦИН II и ЦИН III.

Известен способ дифференциации цервикальных интраэпителиальных неоплазий с помощью анализа протеомного состава цервиковагинальной жидкости (патент РФ №2674335, дата публикации 07.12.2018 г.) [5], в котором с помощью хромато-масс-спектрометрического метода анализируют панель значимо изменяющихся специфических белков в цервиковагинальной жидкости и при обнаружении белков CAST, GM2A, SPINK5, SBSN, ACTG1, SERPINB1, СЕАСАМ5, CRISP3, SPRR3 делают заключение о наличии дисплазии тяжелой степени - HSIL. При обнаружении белков ACTG1, SERPINB1, СЕАСАМ5, CRISP3, SPRR3, IGHA1, SERPINB13, SPRR1A делают заключение о наличии дисплазии легкой степени - LSIL. При обнаружении белков IGHA1, SERPINB13, SPRR1A, CAST, GM2A, SPINK5, SBSN делают заключение о наличии атипии клеток - ASCUS. При обнаружении белков CTSV, CD5L, CLU, COL1A2, SPRR1A, SPRR1B, CRISP3, CTSC, EVPL, CAPZB, H1F0, IVL, LYPD3, PIGR, SERPINB3, SPINK7, SPRR2D, SPRR3, SBSN, TXN, TAGLN2, WFDC2 делают заключение о наличии рака шейки матки. Использование данного способа позволяет дифференцировать неопластические процессы в эпителии шейки матки у ВПЧ-позитивных женщин по степени тяжести.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при применении данного способа относятся невозможность его использования в дифференциальной диагностике ЦИН II и ЦИН III. Кроме того, анализ предполагает большую панель специфических белков, что является довольно дорогостоящим подходом, к тому же далеко не все клинические учреждения обладают хромато-масс-спектрометрами и работающими на них специалистами.

Известен способ диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазий (патент РФ №2705816, дата публикации 12.11.2019 г.) [6], в котором берут соскоб со слизистой оболочки эндоцервикса, создают и исследуют препарат с помощью световой микроскопии. При обнаружении в препарате в клетках плоского эпителия изменений, характерных для дисплазии, скоплений по 11-50 эпителиальных клеток с признаками железистой дифференцировки и папиллярных структур из пролиферирующих незрелых эпителиальных клеток диагностируют цервикальную интраэпителиальную неоплазию. Изобретение позволяет повысить точность и достоверность диагностики до начала хирургического лечения, а также возможность неинвазивно верифицировать ЦИН в трудно- и недоступных участках шейки матки.

Основной причиной, препятствующей достижению указанного ниже технического результата при применении данного способа, является невозможность дифференциального разделения ЦИН I, ЦИН II и ЦИН III.

Наиболее близким по технической сути к заявляемому нами способу, который был принят в качестве прототипа, является метод многопараметрического проточного цитометрического профилирования, с помощью которого проводили фенотипический анализ Т-клеток с использованием следующей панели поверхностных антител: CD3, CD4, CD8, CD25, CD45RA, CD27, CD127, HLA-DR, PD1, TIM3 и LAG3 [7]. Данное исследование проводили с целью обоснования таргетной терапии против PD-(L) 1 для снятия локально-регионарной иммуносупрессии при РШМ и контроля распространение метастазов в лимфоузлы. Авторами также была идентифицирована популяция CD8+FoxP3CD25+Т-клеток, рекомендованная в качестве терапевтической мишени и прогностического биомаркера при применении лекарственной блокады PD-(L) 1.

Недостатком данного метода является его трудоемкость (слишком большая панель антител), использование в качестве биоматериала первичных опухолей и опухоль-пораженных (метастазированных) лимфоузлов. Кроме того, в исследовании использовался биоматериал пациенток с IB1, IB2, IIA2, IIB, IIIB стадиями рака шейки матки, поэтому о дифференциальном разделения ЦИН I, ЦИН II и ЦИН III речи также не идет.

Мы предлагаем использовать иммунологические показатели в качестве дополнительных критериев для диагностики ЦИН. Важность предлагаемого подхода к диагностике заключается в подтверждении или исключении наличия участков поражения эпителия, соответствующих более выраженной степени заболевания, чем установленной при гистологическом (цитологическом, кольпоскопическом) исследовании.

Техническим результатом заявляемого способа является установление и дифференциация степени развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии, при использовании в качестве биоматериала венозной крови, в качестве метода её анализа - многопараметрической проточной цитометрии. Кроме того, предлагаемый способ диагностики будет способствовать более правильному выбору тактики лечения пациенток с сохранением репродуктивной функции и сокращению сроков пребывания их в стационаре.

Технический результат данного способа достигается тем, что осуществляют забор венозной крови пациенток и проводят иммунологическое исследование лимфоцитов крови методом многопараметрической проточной цитометрии, в котором определяют количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3 + и CD3+CD4+PD1+LAG3+ в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, при количестве клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ и CD3+CD4+PD1+LAG3+ в каждом из вариантов менее 2% от общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов диагностируют цервикальную интраэпителиальную неоплазию I степени (ЦИН I), при количестве клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ и CD3+CD4+PD1+LAG3+ в каждом из вариантов от 2% до 5% в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов диагностируют цервикальную интраэпителиальную неоплазию II степени (ЦИН II), при количестве клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ и CD3+CD4+PD1+LAG3+ в каждом из указанных случаев более 5% диагностируют цервикальную интраэпителиальную неоплазию III степени (ЦИН III).

Для достижения поставленной цели было проведено иммунологическое обследование 96 женщин, которые находились на лечении в ГБУЗ «Республиканский онкологический диспансер» и Женская консультация Родильного дома им. К.А. Гуткина Республики Карелия. Критериями включения пациенток в данное исследование являлись:

1. Клинически и морфологически подтвержденный диагноз -цервикальная интраэпителиальная неоплазия I, II, III степени (ЦИН I, II, III);

2. Верифицированное методом ПНР наличие ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 18, 31, 33 типов) в соскобах из цервикального канала;

3. Возраст пациенток 20-64 года;

4. Отсутствие значимой экстрагенитальной патологии (в частности, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет, обострение хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, мочеполовой системы);

5. Информированное согласие пациенток на участие в исследовании. Критерием исключения из исследования являлось применяемое ранее хирургическое лечение. Все пациентки с ЦИН прошли обязательный объем диагностических исследований. Полученные в результате исследований иммунологические показатели сравнивали с аналогичными показателями здоровых женщин той же возрастной группы.

Предлагаемый способ включает следующие этапы:

1. Забор венозной крови (5 мл) проводится в вакуумные пробирки типа Vacutainer (США), содержащие в качестве антикоагулянта 3,8% цитрат натрия;

2. Освобождение от эритроцитов осуществляется путем смешивания 100 мкл цельной крови со свежеприготовленным аммонийным буфером (8,3 г NH₄Cl, 1 г KHCO₃, 0,037 г EDTA на 1 л ddH₂O, рН 7,3) из расчета 1:25, смесь инкубируется в течение 10 мин при +4°С с периодическим перемешиванием. Полученный образец центрифугируется в течение 7 мин при 1200 об/мин. После удаления супернатанта, осадок ресуспендируется в растворе Версена (2 мл) и снова центрифугируется в течение 4 мин при 1200 об/мин, после чего супернатант тщательно удаляется, в осадке остается фракция лейкоцитов, которая анализируется согласно пп. 3-6. Подобная процедура проделывается с каждым поступившим на анализ биоматериалом;

3. Далее определяется суммарный объем буфера (0,5% БСА-Версен) в зависимости от количества подготовленных для анализа образцов из расчета 100 мкл на образец за вычетом объема антител, в котором ресуспендируются клетки лейкоцитарной фракции и затем переносятся в цитометрические пробирки. При необходимости предварительно проводится подсчет количества клеток с трипановым синим с помощью автоматического счетчика ТС20 (BioRad, США). В среднем, количество лейкоцитов в 1 образце составляет 0,3-0,5 млн клеток/100 мкл буфера;

4. Для предотвращения неспецифического связывания антител через рецепторы Fc-фрагментов, к образцам добавляется 10 мкл блокирующего реагента (FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec), полученная смесь инкубируется в течение 10 мин, после чего к ней сразу добавляются антитела в соответствии с рекомендациями фирм производителей;

5. Используется следующий набор меченых моноклональных антител: CD3-VioBlue (Clone: REA613, Miltenyi Biotec; рабочее разведение 1:70); CD4-FITC (Clone: MT310, Dako Agilent; рабочее разведение 1:20); PD1/CD279-PE (Clone: EH12.2H7, BioLegend; рабочее разведение 1:30); TIM3/CD366-APC (Clone: F38-2E2, BioLegend; рабочее разведение 1:30); LAG3/CD223-APC (Clone: 7H2C65, BioLegend; рабочее разведение 1:30). Для каждого образца крови готовится 2 опытных пробы с 4 видами антител (флуорофоров): 1) CD3, CD4, PD1, TIM3; 2) CD3, CD4, PD1, LAG3. Важно использовать не менее 2 дифференцировочных маркеров для четкого обособления популяции лимфоцитов (в данном случае - CD3 и CD4) и одновременно анализировать в популяции экспрессию 2 маркеров иммунных контрольных точек (соответственно, PD1 и TIM3, либо PD1 и LAG3);

6. После добавления антител содержимое пробирок тщательно перемешивается и инкубируется в течение 30 мин в темноте. Далее не связавшиеся с рецепторами лейкоцитов антитела отмываются 1 мл раствора Версена и после центрифугирования образца (3 мин при 1200 об/мин) полученный осадок ресуспендируется в 0,4 мл буфера ("sample volume"). Измерения проводятся на проточном цитометре MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec, Германия) с использованием ПО MACSQuantify version 2.11. Настройка напряжения на ФЭУ и компенсация перекрывания спектров излучения красителей проводятся с помощью моноокрашенных контролей. Границы между позитивно окрашенными и негативными популяциями клеток с учетом взаимного влияния красителей на уровень автофлуоресценции устанавливаются по серии FMO (Fluorescence Minus One) контролей. В каждом образце анализируется не менее 100 000 клеток ("uptake volume" - 100 мкл) для получения статистически значимых измерений. Оценивается экспрессия PD1, TIM3 и LAG3 маркеров в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, так как именно ко-экспрессия PD1 с другим ингибиторным маркером (LAG3 или TIM3) более точно характеризует дисфункциональные Т-клетки, появляющиеся в крови при развитии ЦИН. Результат выражается в процентах (%), характеризующих наличие в крови клеток, типируемых по маркерам PD1 и TIM3, либо PD1 и LAG3, в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов.

В результате проведенных исследований были зарегистрированы достоверные отличия в иммунологических показателях у больных НИН I, II и III, что дает возможность использовать данные показатели в дифференциальной диагностике цервикальных интраэпителиальных неоплазий. Сопоставление результатов гистологического исследования и уровня экспрессии PD1, TIM3 и LAG3 маркеров в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов показало, что при цервикальной интраэпителиальной неоплазий I степени (ЦИН I) количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ и CD3+CD4+PD1+LAG3+ в каждом из вариантов не превышает 2% от общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, при цервикальной интраэпителиальной неоплазий II степени (ЦИН II) количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ и CD3+CD4+PD1+LAG3+ в каждом из вариантов составляет от 2% до 5% от общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, в то время как при цервикальной интраэпителиальной неоплазий III степени (ЦИН III) количество таких клеток в каждом из указанных случаев более 5%.

Полученные результаты показали, что заявляемый способ обладает высокой специфичностью и позволяет получить достаточно надежные и селективные результаты, что иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Пациентка В. 28 лет, обратилась в ЖК Родильного дома им. К.А. Гуткина РК. На основании клинико-анамнестического, кольпоскопического и гистологического обследований пациентке был поставлен диагноз ЦИН I. При проведении иммунологического исследования получены следующие показатели: количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов составляет 1,1%, количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+LAG3+1,9%. Каждое из полученных значений менее 2%, следовательно, у данной пациентки можно предполагать наличие участков поражения эпителия соответствующих легкой дисплазии (ЦИН I).

Пример 2. Пациентка С. 58 лет, обратилась в ГБУЗ РОД РК. На основании клинико-анамнестического, кольпоскопического и гистологического обследований пациентке был поставлен диагноз ЦИН III. При проведении иммунологического исследования получены следующие показатели: количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов составляет 5,0%, количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+LAG3+4,7%. Каждое из полученных значений более 2%, но не превышает 5%, следовательно, у данной пациентки можно предполагать умеренную дисплазию (ЦИН II). Пациентке была проведена конизация шейки матки. При гистологическом исследовании операционного материала был установлен диагноз ЦИН П.

Пример 3. Пациентка Р. 35 лет, обратилась в ГБУЗ РОД РК. На основании клинико-анамнестического, кольпоскопического и гистологического обследований пациентке был поставлен диагноз ЦИН III на фоне стационарного эндоцервикоза с образованием сосочковых структур и эпидермизации. При проведении иммунологического исследования получены следующие показатели: количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов составляет 9,3%, количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+LAG3+5,1%. Каждое из полученных значений более 5%, следовательно, у данной пациентки можно подтвердить диагноз тяжелой дисплазии (ЦИН III).

Пример 4. Пациентка К. 41 год, обратилась в ЖК Родильного дома им. К.А. Гуткина РК. На основании клинико-анамнестического, цитологического, кольпоскопического обследований пациентке был поставлен диагноз эндоцервикоз с атипическими клетками плоского эпителия неопределенного происхождения. При проведении иммунологического исследования получены следующие показатели: количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+TIM3+ в общей популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов составляет 2,1%, количество клеток с фенотипом CD3+CD4+PD1+LAG3+3,2%. Оба значения соответствуют диапазону от 2 до 5%, следовательно, у данной пациентки можно предположить умеренную дисплазию (ЦИН II). Пациентке было проведено гистологическое исследование, при котором был установлен диагноз ЦИН II.

Приведенные выше экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявляемый способ может быть с высокой степенью надежности использован для выявления и дифференциальной диагностики ЦИН, ассоциированных с ВПЧ высокого онкогенного риска. Данный способ диагностики будет способствовать более правильному выбору тактики лечения пациенток с сохранением репродуктивной функции и сокращению сроков пребывания их в стационаре.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Сухих Г.Т., Прилепская В.Н. Профилактика рака шейки матки: Руководство для врачей. - 3-е изд. - М.: МЕДпресс-информ, 2012. - 192 с.

2. Пат. 2464570 РФ, МПК G01N 33/53 (2006.01). Метод диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий / Боженко В.К., Кудинова Е.А., Близнюков О.П., Мельникова Н. В., Бурменская О.В. - №2010147074/15; Заяв. 19.11.2010; Опубл. 20.10.2012, Бюл. 29. - 9 с: 1 табл., 2 пр.

3. Пат. 2506892 РФ, МПК А61В 5/00 (2006.01), G01N 33/48 (2006.01). Способ дифференциальной диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазий III степени и преинвазивного рака шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека / Орнер И.Ю., Абрамовских О.С, Зотова М.А., Батурина И.Л., Никушкина К.В., Телешева Л.Ф., Жаров А.В. - №2012153252/14; Заяв. 10.12.2012; Опубл. 20.02.2014, Бюл. 5. - 12 с: 4 табл., 3 пр.

4. Пат. 2629632 РФ, МПК G01N 33/50 (2006.01), C12Q 1/68 (2006.01), G01N 33/543 (2006.01). Способ ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН) на основе изучения метаболических маркеров / Хлебкова Ю.С, Вишнякова П.А., Межевитинова Е.А., Высоких М.Ю. - №2016122438; Заяв. 07.06.2016; Опубл. 30.08.2017, Бюл. 25. - 10 с: 5 ил., 1 табл., 3 пр.

5. Пат. 2674335 РФ, МПК G01N 33/48 (2006.01). Способ дифференциации цервикальных интраэпителиальных неоплазий с помощью анализа протеомного состава цервиковагинальной жидкости / Кононихин А.С, Бржозовский А.Г., Зардиашвили М.Д., Стародубцева Н.Л., Бугрова А.Е., Чаговец В.В., Назарова Н.М., Франкевич В.Е. - №2017143832; Заяв. 14.12.2017; Опубл. 07.12.2018, Бюл. 34. - 10 с: 8 ил., 6 пр.

6. Пат. 2705816 РФ, МПК G01N 33/48 (2006.01). Способ диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазий / Захарова Н.М., Ветчинникова О.Н., Цыбин А.А. - №2019101703; Заяв. 22.01.2019; Опубл. 12.11.2019, Бюл. 32. - 7 с.: 3 ил., 2 пр.

7. Heeren A.M., Rotman J., Stam A.G.M., Pocorni N., Gassama A.A., Samuels S., Bleeker M.C.G., Mom C.H., Zijlmans H.J.M.A.A., Kenter G.G., Jordanova E.S., de Gruijl T.D. Efficacy of PD-1 blockade in cervical cancer is related to a CD8+FoxP3+CD25+ T-cell subset with operational effector functions despite high immune checkpoint levels // J. Immunother Cancer, 2019. - Vol. 7 (1). E. 43.