08.08.2020
220.018.3e35

Биспецифические антитела, специфические к pd1 и tim3

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1 (белком 1 запланированной гибели клеток), и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3. Кроме того, представлен полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин и способ получения антитела по изобретению. Кроме того, рассмотрена фармацевтическая композиция, способ ингибирования роста опухолевых клеток и применение антитела для лечения инфекций, для профилактики и лечения рака. Благодаря способности связывать как PD1, который характеризуется широким профилем экспрессии, так и антиген иммунных клеток TIM-3, предложенное антитело может найти применение в лечении большого числа заболеваний, в том числе рака. 9 н. и 20 з.п. ф-лы, 14 ил., 28 табл., 18 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Область, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, включающим первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, прежде всего к биспецифическим антителам, которые связываются с TIM3 с меньшей связывающей аффинностью по сравнению со связывающей аффинностью с PD1. Настоящее изобретение кроме того относится к способам получения таких соединений и к способам их применения.

Предшествующий уровень техники

Важность иммунной системы в защите против рака основана на ее способности распознавать, и разрушать аномальные клетки. Однако, некоторые опухолевые клетки способны уклоняться от иммунной системы, вызывая состояние подавления иммунного ответа (Zitvogel и др., Nature Reviews Immunology, 6, сс. 715-727 (2006)). Один пример механизма подавления иммунного ответа, присутствующего у опухоленесущих хозяев, заключается в ускорении дисфункции и истощения Т клеток. Основное внимание было направлено на Т клетки при попытках использовать для лечения эндогенную противоопухолевую иммунную систему за счет способности Т клеток к селективному распознаванию пептидов, образующихся из белков во всех отделах клетки, их способности к прямому распознаванию и уничтожению антигенэкспрессирующих клеток (эффекторными CD8+ Т клетками, известными также под названием цитотоксичных Т лимфоцитов (CTL)) и их способности вызывать обратный иммунный ответ (с использованием хелперных CD4+ Т клеток), что объединяет адаптивный и врожденный эффекторные механизмы. Истощенные Т клетки не способны к пролиферации и проявлению эффекторных функций, таких как цитотоксичность и секреция цитокинов, в ответ на стимуляцию антигеном. Дальнейшие исследования показали, что истощенные Т клетки характеризуются замедленной экспрессией ингибиторной молекулы PD-1 (белок 1 запланированной гибели клеток), и такая блокада взаимодействий PD-1 и PD-L1 (лиганд PD-1) может обращать истощение Т клеток и восстановить антиген-специфический ответ Т клеток у мыши, инфицированной LCMV (Barber и др., Nature, 439, сс. 682-687 (2006)). Однако направленное воздействие на путь PD-1-PD-L1 в отдельности не всегда приводит к обращению истощения Т клеток (Gehring и др., Gastroenterology, 137, сс. 682-690) (2009)), что указывает на предположительное участие других молекул в истощении Т клеток (Sakuishi J., Experimental. Med., 207, сс. 2187-2194 (2010)).

TIM-3 представляет собой молекулу, изначально идентифицированную как селективно экспрессирующуюся на секретирующих интерферон-γ (ИНФ-γ) клетках Th1 и Tc1 (Monney и др., Nature, 415, сс. 536-541 (2002)). Взаимодействие TIM-3 с его лигандом, галектином-9, запускает гибель Т клеток TIM-3+. Таким образом, оба TIM-3 и PD-1 могут функционировать в качестве отрицательных регуляторов ответных реакций Т клеток. Было установлено, что TIM-3 маркируют наиболее подавленную или бифункциональную популяцию Т клеток CD8+ в доклинических моделях, как солидных опухолей, так и гематологических опухолей (Sakuishi J., Experimental. Med., 207, сс. 2187-2194 (2010), Zhou, Blood, 117, сс. 4501-4510 (2011), Majeti R. и др., PNAS, 106, сс. 3396-3401 (2009)). В данных моделях, все Т CD8+ TIM-3+ Т клетки совместно экспрессируют PD1, и эти клетки с двойной экспрессией характеризуются большим количеством дефектов, как в прогрессировании клеточного цикла, так и в продуцировании эффекторных цитокинов (интерлейкин-2 (IL)-2, TNF, и ИНФ-γ) по сравнению с клетками, экспрессирующими PD1 в отдельности. Таким образом, путь TIM-3 может действовать совместно с путем PD-1 для ускорения развития острого бифункционального фенотипа в Т клетках CD8+ при раке. Таким образом, следует ожидать, что объединенное направленное воздействие на пути TIM-3 и PD1 будет высокоэффективным для контроля роста опухоли.

TIM3 представляет собой белок человека, который принадлежит к подсемейству иммуноглобулинов и семейству белков TIM. В организме человека, как и в организме мыши, TIM-3 экспрессируется на Т клетках, а также на клетках фагоцитов, таких как макрофаги и дендритные клетки. Связывание TIM3 с лигандом белка (например, с галектином-9) может ингибировать ответ Th1 по механизму индукции апоптоза, и тем самым приводить к индукции периферической толерантности. Снижение экспрессии TIM3 человека с использованием малой интерферирующей РНК (миРНК) или ингибирование TIM3 человека с использованием блокирующих антител увеличивает секрецию интерферона-α из CD4 положительных Т клеток, поддерживая ингибиторную роль TIM3 в Т клетках человека. В фагоцитах TIM3 также функционирует в качестве рецептора для распознавания апоптотических клеток. Анализ клинических образцов от пациентов с аутоиммунными заболеваниями показывает отсутствие экспрессии TIM3 в CD4 положительных клетках. Прежде всего, в клонах Т клеток из цереброспинальной жидкости пациентов с рассеянным склерозом уровень экспрессии TIM3 снижается, а уровень секреции ИНФ-γ повышается по сравнению с клонами от здоровых доноров (Koguchi K. и др., J. Exp. Med., 203, сс. 1413-1418 (2006)). Существуют сообщения о связи TIM-3 с аллергическими заболеваниями или астмой (заявки WO 96/27603 и WO 2003/063792).

Примеры моноклональных антител анти-TIM3 включают моноклональные крысиные антитела против TIM3 человека (клон 344823, фирмы R&D Systems) и моноклональные мышиные антитела против TIM-3 человека (клон F38-2E2, фирмы R&D Systems). В заявке WO 2013/06490 описаны антитела анти-TIM3, которые характеризуются быстрой интернализацией, а их иммуноконъюгаты использовали для лечения рака и снижения воспаления. В патенте США 2012/189617 описаны антитела анти-TIM-3, которые проявляют большую эффекторную активность, такую как зависимую от антител клеточную цитотоксичность (активность ADCC) при заболеваниях, связанных с клетками, экспрессирующими TIM3 человека.

Белок программирования гибели клеток 1 (PD-1 или CD279) представляет собой ингибиторный член семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 является рецептором, расположенным на поверхности клеток, и экспрессируется на активированных В клетках, Т клетках и миелоидных клетках (Okazaki и др., Curr. Opin. Immunol., 14, сс. 391779-391782 (2002), Bennett и др., J. Immunol., 170, сс. 711-718 (2003)). В структурном отношении PD-1 является трансмембранным белком мономерного типа 1, содержащим один вариабельно-подобный внеклеточный домен иммуноглобулина и цитоплазматический домен, содержащий иммунорецепторный тирозиновый ингибиторный мотив (ITIM) и иммунорецепторный тирозиновый мотив переключения (ITSM). Активированные Т клетки временно экспрессируют PD1, но гиперэкспрессия PD1 замедлена, и его лиганд PDL1 способствует иммунному истощению, что приводит к персистенции вирусных инфекций, уклонению опухолей от иммунной системы, повышению инфицированности и смертности. Экспрессия PD1 индуцируется при распознавании антигена рецептором Т клеток, а их экспрессия поддерживается главным образом за счет непрерывной передачи сигнала от рецептора Т клеток. После продолжительного воздействия антигена повторное метилирование локуса PD1 не происходит, что приводит к непрерывной гиперэкспрессии. Блокировка пути PD1 может восстановить функциональность истощенных Т клеток при раке и хронических вирусных инфекциях (Sheridan, Nature Biotechnology, 30, сс. 729-730 (2012)). Моноклональные антитела к PD-1 описаны, например, в заявках WO 2003/042402, WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2004/072286, WO 2004/087196, WO 2006/121168, WO 2006/133396, WO 2007/005874, WO 2008/083174, WO 2008/156712, WO 2009/024531, WO 2009/014708, WO 2009/101611, WO 2009/114335, WO 2009/154335, WO 2010/027828, WO 2010/027423, WO 2010/029434, WO 2010/029435, WO 2010/036959, WO 2010/063011, WO 2010/089411, WO 2011/066342, WO 2011/110604, WO 2011/110621, WO 2012/145493, WO 2013/014668, WO 2014/179664 и WO 2015/112900.

Было установлено также, что блокировка обоих PD1 и TIM3 может восстановить антибактериальные иммунные ответные реакции, например, у пациентов с острым алкогольным гепатитом (ААН). Лимфоциты таких пациентов экспрессируют высокие уровни иммунных ингибиторных рецепторов, продуцируют низкие уровни интерферона-γ (ИНФ-γ) и повышают продуцирование IL10 за счет продолжительного воздействия эндотоксина. Эти эффекты могут обращать блокировку PD1 и TIM3, что повышает активность Т клеток и нейтрофилов (Markwick и др., Gastroenterology, 148, сс. 590-602 (2015)).

Биспецифические антитела против TIM3 и PD1 для иммунотерапии при хронических иммунных состояниях уже описаны в заявке WO 2011/159877. Однако, существует необходимость в разработке новых биспецифических антител, которые не только одновременно связываются с PD1 и TIM3 и таким образом селективно целенаправленно воздействуют на Т клетки, экспрессирующие оба PD1 и TIM3, но также и исключают блокировку TIM3 на других клетках, таких как клетки врожденного иммунитета, например, наивные дендритные клетки (DC) и моноциты. Биспецифические антитела по настоящему изобретению не только эффективно блокируют PD1 и TIM3 на Т клетках, которые сверхэкспрессируют PD1 и TIM3, но и являются высокоселективными в отношении этих клеток, что способствует исключению побочных эффектов при введении высоко активных антител TIM3.

Краткое содержание настоящего изобретения

В одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и

указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает:

(a) VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или

(б) VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, или

(в) VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и

(iii) HVR-H3 включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.

В еще одном объекте настоящего изобретения биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, является двухвалентным.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где биспецифическое антитело связывается с TIM3 с низкой аффинностью, а с PD1 связывается с высокой аффинностью. В предпочтительном объекте в настоящем изобретении предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где биспецифическое антитело связывается с TIM3 со связывающей аффинностью, которая по меньшей мере в 50 раз меньше по сравнению со связывающей аффинностью с PD1, более предпочтительно со связывающей аффинностью, которая по крайней мере в 100 раз меньше по сравнению со связывающей аффинностью с PD1. В одном предпочтительном варианте связывающую аффинность (KD) определяют с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса (как описано, например, в примере 12.)

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

(а) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, или

(б) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, или

(в) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, или

(г) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, или

(д) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49,

и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает

(а) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или

(б) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или

(в) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или

(г) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, или

(д) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, или

(е) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или

(ж) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, или

(з) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

В предпочтительном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46,

и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, или VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

Прежде всего в настоящем изобретении предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и

указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и

VL домен, включающий

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

В более предпочтительном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

В предпочтительном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где биспецифическое антитело связывается с TIM3 со связывающей аффинностью, которая по крайней мере в 50 раз меньше по сравнению со связывающей аффинностью с PD1, более предпочтительно со связывающей аффинностью, которая крайней мере в 100 раз меньше по сравнению со связывающей аффинностью с PD1.

В другом объекте настоящего изобретения биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело или химерное антитело. Прежде всего, оно представляет собой гуманизированное или химерное антитело.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где биспецифическое антитело включает Fc домен, первый Fab фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй Fab фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3.

Предпочтительно Fc домен представляет собой Fc домен IgG, более предпочтительно Fc домен представляет собой Fc домен IgG1 или Fc домен IgG4.

В одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где Fc домен включает одну или более аминокислотных замен, что снижает связывание с Fc рецептором, прежде всего с Fcγ рецептором. Предпочтительно Fc домен представляет собой подкласс IgG1 человека с аминокислотными мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация по EU индексу Кабата).

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где Fc домен включает модификацию, ускоряющую ассоциацию первой и второй субъединиц Fc домена.

В одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где первая субъединица Fc домена включает выступы, а вторая субъединица Fc домена включает впадины согласно методу "выступы-во-впадины". В предпочтительном объекте первая субъединица Fc домена включает аминокислотные замены S354C и T366W (EU нумерация), а вторая субъединица Fc домена включает аминокислотные замены Y349C, T366S и Y407V (нумерация по EU индексу Кабата).

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где в одном из Fab фрагментов вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга таким образом, что VH домен является частью легкой цепи, а VL домен представляет собой часть тяжелой цепи. Предпочтительно в биспецифическом антителе в первом Fab фрагменте, включающем антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где в одном из Fab фрагментов в консервативном домене CL аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация по EU индексу Кабата), и в консервативном домене СН1 аминокислоты в положениях 147 и 213 заменены независимо на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация по EU индексу Кабата). В предпочтительном объекте в биспецифическом антителе во втором Fab фрагменте, включающем антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, в консервативном домене CL аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация по EU индексу Кабата), и в консервативном домене СН1 аминокислоты в положениях 147 и 213 заменены независимо на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация по EU индексу Кабата).

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включающее:

(а) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 50, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 52,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 51, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 53, или

(б) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 54, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 56,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 55, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 57, или

(в) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 58, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 60,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 59, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 61, или

(г) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 62, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 64,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 63, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 65, или

(д) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 66, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 68,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 67, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 69.

В предпочтительном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включающее:

(а) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, или

(б) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, или

(в) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, или

(г) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, или

(д) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий биспецифическое антитело, как описано выше. Кроме того, в настоящем изобретении предлагается вектор, прежде всего вектор экспрессии, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению и прокариотическую или эукариотическую клетку, включающую полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению. В некоторых вариантах клетка хозяина представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку млекопитающих.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается способ получения биспецифического антитела, включающего первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано выше в данном контексте, включающий стадии а) трансформации клетки-хозяина векторами, включающими полинуклеотиды, кодирующие указанные биспецифическое антитела, б) культивирования клетки-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии биспецифического антитела и в) выделения биспецифического антитела из культуры. В настоящее изобретение также включено биспецифическое антитело, полученное способом по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается фармацевтическая композиция, включающая биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, и по крайней мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

В настоящем изобретении предлагается также биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, или фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, для применения в качестве лекарственного средства.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, или фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, для применения

i) при модуляции иммунных ответных реакций, таких как восстановление активности Т клеток,

ii) при стимуляции иммунной ответной реакции или функции,

iii) при лечении инфекционных заболеваний,

iv) при лечении рака,

v) при замедлении прогрессирования рака,

vi) при продлении жизни пациенту, страдающему от рака.

В одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, или фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, для применения при лечении заболевания у индивидуума, нуждающегося в таком лечении. В особом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, или фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, для применения при лечении рака. В другом особом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, или фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, для применения при модуляции иммунной ответной реакции. В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, или фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, для применения при лечении хронической вирусной инфекции.

Предлагается также применение биспецифического антитела, включающего первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, прежде всего для получения лекарственного средства для лечения рака, а также способ лечения заболевания индивидуума, который включает введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, включающей биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, в фармацевтически приемлемой форме. В особом объекте заболеванием является рак. В другом особом объекте заболеванием является хроническая вирусная инфекция. В другом объекте предлагается способ модуляции иммунной ответной реакции у индивидуума, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, включающей биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, в фармацевтически приемлемой форме. В любом из приведенных выше объектов индивидуумом предпочтительно является млекопитающее, прежде всего человек.

В настоящем изобретении также предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, или фармацевтическая композиция, включающая биспецифическое антитело, для применения при профилактике или лечении рака, где биспецифическое антитело вводят в комбинации с химиотерапевтическим агентом, лучевой терапией и/или другими агентами, которые используют в иммунотерапии рака.

Кроме того в настоящем изобретении предлагается способ ингибирования роста опухолевых клеток у индивидуума, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества биспецифического антитела, включающего первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, как описано в данном контексте, для ингибирования роста опухолевых клеток. Индивидуумом предпочтительно является млекопитающее, прежде всего человек.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Блокада PD1 химерным PD1-0103 значительно повышает секрецию ИНФ-γ при аллогенной стимуляции первичных Т клеток человека.

Фиг. 2. Блокада PD1 химерным PD1-0103 значительно увеличивает секрецию интерферона-γ (ИНФ-γ) при аллогенной стимуляции первичных Т клеток человека.

Фиг. 3. Блокада PD1 химерным PD1-0103 значительно увеличивает секрецию α-фактора некроза опухоли (TNF) при аллогенной стимуляции первичных Т клеток человека.

Фиг. 4А. Частота попадания в группу Т клеток CD4, продуцирующих гранзим В. Фиг. 4Б. Количество ИНФ-γ, определенного по поглощению (оптическая плотность, O.D.) в супернатанте РСЛ в присутствии увеличивающихся концентраций различных антител анти-PD-1.

Фиг. 5А. Влияние блокады PD1/PD-L1 на повторную активацию подавленной передачи сигнала рецептора Т клеток в присутствии различных антител анти-PD-1.

Фиг. 5Б. Влияние блокады PD1/PD-L1 на повторную активацию подавленной передачи сигнала рецептора Т клеток в присутствии различных антител анти-PD-1.

Фиг. 6. Схематическое изображение анализа FRET для одновременного связывания биспецифических антител анти-PD1/TIM3 с рекомбинантными клетками.

Фиг. 7. Индукция сигнала FRET после обработки/связывания различных биспецифических антител PD1/TIM3 на клетках, экспрессирующих PD1 и TIM3: клетки HEK293, дважды трансфектированные PD1 SNAP TIM3 CLIP, окрашивали 100 нМ раствором SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) и 100 нМ раствором Clip-Red (Cisbio) в течение 1 ч при 37° в буферном растворе Tag-Lite (Cisbio). После промывки меченые клетки инкубировали с указанными биспецифическими антителами анти-PD1/TIM3 (0-10 нМ) (гуманизированные биспецифическое варианты показаны на фиг. 7Б в течение 1 ч при 4°С, измеряли время разрешенную флуоресценцию при 665/620 нм на ридере BMG Pherastar (обозначенную как средняя величина +/- СО сигнала FRET (соотношение 665/620 нм × 10000), n=3). Фиг. 7А. Форматы 1+1 (антитела PD1TIM3_0389 и PD1TIM3_0168) по сравнению с конструктами 2+2 (PD1TIM3_0358 + PD1TIM3_0359). Фиг. 7Б. Гуманизированные биспецифическое варианты (PD1TIM3_0476 и PD1TIM3_477).

Фиг 8. Анализ FRET для одновременного связывания биспецифических антител анти-PD1/TIM3 1+1 PD1TIM3-0168: PD1, меченные SNAP, и клетки TIM3, меченные CLIP (как описано выше), окрашивали 100 нМ раствором SNAP-Lumi4-Tb и 100 нМ раствором Clip-Red. После промывки меченные клетки инкубировали с биспецифическими антителами анти-PD1/TIM3 #0168 (при указанных концентрациях) в течение 1 ч при 4°С, измеряли время разрешенную флуоресценцию при 665/620 нм на ридере BMG Pherastar (линии черного цвета). Чтобы выделить специфичность сигнала FRET, индуцированного биспецифическими антителами, добавляли либо моноклональные антитела анти-PD1 (#0165, фиг. 8А) либо блокирующие антитела анти-TIM3 (#0018, фиг. 8Б) для конкуренции, приводящей к практически полному исключению сигнала FRET (кривые серого цвета). Обработка антителами анти-PD1 в отдельности не приводила к индукции FRET (пунктирные линии, только на левой диаграмме).

Фиг. 9А. Биспецифическое антитело 1+1 PD1TIM3-0389 характеризуется отношением связывания с положительными Т клетками CD4+ (PD1+, TIM3+), аналогичным отношению химерных антител TIM3_0028 (chi0028) и гуманизированных антител TIM3-0438 (0438), но меньшим связыванием с моноцитами, NK клетками и Т клетками CD3+.

Фиг. 9Б. Биспецифическое антитела 1+1 PD1TIM3-0389 характеризуются значительно большим средним флуоресцентным сигналом (MFI) для связывания с CD4+ положительными Т-клетками (PD1+, TIM3+) по сравнению с химерными антителами TIM3_0028 (chi0028) и гуманизированными антителами TIM3-0438 (0438).

Фиг. 9В. Связывание биспецифических антител 1+1 PD1TIM3-0168 с CD4+ положительными Т клетками (PD1+, TIM3+) не отличается от связывания с химерными антителами TIM3_0018 (TIM3-chi0018) и гуманизированными антителами TIM3-0434 (0434).

Фиг. 9Г. Биспецифическое антитела 1+1 PD1TIM3-0168 характеризуются только незначительным повышением MFI для связывания с CD4+ положительными Т клетками (PD1+, TIM3+).

Фиг. 9Д и фиг. 9Е. Антитело анти-TIM3 TIM3-0038 характеризуется связыванием, как с моноцитами, так и с Т клетками CD4+.

Фиг. 9Ж и фиг. 9З. Биспецифическое антитело 1+1 PD1TIM3-0166 (на основе химерных антител PD1-0103//TIM3-0038) характеризуются значительно сниженным связыванием с моноцитами (по сравнению с исходными антителами анти-TIM3 TIM3_0038, см. фиг. 4Д и фиг. 4Е, но сохраняет значительное связывание с Т клетками CD4+.

Фиг. 10А-10Г. Биспецифическое антитела 1+1 PD1TIM3-0166 (на основе химерных антител PD1-0103//TIM3-0038) характеризуются сниженной интернализацией по сравнению с биспецифическими антителами 2+2 PD1TIM3-0321 (также на основе химерных антител PD1-0103//TIM3-0038, но содержащих 2 антигенсвязывающих участка для PD и 2 антигенсвязывающих участка для TIM3) и по сравнению с исходными антителами TIM3-0038 на активированных Т клетках CD4+ и на активированных NK клетках.

Фиг. 11А. Анализ в течение времени показывает, что содержание биспецифических антител и антител PD1 повышается в мембране по сравнению с внеклеточной кластеризацией антител TIM3.

Обозначения антител на фиг. 11А: TIM3 (chi18-А647 означает химерные антитела TIM3_0018, меченные AlexaA647), a-TIM3 (chi28-А647 означает химерные антитела TIM3_0028, меченные AlexaA647), биспец. (0168-А647 означает антитела 1+1 PD1TIM3_0168 (на основе химерных антител PD1-0103/TIM3-0018) меченных AlexaA647) биспец. (0389-А647 означает антитела 1+1 PD1TIM3_0389 (на основе химерных антител PD1-0103/TIM3-0028) меченных Alexa 647) и a-PD1 (0165-А488 означает химерные антитела PD1-0103, меченные Alexa488).

Антитело анти-PD1 и биспецифическое антитела 1+1 PD1TIM3_0389 (Биспец. 0389) характеризуются очень низкой интернализацией даже через 3 ч, в то время как интернализация других биспецифических антител 1+1 PD1TIM3_0168 (Биспец. 0168) более высокая. Более высокой интернализацией характеризуется антитело aTIM3 Ab 0028, при этом наибольшая интернализация наблюдается для антитела aTIM3-0018.

Фиг. 11Б. Химерное антитело PD1-0103 (aPD1-0165) характеризуется очень низкой интернализацией, в то время как высокоаффинное химерное антитело TIM3_0018 (aTIM3-chi18) характеризуется значительной интернализацией при связывании с TIM3 даже через 15 мин. Интернализация для химерных антител TIM3_0028 (aTIM3-chi28) с низкой аффинностью связывания незначительно снижается. Биспецифическое антитела 1+1 АВ 0168 (состоящие из антител aPD1-0165 с высокоаффинным линкером и высокоаффинного TIM3-0018) характеризуются значительно сниженной интернализацией. Биспецифическое антитела 1+1 АВ 0389 (состоящие из химерных антител PD1-0103 (aPD1-0165) с высокоаффинным линкером и высокоаффинным TIM3_0028 (aTIM3-0028) характеризуются значительно сниженной интернализацией. Это может быть связано с двухвалентным связыванием с PD1 и TIM3, при этом высокая аффинность связывания с PD1 удерживает антитело у поверхности клетки.

Фиг. 12А. Эффективность биспецифических антител PD1-TIM3 1+1 PD1TIM3_0168 (на основе химерных антител PD1-0103/TIM3-0018 (означает АВ 0168) по сравнению с химерными антителами PD1-0103 (=PD1-0165) и химерными антителами TIM3_0018 (=TIM3-chi18) и их комбинациями.

Фиг. 12Б. Эффективность биспецифических антител PD1-TIM3 1+1 PD1TIM3_0389 (на основе химерных антител PD1-0103 / TIM3-0028 (= Bispec АВ 0389) по сравнению с химерными антителами PD1-0103 (=PD1-0165) и химерными антителами TIM3_0028 (=TIM3-chi28) и их комбинациями.

Фиг. 12В. Эффективность биспецифических антител PD1-TIM3 1+1 PD1-0103/Ky8213 (на основе химерных антител PD1-0103 / и антител анти-TIM3 Ky8213, описанных в патенте США 20120189617 (см. антитело 8213, например, пример 33), которые получали аналогично тому, как описано в примере 1, в виде 1+1 CrossMab) по сравнению с химерными антителами PD1-0103 (=PD1-0165) и антителами анти-TIM3-Ky8213 (как описано в патенте США 20120189617 (см. антитело 8213) например, пример 33) и их комбинациями.

Фиг. 12Г. Эффективность биспецифических антител PD1-TIM3 1+1 PD1TIM3_0389 (на основе химерных антител PD1-0103/TIM3-0028 (=Bispec АВ 0389 (1+1))) по сравнению с биспецифическими антителами PD1-TIM3 2+2 PD1TIM3_0358 на основе химерных антител PD1-0103/TIM3-0028 (=Bispec АВ 0358 (2+2)), а также химерными антителами PD1-0103 (=PD1-0165) и химерными антителами TIM3_0028 (=TIM3-chi28) и их комбинациями.

Фиг. 13. Обработка биспецифическими антителами PD1-TIM3 1+1 PD1TIM3_0476 значительно повышает способность Т клеток CD4 высвобождать ИНФ-γ по сравнению с обработкой антителами PD1 или TIM3 в отдельности и даже по сравнению с обработкой исходными антителами PD1_0376 и антителами TIM3_0438. Т клетки CD4 совместно культивировали с линией опухолевых клеток, экспрессирующей MHCII. Биспецифическое антитела PD1-TIM3 1+1 PD1TIM3_0476 исследовали по сравнению с антителами PD1 aPD1_0376, MDX-1106 (ниволумаб) и MK-3475 (пембролизумаб), антителами TIM3 aTIM3_0438 и Kyowa-8213 (как описано в заявке WO 2011/155697) и по сравнению с комбинацией антител анти-PD1 aPD1-0376 и анти-TIM3 aTIM3_0438.

Фиг. 14А и фиг. 14Б. Результаты исследования эффективности биспецифических антител PD1-TIM3 1+1 (0476) по сравнению с антителами PD1 или TIM3 в отдельности с использованием самок мышей с подавленным иммунитетом (NOG), сенсибилизированных клетками MKN45 и снабженных РВМС от здорового донора (человека) показаны на фиг. 14А и фиг. 14Б. Графики представляют собой измерение среднего размера опухоли (в группе лечения) включая стандартную ошибку среднего размера опухоли в течение 30 сут. Кривые, обозначенные закрашенными кружками, соответствуют возрастанию размера опухоли без лечения (носитель). На фиг. 14А показан рост опухоли при лечении меньшей дозой (1,5 мг/кг антител PD1_0376, 1,5 мг/кг ниволумаба, 1,5 мг/кг антител TIM3_0438 или 3 мг/кг биспецифических антител 1+1 PD1TIM3_0476), на фиг. 14Б показан рост опухоли при более высоких дозах (5 мг/кг антител PD1_0376, 5 мг/кг ниволумаба, 5 мг/кг антител TIM3_0438 или 10 мг/кг биспецифических антител 1+1 PD1TIM3_0476).

Подробное описание настоящего изобретения

Определения

Если не указано иное, технические и научные термины, использованные в данном контексте, имеют те же значения, что и обще используемые термины в данной области техники. Данные термины использованы для понимания данного описания и эти термины, использованные в единственном числе, означают также и множественное число, и наоборот.

Термин "антигенсвязывающая молекула", использованный в данном контексте, в самом широком смысле означает молекулу, которая специфично связывается с антигенной детерминантой. Примеры антигенсвязывающих молекул включают антитела, фрагменты антител и связывающиеся с каркасными областями антигена белки.

Термин "антитело", использованный в данном контексте в самом широком смысле, означает различные структуры антител, включая, но, не ограничиваясь только ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, моноспецифические и полиспецифические антитела (например, биспецифическое антитела), а также фрагменты антител при условии, что они проявляют требуемую антигенсвязывающую активность.

Термин "моноклональное антитело", использованный в данном контексте, означает антитело, полученное из популяции в значительной степени гомогенных антител, то есть индивидуальных антител, включающих популяцию, которая является идентичной и/или связывается с аналогичным эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих природные мутации или мутации, возникающие в процессе получения моноклональных антител, при этом такие варианты обычно присутствуют в следовых количествах. И наоборот, в отличие от получения поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое из полученных моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене.

Термин "моноспецифическое антитело", использованный в данном контексте, означает антитело, содержащее один или более участков связывания с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. Термин "биспецифическое антитело" означает, что антитело способно специфично связываться по крайней мере с двумя различными антигенными детерминантами, например, два участка связывания, каждый из которых образован парой вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела и вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела, связывающимися с различными антигенами или различными эпитопами одного и того же антигена. Такое биспецифическое антитело характеризуется форматом 1+1. Другие форматы биспецифических антител включают форматы 2+1 (включающие 2 участка связывания для первого антигена или эпитопа и один участок связывания для второго антигена или эпитопа) или форматы 2+2 (включающие 2 участка связывания для первого антигена или эпитопа и 2 участка связывания для второго антигена или эпитопа). Обычно биспецифическое антитело включает два участка связывания с антигеном, каждый из которых является специфичным для различных антигенных детерминант.

Термин "валентность", использованный в данном контексте, означает присутствие определенного числа участков связывания в связывающейся с антигеном молекуле. Аналогичным образом, термины "двухвалентный", "четырехвалентный" и "шестивалентный" означают присутствие двух участков связывания, четырех участков связывания и шести участков связывания, соответственно, в составе молекулы, связывающей антиген. Биспецифическое антитела по настоящему изобретению являются по крайней мере "двухвалентными", и могут быть "трехвалентными" или "мультивалентными" (например, "четырехвалентными" или "шестивалентными"). В конкретном объекте настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению включают два или более участков связывания и являются биспецифическими. Таким образом, антитела могут быть биспецифическими даже в тех случаях, когда антитело содержит более двух участков связывания (т.е. когда антитело является трехвалентным или мультивалентным). Прежде всего, настоящее изобретение относится к биспецифическими двухвалентным антителам, характеризующимся наличием одного участка связывания для каждого антигена, с которым они специфично связываются.

Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "целое антитело", использованные в настоящем контексте, являются взаимозаменяемыми и означают антитело, структура которого в основном близка к структуре природного антитела. Термин "природные антитела" означает молекулы природного иммуноглобулина" с различной структурой. Например, природные антитела класса IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины молекулярной массы приблизительно 150000 Да, состоят из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, соединенных дисульфидной связью. От N-концевого фрагмента до С-концевого фрагмента каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH), которую также называют вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три консервативных домена (CH1, СН2, и СН3), которые также называют консервативными областями тяжелой цепи. Аналогичным образом, от N-концевого фрагмента до С-концевого фрагмента каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL), которую также называют вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует консервативный домен легкой цепи (CL), который также называют консервативной областью легкой цепи. Тяжелую цепь антитела можно отнести к одному из 5 типов, которыми являются α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых можно далее подразделить на подтипы, например, γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) и α2 (IgA2). Легкую цепь антитела можно отнести к одному из двух типов, которые называются каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности их консервативного домена.

Термин "фрагмент антитела" означает молекулу, отличную от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с интактным антителом. Примеры фрагментов антител включают, но, не ограничиваясь только ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, диатела, триатела, тетратела, кросс-Fab фрагменты, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv), мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител и однодоменных антител. Обзор определенных фрагментов антител представлен в работе Hudson и др., Nat. Med., 9, сс. 129-134 (2003). Обзор scFv фрагментов представлен в работе, например, , The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, Rosenburg and Moore (ред.), Springer-Verlag, Нью-Йорк, сс. 269-315 (1994), в заявке WO 93/16185 и в патентах США №№5571894 и 5587458. Описание Fab и F(ab')2 фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором реутилизации и характеризующихся повышенным периодом полураспада in vivo, приведено в патенте США №5869046. Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими участками, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими, см. например, ЕР 404097, WO 1993/01161, статьи Hudson и др., Nat. Med., 9, сс. 129-134 (2003) и Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, сс. 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела описаны также в работе Hudson и др., Nat. Med., 9, сс. 129-134 (2003). Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего антитела однодоменным антителом является однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Waltham, MA, см., например, патент США 6248516 В1). Кроме того, фрагменты антител включают одноцепочечные полипептиды со свойствами VH домена, а именно способные ассоциировать вместе с VL доменом, или со свойствами VL домена, а именно, способные ассоциировать вместе с VH доменом и связываться с участком связывания функционального антигена, обеспечивая таким образом антигенсвязывающее свойство полноразмерных антител. Фрагменты антител можно получать по различным методикам, включая, но, не ограничиваясь только ими, протеолитическое расщепление интактных антител и продуцирование рекомбинантными клетками хозяина (например, Е.coli или фаг), как описано в данном контексте.

При расщеплении интактных антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, которые называют "Fab фрагментами", каждый из которых содержит вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, а также консервативный домен легкой цепи и первый консервативный домен тяжелой цепи (СН1). Таким образом, термин "Fab фрагмент", использованный в данном контексте, означает фрагмент антитела, содержащий фрагмент легкой цепи, включающий VL домен и консервативный домен легкой цепи (CL), и VH домен и первый консервативный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов добавлением нескольких остатков в С-концевом фрагменте СН1 домена тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH фрагменты представляют собой Fab' фрагменты, в которых остаток(ки) цистеина консервативных доменов содержит свободную тиольную группу. При обработке пепсином образуется F(ab')2 фрагмент, содержащий 2 антигенсвязывающих участка (2 Fab фрагмента) и часть Fc области.

Термин "кросс-Fab фрагмент" или "xFab фрагмент" или "кроссоверный Fab фрагмент" означает Fab фрагмент, в котором либо вариабельные области, либо консервативные области тяжелой и легкой цепи заменены друг на друга. В биспецифических антителах по настоящему изобретению возможно и включено использование композиций двух различных цепей кроссоверного Fab фрагмента. С одной стороны, вариабельные области тяжелой и легкой цепей Fab заменены, то есть кроссоверный Fab фрагмент включает пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и консервативной области тяжелой цепи (СН1), и пептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и консервативной области легкой цепи (CL). Такие кроссоверные Fab фрагменты обозначают также CrossFab (VLVH). С другой стороны, когда консервативные области тяжелой и легкой цепей Fab заменены друг на друга, то кроссоверный Fab фрагмент включает пептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и консервативной области легкой цепи (CL), и пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и консервативной области тяжелой цепи (СН1). Такой кроссоверный Fab фрагмент обозначают также CrossFab (CLCH1).

"Одноцепочечный Fab фрагмент" или "scFab" представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), консервативного домена 1 антитела (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), консервативного домена легкой цепи антитела (CL) и линкера, где указанные домены антитела и указанный линкер располагаются в следующем порядке при направлении от N-концевого фрагмента к С-концевому фрагменту: a) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-СН1, в) VH-CL-линкер-VL-CH1 или г) VL-CH1-линкер-VH-CL, и где указанный линкер представляет собой полипептид, включающий по крайней мере 30 аминокислот, предпочтительно от 32 до 50 аминокислот. Указанные одноцепочечные Fab фрагменты стабилизированы за счет природной дисульфидной связи между CL доменом и СН1 доменом. Кроме того такие одноцепочечные молекулы Fab могут быть дополнительно стабилизированы за счет образования межцепных дисульфидных связей при введении остатков цистеина (например, в положение 44 в вариабельной тяжелой цепи и в положение 100 в вариабельной легкой цепи по нумерации Кабата).

Термин "одноцепочечный кроссоверный Fab фрагмент" или "x-scFab" означает полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), консервативного домена 1 антитела (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), консервативного домена легкой цепи антитела (CL) и линкера, где указанные домены антитела и указанный линкер располагаются в следующем порядке при направлении от N-концевого фрагмента к С-концевому фрагменту: а) VH-CL-линкер-VL-СН1 и б) VL-CH1-линкер-VH-CL, где VH и VL вместе образуют антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с антигеном, и где указанный линкер представляет собой полипептид, состоящий по крайней мере из 30 аминокислот. Кроме того такие молекулы x-scFab могут быть дополнительно стабилизированы за счет образования межцепных дисульфидных связей при введении остатков цистеина (например, в положение 44 в вариабельной тяжелой цепи и в положение 100 в вариабельной легкой цепи по нумерации Кабата).

Термин "одноцепочечный вариабельный (scFv) фрагмент" означает гибридный белок вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой цепей (VL) антитела, связанных через короткий пептидный линкер, содержащий от 10 до приблизительно 25 аминокислот. Линкер обычно обогащен глицином для придания ему гибкости, а также серином или треонином для придания растворимости и может либо соединять N-концевой фрагмент VH с С-концевым фрагментом VL, либо наоборот. Этот белок сохраняет специфичность исходного антитела, несмотря на удаление консервативных областей и введение линкера. Антитела scFv описаны, например, в работе Houston J.S., Methods in Enzymol., 203, сс. 46-96 (1991)). Кроме того, фрагменты антител включают одноцепочечные полипептиды со свойствами VH домена, а именно способные ассоциироваться вместе с VL доменом, или со свойствами VL домена, а именно способные ассоциироваться вместе с VH доменом и связываться с участком связывания функционального антигена и, таким образом, обеспечивая антигенсвязывающее свойство полноразмерных антител.

"Белки, связывающиеся с каркасными областями антигена" известны в данной области техники, например, фибронектин и сконструированные белки с анкириновым повтором (DARPin), которые используют в качестве альтернативных каркасных областей для антигенсвязывающих доменов, см., например, Gebauer и Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics, Curr. Opin. Chem. Biol., 13, cc. 245-255 (2009) и Stumpp и др., Darpins: A new generation of protein therapeutics, Drug Discovery Today, 13, cc. 695-701 (2008). В одном объекте настоящего изобретения белок, связывающийся с каркасной областью антигена, выбирают из группы, включающей CTLA-4 (эвитело), липокалины (Anticalin), молекулу - производное А белка, такую как Z домен А белка (аффитело), А домен (Avimer/Maxibody), сывороточный трансферрин (транс-тело), сконструированный белок с анкириновым повтором (DARPin), вариабельный домен легкой или тяжелой цепи антитела (однодоменное антитело, sdAb), вариабельный домен тяжелой цепи антитела (нанотело, aVH), фрагменты VNAR, фибронектин (AdNectin), домен лектина типа С (тетранектин), вариабельный домен нового рецептора антигена β-лактамазы (фрагменты VNAR), γ-кристаллин или убиквитин человека (молекулы аффилина), домен ингибиторов протеазы человека Кунитца, микротела, такие как белки семейства ноттин, пептидные аптамеры и фибронектин (аднектин).

CTLA-4 (цитотоксичный ассоциированный с Т лимфоцитом антиген 4) представляет собой рецептор семейства CD28, в основном экспрессирующийся на Т клетках CD4+. Его внеклеточный домен содержит вариабельный домен, подобный изгибу Ig. Петли, соответствующие CDR областям антител, можно заменить на гетерогенную последовательность для обеспечения различных связывающих свойств. Молекулы CTLA-4, сконструированные для получения различных связывающих специфичностей, известны также под названием эвитела (например, патент США 7166697 В1). Размер эвител близок к размеру изолированной вариабельной области антитела (например, домена антитела). Более подробно они описаны в работе Journal of Immunological Methods, 248, 1-2, сс. 31-45 (2001). Липокалины представляют собой семейство внеклеточных белков, которые переносят небольшие гидрофобные молекулы, такие как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Они характеризуются жесткой вторичной β-складчатой структурой с рядом петель на открытом конце конической структуры, которую можно сконструировать для связывания с различными мишенями-антигенами. Размер антикалинов составляет от 160 до 180 аминокислот и они являются производными липокалинов. Более подробно антикалины описаны в статье Biochim. Biophys. Acta, 1482, сс. 337-350 (2000), в патентах США 7250297 В1 и 20070224633. Аффитело представляет собой каркасную область А белка стафилококка золотистого Staphylococcus aureus, который можно модифицировать для связывания с антигеном. Домен состоит из трех-спирального узла приблизительно из 58 аминокислот. Библиотеки получают при рандомизации поверхностных остатков. Более подробно аффитела описаны в статье Protein Eng. Des. Sel., 17, сс. 455-462 (2004) и в патенте ЕР 1641818 А1. Авимеры представляют собой белки из семейства каркасных областей А домена. Нативные домены приблизительно из 35 аминокислот формируют определенную структуру, связанную дисульфидными мостиками. Многообразие генерируется за счет шаффлинга (перестановки) природных вариаций, которые характеризуются для семейства А домена. Подробности представлены в работах Nature Biotechnology, 23, 12, сс. 1556-1561 (2005) и Expert Opinion on Investigational Drugs, 16, 6, сс. 909-917 (июль 2007 г). Трансферрин представляет собой мономерный сывороточный транспортный гликопротеин. Трансферрины конструируют для связывания с различными антигенами-мишенями при встраивании пептидных последовательностей в наружную петлю, доступную для встраивания. Примеры сконструированных трасферриновых каркасных областей включают транс-тело, которое более подробно описано в работе J. Biol. Chem., 274, сс. 24066-24073 (1999). Сконструированные белки с анкириновым повтором (DARPin) являются производными семейства белков, которые опосредуют присоединение интегральных мембранных белков к цитоскелету. Отдельный анкириновый повтор представляет собой мотив из 33 остатков, содержащий 2 α-спирали и β-поворот. Их можно сконструировать для связывания с различными антигенами-мишенями при рандомизации остатков в первой α-спирали и β-повороте каждого повтора. Их связующую границу раздела можно увеличить при увеличении числа модулей (метод созревания аффинности). Подробное описание приведено в следующих документах J. Mol. Biol., 332, сс. 489-503 (2003), PNAS 100, 4, сс. 1700-1705 (2003) и J. Mol. Biol., 369, сс. 1015-1028 (2007) и в патенте США 20040132028 А1.

Однодоменное антитело представляет собой фрагмент антитела, состоящий из отдельного мономерного вариабельного домена антитела. Первые отдельные домены являются производными вариабельного домена тяжелой цепи верблюжьего антитела (нанотела или VHH фрагменты). Кроме того, термин "однодоменное антитело" включает автономный вариабельный домен автономной тяжелой цепи человека (aVH) или VNAR фрагменты акул. Фибронектин представляет собой каркасную область, которую можно сконструировать для связывания с антигеном. Аднектины состоят из основной цепи природной аминокислотной последовательности десятого домена из 15 повторяющихся звеньев фибронектина человека типа III (FN3). Три петли на одном конце β-сэндвича можно сконструировать для придания аднектину специфичного распознавания требуемой терапевтической мишени. Подробности описаны в работах Protein Eng. Des. Sel., 18, сс. 435-444 (2005), в патенте США 20080139791, заявке WO 2005056764 и в патенте США 6818418 В1. Пептидные аптамеры представляют собой комбинаторные молекулы распознавания, состоящие из консервативного каркасного белка, обычно тиоредоксина (TrxA), который содержит структурно ограниченную вариабельную пептидную петлю, введенную в активный участок. Подробности описаны в работе Expert Opin. Biol. Ther., 5, сс. 783-797 (2005). Микротела являются производными природных микробелков, содержащих от 25 до 50 аминокислот с 3-4 цистеиновыми связями, примеры микробелков включают KalataBI, конотоксин и кноттины. Микробелки содержат петлю, которую можно сконструировать для включения до 25 аминокислот, не оказывая влияния на общую конформацию микробелка. Подробная информация по конструированию доменов кноттина приведена в заявке WO 2008098796.

Термин "антигенсвязывающая молекула, которая связывается с тем же самым эпитопом", использованный для обозначения референс-молекулы, означает антигенсвязывающую молекулу, которая блокирует связывание референс-молекулы с ее антигеном по данным конкурентного метода анализа на 50% или более, и наоборот, референс-молекула блокирует связывание антигенсвязывающей молекулы с ее антигеном по данным конкурентного метода анализа на 50% или более.

Термин "антигенсвязывающий участок", использованный в настоящем контексте, означает часть антигенсвязывающей молекулы, которая специфично связывается с антигенной детерминантой. Более подробно, термин "антигенсвязывающий участок" означает участок антитела, который включает область, специфично связывающуюся с частью или с целым антигеном и являющуюся комплементарной им. Если антиген является крупной молекулой, то антигенсвязывающая молекула может связываться только с определенной частью антигена, которая называется эпитопом. Антигенсвязывающий участок связывания может представлять собой, например, один или более вариабельных доменов (которые называют также вариабельными областями). Предпочтительно антигенсвязывающий участок включает вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH). В одном объекте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий участок способен связываться со своим антигеном и блокировать или частично блокировать его функцию. Антигенсвязывающие участки, которые специфично связываются с PD1 или TIM-3, включают антитела и их фрагменты, как будет описано ниже в данном контексте. Кроме того, антигенсвязывающие участки могут включать белки, связывающиеся с каркасным антигеном, например, связывающие домены, которые полученные на основе сконструированных повторных белков или требуемых повторных доменах (см., например, заявку WO 2002/020565).

Термин "антигенная детерминанта", использованный в данном контексте, является синонимом терминов "антиген" и "эпитоп" и означает участок (например, непрерывная последовательность аминокислот или конформационная конфигурация из различных не соседних аминокислот) макромолекулы полипептида, с которым связывается антигенсвязывающий участок, при этом образуется комплекс антигенсвязывающего участка и антигена. Пригодные антигенные детерминанты можно найти, например, на поверхности опухолевых клеток, на поверхности инфицированных вирусом клеток, на поверхности клеток, ассоциированных с другими заболеваниями, на поверхности иммунных клеток, в свободной форме в сыворотке крови и/или во внеклеточной матрице (ЕСМ). Белками, используемыми в качестве антигенов по настоящему изобретению, могут быть любые природные формы белков из любых позвоночных, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антигеном является белок человека. Термин "специфичный белок по настоящему изобретению" означает "полноразмерный" непроцессированный белок, а также любую форму белка, которая образуется в результате процессинга в клетке. Данный термин также означает природные варианты белка, например, сплайс-варианты или аллельные варианты.

Термин "специфичное связывание" означает, что связывание селективно для антигена и может не включать нежелательные или неспецифичные взаимодействия. Способность антигенсвязывающей молекулы связываться со специфичным антигеном можно измерить либо с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) или другой методики, известной специалистам в данной области техники, например, поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (анализ на приборе BIAcore) (Liljeblad и др., Glyco. J., 17, сс. 323-329 (2000)), и стандартных анализов связывания (Heeley, Endocr. Res., 28, сс. 217-229 (2002)). В одном варианте осуществления настоящего изобретения степень связывания антигенсвязывающей молекулы с неродственным белком составляет приблизительно менее 10% от связывания антигенсвязывающей молекулы с антигеном, по данным, например, метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). В некоторых вариантах молекула, которая связывается с антигеном, характеризуется константой диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10-7 М или менее, например, от 10-7 М до 10-13 М, например, от 10-9 М до 10-13 М).

Термин "аффинность" или " связывающая аффинность" означает силу суммарных общих нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, антитела) и его компонентом связывания (например, антигеном). Если не указано иное, термин "связывающая аффинность", использованный в данном контексте, отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитела и антигена). Аффинность молекулы X к ее компоненту Y в основном можно представить константой диссоциации (Kd), которая означает отношение констант скоростей диссоциации и ассоциации (koff и kon, соответственно). Таким образом, эквивалентные аффинности могут включать различные константы скорости, при условии, что сохраняются те же самые отношения констант скорости. Аффинность можно измерять стандартными методами, известными в данной области техники, включая описанные в данном контексте. Предпочтительным методом измерения аффинности является поверхностный плазмонный резонанс (ППР).

Термин "высокая аффинность" антитела, использованный в данном контексте, означает антитело с Kd 10-9 М или менее и даже более предпочтительно 10-10 М или менее, для антигена-мишени. Термин "низкая аффинность" антитела означает антитело с Kd 10-8 или более.

Термин "аффинность зрелого антитела" означает антитело с одним или более изменениями в одном или более гипервариабельных областях (HVR), по сравнению с исходным антителом, в котором отсутствуют такие изменения, которые приводят к улучшению аффинности антитела в отношении антигена.

Термины "биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM-3", "биспецифическое антитело, которое специфично связывается с PD1 и TIM-3", "биспецифическая антигенсвязывающая молекула, специфичная к PD1 и TIM-3" в данном контексте используют взаимозаменяемо и они означают биспецифическое антитело, способное связываться с PD1 и TIM-3 с достаточной аффинностью таким образом, что антитело является пригодным для применения в качестве диагностического и/или лекарственного агента для направленного воздействия на PD1 и TIM-3.

Термин «PD1», известный также под названием белок 1 запрограммированной смерти клетки, представляет собой мембранный белок типа I, содержащий 288 аминокислот, который впервые был описан в 1992 г (Ishida и др., EMBO J., 11, сс. 3887-3895 (1992)). PD-1 является членом обширного семейства CD28/CTLA-4 Т клеточных регуляторов и содержит 2 лиганда, PD-L1 (В7-Н1, CD274) и PD-L2 (B7-DC, CD273). Структура белка включает внеклеточный домен IgV, за которым следует трансмембранная область внутриклеточный хвост. Внутриклеточный хвост содержит 2 участка фосфорилирования, расположенных в иммунорецепторном ингибиторном тирозиновом мотиве и в иммунорецепторном переключательном тирозиновом мотиве, что позволяет предположить, что PD-1 отрицательно регулирует сигналы TCR. Это согласуется со связыванием фосфатаз SHP-1 и SHP-2 с цитоплазматическим участком PD-1 при связывании лиганда. В то время как PD-1 не экспрессируется на нативных Т клетках, наблюдается его регуляция повышением активности после опосредованной рецептором Т клеток (TCR) активацией, а также его наблюдается экспрессия на активированных и истощенных Т клетках (Agata и др., Int. Immunology, 8, сс. 765-772 (1996)). Такие истощенные Т клетки характеризуются бифункциональным фенотипом и неспособны на соответствующую ответную реакцию. Несмотря на то, что PD-1 характеризуется относительно широким профилем экспрессии, его наиболее важная роль вероятно заключается в выполнении функции совместного ингибиторного рецептора на Т клетках (Chinai и др., Trends in Pharmacological Sciences, 36, сс. 587-595 (2015)). Таким образом, современные терапевтические подходы направлены на блокировку взаимодействия PD-1 с его лигандами для увеличения ответной реакции Т клеток. Термины "запрограммированная смерть 1", "запрограммированная смерть клетки 1", "белок PD-1," "PD-1, "PD1," "PDCD1," "hPD-1" и "hPD-I" можно использовать взаимозаменяемо и они включают варианты, изоформы, гомологи PD-1 человека и аналоги, содержащие о крайней мере один общий с PD-1 эпитоп. Аминокислотная последовательность PD1 человека представлена в базе данных UniProt (www.uniprot.org), номер доступа Q15116 (SEQ ID NO: 89).

Термины "антитело анти-PD1" и "антитело, включающее антигенсвязывающий участок, который связывается с PD1" означают антитело, связывающееся с PD1, прежде всего с полипептидом PD1, который экспрессируется на поверхности клетки с достаточной аффинностью таким образом, что антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического агента для направленного воздействия на PD1. В одном варианте степень связывания антитела анти-PD1 с неродственным белком, который не является PD белком, составляет менее приблизительно 10% от связывания антитела с PD1, по данным измерений, например, методом радиоиммуноанализа (RIA) или проточной цитометрии (FACS) или методом ППР с использованием системы биосенсора, такой как Biacore®. В некоторых вариантах антигенсвязывающий белок, который связывается с PD1 человека, характеризуется величиной KD связывающей аффинности с PD1 человека ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ, или ≤0,001 нМ (например, 10-8 М или менее, например, от 10-8 М до 10-13 М, например, от 10-9 М до 10-13 М). В одном предпочтительном варианте соответствующую величину связывающей аффинности KD определяли методом ППР с использованием внеклеточного домена (ECD) PD1 человека (PD1-ECD) для связывающей аффинности PD1. Термин "антитело анти-PD1" означает также биспецифическое антитела, которые способны связываться с PD1 и вторым антигеном.

Термин "TIM3", сокращенно "молекула 3, содержащая домен Т клеточного иммуноглобулина и муцина", который обозначают также TIM-3, HAVCR2, KIM-3, TIMD3 и FLJ14428, означает поверхностный белок специфической Т хелперной клетки, который регулирует активацию макрофагов и тяжесть воспалительного состояния. TIM3 также связан с раком, прежде всего с раковыми стволовыми клетками. Нуклеотидная и белковая последовательности TIM3 известны для многих видов. Например, аминокислотная последовательность человека представлена в базе данных Uniprot, номер доступа Q8TDQ0 (SEQ ID NO: 93). Белок человека характеризуется внеклеточным доменом, содержащим Ig-подобный домен и домен муцина (также включающий О- и N-связанные сайты гликозилирования), включающий приблизительно 22-202 аминокислот, трансмембранный домен (203-223 аминокислот), и внутриклеточный домен (цитоплазматический) (аминокислоты 224-301). Для белка TIM3 человека с последовательностью SEQ ID NO: 93, внеклеточный домен содержит приблизительно 22-202 аминокислоты, трансмембранный домен содержит приблизительно 203-223 аминокислоты и цитоплазматический домен содержит приблизительно 224-301 аминокислоту. Термин "TIM3" включает варианты, изоформы, видовые гомологи TIM3 человека и его аналоги, содержащие по крайней мере один эпитоп, общий с TIM3.

Термины "антитело анти-TIM3" и "антитело, включающее антигенсвязывающий участок, который связывается с TIM3" означают антитело, связывающееся с TIM3, прежде всего с полипептидом TIM3, который экспрессируется на поверхности клетки, с достаточной аффинностью таким образом, что антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического агента для направленного воздействия на TIM3. В одном варианте степень связывания антитела анти-TIM3 с неродственным белком, который не является TIM3, составляет менее приблизительно 10% от связывания антитела с TIM3, по данным измерений, например, методом радиоиммуноанализа (RIA) или проточной цитометрии (FACS) или методом ППР с использованием системы биосенсора, такой как Biacore®. В некоторых вариантах антигенсвязывающий белок, который связывается с TIM3 человека, характеризуется величиной связывающей аффинности KD с TIM3 человека ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ, или ≤0,001 нМ (например, 10-7 М или менее, например, от 10-8 М до 10-13 М, например, от 10-9 М до 10-13 М). В одном предпочтительном варианте соответствующая величина связывающей аффинности KD определяли ППР с использованием внеклеточного домена (ECD) TIM3 человека (TIM3-ECD) для связывающей аффинности PD1. Термин "антитело анти-TIM3" означает также биспецифическое антитела, способные связываться с TIM3 и вторым антигеном.

Термин "блокирующее антитело" или "антагонист антитела" означает антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность связывающегося с ним антигена. В некоторых вариантах блокирующие антитела или антагонисты антител частично или полностью ингибируют биологическую активность антигена. Например, биспецифическое антитела по настоящему изобретению блокируют передачу сигнала через PD-1 и TIM-3 таким образом, чтобы восстановить функциональную ответную реакцию от Т клеток (например, пролиферацию, продуцирование цитокинов, гибель клеток-мишеней) от состояния дисфункции до стимуляции антигена.

Термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" означают домен тяжелой или легкой цепи антитела, который принимает участие в связывании антигенсвязывающей молекулы с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно характеризуются одинаковой структурой, при этом каждый домен включает 4 консервативных каркасных области (FR) и 3 гипервариабельные области (HVR). См., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6е изд., Freeman W.H. and Co., с. 91 (2007). Для обеспечения антигенсвязывающей специфичности может быть достаточно одного VH или VL домена.

Термин "гипервариабельная область" или "HVR," использованный в настоящем контексте, означает каждую из областей вариабельного домена антитела, которые характеризуются гипервариабельной последовательностью и/или образуют структурно определенные петли ("гипервариабельные петли"). В основном, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR, три в VH домене (H1, Н2, Н3) и три в VL домене (L1, L2, L3). HVR обычно содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из "определяющих комплементарность областей" (CDR), причем последние характеризуются более высокой вариабельностью и/или принимают участие в распознавании антигена. Примеры гипервариабельных петель расположены в следующих положениях аминокислотных остатков 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196, cc. 901-917 (1987)). Примеры областей CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-Н3) расположены в следующих положениях аминокислотных остатков 24-34 L1, 50-56 L2, 89-97 L3, 31-35В H1, 50-65 Н2 и 95-102 Н3 (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5е изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Термин "гипервариабельные области (HVR)" означает также определяющие комплементарность области (CDR), и данные термины используют в данном контексте взаимозаменяемо при описании участков вариабельной области, которые образуют антигенсвязывающие участки. Данная область описана в документах Kabat и др., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) и Chothia и др., J. Mol. Biol., 196, cc. 901-917 (1987), где определения включают перекрывание или подгруппы аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее, применение каждого определения для обозначения CDR антитела или его вариантов включено в значение термина, как определено в настоящем контексте. Соответствующие аминокислотные остатки, которые означают CDR, как определено в каждой из цитированных выше ссылок, представлены ниже в табл. А для сравнения. Точные номера остатков, означающих конкретные CDR, изменяются в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области техники могут определить остатки, включающие конкретную CDR данной вариабельной области аминокислотной последовательности антитела.

1 Нумерация всех определений CDR в табл. А представлена согласно системе нумерации, определенной в работе Kabat и др. (см. ниже).

2 Сокращение "AbM" со строчной буквой "b", использованное в табл. А, означает CDR, как определено с помощью программного обеспечения для моделирования структуры антител Oxford Molecular's "AbM".

В работе Kabat и др. определена также система нумерации для последовательностей вариабельной области, которая является пригодной для любого антитела. Специалист в данной области техники способен однозначно применить данную систему "нумерации Кабата" к любой последовательности вариабельной области без любых экспериментальных данных, не относящихся к самой последовательности. Термин "нумерация Кабата", использованный в данном контексте, означает систему нумерации, установленную в работе Kabat и др., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Если не указано иное, то нумерация положений определенных аминокислотных остатков в вариабельной области антитела соответствует системе нумерации Кабата.

За исключением CDR1 в VH, CDR области обычно содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. CDR области также включают "определяющие специфичность остатки", или "SDR," которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR содержатся в CDR областях, которые называют abbriviated-CDR или a-CDR. Примеры a-CDR областей (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-Н2 и a-CDR-Н3) находятся в положениях аминокислотных остатков 31-34 L1, 50-55 L2, 89-96 L3, 31-35В H1, 50-58 Н2 и 95-102 Н3 (см. статью Almagro и Fransson, Front. Biosci., 13, cc. 1619-1633 (2008)). Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) в данном контексте пронумерованы в соответствии с работой Kabat и др.

Термин "каркасная область" или "FR" означает остатки вариабельного домена, отличающиеся от остатков гипервариабельной области (HVR). FR область вариабельного домена обычно состоит из четырех FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно находятся в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термин "акцепторная каркасная область человека", использованный в данном контексте, означает каркасную область, включающую аминокислотную последовательность каркасной области вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасную область вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученную из каркасной области иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной области человека, как определено ниже. Акцепторная каркасная область человека, полученная из каркасной области иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной области человека, может включать аналогичную аминокислотную последовательность или может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах, число изменений аминокислот составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых вариантах, акцепторная каркасная область человека VL состоит из идентичной последовательности каркасной области иммуноглобулина человека VL или последовательности консенсусной каркасной области человека.

Термин "химерное антитело" означает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретного источника или видов, в то время как оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или видов.

Термин "класс" антитела означает тип консервативного домена или консервативной области, характерный для тяжелой цепи антитела. Существует 5 основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них дополнительно подразделяются на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Консервативные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ, и μ, соответственно.

Термин "гуманизированное антитело" означает химерное антитело, включающее аминокислотные остатки из HVR областей, не относящиеся к человеку и аминокислотные остатки из FR областей человека. В определенных вариантах гуманизированное антитело включает в основном по крайней мере все из одного, и обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR области (например, CDR области) соответствуют областям антитела, не относящегося к человеку, а также все или практически все FR области соответствуют областям антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может включать по крайней мере часть консервативной области, полученной из антитела человека. Термин "гуманизированная форма антитела", например, антитела не человека, означает антитело, которое подвергалось гуманизации. Другие формы "гуманизированных антител" по настоящему изобретению представляют собой антитела, в которых консервативную область дополнительно модифицировали или изменяли по сравнению с исходным антителом, при этом получали свойства по настоящему изобретению, прежде всего в отношении связывания с C1q и/или Fc рецептором (FcR).

Термин "антитело человека" означает антитело, которое включает аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека, или полученной из не относящегося к человеку источника, использующего антитела человека, или последовательностей, кодирующих другие антитела человека. Данное определение антитела человека не включает гуманизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие остатки, не относящиеся к человеку.

Термин "моноклональное антитело", использованный в данном контексте, означает антитело, полученное из популяции в значительной степени гомогенных антител, то есть индивидуальных антител, включающих популяцию, идентичную и/или связывающуюся с тем же самым эпитопом, за исключением возможного варианта антител, например, содержащих природные мутации или образующихся при получении моноклональных антител, при этом такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение "моноклональный" означает тип антитела, а именно антитело, полученное в основном из гомогенной популяции антител, и не следует понимать, что антитело должно быть получено любым конкретным способом. Например, моноклональные антитела по настоящему изобретению можно получать различными методами, включая, но, не ограничиваясь только ими, метод гибридом, методы рекомбинантных ДНК, методы фагового дисплея и методы, использующие трансгенных животных, содержащих все или часть локусов иммуноглобулина человека, при этом указанные методы и другие типичные методы получения моноклональных антител описаны в данном контексте.

Термин "Fc домен" или "Fc область", использованный в данном контексте, означает С-концевую область тяжелой цепи антитела, содержащую по крайней мере часть консервативной области. Термин включает природные последовательности Fc областей и вариант Fc областей. Прежде всего Fc область тяжелой цепи IgG человека расположена от Cys226, или от Pro230, до С-концевого остатка тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc области может как присутствовать, так и отсутствовать. Аминокислотные последовательности тяжелых цепей всегда включают С-концевой лизин, однако варианты без С-концевого лизина включены в настоящее изобретение.

Fc домен IgG включает IgG СН2 и IgG СН3 домены. "СН2 домен" Fc домена IgG человека обычно расположен от аминокислотного остатка в положении приблизительно 231 до аминокислотного остатка приблизительно в положении 340. В одном варианте к СН2 домену присоединена углеводная цепь. СН2 домен по настоящему изобретению может представлять собой СН2 домен или вариант СН2 домена с природной последовательностью. Термин "СН3 домен" означает последовательность от С-концевого остатка до СН2 домена в Fc области (то есть от аминокислотного остатка в положении приблизительно 341 до аминокислотного остатка в положении приблизительно 441 в составе IgG). СН3 область по настоящему изобретению может представлять собой СН3 домен или вариант СН3 домена с природной последовательностью (например, СН3 домен с встроенной "выпуклостью" ("выступом") в одной из их цепей и соответственно встроенной "полостью" ("впадиной") в другой из их цепей, см. патент США 5821333, включенный в данное описание в качестве ссылки). Такой вариант СН3 доменов можно использовать для осуществления гетеродимеризации двух неидентичных тяжелых цепей антител, как описано в данном контексте. Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc домене или консервативной области осуществляется согласно EU системе нумерации, также называемой EU индексом, как описано в работе Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5е изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Методика "выступ-во-впадину" описана, например, в патентах США 5731168 и 7695936, статьях Ridgway и др., Prot. Eng., 9, сс. 617-621 (1996) и Carter, J. Immunol. Meth., 248, сс. 7-15 (2001). В основном, способ включает встраивание выпуклости ("выступа") в первый полипептид и соответствующей полости ("впадины") во второй полипептид таким образом, чтобы выпуклость располагалась в полости, обеспечивая образование гетеродимера и затрудняя образование гомодимера. Выступы получают при замене малых боковых цепей аминокислот на поверхности первого полипептида на боковые цепи большого размера (например, тирозин или триптофан). Соответствующие впадины идентичного или меньшего размера по сравнению с выступами получают во втором полипептиде при замене аминокислот с боковыми цепями большого размера на меньшие (например, аланин или треонин). Выступ и впадину можно получить при изменении кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты, например, с использованием сайт-специфичного мутагенеза или синтеза пептидов. В особом варианте модификация выступа включает замену аминокислоты T366W в одной из двух субъединиц Fc домена, а модификация впадины включает замены аминокислот T366S, L368A и Y407V в другой из двух субъединиц Fc домена. В другом особом варианте субъединица Fc домена, включающая модификацию выступа, дополнительно включает аминокислотную замену S354C, а субъединица Fc домена, включающая модификацию впадины, дополнительно включает аминокислотную замену Y349C. Введение таких двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидных связей между двумя субъединицами Fc области, таким образом дополнительно стабилизируя димер (Carter, J. Immunol. Methods, 248, сс. 7-15 (2001)).

Термин "область, эквивалентная Fc области иммуноглобулина" означает природные аллельные варианты Fc области иммуноглобулина и варианты, содержащие изменения, которые образуют замены, вставки или делеции, но которые не снижают в значительной степени способность иммуноглобулина опосредовать эффекторные функции (такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность). Например, одну или более аминокислот можно удалить из N-концевого фрагмента или С-концевого фрагмента Fc домена иммуноглобулина без значительной потери биологической функции. Такие варианты можно выбирать согласно общим правилам, известным в данной области техники, которые оказывают минимальное влияние на активность (см., например, Bowie J.U. и др., Science, 247, сс. 1306-13010 (1990)).

Термин "эффекторные функции" означает такие биологические функции, которые связаны с Fc доменом антитела, которые изменяются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание с C1q и комплементарно зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC), связывание с Fc рецептором, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), секрецию цитокинов, опосредуемый иммунным комплексом захват антигена антиген-презентирующими клетками, регуляцию с пониженной активностью рецепторов поверхности клетки (например, рецептора В клеток) и активацию В клеток.

Термин "активирующий Fc рецептор" означает Fc рецептор, который после взаимодействия с Fc доменом антитела вызывает передачу сигналов, которые стимулируют содержащую рецептор клетку осуществлять эффекторные функции. Активирующие Fc рецепторы включают FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) и FcαRI (CD89). Предпочтительным активирующим Fc рецептором является FcγRIIIa человека (см. UniProt, номер доступа Р08637, версия 141).

Термин "пептидный линкер" означает пептид, содержащий одну или более аминокислот, обычно приблизительно от 2 до 20 аминокислот. Пептидные линкеры известны в данной области техники или описаны в данном контексте. Пригодные не иммуногенные пептидные линкеры включают, например, (G4S)n, (SG4)n или G4(SG4)n пептидные линкеры, где "n" обычно означает число от 1 до 10, обычно от 2 до 4 и предпочтительно 2.

Термин "гибридный" или "присоединенный" означает, что компоненты (например, антигенсвязывающий участок и Fc домен) соединены пептидными связями либо напрямую, либо через один или более пептидных линкеров.

Термин "аминокислота", используемый в данном контексте, означает группу природных карбоновых α-аминокислот, включающих аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Термин "идентичности аминокислотной последовательности в процентах (%)" в отношении референсного полипептида (белка) означает процент аминокислотных остатков в сравниваемой последовательности, которые являются идентичными аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и введения при необходимости гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей, не учитывая любые консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществить различными способами, которые известны в данной области техники, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN. SAWI или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая различные алгоритмы, необходимые для обеспечения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей. Однако, для целей настоящего изобретения величины идентичности аминокислотной последовательности в % получали с использованием программного обеспечения для сравнения последовательностей ALIGN-2. Автором программного обеспечения ALIGN-2 для сравнения последовательностей является фирма Genentech Inc., и код источника заполняли с использованием документации пользователя в офисе U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, США, где его регистрировали под регистрационным номером U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программное обеспечение ALIGN-2 является общедоступным на фирме Genentech, Inc., South San Francisco, Калифорния, или его можно составить по исходному коду. Программное обеспечение ALIGN-2 можно также составить для использования в операционной системе UNIX, включая цифровую версию UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены в программном обеспечении ALIGN-2 и не изменяются. В случаях, когда программное обеспечения ALIGN-2 используют для сравнения последовательностей аминокислот, идентичность данной аминокислотной последовательности А в % по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В (которую в другом варианте можно назвать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или включает определенную % идентичность аминокислотной последовательности в % по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В) рассчитывают по следующей формуле:

100 × частное X/Y

где X означает число аминокислотных остатков, рассчитанных как идентичные совпадения при сравнении последовательностей А и B в программе ALIGN-2, и где Y означает общее число аминокислотных остатков в последовательности В. Следует понимать, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то идентичность аминокислотной последовательности в % при сравнении А с В не равна идентичности аминокислотной последовательности в % при сравнении В с А. Если не указано иное, все значения идентичности аминокислотных последовательностей, использованные в данном контексте, были получены, как описано в предыдущем абзаце, с использованием программного обеспечения ALIGN-2.

В некоторых объектах предлагаются варианты аминокислотных последовательностей биспецифических антител по настоящему изобретению. Например, может возникнуть необходимость улучшить связывающую аффинность и/или другие биологические свойства биспецифических антител. Варианты аминокислотных последовательностей биспецифических антител можно получать при введении соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулы или с использованием синтеза пептидов. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечного конструкта можно использовать любые комбинации делеций, вставок или замен при условии, что конечный конструкт обладает требуемыми характеристиками, например, антигенсвязывающими свойствами. Сайты для заместительного мутагенеза включают HVR область и каркасные области (FR). Консервативные замены приведены в табл. Б под названием "Предпочтительные замены" и далее обсуждаются со ссылкой на классы аминокислотных боковых цепей (1)-(6). Аминокислотные замены можно вводить в исследуемую молекулу и в продуктах определять требуемую активность, например, сохраненное/улучшенное связывание с антигеном, сниженную иммуногенность или улучшенные ADCC или CDC.

Аминокислоты могут быть сгруппированы по общим свойствам боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile,

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln,

(3) кислотные: Asp, Glu,

(4) основные: His, Lys, Arg,

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепей: Gly, Pro,

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены означают замену члена одного из этих классов на другой класс.

Термин "варианты аминокислотной последовательности" означает значительные варианты, в которых введены аминокислотные замены одного или более остатков в гипервариабельной области исходной антигенсвязывающей молекулы (например, гуманизированном антителе или антителе человека). Обычно, конечный вариант(ы), выбранный(е) для дальнейшего исследования, включает модификации (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенная аффинность, сниженная иммуногенность) по сравнению с исходной антигенсвязывающей молекулой и/или в значительной степени сохраняет определенные биологические свойства исходной антигенсвязывающей молекулы. Типичный вариант с заменой включает антитело со зрелой аффинностью, которое можно получить, например, по методикам созревания аффинности с использованием фагового дисплея, таким, как описано в данном контексте. Краткое описание метода: проводят мутации одного или более остатков HVR и вариант антигенсвязывающей молекулы отражают на фаг и определяют конкретную биологическую активность (например, связывающую аффинность). В некоторых вариантах замены, вставки и делеции можно осуществлять в составе одной или более HVR при условии, что такие изменения не приведут к значительному снижению способности антигенсвязывающей молекулы связываться с антигеном. Например, в HVR можно осуществить консервативные изменения (например, консервативные замены, описанные в данном контексте), которые не приводят к значительному снижению связывающей аффинности. Пригодный метод идентификации остатков или областей антитела, которые можно выбрать для мутагенеза, называется "аланинсканирующим мутагенезом", как описано в статье Cunningham и Wells, Science, 244, сс. 1081-1085 (1989). Согласно данному методу остаток или группу с остатками-мишенями (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для оценки влияния такого изменения на взаимодействие антитела с антигеном. Можно осуществлять дополнительные замены в положениях аминокислот, которые проявляют функциональную чувствительность к исходным заменам. В другом варианте, или дополнительно, можно использовать кристаллическую структуру комплекса антигена с антигенсвязывающей молекулой для идентификации контактирующих точек между антителом и антигеном. Такие контактирующие остатки и соседние остатки можно выбрать в качестве мишеней для модификации. Варианты можно исследовать на наличие требуемых свойств.

Вставки в аминокислотные последовательности включают присоединение последовательностей длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто и более остатков, к N- или С-концевому фрагменту, а также вставки одного или более аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают биспецифическое антитела с N-концевым остатком метионина. Другие варианты вставок включают присоединение полипептида к N- или С-концевому фрагменту, что повышает период полураспада биспецифического антитела в сыворотке.

В определенных объектах биспецифическое антитела, предлагаемые по настоящему изобретению, изменяют для повышения или снижения степени гликозилирования антитела. Гликозилированные варианты молекул легко получить при изменении аминокислотной последовательности таким образом, что вставить или удалить один или более участков гликозилирования, например, можно изменять углеводы, присоединенные к Fc домену. Природные антитела, которые продуцируются обычно в клетках млекопитающих, обычно включают разветвленный двухантенный олигосахарид, который обычно присоединен через N-связь к Asn297 СН2 домена Fc области. См., например, Wright и др., TIBTECH, 15, сс. 26-32 (1997). Олигосахарид может содержать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc на "стебле" двухантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах модификации олигосахарида в биспецифических антителах по настоящему изобретению можно проводить для конструирования вариантов с улучшенными определенными свойствами. В одном объекте предлагаются варианты биспецифических антител с углеводной структурой, обедненной фукозой, присоединенной (напрямую или косвенно) к Fc домену. Такие фукозолированные варианты характеризуются улучшенной функцией ADCC, см. например, публикацию патента США 2003/0157108 (Presta L.) или 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Другие варианты биспецифических антител по настоящему изобретению включают антитела с разделенными на 2 части олигосахаридами, например, в которых двухантенный олигосахарид, присоединенный к Fc домену, разделен на 2 части остатком GlcNAc. Такие варианты могут характеризоваться сниженным фукозилированием и/или улучшенной функцией ADCC, см., например, заявку WO 2003/011878 (Jean-Mairet и др.), патенты США 6602684 (Umana и др.) и 2005/0123546 (Umana и др.). Предлагаются также варианты, содержащие по крайней мере один остаток галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc области. Такие варианты антител могут характеризоваться улучшенной функцией CDC и описаны, например, в заявках WO 1997/30087 (Patel и др.), WO 1998/58964 (Raju S.) и WO 1999/22764 (Raju S.).

В некоторых вариантах можно получить сконструированные цистеиновые варианты биспецифических антител по настоящему изобретению, например, "thioMAb", в которых один или более остатков молекулы заменены на остатки цистеина. В предпочтительных вариантах замененные остатки находятся в доступных участках молекулы. При замене таких остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы таким образом будут расположены в доступных участках антитела, и их можно использовать для конъюгирования антитела с другими фрагментами, такими как лекарственные фрагменты или фрагменты линкер-лекарственное средство, для конструирования иммунноконъюгата. В определенных вариантах любой один или более приведенных ниже остатков можно заменять на цистеин: V205 (нумерация по Кабату) в легкой цепи, А118 (EU нумерация) в тяжелой цепи и S400 (EU нумерация) в тяжелой цепи Fc области. Сконструированные антигенсвязывающие молекулы цистеина можно получить согласно тому, как описано в патенте США 7521541.

В определенных объектах биспецифическое антитела по настоящему изобретению можно дополнительно модифицировать для введения в них дополнительных небелковых фрагментов, известных в данной области техники и общедоступных. Фрагменты, пригодные для модификации антител, включают, но, не ограничиваясь только ими, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но, не ограничиваясь только ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры и статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля характеризуется преимуществами при получении за счет его стабильности в воде. Полимер может характеризоваться любой молекулярной массой и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может изменяться, и если присоединено более одного полимера, то они могут быть одинаковыми или различными. Обычно, число и/или тип полимеров, которые используют для модификации, определяют с учетом следующих факторов, включающих, но, не ограничиваясь только ими, конкретные свойства или функции улучшаемого антитела, возможность использовать производное биспецифического антитела в лечении при определенных условиях и т.п.

В другом объекте предлагаются конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно селективно нагревать при облучении. В одном варианте в качестве небелкового фрагмента используют углеродную нанотрубку (Kam N.W. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, сс. 11600-11605 (2005)). Облучение может характеризоваться любой длиной волны и включать, но, не ограничиваясь только ими, длины волн, которые не оказывают отрицательное действие на обычные клетки, но в результате такого облучения нагревается небелковый фрагмент до температуры, при которой происходит гибель клеток, соседних с конъюгатом антитела и небелкового фрагмента.

Термин "иммуноконъюгат" означает антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичных молекул, включая, но, не ограничиваясь только им, цитотоксичный агент.

Термин "полинуклеотид" означает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты или конструкт, например, матричную РНК (мРНК), вирусную РНК или плазмидную РНК (пРНК). Полинуклеотид может включать обычную фосфодиэфирную связь или необычную связь (например, амидную связь, например, такую, которая присутствует в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин "молекула нуклеиновой кислоты" означает любой один или более сегментов нуклеиновой кислоты, например, фрагменты ДНК или РНК, присутствующие в полинуклеотиде.

Термин «изолированная» молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотида означает молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, выделенную из ее природной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащийся в векторе, рассматривается как изолированный для целей настоящего изобретения. Другие примеры изолированных полинуклеотидов включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичных клетках-хозяина, или очищенные (частично или практически полностью) полинуклеотиды в растворе. Изолированный полинуклеотид включает молекулу полинуклеотида, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу полинуклеотида, но молекула полинуклеотида находится вне хромосомы в месте локализации хромосомы, которое отличается от локализации его природной хромосомы. Изолированные молекулы РНК включают транскрипты РНК in vivo или in vitro по настоящему изобретению, а также отрицательные и положительные формы цепей и двухцепочечные формы. Изолированные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кроме того включают синтетические молекулы. Кроме того полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут являться регуляторным элементом, таким как промотор, рибосом связывающий сайт или терминатор транскрипции, или включать его.

Нуклеиновая кислота или полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, идентичность которой по сравнению с эталонной полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению составляет по крайней мере 95%, означает, что нуклеотидная последовательность идентична эталонной последовательности за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Другими словами, чтобы получить полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, идентичность которой с эталонной нуклеотидной последовательностью составляет по крайней мере 95%, можно удалить или заменить на другой нуклеотид вплоть до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности, или вплоть до 5% нуклеотидов от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности можно вставить в эталонную последовательность. Эти изменения эталонной последовательности можно проводить в 5'- или 3'-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом положении между этими концевыми положениями, рассеянные либо индивидуально среди остатков в эталонной последовательности, или в одной или более соседних групп в эталонной последовательности. На практике идентичность конкретной нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, которая может составлять по крайней мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, можно определять стандартным методом с использованием известных компьютерных программ, таких как программы, описанные выше для полипептидов (например, ALIGN-2).

Термин «кассета экспрессии» относится к полинуклеотиду, полученному рекомбинантным или синтетическим методом, с набором специфических элементов нуклеиновых кислот, которые позволяют осуществлять транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантную кассету экспрессии можно включить в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Обычно часть рекомбинантной кассеты экспрессии экспрессионного вектора включает, наряду с другими последовательностями, последовательность нуклеиновой кислоты, предназначенной для транскрипции, и промотор. В некоторых вариантах кассета экспрессии по настоящему изобретению включает полинуклеотидные последовательности, которые кодируют биспецифическое, антигенсвязывающие соединения по настоящему изобретению или их фрагменты.

Термин «эффективное количество» агента означает количество, которое требуется для осуществления физиологического изменения в клетке или ткани, в которые его вводят.

Термин «терапевтически эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, означает количество, проявляющее эффективность в дозировках и в течение периодов времени, когда достигается требуемый лечебный или профилактический результат. Терапевтически эффективное количество агента, например, устраняет, снижает, замедляет развитие, сводит к минимуму или предотвращает отрицательные действия заболевания.

«Индивидуум» или «субъект» означает млекопитающее. Млекопитающие включают, но, не ограничиваясь только ими, домашних животных (например, крупный рогатый скот, овцы, собаки, кошки и лошади), приматов (например, человек и приматы, не относящиеся к человеку, такие как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). Прежде всего индивидуумом или субъектом является человек.

Термин «фармацевтическая композиция» означает состав, который в указанной форме обеспечивает биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в этом составе и проявляющего эффективность, и который не содержит никаких дополнительных компонентов, оказывающих неприемлемую токсичность на организм субъекта, которому вводят этот состав.

«Фармацевтически приемлемый носитель» означает ингредиент в фармацевтической композиции, который не является активным ингредиентом и который не оказывает токсическое действие на субъект. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но, не ограничиваясь только ими, буферное вещество, эксципиент, стабилизатор или консервант.

Использованный в данном контексте термин «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечебный» или «терапия») означают клиническое вмешательство с целью изменить природный ход заболевания у индивидуума, нуждающегося в лечении, которое можно осуществлять либо для профилактики, либо в ходе клинической патологии. Требуемые действия лечения включают, но, не ограничиваясь только ими, профилактику возникновения или рецидива заболевания, снижение интенсивности симптомов, снижение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, профилактику метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, смягчение или облегчение патологического состояния, а также ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых вариантах биспецифическое, связывающее активирующий Т клетки антиген соединение по настоящему изобретению используют для замедления развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Термин «вкладыш в упаковке» означает инструкции, обычно содержащиеся в упаковке терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждения в отношении применения таких терапевтических продуктов.

Термин "рак", используемый в данном контексте, означает пролиферативные заболевания, такие как лимфомы, лимфоцитарные лейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легких (NSCL), бронхиолоальвеолярноклеточный рак легкого, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, меланома кожи или интраокулярная меланома, рак матки, рак яичника, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, карцинома ободочной кишки, рак молочной железы, рак матки, карцинома фалоппиевых труб, карцинома эндометрия, рак шейки матки, карцинома влагалища, рак наружных половых органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркома мягкой ткани, рак уретры, рак полового члена, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или уретры, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, рак желчных протоков, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), опухоли спинного мозга, глиома стволового тела мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимоны, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточная карцинома, аденома гипофиза и саркома Юинга, включая рефракторные формы всех перечисленных выше раков, или комбинация одного или более перечисленных выше раков.

Биспецифическое антитела по настоящему изобретению

В настоящем изобретении предлагаются новые биспецифическое антитела, включающие первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM-3, характеризующиеся предпочтительными перспективными свойствами, такими как продуцируемость, стабильность, связывающая аффинность, биологическая активность, специфическая активность в отношении определенных Т клеток, направленная эффективность и сниженная токсичность. Прежде всего такие биспецифическое антитела связываются с PD1 с высокой аффинностью, а с TIM-3 связываются с низкой аффинностью.

А. Примеры биспецифических антител, которые связываются с PD1 и TIM-3

В одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и

указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает:

(а) VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или

(б) VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, или

(в) VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и

(iii) HVR-H3 включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.

В конкретном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и

указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает:

VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В другом конкретном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и

указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает:

VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

(а) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, или

(б) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, или

(в) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, или

(г) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, или

(д) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49,

и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает:

(а) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или

(б) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или

(в) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или

(г) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, или

(д) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, или

(е) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или

(ж) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, или

(з) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

В другом объекте биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, представляет собой антитело человека, гуманизированное или химерное антитело. Предпочтительным является гуманизированное антитело.

В одном объекте настоящего изобретения предлагается гуманизированное биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

(а) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, или

(б) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, или

(в) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, или

(г) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49,

и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает:

(а) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или

(б) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, или

(в) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, или

(г) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или

(д) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В предпочтительном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46,

и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, или VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

Предпочтительно в настоящем изобретении предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает:

VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и

указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает VH домен, включающий:

(i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,

(ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

(iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и

VL домен, включающий:

(i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20,

(ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и

(iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

Более конкретно, в настоящем изобретении предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49, и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

Более конкретно, в настоящем изобретении предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49, и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В одном объекте биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, является двухвалентным. Это означает, что биспецифическое антитело включает первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3 (формат 1+1).

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где биспецифическое антитело связывается с TIM3 с низкой аффинностью, а с PD1 связывается с высокой аффинностью. В предпочтительном объекте в настоящем изобретении предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где связывающая аффинность биспецифического антитела в отношении TIM3 по меньшей мере в 50 раз ниже по сравнению со связывающей аффинностью в отношении PD1, более предпочтительно по крайней мере в 100 раз ниже по сравнению со связывающей аффинностью в отношении PD1. В одном предпочтительном варианте связывающую аффинность (KD) определяют с использованием поверхностного плазменного резонанса (как описано, например, в примере 12.)

В одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где

указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1 с высокой аффинностью, включает:

(а) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, или

(б) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, или

(в) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, или

(г) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, или

(д) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49,

и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3 с низкой аффинностью, включает:

(а) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, или

(б) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или

(в) VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

В особом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где указанный первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1 с высокой аффинностью, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, и указанный второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3 с низкой аффинностью, включает VH домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и VL домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где биспецифическое антитело включает Fc домен, первый Fab фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй Fab фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3.

Предпочтительно Fc домен представляет собой Fc домен IgG, более предпочтительно Fc домен представляет собой Fc домен IgG1 или Fc домен IgG4.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включающее:

(а) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 50, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 52,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 51, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 53, или

(б) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 54, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 56,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 55, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 57, или

(в) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 58, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 60,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 59, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 61, или

(г) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 62, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 64,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 63, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 65, или

(д) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 66, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 68,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 67, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, идентичность которой составляет по крайней мере 95% по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 69.

В предпочтительном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включающее:

(а) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, или

(б) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, или

(в) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, или

(г) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, или

(д) первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68,

вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69.

Более предпочтительно в настоящем изобретении предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включающее первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включающее первую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, вторую тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69.

В другом объекте биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, является четырехвалентным. В одном объекте биспецифическое антитело включает два антигенсвязывающих участка, которые специфично связываются с PD1, и два антигенсвязывающих участка, которые специфично связываются с TIM3 (формат 2+2).

В одном объекте биспецифическое антитело по настоящему изобретению включает:

(а) две легких цепи и две тяжелых цепи антитела, включающего два Fab фрагмента, включающих антигенсвязывающие участки, которые специфично связываются с TIM3,

(б) два дополнительных Fab фрагмента, включающих антигенсвязывающие участки, которые специфично связываются с PD1, где каждый из указанных дополнительных Fab фрагментов присоединен через пептидный линкер к С-концевому фрагменту тяжелой цепи по п. (а).

В предпочтительном объекте пептидным линкером является (G4S)4. В другом объекте два дополнительных Fab фрагмента, включающих антигенсвязывающие участки, которые специфично связываются с PD1, представляют собой кроссоверные Fab фрагменты, где вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и VL-CH цепи каждая присоединена через пептидный линкер к С-концевому фрагменту тяжелой цепи по п. (а).

В другом объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, включающее:

(а) две тяжелые цепи, каждая из которых включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, или

(б) две тяжелые цепи, каждая из которых включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75, или

(в) две тяжелые цепи, каждая из которых включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, первую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77, и вторую легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78.

Модификации Fc домена, снижающие связывание с Fc рецептором и/или эффекторную функцию

В некоторых объектах одну или более аминокислотных модификаций можно вводить в Fc область антитела по настоящему изобретению, при этом получают вариант Fc области. Вариант Fc области может включать последовательность Fc области человека (например, Fc область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), включающую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более положениях аминокислот.

В приведенном ниже разделе описаны предпочтительные объекты биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, включающих модификации Fc домена, снижающие связывание с Fc рецептором и/или эффекторную функцию. В одном объекте настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, включающему первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где Fc домен содержит одну или более аминокислотных замен, которые снижают связывание с Fc рецептором, прежде всего с Fcγ рецептором. Прежде всего, Fc домен представляет собой подкласс IgG1 человека с аминокислотными мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация по EU индексу Кабата).

Fc домен придает благоприятные фармакокинетические свойства биспецифическими антителам по настоящему изобретению, включая продолжительный период полураспада в сыворотке, что способствует хорошему накоплению в ткани-мишени и благоприятному коэффициенту распределения в ткани/крови. В то же время он может, однако, приводить к нежелательному направленному взаимодействию биспецифических антител по настоящему изобретению с клетками, экспрессирующие Fc рецепторы, а не к связыванию с предпочтительными антигенпрезентирующими клетками. Соответственно, в предпочтительных вариантах Fc домен биспецифических антител по настоящему изобретению характеризуется сниженной связывающей аффинностью в отношении Fc рецептора и/или сниженной эффекторной функцией по сравнению с Fc доменом природного IgG, прежде всего Fc доменом IgG1, или Fc доменом IgG4. Более предпочтительно Fc доменом является Fc домен IgG1.

В одном таком объекте Fc домен (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, включающая указанный Fc домен) характеризуется связывающей аффинностью менее 50%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10% и наиболее предпочтительно менее 5% по сравнению с Fc доменом природного IgG1 (или биспецифической антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению, включающей Fc домен природного IgG1) и/или характеризуется эффекторной функцией менее 50%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10% и наиболее предпочтительно менее 5% по сравнению с Fc доменом природного IgG1 (или биспецифической антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению, включающей Fc домен природного IgG1). В одном объекте Fc домен (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, включающая указанный Fc домен) не связывается в значительной степени с Fc рецептором и/или не индуцирует эффекторную функцию. В предпочтительном объекте Fc рецептор представляет собой Fcγ рецептор. В одном объекте Fc рецептором является Fc рецептор человека. В одном объекте Fc рецептор представляет собой активирующий Fc рецептор. В особом объекте Fc рецептором является активирующий Fcγ рецептор человека, более предпочтительно FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa рецептор человека, наиболее предпочтительно FcγRIIIa рецептор человека. В одном объекте Fc рецептор представляет собой ингибирующий Fc рецептор. В особом варианте Fc рецептором является ингибирующий Fcγ рецептор человека, более предпочтительно FcγRIIB рецептор человека. В одном объекте эффекторной функцией является одна или более из следующих активностей CDC, ADCC, ADCP и секреция цитокинов. В предпочтительном объекте эффекторной функцией является ADCC. В одном объекте Fc домен характеризуется в значительной степени аналогичной связывающей аффинностью по сравненью с неонатальным Fc рецептором (FcRn), по сравнению с Fc доменом природного IgG1. В значительной степени аналогичное связывание с FcRn достигается в случае, когда Fc домен (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, включающая указанный Fc домен) характеризуется связывающей аффинностью приблизительно более 70%, предпочтительно приблизительно более 80%, более предпочтительно приблизительно более 90% связывающей аффинности Fc домена природного IgG1 (или биспецифической антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению, включающей Fc домен природного IgG1) по сравнению с FcRn.

В предпочтительном объекте Fc домен конструируют для получения сниженной связывающей аффинности к Fc рецептору и/или сниженной эффекторной функции по сравнению с несконструированным Fc доменом. В предпочтительном объекте Fc домен биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению содержит одну или более аминокислотных мутаций, которые снижают связывающую аффинность Fc домена к Fc рецептору и\или эффекторную функцию. Обычно одна или более одинаковых аминокислотных мутаций присутствуют в каждой из двух субъединиц Fc домена. В одном объекте аминокислотные мутации снижают связывающую аффинность Fc домена к Fc рецептору. В другом объекте аминокислотная мутация снижает связывающую аффинность Fc домена к Fc рецептору по крайней мере в 2 раза, по крайней мере в 5 раз или по крайней мере в 10 раз. В одном объекте биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, включающая сконструированный Fc домен, характеризуется связывающей аффинностью к Fc рецептору менее 20%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5% связывающей аффинностью Fc рецептора по сравнению с биспецифическими антителами по настоящему изобретению, включающими несконструированный Fc домен. В предпочтительном объекте Fc рецептор представляет собой Fcγ рецептор. В других объектах Fc рецептором является Fc рецептор человека. В одном объекте Fc рецептор представляет собой ингибирующий Fc рецептор. В особом варианте Fc рецептором является ингибирующий Fcγ рецептор человека, более предпочтительно FcγRIIB рецептор человека. В одном объекте Fc рецептор представляет собой активирующий Fc рецептор. В особом объекте Fc рецептором является активирующий Fcγ рецептор человека, более предпочтительно FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa рецептор человека, наиболее предпочтительно FcγRIIIa рецептор человека. Предпочтительно снижается связывание к каждому из указанных рецепторов. В некоторых объектах связывающая аффинность к компоненту комплемента, особенно связывающая аффинность к C1q, также снижается. В одном объекте связывающая аффинность к неонатальному Fc рецептору (FcRn) не снижается. В значительной степени аналогичное связывание к FcRn, то есть сохранение связывающей аффинности Fc домена к указанному рецептору, достигается, когда Fc домен (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, включающая указанный Fc домен) проявляет связывающую аффинность на уровне приблизительно более 70% по сравнению со связыванием несконструированной формы Fc домена (или биспецифическая антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, включающей указанный Fc домен) с FcRn. Fc домен или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, включающая указанный Fc домен, может проявлять аффинность на уровне приблизительно более 80% и даже приблизительно более 90% по сравнению с указанной аффинностью. В некоторых вариантах Fc домен биспецифического антитела по настоящему изобретению конструируют для снижения эффекторной функции по сравнению с несконструированным Fc доменом. Сниженная эффекторная функция включает, но, не ограничиваясь только ими, одно или более следующих свойств: сниженная комплемент зависимая-цитотоксичность (CDC), сниженная антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), сниженный антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), сниженная секреция цитокинов, снижение опосредованного иммунным комплексом захвата антигена антигенпрезентирующими клетками, сниженное связывание с NK клетками, сниженное связывание с макрофагами, сниженное связывание с моноцитами, сниженное связывание с полиморфноядерными клетками, снижение прямой передачи сигналов, индуцирующих апоптоз, сниженное созревание дендритных клеток или сниженный прайминг Т клеток.

Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более следующих остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 в Fc области (патент США 6737056). Такие Fc мутантные формы включают Fc мутантные формы с заменами двух или более следующих аминокислот в положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый Fc мутант "DANA" с заменами остатков 265 и 297 на аланин (патент США 7332581). Определенные варианты антител с улучшенным или сниженным связыванием с FcR описаны в работах, например, в патенте США 6737056, заявке WO 2004/056312 и статье Shields R.L. и др., J. Biol. Chem., 276, сс.6591-6604 (2001).

В одном объекте настоящего изобретения Fc домен включает замены аминокислот в положениях Е233, L234, L235, N297, Р331 и Р329. В некоторых объектах Fc домен включает замены аминокислот в положениях L234A и L235A ("LALA"). В одном таком варианте Fc домен представляет собой Fc домен IgG1, предпочтительно Fc домен IgG1 человека. В одном объекте Fc домен включает замену аминокислоты в положении Р329. В более конкретном объекте замены аминокислот включают Р329А или P329G, предпочтительно P329G. В одном варианте Fc домен включает замену аминокислоты в положении Р329, и кроме того замену аминокислоты выбирают из группы, включающей Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. В более предпочтительных вариантах Fc домен включает следующие аминокислотные мутации L234A, L235A и P329G ("P329G LALA"). Комбинация замен "P329G LALA" практически полностью исключает связывание Fcγ рецептора с Fc доменом IgG1, как описано в заявке РСТ № WO 2012/130831 А1. В указанном документе описаны также методы получения таких Fc доменов и методы оценки их свойств, таких как связывание с Fc рецептором или их эффекторные свойства. Таким антителом является IgG1 с мутациями L234A и L235A или с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация по EU индексу Кабата, Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

В одном объекте биспецифическое антитело по настоящему изобретению включает (все положения пронумерованы по EU индексу Кабата) (i) гомодимерную Fc область подкласса IgG1 человека необязательно с мутациями P329G, L234A и L235A, или (ii) гомодимерную Fc область подкласса IgG4 человека необязательно с мутациями P329G, S228P и L235E, или (iii) гомодимерную Fc область подкласса IgG1 человека необязательно с мутациями P329G, L234A, L235A, I253A, Н310А, и Н435А, или необязательно с мутациями P329G, L234A, L235A, Н310А, Н433А, и Y436A, или (iv) гетеродимерную Fc область, где одна полипептидная Fc область включает мутацию T366W, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A и Y407V, или где одна полипептидная Fc область включает мутации T366W и Y349C, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A, Y407V и S354C, или где одна полипептидная Fc область включает мутации T366W и S354C, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C, или (v) гетеродимерную Fc область подкласса IgG1 человека, где обе полипептидные Fc области включают мутации P329G, L234A и L235A, и одна полипептидная Fc область включает мутацию T366W, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A и Y407V, или где одна полипептидная Fc область включает мутации T366W и Y349C, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A, Y407V, и S354C, или где одна полипептидная Fc область включает мутации T366W и S354C, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C.

В одном объекте Fc домен представляет собой Fc домен IgG4. В более подробном варианте Fc доменом является Fc домен IgG4, включающий аминокислотную замену в положении S228 (нумерация по Кабату), предпочтительно аминокислотную замену S228P. В другом варианте Fc домен представляет собой Fc домен IgG4, включающий аминокислотные замены L235E, S228P и P329G. Такая аминокислотная замена снижает in vivo обмен Fab плеч в антителах IgG4 (см. Stubenrauch и др.. Drug Metabolism and Disposition, 38, cc. 84-91 (2010)). Таким образом, в одном объекте настоящего изобретения предлагается биспецифическое антитело, включающее (все положения пронумерованы по EU индексу по Кабату) гетеродимерную Fc область подкласса IgG4 человека, где обе полипептидные Fc области включают мутации P329G, S228P и L235E, и одна полипептидная Fc область включает мутацию Т T366W, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A и Y407V, или где одна полипептидная Fc область включает мутации T366W и Y349C, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A, Y407V и S354C, или где одна полипептидная Fc область включает мутации T366W и S354C, а другая полипептидная Fc область включает мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C.

Антитела с увеличенными временами полураспада и улучшенным связыванием с неонатальным Fc рецептором (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (статьи Guyer R.L. и др., J. Immunol., 117, cc. 587-593 (1976) и Kim J.K. и др., J. Immunol., 24, cc. 2429-2434 (1994)), описаны в патенте США 2005/0014934. Такие антитела включают Fc область с одной или более заменами, которые улучшают связывание Fc области с FcRn. Такие Fc варианты включают варианты замен одного или более остатков в Fc области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену остатка 434 в Fc области 434 (патент США 7371826). См. также документы Duncan A.R. и Winter G., Nature, 322, ее. 738-740 (1988), патенты США 5648260, 5624821 и заявку WO 94/29351, в которых описаны другие примеры вариантов Fc области.

Связывание с Fc рецепторами легко определить, например, с использованием методов ИФА или ППР и с использованием стандартных приборов, таких как BIAcore (GE Healthcare), a Fc рецепторы можно получать методом рекомбинантной экспрессии. В данном контексте описан такой пригодный метод связывания. В другом варианте связывающую аффинность Fc доменов или активирующие клетки биспецифическое антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc домен для Fc рецепторов, можно оценить с использованием известных клеточных линий, экспрессирующих определенные Fc рецепторы, такие как NK клетки человека, экспрессирующие FcγIIIa рецептор человека. Эффекторную функцию Fc домена или биспецифических антител по настоящему изобретению, включающих Fc домен, можно оценивать методами, известными в данной области техники. Пригодный способ измерения ADCC описан в данном контексте. Другие примеры анализов in vitro для оценки ADCC исследуемой молекулы описаны в патенте США №5500362, в статьях Hellstrom и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, cc. 7059-7063 (1986) и Hellstrom и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, cc. 1499-1502 (1985), в патенте США №5821337, в статье Bruggemann и др., J. Exp. Med., 166, cc. 1351-1361 (1987). В другом варианте можно использовать нерадиоактивные методы анализа (см., например, нерадиоактивный метод определения цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA), и нерадиоактивный метод определения цитотоксичности CytoTox® 96 (Promega, Madison, WI)). Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают моноядерные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-киллеры (NK). В другом варианте или дополнительно, активность ADCC исследуемой молекулы можно оценивать in vivo, например, на модели животных, такой как описано в работе Clynes и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, cc. 652-656 (1998).

Модификации Fc домена, способствующие гетеродимеризации

Биспецифическое антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению включают различные антигенсвязывающие участки, присоединенные к одной или другой из двух субъединиц Fc домена, вследствие чего две субъединицы Fc домена могут содержать две неидентичные полипептидные цепи. Рекомбинантная коэкспрессия таких полипептидов и последующая димеризация приводят к образованию нескольких возможных комбинаций двух полипептидов. Для улучшения выхода и чистоты биспецифических антител по настоящему изобретению при рекомбинантном продуцировании предпочтительно введение в Fc домен биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению модификации, способствующей ассоциации требуемых полипептидов.

Соответственно, предпочтительные объекты настоящего изобретения относятся к биспецифическому антителу, включающему первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где Fc домен содержит модификацию, способствующую ассоциации первой и второй субъединиц Fc домена. Участок наиболее интенсивного белок-белкового взаимодействия между двумя субъединицами Fc домена IgG человека расположен в СН3 домене Fc домена. Таким образом, в одном объекте модификацию осуществляют в СН3 домене Fc домена.

В особом объекте указанная модификация представляет собой, так называемую модификацию "выступ-во-впадину", включающую модификацию "выступ" в одной из двух субъединиц Fc домена и модификацию "впадина" в другой из двух субъединиц Fc домена. Таким образом, настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, включающему первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM3, где первая субъединица Fc домена содержит выступы, а вторая субъединица Fc домена содержит впадины согласно методу выступ-во-впадину. В предпочтительном объекте первая субъединица Fc домена содержит аминокислотные замены S354C и T366W (EU нумерация), и вторая субъединица Fc домена содержит аминокислотные замены Y349C, T366S и Y407V (нумерация по EU индексу Кабата).

Технология выступ-во-впадину описана, например, в патентах США №№5731168, 7695936, работах Ridgway и др., Prot. Eng., 9, cc.617-621 (1996) и Carter, J. Immunol. Meth., 248, cc. 7-15 (2001). Обычно данный способ включает введение выпуклости ("выступа") на границе раздела первого полипептида и соответствующую полость ("впадину") на границе раздела второго полипептида, таким образом, что выпуклость может быть расположена в полости для ускорения образования гетеродимера и затруднения образования гомодимера. Выпуклости конструируют при замене небольших боковых цепей аминокислот на большие по размеру боковые цепи (например, тирозин и триптофан). Компенсирующие полости идентичного или меньшего размера по сравнению с размером выпуклостей создают на поверхности второго полипептида при замене боковых групп аминокислот большого размера на меньшие (например, аланин или треонин).

Соответственно, в одном объекте в СН3 домене первой субъединицы Fc домена биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток с боковой цепью большего объема, при этом получают выпуклость в СН3 домене первой субъединицы, которая размещается в полости СН3 домена второй субъединицы, и в СН3 домене второй субъединицы Fc домена аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток с боковой цепью меньшего объема, при этом получают полость в СН3 домене второй субъединицы, в которой размещается выпуклость в СН3 домене первой субъединицы. Выпуклость и полость можно получать при изменении нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, например, например, сайт-специфичным мутагенезом, или пептидным синтезом. В особом объекте в СН3 домене первой субъединицы Fc домена остаток треонина в положении 366 заменен на остаток триптофана (T366W), и в СН3 домене второй субъединицы Fc домена остаток тирозина в положении 407 заменен на остаток валина (Y407V). В одном объекте во второй субъединице Fc домена дополнительно остаток треонина в положении 366 заменен на остаток серина (T366S) и остаток лейцина в положении 368 заменен на остаток аланина (L368A).

В другом объекте в первой субъединице Fc домена дополнительно остаток серина в положении 354 заменен на остаток цистеина (S354C), и во второй субъединице Fc домена дополнительно остаток тирозина в положении 349 заменен на остаток цистеина (Y349C). Введение таких двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидной связи между двумя субъединицами Fc домена, дополнительно стабилизируя димер (Carter J., Immunol. Methods, 248, cc. 7-15 (2001)). В конкретном объекте первая субъединица Fc домена включает аминокислотные замены S354C и T366W (EU нумерация), а вторая субъединица Fc домена включает аминокислотные замены Y349C, T366S и Y407V (нумерация по EU индексу Кабата).

В других вариантах или дополнительно можно использовать другие методики выступ-во-впадину, как описано в ЕР 1870459. В одном варианте мультиспецифическое антитело включает мутации R409D и K370E в СН3 домене "цепь с выступом" и мутации D399K и E357K в СН3 домене "цепь с впадиной" (нумерация по EU индексу Кабата).

В одном объекте биспецифическое антитело включает мутацию T366W в СН3 домене "цепь с выступом" и мутации T366S, L368A и Y407V в СН3 домене "цепь с впадиной" и дополнительно мутации R409D и K370E в СН3 домене "цепь с выступом" и мутации D399K и Е357K в СН3 домене "цепь с впадиной" (нумерация по EU индексу Кабата).

В одном объекте биспецифическое антитело включает мутации Y349C и T366W в одном из двух СН3 доменов и мутации S354C, T366S, L368A и Y407V в другом из двух СН3 доменов, или мультиспецифическое антитело включает мутации Y349C и T366W в одном из двух СН3 доменов и мутации S354C, T366S, L368A и Y407V в другом из двух СН3 доменов, а также дополнительно включает мутации R409D и K370E в СН3 домене "цепь с выступом" и мутации D399K и Е357К в СН3 домене "цепь с впадиной" (нумерация по EU индексу Кабата).

В другом объекте модификация, ускоряющая ассоциацию первой и второй субъединиц Fc домена, включает модификацию, опосредованную электростатическими эффектами, например, как описано в публикации РСТ WO 2009/089004. Обычно данная методика включает замену одного или более аминокислотных остатков на границе раздела двух субъединиц Fc домена на заряженные аминокислотные остатки таким образом, что образование гомодимера становится электростатически невыгодным процессом, а гетеродимеризация становится электростатически выгодным процессом.

Кроме методики "выступ-во-впадину" в данной области техники известны другие методики модификации СН3 доменов тяжелых цепей мультиспецифического антитела для обеспечения гетеродимеризации. Данные методики, особенно описанные в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 и WO 2013/096291, рассматриваются в данном контексте в качестве альтернативы методике "выступ-во-впадину" в комбинации с биспецифическими антителом.

В одном объекте в биспецифическом антителе использовали подход, описанный в ЕР 1870459, для обеспечения гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифического антитела. Данный подход основан на введении заряженных аминокислот с противоположными зарядами в определенные аминокислотные положения на поверхности раздела СН3/СН3 доменов между первой и второй тяжелыми цепями.

Соответственно, в данном объекте в третичной структуре мультиспефического антитела СН3 домен первой тяжелой цепи и СН3 домен второй тяжелой цепи образуют поверхность раздела, которая расположена между соответствующими СН3 доменами антитела, где соответствующие аминокислотные последовательности СН3 домена первой тяжелой цепи и аминокислотная последовательность СН3 домена второй тяжелой цепи включают набор аминокислот, расположенных на указанной поверхности раздела в третичной структуре антитела, где в составе набора аминокислот, которые расположены на поверхности раздела СН3 домена одной тяжелой цепи, первая аминокислота заменена на положительно заряженную аминокислоту, и в составе набора аминокислот, которые расположены в поверхности раздела СН3 домена другой тяжелой цепи, вторая аминокислота заменена на отрицательно заряженную аминокислоту. Биспецифическое антитело по данному объекту в данном контексте также обозначают как "СН3(+/-)-сконструированное биспецифическое антитело" (где знак "+/-" означает противоположно заряженные аминокислоты, введенные в соответствующие СН3 домены).

В одном объекте в СН3(+/-)-сконструированном биспецифическом антителе положительно заряженную аминокислоту выбирают из K, R и Н, и отрицательно заряженную аминокислоту выбирают из Е или D.

В одном объекте в СН3(+/-)-сконструированном биспецифическом антителе положительно заряженную аминокислоту выбирают из K и R, и отрицательно заряженную аминокислоту выбирают из Е или D.

В одном объекте в СН3(+/-)-сконструированном биспецифическом антителе положительно заряженной аминокислотой является K, и отрицательно заряженной аминокислотой является Е.

В одном объекте в СН3(+/-)-сконструированном биспецифическом антителе в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота R в положении 409 заменена на D и аминокислота К заменена на Е, и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 399 заменена на К и аминокислота Е в положении 357 заменена на К (нумерация по EU индексу Кабата).

В одном объекте использовали подход, описанный в заявке WO 2013/157953, для обеспечения гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифического антитела. В одном варианте в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на К, и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на D (нумерация по EU индексу Кабата). В другом варианте в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на К, и аминокислота L в положении 351 заменена на К, а в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на К (нумерация по EU индексу Кабата).

В другом варианте в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на К, и аминокислота L в положении 351 заменена на К и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на D (нумерация по EU индексу Кабата). Кроме того, по крайней мере одна из следующих замен включена в СН3 домен другой тяжелой цепи: аминокислота Y в положении 349 заменена на Е, аминокислота Y в положении 349 заменена на D и аминокислота L в положении 368 заменена на Е (нумерация по EU индексу Кабата). В одном варианте аминокислота L в положении 368 заменена на Е (нумерация по EU индексу Кабату).

В одном объекте использовали подход, описанный в заявке WO 2012/058768 для обеспечения гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифического антитела. В одном объекте в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на Y и аминокислота Y в положении 407 заменена на А, и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на А и аминокислота К в положении 409 заменена на F (нумерация по EU индексу Кабата). В другом варианте кроме упомянутых выше замен в СН3 домене другой тяжелой цепи по крайней мере одна из аминокислот в положениях 411 (исходно Т), 399 (исходно D), 400 (исходно S), 405 (исходно F), 390 (исходно N) и 392 (исходно К) заменена (нумерация по EU индексу по Кабату). Предпочтительными заменами являются:

- замена аминокислоты Т в положении 411 на аминокислоту, выбранную из N, R, Q, К, D, Е и W (нумерация по EU индексу Кабата),

- замена аминокислоты D в положении 399 на аминокислоту, выбранную из R, W, Y и K (нумерация по EU индексу Кабата),

- замена аминокислоты S в положении 400 на аминокислоту, выбранную из Е, D, R и K (нумерация по EU индексу Кабата),

- замена аминокислоты F в положении 405 на аминокислоту, выбранную из I, М, Т, S, V и W (нумерация по EU индексу Кабата),

- замена аминокислоты N в положении 390 на аминокислоту, выбранную из R, K и D (нумерация по EU индексу Кабата) и

- замена аминокислоты K в положении 392 на аминокислоту, выбранную из V, М, R, L, F и Е (нумерация по EU индексу Кабата).

В другом объекте биспецифическое антитело конструируют согласно заявке WO 2012/058768), то есть в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на Y и аминокислота Y в положении 407 заменена на А, и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на V и аминокислота K в положении 409 заменена на F (нумерация по EU индексу Кабата). В другом варианте осуществления мультиспецифического антитела в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на А, и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на А и аминокислота K в положении 409 заменена на F (нумерация по EU индексу Кабата). В последнем упомянутом варианте в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота K в положении 392 заменена на Е, и аминокислота Т в положении 411 заменена на Е, и аминокислота D в положении 399 заменена на R и аминокислота S в положении 400 заменена на R (нумерация по EU индексу Кабата).

В одном объекте использовали подход, описанный в заявке WO 2011/143545, для обеспечения гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифического антитела. В одном объекте аминокислотные модификации в СН3 доменах обеих тяжелых цепей вводили в положениях 368 и/или 409 (нумерация по EU индексу Кабата).

В одном объекте использовали подход, описанный в заявке WO 2011/090762, для обеспечения гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифического антитела. В заявке WO 2011/090762 описаны аминокислотные модификации согласно методике "выступ-во-впадину" (КМ). В одном варианте в CH3 домене одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на W, и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на А (нумерация по EU индексу Кабата). В другом варианте в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на Y, и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на Т (нумерация по EU индексу Кабата).

В одном объекте использовали подход, описанный в заявке WO 2009/089004 для обеспечения гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифического антитела. В одном варианте в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота K или N в положении 392 заменена на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном варианте на Е или D, в одном предпочтительном варианте на D), и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 399, аминокислота Е или D в положении 356 или аминокислота Е в положении 357 заменены на положительно заряженную аминокислоту (в одном варианте на K или R, в одном предпочтительном варианте на K, в одном предпочтительном варианте аминокислоты в положениях 399 или 356 заменены на K) (нумерация по EU индексу Кабата). В одном другом варианте кроме упомянутых выше замен в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота K или R в положении 409 заменена на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном варианте на Е или D, в другом предпочтительном варианте на D) (нумерация по EU индексу Кабата). В еще одном объекте, кроме упомянутых выше замен в СН3 домене одной тяжелой цепи, аминокислота K в положении 439 и/или аминокислота K в положении 370 независимо друг от друга заменены на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном предпочтительном варианте на Е на D, в другом предпочтительном варианте на D) (нумерация по EU индексу Кабата).

В одном объекте использовали подход, описанный в заявке WO 2007/147901 для обеспечения гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифического антитела. В одном варианте в СН3 домене одной тяжелой цепи аминокислота K в положении 253 заменена на Е, аминокислота D в положении 282 заменена на K и аминокислота K в положении 322 заменена на D, и в СН3 домене другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 239 заменена на K, аминокислота Е в положении 240 заменена на K и аминокислота K в положении 292 заменена на D (нумерация по EU индексу Кабата).

С-концевой фрагмент тяжелой цепи биспецифического антитела, как описано в данном контексте, может представлять собой полноразмерный С-концевой фрагмент, содержащий аминокислотные остатки PGK. С-концевой фрагмент тяжелый цепи может представлять собой укороченный С-концевой фрагмент, из которого были удалены одна или две С-концевые аминокислоты. В одном предпочтительном варианте С-концевой фрагмент тяжелой цепи представляет собой укороченный С-концевой фрагмент, содержащий аминокислотные остатки PG.

В одном из всех объектов, описанных в данном контексте, биспецифическое антитело, включающее тяжелую цепь, включающую С-концевой СН3 домен, как описано в данном контексте, включает С-концевой дипептид глицин-лизин (G446 и K447, нумерация по EU индексу Кабата). В одном из всех объектов, описанных в данном контексте, биспецифическое антитело, включающее тяжелую цепь, включающую С-концевой СН3 домен, как описано в данном контексте, включает С-концевой остаток глицина (G446, нумерация по EU индексу Кабата).

Модификации Fab доменов

В одном объекте настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, включающему первый Fab фрагмент, который специфично связывается с PD1, и второй Fab фрагмент, который специфично связывается с TIM3, где в одном из Fab фрагментов заменены друг на друга либо вариабельные домены VH и VL, либо консервативные домены СН1 и CL. Биспецифическое антитела получают по методике Crossmab.

Мультиспецифические антитела с заменой/обменом доменов в одном связывающем плече (CrossMabVH-VL или CrossMabCH-CL) подробно описаны в заявке WO 2009/080252 и работе Schaefer W. и др., PNAS, 108, Icc. 1187-1191 (2011). Они явно снижают образование побочных продуктов, которое связано с ошибочным спариванием легкой цепи по отношению к первому антигену с неправильной тяжелой цепью по отношению ко второму антигену (по сравнению с подходами без указанного обмена доменов).

В предпочтительном объекте настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, включающему первый Fab фрагмент, который специфично связывается с PD1, и второй Fab фрагмент, который специфично связывается с TIM3, где в одном из Fab фрагментов вариабельные домены VH и VL заменены друг на друга таким образом, что VH домен является частью легкой цепи, а VL домен является частью тяжелой цепи. В предпочтительном объекте биспецифическими антителом является антитело, в котором первый Fab фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга.

В одном объекте для дополнительного улучшения правильного спаривания биспецифическое антитело, включающее первый Fab фрагмент, который специфично связывается с PD1, и второй Fab фрагмент, который специфично связывается с TIM3, могут содержать различные заряженные аминокислотные замены (так называемые «заряженные остатки»). Такие модификации включены в перекрестные или неперекрестные СН1 и CL домены.

В предпочтительном объекте настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, включающему первый Fab фрагмент, который специфично связывается с PD1, и второй Fab фрагмент, который специфично связывается с TIM3, где в одном из Fab фрагментов в консервативном CL домене аминокислота в положении 124 независимо заменена на лизин (К), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация согласно EU индекса Кабата), и в консервативном СН1 домене аминокислоты в положениях 147 и 213 независимо заменены на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU индексу Кабата). В предпочтительном объекте биспецифическими антителом является антитело, где во втором Fab фрагменте, включающем антигенсвязывающий участок, специфично связывающийся с TIM3, в консервативном CL домене аминокислота в положении 124 независимо заменена на лизин (К), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация согласно EU индекса Кабата), и в консервативном СН1 домене аминокислоты в положениях 147 и 213 независимо заменены на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU индексу Кабатау).

В предпочтительном объекте настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, включающему первый Fab фрагмент, который специфично связывается с PD1, и второй Fab фрагмент, который специфично связывается с TIM3, где в одном из CL доменов аминокислота в положении 123 (нумерация по EU индексу) заменена на аргинин (R) и аминокислота в положении 124 (нумерация по EU индексу) заменена на лизин (K) и где в одном из СН1 доменов аминокислоты в положениях 147 (нумерация по EU индексу) и 213 (нумерация по EU индексу) заменена на глутаминовую кислоту (Е). В предпочтительном объекте биспецифическими антителом является антитело, в котором во втором Fab фрагменте, включающем антигенсвязывающий участок, специфично связывающийся с TIM3, аминокислота в положении 123 (нумерация по EU индексу) заменена на аргинин (R) и аминокислота в положении 124 (нумерация по EU индексу) заменена на лизин (K) и где в одном из СН1 доменов аминокислоты в положении 147 (нумерация по EU индексу) и в положении 213 (нумерация по EU индексу) заменена на глутаминовую кислоту (Е).

В другом объекте биспецифическое антитело представляет собой двухвалентное антитело, включающее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга.

Антитело по п. а) не содержит модификаций, как описано в п. в), а тяжелая цепь и легкая цепь по п. а) являются изолированными цепями.

В антителе по п. б) в легкой цепи вариабельный домен VL легкой цепи заменен на вариабельный домен VH тяжелой цепи указанного антитела, и вариабельный домен VH тяжелой цепи заменен на вариабельный домен VL легкой цепи указанного антитела.

В одном объекте (i) в консервативном домене CL первой легкой цепи по п. а) аминокислота в положении 124 (нумерация по Кабату) заменена на положительно заряженную аминокислоту, и где в консервативном домене СН1 первой тяжелой цепи по п. а) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация согласно EU индекса Кабата) заменена на отрицательно заряженную кислоту, и (ii) в консервативном домене CL второй легкой цепи по п. б) аминокислота в положении 124 (нумерация по Кабату) заменена на положительно заряженную кислоту, и где в консервативном домене СН1 второй тяжелой кислоты по п. б) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация по EU индексу Кабата) заменена на отрицательно заряженную аминокислоту.

В другом объекте (i) в консервативном домене CL первой легкой цепи по п. а) аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация по Кабату) (в одном предпочтительном варианте заменена независимо на лизин (К) или аргинин (R)), и где в консервативном домене СН1 первой тяжелой цепи по п. а) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация по EU индексу Кабата), или (ii) в консервативном домене CL второй легкой цепи по п. б) аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация по Кабату) (в одном предпочтительном варианте независимо на лизин (К) или аргинин (R)), и где в консервативном домене СН1 второй легкой цепи по п. б) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU индексу Кабата).

В одном объекте в консервативном домене CL второй тяжелой цепи аминокислоты в положениях 124 и 123 заменены на К (нумерация согласно индексу EU Кабата).

В одном объекте в консервативном домене CL второй тяжелой цепи аминокислота в положении 123 заменена на R и аминокислота в положении 124 заменена на К (нумерация согласно индексу EU Кабата).

В одном объекте в консервативном домене СН1 второй легкой цепи аминокислоты в положениях 147 и 213 заменены на Е (нумерация согласно индексу EU Кабата).

В одном объекте в консервативном домене CL первой легкой цепи аминокислоты в положениях 124 и 123 заменены на К, и в консервативном домене СН1 первой тяжелой цепи аминокислоты в положениях 147 и 213 заменены на Е (нумерация согласно индексу EU Кабата).

В одном объекте в консервативном домене CL первой легкой цепи аминокислота в положении 123 заменена на R и аминокислота в положении 124 заменена на К, и в консервативном домене СР1 первой тяжелой цепи обе аминокислоты в положениях 147 и 213 заменены на Е (нумерация согласно индексу EU Кабата).

В одном объекте в консервативном домене CL второй тяжелой цепи аминокислоты в положениях 124 и 123 заменены на К, и где в консервативном домене СН1 второй легкой цепи аминокислоты в положениях 147 и 213 заменены на Е, и в вариабельном домене VL первой легкой цепи аминокислота в положении 38 заменена на К, и в вариабельном домене VH первой тяжелой цепи аминокислота в положении 39 заменена на Е, и в вариабельном домене VL второй тяжелой цепи аминокислота в положении 38 заменена на К, и в вариабельном домене VH второй легкой цепи аминокислота в положении 39 заменена на Е (нумерация согласно индексу EU Кабата).

В одном объекте биспецифическими антителом является двухвалентное антитело, включающее

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга, и где консервативные домены CL и СН1 второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга.

Антитело по п. а) не содержит модификаций, описанных в п. б), и тяжелая цепь и легкая цепь по п. а) представляют собой изолированные цепи. В антителе по п. б) в легкой цепи вариабельный домен VL легкой цепи заменен на вариабельный домен VH тяжелой цепи указанного антитела, и консервативный домен CL легкой цепи заменен на консервативный домен СН1 тяжелой цепи указанного антитела, и вариабельный домен VH тяжелой цепи заменен на вариабельный домен VL легкой цепи, и консервативный домен СН1 тяжелой цепи заменен на консервативный домен CL легкой цепи указанного антитела.

В одном объекте биспецифическим антителом является двухвалентное антитело, включающее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося со вторым антигеном, где консервативные домены CL и СН1 второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга.

Антитело по п. а) не содержит модификаций, описанных в п. б), и тяжелая цепь и легкая цепь по п. а) представляют собой изолированные цепи. В антителе по п. б) консервативный домен CL легкой цепи заменен на консервативный домен СН1 тяжелой цепи указанного антитела, и консервативный домен СН1 тяжелой цепи заменен на консервативный домен CL легкой цепи указанного антитела.

В одном объекте мультиспецифическим антителом является мультиспецифическое антитело, включающее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) один, два, три или четыре одноцепочечных Fab фрагментов, специфично связывающихся с одним-четырьмя другими антигенами (то есть со вторым и/или третьим и/или четвертым и/или пятым антигеном, предпочтительно специфично связывающихся с одним другим антигеном, то есть со вторым антигеном),

где указанные одноцепочечные Fab фрагменты по п. б) присоединены к полноразмерному антителу по п. а) через пептидный линкер к С- или N-концевому фрагменту тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном объекте один или два идентичных одноцепочечных Fab фрагмента, связывающихся со вторым антигеном, присоединены к полноразмерному антителу через пептидный линкер к С-концевому фрагменту тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном объекте один или два идентичных одноцепочечных Fab фрагмента, связывающихся со вторым антигеном, присоединены к полноразмерному антителу через пептидный линкер к С-концевому фрагменту тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела.

В одном объекте один или два идентичных одноцепочечных Fab фрагмента, связывающихся со вторым антигеном, присоединены к полноразмерному антителу через пептидный линкер к С-концевому фрагменту легких цепей указанного полноразмерного антитела.

В одном объекте один или два идентичных одноцепочечных Fab фрагмента, связывающихся со вторым антигеном, присоединены к полноразмерному антителу через пептидный линкер к С-концевому фрагменту каждой тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном объекте один или два идентичных одноцепочечных Fab фрагмента, связывающихся со вторым антигеном, присоединены к полноразмерному антителу через пептидный линкер к С-концевому фрагменту каждой тяжелой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном объекте один или два идентичных одноцепочечных Fab фрагмента, связывающихся со вторым антигеном, присоединены к полноразмерному антителу через пептидный линкер к С-концевому фрагменту каждой легкой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном объекте биспецифическое антитело является трехвалентным антителом, включающим:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и содержащее две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи антитела,

б) первый полипептид, состоящий из

ба) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела, или

бб) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела и консервативного домена 1 (СН1) антитела,

где указанный первый полипептид присоединен к N-концевому фрагменту его VH домена через пептидный линкер к С-концевому фрагменту одной из двух тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела,

в) второй полипептид, состоящий из

ва) вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела, или

вб) вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела и консервативного домена легкой цепи (CL) антитела, и

где указанный второй полипептид присоединен к N-концевому фрагменту его VL домена через пептидный линкер к С-концевому фрагменту другой из двух тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела,

где вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела первого полипептида и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела второго полипептида вместе образуют антигенсвязывающий участок, специфично связывающийся со вторым антигеном.

В одном объекте вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела полипептида по п. б) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела полипептида по п. в) соединены и стабилизированы через межцепную дисульфидную связь между следующими положениями:

(i) положение 44 вариабельного домена тяжелой цепи и положение 100 вариабельного домена легкой цепи, или

(ii) положение 105 вариабельного домена тяжелой цепи и положение 43 вариабельного домена легкой цепи, или

(iii) положение 101 вариабельного домена тяжелой цепи и положение 100 вариабельного домена легкой цепи (нумерация по EU индексу Кабата).

Методики введения неприродных дисульфидных связей для стабилизации описаны, например, в документах WO 94/029350, Rajagopal V. и др., Prot. Eng., сс. 1453-1459 (1997), Kobayashi Н. и др., Nucl. Med. Biol., 25, сс. 387-393 (1998) и Schmidt М. и др., Oncogene, 18, сс. 1711-1721 (1999). В одном варианте необязательная дисульфидная связь между вариабельными доменами полипептидов по п. б) и п. в) образована между вариабельным доменом тяжелой цепи в положении 44 и вариабельным доменом легкой цепи в положении 100. В одном варианте необязательная дисульфидная связь между вариабельными доменами полипептидов по п. б) и п. в) образована между вариабельным доменом тяжелой цепи в положении 105 и вариабельным доменом легкой цепи в положении 43 (нумерация по Кабату). В одном варианте предпочтительным является трехвалентное биспецифическое антитело, не содержащее указанной необязательной дисульфильфидной стабилизации между VH и VL доменами одноцепочечных Fab фрагментов.

В одном объекте биспецифическое антитело является триспецифическим или тетраспецифическим антителом, включающим:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь полноразмерного антитела, специфично связывающегося с первым антигеном, и

б) вторую (модифицированную) легкую цепь и вторую (модифицированную) тяжелую цепь полноразмерного антитела, которое специфично связывается со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и/или где консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и

в) где от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, которые специфично связываются с одним или двумя другими антигенами (то есть с третьим и/или четвертым антигеном), присоединены через пептидный линкер к С- или N-концевому фрагменту легких цепей или тяжелых цепей по п. а) и/или п. б).

Антитело по п. а) не содержит модификаций, описанных в п. б), а тяжелая и легкая цепь по п. а) представляют собой изолированные цепи.

В одном объекте триспецифическое или тетраспецифическое антитело включает один или два антигенсвязывающих пептидов по п. в), которые специфично связываются с одним или двумя другими антигенами.

В одном объекте антигенсвязывающие пептиды выбирают из группы, состоящей из scFv фрагмента и scFab фрагмента.

В одном объекте антигенсвязывающие пептиды представляют собой scFv фрагменты.

В одном объекте антигенсвязывающие пептиды представляют собой scFab фрагменты.

В одном объекте антигенсвязывающие пептиды присоединены к С-концевому фрагменту тяжелых цепей по п. а) и/или п. б).

В одном объекте три специфическое или тетра специфическое антитело включает один или два антигенсвязывающих пептида по п. в), которые специфично связываются с одним другим антигеном.

В одном объекте три специфическое или тетра специфическое антитело включает два идентичных антигенсвязывающих пептида по п. в), которые специфично связываются с третьим антигеном. В одном предпочтительном варианте такие два идентичные антигенсвязывающие пептиды оба связаны через один и тот же пептидный линкер к С-концевому фрагменту тяжелых цепей по п. а) или п. б). В одном предпочтительном варианте два идентичных антигенсвязывающих пептида являются scFv фрагментом или scFab фрагментом.

В одном объекте три специфическое или тетра специфическое антитело включает два антигенсвязывающих пептида по п. в), которые специфично связываются с третьим и четвертым антигеном. В одном предпочтительном варианте такие два антигенсвязывающие пептиды оба присоединены через один и тот же пептидный линкер к С-концевому фрагменту тяжелых цепей по п. а) или п. б). В одном предпочтительном варианте два идентичных антигенсвязывающих пептида являются scFv фрагментом или scFab фрагментом.

В одном объекте биспецифическое антитело является биспецифическим тетравалентным антителом, включающим:

а) две легкие цепи и две тяжелые цепи антитела, которое специфично связывается с первым антигеном (и включает два Fab фрагмента),

б) два дополнительных Fab фрагмента антитела, которое специфично связывается со вторым антигеном, где указанные Fab фрагменты оба присоединены через пептидный линкер к С- или N-концевому фрагменту тяжелых цепей по п. а), и

где в Fab фрагментах осуществлены следующие модификации:

(i) в обоих Fab фрагментах по п. а), или в обоих Fab фрагментах по п. б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и/или консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга, или

(ii) в обоих Fab фрагментах по п. а) вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и в обоих Fab фрагментах по п. б) вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, или консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга, или

(iii) в обоих Fab фрагментах по п. а) вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, или консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и в обоих Fab фрагментах по п. б) вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга, или

(iv) в обоих Fab фрагментах по п. а) вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и в обоих Fab фрагментах по п. б) консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга, или

(v) в обоих Fab фрагментах по п. а) консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и в обоих Fab фрагментах по п. б) вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга.

В одном объекте указанные дополнительные Fab фрагменты оба присоединены через пептидный линкер к С-концевому фрагменту тяжелых цепей по п. а) или к N-концевому фрагменту по п. а).

В одном объекте указанные дополнительные Fab фрагменты оба присоединены через пептидный линкер к С-концевому фрагменту тяжелых цепей по п. а).

В одном объекте указанные дополнительные Fab фрагменты оба присоединены через пептидный линкер к N-концевому фрагменту тяжелых цепей по п. а).

В одном объекте в Fab фрагментах осуществлены следующие модификации: в обоих Fab фрагментах по п. а), или в обоих Fab фрагментах по п. б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или консервативные домены CL и СН1 заменены друг на друга.

В одном объекте биспецифическое антитело является тетравалентным антителом, включающим:

а) (модифицированную) тяжелую цепь первого антитела, специфично связывающегося с первым антигеном и включающим первую пару VH-CH1 доменов, где к С-концевому фрагменту указанной тяжелой цепи присоединен через пептидный линкер N-концевой фрагмент второй пары VH-CH1 доменов,

б) две легкие цепи указанного первого антитела по п. а),

в) (модифицированную) тяжелую цепь второго антитела, специфично связывающегося со вторым антигеном и включающим первую пару VH-CL доменов, где к С-концевому фрагменту указанной тяжелой цепи присоединен через пептидный линкер N-концевой фрагмент второй пары VH-CL доменов,

г) две (модифицированные) легкие цепи указанного второго антитела по п. в), каждая из которых включает пару CL-CH1 доменов.

В одном объекте биспецифическое антитело включает:

а) тяжелую цепь и легкую цепь первого полноразмерного антитела, специфично связывающегося с первым антигеном, и

б) тяжелую цепь и легкую цепь второго полноразмерного антитела, которое специфично связывается со вторым антигеном, где N-концевой фрагмент тяжелой цепи присоединен к С-концевому фрагменту легкой цепи через пептидный мостик.

Антитело по п. а) не содержит модификаций, описанных в п. б), и тяжелая цепь и легкая цепь представляют собой изолированные цепи.

В одном объекте биспецифическое антитело включает

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и содержащее две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи антитела, и

б) Fv фрагмент, специфично связывающийся со вторым антигеном, включающим VH2 домен и VL2 домен, где оба домена соединены друг с другом через дисульфидную связь,

где только либо VH2 домен, либо VL2 домен присоединен через пептидный линкер к тяжелой или легкой цепи полноразмерного антитела, специфично связывающегося с первым антигеном.

В биспецифическом антителе тяжелые цепи и легкие цепи по п. а) представляют собой изолированные цепи.

В одном объекте домены, отличные от VH2 домена или VL2 домена, не связаны через пептидный линкер с тяжелой или легкой цепью полноразмерного антитела, специфично связывающегося с первым антигеном.

Во всех объектах, как описано в данном контексте, первая легкая цепь включает VL домен и CL домен, и первая тяжелая цепь включает VH домен, СН1 домен, шарнирную область, СН2 домен и СН3 домен.

В одном объекте биспецифическое антитело представляет собой трехвалентное антитело, включающее:

а) два Fab фрагмента, специфично связывающихся с первым антигеном,

б) один кроссоверный Fab фрагмент, специфично связывающийся со вторым антигеном, в котором СН1 и CL домены заменены друг на друга,

в) одну Fc-область, включающую первую тяжелую цепь Fc области, а также Fc область первой тяжелой цепи и Fc область второй тяжелой цепи,

где С-концевой фрагмент СН1 доменов двух Fab фрагментов присоединены к N-концевому фрагменту полипептидов Fc области тяжелой цепи, и где С-концевой фрагмент CL домена кроссоверного Fab фрагмента присоединен к N-концевому фрагменту VH домена одного из Fab фрагментов.

В одном объекте биспецифическое антитело представляет собой трехвалентное антитело, включающее %:

а) два Fab фрагмента, специфично связывающихся с первым антигеном,

б) один кроссоверный Fab фрагмент, специфично связывающийся со вторым антигеном, в котором СН1 и CL домены заменены друг на друга

в) одну Fc область, включающую Fc область первой тяжелой цепи и Fc область второй тяжелой цепи,

где С-концевой фрагмент СН1 домена первого Fab фрагмента присоединен к N-концевому фрагменту одного из полипептидов Fc области тяжелой цепи, а С-концевой фрагмент CL домена кроссоверного Fab фрагмента присоединен к N-концевому фрагменту полипептида Fc области другой тяжелой цепи, и где С-концевой фрагмент домена второго Fab фрагмента присоединен к N-концевому фрагменту VH домена первого Fab фрагмента или к N-концевому фрагменту VH домена кроссоверного Fab фрагмента.

В одном объекте биспецифическое антитело включает:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и включающее две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи антитела и

б) Fab фрагмент, специфично связывающий со вторым антигеном, включающий VH2 домен и VL2 домен, включающий фрагмент тяжелой цепи и фрагмент легкой цепи, где во фрагменте легкой цепи вариабельный домен VL2 легкой цепи заменен на вариабельный домен VH2 тяжелой цепи указанного антитела, и во фрагменте тяжелой цепи вариабельный домен VH2 тяжелой цепи заменен на вариабельный домен VL2 легкой цепи указанного антитела

где фрагмент Fab тяжелой цепи введен между СН1 доменом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела и соответствующей Fc областью полноразмерного антитела, а N-концевой фрагмент Fab фрагмента легкой цепи присоединен к С-концевому фрагменту легкой цепи полноразмерного антитела, которая спарена с тяжелой цепью полноразмерного антитела, в которое введен Fab фрагмент тяжелой цепи.

В одном объекте биспецифическое антитело включает:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и включающее две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи антитела и

б) Fab фрагмент, специфично связывающийся со вторым антигеном, включающим VH2 домен и VL2 домен, включающие фрагмент тяжелой цепи и фрагмент легкой цепи, где во фрагменте легкой цепи вариабельный домен VL2 легкой цепи заменен на вариабельный домен VH2 тяжелой цепи указанного антитела, и во фрагменте тяжелой цепи вариабельный домен VH2 тяжелой цепи заменен на вариабельный домен VL2 легкой цепи указанного антитела, и где С-концевой фрагмент Fab фрагмента тяжелой цепи присоединен к N-концевому фрагменту одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, и С-концевой фрагмент Fab фрагмента легкой цепи присоединен к N-концевому фрагменту легкой цепи полноразмерного антитела, конъюгированного с тяжелой цепью полноразмерного антитела, с которым конъюгирован фрагмент тяжелой цепи Fab фрагмента.

Полинуклеотиды

В настоящем изобретении кроме того предлагаются изолированные полинуклеотиды, кодирующие биспецифическое антитело, как описано в данном контексте, или их фрагменты.

В некоторых вариантах полинуклеотидом или нуклеиновой кислотой является ДНК. В других вариантах полинуклеотидом по настоящему изобретению является РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК по настоящему изобретению может являться одноцепочечной или двухцепочечной.

Б. Рекомбинантные методы

Биспецифическое антитела, предложенные в данном контексте, можно получать с использованием рекомбинантных методов и композиций, например, как описано в патенте США №4816567. В одном объекте предлагается изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело, описанное в данном контексте. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, включающую VL антигенсвязывающих участков, и/или аминокислотную последовательность, включающую VH антигенсвязывающих участков, которые специфично связываются с PD1 и TIM-3, соответственно (например, в легкой и/или тяжелой цепях антитела). В другом объекте предлагается один или более векторов (например, векторы экспрессии), включающие указанную нуклеиновую кислоту. В другом объекте предлагается клетка-хозяин, включающая указанную нуклеиновую кислоту. В одном таком объекте клетка-хозяина включает (например, трансформирована с его помощью): (1) вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую VL антитела, и аминокислотную последовательность, включающую VH антитела, или (2) первый вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую VL антитела, и второй вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую VH антитела. В одном объекте клеткой-хозяина является эукариотическая клетка, например, клетка яичника китайского хомяка (СНО) или лимфоидная клетка (например, клетки Y0, NS0, Sp20). В одном объекте предлагается способ получения биспецифического антитела, где метод включает культивирование клетки-хозяина, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как описано выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и необязательно выделение антитела из клетки-хозяина (или из культуральной среды клетки-хозяина).

Для рекомбинантного получения биспецифических антител, включающих первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с PD1, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывается с TIM-3, как описано в данном контексте, нуклеиновую кислоту, кодирующую биспецифическое антитела, например, как описано выше, изолируют и встраивают в один или более векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяина. Такую нуклеиновую кислоту легко изолировать и секвенировать с использованием стандартных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).

Пригодные клетки-хозяина для клонирования или для экспрессии кодирующих антитело векторов включают прокариотические и эукариотические клетки, описанные в данном контексте. Например, антитела можно получать в бактериях, предпочтительно, если отсутствует необходимость в гликозилировании и Fc эффекторной функции. Экспрессия фрагментов антител и полипептидов в бактериях описана, например, в патен