08.08.2020
220.018.3e25

АНТИТЕЛА ПРОТИВ ТРАНСФЕРРИНОВОГО РЕЦЕПТОРА, ОБЛАДАЮЩИЕ ИНДИВИДУАЛИЗИРОВАННОЙ АФФИННОСТЬЮ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002729416
Дата охранного документа
06.08.2020
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биохимии, в частности к гуманизированному антителу, которое специфично связывается с человеческим трансферриновым рецептором. Также раскрыты челночный модуль и фармацевтическая композиция, содержащие указанные антитела. Раскрыты способ лечения с помощью указанного челночного модуля и применение указанного антитела челночного модуля. Изобретение позволяет эффективно лечить неврологическое расстройство. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 14 пр., 6 табл., 3 ил.
Реферат Свернуть Развернуть

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам против трансферринового рецептора с запланированными скоростями диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора и к их применению в качестве челночного модуля гематоэнцефалического барьера.

Предшествующий уровень техники

Проникновение в мозг лекарственных средств против неврологических расстройств, таких как большие биотерапевтические лекарственные средства или низкомолекулярные лекарственные средства, имеющие слабое проникновение в мозг, строго ограничивается обширным и непроницаемым гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), наряду с другими клеточными компонентами в нейроваскулярной единице (НВЕ). Тестировали многие стратегии для преодоления этого препятствия, и одной из них является применение путей трансцитоза, опосредованных эндогенными рецепторами, экспрессируемыми на эндотелии мозговых капилляров (рецептор гематоэнцефалического барьера). Против данных рецепторов были сконструированы рекомбинантные белки, такие как моноклональные антитела или пептиды, для обеспечения опосредованной рецептором доставки биотерапевтических средств в мозг. Однако остаются неисследованными стратегии для максимизации поглощения в мозг при минимизации неправильной сортировки в пределах мозговых эндотелиальных клеток (МЭК) и степень накопления в пределах определенных органелл (особенно в органеллах, которые приводят к деградации биотерапевтического средства) в МЭК.

Моноклональные антитела и другие биотерапевтические средства имеют огромный терапевтический потенциал для лечения патологии в центральной нервной системе (ЦНС). Однако их доступ в мозг предотвращается ГЭБ. Предыдущие исследования проиллюстрировали то, что очень маленькая процентная доля (приблизительно 0,1%) IgG, инъецированного в кровоток, способна проникать в компартмент ЦНС (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164). Это будет определенно ограничивать любой фармакологический эффект из-за низкой концентрации антитела в пределах ЦНС.

Ранее было обнаружено то, что процентная доля антитела, которое распределяется в ЦНС, могла быть увеличена посредством применения рецепторов ГЭБ (т.е. трансферринового рецептора, инсулинового рецептора и тому подобных) (см., например, WO 95/02421).

Следовательно, существует потребность в системах доставки лекарственных средств против неврологических расстройств через ГЭБ для эффективной челночной доставки лекарственных средств в мозг.

В WO 2014/033074 описывается челнок гематоэнцефалического барьера.

В WO 2014/189973 описываются антитела против трансферринового рецептора и способы их применения. Кроме того, описывается то, что нацеливание на рецептор ГЭБ с использованием традиционного специфичного высокоаффинного антитела обычно приводило к ограниченному увеличению транспорта через ГЭБ. Позднее обнаружили то, что величина поглощения и распределения антитела в ЦНС обратно связана с его аффинностью связывания в отношении рецептора ГЭБ среди исследованных антител против ГЭБ. Например, низкоаффинное антитело к трансферриновому рецептору (TfR), дозированное при терапевтических уровнях дозы, значительно улучшает транспорт через ГЭБ и удерживание в ЦНС антитела против TfR относительно более высокоаффинного антитела против TfR и делает возможным более легкое достижение терапевтических концентраций в ЦНС (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra43). Доказательство такого транспорта через ГЭБ было достигнуто с использованием биспецифичного антитела, которое связывается и с TfR, и с β-секретазой (ВАСЕ1) - ферментом расщепления белка-предшественника амилоида (АРР). Одна системная доза биспецифичного антитела против TfR/BACE1, сконструированного с использованием низкоаффинного антитела, не только приводила к значимому поглощению антитела в мозг, но также кардинально уменьшала уровни мозгового Аβ1-40 по сравнению с одним моноспецифичным антителом против ВАСЕ1, свидетельствуя о том, что проникновение через ГЭБ влияет на эффективность антитела против ВАСЕ1 (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra43; Yu et al., Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra44).

Кроме того, тщательная неклиническая оценка безопасности моноклональных антител (mAb), предназначенных для терапевтического применения, является очень важной из-за увеличивающейся сложности аспектов инженерии антител и варьирования, вызванного разнообразием клеточных систем рекомбинантной продукции для получения антител. Кроме того, сложная структура, уникальные биологические функции и более длительные периоды полувыведения mAb по сравнению с традиционными низкомолекулярными лекарственными средствами увеличивают внимание к безопасности, помимо опасений из-за длительного клинического применения mAb для лечения хронических заболеваний (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009)2-11; Kim, S.J., et al., Mol. Cells 20 (2005) 17-29).

Общей целью неклинических исследований в отношении mAb является определение токсикологических свойств рассматриваемого mAb и предоставление информации для разработки продукта. Главными целями неклинической оценки являются (1) идентификация органов-мишеней в отношении токсичности и определение того, является ли токсичность обратимой после лечения, (2) идентификация безопасной исходной дозы для человеческих клинических испытаний Фазы I и последующих схем повышения дозы, (3) предоставление информации для отслеживания параметров безопасности в клинических испытаниях и (4) предоставление данных по безопасности для поддержки заявленного на этикетке продукта. Для достижения данных целей проводятся неклинические исследования как in vitro, так и in vivo, нацеленные на определение и понимание фармакологических свойств антитела (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Cavagnaro, J.A., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.) "Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals"; Hoboken, NJ: Wiley 2008; 45-65).

Для успешной некпинической оценки безопасности mAb следует выбирать самые релевантные виды животных для тестирования токсичности (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Chapman, K., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126). Релевантным видом является вид, у которого антитело является фармакологически активным, должен присутствовать или экспрессироваться антиген-мишень, и профиль тканевой перекрестной реактивности должен быть аналогичным человеческому (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Chapman, K., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Посредством применения иммунохимических или функциональных анализов может быть идентифицирован релевантный вид животных, у которого экспрессируется желательный эпитоп, и который демонстрирует профиль тканевой перекрестной реактивности, аналогичный человеческим тканям (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Исследования перекрестной реактивности у видов, которые являются полезными в данном процессе, включают иммуногистохимический обзор тканей от разных видов с использованием имеющихся в продаже многовидовых тканевых микрочипов (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). В качестве альтернативы, оценка связывания антител с клетками от данных животных посредством сортировки флюоресцентно-активированных клеток (FACS) типично является более чувствительной, чем иммуногистохимический анализ срезов тканей (Lynch, С.М., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205). Следует сравнить последовательности ДНК и аминокислот антигена-мишени среди видов; следует определить гомологию между видами (Lynch, С.М., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205).

Кроме того, биораспределение, функция и структура антигена должны быть сравнимыми между релевантными видами животных и человеком для обеспечения оценки токсичности, возникающей из-за связывания антитела с антигеном-мишенью, которую называют токсичностью на мишени (Lynch, С.М., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; 19,20). Кроме того, сильные сходства в тканевом распределении антигена-мишени у видов животных и человека делают более вероятным то, что органы-мишени токсичности, идентифицированные у животных, будут прогнозировать потенциальные токсичности у человека. Отсутствие сходства в тканевом распределении антигена между видом животного и человеком не полностью исключает применение данного вида животного для исследований токсичности, но данные различия должны приниматься во внимание для оценки риска у человека. В том, что касается плотности или аффинности антигена, абсолютная эквивалентность между животной моделью и человеком аналогичным образом не требуется. Обоснование релевантности выбранного вида для тестирования токсичности должно быть включено в документ для подачи в регулирующий орган. При использовании только одного вида для оценки безопасности оправданием служит краткое изложение экспериментов, которые демонстрируют отстутствие дополнительных релевантных видов (Lynch, С.М., et al., mAbs1 (2009) 2-11).

Если моноклональное антитело, предназначенное для терапевтического применения, не имеет перекрестной реактивности с видом животных, должно использоваться либо имитирующее антитело, либо другой вид в качестве модели. Таким образом, имитирующие антитела являются потенциальным решением в отношении возможного ограниченного тестирования безопасности с гуманизированными моноклональными антителами с ограниченной видовой перекрестной реактивностью. Однако в настоящее время нет определенных критериев, по которым следовало бы судить о потенциальном имитирующем антителе до его применения в определении вопросов безопасности в отношении клинического агента (Regulatory Toxicology and Pharmacology Volume 40, Issue 3, December 2004, Pages 219-226).

Таким образом, для идентификации животной модели для конкретного mAb следует принять во внимание приведенные выше соображения. Тем не менее необходимо, чтобы рассматриваемое mAb имело перекрестную реактивность с антигеном-мишенью тестируемого вида. В противном случае даже самые подходящие тестируемые виды не могут использоваться. Следовательно, имеется потребность в mAb, которые не имеют внутривидовой перекрестной реактивности, но имеют межвидовую перекрестную реактивность в отношении его мишени у человека и у вида, предназначенного для неклинических испытаний.

В ЕР 2708560 описывается антитело, специфично распознающее трансферриновый рецептор. В FR 2953841 описываются антитела против трансферринового рецептора и их применения для иммунотерапии железозависимых опухолей. В US 2009/162359 описываются двухвалентные биспецифичные антитела.

Краткое изложение сущности изобретения

Обнаружили то, что антитела против трансферринового рецептора, как описано в данном документе, можно использовать в качестве челночного модуля гематоэнцефалического барьера для доставки мозгового эффекторного соединения через гематоэнцефалический барьер в мозг. В некоторых воплощениях челночный модуль гематоэнцефалического барьера представляет собой одновалентное связывающее соединение, которое специфично связывается с трансферриновым рецептором. Антитела против трансферринового рецептора, как описано в данном документе, при использовании в качестве челночного модуля гематоэнцефалического барьера, являются полезными, например, для диагностики или лечения неврологических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера с сопутствующей болезнью Паркинсона.

В данном документе описываются антитела против трансферринового рецептора, которые специфично связываются с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR) и трансферриновым рецептором яванского макака (cyTfR). В некоторых воплощениях антитело против трансферринового рецептора

- связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR) и трансферриновым рецептором яванского макака (cyTfR);

- имеет скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора, которая равна или меньше, чем (т.е. самое большее равна) скорости диссоциации антитела против трансферринового рецептора 128.1 в отношении трансферринового рецептора яванского макака, при этом скорости диссоциации определяются поверхностным плазменным резонансом, и при этом антитело против трансферринового рецептора 128.1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 64 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 65;

- связывается со скоростью диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора, которая составляет от 0,1 1/с до 0,005 1/с включительно.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело против трансферринового рецептора, которое специфично связывается с человеческим трансферриновым рецептором и трансферриновым рецептором яванского макака, которое содержит:

i) гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, полученный из вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 01, и

ii) гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, полученный из вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 26,

где данное антитело имеет скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора, которая равна или меньше, чем (т.е. самое большее равна) скорости диссоциации антитела против трансферринового рецептора 128.1 в отношении трансферринового рецептора яванского макака,

при этом скорости диссоциации определяются поверхностным плазменным резонансом, и при этом антитело против трансферринового рецептора 128.1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 64 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 65.

В одном воплощении скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора составляет от 0,1 1/с до 0,005 1/с включительно.

В одном воплощении антитело имеет в положении 80 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток пролина (Р) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении антитело имеет в положении 91 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток аспарагина (N) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении антитело имеет в положении 93 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток аланина (А) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении антитело имеет в положении 100g вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток серина (S) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении антитело имеет в положении 100g вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток глутамина (Q) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении антитело имеет в положении 65 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток серина (S) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении антитело имеет в положении 105 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток глутамина (Q) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении антитело имеет в положении 80 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток пролина (Р), в положении 91 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток аспарагина (N), в положении 93 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток аланина (А), в положении 100g вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток серина (S), в положении 65 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток серина (S) и в положении 105 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток глутамина (Q) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении антитело имеет в положении 80 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток пролина (Р), в положении 91 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток аспарагина (N), в положении 93 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток аланина (А), в положении 100g вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток глутамина (Q), в положении 65 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток серина (S) и в положении 105 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток глутамина (Q) (нумерация согласно Kabat).

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело против трансферринового рецептора, содержащее: (a) HVR-H1 (гипервариабельная область 1 тяжелой цепи), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 71, 72 или 73; (г) HVR-L1 (гипервариабельная область 1 легкой цепи), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 75; (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 76; и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78.

В одном предпочтительном воплощении антитело против трансферринового рецептора содержит (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 72; (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 75; (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 76; и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело против трансферринового рецептора, которое специфично связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR), содержащее:

i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 24, и

ii) вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 37,

где данное антитело имеет примерно такую же скорость диссоциации, что и антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO 24 и вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO 37.

В одном воплощении скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора составляет от 0,1 1/с до 0,005 1/с включительно.

Одним предпочтительным аспектом, как описано в данном документе, является антитело против трансферринового рецептора, которое специфично связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR), содержащее:

i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 24, и

ii) вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 37.

В одном воплощении всех аспектов данное антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, имеющее по меньшей мере одну специфичность связывания в отношении трансферринового рецептора и по меньшей мере одну специфичность связывания в отношении терапевтической мишени. В одном воплощении антитело содержит первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с трансферриновым рецептором, и второй антигенсвязывающий сайт, который связывается с мозговым антигеном. В другом воплощении мозговой антиген выбран из группы, состоящей из человеческого Абета, рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), человеческого рецептора 2 эпидермального фактора роста (HER2), человеческого альфа-синуклеина, человеческого тау, который фосфорилирован на остатке тирозина или серина, человеческого CD20, белка-предшественника амилоида (АРР) и человеческой глюкоцереброзидазы. В одном предпочтительном воплощении данное мультиспецифичное антитело связывается с обоими из следующих:

i) трансферриновый рецептор и Абета, или

ii) трансферриновый рецептор и CD20, или

iii) трансферриновый рецептор и альфа-синуклеин, или

iv) трансферриновый рецептор и фосфо-тау, или

v) трансферриновый рецептор и HER2, или

vi) трансферриновый рецептор и глюкоцереброзидаза.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 81 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 82 сайта связывания в отношении человеческого Абета.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 79 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 80 сайта связывания в отношении человеческого CD20. В одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи содержит замену аминокислотного остатка в положении 11 по Kabat на любую аминокислоту, но не лейцин. В одном воплощении данная замена включает замену аминокислотного остатка в положении 11 по Kabat на неполярную аминокислоту. В одном предпочтительном воплощении данная замена включает замену аминокислотного остатка в положении 11 по Kabat в вариабельном домене тяжелой цепи SEQ ID NO 79 на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из валина, лейцина, изолейцина, серина и фенилаланина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 83 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 84 сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, полученного из SEQ ID NO 85, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, полученного из SEQ ID NO 86, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, полученного из SEQ ID NO 87, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, полученного из SEQ ID NO 88, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, полученного из SEQ ID NO 89, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, полученного из SEQ ID NO 90, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 91, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 92, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 93, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 94, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и сайт связывания в отношении i) глюкоцереброзидазы, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO 97, или ii) функционального варианта SEQ ID NO 97, имеющего по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, или iii) функционального варианта SEQ ID NO 97, имеющего одну или более чем одну мутацию, делецию или вставку аминокислоты, или iv) усеченного функционального варианта SEQ ID NO 97, имеющего по меньшей мере один аминокислотный остаток на N-конце или С-конце или в пределах удаленной аминокислотной последовательности, или v) комбинацию iii) и iv).

В одном воплощении всех аспектов данное антитело содержит

i) гомодимерную область Fc человеческого подкласса IgG1, возможно с мутациями P329G, L234A и L235A или

ii) гомодимерную область Fc человеческого подкласса IgG4, возможно с мутациями P329G, S228P и L235E или

iii) гетеродимерную область Fc, в которой

а) один полипептид области Fc содержит мутацию T366W, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A и Y407V или

б) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и Y349C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и S354C, или

в) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и S354C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C,

или

iv) гетеродимерную область Fc человеческого подкласса IgG4, в которой оба полипептида области Fc содержат мутации P329G, L234A и L235A, и

а) один полипептид области Fc содержит мутацию T366W, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A и Y407V или

б) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и Y349C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и S354C, или

в) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и S354C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C,

или

v) гетеродимерную область Fc человеческого подкласса IgG4, в которой оба полипептида области Fc содержат мутации P329G, S228P и L235E, и

а) один полипептид области Fc содержит мутацию T366W, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A и Y407V или

б) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и Y349C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и S354C, или

в) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и S354C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C.

В одном воплощении всех аспектов антитело представляет собой CrossMab.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело против трансферринового рецептора, содержащее:

i) вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO 52, 53, 54, 55, 56, 57 и 58, и вариабельный домен легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO 60, 61, 62 и 63,

или

ii) вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25, и вариабельный домен легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 и 47.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является фармацевтический препарат, содержащий антитело, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело, как описано в данном документе, для применения в качестве лекарственного средства.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является применение антитела, как описано в данном документе, в изготовлнии лекарственного средства для лечения неврологического расстройства.

В одном воплощении неврологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства, связанного с глазным заболеванием, конвульсивного расстройства, лизосомальной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, поведенческого расстройства, воспаления ЦНС, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянного склероза, CD20-позитивного рака с метастазами в мозг и Her2-позитивного рака с метастазами в мозг.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является применение антитела, как описано в данном документе, в изготовлении лекарственного средства для транспортировки одного или более чем одного соединения через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Описание графических материалов

Фиг. 1: схема анализа трансцитоза.

Фиг. 2: скорости диссоциации разных антител против трансферринового рецептора, определенные при 25°C с использованием BIAcore; 1: 128.1; 2: 128.1, слитое с антителом mAb86 против pTau; 3: 567; 4: 932; 5: 567, слитое с антителом mAb86 против pTau; 6: 1026; 7: 1027; квадраты: связывание с трансферриновым рецептором яванского макака; круг: связывание с человеческим трансферриновым рецептором; ордината: скорость диссоциации [1/с].

Фиг. 3: скорости диссоциации разных антител против трансферринового рецептора, определенные при 37°C с использованием BIAcore; 1: 128.1; 2: 932; 3: 1026; 4: 1027; квадраты: связывание с трансферриновым рецептором яванского макака; круг: связывание с человеческим трансферриновым рецептором; ордината: скорость диссоциации [1/с].

Подробное описание воплощений изобретения

В данном документе описан гуманизированный вариант кроличьего антитела 299, демонстрирующий сильный трансцитоз в анализе трансцитоза согласно Примеру 8, который имеет перекрестную реактивность в отношении трансферринового рецептора человека и яванского макака, т.е. специфично связывается с обоими ортологами трансферринового рецептора, который демонстрирует хорошее окрашивание клеток, и который имеет аналогичный период полувыведения (отражаемый скоростью диссоциации), что и мышиное антитело 128.1 в отношении трансферринового рецептора яванского макака и трансферринового рецептора человека.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является гуманизированное антитело, которое специфично связывается с трансферриновым рецептором человека, где данное антитело содержит:

в вариабельном домене тяжелой цепи HVR (гипервариабельная область) SEQ ID NO 66, 68 и 72,

и

в вариабельном домене легкой цепи HVR SEQ ID NO 75, 76 и 78.

В одном воплощении гуманизированное антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 37.

В одном воплощении у гуманизированного антитела выключена эффекторная функция.

В одном воплощении гуманизированное антитело специфично связывается с трансферриновым рецептором человека и с трансферриновым рецептором яванского макака.

В одном воплощении гуманизированное антитело представляет собой:

а) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 или

б) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4, или

в) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и, возможно, P329G,

д) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях, и с мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи, или

е) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и, возможно, P329G в обеих тяжелых цепях, и с мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

i) первый сайт связывания, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 37,

и

ii) второй сайт связывания, выбранный из следующих:

а) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 81 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 82, или

б) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 83 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 84, или

в) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 85 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 86, или

г) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 87 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 88, или

д) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 91 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 92, или

е) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 89 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 90, или

ж) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 93 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 94, или

з) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 79 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 80.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является фармацевтический препарат, содержащий антитело, как описано в данном документе, и, возможно, фармацевтически приемлемый носитель.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело, как описано в данном документе, для применения в качестве лекарственного средства.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело, как описано в данном документе, для применения в лечении неврологического расстройства.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является применение антитела, как описано в данном документе, в изготовлении лекарственного средства.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является способ лечения, включающий введение антитела, как описано в данном документе, для лечения неврологического расстройства.

I. Определения

Термин «акцепторная человеческая каркасная область» для целей данного документа представляет собой каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящую из каркасной области человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, как определено ниже. Акцепторная человеческая каркасная область, «происходящая из» каркасной области человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, может содержать такую же аминокислотную последовательность, как и они, или она может содержать изменения аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях число изменений аминокислот составляет 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше, или 2 или меньше. В некоторых воплощениях акцепторная человеческая каркасная область VL является идентичной по последовательности последовательности каркасной области VL человеческого иммуноглобулина или последовательности человеческой консенсусной каркасной области.

Термин «аффинность» относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером связывания (например, антигеном). Если не указано иное, термин «аффинность связывания» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к собственной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы Х в отношении ее партнера Y обычно может быть представлена константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области, включающими способы, описанные в данном документе. Конкретные иллюстративные и типичные воплощения для измерения аффинности связывания описываются далее.

Термин антитело «с созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или более чем одним изменением в одной или более чем одной гипервариабельной области (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не обладает такими изменениями, причем такие изменения приводят к улучшению аффинности антитела в отношении антигена.

Термин «антитело» используется в данном документе в самом широком смысле и охватывает разные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, но не ограничиваясь ими, при условии, что они демонстрируют желательную активность связывания антигена.

Термин «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv) и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

Термин «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или вида, тогда как остальная тяжелая и/или легкая цепь происходит из другого источника или вида.

«Класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, которым обладает его тяжелая цепь. Существуют пять главных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Термин «эффекторные функции» относится к тем биологическим активностям, приписываемым области Fc антитела, которые варьируют в зависмости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание с C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов поверхности клетки (например, рецептора В-клеток) и активацию В-клеток.

«Эффективное количество» агента, например, фармацевтического препарата, относится к эффективному количеству в необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени для достижения желательного терапевтического или профилактического результата.

Термин «область Fc» используется в данном документе для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Данный термин включает области Fc с природной последовательностью и варианты области Fc. В одном воплощении область Fc тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) области Fc может присутствовать или может отсутствовать. Если в данном документе не определено иначе, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или в константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также именуемой индекс EU, как описано в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

«Каркасная область» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно появляются в VH (или VL) в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «полное антитело» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия антитела, имеющего по существу аналогичную структуру структуре природного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат область Fc, как определено в данном документе.

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетки и потомство, полученное от них, независимо от числа пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но может содержать мутации. Сюда включено мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, на которую осуществляется скрининг или отбор у исходно трансформированной клетки.

«Человеческая консенсусная каркасная область» представляет собой каркасную область, которая представляет собой чаще всего встречающиеся аминокислотные остатки в наборе последовательностей каркасных областей VL или VH человеческого иммуноглобулина. В общем, набор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина происходит из подгруппы последовательностей вариабельного домена. Обычно данная подгруппа последовательностей представляет собой такую же подгруппу, что и в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении для VL данной подгруппой является подгруппа каппа I, такая же, как и в Kabat et al., выше. В одном воплощении для VH данной подгруппой является подгруппа III, такая же, как и в Kabat et al., выше.

Термин «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR, не являющихся человеческими, и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVR (например, CDR (область, определяющая комплементарность)) соответствуют HVR антитела, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR соответствуют FR человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. Термин «гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое подверглось гуманизации.

Термин «гипервариабельная область» или «HVR» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности («области, определяющие комплементарность» или «CDR») и образуют структурно определенные петли («гипервариабельные петли»), и/или содержат остатки, контактирующие с антигеном («контакты с антигеном»). В общем, антитела содержат шесть HVR: три в VH (Н1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3).

HVR в данном документе включают:

(а) гипервариабельные петли, находящиеся в аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);

(б) CDR, находящиеся в аминокислотных остатках 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);

(в) контакты с антигеном, находящиеся в аминокислотных остатках 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); и

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) нумеруются в данном документе согласно Kabat et al., выше.

«Индивид» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают домашних животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, человека и приматов, не являющихся человеком, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс), но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях индивид или субъект представляет собой человека.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его природного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищают до чистоты, большей, чем 95% или 99% при определении, например, электрофоретическими (например, SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), изоэлектрофокусировка (IEF), капиллярный электрофорез) или хроматографическими (например, ионообменная ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) или ВЭЖХ с обращенной фазой) способами. Относительно обзора способов оценки чистоты антител, см., например, Flatman, S. et al., J. Chromatogr. В 848 (2007) 79-87.

Термин «выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат данную молекулу нуклеиновой кислоты, но данная молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в участке хромосомы, который отличается от ее природного хромосомного участка.

Термин «моноклональное антитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с тем же самым эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации или возникающих во время получения препарата моноклонального антитела, причем такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий продукции антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению согласно настоящему избретению, можно получать целым рядом методик, включающих способ гибридомы, способы генной инженерии, способы фагового дисплея и способы с использованием трансгенных животных, содержащих все локусы человеческого иммуноглобулина или их часть, но не ограничивающихся ими, причем такие способы и другие типичные способы для получения моноклональных антител описываются в данном документе.

Термин «природные антитела» относится к встречающимся в природе молекулам иммуноглобулинов с варьирующими структурами. Например, природные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидными связями. От N- до С-конца каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также именуемую вариабельный тяжелый домен или вариабельный домен тяжелой цепи, с последующими тремя константными доменами (СН1, СН2 и CH3). Аналогичным образом, от N- до С-конца каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также именуемую вариабельный легкий домен или вариабельный домен легкой цепи, с последующим константным легким доменом (CL). Легкая цепь антитела может быть приписана к одному из двух типов, именуемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин «листок-вкладыш в упаковке» используется для названия инструкций, традиционно включаемых в имеющиеся в продаже упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к контрольной последовательности полипептида определяется как процентная доля аминокслотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными аминокислотным остаткам в контрольной последовательности полипептида, после выравнивания данных последовательностей и, если необходимо, введения пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотной последовательности может достигаться разными способами, которые находятся в пределах квалификации в данной области, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей данного документа, однако, значения % идентичности аминокислотной последовательности получаются с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Авторство компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2 принадлежит Genentech, Inc., и исходный код с пользовательской документацией был подан в Бюро регистрации авторских прав США, Washington D.C., 20559, где он зарегестрирован под регистрационным № авторского права США TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной от Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или может быть составлена из исходного кода. Программу ALIGN-2 следует составлять для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не варьируют.

В ситуациях, когда ALIGN-2 применяется для сравнений аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А с или относительно данной аминокислотной последовательности Б (что может быть альтернативно сформулировано как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности с или относительно данной аминокислотной последовательности Б) рассчитывается следующим образом:

100 умножить на долю X/Y

где Х представляет собой число аминокислотных остатков, подсчитанных как идентичные совпадения, посредством программы выравнивания последовательностей ALIGN-2 в выравнивании А и Б данной программой, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в Б. Будет понятно то, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, % идентичности аминокислотной последовательности А с Б не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности Б с А. Если конкретно не утверждается иное, все значения % идентичности аминокислотной последовательности, используемые в данном документе, как описано в непосредственно предшествующем абзаце, получены с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Термин «фармацевтический препарат» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечивать эффективную биологическую активность содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводился бы препарат.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом препарате, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Термин «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «осуществление лечения») в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к клиническому вмешательству в попытке изменить природный ход индивида, которого лечат, и оно может осуществляться либо для профилактики, либо по ходу клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают предупреждение появления или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, предупреждение метастазов, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшенный прогноз, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела по изобретению используются для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) природного антитела обычно имеют аналогичные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). (См., например, Kindt, T.J., et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), страница 91). Один домен VH или VL может быть достаточным для придания специфичности связывания с антигеном. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH соответственно. См., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628). Нумерация аминокислотных остатков в вариабельной области (вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи) будет осуществляться согласно Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3).

Термин «вектор» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Данный термин включает вектор в качестве структуры самореплицирующейся нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Определенные векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они связаны функциональным образом. Такие векторы называются в данном документе «экспрессионными векторами».

Термин «гематоэнцефалический барьер» (ГЭБ) обозначает физиологический барьер между периферическим кровообращением и мозгом и спинным мозгом, который образуется посредством плотных контактов в пределах плазматических мембран эндотелия капилляров мозга, создающих плотный барьер, который ограничивает транспорт молекул в мозг, даже очень маленьких молекул, таких как мочевина (60 Дальтон). ГЭБ в пределах мозга, гематоспинномозговой барьер в пределах спинного мозга и гематоретинальный барьер в пределах сетчатки представляют собой смежные капиллярные барьеры в пределах ЦНС, и в данном документе они совокупно называются гематоэнцефалический барьер или ГЭБ. ГЭБ также охватывает барьер между кровью и ЦСЖ (цереброспинальная жидкость) (хориоидное сплетение), где данный барьер состоит из эпендимных клеток, а не из эндотелиальных клеток капилляров.

Термин «центральная нервная система» (ЦНС) обозначает комплекс нервных тканей, который контролирует функции организма, и включает мозг и спинной мозг.

Термин «рецептор гематоэнцефалического барьера» (РГЭБ) обозначает внеклеточный мембраносвязанный рецепторный белок, экспрессируемый на эндотелиальных клетках мозга, который способен транспортировать молекулы через ГЭБ или использоваться для транспорта экзогенно введенных молекул. Примеры РГЭБ включают рецептор трансферрина (TfR), рецептор инсулина, рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-R), рецепторы липопротеинов низкой плотности, включающие, без ограничения, белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP1), белок 8, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP8), и гепаринсвязывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста (HB-EGF), но не ограничиваются ими. Типичный РГЭБ представляет собой трансферриновый рецептор (TfR).

Термин «мозговое эффекторное соединение» обозначает молекулу, которая подлежит транспортировке в мозг через ГЭБ. Данное эффекторное соединение типично имеет характерную терапевтическую активность, которую желательно доставлять в мозг. Эффекторные соединения включают лекарственные средства против неврологических расстройств и цитотоксические агенты, такие как, например, полипептиды и антитела, в частности, моноклональные антитела или их фрагменты, направленные на мозговую мишень.

Термин «одновалентное связывающее соединение» обозначает молекулу, способную специфично связываться в режиме одновалентного связывания с РГЭБ. Гематоэнцефалический челночный модуль и/или конъюгат, как описано в данном документе, характеризуются присутствием одной единицы одновалентного связывающего соединения, т.е. гематоэнцефалический челночный модуль и/или конъюгат по настоящему изобретению содержит точно одну единицу одновалентного связывающего соединения. Одновалентное связывающее соединение включает полипептиды, полноразмерные антитела, фрагменты антител, включающие фрагменты Fab, Fab', Fv, молекулы одноцепочечных антител, такие как, например, одноцепочечные Fab, scFv, но не ограничивается ими. Одновалентное связывающее соединение, например, может представлять собой каркасный белок, сконструированный с использованием технологий современного уровня техники, подобных фаговому дисплею или иммунизации. Одновалентное связывающее соединение также может представлять собой полипептид. В некоторых воплощениях одновалентное связывающее соединение содержит домен Ig CH2-CH3 и одноцепочечный Fab (scFab), направленный на рецептор гематоэнцефалического барьера. scFab связан с С-концевым концом домена Ig CH2-CH3 посредством линкера. В некоторых воплощениях scFab направлен на трансферриновый рецептор.

Термин «режим одновалентного связывания» обозначает специфичное связывание с РГЭБ, где взаимодействие между одновалентным связывающим соединением и РГЭБ происходит через один одиночный эпитоп. Режим одновалентного связывания предотвращает любую димеризацию/мультимеризацию РГЭБ из-за одной точки взаимодействия с эпитопом. Режим одновалентного связывания предотвращает то, что изменяется внутриклеточная сортировка РГЭБ.

Термин «эпитоп» обозначает любую полипептидную детерминанту, способную к специфичному связыванию с антителом. В некоторых воплощениях эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорил или сульфонил, и, в некоторых воплощениях, могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, с которой связывается антитело.

«Рецептор трансферрина» (TfR) представляет собой трансмембранный гликопротеин (с молекулярной массой примерно 180000 Да), который состоит из двух связанных дисульфидной связью субъединиц (каждая с кажущейся молекулярной массой примерно 90000 Да), и он участвует в поглощении железа у позвоночных. В одном воплощении TfR в данном документе представляет собой человеческий TfR, содержащий аминокислотную последовательность, как описано в Schneider et al. (Nature 311 (1984) 675-678).

Термин «визуализирующий агент» обозначает соединение, которое имеет одно или более чем одно свойство, которое обеспечивает выявление его присутствия и/или локализации прямо или опосредованно. Примеры таких визуализирующих агентов включают белки и низкомолекулярные соединения, включающие меченое соединение, которое обеспечивает выявление.

Термины «антиген ЦНС» и «мозговая мишень» обозначают антиген и/или молекулу, экспрессируемую в ЦНС, включая мозг, которые могут служить в качестве мишени для антитела или маленькой молекулы. Примеры такого антигена и/или молекулы включают, без ограничения: бета-секретазу 1 (ВАСЕ1), амилоид бета (Абета), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), человеческий рецептор 2 эпидермального фактора роста (HER2), Таu, аполипопротеин Е4 (АроЕ4), альфа-синуклеин, CD20, хантингтин, прионный белок (PrP), киназу 2 с повторами, обогащенными лейцином (LRRK2), паркин, пресенилин 1, пресенилин 2, гамма-секретазу, рецептор смерти 6 (DR6), белок-предшественник амилоида (АРР), рецептор нейротрофина (p75NTR), глюкоцереброзидазу и каспазу 6.

Термин «который специфично связывается» обозначает антитело, селективно или предпочтительно связывающееся с антигеном. Аффинность связывания обычно определяется с использованием стандартного анализа, такого как анализ Скэтчарда или методика поверхностного плазменного резонанса (например, с использованием BIACORE®).

Термин «соединение СН2-CH3 Ig» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к белковому соединению, происходящему из доменов СН2 или CH3 иммуноглобулина. «Соединение СН2-CH3 Ig» содержит два полипептида «СН2-CH3», образующих димер. Данный иммуноглобулин может представлять собой IgG, IgA, IgD, IgE или IgM. В одном воплощении соединение СН2-CH3 Ig было получено из иммуноглобулина IgG и называется в данном документе «соединение СН2-CH3 IgG». Данный термин включает природную последовательность доменов СН2-CH3 и варианты доменов СН2-CH3. В одном воплощении «соединение СН2-CH3 Ig» происходит из домена СН2-CH3 тяжелой цепи человеческого IgG, который простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) области Fc может присутствовать или может не присутствовать. Если в данном документе не определено иначе, нумерация аминокислотных остатков в области домена СН2-CH3 или константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также именуемой индекс EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

«Конъюгат» представляет собой слитый белок по настоящему изобретению, конъюгированный с одной или более чем одной гетерологичной молекулой, включающей метку, лекарственное средство против неврологического расстройства или цитотоксический агент, но не ограничивающейся ими.

Термин «линкер» обозначает химический линкер или одноцепочечный пептидный линкер, который ковалентно связывает разные соединения челночного модуля гематоэнцефалического барьера и/или слитый полипептид, и/или конъюгат, как описано в данном документе. Линкер, например, соединяет мозговое эффекторное соединение с одновалентным связывающим соединением. Например, если одновалентное связывающее соединение содержит соединение СН2-CH3 Ig и scFab, направленный на рецептор гематоэнцефалического барьера, тогда линкер конъюгирует scFab с С-концевым концом соединения СН2-CH3 Ig. Линкер, конъюгирующий мозговое эффекторное соединение с одновалентным связывающим соединением (первый линкер), и линкер, соединяющий scFab с С-концевым концом домена СН2-CH3 Ig (второй линкер), могут быть одинаковыми или разными.

Можно использовать одноцепочечные пептидные линкеры, содержащие от одного до двадцати аминокислотных остатков, связанных пептидными связями. В некоторых воплощениях аминокислоты выбраны из двадцати встречающихся в природе аминокислот. В некоторых других воплощениях одна или более чем одна аминокислота выбрана из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. В других воплощениях линкер представляет собой химический линкер. В некоторых воплощениях линкер представляет собой одноцепочечный пептидный линкер с аминокислотной последовательностью с длиной по меньшей мере 25 аминокислотных остатков, в одном предпочтительном воплощении - с длиной от 32 до 50 аминокислотных остатков. В одном воплощении пептидный линкер представляет собой линкер (GxS)n с G - глицином, S - серином, (х равен 3, n равен 8, 9 или 10) или (х равен 4, n равен 6, 7 или 8), в одном воплощении с х, равным 4, n, равным 6 или 7, в одном предпочтительном воплощении с х, равным 4, n, равным 7. В одном воплощении линкер представляет собой (G4S)4 (SEQ ID NO 95). В одном воплощении линкер представляет собой (G4S)6G2 (SEQ ID NO 96).

Конъюгирование может проводиться с использованием целого ряда химических линкеров. Например, одновалентное связывающее соединение или слитый полипептид и мозговое эффекторное соединение могут быть конъюгированы с использованием целого ряда бифункциональных белковых связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональных производных имидоэфиров (таких как диметиладипимидат HCl), активных сложных эфиров (таких как дисукцинимидилсуберат), альдегидов (таких как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазониябензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение эффекторного соединения при доставке в мозг. Например, могут использоваться кислотолабильный линкер, пептидазочувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5208020).

Ковалентное конъюгирование может быть либо непосредственным, либо через линкер. В некоторых воплощениях непосредственное конъюгирование осуществляется путем конструирования полипептидного слияния (т.е. посредством генетического слияния двух генов, кодирующих одновалентное связывающее соединение в отношении РГЭБ и эффекторное соединение, и экспрессируемого в виде одного полипептида (полипептидной цепи)). В некоторых воплощениях непосредственное конъюгирование осуществляется путем образования ковалентной связи между реакционноспособной группой на одной из двух частей одновалентного связывающего соединения в отношении РГЭБ и соответствующей группой или акцептором на мозговом эффекторном соединении. В некоторых воплощениях непосредственное конъюгирование осуществляется путем модификации (т.е. генетической модификации) одной из двух молекул, подлежащих конъюгированию, для включения реакционноспособной группы (в качестве неограничивающих примеров сульфгидрильной группы или карбоксильной группы), которая образует ковалентное присоединение к другой молекуле, подлежащей конъюгированию при подходящих условиях. В качестве одного неограничивающего примера молекула (т.е. аминокислота) с желательной реакционноспособной группой (т.е. остатком цистеина) может быть введена, например, в одновалентное связывающее соединение к антителу против РГЭБ, и дисульфидная связь образуется с неврологическим лекарственным средством. Способы ковалентного конъюгирования нуклеиновых кислот с белками также известны в данной области (т.е. фотопоперечное связывание, см., например, Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74 (2005) 77-95). Конъюгирование также может осуществляться с использованием целого ряда линкеров. Например, одновалентное связывающее соединение и эффекторное соединение могут быть конъюгированы с использованием целого ряда бифункциональных белковых связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазониябензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фторные соединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Также могут использоваться пептидные линкеры, содержащие от одного до двадцати аминокислотных остатков, связанных пепидными связями. В некоторых таких воплощениях аминокислотные остатки выбраны из двадцати встречающихся в природе аминокислот. В некоторых других таких воплощениях один или более чем один аминокислотный остаток выбран из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение эффекторного соединения при доставке в мозг. Например, могут использоваться кислотолабильный линкер, пептидазочувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5208020).

II. Композиции и способы

Для описания молекулярных взаимодействий обычно используются равновесные константы диссоциации (KD). Она используется как мера силы взаимодействия (например, аффинности) двух молекул друг с другом. Таким образом, значение KD представляет собой меру силы двухмолекулярного взаимодействия.

Но значение KD, как таковое, не описывает кинетику молекулярного взаимодействия, т.е. из значения KD нельзя вывести, с одной стороны, как быстро две молекулы связываются друг с другом (константа скорости ассоциации или «скорость ассоциации») и, с другой стороны, как быстро молекулы диссоциируют (константа скорости диссоциации или «скорость диссоциации»). Характеристика бимолекулярных взаимодействий только по их значению KD пренебрегает тем фактом, что идентичное значение KD может быть составлено крайне разными (разные порядки значения) скоростей ассоциации и диссоциации, так как значение KD представляет собой их отношение.

Но скорости ассоциации и диссоциации являются важными для описания характеристик связывания молекул. Скорость диссоциации является особенно важной, так как она характеризует продолжительность связывания, например, антитела с его антигеном. Длительная скорость диссоциации коррелирует с медленной диссоциацией образовавшегося комплекса, тогда как короткая скорость диссоциации коррелирует с быстрой диссоциацией.

Для того чтобы иметь долговременное (т.е. требующее менее частого дозирования) или индивидуализированное (например, зависящее от окружающих условий) взаимодействие, скорости диссоциации должны быть определены экспериментально. Это даже более важно, так как практически невозможно прогнозировать скорость диссоциации. Кроме того, корреляция между скоростью диссоциации и аффинностью связывания является плохой, как описано выше. Например, из-за того, что значение KD является отношением скорости ассоциации и диссоциации, даже слабые связывающие агенты могут оставаться длительно связанными с их мишенями, тогда как сильные связывающие агенты могут быстро диссоциировать.

Типичным бутылочным горлышком в проектах получения антител является ранжирование многих кандидатов, полученных после пэннинга, на основе силы связывания антитела. В идеале, такой способ будет работать без предшествующего мечения антигенов и с неочищенными бактериальными лизатами. Ylera, F., et al. (Anal. Biochem. 441 (2013) 208-213) описали способ скрининга скорости диссоциации для отбора высокоаффинных антител против лекарственного средства неочищенных лизатов Escherichia coli, содержащих одновалентные фрагменты Fab. Они имеют выбранную скорость диссоциации в качестве параметра ранжирования, так как скорость диссоциации, среди других вещей, является зависимой от концентрации. Они выбрали одновалентный формат для избежания эффектов авидности во время ранжирования скорости диссоциации и определения аффинности в том виде, в котором они наблюдались бы с полноразмерным IgG. Ylera et al. обнаружили то, что клон с наилучшей скоростью диссоциации был идентифицирован посредством стадии ранжирования koff, но не был бы идентифицирован с использованием только силы сигнала ELISA в качестве критерия селекции.

Murray, J.B., et al. (J. Med. Chem. 57 (2014) 2845-2850) описали скрининг скорости диссоциации (ORS) посредством поверхностного плазмонного резонанса в качестве эффективного способа кинетического отбора наилучших образцов для ведущего химического пространства из неочищенных продуктов реакции. Описывается то, что константа скорости диссоциации - kd (скорость диссоциации) является компонентом связывания лиганд-белок с наиболее значимым потенциалом для увеличения эффективности соединения. Авторы действительно описывают то, что кинетическое измерение аффинности во всей программе открытия лекарственных средств является более информативным, чем равновесное определение аффинности в стационарном состоянии. Например, соединение с 10-кратно меньшей скоростью ассоциации и диссоциации не распознавалось бы как отличное при оценке посредством равновесных измерений аффинности. Кроме того, авторы обнаружили то, что данные, определенные с использованием прибора BIAcore T200, демонстрируют среднее различие kd между неочищенными и очищенными образцами 19%, аналогичным образом, данные, определенные с использованием более старого прибора BIAcore T100, имели 15% различие. Авторы наблюдают то, что kd отличаются в среднем только на 30% при сравнении между инструментами и во времени. Это демонстрирует то, что загрязнение следами предыдущего образца, долговременное хранение и отличающееся оборудование имеют умеренный эффект на наблюдаемые kd. В самом деле, эти маленькие отклонения kd близко отражают различия, наблюдаемые в исследованиях во многих лабораториях, где было описано то, что варьирование составляет от 14% до 40%, в зависимости от системы (Murray, J.B., et al., J. Med. Chem. 57 (2014) 2845-2850; Katsamba, P.S., et al., Anal. Biochem. 352 (2006)208-221).

В WO 2014/189973 описаны антитела против трансферринового рецептора и способы их применения. Дополнительно описано то, что нацеливание на рецептор ГЭБ традиционного специфичного высокоаффинного антитела обычно приводило к ограниченному увеличению транспорта через ГЭБ. Позднее обнаружили то, что величина поглощения антитела в и распределения в ЦНС обратно связана с его аффинностью связывания в отношении рецептора ГЭБ среди исследованных антител против ГЭБ. Например, малоаффинное антитело к трансферриновому рецептору (TfR), дозированное при терапевтических уровнях дозы, значительно увеличивает транспорт через ГЭБ и удерживание в ЦНС антитела против TfR относительно более высокоаффинного антитела против TfR и делает возможным более легкое достижение терапевтических концентраций в ЦНС (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra43). Доказательства такого транспорта через ГЭБ добивались с использованием биспецифичного антитела, которое связывается и с TfR, и с расщепляющим ферментом белка-предшественника амилоида (АРР) - β-секретазой (ВАСЕ1). Одна системная доза биспецифичного антитела против TfR/BACE1, сконструированного с использованим низкоаффинного антитела, не только приводила к значимому поглощению антитела в мозг, но также кардинально уменьшала уровни мозгового Аβ1-40 по сравнению с одним моноспецифичным антителом против ВАСЕ1, свидетельствуя о том, что проникновение через ГЭБ влияет на эффективность антитела против ВАСЕ1 (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra43; Yu et al., Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra44).

Доступные данные и эксперименты подчеркивают несколько причинных механизмов, лежащих в основе возрастающего поглощения антитела в ЦНС с использованием подхода с менее аффинным антителом.

Во-первых, высокоаффинные антитела против рецептора ГЭБ (РГЭБ) (например, антитело против TfR из Atwal et al. и Yu et al., выше) ограничивают поглощение в мозг посредством быстрого насыщения РГЭБ в сосудистой системе мозга, таким образом, уменьшая общее количество антитела, поглощенного в мозг, и также ограничивая его распределение в сосудистой системе. Удивительно то, что уменьшение аффинности в отношении РГЭБ улучшает поглощение в мозг и распределение в мозге с надежным сдвигом, наблюдаемым в локализации от сосудистой системы к нейронам и ассоциированным нейропилям в пределах ЦНС. Обнаружили то, что аффинность должна быть ниже определенного верхнего уровня и выше определенного нижнего уровня.

Во-вторых, предполагается то, что меньшая аффинность антитела в отношении РГЭБ ухудшает способность антитела возвращаться на сосудистую сторону ГЭБ через РГЭБ со стороны ЦНС мембраны, так как общая аффинность антитела в отношении РГЭБ является низкой, и местная концентрация антитела на стороне ЦНС ГЭБ является ненасыщающей из-за быстрого рассеивания антитела в компартменте ЦНС.

В третьих, in vivo, и как наблюдалось для системы TfR, антитела с меньшей аффинностью в отношении РГЭБ не подвергаются клиренсу из системы также эффективно, как и антитела с большей аффинностью в отношении РГЭБ и, таким образом, остаются в более высоких концентрациях в системе кровообращения, чем их более высокоаффинные аналоги. Это имеет преимущество, так как уровни менее аффинного антитела в системе кровообращения поддерживаются на терапевтических уровнях в течение более длительного периода времени, чем более высокоаффинного антитела, что, следовательно, улучшает поглощение антитела в мозг в течение более длительного периода времени. Кроме того, это улучшение в площади под кривой концентрации относительно времени как в плазме, так и в мозгу может уменьшать частоту дозирования в клинике, что имело бы потенциальную пользу не только для соблюдения пациентом схемы и режима лечения, и удобства пациента, но также и в уменьшении любых потенциальных побочных эффектов или эффектов вне мишени антитела и/или терапевтического соединения, связанного с ним.

В этих предыдущих исследованиях использовались мышиные антитела, которые специфично связывались с мышиным TfR, но которые специфично не распознавали TfR примата или человека. Соответственно, в данном документе предложены антитела и их функциональные части, которые действительно специфично распознают и TfR примата, особенно яванского макака, и TfR человека для того, чтобы облегчать исследования безопасности и эффективности у приматов с использованием антител до терапевтического или диагностического применения у людей.

Тщательная неклиническая оценка безопасности моноклональных антител (mAb), предназначенных для терапевтического применения, является очень важной из-за возрастающей сложности аспектов инженерии антител и изменчивости, индуцированной разнообразием клеточных систем рекомбинантной продукции для получения антител. Кроме того, сложная структура, уникальные биологические функции и более продолжительные периоды полувыведения mAb по сравнению с традиционными низкомолекулярными лекарственными средствами усиливают факторы, которые необходимо учитывать в связи с безопасностью, помимо опасений из-за длительного клинического применения mAb для лечения хронических заболеваний (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Kim, S.J., et al., Mol. Cells 20 (2005) 17-29).

Общей целью неклинических исследований в отношении mAb является определение токсикологических свойств рассматриваемого mAb и предоставление информации для разработки продукта. Главными целями неклинической оценки являются (1) идентификация органов-мишеней для токсичности и определение того, является ли токсичность обратимой после лечения, (2) идентификация безопасной исходной дозы для человеческих клинических испытаний Фазы I и последующих схем повышения дозы, (3) предоставление информации для отслеживания параметров безопасности в клинических испытаниях и (4) предоставление данных по безопасности для поддержки данных на этикетке продукта. Для того, чтобы достигнуть данных целей проводятся неклинические исследования как in vitro, так и in vivo, нацеленные на определение и понимание фармакологических свойств антитела (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Cavagnaro, J.A., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.) "Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals"; Hoboken, NJ: Wiley 2008; 45-65).

Для успешной неклинической оценки безопасности mAb следует выбирать наиболее релевантные виды животных для тестирования токсичности (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Chapman, K., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126). Релевантным видом является вид, в котором антитело является фармакологически активным, должен присутствовать или экспрессироваться антиген-мишень, и профиль тканевой перекрестной реактивности должен быть аналогичным профилю у человека (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Chapman, K., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). С использованием иммунохимических или функциональных анализов могут быть идентифицированы релевантные виды животных, которые экспрессируют желательный эпитоп и демонстрируют профиль тканевой перекрестной реактивности, аналогичный человеческим тканям (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Исследования перекрестной реактивности у видов, которые являются полезными в данном способе, включают иммуногистохимический обзор тканей из целого ряда видов с использованием имеющихся в продаже многовидовых тканевых микрочипов (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). В качестве альтернативы, оценка связывания антитела с клетками из данных животных посредством сортировки флюоресцентно-активированных клеток (FACS) типично является более чувствительной, чем иммуногистохимический анализ срезов тканей (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205). Следует сравнивать среди видов последовательности ДНК и аминокислот антигена-мишени; следует определять гомологию между видами (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205).

Кроме того, биораспределение, функция и структура антигена должны быть сравнимыми между релевантными видами животных и человеком для обеспечения оценки токсичности, возникающей в результате связывания антитела с антигеном-мишенью, которая называется токсичностью на мишени (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; 19, 20). Кроме того, сильные сходства в тканевом распределении антигена-мишени у видов животных и человека делают более вероятным то, что органы-мишени токсичности, идентифицированные у животных, будут прогнозировать потенциальные токсичности у человека. Недостаток сходства в тканевом распределении антигена между видами животных и человеком не исключает полностью виды животных для исследований токсичности, но данные различия должны быть приняты во внимание для оценки риска у человека. В том, что касается плотности или аффинности в отношении антигена, абсолютная эквивалентность между животной моделью и человеком аналогичным образом не требуется. Подтверждение релевантности видов, отобранных для тестирования токсичности, должно быть включено в документ для подачи в регулирующий орган. При использовании для оценки безопасности только одного вида, требуется краткое изложение экспериментов, которые демонстрируют отсутствие дополнительных релевантных видов (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11).

Если монокпональное антитело, предназначенное для терапевтического применения, не имеет видовой перекрестной реактивности, следует использовать либо имитирующее антитело, либо другой вид в качестве модели. Таким образом, имитирующие антитела являются потенциальным решением в отношении возможного ограниченного тестирования безопасности с гуманизированными моноклональными антителами с ограниченной видовой перекрестной реактивностью. Однако в настоящее время нет определенных критериев, посредством которых следовало бы судить о потенциальном имитирующем антителе до его применения в определении вопросов безопасности в отношении клинического агента (Regulatory Toxicology and Pharmacology, том 40, номер 3, декабрь 2004, страницы 219-226).

Таким образом, для идентификации животной модели для конкретного mAb следует принять во внимание приведенные выше соображения. Но тем не менее, необходимо, чтобы рассматриваемое mAb имело перекрестную реактивность с антигеном-мишенью тестируемого вида. В противном случае, не могут использоваться даже самые подходящие тестируемые виды. Следовательно, имеется потребность в mAb, у которых нет внутривидовой перекрестной реактивности, но имеется межвидовая перекрестная реактивность в отношении их мишени у человека и вида, предназначенного для неклинических испытаний.

А. Типичные антитела против трансферрина

В данном документе описываются антитела против трансферринового рецептора, которые имеют скорость диссоциации в отношении связывания с человеческим трансферриновым рецептором, которая находится в пределах определенного интервала, для того чтобы обеспечивать надлежащий челночный перенос через ГЭБ. Обнаружили то, что данный интервал, с одной стороны, определяется скоростью диссоциации мышиного антитела 128.1 против трансферринового рецептора (аминокислотные последовательности вариабельного домена приводятся в SEQ ID NO 64 и 65), определенной поверхностным плазменным резонансом, в отношении трансферринового рецептора яванского макака, и, с другой стороны, 5% данной скорости диссоциации (т.е. в 20 раз более медленная диссоциация). В одном воплощении скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора составляет от 0,1 1/с до 0,005 1/с включительно.

Гуманизированные антитела клона 299, как описано в данном документе, не были доступными посредством применения стандартных методик гуманизации. В аминокислотную последовательность требовалось ввести нестандартные мутации для того, чтобы получить гуманизированное антитело со скоростями диссоциации в отношении трансферринового рецептора в пределах намеченного интервала от 0,1 1/с до 0,005 1/с включительно. Это особенно важно, поскольку антитела, как описано в данном документе, разрабатываются для перечечения человеческого гематоэнцефалического барьера для челночного переноса терапевтического груза в мозг.

Обнаружили то, что для получения подходящего и возможного для разработки гуманизированного антитела два аминокислотных остатка цистеина в легкой цепи родительского кроличьего антитела должны были быть заменены аминокислотным остатком пролина и аспарагина соответственно. Кроме того, для нахождения в пределах данного интервала скорости диссоциации, остаток серина, присутствующий в середине кроличьей CDRL3, должен быть заменен остатком аланина.

Дополнительно было обнаружено то, что полезно изменять аминокислотные остатки в тяжелой цепи в положениях 65, 100g и 105 (нумерация согласно Kabat).

Вся нумерация в том виде, в котором она используется в данном документе, основывается на схеме нумерации вариабельного домена Kabat.

Клон 299 кроличьего антитела против трансферрина демонстрировал сравнимые свойства со свойствами антитела 128.1 против трсферринового рецептора. Это можно видеть из следующей Таблицы.

В следующей Таблице показаны скорости диссоциации гуманизированных вариантов вариабельного домена кроличьей легкой цепи клона 299 в комбинации с гуманизированными вариантами вариабельного домена кроличьей тяжелой цепи клона 299. Партнером связывания (определяется при 25°С) был человеческий трансферриновый рецептор.

Комбинация VH23 с VL9 была выбрана в качестве исходной точки для дальнейшего конструирования для разработки сайта связывания, который более близко отражает свойства связывания антитела 128.1 с трансферриновым рецептором яванского макака, по отношению к связыванию с человеческим трансферриновым рецептором.

В следующей Таблице для сравнения показаны скорости диссоциации разных типичных вариантов VH23 и VL9, а также разных других гуманизированных вариантов вариабельного домена в отношении человеческого трансферринового рцептора (определенные согласно Примеру 14, 25°С).

контроль: 128.1 - 7,78Е-02 (определено для трансферринового рецептора яванского макака).

В следующей Таблице для сравнения показаны кинетические данные разных типичных вариантов VH23 и VL9 (определенные согласно Примеру 13).

В следующей Таблице показаны скорости диссоциации гуманизированных вариантов вариабельного домена мышиной легкой цепи клона 494 в комбинации с гуманизированными вариантами вариабельного домена мышиной тяжелой цепи клона 494. Партнером связывания был человеческий трансферриновый рецептор.

Более подробно, в одном аспекте данное изобретение отчасти основано на данных о том, что антитело против трансферринового рецептора, как описано в данном документе, может быть использовано в качестве челночного модуля гематоэнцефалического барьера для доставки мозгового эффекторного соединения через гематоэнцефалический барьер в мозг. В некоторых воплощениях челночный модуль гематоэнцефалического барьера представляет собой одновалентное связывающее соединение, которое специфично связывается с трансферриновым рецептором. Антитела против трансферринового рецептора, как описано в данном документе, при использовании в качестве челночного модуля гематоэнцефалического барьера, являются полезными, например, для диагностики или лечения неврологических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и совместное заболевание болезнью Альцгеймера с болезнью Паркинсона.

Обнаружили то, что антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 37, отражает по отношению к человеческому трансферриновому рецептору свойства связывания мышиного антитела 128.1 в отношении трансферринового рецептора яванского макака в том, что касается скорости диссоциации связывания.

Соответственно, один аспект, как описано в данном документе, представляет собой выделенное антитело, которое связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR) и трансферриновым рецептором яванского макака (cyTfR), где данное антитело имеет определенную поверхностным плазменным резонансом скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора от 0,1 1/с до 0,005 1/с.

Другим аспектом, как описано в данном документе, является применение антитела или фрагмента антитела, которое связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR) и трансферриновым рецептором яванского макака (cyTfR), где данное антитело имеет определенную поверхностным плазменным резонансом скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора от 0,1 1/с до 0,005 1/с, для доставки терапевтического соединения через гематоэнцефалический барьер.

В одном воплощении скорость диссоциации определяется при 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 и 0 нМ.

В одном воплощении скорость диссоциации определяется с использованием чипа поверхностного плазмонного резонанса с биотиновой поверхностью и подвижным буфером 1× PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), дополненным 250 мМ хлоридом натрия, при скорости тока 10 мкл/мин.

В одном воплощении ассоциация отслеживается в течение 180 секунд, и диссоциация отслеживается в течение 600 секунд.

В одном воплощении скорость диссоциации определяется на BIAcore T200.

В одном воплощении скорость диссоциации составляет от 0,08 1/с до 0,008 1/с.

В одном воплощении всех аспектов скорость диссоциации определяется при 25°С.

В одном воплощении всех аспектов скорость диссоциации представляет собой скорость диссоциации, определенную при 25°С.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело против трансферринового рецептора, которое специфично связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR) и трансферриновым рецептором яванского макака (cyTfR), которое содержит: i) гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, полученный из вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 1, и ii) гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, полученный из вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 26, где вариабельный домен легкой цепи имеет в положении 80 аминокислотный остаток пролина (Р), в положении 91 аминокислотный остаток аспарагина (N) и в положении 93 аминокислотный остаток аланина (А) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении данное антитело дополнительно имеет в вариабельном домене тяжелой цепи в положении 100g аминокислотный остаток серина (S) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении данное антитело дополнительно имеет в вариабельном домене тяжелой цепи в положении 65 аминокислотный остаток серина (S) (нумерация согласно Kabat).

В одном воплощении данное антитело дополнительно имеет в вариабельном домене тяжелой цепи в положении 105 аминокислотный остаток глутамина (Q) (нумерация согласно Kabat).

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело против трансферринового рецептора, которое специфично связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR) и трансферриновым рецептором яванского макака (cyTfR), которое содержит: i) гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, полученный из вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 1, и ii) гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, полученный из вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 26, где данное антитело имеет скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора в единицах 1/с, которая равна или меньше, чем (т.е. самое большее составляет) скорость диссоциации антитела 128.1 против трансферринового рецептора в единицах 1/с в отношении трансферринового рецептора яванского макака, при этом скорости диссоциации определяются поверхностным плазменным резонансом, и при этом антитело 128.1 против трансферринового рецептора имеет вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 64 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 65.

В одном воплощении данное антитело имеет скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора в единицах 1/с, которая i) равна или меньше, чем (т.е. самое большее составляет) скорость диссоциации в единицах 1/с антитела 128.1 против трансферринового рецептора в отношении трансферринового рецептора яванского макака, ii) равна или больше, чем (т.е. по меньшей мере составляет) 5% скорости диссоциации в единицах 1/с антитела 128.1 против трансферринового рецептора в отношении трансферринового рецептора яванского макака.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело против трансферринового рецептора, которое специфично связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR) и трансферриновым рецептором яванского макака (cyTfR). В некоторых воплощениях антитело против трансферринового рецептора

- связывается с человеческим трансферриновым рецептором (huTfR) и трансферриновым рецептором яванского макака (cyTfR);

- имеет скорость диссоциации в отношении человеческого трансферринового рецептора в единицах 1/с, которая равна или меньше, чем (т.е. самое большее составляет) скорость диссоциации антитела 128.1 против трансферринового рецептора в отношении трансферринового рецептора яванского макака, при этом скорости диссоциации определяются поверхностным плазменным резонансом, и при этом антитело 128.1 против трансферринового рецептора имеет вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO 64 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO 65;

- связывается с человеческим трансферриновым рецептором со скоростью диссоциации, которая составляет от 0,1 1/с до 0,005 1/с включительно.

В одном аспекте в данном документе предложено антитело против трансферринового рецептора, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 71, 72 или 73; (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 75; (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 76; и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78.

В одном аспекте согласно данному изобретению предложено антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; и (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 71 или 72, или 73. В одном аспекте согласно данному изобретению предложено антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; и (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 72. В одном аспекте согласно данному изобретению предложено антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; и (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 73. В одном воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 71 или 72, или 73. В другом воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 71 или 72, или 73, и HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78. В другом воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 71 или 72, или 73, HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78, и HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68. В другом воплощении антитело содержит (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; и (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 72.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложено антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (a) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 75; (б) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 76; и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78. В одном воплощении антитело содержит (а) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 75; (б) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 76; и (в) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78.

В другом аспекте антитело по изобретению содержит (а) домен VH, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 71 или 72, или 73; и (б) домен VL, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 75; (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 76; и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78.

В другом аспекте согласно изобретению предложено антитело, содержащее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 72; (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 75; (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 76; и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 78.

В любом из приведенных выше воплощений антитело против трансферринового рецептора является гуманизированным. В одном воплощении антитело против трансферринового рецептора содержит такие же HVR, как и в любом из приведенных выше воплощений, и дополнительно содержит акцепторную человеческую каркасную область, например, каркасную область человеческого иммуноглобулина или человеческую консенсусную каркасную область.

В другом аспекте антитело против трансферринового рецептора содержит последовательность вариабельного домена (VH) тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 24 и имеющую примерно такую же скорость диссоциации, что и антитело, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO 24. В некоторых воплощениях последовательность VH, имеющая по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело против трансферринового рецептора, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связываться с трансферриновым рецептором с такой же скоростью диссоциации. В некоторых воплощениях в SEQ ID NO 24 всего было заменено, вставлено и/или подвергнуто делеции от 1 до 10 аминокислот. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции происходят в областях вне HVR (т.е. в FR). Возможно антитело против трансферринового рецептора содержит последовательность VH SEQ ID NO 24, включающую посттрансляционные модификации данной последовательности. В конкретном воплощении данная VH содержит одну, две или три HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66; (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 68; и (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 72.

В другом аспекте предложено антитело против трансферринового рецептора, где данное антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 37, и имеющий примерно такую же скорость диссоциации, что и антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) SEQ ID NO 37. В некоторых воплощениях последовательность VL, имеющая по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело против трансферринового рецептора, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связываться с трансферриновым рецептором с такой же скоростью диссоциации. В некоторых воплощениях в SEQ ID NO 37 всего было заменено, вставлено и/или подвергнуто делеции от 1 до 10 аминокислот. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции происходят в областях вне HVR (т.е. в FR). Возможно антитело против трансферринового рецептора содержит в SEQ ID NO 37 последовательность VL, включающую посттрансляционные модификации данной последовательности. В конкретном воплощении данная VL содержит одну, две или три HVR, выбранных из: (a) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 75; (б) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 76; и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 78.

В другом аспекте предложено антитело против трансферринового рецептора, где данное антитело содержит такой же VH, как и в любых из воплощений, предложенных выше, и такой же VL, как и в любых из воплощений, предложенных выше. В одном воплощении антитело содержит последовательности VH и VL в SEQ ID NO 24 и SEQ ID NO 37 соответственно, включающие посттрансляционные модификации данных последовательностей.

В другом аспекте изобретения антитело против трансферринового рецептора согласно любому из приведенных выше воплощений представляет собой моноклональное антитело, включающее химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном воплощении антитело против трансферринового рецептора представляет собой фрагмент антитела, например, фрагмент Fv, Fab, Fab', scFv, диатело или F(ab')2. В другом воплощении данное антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgG1 или другой класс, или изотип антитела, как определено в данном документе.

В одном воплощении всех аспектов антитело связано с терапевтическим соединением.

В другом воплощении всех аспектов антитело связано с визуализирующим агентом или с меткой.

В другом воплощении антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, и терапевтическое соединение, возможно, образует одну часть мультиспецифичного антитела. В одном таком воплощении мультиспецифичное антитело содержит первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с TfR, и второй антигенсвязывающий сайт, который связывается с мозговым антигеном. В одном таком аспекте мозговой антиген выбран из группы, состоящей из следующих: бета-секретаза 1 (ВАСЕ1), Абета, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2), тау, аполипопротеин Е (АроЕ), альфа-синуклеин, CD20, хантингтин, прионовый белок (PrP), киназа 2 с лейцинбогатыми повторами (LRRK2), паркин, пресенилин 1, пресенилин 2, гамма секретаза, рецептор смерти 6 (DR6), белок-предшественник амилоида (АРР), рецептор нейротрофина р75 (p75NTR), глюкоцереброзидаза и каспаза 6. В другом воплощении мультиспецифичное антитело связывается и с TfR, и с ВАСЕ1. В другом воплощении мультиспецифичное антитело связывается и с TfR, и с Абета. В другом воплощении мультиспецифичное антитело связывается и с TfR, и с альфа-синуклеином. В другом воплощении мультиспецифичное антитело связывается и с TfR, и с CD20. В другом воплощении мультиспецифичное антитело связывается и с TfR, и с глюкоцереброзидазой. В другом воплощении терапевтическое соединение представляет собой лекарственное средство против неврологического расстройства.

В одном аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложен фармацевтический препарат, содержащий любое из вышеупомянутых антител и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложено любое из вышеупомянутых антител для применения в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложено применение любого из вышеупомянутых антител в изготовлении лекарственного средства для лечения неврологического расстройства. В одном воплощении данное неврологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства, связанного с глазным заболеванием, эпилепсии, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления ЦНС.

В другом аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложено любое из вышеупомянутых антител для применения в лечении неврологического расстройства. В одном воплощении данное неврологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства, связанного с глазным заболеванием, эпилепсии, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления ЦНС.

В другом аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложено любое из вышеупомянутых антител для применения в транспортировке одного или более чем одного соединения через ГЭБ.

В другом аспекте приведенного выше воплощения предложено применение любого из вышеупомянутых антител в изготовлении лекарственного средства для транспортировки одного или более чем одного соединения через ГЭБ.

В одном аспекте приведенного выше воплощения предложен способ транспортировки соединения через ГЭБ у субъекта, включающий экспонирование любого из вышеупомянутых антител ГЭБ таким образом, что антитело транспортирует связанное с ним соединение через ГЭБ. В одном воплощении ГЭБ находится у человеческого субъекта. В одном воплощении вводится антитело, связанное с соединением, в терапевтической дозе. В одном воплощении данная терапевтическая доза является насыщающей TfR. В другом воплощении введение антитела осуществляется в дозе и/или частота дозирования калибруется для минимизации острых клинических симптомов введения антитела.

В другом аспекте приведенного выше воплощения предложен способ увеличения экспонирования ЦНС субъекта соединению, включающий экспонирование любого из вышеупомянутых антител ГЭБ таким образом, что антитело транспортирует связанное с ним соединение через ГЭБ. В одном воплощении ГЭБ находится у человеческого субъекта. В одном воплощении вводится антитело, связанное с соединением, в терапевтической дозе. В одном воплощении данная терапевтическая доза является насыщающей TfR. В другом воплощении введение антитела осуществляется в дозе и/или частота дозирования калибруется для минимизации острых клинических симптомов введения антитела.

В одном аспекте приведенного выше воплощения предложен способ увеличения удерживания в ЦНС соединения, введенного субъекту, включающий экспонирование любого из вышеупомянутых антител ГЭБ таким образом, что увеличивается удерживание в ЦНС соединения. В одном воплощении вводится антитело, связанное с соединением, в терапевтической дозе. В одном воплощении данная терапевтическая доза является насыщающей TfR. В другом воплощении введение антитела осуществляется в дозе и/или частота дозирования калибруется для минимизации острых клинических симптомов введения антитела.

В одном аспекте приведенного выше воплощения предложен способ лечения неврологического расстройства у млекопитающего, включающий лечение млекопитающего любым из вышеупомянутых антител. В одном воплощении данное неврологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства, связанного с глазным заболеванием, эпилепсии, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления ЦНС. В одном воплощении неврологическое расстройство наблюдается у человеческого субъекта. В одном воплощении вводится антитело, связанное с соединением, в терапевтической дозе. В одном воплощении данная терапевтическая доза является насыщающей TfR. В другом воплощении введение антитела осуществляется в дозе и/или частота дозирования калибруется для минимизации острых клинических симптомов введения антитела.

В одном воплощении у антитела модифицируется одно или более чем одно свойство, выбранное из эффекторной функции области Fc антитела, функции активации комплемента антитела и аффинности антитела в отношении TfR.

В одном воплощении данное свойство представляет собой эффекторную функцию области Fc антитела.

В одном воплощении данное свойство представляет собой функцию активации комплемента антитела.

В одном воплощении данное свойство представляет собой аффинность антитела в отношении TfR.

В одном воплощении эффекторная функция или функция активации комплемента была уменьшена или устранена по отношению к антителу дикого типа того же самого изотипа. В одном воплощении эффекторная функция уменьшается или устраняется способом, выбранным из уменьшения гликозилирования антитела, модификации изотипа антитела на изотип, который имеет пониженную или отсутствующую в природе эффекторную функцию, и модификации области Fc.

В одном воплощении эффекторная функция уменьшается или устраняется посредством уменьшения гликозилирования антитела. В одном воплощении гликозилирование антитела уменьшается способом, выбранным из следующих: продукция антитела в среде, которая не обеспечивает гликозилирование дикого типа; удаление углеводных групп, уже присутствующих на антителе; и модификация антитела таким образом, что гликозилирование дикого типа не происходит.

В одном воплощении гликозилирование антитела уменьшается продукцией антитела в среде, которая не обеспечивает гликозилирование дикого типа, такой как продукция в системе продукции, не являющейся клетками млекопитающего, или где антитело продуцируется синтетически. В одном воплощении антитело продуцируется в системе продукции, не являющейся клетками млекопитающего. В другом воплощении антитело производится синтетически.

В одном воплощении гликозилирование антитела уменьшается посредством модификации антитела таким образом, что гликозилирование дикого типа не происходит, как, например, при которой область Fc антитела содержит мутацию в положении 297 таким образом, что остаток аспарагина дикого типа в данном положении заменяется другой аминокислотой, которая препятствует гликозилированию в данном положении.

В одном воплощении эффекторная функция уменьшается или устраняется посредством по меньшей мере одной модификации области Fc. В одном воплощении эффекторная функция или функция активации комплемента уменьшается или устраняется делецией всей или части области Fc, или посредством инженерии антитела таким образом, что оно не включает область Fc или область, не являющуюся Fc, компетентную в отношении эффекторной функции или функции активации комплемента. В одном воплощении по меньшей мере одна модификация области Fc выбрана из следующих: точечная мутация области Fc для ухудшения связывания с одним или более чем одним рецептором Fc, выбранная из следующих положений: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 30 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, и 439; точечная мутация области Fc для ухудшения связывания с C1q, выбранная из следующих положений: 270, 322, 329 и 321; устранение некоторой части или всей области Fc и точечная мутация в положении 132 домена СН1. В одном воплощении данная модификация представляет собой точечную мутацию области Fc для ухудшения связывания с C1q, выбранную из следующих положений: 270, 322, 329 и 321. В другом воплощении данной модификацией является устранение некоторой части или всей области Fc. В другом воплощении функция запуска комплемента уменьшается или устраняется посредством делеции всей области Fc или ее части, или посредством инженерии антитела таким образом, что оно не включает область Fc, которая занята в пути комплемента. В одном воплощении антитело выбрано из Fab или одноцепочечного антитела. В другом воплощении модифицируется область антитела, не являющаяся Fc, с уменьшением или устранением активации пути комплемента антителом. В одном воплощении модификацией является точечная мутация области СН1 для ухудшения связывания с С3. В одном воплощении точечная мутация находится в положении 132 (см., например, Vidarte et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 38217-38223).

В одном аспекте приведенного выше воплощения аффинность антитела в отношении TfR уменьшается при измерении относительно антитела дикого типа того же самого изотипа, не имеющего пониженную аффинность в отношении TfR. В одном таком аспекте антитело имеет KD или IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация) в отношении TfR от примерно 1 пМ до примерно 100 мкМ.

В одном воплощении у антитела, как описано в данном документе, выключена эффекторная функция. В одном воплощении антитело не имеет эффекторной функции. В одном воплощении антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 и имеет мутации L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении антитело представляет собой:

а) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 или

б) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4, или

в) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и, возможно, P329G,

д) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи, или

е) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P и, возможно, P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи.

В одном аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложен фармацевтический препарат, содержащий любое из вышеупомянутых антител и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложено любое из вышеупомянутых антител для применения в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложено применение любого из вышеупомянутых антител в изготовлении лекарственного средства для лечения неврологического расстройства. В одном воплощении неврологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства, связанного с глазным заболеванием, эпилепсии, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления ЦНС.

В другом аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложено любое из вышеупомянутых антител для применения в лечении неврологического расстройства. В одном воплощении данное неврологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства, связанного с глазным заболеванием, эпилепсии, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления ЦНС.

В другом аспекте приведенного выше воплощения согласно изобретению предложено любое из вышеупомянутых антител для применения в транспортировке одного или более чем одного соединения через ГЭБ.

В другом аспекте приведенного выше воплощения предложено применение любого из вышеупомянутых антител в изготовлении лекарственного средства для транспортировки одного или более чем одного соединения через ГЭБ.

В одном аспекте приведенного выше воплощения предложен способ транспортировки соединения через ГЭБ у субъекта, включающий экспонирование любого из вышеупомянутых антител ГЭБ таким образом, что антитело транспортирует связанное с ним соединение через ГЭБ. В одном воплощении ГЭБ находится у человеческого субъекта. В одном воплощении антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном воплощении данная терапевтическая доза является насыщающей TfR. В другом воплощении введение антитела осуществляется в дозе и/или при частоте дозирования, откалиброванных для минимизации острых клинических симптомов введения антитела.

В другом аспекте приведенного выше воплощения предложен способ увеличения степени воздействия соединения на ЦНС субъекта, включающий экспонирование любого из вышеупомянутых антител ГЭБ таким образом, что антитело транспортирует связанное с ним соединение через ГЭБ. В одном воплощении ГЭБ находится у человеческого субъекта. В одном воплощении антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном воплощении данная терапевтическая доза является насыщающей TfR. В другом воплощении введение антитела осуществляется в дозе и/или при частоте дозирования, откалиброванных для минимизации острых клинических симптомов введения антитела.

В одном аспекте приведенного выше воплощения предложен способ увеличения удерживания в ЦНС соединения, введенного субъекту, включающий экспонирование любого из вышеупомянутых антител ГЭБ таким образом, что увеличивается удерживание соединения в ЦНС. В одном воплощении ГЭБ находится у человеческого субъекта. В одном воплощении антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном воплощении данная терапевтическая доза является насыщающей TfR. В другом воплощении введение антитела осуществляется в дозе и/или при частоте дозирования, откалиброванных для минимизации острых клинических симптомов введения антитела.

В одном аспекте приведенного выше воплощения предложен способ лечения неврологического расстройства у млекопитающего, включающий лечение млекопитающего любым из вышеупомянутых антител. В одном воплощении неврологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства, связанного с глазным заболеванием, эпилепсии, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления ЦНС. В другом таком аспекте неврологическое расстройство наблюдается у человеческого субъекта. В одном воплощении антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном воплощении данная терапевтическая доза является насыщающей TfR. В другом воплощении введение антитела осуществляется в дозе и/или при частоте дозирования, откалиброванных для минимизации острых клинических симптомов введения антитела.

В другом воплощении предложен способ уменьшения клиренса соединения, введенного субъекту, где данное соединение связано с антителом, которое с низкой аффинностью связывается с TfR таким образом, что уменьшается клиренс соединения.

В другом воплощении предложен способ оптимизации фармакокинетики и/или фармакодинамики соединения для того, чтобы оно было эффективным в ЦНС субъекта, где данное соединение связано с антителом, которое с низкой аффинностью связывается с TfR, и данное антитело выбрано таким образом, что его аффинность в отношении TfR после связывания с соединением приводит к такому уровню транспорта антитела, конъюгированного с соединением, через ГЭБ, который оптимизирует фармакокинетику и/или фармакодинамику соединения в ЦНС.

В другом аспекте антитело против трансферринового рецептора согласно любому из приведенных выше аспектов и воплощений может включать любую из характеристик, одиночно или в комбинации, как описано в Разделах 1-5 ниже.

1. Аффинность антитела

В одном воплощении Kd измеряется посредством анализа связывания радиоактивно меченого антигена (RIA). В одном воплощении RIA проводится с Fab версией интересующего антитела и его антигеном. Например, аффинность связывания Fab в отношении антигена в растворе измеряется посредством уравновешивания Fab с минимальной концентрацией меченного 125I антигена в присутствии рядов титрования немеченого антигена, затем захватывая связанный антиген планшетом, покрытым антителом против Fab (см., например, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Для установления условий для анализа многолуночные планшеты MICROTITER® (Thermo Scientific) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл захватывающего антитела против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6) и затем блокируют 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение двух-пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°С). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) 100 пМ или 26 пМ [125I]-антиген смешивается с серийными разведениями интересующего Fab (например, согласно оценке антитела против VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) - Fab-12 - в Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). Интересующий Fab затем инкубируется в течение ночи; однако, инкубация может продолжаться в течение более длительного периода (например, примерно 65 часов) для обеспечения того, что достигается равновесие. Затем смеси переносятся в захватывающий планшет для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Раствор затем удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% полисорбата 20 (TWEEN-20®) в PBS. При высыхании планшетов добавляют 150 мкл/лунку сцинтиллятора (MICROSCINT-20™; Packard), и в планшетах осуществляют счет на гамма-счетчике TOPCOUNT™ (Packard) в течение десяти минут. Для применения в анализах конкурентного связывания выбирают концентрации каждого Fab, которые дают связывание, меньшее чем или равное 20% от максимального связывания.

Согласно другому воплощению Kd измеряется с использованием анализа поверхностного плазменного резнанаса BIACORE®. Например, анализ с использованием BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) проводится при 25°C с использованием чипов СМ5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). В одном воплощении биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, BIACORE, Inc.) активируются N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидагидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводится 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~ 0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости тока 5 мкл/минуту с достижением приблизительно 10 единиц ответа (RU) связавшегося белка. После инъекции антигена инъецируется 1 М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики инъецируются двухкратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) с 0,05% поверхностно-активного вещества полисорбат 20 (TWEEN-20™) (PBST) при 25°С при скорости тока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) рассчитываются с использованием простой модели связывания Лангмюра один к одному (BIACORE® Evaluation Software, версия 3.2) посредством одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесная константа диссоциации (KD) рассчитывается как отношение koff/kon (см., например, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Если скорость ассоциации, определенная описанным выше поверхностным плазменным резонансом, превышает 106 М-1 с-1, тогда скорость ассоциации может быть определена посредством применения методики гашения флуоресценции, в которой измеряется увеличение или уменьшение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение - 295 нм; испускание - 340 нм, полоса пропускания - 16 нм) 20 нМ антитела против антигена (в виде Fab) в PBS, рН 7,2, при 25°С в присутствии возрастающих концентраций антигена при измерении в спектрометре, таком как спектрофотометр, оснащенный остановленной струей (Aviv Instruments), или спектрофотометр серии 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) с кюветой с перемешиванием.

2. Фрагменты антител

В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данном документе, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела включают фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv и scFv, и другие фрагменты, описанные ниже, но не ограничиваются ими. Для обзора определенных фрагментов антител, см. Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Для обзора фрагментов scFv см., например, Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; см. также WO 93/16185; US 5571894 и US 5587458. Для обсуждения фрагментов Fab и F(ab')2, содержащих остатки эпитопа, связываемого рецептором утилизации и имеющих повышенные периоды полувыведения in vivo, см. US 5869046.

Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифичными. См., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; и Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Триатела и тетратела также описываются в Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039129-134).

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть, или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых воплощениях однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, US 6248516).

Фрагменты антитела могут быть получены разными методиками, включающими протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продукцию рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е.coli или фагом), но не ограничивающимися ими, как описано в данном документе.

3. Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данном документе, представляет собой химерное антитело. Определенные химерные антитела описываются, например, в US 4816567; и Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). В одном примере химерное антитело содержит вариабельную область, не являющуюся человеческой (например, вариабельную область, происходящую от мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, не являющегося человеком, такого как обезьяна), и человеческую константную область. В другом воплощении химерное антитело представляет собой антитело «с переключением класса», у котрого класс или подкласс был изменен от класса или подкласса родительского антитела. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Типично антитело, не являющееся человеческим, гуманизируют для уменьшения иммуногенности у человека, при сохранении специфичности и аффинности родительского антитела, не являющегося человеческим. В общем, гуманизированное антитело содержит один или более чем один вариабельный домен, в котором HVR, например, CDR (или их части) происходят из антитела, не являющегося человеческим, и FR (или их части) происходят из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно также будет содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых воплощениях некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из антитела, не являющегося человеческим (например, антитела, из которого происходят остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Обзор гуманизированных антител и способов их получения делается, например, в Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, и они дополнительно описываются, например, в Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, С. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5821337, US 7527791, US 6982321 и US 7087409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (описывающей пересадку области, определяющей специфичность (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (описывающей «изменение поверхности (вариабельного домена)» (resurfacing)); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (описывающей «перетасовку FR»); и Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 и Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (описывающей подход «направленного отбора» для перетасовки FR).

Человеческие каркасные области, которые можно использовать для гуманизации, включают каркасные области, отобранные с использованием способа «наилучшей аппроксимации» (см., например, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; каркасные области, происходящие из консенсусной последовательности вариабельных областей легкой или тяжелой цепи конкретной подгруппы человеческих антител (см., например, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; и Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); человеческие зрелые (соматически мутировавшие) каркасные области или человеческие каркасные области зародышевой линии (см., например, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); и каркасные области, полученные в результате скрининга библиотек FR (см., например, Васа, М. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 и Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618), но не ограничиваются ими.

4. Мультиспецифичные антитела

В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данном документе, представляет собой мультиспецифичное антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух разных сайтов. В некоторых воплощениях одна из специфичностей связывания направлена в отношении трансферринового рецептора, и другая - в отношении любого другого антигена. Биспецифичные антитела также могут использоваться для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют трансферриновый рецептор. Биспецифичные антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методики получения мультиспецифичных антител включают рекомбинантную соэкспрессию двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, имеющих разные специфичности (см. Milstein, С. and Cuello, А.С., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829 и Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), и генетическую инженерию «выступ во впадину» (см., например, US 5731168), но не ограничиваются ими. Мультиспецифичные антитела также можно получать инженерией эффектов электростатического наведения для получения Fc-гетеродимерных молекул антитела (WO 2009/089004); поперечным связыванием двух или более чем двух антител или фрагментов (см., например, US 4676980 и Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); применением лейциновых молний для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; применением технологии «диатела» для получения биспецифичных фрагментов антител (см., например, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); применением димеров одноцепочечных Fv (scFv) (см., например, Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); и получением триспецифичных антител, как описано, например, в Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

В данный документ также включены генетически модифицированные антитела с тремя или более чем тремя функциональными антигенсвязывающими сайтами, включающие «антитела-осьминоги» (см., например, US 2006/0025576).

Антитело или фрагмент в данном документе также включает «Fab двойного действия» или «DAF», содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывается с трансферриновым рецептором, а также с другим, отличным антигеном (см., например, US 2008/0069820).

Антитело или фрагмент в данном документе также включает мультиспецифичные антитела, описанные в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, антитело против трансферринового рецептора представляет собой биспецифичное антитело.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является двухвалентное, биспецифичное антитело, содержащее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающуюся с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающуюся со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменяют друг друга,

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь и легкая цепь согласно а) представляют собой изолированные цепи.

В антителе согласно б)

в пределах легкой цепи

вариабельный домен легкой цепи VL заменен вариабельным доменом тяжелой цепи VH указанного антитела,

и

в пределах тяжелой цепи

вариабельный домен тяжелой цепи VH заменен вариабельным доменом легкой цепи VL указанного антитела.

В одном воплощении

i) в константном домене CL первой легкой цепи согласно а) аминокислота в положении 124 (нумерация согласно Kabat) заменена положительно заряженной аминокислотой, и где в константном домене СН1 первой тяжелой цепи согласно а) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация согласно индексу EU по Kabat) заменена отрицательно заряженной аминокислотой,

или

ii) в константном домене CL второй легкой цепи согласно б) аминокислота в положении 124 (нумерация согласно Kabat) заменена положительно заряженной аминокислотой, и где в константном домене СН1 второй тяжелой цепи согласно б) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация согласно индексу EU по Kabat) заменена отрицательно заряженной аминокислотой.

В одном предпочтительном воплощении

i) в константном домене CL первой легкой цепи согласно а) аминокислота в положении 124 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация согласно Kabat) (в одном предпочтительном воплощении - независимо лизином (K) или аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первой тяжелой цепи согласно а) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

или

ii) в константном домене CL второй легкой цепи согласно б) аминокислота в положении 124 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация согласно Kabat) (в одном предпочтительном воплощении - независимо лизином (K) или аргинином (R)), и где в константном домене СН1 второй тяжелой цепи согласно б) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении в константном домене CL второй тяжелой цепи аминокислоты в положении 124 и 123 заменяются на K (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении в константном домене СН1 второй легкой цепи аминокислоты в положении 147 и 213 заменяются на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном предпочтительном воплощении в константном домене CL первой легкой цепи аминокислоты в положении 124 и 123 заменяются на K, и в константном домене СН1 первой тяжелой цепи аминокислоты в положении 147 и 213 заменяются на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении в константном домене CL второй тяжелой цепи аминокислоты в положении 124 и 123 заменяются на K, и где в константном домене СН1 второй легкой цепи аминокислоты в положении 147 и 213 заменяются на Е, и в вариабельном домене VL первой легкой цепи аминокислота в положении 38 заменяется на K, и в вариабельном домене VH первой тяжелой цепи аминокислота в положении 39 заменяется на Е, в вариабельном домене VL второй тяжелой цепи аминокислота в положении 38 заменяется на K, и в вариабельном домене VH второй легкой цепи аминокислота в положении 39 заменяется на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Одним аспектом, как описано в данном документе, является двухвалентное, биспецифичное антитело, содержащее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающуюся с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающуюся со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменяют друг друга, и где константные домены CL и СН1 второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменяют друг друга,

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь и легкая цепь согласно а) представляют собой изолированные цепи.

В антителе согласно б)

в пределах легкой цепи

вариабельный домен легкой цепи VL заменен вариабельным доменом тяжелой цепи VH указанного антитела, и константный домен легкой цепи CL заменен константным доменом тяжелой цепи СН1 указанного антитела;

и

в пределах тяжелой цепи

вариабельный домен тяжелой цепи VH заменен вариабельным доменом легкой цепи VL указанного антитела, и константный домен тяжелой цепи СН1 заменен константным доменом легкой цепи CL указанного антитела.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является двухвалентное, биспецифичное антитело, содержащее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающиеся с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающиеся со вторым антигеном, где константные домены CL и СН1 второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменяют друг на друга,

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь и легкая цепь согласно а) представляют собой изолированные цепи.

В антителе согласно б)

в пределах легкой цепи

константный домен легкой цепи CL заменен константным доменом тяжелой цепи СН1 указанного антитела;

и в пределах тяжелой цепи

константный домен тяжелой цепи СН1 заменен константным доменом легкой цепи CL указанного антитела.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является мультиспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) один, два, три или четыре одноцепочечных фрагмента Fab, специфично связывающихся с одним-четырьмя дополнительными антигенами (т.е. вторым и/или третьим, и/или четвертым, и/или пятым антигеном, предпочтительно специфично связывающихся с одним дополнительным антигеном, т.е. со вторым антигеном),

в котором указанные одноцепочечные фрагменты Fab согласно б) слиты с указанным полноразмерным антителом согласно а) через пептидный линкер на С- или N-конце тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела,

где первый антиген или один из дополнительных антигенов представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

В одном воплощении один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с указанным полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце тяжелой или легкой цепей указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с указанным полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с указанным полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце легких цепей указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с указанным полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце каждой тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с указанным полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце каждой тяжелой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с указанным полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце каждой легкой цепи указанного полноразмерного антитела.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является трехвалентное биспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела,

б) первый полипептид, состоящий из

ба) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH),

или

бб) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена 1 антитела (СН1),

где указанный первый полипептид слит N-концом его домена VH через пептидный линкер с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела,

в) второй полипептид, состоящий из

ва) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL),

или

вб) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL),

где указанный второй полипептид слит N-концом домена VL через пептидный линкер с С-концом другой из двух тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела,

и

где вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) первого полипептида и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) второго полипептида совместно образуют антигенсвязывающийся сайт, специфично связывающийся со вторым антигеном,

и

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

В одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) полипептида согласно б) вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) полипептида согласно в) связаны и стабилизируются посредством межцепочечного дисульфидного мостика посредством введения дисульфидной связи между следующими положениями:

i) положением 44 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи или

ii) положением 105 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 43 вариабельного домена легкой цепи, или

iii) положением 101 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи (нумерация всегда согласно индексу EU по Kabat).

Методики введения неприродных дисульфидных мостиков для стабилизации описываются, например, в WO 94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393; или Schmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721. В одном воплощении возможная дисульфидная связь между вариабельными доменами полипептидов согласно б) и в) находится между положением 44 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи. В одном воплощении возможная дисульфидная связь между вариабельными доменами полипептидов согласно б) и в) находится между положением 105 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 43 вариабельного домена легкой цепи (нумерация всегда согласно Kabat). В одном воплощении предпочтительным является трехвалентное биспецифичное антитело без указанной возможной дисульфидной стабилизации между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечных фрагментов Fab.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является триспецифичное или тетраспецифичное антитело, содержащее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь полноразмерного антитела, которая специфично связывается с первым антигеном, и

б) вторую (модифицированную) легкую цепь и вторую (модифицированную) тяжелую цепь полноразмерного антитела, которая специфично связывается со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга и/или где константные домены CL и СН1 заменяют друг друга, и

в) где от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, которые специфично связываются с одним или двумя дополнительными антигенами (т.е. с третьим и/или четвертым антигеном), слиты через пептидный линкер с C- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей а) и/или б),

где первый антиген или второй антиген, или один из дополнительных антигенов представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь, и легкая цепь согласно а) представляют собой изолированные цепи.

В одном воплощении триспецифичное или тетраспецифичное антитело содержит согласно в) один или два антигенсвязывающих пептида, которые специфично связываются с одним или двумя дополнительными антигенами.

В одном воплощении антигенсвязывающие пептиды выбраны из группы фрагмента scFv и фрагмента scFab.

В одном воплощении антигенсвязывающие пептиды представляют собой фрагменты scFv.

В одном воплощении антигенсвязывающие пептиды представляют собой фрагменты scFab.

В одном воплощении антигенсвязывающие пептиды слиты с С-концом тяжелых цепей а) и/или б).

В одном воплощении триспецифичное или тетраспецифичное антитело содержит согласно в) один или два антигенсвязывающих пептида, которые специфично связываются с одним дополнительным антигеном.

В одном воплощении триспецифичное или тетраспецифичное антитело содержит согласно в) два идентичных антигенсвязывающих пептида, которые специфично связываются с третьим антигеном. В одном предпочтительном воплощении такие два идентичных антигенсвязывающих пептида оба слиты посредством одинакового пептидного линкера с С-концом тяжелых цепей а) и б). В одном предпочтительном воплощении два идентичных антигенсвязывающих пептида представляют собой либо фрагмент scFv, либо фрагмент scFab.

В одном воплощении триспецифичное или тетраспецифичное антитело содержит согласно в) два антигенсвязывающих пептида, которые специфично связываются с третьим и с четвертым антигеном. В одном воплощении указанные два антигенсвязывающих пептида слиты через одинаковый пептидный соединитель с С-концом тяжелых цепей а) и б). В одном предпочтительном воплощении указанные два антигенсвязывающих пептида представляют собой либо фрагмент scFv, либо фрагмент scFab.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное четырехвалентное антитело, содержащее:

а) две легкие цепи и две тяжелые цепи антитела, которые специфично связываются с первым антигеном (и содержат два фрагмента Fab),

б) два дополнительных фрагмента Fab антитела, которые специфично связываются со вторым антигеном, где указанные дополнительные фрагменты Fab оба слиты через пептидный линкер либо с C-, либо с N-концами тяжелых цепей а),

и

где во фрагментах Fab были проведены следующие модификации

i) в обоих фрагментах Fab а) или в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и/или константные домены CL и СН1 заменяют друг друга,

или

ii) в обоих фрагментах Fab а) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и константные домены CL и СН1 заменяют друг друга,

и

в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, или константные домены CL и СН1 заменяют друг друга,

или

iii) в обоих фрагментах Fab а) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, или константные домены CL и СН1 заменяются друг друга,

и

в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и константные домены CL и СН1 заменяют друг друга,

или

iv) в обоих фрагментах Fab а) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и в обоих фрагментах Fab б) константные домены CL и СН1 заменяют друг друга,

или

v) в обоих фрагментах Fab а) константные домены CL и СН1 заменяют друг друга, и в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга,

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

В одном воплощении указанные дополнительные фрагменты Fab оба слиты через пептидный линкер либо с С-концами тяжелых цепей а), либо с N-концами тяжелых цепей а).

В одном воплощении указанные дополнительные фрагменты Fab оба слиты через пептидный линкер с С-концами тяжелых цепей а).

В одном воплощении указанные дополнительные фрагменты Fab оба слиты через пептидный соединитель с N-концами тяжелых цепей а).

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab а) или в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяются друг на друга,

и/или

константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab а) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга,

и/или

константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab а) константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга,

и/или

константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab б) константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное четырехвалентное антитело, содержащее:

а) (модифицированную) тяжелую цепь первого антитела, которая специфично связывается с первым антигеном и содержит первую пару доменов VH-CH1, в которой с С-концом указанной тяжелой цепи слит N-конец второй пары доменов VH-CH1 указанного первого антитела через пептидный линкер,

б) две легкие цепи указанного первого антитела а),

в) (модифицированную) тяжелую цепь второго антитела, которая специфично связывается со вторым антигеном и содержит первую пару доменов VH-CL, в которой с С-концом указанной тяжелой цепи слит N-конец второй пары доменов VH-CL указанного второго антитела через пептидный линкер, и

г) две (модифицированные) легкие цепи указанного второго антитела в), причем каждая из них содержит пару доменов CL-CH1,

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

а) тяжелую цепь и легкую цепь первого полноразмерного антитела, которое специфично связывается с первым антигеном, и

б) тяжелую цепь и легкую цепь второго полноразмерного антитела, которое специфично связывается со вторым антигеном, где N-конец тяжелой цепи соединяется с С-концом легкой цепи через пептидный линкер,

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь и легкая цепь представляют собой выделенные цепи.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) фрагмент Fv, специфично связывающийся со вторым антигеном, содержащий домен VH2 и домен VL2, в котором оба домена соединяются друг с другом посредством дисульфидного мостика,

где только либо домен VH2, либо домен VL2 слит через пептидный линкер с тяжелой или легкой цепью полноразмерного антитела, специфично связывающегося с первым антигеном,

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

В данном биспецифичном антителе тяжелые цепи и легкие цепи согласно а) представляют собой изолированные цепи.

В одном воплощении другой из домена VH2 или домена VL2 не слит через пептидный линкер с тяжелой или легкой цепью полноразмерного антитела, специфично связывающегося с первым антигеном.

Во всех аспектах, как описано в данном документе, первая легкая цепь содержит домен VL и домен CL, и первая тяжелая цепь содержит домен VH, домен СН1, шарнирную область, домен СН2 и домен CH3.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное трехвалентное антитело, содержащее:

а) два фрагмента Fab, которые специфично связываются с первым антигеном,

б) один фрагмент CrossFab, который специфично связывается со вторым антигеном, в котором домены СН1 и CL заменяют друг друга,

в) одну область Fc, содержащую первую область Fc тяжелой цепи и вторую область Fc тяжелой цепи,

где С-концы доменов СН1 двух фрагментов Fab соединяются с N-концами полипептидов тяжелой цепи области Fc, и

где С-конец домена CL фрагмента CrossFab соединяется с N-концом домена VH одного из фрагментов Fab,

и

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное трехвалентное антитело, содержащее:

а) два фрагмента Fab, которые специфично связываются с первым антигеном,

б) один фрагмент CrossFab, который специфично связывается со вторым антигеном, в котором домены СН1 и CL заменяют друг друга,

в) одну область Fc, содержащую первую тяжелую цепь области Fc и вторую тяжелую цепь области Fc,

где С-конец домена СН1 первого фрагмента Fab соединяется с N-концом одного из полипептидов тяжелой цепи области Fc, и С-конец домена CL фрагмента CrossFab соединяется с N-концом другого полипептида тяжелой цепи области Fc, и

где С-конец домена СН1 второго фрагмента Fab соединяется с N-концом домена VH первого фрагмента Fab или с N-концом домена VH фрагмента CrossFab, и

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) фрагмент Fab, специфично связывающийся со вторым антигеном, содержащий домен VH2 и домен VL2, содержащий фрагмент тяжелой цепи и фрагмент легкой цепи, где

в пределах фрагмента легкой цепи

вариабельный домен легкой цепи VL2 заменяется на вариабельный домен тяжелой цепи VH2 указанного антитела,

и

в пределах фрагмента тяжелой цепи

вариабельный домен тяжелой цепи VH2 заменяется на вариабельный домен легкой цепи VL2 указанного антитела,

где фрагмент Fab тяжелой цепи вставлен между доменом СН1 одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела и соответствующей областью Fc полноразмерного антитела, и N-конец легкой цепи фрагмента Fab конъюгирован с С-концом легкой цепи полноразмерного антитела, которая образует пару с тяжелой цепью полноразмерного антитела, в которую был вставлен фрагмент Fab тяжелой цепи, и

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) фрагмент Fab, специфично связывающийся со вторым антигеном, содержащий домен VH2 и домен VL2, содержащий фрагмент тяжелой цепи и фрагмент легкой цепи, где

в пределах фрагмента легкой цепи

вариабельный домен легкой цепи VL2 заменен на вариабельный домен тяжелой цепи VH2 указанного антитела,

и

в пределах фрагмента тяжелой цепи

вариабельный домен тяжелой цепи VH2 заменен на вариабельный домен легкой цепи VL2 указанного антитела,

где С-конец фрагмента тяжелой цепи фрагмента Fab конъюгирован с N-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, и С-конец фрагмента легкой цепи фрагмента Fab конъюгирован с N-концом легкой цепи полноразмерного антитела, которая образует пару с тяжелой цепью полноразмерного антитела, с которой конъюгирован фрагмент тяжелой цепи фрагмента Fab, и

где первый антиген или второй антиген представляет собой человеческий трансферриновый рецептор.

В одном воплощении всех аспектов антитело, как описано в данном документе, представляет собой мультиспецифичное антитело, которое требует гетеродимеризации по меньшей мере двух полипептидов тяжелой цепи, и где антитело специфично связывается с человеческим трансферриновым рецептором и вторым антигеном, не являющимся человеческим трансферриновым рецептором.

Было описано несколько подходов для модификаций CH3 для того, чтобы поддерживать гетеродимеризацию, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291, которые включены в данный документ посредством ссылки. Типично в подходах, известных в данной области, и домен CH3 первой тяжелой цепи, и домен CH3 второй тяжелой цепи генетически модифицированы комплементарным образом таким образом, что тяжелая цепь, содержащая один генетически модифицированный домен CH3, больше не может гомодимеризоваться с другой тяжелой цепью той же самой структуры (например, первая тяжелая цепь с генетически модифицированным CH3 больше не может гомодимеризоваться с другой первой тяжелой цепью с генетически модифицированным CH3; и вторая тяжелая цепь с генетически модифицированным CH3 больше не может гомодимеризоваться с другой второй тяжелой цепью с генетически модифицированным CH3). Посредством этого тяжелая цепь, содержащая один генетически модифицированный домен CH3, принуждается к гетеродимеризации с другой тяжелой цепью, содержащей домен CH3, которая генетически модифицирована комплементарным образом. Для этого воплощения изобретения домен CH3 первой тяжелой цепи и домен CH3 второй тяжелой цепи генетически модифицируются комплементарным образом посредством аминокислотных замен таким образом, что первая тяжелая цепь и вторая тяжелая цепь принуждаются к гетеродимеризации, тогда как первая тяжелая цепь и вторая тяжелая цепь больше не могут гомодимеризоваться (например, по стерическим причинам).

В данной области известны разные подходы для поддержки гетеродимеризации тяжелых цепей, которые были процитированы и включены выше, и они рассматриваются как другие альтернативы, используемые в мультиспецифичном антителе по изобретению, которое содержит «неспаренную область Fab», полученную из первого антитела, которая специфично связывается с первым антигеном, и «спаренную область Fab», полученную из второго антитела, которая специфично связывается со вторым антигеном, в комбинации с конкретными аминокислотными заменами, описанными выше для данного изобретения.

Домены CH3 мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, могут быть изменены посредством технологии «выступ во впадину», которая подробно описана с несколькими примерами, например, в WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621 и Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. В данном способе взаимодействующие поверхности двух доменов CH3 изменяют для увеличения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих данные два домена CH3. Каждый из двух доменов CH3 (двух тяжелых цепей) может быть «выступом», тогда как другой - «впадиной». Введение дисульфидного мостика дополнительно стабилизирует гетеродимеры (Merchant, А.М., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) и увеличивает выход.

В одном предпочтительном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутацию T366W в домене CH3 «цепи выступа» и мутации T366S, L368A, Y407V в домене CH3 «цепи впадины» (нумерация согласно индексу EU по Kabat). Также может быть использован дополнительный межцепоченый дисульфидный мостик между доменами CH3 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), например, посредством введения мутации Y349C в домен CH3 «цепи выступа» и мутации Е356С или мутации S354C в домен CH3 «цепи впадины». Таким образом, в другом предпочтительном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации Y349C и T366W в одном из двух доменов CH3 и мутации Е356С, T366S, L368A и Y407V в другом из двух доменов CH3, или мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации Y349C и T366W в одном из двух доменов CH3 и мутации S354C, T366S, L368A и Y407V в другом из двух доменов CH3 (дополнительная мутация Y349C в одном домене CH3 и дополнительная мутация Е356С или S354C в другом домене CH3, образующая межцепочечный дисульфидный мостик) (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Но также альтернативно или дополнительно можно использовать другие технологии «выступа во впадину», как описано ЕР 1870459 А1. В одном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации R409D и K370E в домене CH3 «цепи выступа» и мутации D399K и E357K в домене CH3 «цепи впадины» (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутацию T366W в домене CH3 «цепи выступа» и мутации T366S, L368A и Y407V в домене CH3 «цепи впадины», и дополнительно мутации R409D и K370E в домене CH3 «цепи выступа» и мутации D399K и E357K в домене CH3 «цепи впадины» (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации Y349C и T366W в одном из двух доменов CH3 и мутации S354C, T366S, L368A и Y407V в других двух доменах CH3, или мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации Y349C и T366W в одном из двух доменов CH3 и мутации S354C, T366S, L368A и Y407V в других двух доменах CH3 и дополнительно мутации R409D и K370E в домене CH3 «цепи выступа» и мутации D399K и E357K в домене CH3 «цепи впадины» (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Помимо «технологии выступ во впадину» в данной области известны другие методики для модификации доменов CH3 тяжелых цепей мультиспецифичного антитела для усиления гетеродимеризации. Данные технологии, особенно технологии, описанные в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 и WO 2013/096291, рассматриваются здесь в качестве альтернатив «технологии выступ во впадину» в сочетании с мультиспецифичным антителом, как описано в данном документе.

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в ЕР 1870459. Данный подход основывается на введении заряженных аминокислот с противоположными зарядами в конкретные положения аминокислот на поверхности контакта доменов CH3/CH3 между обеими - первой и второй тяжелыми цепями.

Соответственно, данное воплощение относится к мультиспецифичному антителу, как описано в данном документе, где в третичной структуре антитела домен CH3 первой тяжелой цепи и домен CH3 второй тяжелой цепи образуют поверхность контакта, которая расположена между соответствующими доменами CH3 антитела, где каждая из соответствующих аминокислотных последовательностей домена CH3 первой тяжелой цепи и домена CH3 второй тяжелой цепи содержит набор аминокислот, которые расположены в пределах указанной поверхности контакта в третичной структуре антитела, где из набора аминокислот, которые расположены на поверхности контакта в домене CH3 одной тяжелой цепи первая аминокислота заменена на положительно заряженную аминокислоту, и из набора аминокислот, которые расположены на поверхности контакта в домене CH3 другой тяжелой цепи вторая аминокислота заменена на отрицательно заряженную аминокислоту. Мультиспецифичное антитело согласно данному воплощению в данном документе также называется «CH3(+/-)-генетически модифицированное мультиспецифичное антитело» (где сокращение «+/-» обозначает противоположно заряженные аминокислоты, которые были введены в соответствущие домены CH3).

В одном воплощении указанного CH3(+/-)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, положительно заряженная аминокислота выбрана из K, R и Н, и отрицательно заряженная аминокислота выбрана из Е или D.

В одном воплощении указанного CH3(+/-)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, положительно заряженная аминокислота выбрана из K и R, и отрицательно заряженная аминокислота выбрана из Е или D.

В одном воплощении указанного CH3(+/-)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, положительно заряженная аминокислота представляет собой K, и отрицательно заряженная аминокислота представляет собой Е.

В одном воплощении указанного CH3(+/-)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота R в положении 409 заменена на D, и аминокислота K в положении заменена на Е, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 399 заменена на K, и аминокислота Е в положении 357 заменена на K (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2013/157953. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на K, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на D (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В другом воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на K, и аминокислота L в положении 351 заменена на K, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на D (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В другом воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на K, и аминокислота L в положении 351 заменена на K, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на D (нумерация согласно индексу EU по Kabat). Дополнительно в домене CH3 другой тяжелой цепи содержится по меньшей мере одна из следующих замен: аминокислота Y в положении 349 заменена на Е, аминокислота Y в положении 349 заменена на D, и аминокислота L в положении 368 заменена на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении аминокислота L в положении 368 заменена на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2012/058768. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на Y, и аминокислота Y в положении 407 заменена на А, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на А, и аминокислота K в положении 409 заменена на F (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В другом воплощении в домене CH3 другой тяжелой цепи, помимо вышеупомянутых замен, заменена по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 411 (исходно Т), 399 (исходно D), 400 (исходно S), 405 (исходно F), 390 (исходно N) и 392 (исходно K) (нумерация согласно индексу EU по Kabat). Предпочтительными заменами являются следующие:

- замена аминокислоты Т в положении 411 аминокислотой, выбранной из N, R, Q, K, D, Е и W (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

- замена аминокислоты D в положении 399 аминокислотой, выбранной из R, W, Y и K (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

- замена аминокислоты S в положении 400 аминокислотой, выбранной из Е, D, R и K (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

- замена аминокислоты F в положении 405 аминокислотой, выбранной из I, М, Т, S, V и W (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

- замена аминокислоты N в положении 390 аминокислотой, выбранной из R, K и D (нумерация согласно индексу EU по Kabat) и

- замена аминокислоты K в положении 392 аминокислотой, выбранной из V, М, R, L, F и Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В другом воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе (генетически модифицированное согласно WO 2012/058768), в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на Y, и аминокислота Y в положении 407 заменена на А, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на V, и аминокислота K в положении 409 заменена на F (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В другом воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на А, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на А, и аминокислота K в положении 409 заменена на F (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В указанном последнем вышеупомянутом воплощении в домене CH3 указанной другой тяжелой цепи аминокислота K в положении 392 заменена на Е, аминокислота Т в положении 411 заменена на Е, аминокислота D в положении 399 заменена на R, и аминокислота S в положении 400 заменена на R (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2011/143545. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домены CH3 обеих тяжелых цепей вводятся модификации аминокислот в положениях 368 и/или 409 (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2011/090762. WO 2011/090762 относится к модификациям аминокислот согласно технологии «выступ во впадину». В одном воплощении указанного CH3(KiH)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на W, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на А (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В другом воплощении указанного CH3(KiH)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на Y, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на Т (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, которое принадлежит к изотипу IgG2, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2011/090762.

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2009/089004. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота K или N в положении 392 заменена на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном предпочтительном воплощении - на Е или D, в одном предпочтительном воплощении - на D), и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 399, аминокислота Е или D в положении 356, или аминокислота Е в положении 357 заменена на положительно заряженную аминокислоту (в одном предпочтительном воплощении - на K или R, в одном предпочтительном воплощении - на K, в одном предпочтительном воплощении аминокислоты в положениях 399 или 356 заменены на K) (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном дополнительном воплощении, помимо вышеупомянутых замен, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота K или R в положении 409 заменена на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном предпочтительном воплощении - на Е или D, в одном предпочтительном воплощении - на D) (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В еще одном другом воплощении, помимо или в качестве альтернативы вышеупомянутым заменам, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота K в положении 439 и/или аминокислота K в положении 370 независимо друг от друга заменены на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном предпочтительном воплощении - на Е или D, в одном предпочтительном воплощении - на D) (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2007/147901. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене CH3 одной тяжелой цепи аминокислота K в положении 253 заменена на Е, аминокислота D в положении 282 заменена на K, и аминокислота K в положении 322 заменена на D, и в домене CH3 другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 239 заменена на K, аминокислота Е в положении 240 заменена на K, и аминокислота K в положении 292 заменена на D (нумерация согласно индексу EU no Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2007/110205.

В одном воплощении всех аспектов и воплощений, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело представляет собой биспецифичное антитело или триспецифичное антитело. В одном предпочтительном воплощении изобретения мультиспецифичное антитело представляет собой биспецифичное антитело.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, антитело представляет собой двухвалентное или трехвалентное антитело. В одном воплощении данное антитело представляет собой двухвалентное антитело.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело имеет структуру константного домена антитела типа IgG. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 или к человеческому подклассу IgG1 с мутациями L234A и L235A. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG2. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG3. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG4 или к человеческому подклассу IgG4 с дополнительной мутацией S228P. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 или к человеческому подклассу IgG4. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 с мутациями L234A и L235A (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG4 с мутациями S228P и L235E (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую домен CH3, как определено в данном документе, содержит дополнительный С-концевой глицин-лизиновый дипептид (G446 и K447, нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую домен CH3, как определено в данном документе, содержит дополнительный С-концевой остаток глицина (G446, нумерация согласно индексу EU по Kabat).

5. Варианты антител

В некоторых воплощениях рассматриваются предложенные в данном документе варианты аминокислотной последовательности антител. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены введением подходящих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или посредством пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции из и/или вставки в, и/или замены остатков в пределах аминокислотных последовательностей антитела. Можно сделать любую комбинацию делеции, вставки и замены для получения конечной конструкции, при условии, что данная конечная конструкция обладает желательными характеристиками, например, связывания антигена.

а) Варианты с заменой, вставкой и делецией

В некоторых воплощениях предложены варианты антитела, имеющие одну или более чем одну аминокислотную замену. Интересующие сайты для мутагенеза, приводящего к заменам, включают HVR и FR. Консервативные замены показаны в Таблице 1 под заголовком «консервативные замены». В Таблице 1 предложены более существенные замены под заголовком «типичные замены», и, как описано далее ниже по отношению к классам боковых цепей аминокислот. В интересующее антитело могут быть введены аминокислотные замены, и продукты подвергаются скринингу в отношении желательной активности, например, сохраненного/улучшенного связывания антигена, пониженной иммуногенности или улучшенной ADCC или CDC.

Аминокислоты могут быть сгруппированы согласно общим свойствам боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены будут влечь за собой замену члена одного из данных классов на другой класс.

Один тип варианта с заменами включает замену одного или более чем одного остатка гипервариабельной области родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). В общем, полученный(ные) в результате вариант(ты), отобранный(ные) для дальнейшего исследования, будет(дут) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) относительно родительского антитела и/или будет(дут) иметь по существу сохраняющиеся определенные биологические свойства родительского антитела. Типичным вариантом с заменами является антитело с созревшей аффинностью, которое может быть с удобством получено, например, с использованием методик созревания аффинности на основе фагового дисплея, таких как методики, описанные в данном документе. Вкратце, один или более чем один остаток HVR мутируется, варианты антитела подвергаются дисплею на фаге и подвергаются скринингу на определенную биологическую активность (например, аффинность связывания).

Изменения (например, замены) могут быть сделаны в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть сделаны в «горячих точках» HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), и/или остатках, которые контактируют с антигеном, причем полученные в результате варианты VH или VL тестируются на аффинность связывания. Созревание аффинности посредством конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, в Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. В некоторых воплощениях созревания аффинности в выбранные для созревания вариабельные гены вводится разнообразие посредством любого из целого ряда способов (например, ПЦР (полимеразная цепная реакция), склонная к ошибкам, перетасовка цепи или мутагенез, управляемый олигонуклеотидом). Затем создается вторичная библиотека. Данная библиотека затем подвергается скринингу для идентификации любых вариантов антитела с желательной аффинностью. Другой способ введения разнообразия включает подходы, направленные на HVR, в которых рандомизируются несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за раз). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, могут быть специфично идентифицированы, например, с использованием мутагенеза на основе аланинового сканирования или моделирования. В частности, часто в качестве мишени используются CDR-H3 и CDR-L3.

В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут происходить в пределах одной или более чем одной HVR, при условии, что такие изменения по существу не уменьшают способность антитела к связыванию антигена. Например, в HVR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, как предложено в данном документе), которые по существу не уменьшают аффинность связывания. Такие изменения, например, могут быть вне остатков, контактирующих с антигеном в HVR. В некоторых воплощениях вариантов последовательностей VH и VL, предложенных выше, каждая HVR либо является неизменной, либо содержит не больше, чем одну, две или три аминокислотные замены.

Полезный способ идентификации остатков или областей антитела, которые могут служить в качестве мишени для мутагенеза, называется «мутагенезом на основе аланинового сканирования», как описано Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. В данном способе остаток или группа остатков-мишеней (например, заряженных остатков, таких как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируется и заменяется нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для определения того, подвергается ли влиянию взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены могут быть введены в положениях аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к исходным заменам. В качестве альтернативы или дополнительно, может быть определена кристаллическая структура комплекса антиген-антитело для идентификации контактных точек между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут служить в качестве мишени или устраняться в качестве кандидатов для замены. Варианты могут быть подвергнуты скринингу для определения того, имеют ли они желательные свойства.

Вставки в аминокислотную последовательность включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более чем сто остатков, а также вставки внутри последовательности одиночных или многих аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие вставочные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или С-концом антитела фермента (например, для ADEPT (антителоопосредованная терапия с использованием ферментов и пролекарств)) или полипептида, который увеличивает период полувыведения антитела в сыворотке.

б) Варианты по гликозилированию

В некоторых воплощениях предложенное в данном документе антитело изменяют для увеличения или уменьшения степени, в которой гликозилируется антитело. Добавление или делеция сайтов гликозилирования в антителе могут с удобством осуществляться посредством изменения аминокислотной последовательности таким образом, что создается или удаляется один или более чем один сайт гликозилирования.

Когда антитело содержит область Fc, может быть изменен углевод, присоединенный к ней. Природные антитела, продуцированные клетками млекопитающих, типично содержат разветвленный двухантенный олигосахарид, который обычно присоединен N-связью к Asn297 домена СН2 области Fc (см., например, Wright, A. and Morrison, S.L, TIBTECH 15 (1997) 26-32). Данный олигосахарид может включать разные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» структуры двухантенного олигосахарида. В некоторых воплощениях могут быть сделаны модификации олигосахарида в антителе по изобретению для того, чтобы создать варианты антитела с некоторыми улучшенными свойствами.

В одном воплощении предложены варианты антитела, имеющие структуру углевода, в которой отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или опосредованно) к области Fc. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяется посредством расчета среднего количества фукозы в пределах цепи сахара на Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn297 (например, сложных, гибридных и высокоманнозных структур), при измерении масс-спектрометрией MALDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы), как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположеному примерно в положении 297 в области Fc (EU нумерация остатков области Fc); однако, Asn297 также может быть расположен примерно в плюс/минус 3 аминокислотах выше или ниже положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, из-за минорных вариаций последовательности в антителах. Такие фукозилированные варианты могут иметь улучшенную функцию ADCC. См., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621. Примеры публикаций, относящихся к «дефукозилированным» или «дефицитным по фукозе» вариантам антител включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Примеры линий клеток, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают клетки СНО (яичники китайского хомяка) Leс13, дефицитные по фукозилированию белка (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, особенно в Примере 11), и нокаутные линии клеток, такие как нокаутные клетки СНО по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688 и WO 2003/085107).

Кроме того, предложены варианты антител с разделенными надвое олигосахаридами, например, в которых двухантенный олигасахарид, присоединенный к области Fc антитела, разделен надвое GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженное фукозилирование и/или улучшенную функцию ADCC. Примеры таких вариантов антител описываются, например, в WO 2003/011878; US 6602684 и US 2005/0123546. Также предложены варианты антител с по меньшей мере одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к области Fc. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию CDC. Такие варианты антител описываются, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

в) Варианты области Fc

В некоторых воплощениях в область Fc антитела, предложенного в данном документе, могут быть введены одна или более чем одна аминокислотная модификация, генерируя, посредством этого, вариант области Fc. Данный вариант области Fc может содержать последовательность человеческой области Fc (например, области Fc человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более чем одном положении аминокислоты.

В некоторых воплощениях согласно данному изобретению рассматривается вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, которые делают его желательным кандидатом для применений, в которых важным является период полувыведения антитела in vivo, тем не менее, определенные эффекторные функции (такие как комплемент и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Могут проводиться анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения уменьшения/устранения активностей CDC и/или ADCC. Например, анализы связывания с рецептором Fc (FcR) могут проводиться для обеспечения того, что у антитела отсутствует связывание с FcγR (следовательно, вероятно отсутствует активность ADCC), но сохраняется способность к связыванию с FcRn. У первичных клеток для опосредования ADCC - клеток NK - экспрессируется только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена в Таблице 3 на странице 464 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки активности ADCC интересующей молекулы описываются в US 5500362 (см., например, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063 и Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5821337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). В качестве альтернативы, можно использовать способы нерадиоактивного анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают одноядерные клетки периферической крови (РВМС) и клетки-природные киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы можно оценивать in vivo, например, в такой животной модели, как модель, раскрытая в Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Также можно проводить анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не способно связываться с C1q и, следовательно, не имеет активности CDC. См., например, ELISA связывания C1q и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052 и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Связывание с FcRn и определения клиренса/периода полувыведения in vivo также можно проводить с использованием способов, известных в данной области (см., например, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769).

Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более чем одного остатка области Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US 6737056). Такие мутанты Fc включают мутантов Fc с заменами в двух или более чем двух положениях аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (US 7332581).

Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR (см., например, US 6737056; WO 2004/056312 и Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

В некоторых воплощениях вариант антитела содержит область Fc с одной или более чем одной аминокислотной заменой, которая улучшает ADCC, например, с заменами в положениях 298, 333 и/или 334 области Fc (EU нумерация остатков).

В некоторых воплощениях в области Fc делаются изменения, которые приводят к измененным (т.е. либо улучшенным, либо уменьшенным) связыванию с C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в US 6194551, WO 99/51642 и Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

Антитела с увеличенными периодами полувыведения и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG в плод (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 и Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), описываются в US 2005/0014934. Данные антитела содержат область Fc с одной или более чем одной заменой в ней, которая улучшается связывание области Fc с FcRn. Такие варианты Fc включают варианты с заменами в одном или более чем одном остатке Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой остатка 434 области Fc (US 7371826).

См. также Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5648260; US 5624821 и WO 94/29351 относительно других примеров вариантов области Fc.

г) Варианты антител, модифицированные по цистеину

В некоторых воплощениях может быть желательным создание антител, модифицированных по цистеину, например, «тиоМАб», в которых один или более чем один остаток антитела заменен остатком цистеина. В конкретных воплощениях замененные остатки встречаются в доступных сайтах антитела. Посредством замены данных остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы располагаются в доступных сайтах антитела и могут быть использованы для конъюгирования антитела с другими группировками, такими как группировки лекарственных средств или группировки линкер-лекарственное средство, с созданием иммуноконъюгата, как описано в данном документе далее. В некоторых воплощениях любой один или более чем один из следующих остатков может быть заменен на цистеин: V205 (нумерация по Kabat) легкой цепи; А118 (нумерация EU) тяжелой цепи и S400 (нумерация EU) тяжелой цепи области Fc. Антитела, модифицированные по цистеину, могут быть получены, как описано, например, в US 7521541.

д) Производные антител

В некоторых воплощениях предложенное в данном документе антитело может быть дополнительно модифицировано так, чтобы оно содержало дополнительные небелковые группировки, которые известны в данной области и являются легкодоступными. Группировки, подходящие для дериватизации антитела, включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1, 3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущества в производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и, при присоединении более чем одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем, число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, могут определяться на основе соображений, включающих конкретные свойства или функции антитела, подлежащие улучшению, но не ограничивающиеся ими, независимо от того, будет ли производное антитела использоваться в терапии при определенных условиях, и т.д.

В другом воплощении предложены конъюгаты антитела и небелковой группировки, которая может быть селективно нагрета под воздействием радиации. В одном воплощении небелковая группировка представляет собой углеродную нанотрубку (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Радиация может иметь любую длину волны и включает длины волн, которые не причиняют вреда обычным клетках, но которые нагревают небелковую группировку до температуры, при которой умерщвляются клетки, приближенные к небелковой группировке антитела, но не ограничивается ими.

Б. Челночные модули гематоэнцефалического барьера

В одном воплощении всех аспектов антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, имеющее по меньшей мере одну специфичность связывания в отношении трансферринового рецептора и по меньшей мере одну специфичность связывания в отношении терапевтической мишени. В одном воплощении антитело содержит первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с трансферриновым рецептором, и второй антигенсвязывающий сайт, который связывается с мозговым антигеном. В другом воплощении мозговой антиген выбран из группы, стостящей из Абета, рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), рецептора 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2), альфа-синуклеина, CD20, глюкоцереброзидазы или белка-предшественника амилоида (АРР). В одном предпочтительном воплощении мультиспецифичное антитело связывается с обоими из следующих:

i) трансферриновый рецептор и Абета, или

ii) трансферриновый рецептор и CD20, или

iii) трансферриновый рецептор и альфа-синуклеин, или

iv) трансферриновый рецептор и фосфо-тау, или

v) трансферриновый рецептор и HER2, или

vi) трансферриновый рецептор и глюкоцереброзидаза.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 81 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 82 сайта связывания в отношении Абета.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 79 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 80 сайта связывания в отношении человеческого CD20. В одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи содержит замену аминокислотного остатка в положении 11 по Kabat на любую аминокислоту, но не лейцин. В одном воплощении данная замена включает замену аминокислотного остатка в положении 11 по Kabat на неполярную аминокислоту. В одном предпочтительном воплощении данная замена включает замену аминокислотного остатка в положении 11 по Kabat в вариабельном домене тяжелой цепи SEQ ID NO 79 на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из валина, лейцина, изолейцина, серина и фенилаланина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 83 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 84 сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, полученного из SEQ ID NO 85, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, полученного из SEQ ID NO 86, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, полученного из SEQ ID NO 87, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, полученного из SEQ ID NO 88, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, полученного из SEQ ID NO 89, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, полученного из SEQ ID NO 90, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 91, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 92, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 93, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 94, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 24 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 37, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и сайт связывания в отношении человеческой глюкоцереброзидазы.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 7 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 34, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 83 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 84 сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 7 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 34, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 85 и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 86 сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 7 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 34, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 87, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 88, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 7 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 34, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 89, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 90, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 7 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 34, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 91 и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 92, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 7 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 34, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и по меньшей мере одну пару гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи, происходящего из SEQ ID NO 93, и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи, происходящего из SEQ ID NO 94, сайта связывания в отношении человеческого альфа-синуклеина.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, содержащее по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO 7 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO 34, образующую сайт связывания в отношении трансферринового рецептора, и сайт связывания в отношении человеческой глюкоцереброзидазы.

Одновалентные связывающие соединения, которые специфично связываются с рецептором гематоэнцефалического барьера, могут быть охарактеризованы в отношении их свойств связывания и трансцитоза:

- эффективное клеточное связывание с клетками, экспрессирующими РГЭБ, в качестве одновалентного связывающего соединения,

- эффективный трансцитоз in vitro в качестве одновалентного связывающего соединения,

- перекрестная реактивность в отношении антигенов человека-яванского макака (например, в экспериментах BIAcore и FACS (флуоресцентная сортировка клеток)).

Скрининг на трансцитоз можно проводить в анализе на основе hCMEC/D3. Данный анализ можно проводить в режиме импульсного мечения. Мозговые эндотелиальные клетки hCMEC/D3 инкубируются с одновалентным связывающим соединением в течение 1 часа, затем промываются, и в 0 часов и 4 часа после промывки определяются следующие параметры:

i) количество одновалентного связывающего соединения, поглощенного в клетки на протяжении стадии загрузки,

ii) базолатеральное количество одновалентного связывающего соединения чер