Способ поверхностной стерилизации бобов сои in vitro

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к культивированию тканей и органов растений и может быть использовано в сельском хозяйстве для повышения эффективности работы с растениями сои in vitro в селекции растений.

Известен способ поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, включающий получение бобов, их стерилизацию 10 минут в 70%-этане, промывку 5 минут в дистиллированной воде и 10 минут в 0,1%-м растворе диацида, выделение эксплантов, культивирование на питательной среде и учет. (см. например: Хохлова Н.И, Фисенко П.П. Культура незрелых зародышей диких австралийских видов сои // Некоторые вопросы селекции и технологии возделывания сельскохозяйственных культур в Приморье, 1994. - С. 10-17.)

Недостатком данного способа поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, является:

- использование диацида - высокотоксичного ртуть содержащего соединения (1 класс опасности), оказывающего мутагенное и канцерогенное действие;

- большая трудоемкость при промывке после стерилизации бобов сои.

Известен способ поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, включающий получение бобов, их стерилизацию 48 часов отбеливателем с содержанием хлора 8-12% с добавлением 3,5 мл концентрированной серной кислоты, 5 кратную промывку стерильной дистиллированной водой, выделение эксплантов, культивирование на питательной среде и учет. (см. например: Raza G, Singh MB, Bhalla HL. In Vitro. Plant Regeneration from Commercial Cultivars of Soybean // Biomed Research Internatuonal. - 2017. - Vol. 2017(1). - P. 1-9.)

Недостатком способа поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, является:

- получение и использование высокотоксичного газообразного хлора;

- продолжительное время проведения стерилизации бобов сои;

- большое количество промывок после поверхностной стерилизации бобов сои.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, включающий получение бобов, их стерилизацию в течении 2 минут в 70% 2-пропанолом и помещением в 1% раствор гипохлорита натрия (20% отбеливатель Clorox) на 10 минут, 4-х кратное промывание стерильной водой, выделение эксплантов, культивирование на питательной среде, учет, (см.например: Wennuan L., Patricia J.M., Glenn B.C. Somatic embryogenesis in soybean via somatic embryo cycling. //In Vitro Cell. Dev. Biol. - 1992. - Vol. 28. - P. 153-160.)

Недостатком способа поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, является:

- затрата продолжительного времени на стерилизацию бобов сои;

- большое количество промываний после воздействия стерилизующего агента на бобы сои.

Цель изобретения - упрощение способа поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, повышение выхода стерильных и жизнеспособных эксплантов сои in vitro, ускорение селекционного процесса в селекции, сведение до минимума вредного воздействия стерилизующего агента.

Указанная цель достигается тем, что в способе поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, включающем получение бобов, их стерилизацию агентом, промывку, выделение эксплантов, культивирование на питательной среде и учет, согласно изобретению стерилизацию бобов сои осуществляют в растворе агента «АХД-2000 экспресс» в течении 1,5 минут, с последующей 2-х кратной промывкой стерильной дистиллированной водой, при этом раствор агента используют многократно до семи раз.

По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа поверхностной стерилизации бобов сои in vitro является следующее:

1. «стерилизацию бобов осуществляют в растворе агента «АХД-2000 экспресс» в течение 1,5 минут…», что позволяет:

- отказаться от использования токсичных стерилизующих агентов, что снизить вредоносное воздействие его на персонал;

- сократить время стерилизации, что ускорит селекционный процесс в селекции растений;

- повысить выход стерильных и жизнеспособных эксплантов сои in vitro;

- использовать данный стерилизующий агент впервые в культуре тканей и органов растений.

2. «…с последующей 2-х кратной промывкой стерильной дистиллированной водой…», что позволяет:

- сократить время промывки стерильной дистиллированной водой, что ускорит селекционный процесс;

- уменьшить количество используемой стерильной дистиллированной воды.

3. «…при этом раствор агента используют многократно до семи раз», что позволяет:

- сэкономить стерилизующий агент в количественном и стоимостном выражении;

- получать высокую долю асептических жизнеспособных эксплантов.

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели доказывают, что заявляемый способ обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решений, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ поверхностной стерилизации бобов сои in vitro имеет изобретательский уровень.

Предлагаемый способ поверхностной стерилизации бобов сои in vitro осуществляется следующим образом. В подготовленную почву высаживают семена сои на полевых делянках и культуральной комнате. В июле, августе месяце собирают незрелые бобы сои с растений размером семян 4-7 мм, как с опытных полей, так и в культуральной комнате. Поверхностную стерилизацию осуществляют в условиях ламинар-бокса путем погружения бобов сои в готовый раствор дезинфицирующего средства «АХД-2000 экспресс» [действующие вещества: N-пропанол (пропанол-1) 40%; Алкилдим тилбензиламмоний хлорид (АДБАХ) 0,15%; Изопропиловый спирт (пропанол-2) 35%]. Процесс стерилизации длиться 1,5 минуты.

Из таблицы 1 видно, что эффективным стерилизующим агентом является АХД-2000 экспресс для бобов сои генотипа 1Н. При экспозиции 1,5 мин. выход жизнеспособных эксплантов составляет 100%.

Из таблицы 2 видно, что эффективным стерилизующим агентом является АХД-2000 экспресс для бобов сои генотипа 1Н. При экспозиции 1,5 мин. выход жизнеспособных эксплантов составляет 100%.

Данные таблицы 3 показывают, что эффективным стерилизующим агентом является АХД-2000 экспресс для бобов сои генотипа 2Н. При экспозиции 1,5 мин. выход жизнеспособных эксплантов составляет 100%.

Данные таблицы 4 показывают, что эффективным стерилизующим агентом является АХД-2000 экспресс для бобов сои генотипа 2Н. При экспозиции 1,5 мин. выход жизнеспособных эксплантов составляет 100%.

Данные таблицы 5 показывают, что эффективным стерилизующим агентом является АХД-2000 экспресс для бобов сои генотипа 3Н. При экспозиции 1,5 мин. выход жизнеспособных эксплантов составляет 100%.

Данные таблицы 6 показывают, что эффективным стерилизующим агентом является АХД-2000 экспресс для бобов сои генотипа 3Н. При экспозиции 1,5 мин. выход жизнеспособных эксплантов составляет 100%.

Далее следует 2-х кратная промывка стерильной дистиллированной водой бобов сои генотипов 1Н, 2Н, 3Н.

Из таблица 7 видно, что оптимальным количеством промывок стерилизованных бобов сои in vitro генотипов 1Н, 2Н, 3Н составляет две, при 1,5 минуты воздействия агента АХД-2000 экспресс.

Данные таблицы 8 показывают, что эффективным количеством повторностей применения стерилизующего агента АХД-2000 экспресс по разным генотипам, выращенных в различных условиях, составляет до 7 раз.

Стерильные бобы сои помещают в чашки Петри, извлекают недозрелые зародыши длиной 4-7 мм. Экспланты отчленяют и помещают по одной в пробирку диаметром 18 мм для культивирования на питательную среду, содержащую: соли MS (Murashige and Skoog, 1962), витамины B5 (Gamborg et al., 1968), 3% сахарозы, 0,65% агара, при рН 5,9 до автоклавирования, 5 мг/л 2,4-D. Учет эффективности применения стерилизующего агента проводят через четыре недели после посадки.

Применение предлагаемого изобретения позволит упростить способ поверхностной стерилизации бобов сои in vitro, повысить выход стерильных и жизнеспособных эксплантов сои in vitro, ускорить селекционный процесс в селекции, свести до минимума вредного воздействия стерилизующего агента.