ПРИМЕНЕНИЕ ЛИЗИНА ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ/УВЕЛИЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ В ПРИСУТСТВИИ ЛЕГОЧНОГО СУРФАКТАНТА, КОТОРЫЙ ИНГИБИРУЕТ УКАЗАННЫЕ АНТИБИОТИКИ

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/220,212, поданной 17 сентября 2015 года, и предварительной заявки на патент США 62/247,619, поданной 28 октября 2015 года; содержание данных предварительных заявок полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к области борьбы с бактериальной инфекцией, более конкретно, дыхательных путей, и еще более конкретно, нижних дыхательных путей, в особенности, тканей и органов, эпителий которых характеризуется присутствием легочного сурфактанта. Настоящее изобретение в большей степени затрагивает проблему снижения эффективности антибиотиков при борьбе с инфекцией, которое вызвано факторами в окружающей среде области инфицировани, такими как легочный сурфактант, нежели развития резистентности к антибиотикам.

Описание предшествующего уровня техники

[0002] Полипептид бактериофага лизин CF-301 представляет собой первое в своем классе антимикробное средство для лечения бактериемии Staphylococcus aureus и эндокардита, находящееся в разработке. Характерные свойства CF-301 включают быстрый патоген-специфичный бактериолиз, отсутствие резистентности, синергию с антибиотиками, соответсвующим стандартам оказания медицинской помощи, и активность против биопленок (Schuch et al., JInfect Dis.; 209(9):1469-78 (2014). doi: 10.1093/infdis/jit637. Epub 2013 Nov 28.). CF-301 представляет собой первый лизин, клинические исследования которого, контролируемые FDA, были начаты. CF-301 (PlySs2) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 (учетный номер GenBank ZP 03625529), и был описан в патенте США №9034322.

[0003] Другие лизины, активные против Staphylococci, которые вызывают инфекции воздухоносных или дыхательных путей, включают, без ограничения, PlyC, PlyGBS, LysK, лизостафин, химерный лизин ClyH (Cheng et al. Antimicrob Agents Chemother. 49(1):111-117 (2005); McGowan et al. Proc Natl Acad Sci U S A.,109(31):12752-7 (2012), Becker et al. FEMS Microbiol Lett., 287(2):185-91 (2008), Yang et al. Antimicrob Agents Chemother. 2014; 58(1):536-42 (2014). Полипептиды лизина, активные против Streptococcus pneumoniae, включают лизины PAL и Cpl1, описанные, соответственно, в публикациях WO 2008/00132 (включая последовательность домена CHAP для химеризации) и CN 102021161 (Garcia et al. J Virol. 61(8):2573-80 (1987); Varea et al. J Biol Chem., 279(42):43697-707. (2004)). Описания вышеуказанных патентов и ссылок полностью включены посредством ссылки для всех целей. Были идентифицированы некоторые другие лизины, активные против множества бактериальных патогенов, включая бактерий, которые вызывают инфекции воздухоносных путей и, более конкретно, нижних дыхательных путей. Перечень лизинов доступен по ссылке: http://www.rockefeller.edu/vaf/phagelist.php.

[0004] Циклический липопептидный антибиотик даптомицин был одобрен для лечения инфекций кожи и кожных структур. Даптомицин является в высокой степени бактерицидным против грамположительных (G+) бактерий и осуществляет свою активность посредством встраивания в G+ плазматическую мембрану и разрушения ее функциональной целостности - механизма, строго зависимого от присутствия физиологических уровней свободного кальция. Однако даптомицин не смог удовлетворить критериям клинического исследования тяжелой внебольничной пневмонии. Было показано, что данный недостаток обусловлен взаимодействием между даптомицином и легочным сурфактантом, который ингибирует активность данного антибиотика, в особенности, в условиях легких и, в более широком смысле, в условиях воздухоносных путей, в которых присутствует легочный сурфактант. Surfactant Inhibition of Daptomycin, Silverman, J. A. et al, JID, 191:2149-2152 (2005). Таким образом, даптомицин не показан для лечения инфекций легких и, в более широком смысле, воздухоносных путей (в особенности, нижних дыхательных путей), и специалисты в данной области техники не будут применять схему лечения, включающую даптомицин, для лечения таких инфекций. Неспособность даптомицина бороться с инфекцией в присутствии легочных сурфактантов была наглядно продемонстрирована в публикации Koplowicz et al. Clin Infect Dis. 49(8):1286-7 (2009). Недавние исследования были сфокусированы на преодолении отсутствия активности даптомицина в присутствии сурфактанта посредством исследования и оценки антибактериальной активности гибридных молекул структурно родственного липопептида А54145 (Nguyen et al. Antimicrob Agents Chemother. 2010 Apr; 54(4): 1404-1413).

[0005] Легочный сурфактант, первичный компонент бронхоальвеолярной жидкости, представляет собой сложную смесь белков и липидов, которая покрывает внутреннюю поверхность воздухоносных путей, снижая поверхностное натяжение в альвеолах. Сурфактант состоит, главным образом, из дипальмитоилфосфатидилхолина (~ 80% у всех видов млекопитающих) наряду со значительными количествами фосфатидилглицерола (ФГ) и меньшими количествами минорных фосфолипидов, нейтральных липидов и холестерола. Присутствуют 4 белковых компонента: гидрофильные белки SP-A и SP-D и гидрофобные белки SP-B и SP-C. Goerke J. Pulmonary surfactant: functions and molecular composition. Biochim Biophys Acta 1998; 1408:79-89. Даптомицин вводят в искусственные мембранные везикулы, состоящие из фосфатидилхолина (ФХ) и ФХ/ФГ. Lakey JH, et al: Fluorescence indicates a calcium-dependent interaction between the lipopeptide antibiotic LY146032 and phospholipid membranes. Biochemistry 1988; 27:4639-45; Jung D, et al. Structural transitions as determinants of the action of the calcium-dependent antibiotic daptomycin. Chem Biol 2004; 11:949-57.

[0006] Главной проблемой в медицине является появление резистентных к лекарственным средствам бактерий, поскольку в случае широкого множества заболеваний и других состояний применяют множество антибиотиков. Больничные инфекции являются 8-ой из основных причин смерти в США, в значительной степени в связи с резистентными к лекарственным средствам и вновь возникающими патогенами. Например, ежегодно наблюдают более 500000 случаев Staphylococcus aureus в США, и свыше 65% штаммов являются резистентными ко многим лекарственным средствам (например, определенные штаммы метициллин-резистентного S. aureus (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) также являются резистентными ко многим лекарственным средствам). Применение большего количества антибиотиков и количество бактерий, демонстрирующих резистентность, привели к более увеличению длительности лечения. Более того, на сегодняшний день все более часто используют неспецифичные антибиотики широкого спектра действия, некоторые из которых характеризуются пагубными эффектами в отношении пациента. Проблема, связанная с данным увеличенным применением, состоит в том, что множество антибиотиков не проникают с легкостью через выстилки слизистых или ингибируются факторами, присутствующими в данных выстилках, как обсуждалось выше. Дополнительно, количество человек, страдающих от аллергии на антибиотики, по всей видимости, увеличивается. Соответственно, существует коммерческая потребность в новых антибактериальных подходах, в особенности таковых, которые функционируют посредством новых механизмов или обеспечивают новые или улучшенные способы уничтожения патогенных бактерий, обеспечивая за счет этого лечение инфекции.

[0007] Открытие полипептидов лизина, ферментов, полученных из бактериофагов, которые способны проникать через стенку или внешнюю мембрану бактерий и напрямую лизировать бактерии или подвергать их воздействию бактерицидных средств, таких как иммунная система хозяина и/или антибиотики, стало прорывом в области инфекционных заболеваний. В частности, было обнаружено, что лизины, введенные в сочетании с антибиотиками, действуют синергически с последними, что приводит к повышению эффективности антибиотиков даже против резистентных патогенов. Данная синергия открыла путь для применения уменьшенных доз антибиотика и/или лизина, что снижает возможность возникновения побочных эффектов. См., например, патент США 9,034,322.

[0008] Однако ранее, когда было обнаружено, что антибиотик является неэффективным для лечения конкретной инфекции, вызванной возбудителем, который является восприимчивым к лечению в иной ситуации, вследствие факторов окружающей среды, таких как ингибирование сурфактантом, а не вследствие резистентности, не было предложено применение лизинов. В действительности, не было причин ожидать, что лизины улучшат эффективность антибиотиков на фоне ингибирования легочным сурфактантом. Соответственно, эффективность способов, раскрытых ниже, оказалась неожиданной.

[0009] Грамположительные бактерии окружены клеточной стенкой, содержащей полипептиды и полисахарид. Грамположительная клеточная стенка представляется широкой, плотной стенкой, которая составляет 20-80 нм в толщину и состоит из многочисленных взаимосвязанных слоев пептидогликана. От 60% до 90% грамположительной клеточной стенки составляет пептидогликан, придающий клетке форму, жесткую структуру и устойчивость к осмотическому шоку. Клеточная стенка поглощает окрашивание кристаллическим фиолетовым по Граму, что позволяет клеткам окрашиваться пурпурным цветом и вследствие этого являться «грамположительными». Грамположительные бактерии включают, без ограничения, роды Actinomyces, Bacillus, Listeria, Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium и Clostridium. Значимые с медицинской точки зрения виды включают Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis. Виды Bacillus, которые являются спорообразующими, вызывают сибирскую язву и гастроэнтерит. Спорообразующие виды Clostridium вызывают ботулизм, столбняк, газовую гангрену и псевдомембранозный колит. Виды Corynebacterium вызывают дифтерию, и виды Listeria вызывают менингит. Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoneae являются двумя основными возбудителями пневмонии, будь то внебольничной, больничной, вызванной аспирацией или оппортунистической.

[0010] Таким образом, постольку, поскольку эффективные в иных случаях антибиотики ингибируются факторами, присутствующими в органе или ткани, которые являются сайтом инфекции, такими как легочный сурфактант в случае инфекций легких или других воздухоносных путей и, в более широком смысле, дыхательных путей, схема (режим) лечения, которая восстанавливала бы и даже увеличивала активность таких антибиотиков, будет иметь огромное коммерческое значение и значение для общественного здравоохранения.

[0011] Помимо даптомицина, который обсуждается выше, другие антибиотики, которые, как известно, ингибируются легочным сурфактантом, включают, без ограничения: тобрамицин, аминогликозид, применяемый для лечения инфекций, вызванных грамотрицательной бактерией Pseudomonas aeruginosa, типичным возбудителем пневмонии (van A et al. Antimicrob. Agents Chemother. 39:329-333 (1995)), и колистин, циклический липопептид (полимиксин), активный против широкого диапазона грамотрицательных бактерий, включая P. aeruginosa. Schwameis, R. et al, Effect of Pulmonary Surfactant on Antimicrobial Activity In Vitro, October 2013 Volume 57 Number 10 Antimicrobial Agents and Chemotherapy p. 5151-5154.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего от бактериальной инфекции органа или ткани, в которых присутствует легочный сурфактант, причем указанный способ включает, независимо от очередности, следующие этапы:

a. введение субъекту первого количества антибиотика, обладающего антибактериальной активностью против бактерий, которые вызывают инфекцию, активность которого ингибируется легочным сурфактантом;

b. совместное введение субъекту второго количества полипептида лизина, причем указанные первое и второе количества в комбинации являются эффективными для уничтожения бактерий, которые вызывают инфекцию, и посредством этого лечение инфекции.

[0013] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лизин обладает антибактериальной активностью против бактерий, которые вызывают инфекцию.

[0014] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первое количество является таким, которое будет неэффективным для лечения инфекции, если антибиотик был введен в форме монотерапии.

[0015] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик представляет собой циклический липопептид или аминогликозид.

[0016] Согласно более конкретному варианту реализации настоящего изобретения полипептид лизина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее варианты, обладающие антибактериальной активностью против Staphylococcus aureus и идентичностью последовательности по меньшей мере 80% с SEQ ID NO: 1, и бактерия, которая вызывают инфекцию, представляет собой Staphylococcus aureus.

[0017] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения S. aureus представляет собой MRSA, MSSA (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus, метициллин-чувствительный Staphylococcus aureus) или VISA (vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, обладающий промежуточной чувствительностью к ванкомицину).

[0018] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик представляет собой циклический липопептид, например, даптомицин.

[0019] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик представляет собой аминогликозид, например, тобрамицин.

[0020] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второе количество или первое количество представляет собой подпороговое количество (или оба количества являются подпороговыми).

[0021] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид лизина вводят парентерально или посредством ингаляции; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик вводят перорально или парентерально или посредством ингаляции.

[0022] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой млекопитающего субъекта.

[0023] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид лизина представляет собой PAL или Срl-1, и бактерия, которая вызывают инфекцию, представляет собой Streptococcus pneumoniae.

[0024] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения бактерия, которая вызывают инфекцию, является грамотрицательной, например, P. aeruginosa.

[0025] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лизин представляет собой артилизин, описанный в одной или нескольких из следующих заявок на патент: US 20140120074, WO/2015/070912; WO/2015/071436; WO/2015/070911; WO/2015/071437; US 20150118731 и WO/2012/085259, или представляет собой GN (gramnegative, грамотрицательный) лизин, содержащий последовательность, выбранную из группы артилизинов, описанных в одной или нескольких из следующих заявок на патент: US 20140120074, WO/2015/070912; WO/2015/071436; WO/2015/070911; WO/2015/071437; US 20150118731 и WO/2012/085259, и следующих грамотрицательных (направленных против грамотрицательных бактерий) лизинов, раскрытых в предварительной заявке на патент США 62/247,619, поданной 28 октября 2015 года, копия которой включена в настоящую заявку на патент в виде Приложения А и которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки: GN37 (SEQ ID NO: 6); GN2 (SEQ ID NO: 7); GN4 (SEQ ID NO: 8); GN14 (SEQ ID NO: 9); GN43 (SEQ ID NO: 10); PGN4 (SEQ ID NO: 11); FGN4-1 (SEQ ID NO: 12); FGN4-2 (SEQ ID NO: 13); FGN4-3 (SEQ ID NO: 14); и FGN4-4 (SEQ ID NO: 15).

[0026] Согласно различным более конкретным вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик представляет собой циклический липопептид, такой как колистин, или аминогликозид, такой как тобрамицин.

[0027] Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего от стрептококковой или стафилококковой бактериальной инфекции нижних дыхательных путей, в которых присутствует легочный сурфактант, причем указанный способ включает, независимо от очередности, следующие этапы:

а. введение субъекту первого количества антибиотика, обладающего антибактериальной активностью против бактерий, которые вызывают инфекцию, активность которого ингибируется легочным сурфактантом;

i. совместное введение субъекту второго количества по меньшей мере одного полипептида лизина, выбранного из группы, состоящей из: CF-301, ClyS, лизостафина, LysK, Sal-200, LysGH15, PlyV12, ClyH, MV-L, Ply, PlyPly, PlyGBS, LambdaSa1, LambdaSa2, Cpl1, Pal, активных фрагментов и химерных комбинаций указанных лизинов, в которых связывающий домен одного вышеуказанного лизина или его фрагментов был гибридизован с каталитическим доменом другого,

причем указанные первое и второе количества в комбинации являются эффективными для уничтожения бактерий, которые вызывают инфекцию, и посредством этого лечение инфекции.

[0028] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик представляет собой даптомицин.

[0029] Способ восстановления или увеличения бактерицидной активности антибиотика в органе или ткани, в которых присутствует легочный сурфактант в количестве, которое ингибирует или будет ингибировать активность антибиотика против бактериальной инфекции в указанном органе или ткани, причем указанный способ включает: введение субъекту, страдающему от инфекции указанного органа или ткани, первого количества указанного антибиотика и совместное введение субъекту второго количества полипептида лизина, обладающего антибактериальной активностью против бактерии, которая вызывает инфекцию, причем введение лизина преодолевает ингибирование или избегает ингибирования, и причем количества в комбинации являются эффективными для уничтожения указанной бактерии и посредством этого лечения инфекции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0030] Фигура 1 демонстрирует, что CF-301 является активным в бычьем сурфактанте, тогда как DAP (даптомицин) не является активным. На фигуре 1 представлены значения МИК (минимальной ингибирующей концентрации) для CF-301 и DAP против штамма MRSA MW2 (фигура 1А), штамма MSSA АТСС 29213 (фигура 1В) и штамма VISA АТСС 700699 (фигура 1С).

[0031] Фигура 2 содержит изображения, демонстрирующие, что CF-301 способствует связыванию BODIPY-DAP (DAP^BD) с MRSA в 7,5% сурфактанте. Увеличение: 1000х.

[0032] Фигура 3 содержит изображения, демонстрирующие, что CF-301 способствует связыванию DAP^BD с VISA в 7,5% сурфактанте. Увеличение = 2000x.

[0033] Фигура 4 содержит изображения анализов методом ТЭМ (трансмиссионной электронной микроскопии, фигура 4А) и СЭМ (сканирующей электронной микроскопии, фигура 4В), демонстрирующие, что CF-301 и DAP действуют совместно для уничтожения S. aureus и снижают уровень структур, подобных биопленке, в 7,5% сурфактанте. На фигуре 4А масштабные линейки составляют 0,5 мкм. На фигуре 4В масштабные линейки составляют 2 мкм (5000-кратные изображения) и 1 мкм (20000-кратные изображения).

[0034] Фигура 5А представляет собой кривую выживаемости мышей, инфицированных интраназально 5×10⁸ КОЕ (колониеобразующих единиц) S. aureus (штамм MRSA АТСС ВАА-42) и получавших лечение солевым раствором, CF-301 (в.в., внутривенно), DAP (п.к., подкожно) или CF-301/DAP. (n=10 мышей/группу; р<0,05 по сравнению с DAP). Фигура 5 В представляет собой логарифмический график КОЕ/легкие через 1 и 3 дня после инфекции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0035] Согласно настоящему изобретению можно применять общепринятые методики молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК в пределах компетентности в данной области техники. Такие методики полностью объяснены в литературе. См., например, руководства Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R.M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J.E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J.E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Определения

[0036] Следующие термины и фразы включают значения, представленные ниже, если контекст однозначно не диктует обратное.

[0037] Термин «лечение» означает любой процесс, действие, применение, терапию или т.п., при которых субъект, включая человека, получает медицинскую помощь с целью обеспечения лечения или излечения расстройства, или уничтожения либо истребления патогена, или улучшения состояния субъекта, напрямую либо опосредованно. Лечение также означает снижение заболеваемости или облегчение симптомов, устранение повторного возникновения, предотвращение повторного возникновения, предотвращение заболеваемости, улучшение симптомов, улучшение прогноза или комбинации указанных событий. «Лечение» также включает уменьшение популяции, снижение скорости роста или вирулентности бактерий у субъекта и посредством этого контроль или снижение бактериальной инфекции у субъекта или бактериальной контаминации органа либо ткани или окружающей среды. Таким образом, «лечение», которое снижает заболеваемость, является эффективным для ингибирования роста по меньшей мере одной грамположительной или по меньшей мере одной грамотрицательной бактерии в конкретной среде, независимо от того, является ли таковая субъектом или окружающей средой. С другой стороны «лечение» уже установившейся инфекции или контаминации означает уменьшение популяции или уничтожение, включая даже истребление грамположительных или грамотрицательных бактерий, которые вызывают инфекцию или контаминацию.

[0038] «Предотвращение» включает предотвращение заболеваемости, повторного возникновения, распространения, манифестации или установления нарушения, такого как бактериальная инфекция. Не предполагается, что настоящее изобретение ограничено полным предотвращением или предотвращением установления инфекции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отсрочивают манифестацию или снижают тяжесть обусловленного впоследствии заболевания, что является примерами предотвращения. Обусловленные заболевания в контексте настоящего изобретения включают таковые, манифестация которых сопровождается клиническими или предклиническими симптомами, такими как обнаружение бактериального патогена, а также обнаружение роста бактериального патогена, когда симптомы, связанные с данной патологией, еще не проявляются.

[0039] Термин «эффективное количество» означает количество, которое, при применении или введении с соответствующей частотой или в режиме введения доз, является достаточным для предотвращения или ингибирования роста бактерий или предотвращения, снижения или облегчения манифестации, тяжести, длительности или прогрессирования нарушения, лечение которого проводят (здесь - роста бактериального патогена или инфекции), для предотвращения распространения нарушения, лечение которого проводят, для вызова регрессии нарушения, лечение которого проводят, или для усиления или улучшения профилактического или терапевтического эффекта или эффектов другой терапии, такой как антибиотикотерапия или бактериостатическая терапия.

[0040] «Совместное введение» включает раздельное введение полипептида лизина и антибиотика или любого другого антибактериального средства последовательным способом, а также введение данных средств по существу одновременным способом, например, в единой смеси/композиции или в дозах, которые вводят отдельно, но несмотря на это, вводят по существу одновременно субъекту, например, в различное время в один и тот же день или период в течение 24 часов (или более короткий или длительный интервал при условии, что введение антибиотика получает пользу от совместного введения лизина). Такое совместное введение полипептидов лизина с одним или несколькими дополнительными антибактериальными средствами, такими как антибиотики, может быть обеспечено в виде непрерывного лечения, которое длится в течение дней, недель или месяцев. Дополнительно, совместное введение необязательно должно быть непрерывным или одинаковым по длительности при условии, что ингибирование введенного антибиотика легочным сурфактантом снижается, и эффективность антибиотика при лечении инфекций органа или ткани, в которых присутствует легочный сурфактант, восстанавливается или увеличивается.

[0041] «Субъект» означает субъекта, лечение которого проводят, и включает, среди прочего, млекопитающее, включая, без ограничения, человека, растение, низшее растение, одноклеточный организм или культуру клеток. Например, термин «субъект» включает организмы, например, прокариоты и эукариоты, восприимчивые к грамотрицательным или грамположительным бактериальным инфекциям или страдающие от данных инфекций. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, отличных от человека. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека, например, человека, страдающего от бактериальной инфекции, подверженного риску заболевания бактериальной инфекцией или восприимчивого к бактериальной инфекции, вне зависимости от того, является ли такая инфекция системной или ограничена конкретным органом или тканью.

[0042] «Полипептид» используется взаимозаменяемо с терминами «белок» и «пептид» и означает полимер, состоящий из остатков аминокислот и содержащий по меньшей мере приблизительно 30 остатков аминокислот. Термин включает не только полипептиды в выделенной форме, но также их активные фрагменты и производные (как определено ниже). Термин «полипептид» также включает гибридные белки или гибридные полипептиды, содержащие полипептид лизина, описанный ниже, и сохраняющие функцию лизина. Полипептид может представлять собой встречающийся в природе полипептид или сконструированный или полученный синтетическим способом полипептид. Конкретный полипептид лизина может, например, быть получен или выделен из нативного белка посредством ферментативного или химического расщепления либо может быть получен с применением общепринятых методик пептидного синтеза (например, твердофазного синтеза) или методик молекулярной биологии (таких как таковые, раскрытые в руководстве Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), либо может быть, следуя определенной стратегии, усечен или сегментирован с получением активных фрагментов, как проиллюстрировано, например, в данном документе фрагментом GN4, содержащим амфипатический домен GN4, и другими усеченными версиями указанного фрагмента, сохраняющими активность лизина против той же или по меньшей мере одной общей бактерии-мишени (см. Приложение А). Также включены варианты нативных полипептидов лизина, которые характеризуются идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 98% с нативным полипептидом лизина (который, как указано выше, включает активные фрагменты нативного белка лизина).

[0043] «Бактерицидный» в контексте средства или соединения общепринято означает способность вызывать гибель бактерий или способность уничтожать бактерии в степени по меньшей мере 3-log (99,9%) или лучшее снижение среди исходной популяции бактерий.

[0044] «Увеличение» в контексте настоящего изобретения означает, что степень антимикробной активности антибиотика является более высокой, чем в присутствии легочного сурфактанта. Например, антибиотическая активность в контексте настоящего изобретения может восстанавливаться или увеличиваться по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 16 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 24 раза, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 100 раз, более чем в 10 раз, более чем в 20 раз, более чем в 50 раз, более чем в 100 раз. Дополнительно, в контексте настоящего изобретения активность лизина может увеличиваться по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 10 раз, вплоть до в 10 раз, вплоть до в 16 раз, вплоть до в 20 раз, более чем в 2 раза, более чем в 4 раза, более чем в 8 раз, более чем в 10 раз, более чем в 20 раз.

[0045] «Ингалируемый» означает способ прямой доставки композиции в дыхательные пути в течение обычного или вспомогательного дыхания или в сочетании с ним (например, посредством интратрахеобронхиального, легочного и/или назального введения). Ингалируемые составы включают, без ограничения, мелкодисперсные, распыляемые составы, сухой порошок и/или составы в виде аэрозоля.

[0046] «Биопленка» означает совокупность бактерий, которые включены в самопродуцируемый матрикс полисахаридов, гликопротеинов или нуклеиновых кислот. В данном состоянии бактерии являются в высокой степени резистентными к антибиотикам.

Варианты реализации

[0047] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении описано комбинирование CF-301 с антибиотиком даптомицином (DAP) для расширения показаний для обоих лекарственных средств в отношении инфекций органа или ткани, таких как инфекции воздухоносных путей, в которых присутствует легочный сурфактант.Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения легочный сурфактант экспрессируется в органах или тканях, отличных от дыхательной системы (Madsen et al. Am J Respir Cell Mol Biol., 29(5):591-7 (2000)). Несмотря на то, что в случае бактериемии и эндокардита DAP является мощным терапевтическим вариантом, его нельзя применять при легочных инфекциях в связи с селективным ингибированием легочным сурфактантом (Silverman et al., J Infect Dis., 191 (12):2149-52. (2005)). В свете клинических ограничений, связанных с опосредованным сурфактантом ингибированием DAP, в настоящем изобретении описано, что CF-301 восстанавливает или увеличивает активность DAP в легких (и в других частях дыхательных путей, в которых присутствует легочный сурфактант, включая, например, бронхиальные ходы, а также трахею и глотку), в которых активность DAP, как правило, ингибируется легочным сурфактантом, и в связи с этим обеспечивает новый вариант лечения инфекций воздухоносных путей и, в особенности, нижних дыхательных путей, таких как стафилококковая пневмония, бронхиальная пневмония, пневмококковая пневмония и атипичная пневмония.

[0048] В более широком смысле в настоящем изобретении описано, что можно избежать ингибирования или преодолеть ингибирование антибиотиков, вызванное факторами окружающей среды, такими как присутствие легочного сурфактанта в органе или ткани, таком как респираторный эпителий, и эффективность антибиотика в данной среде можно восстановить или увеличить посредством совместного введения антибиотика и лизина.

[0049] Антибиотик может являться таковым, к которому в норме восприимчив возбудитель инфекции, лечение которой проводят; лизин может являться таковым, который является активным против того же организма. Как правило, антибиотик будут вводить в первом количестве, таком как количество, которое будет являться эффективным количеством при применении в монотерапии при отсутствии сурфактанта, или в меньшем количестве, включая согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения подпороговое количество, поскольку антибиотик будет по существу освобожден от влияния сурфактанта и получит возможность действовать синергично с лизином. Таким образом, применяемое количество антибиотика будет подвергнуто точной корректировке, которая хорошо известна специалистам в данной области техники. Лизин будут, как правило, вводить во втором количестве, таком как количество, которое будут использовать при применении лизина в монотерапии, или в меньшем количестве, включая согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения подпороговое количество, поскольку лизин и антибиотик действуют синергически. Вновь, количество лизина будут подвергать оптимизации, которая хорошо известна специалистам в данной области техники. Первое и второе количества будут таковыми, которые по меньшей мере в комбинации (или даже также индивидуально) будут эффективными для уничтожения бактерий, которые вызывают инфекцию, и посредством этого для лечения инфекции, таким образом, истребляя инфекцию или способствуя ее частичному или полному уничтожению.

[0050] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лизин вводят в первом количестве, и антибиотик вводят во втором количестве.

[0051] Антибиотик можно вводить любым подходящим путем, таким как парентеральный, пероральный путь или, в некоторых случаях, посредством ингаляции. Лизин можно вводить любым подходящим путем, посредством инъекции (парентерально) или посредством ингаляции. Длительность терапии будет определена посредством оценки эффективности лечения, например, на основании ослабления и/или устранения симптомов, снижения или устранения титров патогена, улучшения физического состояния субъекта, лечение которого проводят, и т.д., а также на основании степени улучшения одного или нескольких из таких оцениваемых параметров. Вполне могут наблюдаться вариации от субъекта к субъекту в зависимости от таких факторов как возраст, тип инфекции, осложнения при лечении и общее физическое состояние пациента. Нормальная длительность монотерапии антибиотиком будет являться отправной точкой для определения длительности совместной терапии согласно настоящему изобретению.

[0052] В связи с присутствием легочного сурфактанта внутренняя часть воздухоносных путей характеризуется уникальной окружающей средой в организме. Исследования показали, что в некоторых случаях может возникнуть органспецифичное ингибирование антибиотика, что приводит к неэффективности конкретного антибиотика в данном конкретном органе. Такое органспецифичное ингибирование наблюдалось в случае даптомицина (DAP), когда небольшие количества легочного сурфактанта были способны ингибировать активность DAP против Staphylococcus aureus, в результате чего DAP становился неподходящим для лечения легочных инфекций, вызванных данным патогеном (Silverman et al., J Infect Dis., 191(12):21A9-52. (2005)). Исследования, проведенные Silverman с соавт., были дополнительно подтверждены на пациентах, которые получали лечение DAP бронхоальвеолярной пневмонии, вызванной S. aureus (Koplowicz et al. Clin Infect Dis. 49(8): 1286-7 (2009)). В обоих исследованиях (Silverman et al. и Koplowicz et al.) было установлено, что присутствие легочных сурфактантов препятствует антимикробному действию DAP. На основании этого было высказано предположение, что DAP будет активным и доступным для лечения инфекций, вызванных другими респираторными патогенами, при условии, что DAP является активным против таких патогенов при отсутствии легочного сурфактанта (например, in vitro или когда инфекция установилась в органе или ткани, лишенных или по существу лишенных легочного сурфактанта). Неограничивающие примеры таких патогенов представляют собой коагулазонегативные стафилококки, Streptococcus pneumoniae и Streptococcus pyogenes.

[0053] Помимо DAP, который относится к классу циклических липопептидных антибиотиков, вызванное легочным сурфактантом ингибирование антибиотической активности наблюдалось для других антибиотиков, таких как колистин, липопетид и тобрамицин, аминогликозид. Таким образом, способы согласно настоящему изобретению можно применять для восстановления или увеличения активности данных антибиотиков против чувствительных бактериальных патогенов, когда такие патогены инфицируют орган или ткань, в которых присутствует легочный сурфактант.

[0054] На сегодняшний день DAP показан для лечения осложненных инфекций кожи и кожных структур (complicated skin and skin structure infections, cSSSI), вызванных чувствительными изолятами следующих грамположительных бактерий: Staphylococcus aureus (включая метициллин-резистентные изоляты), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae подвид equisimilis и Enterococcus faecalis (исключительно ванкомицин-чувствительные изоляты). DAP также применяют при лечении инфекций кровотока Staphylococcus aureus, включая таковые с правосторонним инфекционным эндокардитом, вызванные метициллин-чувствительными и метициллин-резистентными изолятами. Более того, в исследованиях in vitro было показано, что резистентный к пенициллину Streptococcus pneumoniae ингибируется DAP (Piper et al. J Infect Chemother (2005) 11:207-209).

[0055] Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает способы восстановления или увеличения ингибируемой сурфактантом антибиотической активности, причем указанные способы включают введение комбинации лизина и одного или нескольких антибиотиков в орган или ткань, в которых присутствует легочный сурфактант. Поскольку легочные сурфактанты присутствуют в ткани легких, а настоящее изобретение обеспечивает доказательство способности лизина восстанавливать антимикробную активность ингибируемого сурфактантом антибиотика in vitro и in vivo, предполагается, что другие бактерии, которые вызывают инфекции нижних дыхательных путей, будут уничтожены комбинациями DAP и лизинов, активных против данных бактерий.

[0056] Следует понимать, что лизины, примеры которых приведены в данном документе, в том числе в таблицах 1-3, можно заменить их активными фрагментами и химерными комбинациями связывающего домена одного лизина с каталитическим доменом другого. См., например, публикацию Cheng et al. Appl Microbiol Biotechnol. 74(6): 1284-91 (2007). В действительности некоторые примеры уже представляют собой фрагменты или химерные полипептиды лизина.

[0057] Полное раскрытие всех документов, цитируемых в таблице выше, полностью включено посредством ссылки для всех целей.

[0058] Класс аминогликозидных антибиотиков включает множество различных средств. Гентамицин, тобрамицин, амикацин, стрептомицин, неомицин и паромомицин одобрены Управлением США по контролю над качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA). Тобрамицин является активным против различных грамотрицательных бактерий, включая, без ограничения, P. aeruginosa, Е. coli, Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp. и другие. В частности, тобрамицин демонстрирует высокую активность против P. aeruginosa, распространенного возбудителя пневмонии, как внебольничной, так и больничной.

[0059] Что касается грамположительных бактерий, тобрамицин демонстрирует более узкий спектр активности, причем большинство грамположительных бактерий, за исключением S. aureus и S. epidermidis, резистентны к тобрамицину. Однако, аналогично DAP, активность тобрамицина против Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus и S. pneumoniae снижена в присутствии сурфактанта (van A et al. Antimicrob.

Agents Chemother. 39:329-333 (1995)). Инфекции, связанные с Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus и S. pneumoniae, а также лизины, активные против данных бактерий, перечислены в таблице 2.

[0060] Таким образом, способы согласно настоящему изобретению можно применять для восстановления или увеличения ингибируемой сурфактантом антибиотической активности с целью лечения инфекций, вызванных грамположительными бактериями или грамотрицательными бактериями, или ими обоими. Обычно инфекции являются полимикробными со смесью грамположительных и грамотрицательных видов (Citron et al. J Clin Microbiol. 45(9): 2819-2828 (2007)). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению можно применять для восстановления или увеличения ингибируемой сурфактантом антибиотической активности с целью лечения полимикробной инфекции.

[0061] Полное раскрытие всех документов, цитируемых в таблице выше, полностью включено посредством ссылки для всех целей.

[0062] Колистин (также известный как полимиксин Е) относится к группе полимиксиновых антибиотиков. Колистин обладает узким антибактериальным спектром, и его в первую очередь применяют в случае инфекций P. aeruginosa и A. baumannii. Инфекции, вызванные P. aeruginosa и A. baumanni, и лизины, активные против данных бактерий, перечислены в таблице 3.

[0063] Полное раскрытие всех документов, цитируемых в таблице выше, полностью включено посредством ссылки для всех целей.

[0064] Легочная инфекция, вызванная S. aureus, может возникнуть среди индивидуумов во внебольничных или больничных условиях. Более того, легочная инфекция, вызванная S. aureus, может развиваться среди индивидуумов с колонизацией S. aureus кожи или ноздрей. Часто инфекция, вызванная S. aureus, возникает в контексте интубации или применения других технических средств для диагностики и лечения дыхательных путей. Пневмония S. aureus может также возникнуть после вирусной пневмонии или в условиях правостороннего эндокардита с легочной эмболией.

[0065] Наиболее распространенные причины бактериальных инфекций легких у нормальных хозяев включают Streptococcus pneumoniae, Haemophilus species, Staphylococcus aureus и Mycobacterium tuberculosis.

[0066] Главной причиной заболеваемости и смертности у пациентов с кистозным фиброзом (КФ) является бронхоэктаз и обструктивная болезнь легких. Болезнь легких наблюдается у 98% пациентов с КФ ко времени достижения ими совершеннолетия. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в терапии данного нарушения, большинство пациентов испытывают осложнения со стороны дыхательной системы. S aureus является одним из патогенов, наиболее часто обнаруживаемых в воздухоносных путях пациентов с КФ. Таким образом, согласно одному варианту реализации настоящее изобретение направлено на лечение легочных инфекций S. aureus у субъектов с КФ посредством введения даптомицина и лизина, активного против патогена, такого как CF-301.

[0067] Как указано выше, настоящее изобретение обеспечивает способы восстановления или увеличения ингибируемой сурфактантом антибиотической активности, причем указанные способы включают введение комбинации лизина и одного или нескольких антибиотиков в орган или ткань, в которых присутствует легочный сурфактант.

[0068] Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, страдающего от бактериальной инфекции органа или ткани, в которых присутствует легочный сурфактант, например, легкого или, в более широком смысле, дыхательных путей, причем указанный способ включает введение субъекту первого количества антибиотика, который в норме ингибируется легочным сурфактантом, и совместное введение субъекту второго количества полипептида лизина, причем первое и второе количества вместе являются эффективными для лечения инфекции (данное утверждение не исключает того, что отдельные компоненты комбинации обладают собственным эффектом). Лизин, предпочтительно, нацелен, т.е. является активным против бактерий, которые вызывают инфекцию. Патогены, которые вызывают инфекцию, могут являться резистентными к по меньшей мере одному антибиотику, соответствующему стандартам оказания медицинской помощи, но должны быть чувствительными к антибиотику, который применяют в комбинации с лизином.

[0069] Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, страдающего от бактериальной инфекции органа или ткани, в которых присутствует легочный сурфактант, например, легкого или, в более широком смысле, дыхательных путей, причем указанный способ включает введение субъекту первого количества полипептида лизина и совместное введение субъекту второго количества антибиотика, который в норме ингибируется легочным сурфактантом, причем первое и второе количества вместе являются эффективными для лечения инфекции (данное утверждение не исключает того, что отдельные компоненты комбинации обладают собственным эффектом).

[0070] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения инфекция воздухоносных путей представляет собой связанное со стафилококком заболевание или состояние (например, заболевание или состояние, связанное с присутствием бактерий Staphylococcus, включая такие заболевания, которые являются следствием инфекции Staphylococcus, или инфекция Staphylococcus является осложнением другого заболевания или состояния, такого как трансплантат, или рак, или противораковая терапия, такая как химиотерапия).

[0071] Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способ восстановления или увеличения бактерицидной активности антибиотика у субъекта, страдающего от бактериальной инфекции органа или ткани, в которых присутствует легочный сурфактант, в количестве, которое ингибирует или будет ингибировать активность антибиотика против бактериальной инфекции у указанного субъекта, причем указанный способ включает: введение субъекту, страдающему от инфекции указанного органа или ткани, первого количества указанного антибиотика и совместное введение субъекту второго количества полипептида лизина, обладающего антибактериальной активностью против бактерии, которая вызывает инфекцию, причем количества в комбинации являются эффективными для уничтожения указанной бактерии и посредством этого лечения инфекции.

[0072] Настоящее изобретение также обеспечивает способы восстановления или увеличения активности лизина, такого как CF-301, причем указанные способы включают введение комбинации антибиотика и лизина (например, DAP и лизина CF-301). Согласно аспекту настоящего изобретения активность лизина CF-301 усилена по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 10 раз, вплоть до в 10 раз, вплоть до в 16 раз, вплоть до в 20 раз или более.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

CF-301, но не DAP, является активным в легочном сурфактанте

[0073] С целью определения индивидуальной активности CF-301 и DAP против различных штаммов Staphylococcus aureus в присутствии сурфактанта авторы настоящего изобретения исследовали 3 различных штамма S. aureus и использовали бычий сурфактант (Survanta, AbbVie Inc), который функционально эквивалентен сурфактанту человека. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) проводили с применением метициллин-резистентного штамма (MRSA) MW2 (фигура 1А), метициллин-чувствительного (MSSA) штамма АТСС 29213 (фигура 1В) и штамма Staphylococcus aureus, обладающего промежуточной чувствительностью к ванкомицину (VISA), АТСС 700699 (фигура 1С), в присутствии увеличивающихся концентраций сурфактанта (фигура 1). Значения МИК определяли методом микроразведений в бульоне согласно руководству Clinical and Laboratory Standards Institute. M07-A9. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. 8th ed. Wayne, PA: CLSI, 2012. Вкратце, каждый штамм бактерий суспендировали в среде роста с применением бульона Мюллера-Хинтона с откорректированным содержанием кальция в концентрации 5×10⁵ колониеобразующих единиц [КОЕ]/мл и подвергали воздействию CF-301 или DAP в сериях из 2-кратных серийных разведений в 96-луночных планшетах из полипропилена для микротитрования (Becton, Dickinson, and Company). Через 24 часа инкубации при температуре 35°С в атмосферном воздухе значения МИК регистрировали в виде наиболее разведенной концентрации каждого соединения (CF-301 или DAP), которая ингибировала рост бактерий каждого штамма (Schuch et al, J Infect Dis.; 209(9): 1469-78 (2014)). Исходные значения МИК (т.е. без сурфактанта) для CF-301 и DAP (соответственно) составляли 32 и 1 мкг/мл для MW2 (фигура 1А), 16 и 1 мкг/мл для АТСС 29213 (фигура 1В) и 64 и 2 мкг/мл для АТСС 700699 (фигура 1С).

[0074] Как показано на фигуре 1А-С, CF-301, но не DAP, продемонстрировал антимикробную активность в присутствии легочного сурфактанта на каждом исследованном штамме. МИК CF-301 увеличивалась вплоть до в 2 раза (в случае штаммов MRSA и MSSA) и в 4 раза (в случае VISA) в диапазоне концентраций сурфактанта от 1,25 до 15% (фигура 1А-С). МИК DAP, однако, увеличивалась в 256 раз в том же диапазоне сурфактанта, что и диапазон, использованный для исследования CF-301. В совокупности данные результаты демонстрируют, что CF-301 является активным в присутствии сурфактанта против штаммов MRSA, MSSA и VISA S. aureus, в то время как DAP не является активным.

Пример 2

Активность DAP в легочном сурфактанте возможна при применении в комбинации с CF-

[0075] После установления того, что DAP не является активным в присутствии сурфактанта, авторы настоящего изобретения решили оценить возможность того, что CF-301 способствует активности DAP в присутствии сурфактанта и позволяет DAP осуществлять свою антимикробную функцию даже в присутствии легочного сурфактанта. Антимикробную активность CF-301 и DAP совместно в присутствии сурфактанта оценивали с применением 2 различных способов: анализа МИК комбинации и анализа методом «шахматной доски». Тест разведения методом «шахматной доски» является широко применяемым способом исследования синергии между множеством соединений in vitro (White et al. Antimicrob Agents Chemother. 40(8):1914-8 (1996)). «Шахматные доски» получали с применением комбинаций суб-МИК CF-301 с суб-МИК даптомицина по отношению к панели из 20 штаммов MRSA и 20 MSSA в 7,5% сурфактанте. Анализ МИК комбинации представляет собой разновидность метода микроразведений, в которой два соединения в комбинации (вместо одного соединения) разводят в два раза по оси X 96-луночного планшета (Schuch et al, J Infect Dis.; 209(9): 1469-78 (2014)), и определяют наименьшую концентрацию комбинации соединений (в данном случае - CF-301 и DAP), необходимую для ингибирования роста бактерий. Для целей дизайна эксперимента синергию определяли как ингибирующую активность, превышающую активность, которая будет предсказана посредством сложения 2-х соединений вместе (т.е. минимальная фракционная ингибирующая концентрация [ФИКмин.] ≤0,5) (Moody J. 2007. Synergism testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods, p 1-23 In Garcia LS, Isenberg HD, editors. (ed), Clinical microbiology procedures handbook, 2nd ed. ASM Press, Washington, DC).

[0076] Как показано в таблице 4, объединение CF-301 и DAP в присутствии 7,5% сурфактанта привело к ингибирующим концентрациям роста в 16-32 раз и в 512 - 1024 раз меньшим, соответственно, чем при применении каждого соединения в монотерапии. Важно отметить, что объединение CF-301 и DAP восстановило активность DAP, несмотря на присутствие сурфактанта; это свидетельствует, что добавление лизина к антибиотику, который в противном случае ингибируется сурфактантом, преодолевает ингибирование таких антибиотиков. Результаты согласовались среди различных штаммов, включая 5 штаммов MRSA (MW2, ВАА-1720, NRS-192, NRS-265, NRS-255) и 5 штаммов MSSA (АТСС-29213, NRS-131, АТСС 25923, АТСС 49521 и Newman) (таблица 4, данные представляют собой значения МИК для каждой группы в монотерапии и в комбинации).

[0077] Более того, как видно из анализа методом «шахматной доски» с применением бульона Мюллера-Хинтона с добавлением 7,5% сурфактанта, суб-МИК концентрации CF-301 и DAP демонстрировали мощную синергию (ФИК≤0,5) в отношении панели из 20 штаммов MRSA и MSSA (таблицы 5 и 6). Для значений, приведенных в таблицах 2 и 3, показаны отдельные МИК и фракционные подавляющие концентрации (ФИК) комбинации, где значения ФИК≤0,5 свидетельствуют о мощной синергии.

Взятые вместе, данные результаты демонстрируют, что CF-301 восстанавливает активность DAP и способствует активности DAP в присутствии легочного сурфактанта.

*Респираторный изолят

* Респираторный изолят

Пример 3

CF-301 способствует (или позволяет осуществляться) связыванию DAP со Staphylococcus aureus

[0078] С учетом того, что CF-301 восстанавливает активность DAP в присутствии сурфактанта (пример 2), авторы настоящего изобретения предположили, что CF-301 способствует связыванию DAP со Staphylococcus aureus. Для оценки взаимодействия DAP с клеточной мембраной (КМ) бактерий применяли анализ меченного BODIPY даптомицина (BDP-DAP), как описано ранее (Tran et al. MBio., 23; 4(4) (2013)). Вкратце, клетки штаммов MRSA MW2 (фигура 2) и VISA АТСС 700699 (фигура 3) в середине фазы логарифмического роста окрашивали DAPI, промывали и ресуспендировали в 25 мМ Tris, рН 7,2, с 50 мкг/мл CaCl₂ и 7,5% сурфактантом. Затем добавляли BODIPY-DAP (до 4 мкг/мл) с последующим добавлением CF-301 (до 4 или 8 мкг/мл). Контроль не содержал CF-301. После инкубации в течение 30 или 60 минут при комнатной температуре клетки разводили, промывали, фиксировали и высевали на стекла, сенсибилизированные 0,01% лизином, с последующей визуализацией методом флуоресцентной микроскопии (фигура 2, 1000х; фигура 3, увеличение = 2000х).

[0079] Как показано на фигуре 2, CF-301 (8 мкг/мл) способствовал связыванию BODIPY-DAP (DAP^BD) с MRSA в присутствии 7,5% сурфактанта. Аналогично, CF-301 (4 мкг/мл) способствовал связыванию DAP^BD с VISA в 7,5% сурфактанте (фигура 3, штамм VISA АТСС 700699, меченный DAPI и обработанный в течение 30 мин. буфером (фигура 3А), DAP^BD (4 мкг/мл; 1/64 МИК) (фигура 3 В) или DAP^BD и CF-301 (4 мкг/мл; 1/128 МИК) (фигуры 3C-G)). В совокупности данные результаты свидетельствуют, что CF-301 способствует связыванию DAP с КМ бактерий.

Пример 4

CF-301 и DAP действуют совместно для уничтожения S. aureus и уменьшения/разрушения подобных биопленке структур в 7,5% сурфактанте.

[0080] Затем авторы настоящего изобретения исследовали способность CF-301 и DAP совместно уничтожать S. aureus и уменьшать и разрушать подобные биопленке структуры в присутствии сурфактанта в 25 мМ Tris, рН 7,2 (с 50 мкг/мл CaCl₂ и 7,5% сурфактантом). Штамм VISA АТСС 700699 обрабатывали в течение 20 мин. сам по себе (контроль) или DAP (4 мкг/мл; 1/64 МИК), CF-301 (4 мкг/мл; 1/128 МИК) или комбинацией DAP и CF-301. Анализ методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) (фигура 4А) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (фигура 4В) свидетельствует об эффективном уничтожении S. aureus (фигура 4А), а также о снижении образования биопленки (фигура 4В) при объединении CF-301 и DAP. Таким образом, аналогично тому, что наблюдалось в предыдущих примерах, данные наблюдения свидетельствуют, что CF-301 позволяет DAP преодолевать ингибирующие эффекты сурфактанта.

Пример 5

Комбинированная терапия CF-301 и DAP превосходит монотерапию на модели пневмонии S. aureus на мышах

[0081] Учитывая преимущества, наблюдаемые in vitro при объединении CF-301 и DAP, оценивали эффекты применения CF-301 и DAP совместно in vivo. С целью решения данного вопроса мышей инфицировали интраназально 5×10⁸ КОЕ S. aureus (штамм MRSA АТСС ВАА-42) и проводили лечение солевым раствором, CF-301 (в.в.), DAP (п.к.) или комбинацией CF-301/DAP один раз в день, начиная через четыре часа после начала инфекции (n=10 мышей/группу; р<0,05 по сравнению с DAP). Эксперимент проводили в течение 14 дней после инфекции. Через 14 дней лечение комбинацией CF-301 и DAP привело к 70% выживаемости; это демонстрирует, что комбинированная терапия превосходила лечение любым из лекарственных средств в монотерапии (Р<0,05 по сравнению с DAP).

[0082] Как показано на фигуре 5А, комбинированная терапия CF-301 и DAP превосходила монотерапию на модели пневмонии S. aureus на мышах. Аналогично тому, что наблюдалось in vitro, применение CF-301 помимо DAP приводило к восстановлению антимикробной активности DAP. Данные in vivo, полученные в данном эксперименте, дополнительно подтверждают данные выводы. Например, у животных, которые получали лечение DAP в монотерапии, наблюдался такой же характер выживаемости, что и у животных, которые получали лечение солевым раствором (контроль). Однако добавление CF-301 к лечению DAP восстанавливает антимикробную активность CF-301.

[0083] Более того, общее количество КОЕ бактерий в легких в каждой из 4 инфицированных групп животных (измеренное через 1 и 3 дня после инфекции) в значительной степени снижалось после лечения CF-301 и DAP в комбинации (фигура 5В).

[0084] Как свидетельствуют примеры, описанные в данном документе, CF-301 способствует активности DAP и позволяет антимикробным эффектам DAP осуществляться в присутствии сурфактанта. Данные результаты были подтверждены как in vitro, так и in vivo.

[0085] В заключении, авторы настоящего изобретения использовали минимальную (и в некоторых экспериментах субминимальную) ингибирующую концентрацию (МИК) и анализы методом «шахматной доски» с бычьим легочным сурфактантом и без него (функциональный эквивалент сурфактанта человека), чтобы продемонстрировать мощное синергическое взаимодействие между CF-301 и DAP против изолятов MRSA, MSSA и VISA Staphylococcus aureus. Снижения МИК вплоть до в 1024 раза наблюдались для DAP в присутствии CF-301 в сурфактанте. Более того, на модели инфекции легких на мышах BALB/c была продемонстрирована эффективность CF-301 и/или DAP на основании выживаемости и уровней КОЕ. Результаты in vitro и in vivo, представленные в примерах 1-5, свидетельствуют, что комбинация CF-301 с DAP может являться эффективной терапией, направленной на инфекции S. aureus в легких.

[0086] CF-301 действует синергически с DAP - на суб-МИК уровнях - для уничтожения спектра изолятов MSSA и MRSA в присутствии легочного сурфактанта (мощного ингибитора DAP). Результаты демонстрируют более быстрое накопление DAP в клетках бактерий в присутствии CF-301. Примечательно, что комбинированная терапия является в высокой степени эффективной в окружающей среде легких инфицированных мышей; это свидетельствует, что CF-301 и DAP являются эффективными для лечения стафилококковой пневмонии, нового показания для обоих лекарственных средств. Комплементарные и синергические активности данных средств усиливаются новыми свойствами CF-301, которые включают быстрый бактериолиз, специфичность в отношении S. aureus, отсутствие резистентности и мощную противобиопленочную активность.

[0087] Все источники, ссылки на которые приводятся в данном документе, полностью включены посредством ссылки для всех целей. Приведенные выше примеры являются иллюстративными и неограничивающими. Несмотря на то, что выше описаны конкретные варианты реализации настоящего изобретения, специалисты в данной области техники с легкостью смогут представить дополнительные варианты реализации, модификации и вариации, все из которых включены в объем формулы изобретения, представленной ниже, включая эквиваленты.