КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНАКИНРУ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим анакинра, буфер и, возможно, по меньшей мере один осмолит и, возможно, дополнительные эксципиенты. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанных композиций для лечения глазных расстройств.

Предшествующий уровень техники

Семейство интерлейкина-1 представляет собой группу белков, участвующих в регуляции иммунных и воспалительных ответов. Члены данной группы опосредуют целый ряд заболеваний, таких как ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, астма, диабет, лейкоз и псориаз.

Анакинра представляет собой рекомбинантную форму встречающегося в природе белка - антагониста рецептора интерлейкина-1 (ИЛ-1 ra), функционирующую в качестве конкурентнго ингибитора связывания ИЛ-1 (интерлейкин-1) с рецептором. ИЛ-1 га имеет балансирующую функцию в отношении других провоспалительных вариантов ИЛ-1 (Clin. Therapeutics 2004, 26, 1960-1975). Недостаточность ИЛ-1 га могла бы, таким образом, быть фактором риска для целого ряда аутоиммунных заболеваний. Симптомы данных заболеваний могут быть облегчены лечением анакинра.

Компоненты в белковом лекарственном препарате могут включать буферизующие агенты, агенты, придающие тоничность, антиоксиданты, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества, объемообразующие агенты, хелатирующие агенты и консерванты. Kineret^® - препарат анакинра при рН 6,5, подходящий для инъекции - содержит цитрат натрия, хлорид натрия, динатрия ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), полисорбат 80 и воду. Выбор цитрата натрия в качестве буферизующего компонента для анакинра в препарате Kineret^® был основан на подробных исследованиях, оценивающих коротко- и долговременную стабильность анакинра. Оценивали несколько потенциальных буферизующих компонентов, причем одним из них был фосфат натрия, и цитрат натрия был идентифицирован как обеспечивающий оптимальную стабильность в отношении агрегации анакинра (WO 2005/097195). Агрегация анакинра была главным предметом озабоченности для выбора буферизующего компонента, стабилизаторов и температуры хранения. Концентрацию цитрата натрия минимизировали настолько, насколько это возможно, принимая во внимание его известный местный раздражающий эффект при инъекции.

Анакинра также готовили без цитрата натрия для того, чтобы избегать описанных проблем с местной переносимостью в месте подкожной инъекции (WO 2012/108828). Подходящие компоненты в препарате белкового лекарственного средства и их соответствующие уровни определяются, например, намеченным применением.

Жидкие лекарственные продукты из биологических молекул с предварительно определенным составом и рН могут изготовляться разными способами. Самым обычным способом является приготовление маточных растворов с определенными составами и затем их смешивание друг с другом с получением носителя. Данный носитель затем смешивается с активным белком в водном растворе до конечного состава с предварительно определенным рН.

ИЛ-1 также играет роль в целом ряде глазных расстройств, таких как раздражение и поддержание воспаления и боли, ассоциированных с синдромом сухого глаза, и краснота и зуд, ассоциированные с аллергическим конъюнктивитом. Было показано то, что ИЛ-1 га может быть способен предупреждать и лечить определенные расстройства глаза, связанные с ИЛ-1 (WO 2009/025763, Amparo et al., JAMA Ophthalmology 2013, 131, 6, 715-723). В WO 2014/160371 раскрываются стабильные препараты химерного цитокинового белка ИЛ-1β/ИЛ-1ra для местного применения для глаз.

Одним вызовом с препаратами белкового лекарственного средства, в общем, является плохая стабильность активного белка. Следовательно, существует потребность в глазном препарате антагониста рецептора интерлейкина-1 с улучшенной стабильностью.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предложение новых композиций анакинра с улучшенной стабильностью.

Другой целью настоящего изобретения является предложение новых композиций анакинра, подходящих для применения в терапии, такой как терапия, предпочтительно включающая местное применение таких композиций анакинра.

Другой целью настоящего изобретения является предложение новых композиций анакинра с низкими концентрациями анакинра, такими как от 0,01 мг/мл до 30 мг/мл анакинра.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано содержание мономера анакинра в растворах анакинра после хранения при 35°С, приготовленных в разных концентрациях буферов HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновоя кислота), по сравнению с растворами анакинра после хранения при 35°С, приготовленными в цитратном буфере. На ФИГ. 1А показаны данные с добавленным осмолитом таурином, и на ФИГ. 1Б показаны данные с добавленным осмолитом гидроксипролином. Дополнительные подробности предоставляются в Примере 7.

На фиг. 2 показано содержание мономера анакинра в растворах 25 мг/мл анакинра после хранения при 35°С, приготовленных в цитрате-HEPES или цитратных буферах с осмолитами. Дополнительные подробности предоставляются в Примере 8.

На фиг. 3 показано содержание мономера анакинра в растворах анакинра после хранения при 35°С, приготовленных в HEPES или цитратных буферах. Дополнительные подробности предоставляются в Примере 9.

Композиция, содержащая анакинра и буфер, как определено в данном раскрытии, является полезной в том, что она демонстрирует стабильность при определенных условиях. Условия, которым может подвергаться имеющийся в продаже продукт анакинра, включают долговременное хранение при условиях охлаждения, коротковременное хранение при условиях окружающей среды и механическое напряжение во время транспортровки, причем все данные условия представляют собой условия, которые была разработана выдерживать приведенная выше композиция.

Под термином «анакинра» подразумевается рекомбинантная форма антагониста рецептора ИЛ-1 (ИЛ-1 ra), имеющая последовательность из 152 аминокислот, показанную в виде положений 26-177 в эталонной последовательности NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США) NP_776214.1 (www.ncbi.nlm.nih.gov). Кроме того, термин «анакинра» следует понимать как включающий модифицированные формы анакинра, например, аминокислотные варианты, имеющие по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичности с аминокислотной последовательностью анакинра. Специалисту в данной области будет понятно то, что в пределах аминокислотной последовательности анакинра могут быть сделаны многие комбинации делеций, вставок, инверсий и замен, при условии того, что образующаяся молекула («вариант анакинра») является биологически активной, например, обладает способностью ингибировать ИЛ-1. Конкретные варианты анакинра описываются, например, в патентах США №5075222; 6858409 и 6599873.

Термин «анакинра» дополнительно включает слитые белки, содержащие анакинра. Анакинра может быть отформатирована для того, чтобы она имела больший гидродинамический размер, например, посредством присоединения полиалкиленгликолевых групп (например, группы полиэтиленгликоля (PEG)), сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или по меньшей мере его части, связывающей трансферрин, области Fc антитела, или посредством конъюгирования с доменом антитела.

Под термином «буфер» подразумевается химическое соединение, используемое для предотвращения изменений рН. Применение буфера является средством поддержания рН при почти постоянном значении в широком спектре химических приложений. HEPES или 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота представляет собой цвиттерионный химический органический буферизующий агент, который придает полезные свойства раскрытой в данном документе композиции по сравнению с другими буферами. В частности, применение буфера HEPES может давать стабильную композицию. Другим буфером, который можно использовать в описанной в данном документе композиции, является натрий-цитратный буфер. Цитрат натрия представляет собой натриевую соль лимонной кислоты, и ранее было продемонстрировано то, что он дает улучшенную стабильность композициям анакинра для инъекции. Однако, как продемонстрировано в приложенных примерах, цитрат натрия в комбинации с HEPES неожиданно стабилизирует композиции, содержащие анакинра в концентрации примерно от 2 до 30 мг/мл, при определенных условиях, таких как повышенные температуры хранения. В частности, один буфер HEPES неожиданно стабилизирует композиции, содержащие анакинра в концентрации примерно от 2 до 30 мг/мл при определенных условиях, таких как повышенные температуры хранения. Буфер HEPES, однако, известен в данной области как буфер, который обычно не используется в фармацевтической области местного применения фармацевтических агентов в глаз.

То есть, в одном аспекте изобретения предложена композиция, содержащая:

от 0,01 мг/мл до 30 мг/мл анакинра;

буфер, выбранный из HEPES и смеси HEPES и цитрата натрия;

и,

возможно, по меньшей мере один осмолит.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит по меньшей мере один осмолит.

В одном воплощении данного аспекта указанный буфер представляет собой буфер HEPES.

В одном воплощении данного аспекта указанный буфер стабилизирует рН композиции на значении рН от 6 до 7.

В одном воплощении данного аспекта предложена композиция, содержащая:

от 0,01 мг/мл до 30 мг/мл анакинра; буфер, выбранный из HEPES и смеси HEPES и цитрата натрия, где указанный буфер стабилизирует рН композиции на рН от 6 до 7; и, возможно, по меньшей мере один осмолит. Типично концентрация анакинра составляет от 0,05 мг/мл до 30 мг/мл, как, например, примерно от 0,1 мг/мл до 30 мг/мл, как, например, примерно от 0,5 мг/мл до 30 мг/мл, как, например, примерно от 1 мг/мл до 30 мг/мл, как, например, примерно от 1,5 мг/мл до 30 мг/мл, как, например, примерно от 2 мг/мл до 30 мг/мл, как, например, примерно 5 мг/мл, как, например, примерно 10 мг/мл, как, например, примерно 15 мг/мл, как, например, примерно 20 мг/мл или как, например, примерно 25 мг/мл.

В одном воплощении данного аспекта предложена композиция, содержащая:

от 2 мг/мл до 30 мг/мл анакинра; буфер, выбранный из HEPES и смеси HEPES и цитрата натрия, где указанный буфер стабилизирует рН композиции на рН от 6 до 7; и, возможно, по меньшей мере один осмолит.

В одном воплощении данного аспекта указанный буфер представляет собой смесь цитрата натрия и HEPES.

В данном контексте осмолит следует понимать как химическое соединение, которое имеет потенциал модифицировать осмоляльность раствора и давать стабилизирующий эффект. Осмоляльность представляет собой зависящее от концентрации растворенных веществ свойство, которое зависит от общего числа молей всех растворенных соединений в 1000 г растворителя. Неограничивающими примерами осмолитов являются L-пролин; D-треонин; L-серин; миоинозитол; мальтитол; D-рафиноза; пентагидрат; гидроксипролин; таурин; глицинбетаин; сахароза; маннит; L-пролин; D-треонин; L-серин и метионин.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит по меньшей мере один осмолит.Указанный по меньшей мере один осмолит может быть выбран из таурина, пролина, гидроксипролина, маннита и метионина. В другом воплощении указанный по меньшей мере один осмолит выбран из таурина, пролина и гидроксипролина. В другом воплощении указанный по меньшей мере один осмолит представляет собой таурин. В другом воплощении указанный по меньшей мере один осмолит представляет собой гидроксипролин. В другом воплощении указанный по меньшей мере один осмолит представляет собой смесь таурина и гидроксипролина.

В одном воплощении данного аспекта указанный по меньшей мере один осмолит представляет собой от 15 мг/мл до 40 мг/мл таурина, как, например, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 мг/мл таурина. Другие воплощения включают концентрации таурина, изложенные в примерах.

В одном воплощении данного аспекта указанный по меньшей мере один осмолит представляет собой от 15 мг/мл до 40 мг/мл гидроксипролина, как, например, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 мг/мл гидроксипролина. Другие воплощения включают концентрации гидроксипролина, изложенные в примерах.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция дополнительно содержит один или более чем один хелатирующий агент, поверхностно-активное вещество и регулятор тоничности.

«Хелатирующий агент» представляет собой химическое соединение, которое может образовать две или более чем две отдельные координационные связи между полидентатным (связанным многими связями) лигандом и одним центральным атомом. Обычно данные лиганды представляют собой органические соединения, примерами которых являются синтетические аминополикарбоновые кислоты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и диэтилентриаминпентауксусная кислота (DPTA); фосфонаты; природные агенты, такие как порфириновые кольца хлорофилла и гемоглобина; полисахариды; полинуклеиновые кислоты; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и гистидин; органические дикислоты, такие как малат, и полипептиды, такие как фитохелатин. Кроме того, многие микробные виды продуцируют водорастворимые пигменты, которые служат в качестве хелатирующих агентов, именуемые сидерофорами. Например, известно то, что виды Pseudomonas секретируют пиохелин и пиовердин, которые связывают железо. Другим примером является энтеробактин, продуцируемый Е. coli, который является сильнейшим известным хелатирующим агентом. Лимонная кислота имеет хелатирующие свойства и, следовательно, используется для захвата многовалентных ионов и, соответственно, в качестве примера, смягчает воду в мылах и моющих средствах для стирки белья.

В одном воплощении указанная композиция содержит хелатирующий агент. Указанный хелатирующий агент может быть выбран из ЭДТА; DPTA; фосфоната; природного хелатирующего агента; сидерофора; полисахарида; полинуклеиновой кислоты; аминокислоты; органической дикислоты и полипептида. Конкретные примеры таких хелатирующих агентов определяются выше. В одном воплощении данного аспекта указанным хелатирующим агентом является ЭДТА.

Под термином «поверхностно-активное вещество» подразумевается соединение, которое уменьшает поверхностное натяжение (или натяжение на границе раздела) между жидкой и газовой фазой, между двумя жидкостями или между жидкостью и твердым веществом. Поверхностно-активные вещества являются амфифильными, подразумевая то, что они содержат и гидрофобные группы, и гидрофильные группы. Поверхностно-активные вещества будут диффундировать в воде и адсорбироваться на поверхностях раздела между воздухом и водой или на поверхности раздела между маслом и водой, в случае, когда вода смешивается с маслом.

В одном воплощении указанная композиция содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. Неограничивающие примеры подходящих поверхностно-активных веществ для применения в указанных композициях включают блокполимеры этиленоксида и пропиленоксида, такие как полоксамеры, которые представляют собой триблоксополимеры, состоящие из центральной цепи полипропиленоксида, фланкированной двумя цепями полиэтиленоксида, примерами которых является плюроник F68; сорбитана монолаурат; сложный эфир сорбита; сложный эфир полиглицерина и жирных кислот; кокамид DEA (диэтаноламин) лаурилсульфат; алканоламид; полиоксиэтиленпропиленгликоля стеарат; лауриловый простой эфир полиоксиэтилена; цетиловый простой эфир полиоксиэтилена; полисорбат, такой как полисорбат 80 (PS80, также известный как полиоксиэтиленсорбитана моноолеат или Tween 80™), и полисорбат 20 (PS20); глицерина моностеарат; глицерина дистеарат; сорбита монопальмитат; полиоксиэтилена сорбитана моноолеат; полиоксиэтилена сорбитана монолаурат и пропиленгликоля моностеарат, но не ограничиваются ими. В одном воплощении указанное поверхностно-активное вещество является неионным. В одном воплощении указанное поверхностно-активное вещество выбрано из полисорбата 80 и плюроника F68. Предпочтительно указанное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.

Под термином «регулятор тоничности» обычно подразумевается агент, который корректирует осмоляльность раствора и, более конкретно, агент, который корректирует осмоляльность до значения осмоляльности около значения осмоляльности физиологической жидкости.

В одном воплощении указанная композиция содержит один или более чем один регулятор тоничности. Подходящие регуляторы тоничности включают: хлорид натрия (NaCI), сорбит, маннит, сахарозу, трегалозу или другие сахара. В одном воплощении данного аспекта указанный регулятор тоничности представляет собой NaCI.

В одном воплощении указанная композиция содержит ЭДТА в качестве хелатирующего агента, полисорбат 80 в качестве поверхностно-активного вещества и NaCI в качестве регулятора тоничности.

В одном воплощении данного аспекта указанный буфер стабилизирует рН композиции на значении рН примерно 6,5. Как объясняется в данном документе в других местах, функцией буфера является поддержание рН при почти постоянном значении. В данном воплощении буфер, таким образом, поддерживает рН композиции при примерно 6,5.

В одном воплощении данного аспекта предложена композиция, где указанная композиция имеет осмоляльность примерно от 150 до 320 мОсмоль/кг. При описании осмоляльности раствора как изотоничный/гипертоничный или гипотоничный обозначение тоничности означает то, что осмотическое давление раствора относится к осмотическому давлению физиологического раствора. В общем, изотоничный раствор имеет осмоляльность приблизительно от 280 до 320 мОсм/кг.

В одном воплощении указанная композиция содержит осмолит, концентрация которого корректируется для обеспечения изотоничной композиции. В частности, такая композиция может иметь осмоляльность от 280 до 320 мОсмоль/кг. Изотоничные препараты обычно являются предпочтительными для местных применений, так как они типично имеют тенденцию быть менее раздражающими, чем неизотоничные растворы. Изотоничная композиция, предпочтительно имеющая осмоляльность в определенном интервале, подходит для глазного применения, так как ее осмоляльность находится в пределах того же интервала, что и осмоляльность глаза.

Однако гипотоничные композиции также могут быть полезными для нанесения на глаз. Следовательно, в одном воплощении указанная композиция содержит осмолит, где концентрация указанного осмолита корректируется для предоставления гипотоничной композиции. В частности, такая композиция может иметь осмоляльность от 150 до 280 мОсмоль/кг. Гипотоничная композиция может давать полезные свойства при нанесении на глаз пациента, в частности, если указанный пациент страдает от синдрома сухого глаза. Тогда данная композиция может давать пациенту облегчение посредством увлажнения глаза.

В одном воплощении композиция содержит дополнительные ингредиенты, такие как один или более чем один консервант. Консервант может быть добавлен в композицию для того, чтобы, например, поддерживать ее микробиологическую безопасность.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 2 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- от 5 мМ до 50 мМ буфер HEPES, где указанный буфер стабилизирует рН композиции на рН от 6 до 7; и

- от 1 мг/мл до 100 мг/мл осмолита, выбранного из таурина и гидроксипролина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 2 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- от 5 мМ до 50 мМ буфер HEPES, где указанный буфер стабилизирует рН композиции на рН от 6 до 7;

- от 1 мг/мл до 100 мг/мл осмолита, выбранного из таурина, пролина, гидроксипролина, маннита и метионина;

- от 0,05 мМ до 1 мМ ЭДТА;

- от 0,01% до 1% полисорбата 80; и

- от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл NaCI.

Композиции, как определено выше, были подвергнуты анализам на стабильность и продемонстрировали в таких анализах полезные свойства.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 2 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- от 5 мМ до 50 мМ буфер HEPES, где указанный буфер стабилизирует рН композиции на рН от 6 до 7;

- от 1 мг/мл до 50 мг/мл осмолита, выбранного из таурина, пролина и гидроксипролина;

- от 0,05 мМ до 1 мМ ЭДТА;

- от 0,01% до 1% полисорбата 80; и

- от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл NaCI.

Композиции, как определено выше, были подвергнуты анализам на стабильность и продемонстрировали в таких анализах хорошие свойства.

В одном воплощении данного аспекта указанный буфер представляет собой буфер HEPES от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ. Указанный буфер HEPES может дополнительно стабилизировать рН композиции на примерно 6,5.

В одном воплощении данного аспекта указанный буфер представляет собой примерно 10 мМ буфер HEPES. Указанный буфер HEPES может дополнительно стабилизировать рН композиции на примерно 6,5.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 2 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- смесь от 5 мМ до 50 мМ буфера HEPES и от 0,05 мМ до 2 мМ натрий-цитратного буфера, где указанный смешанный буфер стабилизирует рН композиции на рН от 6 до 7;

- от 1 мг/мл до 100 мг/мл осмолита, выбранного из таурина, пролина, гидроксипролина, маннита и метионина;

- от 0,05 мМ до 1 мМ ЭДТА;

- от 0,01% до 1% полисорбата 80; и

- от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл NaCI.

Композиции, как определено выше, были подвергнуты анализам на стабильность и продемонстрировали в таких анализах хорошие свойства.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 2 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- смесь от 5 мМ до 50 мМ буфера HEPES и от 0,05 мМ до 2 мМ натрий-цитратного буфера, где указанный смешанный буфер стабилизирует рН композиции на рН от 6 до 7;

- от 1 мг/мл до 50 мг/мл осмолита, выбранного из таурина, пролина и гидроксипролина;

- от 0,05 мМ до 1 мМ ЭДТА;

- от 0,01% до 1% полисорбата 80; и

- от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл NaCI.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 2 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- 10 мМ - 50 мМ буфер HEPES; и

- 15 мг/мл - 25 мг/мл таурина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 2 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- 10 мМ - 50 мМ буфер HEPES; и

- 20 мг/мл - 30 мг/мл гидроксипролина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 2 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- 10 мМ - 50 мМ буфер HEPES;

- 10 мг/мл -15 мг/мл таурина; и

- 10 мг/мл -15 мг/мл гидроксипролина.

Композиции, как определено выше, были подвергнуты анализам на стабильность и продемонстрировали в таких анализах хорошие свойства.

В одном воплощении данного аспекта указанный буфер представляет собой смесь 10 мМ буфера HEPES и 1,2 мМ натрий-цитратного буфера. Указанный смешанный буфер может, кроме того, стабилизировать рН композиции на значении примерно 6,5.

В одном воплощении данного аспекта указанный по меньшей мере один осмолит представляет собой таурин. В частности, указанный по меньшей мере один осмолит представляет собой от 20 мг/мл до 40 мг/мл таурина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 5 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- 10 мМ буфер HEPES, который стабилизирует рН композиции на значении примерно 6,5;

- 0,5 мМ ЭДТА;

- 0,1% полисорбата 80;

- от 1 мг/мл до 1,5 мг/мл NaCI; и

- 30 мг/мл таурина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 5 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- смесь 10 мМ HEPES и 1,2 мМ натрий-цитратного буфера, которая стабилизирует рН композиции на примерно 6,5;

- 0,5 мМ ЭДТА;

- 0, 1% полисорбата 80;

- от 1 мг/мл до 1,5 мг/мл NaCI; и

- 30 мг/мл таурина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 5 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- 10 мМ буфер HEPES, который стабилизирует рН композиции на значении примерно 6,5; и

- примерно 30 мг/мл таурина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 5 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- 10 мМ буфер HEPES, который стабилизирует рН композиции на примерно 6,5; и

- примерно 30 мг/мл гидроксипролина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 5 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- 10 мМ буфер HEPES, который стабилизирует рН композиции на значении примерно 6,5;

- 0,5 мМ ЭДТА;

- 0,1% полисорбата 80;

- от 1 мг/мл до 1,5 мг/мл NaCI; и

- примерно 30 мг/мл таурина.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит от примерно 15 мг/мл до примерно 25 мг/мл анакинра.

В одном воплощении данного аспекта указанная композиция содержит:

- от 5 мг/мл до 25 мг/мл анакинра;

- смесь 10 мМ HEPES и 1,2 мМ натрий-цитратного буфера, которая стабилизирует рН композиции на примерно 6,5;

- 0,5 мМ ЭДТА;

- 0,1% полисорбата 80;

- от 1 мг/мл до 1,5 мг/мл NaCI; и

- 30 мг/мл таурина.

В одном воплощении композиция согласно аспектам, раскрытым в данном документе, не содержит или по существу не содержит цитрат.

В одном воплощении композиция согласно аспектам, раскрытым в данном документе, наносится субъекту, например, человеку или другому млекопитающему, местно. Местное применение, например, включает глазное применение, т.е. нанесение на глаз; нанесение на кожу или на слизистую.

В одном аспекте настоящего изобретения данные композиции наносятся на глаз местно.

Местные глазные лекарственные средства обычно самостоятельно применяются пациентами. Поскольку пациент может хранить лекарственное средство в течение относительно длительного приода времени, и для удобства ему также нужна возможность обращаться с лекарственным средством в течение некоторого времени при температуре окружающей среды, препарат может подвергаться воздействию более высоких температур и большим уровням напряжения в результате встряхивания, чем препарат, который типично хранит до применения только лечащий врач или фармацевт, или, в качестве альтернативы, для пациента, обращающегося с температурочувствительным лекарственным средством, нацеленным только на лечение дома у пациента. Как известно в данной области, белки являются более чувствительными к встряхиванию и повышенной температуре, чем маленькие молекулы. Напряжение в результате встряхивания может приводить к осаждению, и тепловой стресс может приводить к осаждению и к химической деградации. Кроме того, во время загрузки соединения в устройство для доставки может быть воздействие теплового стресса.

Композиции по настоящему изобретению являются полезными в лечении местных расстройств, таких как глазные расстройства, расстройства, связанные с ИЛ-1, воспалительные глазные расстройства и, в частности, глазные расстройства, связанные с ИЛ-1.

Расстройства, связанные с ИЛ-1, включают первичный или вторичный синдром Шегрена, такой как сухой кератоконъюнктивит, ассоциированный с синдромом Шегрена, синдром, не являющийся синдромом Шегрена, такой как заболевание слезной железы или обструкция слезной железы; расстройства, связанные с сухостью глаз, сухой кератит, сухой кератоконъюнктивит, ксерофтальмия, расстройство слезной пленки, пониженную продукцию слез, недостаточность слезной жидкости, сухость глаз, ассоциированную с заболеванием «трансплантат против хозяина», и дисфункцию мейбомиевой железы.

Расстройства также включают воспалительные состояния роговицы, неоваскуляризацию роговицы, кератит, включающий периферический язвенный кератит и микробный кератит; заживление раны роговицы, трансплантацию роговицы/кератопластику, хирургию, обеспечивающую кератопротезирование, послойную трансплантацию, селективную эндотелиальную трансплантацию.

Расстройства также включают расстройства, поражающие конъюнктиву, такие как расстройства, связанные с рубцеванием конъюнктивы, и конъюнктивит, например, аллергический конъюнктивит и тяжелый аллергический конъюнктивит, пемфигоидный синдром и синдром Стивенса-Джонсона.

Расстройства также включают аллергические реакции, поражающие глаз, такие как тяжелое аллергическое (атопическое) заболевание глаза, также известное как аллергический конъюнктивит.

Расстройства также включают аутоиммунные расстройства, поражающие глаз, такие как симпатическая офтальмия, синдром Фогта-Коянаги-Харада (VKH), хориоретинопатию «выстрел дробью» (или birdshot хориоретинопатия), глазной рубцевой пемфигоид, гетерохромный иридоциклит Фукса и разные формы увеита.

Расстройства также включают диабетическую ретинопатию, диабетический отек макулы, увеит, офтальмопатию Грейвса, эктропион/энтропион, аллергию на контактные линзы и синдром сухого глаза.

Следовательно, в одном аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция для применения в лечении глазного расстройства. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть приготовлены в целом ряде форм, таких как глазные капли, суспензии и мази.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство представляет собой воспалительное глазное расстройство.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство представляет собой расстройство, связанное с ИЛ-1.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство представляет собой глазное расстройство, связанное с ИЛ-1.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство выбрано из следующих: первичный или вторичный синдром Шегрена, такой как сухой кератоконъюнктивит, ассоциированный с синдромом Шегрена, синдром, не являющийся синдромом Шегрена, такой как заболевание слезной железы или обструкция слезной железы; расстройства, связанные с сухостью глаз, сухой кератит, сухой кератоконъюнктивит, ксерофтальмия, расстройство слезной пленки, пониженная продукция слез, недостаточность слезной жидкости, сухость глаз, ассоциированная с заболеванием «трансплантат против хозяина», дисфункция мейбомиевой железы, воспалительные состояния роговицы, неоваскуляризация роговицы, кератит, включающий периферический язвенный кератит, микробный кератит, заживление раны роговицы, трансплантация роговицы/кератопластика, хирургия, обеспечивающая кератопротезирование, послойная трансплантация, селективная эндотелиальная трансплантация, расстройства, связанные с рубцеванием конъюнктивы, конъюнктивит, например, аллергический конъюнктивит и тяжелый аллергический конъюнктивит, пемфигоидный синдром и синдром Стивенса-Джонсона, аллергические реакции, поражающие глаз, такие как тяжелое аллергическое (атопическое) заболевание глаза, также известное как аллергический конъюнктивит, аутоиммунные расстройства, поражающие глаз, такие как симпатическая офтальмия, синдром Фогта-Коянаги-Харада (VKH), хориоретинопатия «выстрел дробью» (или birdshot хориоретинопатия), глазной рубцевой пемфигоид, гетерохромный иридоциклит Фукса и разные формы увеита, диабетическая ретинопатия, диабетический отек макулы, офтальмопатия Грейвса, эктропион/энтропион, аллергия на контактные линзы и синдром сухого глаза.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство выбрано из следующих: первичный или вторичный синдром Шегрена, синдром, не являющийся синдромом Шегрена; расстройство, связанное с сухостью глаз, сухой кератит, сухой кератоконъюнктивит, ксерофтальмия, расстройство слезной пленки, пониженная продукция слез, недостаточность слезной жидкости, сухость глаз, ассоциированная с заболеванием «трансплантат против хозяина», дисфункция мейбомиевой железы, воспалительные состояния роговицы, неоваскуляризация роговицы, кератит, заживление раны роговицы, трансплантация роговицы/кератопластика, хирургия, обеспечивающая кератопротезирование, послойная трансплантация, селективная эндотелиальная трансплантация, расстройства, связанные с рубцеванием конъюнктивы, аллергический конъюнктивит, пемфигоидный синдром, синдром Стивенса-Джонсона, симпатическая офтальмия, синдром Фогта-Коянаги-Харада (VKH), хориоретинопатия «выстрел дробью» (или birdshot хориоретинопатия), глазной рубцевой пемфигоид, гетерохромный иридоциклит Фукса, диабетическая ретинопатия, диабетический отек макулы, офтальмопатия Г рейвса, эктропион/энтропион, аллергия на контактные линзы и синдром сухого глаза.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство представляет собой аллергический конъюнктивит.

В одном аспекте изобретения предложено применение фармацевтической композиции в получении лекарственного средства, полезного при лечении глазного расстройства.

В одном воплощении данного аспекта применения указанное глазное расстройство представляет собой воспалительное глазное расстройство.

В одном воплощении данного аспекта применения указанное глазное расстройство представляет собой расстройство, связанное с ИЛ-1.

В одном воплощении данного аспекта применения указанное глазное расстройство представляет собой глазное расстройство, связанное с ИЛ-1.

В одном воплощении данного аспекта применения указанное глазное расстройство выбрано из глазного расстройства, как определено в других аспектах в данном докменте.

В одном аспекте изобретения предложен способ лечения глазного расстройства, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению. Типично указанный субъект представляет собой млекопитающее, такое как человек.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство представляет собой воспалительное глазное расстройство.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство представляет собой аллергический конъюнктивит.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство представляет собой расстройство, связанное с ИЛ-1.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство представляет собой глазное расстройство, связанное с ИЛ-1.

В одном воплощении данного аспекта указанное глазное расстройство выбрано из глазного расстройства, как определено в других аспектах в данном документе.

В одном воплощении данного аспекта указанная фармацевтическая композиция вводится местно. В частности, указанная фармацевтическая композиция вводится местно в глаз субъекта.

Некоторые способы изготовления или заполнения требуют по меньшей мере кратковременного воздействия относительно высокой температуры на композицию. Таким образом, для целей изготовления часто требуется, чтобы композиция была температуроустойчивой, например, так, чтобы она могла выдерживать условия, требующиеся для изготовления и распределения композиции в контейнер.

В одном аспекте настоящего изобретения предложено устройство для доставки лекарственного средства, содержащее композицию, как определено в данном документе.

В одном воплощении указанное устройство для доставки лекарственного средства представляет собой контейнер для многократного применения или контейнер для однократного применения.

Под «контейнером для однократного или многократного применения» подразумевается контейнер, который содержит композицию и сконструирован для доставки одной или нескольких доз в одном конкретном случае (контейнер для однократного применения) или для доставки нескольких доз во многих случаях (контейнер для многократного применения). Контейнеры для многократного применения со стерильными лекарственными средствами типично содержат композиции, включающие один или более чем один консервант, для того, чтобы обеспечивать открытие контейнера для отбора разных доз в течение нескольких суток, все еще поддерживая микробиологическую безопасность композиции.

В одном воплощении композиция по изобретению предоставляется в контейнере, полученном по технологии выдува-заполнения-запаивания.

Под «контейнером, полученным по технологии выдува-заполнения-запаивания» подразумевается контейнер, сделанный из полимерного вещества, который формуется, заполняется и запаивается в непрерывном процессе без вмешательства человека в стерильной закрытой области внутри машины. Данную технологию можно использовать для асептического изготовления стерильных фармацевтических жидких лекарственных форм. Например, загрузка композиции в контейнер, полученный по технологии выдува-заполнения-запаивания (BFS, от англ. blow-fill-seal), может приводить к воздействию на композицию повышенных температур, помимо встряхивания и/или механического напряжения, ассоциированного с процессом заполнения.

Композиция, как раскрыто в данном документе, предпочтительно демонстрирует улучшенную стабильность при конкретных условиях. Стабильность композиции, например, может оцениваться с использованием одного или более чем одного способа, описанного в данном документе, такого как оценка внешнего вида; УФ (ультрафиолетовая) спектроскопия; гель-фильтрационная ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) (ГФ-ВЭЖХ); ВЭЖХ с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ); катионообменная ВЭЖХ (КО-ВЭЖХ); оценка мутности; подсчет количества частиц в режиме светотени; микроскопический анализ числа частиц или определение уровня содержания мономеров. При осуществлении оценок стабильности на основе внешнего вида оцениваются, например, опалесценция, цвет и содержание частиц композиции. Специалисту в данной области известны другие способы оценки стабильности композиции.

В одном воплощении, релевантном для разных аспектов изобретения, как раскрыто в данном документе, композиция является стабильной после хранения в течение периода по меньшей мере одна неделя, по меньшей мере две недели, по меньшей мере три недели, по меньшей мере четыре недели, по меньшей мере пять недель или по меньшей мере шесть недель или дольше, как, например, 3, 4, 5 или 6 месяцев при условиях окружающей среды.

В одном воплощении композиция является стабильной при температуре от примерно 20°С до примерно 40°С, например, при температуре от примерно 25°С до примерно 35°С, как, например, при температуре примерно 30°С, в течение периода времени по меньшей мере двое суток; трое суток; пять суток; одна неделя; десять суток; две недели; три недели; четыре недели; пять недель или шесть недель.

В одном воплощении композиция является стабильной при температуре от примерно 2°С до примерно 15°С, например, при температуре от примерно 2°С до примерно 8°С в течение периода времени по меньшей мере одна неделя, две недели, три недели, четыре недели, пять недель, шесть недель, восемь недель, 16 недель, 20 недель, 25 недель, 30 недель, 35 недель, 40 недель, 45 недель, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, семь месяцев, восемь месяцев или более, как, например, от 1 до 5 лет.

ПРИМЕРЫ

Общие материал и методы

В Примерах, приведенных ниже, использовали следующие материалы и методы. Маточный раствор анакинра: 220 мг/мл анакинра в буфере CSE (т.е. цитрат (citrate), соль (salt), EDTA (ЭДТА)): 10 мМ цитрат натрия, 140 мМ хлорид натрия, 0,5 мМ ЭДТА, рН 6,5.

Способы ВЭЖХ создавали согласно самостоятельно разработанным стандартным протоколам. Для анализов посредством гель-фильтрации (ГФ-ВЭЖХ) использовали колонку TSK-Gel G2000 SWXL 7,8 мм × 30 см. Подвижная фаза представляла собой буфер CSE, инъекционный объем / концентрация составляли 100 мкл / 5 мг/мл, длина волны составляла 280 нм, и скорость тока составляла 0,5 мл/мин.

Для анализов катионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографией (КО-ВЭЖХ) использовали колонку Tosoh SP5PW Protein Рак 7,5 мм × 7,5 см, подвижная фаза А представляла собой 20 мМ MES (морфолиноэтансульфоновая кислота), рН 5,5, и подвижная фаза Б представляла собой 20 мМ MES, 1 М NaCI, рН 5,5. Инъекционный объем / концентрация составляли 100 мкл / 5 мг/мл, длина волны составляла 280 нм, и скорость тока составляла 0,5 мл/мин.

Для анализов высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой использовали колонку Phenomenex Jupiter С4 RP 250 × 4,6 мм. Подвижная фаза А представляла собой 0,1%-ную TFA (трифторуксусная кислота) в воде, и подвижная фаза Б представляла собой 0,1%-ную TFA в 90% ацетонитриле. Инъекционный объем / концентрация составляли 50 мкл / 0,3 мг/мл, длина волны составляла 215 нм, и скорость тока составляла 1 мл/мин.

Визуальные наблюдения осуществляли на композициях посредством проверки раствора в круглом стеклянном контейнере относительно черного и белого фона. Отмечали опалесценцию (мутность) и визуальные частицы. Мутность композиций количественно измеряли с использованием турбидиметра НАСН 2100AN. Турбидиметрические значения цитируются в нефелометрических единицах мутности (NTU, от англ. nephelometric turbidity units), где числовое значение представляет собой степень мутности или опалесценции раствора.

Пример 1

Стабильность композиций осмолитов при 35°С

Маточный раствор анакинра разводили до 30 мг/мл анакинра в композициях осмолитов с NaCI или без него. Анализировали одиннадцать разных осмолитов следующим образом:

(а) Маточный раствор анакинра, разведенный водными растворами осмолитов в деионизированной воде - композиции 1-11. Концентрации NaCI, цитрата и ЭДТА после разведения маточного раствора анакинра в буфере CSE водными растворами осмолитов: NaCI - 19,1 мМ (1,12 мг/мл); цитрат - 1,36 мМ; ЭДТА - 0,07 мМ, и

(б) Маточный раствор анакинра, разведенный водными растворами осмолитов в 19,2 мМ NaCI - композиции 12-22. Концентрации NaCI, цитрата и ЭДТА после разведения маточного раствора анакинра в буфере CSE водным NaCI -растворами осмолитов: NaCI - 38,2 мМ (2,24 мг/мл); цитрат - 1,36 мМ; ЭДТА - 0,07 мМ.

Композиции (всего 22) доводили до рН 6,5 плюс/минус 0,1, хранили при 35°С и отслеживали в течение 2 недель.

Наблюдали минимальные изменения как в показателях содержания мономеров, определенного ГФ-ВЭЖХ, так и измеренной мутности на протяжении 2-недельного периода анализа, однако, композиции, содержащие NaCI, были визуально прозрачнее, чем композиции, полученные с деионизированной водой.

Четыре композиции осмолитов давали улучшения на основе внешнего вида, будучи оптически прозрачными и имеющими минимальное содержание частиц через 2 недели при 35°С:

12 (пролин плюс NaCI),

18 (гидроксипролин плюс NaCI),

19 (таурин плюс NaCI) и

22 (маннит плюс NaCI).

Эти четыре композиции были визуально прозрачнее по сравнению с другими композициями, показывая то, что эти четыре осмолита обеспечивали стабилизирующий эффект на анакинра.

Пример 2

Препарат анакинра в разных буферах Препарат в буфере HEPES

Маточный раствор анакинра разводили до 60 мг/мл белка в буфере CSE и диализировали в 10 мМ HEPES, 38,2 мМ NaCI, рН 6,3, 6,5 и 6,9. Во всех случаях 10 мл раствора белка диализировали против 2 × 2 л буфера.

После диализа композиции дополнительно разводили до 30 мг/мл анакинра с использованием 10 мМ буфера HEPES, содержащего разные осмолиты и 38,2 мМ NaCI таким образом, чтобы данные композиции были бы изотоничными с целевым значением 280-320 мОсм/кг. Всего готовили 12 композиций (4 осмолита при рН 6,3, 6,5 и 6,9 соответственно) и хранили при 35°С с полным анализом в t (время), равное 0, 2, 4 и 8 неделям. В качестве контроля использовали 30 мг/мл анакинра в CSE. Данную композицию хранили и тестировали при таких же условиях, что и другие композиции.

Концентрация, измеренная по поглощению в УФ при 280 нм не показывала потери белка в течение 8-недельного периода анализа. При хранении имело место уменьшение содержания мономера для всех образцов при измерении посредством ГФ-ВЭЖХ. Содержание мономера анакинра, измеренное ГФ-ВЭЖХ, через 4 недели было значимо большим в буфере HEPES по сравнению с буфером CSE (больше 99,0% относительно 97,9%).

Было идентифицировано то, что мутность после 2 недель хранения при 35°С была обычно лучше для анакинра, приготовленной в буфере HEPES, чем для анакинра, приготовленной в буфере CSE. В отличие от этого, мутность 30 мг/мл раствора анакинра в буфере CSE при рН 6,5 при хранении в течение 2 недель при 35°С была 15,6 NTU. Сопоставимые данные для анакинра, приготовленной в буфере HEPES при рН 6,5 с осмолитами, составляли 6-9 NTU после двух недель хранения. Для образцов при рН 6,3 и 6,9 значения мутности во всех случаях, кроме одного (пролин, рН 6,3), были лучше, чем мутность анакинра в буфере CSE при таком же рН. Для образцов анакинра в буфере HEPES при рН 6,5, включающих пролин, гидроксипролин, таурин или маннит, мутность была низкой даже через 8 недель, см. Таблицу 2 ниже.

Препарат анакинра в буфере His HCI

Маточный раствор анакинра разводили до 60 мг/мл анакинра в CSE и диализировали в 10 мМ His HCI, 38,2 мМ NaCI, рН 6,5.

После диализа композиции дополнительно разводили до 30 мг/мл анакинра в разных композициях осмолита (таурин, гидроксипролин, пролин, маннит), также содержащих 10 мМ His HCI и 38,2 мМ NaCI, таким образом, что данные композиции были бы изотоничными при целевом значении 280 мОсм/кг. Композиции хранили при 35°С, и полный анализ проводили в t, равное 0, 2 и 4 неделям.

Измеренная концентрация белка не продемонстрировала потери содержания белка через 4 недели при 35°С.

Анализ способом ГФ-ВЭЖХ показал уменьшение содержания мономера, однако, большинство композиций, содержащих анакинра в His буфере, превосходили анакинра в буфере CSE, см. Таблицу 3.

Препарат анакинра в буфере Tris HCI

Маточный раствор анакинра разводили до 60 мг/мл анакинра в буфере CSE и диализировали в 10 мМ Tris HCI, 38,2 мМ NaCI, рН 6,5.

После диализа композиции дополнительно разводили до 30 мг/мл анакинра в разных композициях осмолитов, также содержащих 10 мМ Tris HCI и 38,2 мМ NaCI, таким образом, что данные композиции были бы изотоничными при целевом значении 280 мОсм/кг. Композиции хранили при 35°С, и полный анализ проводили в t, равное 0, 2 и 4 неделям.

Аналогичным образом, данные композиции не показывали потери содержания белка при измерении концентрации белка через 4 недели при 35°С.ГФ-ВЭЖХ продемонстрировала легкое снижение содержания мономера при хранении при 35°С, но данное снижение было обычно меньшим, чем для анакинра в буфере CSE, см. Таблицу 4.

Заключение

Сравнение стабильности 30 мг/мл анакинра в буфере CSE, HEPES, His и Tris показывает то, что стабильность через 4 недели лучше в буферах HEPES, His и Tris, чем в CSE. Общим заключением является то, что буфер HEPES обеспечивает оптимальную стабильность анакинра, и что это также применимо к присутствию осмолита. Данные композиции на основе буфера HEPES давали наилучший общий профиль стабильности, когда принимались во внимание все аналитические способы (концентрация белка, ГФ-ВЭЖХ и мутность).

Пример 3

Композиции, содержащие анакинра в буфере HEPES и по меньшей мере один осмолитический агент Получение

Замороженный маточный раствор анакинра оттаивали и диализировали против 10 мМ HEPES, NaCI (2,24 мг/мл), ЭДТА (0,5 мМ), полисорбата 80 (PS80: 1 мг/мл) при рН 6,5 вместе с разными осмолитами.

Все образцы диализировали в масштабе 2 × 12,5 мл против 2 × 2000 мл буфера. После диализа раствор аликвотировали и разводили маточной композицией осмолитов/№С1/ЭДТА/Р880. Концентрации осмолитов варьировали для получения изотоничности (280-320 мОсмоль/кг) в конечных композициях. Полученные композиции излагаются в Таблице 5.

Разведенное вещество хранили в стеклянных пробирках при 30°С и визуально оценивали на мутность с регулярными интервалами на протяжении 2 недель хранения. Результаты представлены в Таблице 5.

Как можно видеть в Таблице 5, композиции анакинра в буфере HEPES, содержащие осмолиты таурин, пролин и маннит, демонстрировали наилучшие результаты в показателях мутности после 14 суток хранения. Композиции, включающие осмолит таурин, демонстрировали лучшие результаты, чем композиции, включающие любой из других осмолитов.

Пример 4

Композиции, содержащие анакинра в цитратном буфере и по меньшей мере один осмолит Получение

Замороженный маточный раствор анакинра оттаивали и диализировали с 10 мМ цитратом натрия, 2,24 мг/мл NaCI, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мг/мл полисорбата 80, рН 6,5, и разными осмолитами. Концентрация осмолитов варьировала для получения изотоничных композиций (примерно 300 мОсмоль/кг). Разведение приводило к получению композиций, как изложено в Таблице 6 ниже.

Разведенное вещество хранили в стеклянных пробирках при 30°С и анализировали с регулярными интервалами на протяжении 8 недель хранения.

Таблица 6: Мутность композиций анакинра в 10 мМ натрий-цитратном буфере, 1 мг/мл PS80, 2,24 мг/мл NaCI, 0,19 мг/мл ЭДТА и компонентах, определенных ниже.

Для композиций анакинра, содержащих цитратный буфер, выбранные осмолиты давали некоторый стабилизирующий эффект, в зависимости от конкретного осмолита и относительно друг друга и, наиболее примечательно, при низкой концентрации белка. Выбранными осмолитами являются таурин, маннит, пролин, метионин и гидроксипролин. Такие осмолиты как миоинозит или сахароза не давали стабилизирующего эффекта.

Пример 5

Композиции, содержащие анакинра в смеси буфера HEPES и цитратного буфера, и по меньшей мере одного осмолита

Получение

Маточный раствор анакинра разводили до концентраций анакинра 2, 15 и 25 мг/мл раствором, состоящим из 10 мМ HEPES, 2,24 мг/мл NaCI, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мг/мл полисорбата 80, рН 6,5, и разных осмолитов. Концентрация осмолитов варьировала для получения изотоничных композиций (300 мОсмоль/кг). Полученные в результате композиции содержали 0,1, 0,7 и 1,1 мМ остатков цитрата натрия, соответственно, для концентраций анакинра 25, 15 и 2 мг/мл. Разведение приводило к композициям, представленным в Таблице 7.

Разведенное вещество хранили в стеклянных пробирках при 30°С и анализировали с регулярными интервалами на протяжении 8 недель хранения.

Данные результаты подтвердили наблюдавшийся ранее стабилизирующий эффект осмолитов, в этот раз в комбинации с HEPES и цитратным буфером. Осмолиты пролин, гидроксипролин, таурин, маннит и метионин продемонстрировали аналогичное влияние на мутность растворов 2-25 мг/мл анакинра в композициях HEPES/цитратного буфера. Другие осмолиты, такие как сахароза или миоинозит, не обеспечивали защиту анакинра, что демонстрируется большим увеличением мутности при хранении.

Пример 6

Исследование переносимости

Замороженные маточные композиции анакинра (в цитратном буфере с NaCI и ЭДТА) оттаивали, аликвотировали и разводили маточными композициями HEPES/NaCI/ЭДТА/PS80 и разными осмолитами. Концентрации осмолитов варьировали для получения изотоничности (280-320 мОсмоль/кг) в конечных композициях, за исключением гипотоничной композиции «К», имеющей осмоляльность 200-250 мОсмоль/кг. Протестированные композиции изложены в Таблице 8.

Кроликов-альбиносов линии NZW (новозеландский белый) любого пола делили на группы по три (3). Каждую группу тестировали с использованием одного препарата (проанализированный препарат, Таблица 8). Тестирование проводили закапыванием 50 мкл соответствующего препарата в правый глаз. Закапывания проводили на протяжении пяти (5) суток по суточной схеме, как описано ниже. Все закапывания проводили на протяжении периода 8 часов на протяжении каждых суток.

1- ые сутки: пять (5) 50 мкл закапываний в правые глаза в пределах 20 мин

2- ые сутки: 50 мкл закапывания дважды в сутки в правый глаз

3- тьи сутки: 50 мкл закапывания четыре раза в сутки в правые глаза

4- ые сутки: 50 мкл закапывания шесть раз в сутки в правые глаза

5- ые сутки: 50 мкл закапывания восемь раз в сутки в правые глаза

Оценку исследования проводили посредством ежесуточных наблюдений глаз с использованием бальной системы Дрейза (Draize JH, Woodgard G and Calvery HO. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharmacol. Exp.Ther. 1944; 82: 377-390). Наблюдения проводили на обоих глазах.

1-ые сутки: бальная система Дрейза с офтальмоскопом: анализ до введения, сразу после первого введения, затем через 0,5 ч, 1 ч и 4 ч после последнего введения.

С 2-ых по 5-ые сутки: бальная система Дрейза с офтальмоскопом: дважды в сутки до первого и после последнего введения данных суток.

Результаты

Все композиции обычно хорошо переносились при закапывании в глаз, как обобщено в Таблице 9 ниже. Наблюдения красноты конъюнктивы делали в одном случае после исходного закапывания у одного животного на каждую композицию для композиций с пролином, гидроксипролином и маннитом. Эта краснота была кратковременной и не обнаруживалась на протяжении повторных закапываний. Одно из животных, которому закапывали с метионином (тестируемый препарат Е), демонстрировало признаки помутнения роговицы, что, вероятнее всего, представляет собой травму роговицы, которая не была связана с обработкой. Делается заключение о том, что все протестированные композиции могут вводиться в глаз без каких-либо тяжелых эффектов непереносимости. Кроме того, гипотоничная композиция «К», имеющая осмоляльность 200-250 мОсмоль/кг, не давала отклоняющихся от нормы наблюдений.

Пример 7

Стабильность анакинра при разных концентрациях HEPES с осмолитами или без них при 35°С Получение

Замороженный маточный раствор анакинра оттаивали, разводили до 50 мг/мл анакинра и диализировали всего около 18 часов (в течение ночи) при 2-8°С против раствора 10, 25 или 50 мМ HEPES, 38,2 мМ NaCI при рН 6,5. Полученные в результате растворы аликвотировали и разводили разными растворами HEPES/NaCI/осмолитов с получением конечных композиций, как описано в Таблице 10 ниже. Концентрация осмолитов варьировала для получения изотоничных композиций (примерно 280 мОсмоль/кг). Данные растворы использовали для экспериментов в Примерах 7, 8 и 9 ниже.

Таблица 10: конечные композиции анакинра после разведения маточными растворами. Все композиции содержали 2,23 мг/мл NaCI и имели рН 6,5. Концентрации таурина и гидроксипролина варьировали для достижения изотоничных растворов, если иное не отмечено в Таблице. Образцы с 10 мМ цитратом также содержали 0,5 мМ ЭДТА.

Растворы с 2, 15 и 25 мг/мл анакинра в буфере HEPES трех разных концентраций и, возможно, с одним из двух осмолитов готовили, как описано в Таблице 10 выше. Также готовили контрольные образцы при таких же концентрациях анакинра, но приготовленные в цитратном буфере. Полученные растворы хранили в стеклянных пробирках при 35°С и анализировали с регулярными интервалами в течение 8 недель посредством измерения содержания мономера анакинра. Аналитические результаты раскрываются в Таблице 11, и для концентрации белка 25 мг/мл - на ФИГ. 1.

Таблица 11: содержание мономера в %, определенное посредством ГФ-ВЭЖХ, как описано выше, в композициях с 2, 15 и 25 мг/мл анакинра в 10 мМ цитратном буфере или буфере HEPES разных концентраций. Цитратный буфер также содержал 2,24 мг/мл NaCI и 0,19 мг/мл ЭДТА (0,5 мМ). Образцы с HEPES возможно готовили с одним из двух разных осмолитов. Концентрации осмолитов являются такими, как изложено в Таблице 10 выше.

Заключения

Аналитические результаты в Таблице 11 и на ФИГ. 1 показывают то, что уменьшение содержания мономера было наибольшим для образца с цитратным буфером. Образцы с буфером HEPES демонстрируют сравнительно меньшее уменьшение содержания мономера. Варьирование концентрации HEPES в интервале от 10 до 50 мМ не влияло на стабильность анакинра.

Пример 8

Стабильность анакинра при разных концентрациях в HEPES с осмолитами при 35°С

Получение

Растворы с 2, 15 и 25 мг/мл анакинра в буфере HEPES и осмолитах готовили, как описано в Примере 7 и Таблице 10 выше. Также готовили контрольные образцы с теми же самыми концентрациями анакинра, но приготовленные в цитратном буфере.

Приготовленные растворы хранили в стеклянных пробирках при 35°С и анализировали с регулярными интервалами на протяжении 8 недель. Аналитические результаты раскрываются в Таблице 12, а для концентрации белка 2, 15 и 25 мг/мл - на ФИГ. 2.

Таблица 12: содержание мономера анакинра в %, определенное ГФ-ВЭЖХ, как описано выше, в композициях анакинра в цитратном буфере или буфере HEPES. 10 мМ натрий-цитратный буфер содержал 2,24 мг/мл NaCI, 0,19 мг/мл ЭДТА (0,5 мМ). Буфер HEPES содержал компоненты, определенные ниже. Концентрации осмолитов являются такими, как изложено в Таблице 10 выше.

Заключения

Аналитические результаты в Таблице 12 и на ФИГ. 2 показывают то, что снижение содержание мономера было наибольшим для образца с цитратным буфером. Образцы с буфером HEPES демонстрируют сравнительно меньшее снижение содержания мономера, чем те образцы, которые содержали цитратный буфер. Два осмолита - таурин или гидроксипролин - демонстрировали аналогичные стабилизирующие эффекты.

Пример 9

Стабильность анакинра в композициях HEPES с осмолитами или без них при 35°С

Растворы с 15 мг/мл анакинра в буфере HEPES и осмолитах готовили, как описано в Примере 7 и Таблице 10 выше. Также готовили контрольные образцы с такими же концентрациями анакинра, но приготовленные в цитратном буфере.

Полученные растворы, содержащие 15 мг/мл анакинра, приготовленные в 10 мМ HEPES с осмолитами или без них, или в 10 мМ цитратном буфере без осмолитов, хранили в стеклянных пробирках при 35°С и анализировали с регулярными интервалами на протяжении 8 недель хранения. Аналитические результаты раскрываются в Таблице 13 и на ФИГ. 3.

Таблица 13: содержание мономеров в %, определенное ГФ-ВЭЖХ, как описано выше, в композициях 15 мг/мл анакинра в 10 мМ цитратном буфере или буфере HEPES. Цитратный буфер также содержал 2,24 мг/мл NaCI и 0,19 мг/мл ЭДТА (0,5 мМ). Образцы HEPES готовили с осмолитами или без них. Концентрации осмолитов являются такими, как изложено в Таблице 10 выше.

Заключения

Аналитические результаты в Таблице 13 и на ФИГ. 3 показывают то, что снижение содержания мономера было наибольшим для эксперимента 103, содержащего цитрат, но без HEPES или осмолитов. Другие эксперименты показали снижение в порядке 117, 118 больше 104, 107. Для экспериментов без осмолитов буфер HEPES генерирует меньшее снижение мономера анакинра, чем цитратный буфер. Во всех экспериментах, в которых влючаются HEPES и один или два осмолита, снижение содержания мономера меньше, чем для экспериментов с HEPES без какого-либо осмолита.