ПОЛУЧЕНИЕ ОМЕГА 3 ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНЫХ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ИЗ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ СИНТАЗ PUFA ТРАУСТОХИДРИДОВ

ЗАЯВЛЕНИЕ О ПРИОРИТЕТЕ

По настоящей патентной заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке Соединенных Штатов серийный номер 61/909,289, поданной 26 ноября 2013 года, озаглавленной «PRODUCTION OF OMEGA 3 LONG CHAIN POLYUNSATURATED FATTY ACIDS IN OILSEED CROPS BY A THRAUSTOCHYTRID PUFA SYNTHASE».

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным организмам-хозяевам (например, растениям), генетически модифицированным системой синтаз полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) и одним или более акцессорным белком, который позволяет получить и/или улучшает получение PUFA в организме-хозяине. Также настоящее изобретение относится к способам получения и применению таких организмов (например, для получения PUFA) наряду с продуктами, полученными при использовании таких организмов (например, масло и семена).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ

Полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) используют для нутритивных, фармацевтических и промышленных применений, наряду с другими целями. Однако обеспечение в настоящее время PUFA из натуральных источников (например, рыбий жир и масло водорослей) и путем химического синтеза недостаточно или экономически невыгодно для коммерческих потребностей в долгосрочной перспективе.

Растительные масла, полученные из растений (например, семян масличных культур), относительно недорогие, не имеют проблем, связанных с загрязнениями, ассоциируемых с рыбьим жиром, и они считаются экологичными. Однако PUFA, присутствующие в коммерчески культивируемых растениях и растительных маслах, как правило, не содержат PUFA высокой степени насыщенности или с более длинной цепью и, как правило, содержат только жирные кислоты, такие как линолевая кислота (восемнадцать атомов углерода с 2 двойными связями в дельта 9 и 12 позициях 18:2 дельта 9,12) и линоленовая кислота (18:3 дельта 9,12,15).

Описывается продуцирование PUFA с более высокой ненасыщенностью или более длинной цепью в растениях при использовании модификации эндогенно продуцируемых растениями жирных кислот. Например, описаны генетически модифицированные растения с различными индивидуальными генами, кодирующими элонгазу и/или десатуразу жирной кислоты, что в результате приводит к генерированию в листьях или семенах значительных уровней PUFA с более длинной цепью или с большей ненасыщенностью, таких как докозагексаеновая кислота (DHA) и эйкозапентаеновая кислота (EPA), но также содержащих в смеси значительные уровни PUFA с более короткой цепью и меньшей ненасыщенностью. Qi et al. (2004) Nature Biotech. 22:739; PCT International Patent Publication No. WO 04/071467; Abbadi et al. (2004) Клетка растения 16:1; Napier and Sayanova (2005) Proc. Nutr. Soc. 64:387 93; Robert et al. (2005) Functional Plant Biol. 32:473 79; U.S. Patent Publication No. 2004/0172682; Petrie et al. (2012) PLOS One 7:e49165; and U.S. Provisional Application No. 61/345,537 (filed May 17, 2010).

ОПИСАНИЕ

Приведенные в описании настоящей патентной заявки способы и композиции могут быть использованы для получения LC PUFA в трансгенных организмах-хозяевах (например, клетках растений, частях растений и растениях), наряду с некоторыми количествами не свойственных растениям липидов, например, триглицериды (TAG) и фосфолипиды (PL), которыми богаты такие PUFA, и получить их с более длинной основной цепью и с более высокой степенью ненасыщенности по сравнению с доступными ранее. Также в описании настоящей патентной заявки приведены системы для продуцирования PUFA в растении-хозяине за счет обеспечения организма-хозяина, который представляет генетически модифицированный функциональной системой синтаз PUFA.

Некоторые приведенные в описании настоящей патентной заявки варианты воплощения настоящего изобретения включают генетически модифицированные клетки растений (например, клетки канолы, сои, и/или арабидопсиса), которые содержат полинуклеотид(ы), кодирующие по меньшей мере один полипептид синтазы (PFA1, PFA2, и PFA3) полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) из водоросли траустохидрид Schizochytrium (типичным примером которых является Schizochytrium sp., депонированный под ATCC Accession No. PTA 9695) и фосфопантетеинил трансфераза (HetI) из цианобактерий рода Nostoc, продукты экспрессии которых восстанавливают функциональную систему синтаз PUFA. Например, растительная клетка может содержать полинуклеотид(ы), кодирующий PFA1, PFA2, и PFA3 Schizochytrium; и HetI Nostoc. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения растительная клетка также содержит по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий изозим 2 ацил-CoA-синтетазу (SzACS2). В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотид(ы), кодирующий по меньшей мере один ДНК-предпочитающий акцессорный белок, также экспрессируется в растительной клетке-хозяине для промотирования введения LC PUFA в семена масличных культур (например, ACS, DGAT, LPAT, LPCAT, и PDAT).

Приведенные в описании настоящей патентной заявки варианты воплощения настоящего изобретения включают генетически модифицированное растение (например, капусту декоративную, сою культурную, арабидопсис и масличные культуры), содержащее такие клетки растений наряду с потомками, семенами, тканями или их частями. В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированная клетка растения представляет клетку масличной культуры; например и без ограничений, сафлора, подсолнечника и пальмы). Генетически модифицированная клетка масличной культуры экспрессирует функциональную систему синтаз PUFA, что позволяет генерировать характерный жирнокислотный профиль, например, включая растительные масла, содержащие DHA.

Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения обеспечивают полинуклеотид(ы), кодирующий компоненты функциональной системы синтаз PUFA (например, PFA1, PFA2, PFA3 Schizochytrium и HetI Nostoc), и необязательно, по меньшей мере один акцессорный белок (например, SzACS2). В некоторых примерах эти полинуклеотиды содержатся в одном рекомбининтном векторе экспрессии. В других примерах полинуклеотиды содержатся в различных рекомбининтных векторах экспрессии.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотид(ы), кодирующий компоненты функциональной системы синтаз PUFA, и необязательно, по меньшей мере один акцессорный белок, функционально связаны со специфическим промотором семян. Например, полинуклеотид(ы) может быть функционально связан в конкретных примерах с промотором, выбранным из группы, состоящей из PvDlec2; PvPhas; LfKCS3; FAE1; BoACP; BnaNapinC; SSPRO2745.1; и SSPRO2743.1, элементы промотора приведены в качестве примеров в описании настоящей патентной заявки. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотид(ы) функционально связан с конститутивным промотором (например, промоторы убихитина и CsVMV) или специфическим промотором листа. В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения могут быть использованы дополнительные промоторы для проведения экспрессии функциональной системы синтаз PUFA на различных стадиях роста и/или на более поздних стадиях развития семян, например, для обеспечения повышенного накопления LC PUFA.

В других вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотид(ы), кодирующий компоненты функциональных синтаз PUFA, кодирует полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO:1; полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO:4; и/или полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:14, где полинуклеотид(ы) также содержит ген HetI (например, полинуклеотид, кодирующий полипептид с по меньшей мере 80% идентичностью продукту, кодируемому SEQ ID NO:10). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотид(ы) также содержит ген SzACS2 (например, полинуклеотид, кодирующий полипептид с по меньшей мере 80% идентичностью продукту, кодируемому SEQ ID NO:11).

В конкретных примерах полинуклеотид(ы), кодирующий компоненты функциональных синтаз PUFA, содержит полинуклеотид, который по меньшей мере на 70% идентичен SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3; полинуклеотид, который по меньшей мере на 70% идентичен SEQ ID NO:5 и/или SEQ ID NO:6; полинуклеотид, который по меньшей мере на 70% идентичен SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и/или SEQ ID NO:13; и/или полинуклеотид, который кодирует полипептид с по меньшей мере 80% идентичностью SEQ ID NO:10. В конкретных примерах полинуклеотид(ы) также содержит полинуклеотид, который кодирует полипептид с по меньшей мере 80% идентичностью SEQ ID NO:11.

В конкретных примерах полинуклеотид(ы), кодирующий компоненты функциональных синтаз PUFA, гибридизуется в жестких условиях (например, в очень жестких условиях) с SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5 и/или SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:10; и/или SEQ ID NO:11, В конкретных примерах полинуклеотид(ы) гибридизуется в жестких условиях с каждой из/со всеми из SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:10; и SEQ ID NO:11.

Также в описании настоящей патентной заявки приведен способ получения трансгенного растения, где способ включает введение полинуклеотида(ов), кодирующего компоненты функциональных синтаз PUFA, в клетку растения; и регенирование растения из клетки растения. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотид(ы) трансформируетмклетку культивируемого растения одним вектором. В других вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотид(ы) трансформирует клетку культивируемого растения множеством векторов для получения растения, содержащего гены-конституенты в различных событиях. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотид(ы) вводят в клетку культивируемого растения интрогрессией через традиционную селекцию. Функциональная система синтаз PUFA в конкретных примерах воссоздается скрещиванием для оптимизации профиля PUFA растений потомков (например, селекцией для растений, продуцирующих DHA (C22:6, n 3) и/или EPA (C20:5, n 3)).

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, семена или его часть, или не свойственное масло (например, масляное сырье из семян), полученное из генетически модифицированного растения, потомка, семян, клетки, тканей или его части, содержит определяемые количества DHA, DPA(n 6) (C22:5, n 6) и/или EPA. В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, семена или его части, или масло из него имеет жирнокислотный профиль с содержанием от 0,01% до 15% DHA по массе (например, от 0,05% до 10% DHA; или от 0,05% до 5% DHA по массе). В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, семена или его части, или масло из него имеет жирнокислотный профиль с содержанием от 0,01% до 10% EPA по массе (например, от 0,05% до 5% EPA; или от 0,05% до 1% EPA по массе). В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, семена или его части, или масло из него имеет жирнокислотный профиль с содержанием от 0,01% до 10% DPA(n 6) по массе (например, от 0,01% до 5% DPA(n 6); или от 0,01% до 1% DPA(n 6) по массе). В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, семена или его части, или масло из него имеет жирнокислотный профиль с соотношением EPA:DHA от 10:1 до 1:30 (например, от около 2:1 до около 1:10, от около 1:1 до около 1:12, от около 2:1 до около 1:11, от около 1:1,5 до около 1:5, от около 6:1 до около 1:6,5, и около 1:1,25) по массе общих жирных кислот. В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, семена или его части, или масло из него имеет жирнокислотный профиль с соотношением DPA(n 6):DHA от 1:1 до 1:10 (например, от 1:2 до 1:5, от около 1:3 до около 1:5, от около 1:3 до около 1:6, и около 1:5) по массе общих жирных кислот. В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, семена или его части, или масло из него имеет жирнокислотный профиль с содержанием от 70% до 99% триглицеридов по массе масла.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения определяемые количества DHA, DPA(n 6) и/или EPA также обнаруживаются в продуктах, полученных из этих растений (например, масляном продукте, специальных масляных продуктах, зерне и крупке), полученных из генетически модифицированного растения. Растительные масла, содержащие LC PUFA, полученные из генетически модифицированных растений, приведенных в описании настоящей патентной заявки, могут быть использованы в качестве дешевых источников DHA/EPA пищевых ингредиентов для улучшения питания человека. Масла и маслосемена, полученные из генетически модифицированных растений, приведенных в описании настоящей патентной заявки, могут быть использованы в качестве дешевых высококачественных источников ω3 LC PUFA для кормовых продуктов для животных и водных организмов, или в качестве сырья для переэтерификации для получения структурированных липидов, обогащенных ω3 LC PUFA для фармацевтического и нутрицевтического применения.

Также в описании настоящей патентной заявки приведены способы получения масла, содержащего по меньшей мере одну LC PUFA, где способ включает выращивание генетически модифицированного растения (например, масличной культуры), потомка, клетки, ткани или его часть, и/или извлечение масла (например, масла из семян) из генетически модифицированного растения, приведенного в описании настоящей патентной заявки.

Также в описании настоящей патентной заявки приведены способы получения пищевой добавки или лекарственного средства, содержащего по меньшей мере одну LC PUFA для индивидуума, где способ включает обеспечение индивидуума генетически модифицированным растением, потомком, клеткой, тканями или его частью, приведенным в описании настоящей патентной заявки, маслом, приведенным в описании настоящей патентной заявки, семенами, приведенными в описании настоящей патентной заявки, пищевым продуктом, приведенным в описании настоящей патентной заявки, функциональным пищевым продуктом, приведенный в описании настоящей патентной заявки, или фармацевтическим продуктом, приведенным в описании настоящей патентной заявки. Содержащаяся в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения LC PUFA представляет DHA, DPA(n 6) и/или EPA.

Приведенные выше и другие признаки будут более понятны из приведенного ниже подробного описания нескольких вариантов воплощения настоящего изобретения, которые сделаны со ссылкой на приложенные Фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 - краткое изложение приведенных в качестве примера конструктов синтаз PUFA, используемых в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения. Направление транскрипции показано выше каждой PTU в рамке, кодирующая последовательность указана перед каждой PTU и указаны используемые комбинации промотор/терминатор.

Фигура 1a - конструкты синтаз PUFA, расположенные в «Ориентация 1».

ФИГУРА 1b - конструкты, расположенные в «Ориентация 2».

ФИГУРА 1c - конструкты, расположенные в «Ориентация 3».

ФИГУРА 2 -график ВЭЖХ с радиометрическим детектированием 14^C, меченных стандартов EPA, DHA и DPA. Время удерживания для EPA и DHA отмечено, как ~5,3 и ~6,1 минут, соответственно.

Фигура 3 - краткое изложение содержания LC PUFA в событиях в T2 семенах арабидопсиса, трансформированных синтазами PUFA и трансгенами HetI. Каждый вертикальный столбик представляет содержание LC PUFA в одном событии арабидопсиса; черный=DHA, темно-серый=EPA, светло-серый=DPA (n 6).

Фигура 4 - графическое представление содержания LC PUFA в T3 семенах потомков трангенетически селекционированных линий арабидопсиса, продуцирующих DHA. Каждый кружок представляет T3 семя из одного гомозиготного T2 растения. Серый столбик представляет среднее содержание LC PUFA для каждой линии T3 семян.

Фигура 5 графическое представление содержания LC PUFA в индивидуальных T2 семенах из четырех гомозиготных и пяти гемизиготных T1 растений канолы. Для каждой линии анализировали 48 семян. «PUFA» представляют общее DHA+EPA+DPA (n=6). Ось ординат соответствует содержанию LC PUFA как % всех FAME.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот, приведенные в прилагаемом списке последовательностей, указаны при использовании стандартных буквенных аббревиатур для нуклеотидных оснований, как определено в 37 C.F.R. 1,822. Показана только одна нить каждой последовательности нуклеиновой кислоты, а комплементарная нить подразумевается включенной через ссылку на приведенную нить. В приложенном списке последовательностей:

SEQ ID NO: 1 - аминокислотная последовательность приведенного в качестве примера белка PFA1:

MDTRIAIVGMSAILPSGENVRESWEAIRDGLDCLSDLPADRVDVTAYYNPEKTTKDKIYCKRGGFIPEYDFDAREFGLNMFQMEDSDANQTISLLKVKEALTDANIPAFSSGKKNIGCVLGIGGGQKASHEFYSRLNYVVVDKVLRKMGLPEEDVAAAVDKYKASFPEWRLDSFPGFLGNVTAGRCCNTFNMEGMNCVVDAACASSLIAVKVAIEELLYGDCDAMIAGATCTDNSIGMYMAFSKTPVFSTDPSVKAYDAATKGMLIGEGSAMLVLKRYADAVRDGDTVHAVIKGCASSSDGKAAGIYTPTISGQEEALRRAYARANVDPATVTLVEGHGTGTPVGDKIELTALSNLFSKAFSANGGGAEEAEQVAVGSIKSQIGHLKAVAGLAGLVKVVLALKHKTLPQTINVDKPPSLVDGTPIQQSPLYVNTMNRPWFTPVGVPRRAGVSSFGFGGANYHAVLEEFEPEHESAYRYNNLPQVALLHAGDVATLAATVRAKLALATAEQEEARVVKNADYIAYHRFLDECKLRGAVPQAHARVGLLVRDLSSLIAVLEAAAAKLAGEESATEWTVSVATGEAAFRVRGVATEANVAALFSGQGAQYTHMFSDVAMNWPPFRESVAAMDRAQRERFGRPAKRVSSVLYPRKPYGDEPRQDHKEISQTRYSQPATLACSVGAFDIFKAAARAPSFAAGHSLGEFAALYAAGSLDRDAVFDLVCARAKAMSDFTAQASSSGGAMAAVIGAKADQLSLGGAPDVWLANSNSPSQTVITGTAEAVAAASDKLRCSGNFRVVPLACEAAFHSPHMRGAEQTFASALAQAPVSAPAAARFYSNVTGGAAVTSPADVKTNLGKHMTSPVQFVQQVRAMHAAGARVFVEFGPKQVLSRLVKETLGEAGDVVTVAVNPDSAKDSDTQLRQAALTLAVAGVPLKDFDRWQLPDATRLEPVKKKKTTLRLSAATYVSAKTLRQREAVLNDGYTVSGATAVVKEVDTANEERLVRQAQDLQRQLAEASTAAQAAQSKVAELERTIQDLERKVQQQQQEKGENSDSNAAAEVLRRHKELLQRMLQDCDEQAVPVATVVPTPTSSPTPTSSPVSGNSKSTRGSADLQALLAKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASGGSAPAVPSAPAASAAPTPAASTAPSADLQALLSKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASAGSAPAPAVPSAPAASAAPTPAASTAPSADLQALLSKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASGGSAPAPAVPSAPAASAAPTPAAATAPSADLQALLAKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASAGSAPAPAVPSAPAASAAPTPAASTAPSADLQALLSKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASGGSAPAAAVPSAPAASAAPTPATAPSADLQALLSKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASGGSAPAAPSAPALLPTLFGSECEDLSLTFPVITTLPLPAELVLAEGGARPVVVVDDGSALTSSLVSSLGDRAVLLQVQSSSACSPRSTTHKLVTVADRSEAALQAALTSVEAQFGKVGGFVFQFGDDDVQAQLGWALLAAKHLKTSLSEQIEGGRTFFVAVARLDGQLGLSGKSTTATVDLSRAQQGSVFGLCKTLDLEWPAVFCRGIDLAADLDAAQAARCLLGELSDPDVAVRESGYSASGQRCTTTTKSLTTGKPHQPISSSDLFLVSGGARGITPLCVRELAQRVGGGTYVLIGRSELPTTEPAWAVGVESGKPLEKAALAFLKAEFAAGRGAKPTPMLHKKLVGAVVGAREVRASLAEITAQGATAVYESCDVSSAAKVREMVERVQQQGGRRVSGVFHASGVLRDKLVENKSLADFSAVYDTKVGGLINLLACVDLAQLRHLVLFSSLAGFHGNVGQSDYAMANEALNKLAAHLSAVHPQLCARSICFGPWDGGMVTPALKANFIRMGIQIIPRQGGAQTVANMLVSSSPGQLLVGNWGVPPVVPSATEHTVLQTLRQSDNPFLDSHVIQGRRVLPMTLAVGYMAHQAQSIYAGHQLWAVEDAQLFKGIAIDNGADVPVRVELSRRKEEQEDAGKVKVKVQVLLKSQVNGKSVPAYKATVVLSPAPRPSVITRDFDLTPDPACTEHDLYDGKTLFHGKAFQGIEQVLSATPKQLTAKCRNLPLTPEQRGQFVVNLSQQDPFQADIAFQAMLVWARMLRQSAALPNNCERFDFYKPMAPGATYYTSVKLASASPLV

DSVCKCTVAMHDEQGEVYFSARASVVLNKTLTY

SEQ ID NO: 2 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера гена PFA1, указанного в описании настоящей патентной заявки как PFA1 v1, выделенного из траустохидрида Schizochytrium sp. (как представлено под ATCC Accession No. PTA 9695):

ATGGATACTCGCATCGCGATCGTGGGGATGTCGGCGATCCTGCCGAGCGGGGAGAACGTGCGCGAGAGCTGGGAGGCGATCCGCGATGGGCTGGATTGCCTGAGCGATCTGCCGGCGGACCGCGTGGACGTGACGGCCTACTACAACCCGGAGAAGACGACCAAGGACAAGATCTACTGCAAGCGCGGCGGGTTCATCCCGGAGTACGACTTCGACGCGCGTGAGTTCGGGCTCAACATGTTCCAGATGGAGGACTCGGACGCCAACCAGACGATCTCGCTGCTCAAGGTGAAGGAGGCGCTGACGGACGCCAACATCCCGGCGTTCTCGAGCGGTAAGAAGAACATCGGCTGCGTGCTGGGCATCGGCGGCGGCCAGAAGGCGAGCCACGAGTTCTACTCGCGGCTCAACTACGTGGTCGTGGACAAGGTGCTGCGCAAGATGGGCCTGCCGGAGGAAGACGTGGCGGCGGCGGTGGACAAGTACAAGGCGAGTTTCCCCGAGTGGCGCCTCGACTCTTTCCCCGGGTTCCTGGGCAACGTCACGGCGGGGCGCTGCTGCAATACCTTCAACATGGAGGGCATGAACTGCGTCGTGGACGCGGCCTGCGCGTCGTCGCTGATCGCGGTCAAAGTGGCGATCGAGGAGCTGCTCTACGGCGACTGCGATGCGATGATCGCGGGTGCCACCTGCACGGACAACTCGATCGGGATGTACATGGCCTTCTCCAAGACGCCCGTGTTTTCCACGGACCCGAGCGTCAAGGCGTACGACGCCGCCACCAAAGGCATGCTCATCGGCGAGGGCTCGGCGATGCTCGTGCTGAAGCGCTACGCGGACGCCGTGCGCGACGGCGACACCGTGCACGCCGTCATCAAGGGGTGCGCGTCCTCGAGCGACGGCAAGGCGGCGGGCATCTACACGCCGACAATCTCGGGCCAGGAGGAGGCCCTGCGCCGCGCCTACGCCCGCGCCAATGTCGACCCGGCCACTGTGACGCTGGTGGAGGGCCACGGCACGGGTACGCCGGTGGGCGACAAGATCGAGCTGACGGCGCTGAGCAACCTCTTCTCCAAGGCGTTTTCTGCCAACGGTGGCGGCGCGGAGGAAGCAGAGCAGGTGGCGGTGGGCAGCATCAAGTCGCAGATCGGGCACCTCAAGGCGGTGGCCGGGCTGGCCGGGCTGGTCAAGGTGGTGCTGGCGCTCAAGCACAAGACGCTGCCGCAGACGATCAACGTCGACAAGCCGCCGTCGCTGGTGGACGGGACCCCGATCCAGCAGTCGCCGCTGTACGTCAACACGATGAACCGCCCCTGGTTCACGCCCGTAGGGGTGCCGCGCCGCGCCGGCGTGTCGTCGTTTGGGTTTGGCGGTGCCAACTACCACGCCGTGCTGGAGGAGTTTGAGCCCGAGCACGAGAGCGCGTACCGGTACAACAACCTGCCGCAGGTGGCGCTGCTGCACGCGGGGGACGTCGCGACCTTGGCGGCGACGGTTCGCGCCAAGCTGGCGCTGGCCACCGCCGAGCAGGAAGAGGCGCGTGTGGTGAAGAACGCGGACTACATCGCGTACCACCGGTTCCTGGACGAGTGCAAGTTGCGCGGCGCTGTGCCGCAGGCGCACGCGCGGGTGGGACTGCTCGTACGGGACCTGAGCTCGCTCATCGCCGTGCTCGAGGCCGCTGCCGCCAAGCTCGCGGGCGAAGAGAGCGCGACGGAGTGGACGGTCAGCGTTGCTACGGGCGAGGCGGCCTTCCGCGTGCGCGGTGTGGCTACGGAGGCCAACGTGGCGGCGCTGTTCTCGGGCCAGGGCGCGCAGTACACGCACATGTTCAGCGACGTGGCGATGAACTGGCCCCCGTTCCGCGAGAGCGTCGCCGCCATGGACCGCGCCCAGCGCGAGCGCTTCGGGCGGCCTGCCAAGCGCGTGAGCAGCGTGCTGTACCCGCGCAAGCCGTACGGCGACGAACCGCGGCAGGACCACAAGGAGATCTCGCAAACGCGCTACTCGCAGCCCGCAACGCTCGCGTGCTCGGTCGGCGCCTTTGACATCTTCAAAGCGGCGGGACTGGCGCCGAGCTTTGCGGCGGGCCACTCGCTGGGCGAGTTTGCGGCGCTCTACGCGGCCGGGTCGCTCGATCGCGACGCCGTCTTCGACCTGGTCTGCGCGCGCGCCAAGGCCATGAGCGACTTCACGGCCCAGGCCAGCAGCAGCGGTGGCGCCATGGCGGCCGTGATTGGCGCCAAGGCGGACCAGCTCTCGCTGGGTGGCGCGCCCGACGTGTGGCTCGCCAACAGCAACTCGCCCTCGCAGACCGTGATCACGGGAACCGCCGAAGCAGTGGCTGCGGCCTCTGACAAGTTGCGCTGCAGCGGCAACTTCCGCGTCGTGCCTCTGGCCTGCGAGGCGGCCTTCCACTCGCCGCACATGCGCGGCGCGGAGCAGACGTTTGCGTCGGCGCTCGCGCAGGCGCCCGTGTCGGCACCGGCGGCTGCTCGGTTCTACTCTAACGTGACGGGGGGCGCCGCGGTAACCTCGCCCGCGGACGTCAAAACGAACCTGGGCAAGCACATGACGAGCCCTGTGCAGTTCGTGCAGCAGGTGCGAGCCATGCACGCGGCGGGCGCGCGTGTGTTTGTGGAGTTTGGGCCCAAGCAGGTCCTGTCGCGCCTCGTCAAGGAGACCCTTGGCGAGGCCGGCGACGTGGTCACGGTCGCCGTCAACCCAGACTCGGCCAAGGACAGCGACACGCAGCTGCGCCAGGCGGCGCTCACGTTGGCGGTCGCCGGCGTGCCGCTCAAGGACTTTGACCGCTGGCAGCTGCCGGATGCCACGCGCCTCGAGCCTGTCAAGAAGAAGAAGACCACGTTGCGGCTCTCGGCAGCCACCTACGTCTCCGCCAAGACGTTGCGCCAGCGCGAGGCCGTGCTCAACGACGGCTACACTGTCAGTGGTGCCACGGCGGTAGTCAAGGAAGTGGACACGGCCAACGAGGAGCGTCTCGTCCGCCAAGCCCAGGATCTCCAGCGCCAGCTCGCGGAGGCCTCGACGGCAGCCCAGGCGGCGCAGTCCAAGGTCGCGGAGCTCGAGCGCACGATCCAGGACTTGGAGCGCAAGGTGCAGCAGCAGCAGCAAGAGAAGGGTGAGAACTCAGACAGCAACGCTGCCGCCGAAGTGCTGCGGCGCCACAAGGAGCTGCTCCAGCGCATGCTGCAGGACTGTGACGAGCAGGCAGTGCCCGTAGCCACGGTGGTTCCGACACCTACGTCCTCCCCGACGCCTACATCCTCACCCGTATCCGGCAACAGCAAGAGCACTCGTGGCAGTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGGCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCTGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTTGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTTTCCGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTGGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGACGCCATGAAGGCGGAGATCGTGGCTGCCTCTGGTGGTAGTGCTCCTGCGGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCCGCTGCTTCGACTGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGTCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTCTCGGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTGGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCGGAAATCGTGGCTGCCTCTGCTGGTAGTGCTCCTGCTCCTGCTGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCCGCTGCTTCGACTGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGTCCAAGGCGGAGACGGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTCTCGGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTGGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCGGAAATCGTGGCTGCCTCTGGTGGTAGTGCTCCTGCTCCTGCGGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCCGCGGCTGCGACAGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGGCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTTTCCGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTAGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCGGAGATCGTGGCTGCCTCTGCTGGTAGTGCTCCTGCTCCTGCTGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCCGCTGCTTCGACTGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGTCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTCTCGGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTGGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCGGAAATCGTGGCTGCCTCTGGTGGTAGTGCTCCTGCTGCTGCTGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCTGCGACTGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGTCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTTTCCGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTAGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAAGTGGTGGACGCCATGAAGGCGGAGATCGTGGCTGCCTCTGGTGGTAGTGCTCCTGCTGCTCCTTCGGCGCCCGCGCTTCTTCCAACGCTGTTTGGTTCCGAGTGCGAGGACCTGTCTCTGACCTTTCCCGTGATAACGACCCTGCCGCTTCCTGCAGAGCTTGTGCTGGCCGAGGGCGGCGCTCGCCCTGTAGTCGTGGTGGATGATGGATCTGCACTCACCTCGTCGCTGGTGTCCTCGCTCGGCGATCGTGCGGTGCTGCTGCAGGTGCAGTCTTCCTCTGCCTGCTCGCCGCGCTCGACCACGCACAAGTTGGTGACCGTAGCAGACCGCTCTGAAGCGGCGCTACAGGCGGCGCTCACGTCCGTCGAGGCGCAGTTCGGCAAGGTGGGTGGCTTTGTGTTCCAGTTCGGCGACGACGACGTGCAAGCGCAGCTCGGCTGGGCGCTGCTCGCGGCCAAGCACCTCAAAACTTCGCTGTCAGAACAGATCGAGGGCGGTCGCACCTTTTTCGTGGCCGTCGCGCGGCTCGACGGCCAGCTGGGGCTCTCCGGCAAGTCGACGACCGCTACCGTTGATCTCTCCCGCGCGCAGCAGGGCAGCGTGTTCGGCCTGTGCAAGACACTCGACCTGGAGTGGCCCGCTGTCTTCTGCCGCGGAATCGACCTGGCCGCCGACCTCGACGCCGCACAGGCCGCGCGGTGCCTGCTGGGCGAGCTGTCAGACCCCGACGTGGCCGTGCGCGAGTCTGGTTACTCCGCCTCGGGCCAGCGCTGCACGACAACTACGAAGTCGCTGACTACGGGCAAGCCGCACCAGCCGATCTCCTCGTCGGACCTCTTTCTGGTGTCGGGCGGCGCGCGCGGCATCACCCCGCTGTGCGTGCGCGAGCTGGCGCAGCGCGTGGGCGGCGGCACGTACGTGCTCATCGGCCGCTCGGAGCTGCCCACGACGGAGCCTGCCTGGGCGGTCGGCGTGGAGTCTGGCAAGCCGCTGGAGAAGGCCGCGCTGGCGTTCCTGAAGGCGGAGTTTGCAGCGGGCCGCGGGGCCAAGCCGACGCCGATGCTGCACAAGAAGCTCGTGGGCGCCGTGGTCGGAGCGCGCGAGGTGCGAGCCTCGCTCGCCGAGATCACTGCACAGGGCGCCACGGCTGTGTACGAGTCGTGCGACGTGAGCTCTGCCGCCAAGGTGCGTGAGATGGTAGAGCGCGTGCAGCAGCAGGGCGGGCGGCGCGTGTCGGGCGTGTTCCACGCGTCGGGCGTGCTGCGCGACAAGCTCGTGGAGAACAAGTCGCTGGCGGACTTCAGCGCCGTGTACGACACCAAGGTGGGCGGCCTCATCAACCTGCTGGCCTGCGTGGACCTGGCGCAGCTGCGTCACCTCGTGCTCTTCAGCTCGCTCGCGGGCTTCCACGGCAACGTCGGGCAGTCGGACTACGCAATGGCCAACGAGGCGCTCAACAAGCTGGCGGCGCACCTGTCGGCGGTGCACCCGCAGCTGTGCGCGCGCTCGATCTGCTTCGGACCGTGGGACGGCGGCATGGTGACCCCCGCGCTCAAGGCCAACTTCATCCGCATGGGCATCCAGATCATCCCGCGCCAAGGCGGCGCGCAGACCGTCGCCAACATGCTCGTCAGTAGCTCCCCCGGTCAGCTGCTCGTGGGCAACTGGGGCGTGCCACCCGTCGTGCCGAGTGCCACCGAGCACACCGTGCTGCAGACGCTCCGCCAGAGCGACAACCCCTTCCTCGACTCGCACGTGATCCAGGGCCGCCGCGTGCTGCCCATGACCCTGGCCGTGGGCTACATGGCGCACCAGGCGCAGAGCATCTACGCGGGCCACCAGCTGTGGGCCGTCGAGGACGCCCAGCTCTTCAAGGGCATCGCCATCGACAATGGCGCCGACGTGCCCGTGCGCGTGGAGCTGTCGCGCCGCAAGGAGGAGCAGGAGGACGCCGGCAAGGTCAAGGTCAAGGTGCAGGTGCTGCTCAAATCGCAGGTCAACGGCAAGTCGGTGCCCGCGTACAAGGCGACCGTCGTGCTGTCCCCTGCGCCGCGCCCCAGCGTCATCACGCGTGACTTCGACCTCACCCCGGACCCGGCCTGCACGGAGCACGACCTCTACGACGGCAAGACGCTCTTCCACGGCAAGGCCTTCCAGGGCATCGAGCAGGTGCTCTCGGCGACGCCCAAGCAGCTCACCGCCAAGTGCCGCAATTTGCCCCTCACGCCCGAGCAGCGCGGCCAGTTCGTCGTTAACCTCAGCCAGCAGGACCCGTTCCAGGCGGACATTGCGTTCCAGGCGATGCTCGTCTGGGCGCGCATGCTGCGCCAATCGGCGGCCCTGCCCAACAACTGCGAGCGCTTCGACTTTTACAAGCCGATGGCCCCGGGCGCCACCTACTACACGTCGGTCAAGCTGGCCTCGGCCTCACCCTTGGTGGACTCTGTGTGCAAGTGCACCGTGGCGATGCACGATGAGCAAGGTGAGGTGTACTTTTCTGCTCGT

GCCAGCGTCGTCCTCAACAAGACCCTCACGTACTAA

SEQ ID NO: 3 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера оптимизированного гена растения PFA1, указанного в описании настоящей патентной заявки, как PFA1 v2:

ATGGATACCAGAATTGCCATTGTGGGAATGAGTGCGATCCTTCCGAGTGGTGAGAATGTTAGAGAGAGCTGGGAGGCCATCAGAGATGGCTTGGATTGTCTGTCTGATCTGCCTGCGGATCGTGTGGATGTGACTGCCTATTACAATCCAGAGAAAACGACCAAGGACAAAATCTACTGCAAAAGAGGTGGGTTCATCCCTGAGTATGACTTTGATGCTCGTGAGTTTGGCCTCAACATGTTCCAGATGGAAGATTCTGATGCGAACCAGACCATCTCATTGCTCAAGGTGAAGGAAGCTCTCACCGATGCCAACATACCTGCTTTCTCAAGTGGCAAAAAGAACATTGGTTGTGTTCTTGGCATAGGTGGAGGTCAGAAGGCGTCACATGAGTTCTACTCCAGACTCAACTATGTTGTGGTTGACAAAGTGCTCAGAAAGATGGGTTTGCCAGAGGAAGATGTGGCAGCTGCGGTGGACAAGTACAAGGCGAGCTTCCCAGAGTGGAGGCTTGATTCTTTTCCTGGTTTCTTGGGCAATGTTACCGCTGGCAGATGTTGCAACACCTTCAACATGGAGGGCATGAACTGTGTCGTTGACGCTGCCTGTGCTTCAAGCCTGATTGCGGTCAAGGTGGCAATAGAAGAGCTTCTCTATGGTGACTGTGATGCCATGATTGCTGGTGCCACCTGCACAGACAATTCAATAGGGATGTACATGGCCTTCTCCAAGACGCCTGTTTTCTCTACGGACCCGAGTGTCAAAGCGTATGATGCTGCCACCAAAGGCATGTTGATTGGTGAAGGATCTGCGATGCTTGTTCTGAAGAGATATGCGGATGCTGTCAGAGATGGTGACACTGTTCATGCTGTCATCAAGGGCTGTGCTTCCTCAAGTGATGGAAAAGCAGCTGGAATCTACACACCGACAATCAGCGGACAAGAAGAGGCTCTCCGTAGAGCCTATGCACGTGCCAATGTGGACCCAGCCACTGTCACTCTTGTTGAAGGACATGGAACTGGCACTCCGGTTGGGGACAAGATTGAACTCACAGCTCTGAGCAATCTCTTCTCCAAAGCGTTTTCTGCGAATGGAGGTGGAGCTGAGGAAGCTGAGCAAGTTGCTGTTGGCAGCATCAAGAGCCAGATAGGGCACCTCAAAGCGGTTGCTGGATTGGCTGGATTGGTCAAAGTGGTCCTTGCTCTCAAGCACAAGACATTGCCTCAGACGATCAATGTGGACAAGCCACCTTCACTGGTGGATGGGACACCGATTCAACAGTCCCCTTTGTACGTCAACACCATGAACCGTCCCTGGTTCACTCCGGTTGGGGTTCCGAGGAGAGCTGGCGTTTCCTCATTTGGTTTTGGAGGTGCGAACTACCATGCTGTGCTTGAAGAGTTTGAACCTGAACATGAGAGTGCTTACCGTTACAACAATCTTCCCCAAGTTGCTCTCCTTCATGCTGGGGATGTTGCAACTCTTGCTGCCACAGTTAGGGCAAAACTGGCATTGGCCACTGCTGAGCAAGAAGAGGCTAGAGTTGTGAAGAACGCTGATTACATTGCATACCATAGGTTCCTTGATGAATGTAAGTTGAGAGGAGCTGTTCCCCAAGCCCACGCAAGGGTTGGACTTCTGGTGAGGGACCTGTCCTCTCTCATTGCGGTTTTGGAAGCAGCTGCAGCCAAACTTGCTGGAGAAGAGTCAGCAACGGAATGGACGGTCTCAGTTGCCACTGGTGAGGCTGCATTCAGAGTTAGGGGTGTTGCCACAGAGGCCAATGTTGCTGCACTTTTCTCTGGCCAAGGAGCGCAGTACACTCACATGTTCTCAGATGTTGCCATGAACTGGCCTCCGTTCAGAGAGAGTGTTGCTGCGATGGACAGAGCGCAGAGAGAACGTTTTGGGAGGCCAGCCAAAAGAGTCTCCAGTGTTCTCTATCCGAGAAAACCTTATGGAGATGAGCCAAGGCAAGATCACAAAGAGATTTCTCAGACGCGTTACTCTCAGCCAGCAACCCTCGCTTGCTCTGTCGGTGCCTTTGACATCTTCAAAGCAGCTGGATTGGCTCCTTCTTTTGCAGCTGGACATTCCCTGGGAGAGTTTGCAGCTCTCTATGCAGCTGGTTCATTGGATCGTGATGCTGTGTTTGACTTGGTTTGCGCTAGGGCAAAGGCCATGTCTGATTTCACTGCTCAAGCCAGCTCCAGTGGAGGTGCTATGGCAGCGGTCATAGGAGCCAAGGCTGATCAGCTCAGCCTTGGTGGAGCACCTGATGTTTGGCTGGCCAATAGCAACAGTCCATCACAGACGGTGATCACGGGAACTGCTGAAGCAGTGGCAGCTGCATCTGACAAACTTCGTTGTAGTGGAAACTTCAGAGTGGTTCCTCTTGCTTGTGAAGCTGCCTTCCATTCACCACACATGCGTGGAGCAGAGCAGACATTTGCGTCTGCGCTTGCTCAAGCTCCAGTGTCCGCACCTGCAGCTGCCAGATTCTACAGCAACGTCACTGGTGGAGCTGCAGTCACCTCTCCTGCTGATGTCAAAACGAACCTTGGGAAACACATGACTTCTCCTGTGCAGTTTGTGCAGCAAGTCCGTGCCATGCACGCAGCTGGAGCAAGGGTGTTTGTTGAGTTCGGTCCCAAGCAAGTCCTTTCTCGTTTGGTCAAAGAGACCCTTGGGGAAGCTGGAGACGTGGTCACGGTGGCTGTCAACCCAGACTCAGCCAAGGATTCAGACACCCAGCTGAGACAAGCAGCTCTCACCTTGGCTGTGGCTGGTGTTCCACTCAAAGACTTTGACAGATGGCAGCTTCCCGATGCCACTCGTCTTGAGCCTGTCAAGAAAAAGAAAACAACCTTGAGGTTGAGTGCTGCCACCTATGTCTCTGCCAAGACCTTGAGGCAGAGGGAGGCTGTGCTCAATGATGGTTACACTGTGAGTGGTGCCACAGCGGTTGTCAAAGAAGTGGACACTGCAAACGAAGAGAGACTTGTCAGACAAGCACAAGACCTCCAGCGTCAGCTTGCTGAAGCAAGCACTGCAGCCCAAGCAGCTCAATCCAAGGTCGCTGAATTGGAGAGGACAATCCAAGACTTGGAGAGGAAGGTTCAACAGCAACAGCAAGAGAAAGGTGAGAACTCTGACTCCAATGCAGCTGCGGAAGTGCTTAGGAGACACAAGGAACTGCTCCAGAGGATGCTCCAAGATTGTGATGAGCAAGCAGTTCCCGTGGCAACAGTCGTTCCAACACCCACTTCTTCCCCTACACCAACATCCTCACCAGTTAGCGGAAACAGCAAGTCCACCAGAGGATCAGCCGACCTCCAAGCACTCCTGGCGAAAGCTGAGACGGTCGTGATGGCAGTTTTGGCTGCAAAGACTGGCTACGAGGCAGACATGGTGGAAGCAGATATGGATTTGGAGGCTGAGCTTGGGATTGATTCCATCAAAAGGGTGGAGATCCTGAGTGAAGTCCAAGGGCAGCTCGGAGTTGAAGCGAAGGATGTTGATGCCCTTTCACGTACAAGGACCGTCGGAGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCTGAGATTGTTGCTGCATCTGGTGGGTCAGCACCTGCTGTCCCCTCTGCACCAGCTGCATCAGCGGCTCCGACACCTGCTGCGAGTACCGCTCCGAGTGCTGATCTTCAGGCTCTCCTGTCTAAAGCCGAGACGGTTGTGATGGCTGTGCTCGCAGCGAAAACTGGTTACGAGGCTGACATGGTGGAAGCTGACATGGACCTTGAAGCGGAGTTGGGAATAGATAGCATCAAACGTGTTGAAATCTTGTCTGAGGTCCAAGGACAGTTGGGTGTGGAAGCCAAAGATGTCGATGCGCTTTCAAGAACCAGAACCGTCGGTGAGGTCGTGGACGCCATGAAGGCTGAGATTGTGGCTGCCTCTGCTGGCTCCGCTCCTGCTCCAGCAGTTCCTTCTGCACCTGCAGCGTCAGCGGCTCCAACTCCAGCTGCATCCACGGCTCCTTCTGCAGACCTCCAAGCCTTGCTGTCCAAAGCCGAAACAGTTGTGATGGCTGTCCTTGCTGCAAAGACTGGTTACGAAGCCGACATGGTTGAAGCTGACATGGATTTGGAAGCCGAACTTGGAATAGATTCCATCAAAAGAGTGGAGATACTCTCTGAGGTGCAAGGTCAGCTCGGAGTTGAAGCGAAAGACGTTGATGCCCTCAGTAGGACCAGAACTGTTGGGGAAGTTGTCGATGCGATGAAGGCTGAGATTGTCGCTGCCAGCGGTGGATCTGCACCTGCACCTGCGGTCCCGTCAGCTCCAGCAGCCAGCGCAGCTCCGACTCCTGCAGCTGCCACAGCACCGAGTGCGGATCTGCAGGCATTGCTTGCGAAGGCTGAAACAGTTGTCATGGCTGTCCTGGCTGCGAAAACTGGCTATGAGGCTGATATGGTGGAAGCCGACATGGACCTTGAGGCTGAATTGGGCATTGACAGCATCAAGCGTGTTGAGATTCTCAGTGAAGTCCAAGGACAGCTCGGAGTGGAGGCGAAGGATGTGGATGCCCTCTCAAGGACCAGAACAGTTGGTGAGGTCGTTGATGCGATGAAGGCAGAGATTGTTGCTGCCAGTGCTGGTTCTGCTCCCGCACCCGCTGTCCCAAGCGCACCAGCTGCCTCCGCCGCTCCCACACCAGCTGCCTCTACTGCACCAAGTGCGGACCTTCAAGCTCTCCTGAGCAAGGCTGAGACAGTTGTGATGGCAGTCCTTGCTGCGAAAACTGGCTATGAGGCAGACATGGTGGAAGCGGACATGGATCTGGAAGCTGAACTTGGAATTGACTCCATCAAACGTGTTGAAATCCTCTCTGAGGTTCAAGGTCAGCTTGGGGTGGAGGCCAAAGATGTTGATGCTCTTTCCAGAACAAGGACGGTGGGAGAGGTGGTTGATGCCATGAAGGCTGAGATAGTGGCAGCGTCAGGAGGGTCAGCACCTGCAGCTGCCGTTCCGTCCGCACCAGCAGCCTCTGCAGCTCCCACGCCAGCCACCGCTCCTAGTGCTGATTTGCAAGCCCTCCTTTCAAAAGCTGAAACTGTTGTCATGGCTGTTTTGGCTGCCAAGACTGGCTACGAGGCTGACATGGTTGAGGCTGACATGGACTTGGAAGCCGAGCTTGGGATTGATAGCATCAAGCGTGTGGAAATCCTTTCTGAGGTTCAAGGTCAGCTGGGTGTTGAGGCCAAAGATGTCGATGCGTTGTCAAGGACCAGAACGGTTGGAGAAGTGGTCGATGCCATGAAGGCTGAGATAGTTGCTGCCTCTGGAGGTTCAGCTCCTGCAGCTCCGTCAGCACCTGCCCTCCTTCCAACTTTGTTTGGTTCTGAGTGTGAAGATTTGAGCTTGACTTTCCCAGTCATCACAACCCTGCCTCTTCCTGCTGAACTTGTGCTGGCTGAAGGTGGAGCACGTCCTGTGGTTGTGGTTGACGATGGCTCTGCACTCACCAGTTCTCTTGTGTCCTCACTTGGTGATCGTGCTGTGCTCTTGCAAGTTCAGTCCAGCTCTGCCTGTTCACCCAGAAGCACCACGCACAAGTTGGTCACTGTTGCAGACCGTTCTGAAGCTGCATTGCAAGCTGCGCTCACATCAGTTGAAGCACAGTTTGGAAAAGTGGGAGGTTTTGTGTTCCAGTTTGGTGATGACGATGTCCAAGCGCAGCTTGGTTGGGCACTGCTTGCTGCCAAACATCTCAAAACGTCCTTGTCAGAACAGATAGAAGGTGGGAGGACCTTCTTTGTTGCCGTTGCGAGGTTGGATGGTCAGTTGGGGTTGTCTGGAAAGTCCACGACTGCCACTGTTGATCTCTCCAGAGCGCAGCAAGGCTCAGTCTTTGGACTCTGCAAAACCCTTGACTTGGAATGGCCTGCTGTTTTCTGCAGAGGAATCGACCTTGCAGCTGACTTGGATGCTGCACAAGCTGCCAGATGTCTTTTGGGTGAGCTTTCAGACCCAGATGTGGCAGTGAGGGAGTCTGGTTACTCCGCATCTGGGCAAAGATGCACCACAACCACAAAGTCTCTCACCACGGGAAAACCACATCAACCGATCTCTTCCAGTGATTTGTTCCTGGTCTCTGGAGGTGCTCGTGGAATCACACCTCTTTGTGTGAGAGAATTGGCACAGAGGGTGGGAGGTGGAACCTATGTCCTCATTGGGAGAAGTGAGCTGCCCACCACGGAACCTGCCTGGGCTGTTGGTGTTGAGTCAGGGAAACCTCTTGAGAAGGCTGCGCTGGCGTTCCTCAAAGCTGAGTTTGCAGCTGGAAGGGGAGCGAAGCCGACACCGATGCTCCACAAGAAACTTGTTGGAGCTGTTGTGGGAGCTAGAGAGGTCCGTGCGAGCCTGGCAGAGATAACTGCTCAAGGTGCCACAGCTGTCTATGAGTCCTGTGATGTCAGCTCTGCAGCCAAGGTTCGTGAAATGGTTGAGAGGGTTCAACAGCAAGGAGGGAGAAGGGTCAGCGGTGTGTTTCATGCAAGTGGTGTTTTGAGAGACAAGTTGGTTGAGAACAAGTCACTGGCTGATTTCAGTGCTGTGTATGACACAAAGGTTGGTGGACTCATCAACCTCCTTGCCTGTGTGGATCTTGCACAGCTTAGGCACCTGGTGCTCTTCAGCTCCCTTGCTGGGTTCCACGGCAATGTTGGTCAGAGTGACTATGCAATGGCCAATGAGGCTCTCAACAAGCTGGCTGCACATCTGTCTGCTGTGCATCCCCAACTTTGTGCGAGATCCATTTGCTTTGGTCCGTGGGATGGAGGGATGGTGACGCCTGCACTCAAGGCCAACTTCATCAGAATGGGCATTCAGATTATCCCTCGTCAAGGTGGAGCACAGACAGTTGCGAACATGCTTGTCAGCTCCAGCCCTGGTCAGCTCCTTGTTGGGAACTGGGGAGTGCCACCTGTGGTTCCAAGTGCCACTGAGCACACTGTTTTGCAGACTCTTCGTCAGAGCGACAACCCCTTCTTGGATTCACATGTCATTCAAGGGAGAAGGGTTTTGCCGATGACACTGGCTGTCGGCTACATGGCTCACCAAGCTCAGAGCATCTACGCTGGACATCAGCTTTGGGCAGTTGAGGATGCCCAGCTTTTCAAAGGCATAGCCATTGACAATGGAGCTGATGTTCCGGTTAGGGTTGAGTTGTCAAGGAGAAAGGAGGAACAAGAGGATGCTGGCAAGGTCAAGGTCAAGGTTCAAGTGCTTCTCAAATCTCAAGTCAATGGCAAGTCAGTCCCTGCTTACAAGGCGACTGTCGTGCTTTCCCCTGCTCCACGTCCCAGTGTCATCACCCGTGACTTTGATCTCACTCCTGACCCAGCCTGCACCGAACATGACCTCTATGATGGCAAGACGCTCTTCCACGGCAAAGCCTTCCAAGGAATAGAACAAGTTCTTTCTGCGACGCCAAAACAGCTCACTGCCAAATGCAGAAACCTTCCACTCACACCGGAGCAGCGTGGCCAGTTTGTGGTCAATCTCAGCCAGCAAGACCCATTCCAAGCTGACATTGCTTTCCAAGCCATGCTTGTTTGGGCTAGGATGTTGAGACAGTCTGCTGCGCTGCCCAATAACTGTGAAAGGTTTGATTTCTACAAACCGATGGCTCCTGGAGCAACTTACTATACCAGTGTCAAACTGGCTTCAGCTTCACCATTGGTGGATTCTGTGTGCAAATGCACTGTTGCCATGCACGATGAGCAAGGTGAAGTGTACTTCTCTGCGAGA

GCCAGTGTTGTCCTCAACAAGACACTCACATACTGA

SEQ ID NO: 4 - аминокислотная последовательность приведенного в качестве примера белка PFA2:

MPCDNIAVVGMAVQYAGCKNQDEFWDTLMRKEINSSPISAERLGTRYRDLHFHPQRSKYADTFCNDRYGCVDASVDNEHDLLADLARRALLDAGINLDDASTTANLRDFGIVSGCLSFPMDNLQGELLNLYQVHVENRVGAQRFRDSRPWSERPRAVSPEASDPRVYSDPASFVANQLGLGPVRYSLDAACASALYCLKLASDHLLSRSADVMLCGATCFPDPFFILSGFSTFQAMPLGGPDDNPLSVPLRQGSQGLTPGEGGAIMVLKRLEDAVRDGDRIYGTLLGTSLSNAGCGLPLSPHLPSEKSCMEDLYTSVGIDPSEVQYVECHATGTPQGDVVEVEALRHCFRGNTDHPPRMGSTKGNFGHTLVAAGFAGMAKVLLSMQHGTIPPTPGVDRSNCIDPLVVDEAIPWPYSSAQARAGKPGDELKCASLSAFGFGGTNAHCVFREHRQIAATATASPVLPEVTPGPIAIIGMDATFGTLKGLDAFEQAIYKGTDGASDLPSKRWRFLGADTDFLTAMGLDAVPRGCYVRDVDVDYKRLRSPMIPEDVLRPQQLLAVATMDRALQDAGMATGGKVAVLVGLGTDTELYRHRARVTLKERLDPAAFSPEQVQEMMDYINDCGTSTSYTSYIGNLVATRVSSQWGFTGPSFTVTEGANSVYRCLELGKFLLDTHQVDAVVVAGVDLCATAENLYLKARRSAISRQDHPRANFEASADGYFAGEGSGALVLKRQADVGSDDKVYASVAGLTCAAQPAEAVSPLLLQVHNDDNEKRVVEMVELAADSGRHAPHLANSPLSAESQLEQVSKLLAHQVPGSVAIGSVRANVGDVGYASGAASLIKTALCLHNRYLPANPQWERPVAPVSEALFTCPRSRAWLKNPGESRLAAVASASESGSCFGVLLTDEYATHESSNRLSLDDAAPKLIAIRGDTVDDIMAKVNAELALLRAHAETGSATDDDPAAAVAFTAHRLRFLRLVGETVASHGATATLCLALLTTPEKLEKELELAAKGVPRSAKAGRNWMSPSGSAFAPTPVTSDRVAFMYGEGRSPYYGVGLDLHRLWPALHERINDKTAALWENGDSWLMPRAVDADSQRAVQTAFDADQIEMFRTGIFVSICLTDYARDVLGVQPKACFGLSLGEISMLFALSRRNCGLSDQLTQRLRTSPVWSTQLAVEFQALRKLWNVPADAPVESFWQGYLVRASRAEIEKAIGPDNRFVRLLIVNDSSSALIAGKPAECLRVLERLGGRLPPMPVKQGMIGHCPEVAPYTPGIAHIHEILEIPDSPVKMYTSVTNAELRGGSNSSITEFVQKLYTRIADFPGIVDKVSRDGHDVFVEVGPNNMRSAAVSDILGKAATPHVSVALDRPSESAWTQTLKSLALLTAHRVPLHNPTLFADLYHPTFLTAIDSAMQEPPPKPNRFLRSVEVNGYFCPDGISKQVAAASAKPSTHCMVRLHPAKAVVVAAAGAVVADSTPVVKAKQTSSSLLVGDDAFLRCYDVDWPLYMGAMAEGISSVDLVVAAAEARMLASFGAARLPMDQVELQIREIQQRTSNAFAVNLMPGPDEAATVDALLRTGVSIVEASGYTGALSADLVRYRVTGLRRTSCGASVSATHRVVAKVSRTEVAEHFLRPAPAAVLEALVAAKQITPEQAALASRVAMADDVAVEADSGGHTDNRPIHVLLPLVVAQRNRWRHLVDTPVRVGAGGGIACPRAALLAFSLGAAFVVTGSVNQLAREAGTSDAVRLLLATATYSDVAMAPGGVQVLKKQTMFAARATMLAQLQAKFGSFDAVPEPQLRKLERSVFKQSVADVWAAAREKFGVDATAASPQERMALCVRWYMSQSSRWATEATSARKADYQIWCGPAIGSFNDFVRGTKLDATAGTGEFPRVVDINQHILLGASHYRRVQQQ

QQDDDVEYIIV

SEQ ID NO: 5 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера гена PFA2 v1, выделенного из траустохидрида Schizochytrium sp. (как представлено под ATCC Accession No. PTA 9695):

ATGCCGTGCGATAACATTGCGGTCGTGGGCATGGCGGTGCAGTATGCCGGATGCAAGAACCAGGACGAGTTCTGGGATACGCTGATGCGTAAGGAGATCAACTCGAGCCCGATCTCGGCGGAGCGCCTCGGTACGCGCTACCGCGACCTCCACTTCCACCCGCAGCGCAGCAAGTACGCCGACACCTTCTGCAACGATCGCTACGGCTGCGTCGATGCCAGCGTCGACAACGAGCACGACCTCCTCGCCGACCTGGCCCGGCGCGCCCTGCTCGACGCCGGAATTAACCTCGACGACGCCAGCACCACCGCCAACCTACGCGACTTCGGCATCGTGAGCGGCTGCCTGTCGTTCCCCATGGACAATCTGCAGGGCGAGCTGCTCAATCTGTACCAAGTGCATGTGGAGAACCGCGTGGGCGCCCAGCGCTTCCGCGACTCGCGCCCCTGGTCGGAGCGCCCGCGCGCTGTCTCGCCCGAGGCCAGCGACCCGCGCGTGTACTCCGACCCGGCGTCCTTCGTGGCCAACCAGCTCGGCCTGGGGCCCGTGCGCTACAGCCTCGATGCAGCCTGCGCGTCGGCGCTGTACTGCCTCAAGCTGGCGTCCGACCACTTGCTCTCGCGCAGCGCGGACGTGATGCTGTGCGGCGCCACATGCTTTCCGGACCCGTTCTTCATTCTCTCGGGGTTCTCCACCTTCCAGGCGATGCCGCTGGGCGGACCGGACGATAACCCACTGTCCGTGCCGCTGCGGCAGGGCAGCCAGGGCCTGACGCCCGGAGAGGGCGGCGCCATCATGGTGCTGAAGCGCCTCGAGGACGCCGTGCGCGACGGCGACCGCATCTACGGCACCTTGCTCGGCACGAGTCTGAGCAACGCCGGGTGCGGCCTGCCGCTGAGCCCGCACCTGCCGAGCGAGAAGTCGTGCATGGAGGACCTGTACACGAGCGTCGGCATCGACCCAAGCGAGGTGCAGTACGTGGAGTGCCACGCCACGGGCACTCCGCAGGGCGACGTCGTGGAGGTAGAGGCGCTGCGCCACTGCTTTCGAGGTAACACGGACCACCCGCCGCGCATGGGCTCCACCAAGGGCAACTTTGGCCACACTCTCGTGGCGGCCGGGTTCGCAGGCATGGCCAAGGTGCTGCTGTCGATGCAGCACGGCACGATCCCGCCCACGCCCGGTGTCGACCGCTCCAACTGCATCGACCCGCTCGTCGTGGACGAGGCCATCCCTTGGCCGTACTCGTCGGCGCAGGCGCGGGCAGGCAAACCAGGCGATGAGCTCAAGTGCGCCTCGCTCTCCGCCTTTGGCTTTGGTGGAACCAACGCGCACTGTGTCTTCCGTGAGCACCGCCAAATTGCTGCTACTGCGACAGCCTCGCCGGTGCTTCCCGAGGTGACTCCTGGACCGATTGCCATCATCGGGATGGACGCGACGTTTGGTACCCTCAAGGGCCTGGACGCGTTTGAGCAGGCCATCTACAAGGGCACGGACGGCGCCAGCGACCTGCCGAGCAAGCGCTGGCGGTTCCTGGGCGCCGACACGGACTTCTTGACCGCCATGGGCCTCGACGCCGTGCCGCGCGGGTGCTACGTGCGCGACGTGGACGTGGACTACAAGCGGCTGCGGTCGCCGATGATCCCTGAGGACGTCCTGCGCCCGCAACAGCTGCTGGCGGTGGCTACGATGGACCGCGCGCTGCAGGACGCTGGAATGGCGACGGGAGGCAAGGTGGCGGTGCTGGTGGGGCTCGGCACGGACACCGAGCTGTACCGGCACCGCGCGCGCGTGACACTCAAGGAGCGGCTCGACCCGGCCGCGTTCTCGCCCGAGCAGGTGCAGGAGATGATGGACTACATCAACGACTGCGGCACCTCGACGTCGTACACGTCGTACATCGGCAACCTCGTGGCCACGCGCGTGTCCTCGCAGTGGGGCTTTACGGGCCCGTCCTTCACCGTCACCGAAGGCGCAAACTCGGTCTACCGCTGCCTCGAGCTGGGCAAGTTCCTGCTCGACACGCACCAGGTGGACGCCGTCGTGGTGGCCGGCGTCGACCTCTGTGCCACCGCCGAGAACCTTTACCTCAAGGCGCGCCGCTCCGCCATCAGCCGACAGGACCACCCTCGCGCCAACTTTGAGGCCAGCGCCGACGGGTACTTTGCCGGCGAGGGCAGCGGCGCCCTGGTCCTCAAGCGCCAGGCCGACGTTGGCTCAGACGACAAGGTCTACGCCAGTGTCGCGGGCCTCACGTGCGCCGCGCAGCCCGCTGAAGCCGTGTCGCCGCTACTACTCCAAGTCCACAACGACGACAACGAGAAGAGGGTGGTGGAGATGGTGGAGCTCGCCGCCGACTCGGGTCGCCATGCGCCGCACTTGGCCAACTCGCCGCTGAGCGCCGAGTCGCAGCTGGAGCAAGTGTCCAAGTTGCTCGCGCACCAGGTGCCGGGCTCGGTGGCCATCGGCAGCGTGCGCGCCAACGTGGGAGACGTCGGGTACGCCTCGGGCGCCGCGAGCCTCATCAAGACGGCGCTGTGCCTCCACAACCGCTACCTCCCGGCCAACCCGCAGTGGGAGCGGCCGGTGGCGCCGGTCTCCGAGGCGCTGTTTACTTGCCCGCGCTCGCGTGCCTGGCTGAAGAACCCGGGCGAGTCGCGACTGGCGGCTGTCGCCAGTGCCTCCGAGAGCGGGTCCTGCTTTGGCGTGCTCCTCACAGACGAGTACGCCACTCATGAGAGCAGCAACCGCCTCTCGCTGGATGACGCCGCCCCCAAGCTCATCGCGATCCGTGGCGACACCGTTGACGATATCATGGCCAAGGTCAACGCCGAGCTGGCGCTCCTCCGAGCGCACGCCGAAACCGGGTCTGCTACTGACGACGACCCAGCTGCTGCTGTCGCTTTCACTGCTCATCGCTTGCGCTTTTTGCGGCTCGTAGGGGAGACGGTGGCTAGTCACGGTGCCACGGCGACCTTGTGTTTGGCCCTGCTGACAACGCCGGAGAAGCTGGAGAAGGAGTTGGAGCTGGCAGCCAAGGGTGTACCGCGAAGCGCCAAGGCCGGGCGCAACTGGATGTCGCCATCGGGCAGCGCCTTTGCGCCGACACCTGTGACCAGCGACCGCGTCGCGTTCATGTACGGCGAGGGCCGCAGCCCCTACTACGGCGTCGGGCTCGACCTGCACCGCCTGTGGCCGGCTTTGCACGAGCGCATCAACGACAAGACCGCGGCGCTGTGGGAGAACGGCGACTCGTGGCTCATGCCGCGCGCGGTGGATGCCGACTCGCAGCGCGCCGTGCAGACGGCCTTTGACGCGGACCAGATCGAGATGTTCCGCACGGGCATCTTCGTGTCCATCTGCCTCACCGACTACGCGCGCGACGTGCTCGGGGTGCAGCCCAAGGCGTGCTTCGGCCTCAGCCTCGGCGAGATCTCCATGCTCTTTGCGCTGTCGCGACGCAACTGCGGCCTGTCGGACCAGCTCACGCAGCGCCTACGCACCTCGCCGGTGTGGTCGACACAGCTGGCGGTGGAGTTCCAGGCCTTGCGCAAGCTATGGAACGTGCCGGCGGACGCCCCCGTGGAGTCCTTCTGGCAGGGCTACTTGGTTCGCGCCAGCCGCGCCGAAATCGAGAAGGCGATCGGGCCCGACAACCGCTTCGTGCGCCTGCTGATCGTCAACGACTCGAGCAGCGCGCTGATCGCCGGCAAACCTGCCGAGTGTCTGCGCGTGCTGGAGCGCCTGGGCGGGCGGTTGCCGCCGATGCCCGTCAAGCAAGGCATGATTGGGCACTGCCCCGAAGTGGCGCCCTACACGCCGGGCATCGCGCACATCCACGAGATTTTGGAGATTCCGGACAGCCCCGTCAAGATGTACACCTCGGTCACCAACGCCGAGCTGCGCGGGGGCAGCAACAGCAGCATCACCGAGTTCGTGCAGAAGTTGTACACGCGCATCGCCGACTTTCCGGGCATCGTCGACAAGGTCAGCCGTGACGGCCACGATGTCTTCGTCGAGGTGGGGCCGAACAACATGCGCTCCGCCGCGGTCAGTGACATTCTTGGCAAGGCTGCCACCCCGCATGTCTCCGTGGCGCTGGACCGCCCCAGTGAGTCGGCGTGGACGCAGACCCTCAAGTCGCTGGCGCTGCTGACCGCCCACCGCGTGCCCCTGCACAACCCGACTCTGTTTGCGGACCTGTACCACCCCACGTTCCTGACGGCTATCGACTCTGCGATGCAGGAGCCCCCGCCCAAGCCCAACCGCTTCCTTCGCAGCGTAGAGGTCAACGGGTACTTTTGCCCCGACGGCATCAGCAAGCAGGTTGCTGCTGCAAGTGCCAAACCCTCGACGCATTGCATGGTTCGTTTGCACCCAGCCAAGGCAGTTGTGGTTGCTGCTGCTGGTGCTGTGGTTGCTGATTCGACGCCCGTGGTCAAGGCCAAGCAGACGTCGTCGTCGTTGTTGGTTGGGGATGACGCCTTTCTGCGCTGCTACGACGTGGACTGGCCGCTCTACATGGGCGCCATGGCGGAAGGCATCTCGTCGGTAGACCTGGTGGTCGCTGCCGCCGAGGCCCGCATGCTGGCATCATTCGGAGCGGCCCGCTTGCCTATGGACCAGGTGGAACTCCAGATCCGTGAGATCCAGCAACGCACCTCCAACGCCTTTGCTGTCAACCTGATGCCGGGTCCTGACGAGGCCGCGACGGTGGACGCGCTGCTGCGCACGGGCGTCTCAATCGTCGAGGCATCGGGCTACACCGGCGCGCTCTCTGCAGACCTGGTGCGCTACCGTGTCACGGGTCTGCGACGAACTAGTTGCGGTGCTTCTGTGTCGGCGACTCACCGTGTGGTCGCCAAGGTGTCGCGCACCGAGGTGGCCGAGCACTTTCTGCGCCCGGCGCCGGCCGCCGTACTAGAGGCTTTGGTCGCCGCCAAACAGATTACGCCCGAGCAGGCCGCGCTGGCCAGCCGCGTCGCCATGGCCGACGACGTCGCGGTGGAGGCCGACTCGGGCGGGCACACCGACAACCGACCGATCCACGTGCTGCTGCCGCTCGTGGTGGCGCAGCGCAACCGCTGGCGCCACCTGGTGGACACGCCAGTGCGCGTCGGCGCCGGCGGCGGGATCGCCTGTCCGCGCGCCGCGCTGCTCGCCTTTTCCCTGGGCGCCGCCTTTGTGGTCACCGGGTCCGTCAACCAACTGGCCCGCGAGGCTGGCACCAGCGACGCGGTCCGACTACTGCTGGCGACGGCCACCTACTCGGACGTGGCCATGGCGCCGGGCGGCGTCCAGGTGCTCAAGAAGCAGACCATGTTCGCCGCGCGGGCCACGATGCTCGCCCAGCTGCAGGCCAAGTTCGGCTCCTTTGACGCCGTGCCGGAGCCGCAGCTGCGCAAGCTCGAGCGCTCCGTGTTCAAGCAGTCCGTGGCGGACGTGTGGGCTGCTGCACGCGAAAAGTTTGGTGTCGACGCTACCGCTGCAAGTCCGCAGGAGAGGATGGCGCTCTGTGTGCGCTGGTACATGTCGCAGTCGTCGCGATGGGCTACCGAGGCGACGTCCGCGCGCAAGGCGGACTACCAGATCTGGTGCGGCCCCGCCATCGGCAGCTTCAACGACTTCGTTCGCGGCACCAAGCTGGACGCGACCGCTGGCACCGGCGAGTTTCCGCGCGTCGTGGACATCAACCAGCACATCCTCCTCGGAGCCTCGCACTACCGCCGCGTGCAGCAACAA

CAACAGGACGACGACGTAGAATACATCATCGTATAA

SEQ ID NO: 6 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера оптимизированного гена растения PFA2, указанного в описании настоящей патентной заявки, как PFA2 v2:

ATGCCGTGTGACAACATTGCTGTGGTTGGAATGGCAGTTCAGTATGCTGGATGCAAGAACCAGGACGAGTTCTGGGACACACTGATGAGGAAGGAGATCAACAGCTCACCGATCTCAGCGGAGAGGCTTGGGACAAGATACAGAGACCTCCACTTCCATCCTCAGAGGAGCAAGTATGCAGACACCTTCTGCAATGACAGATATGGTTGTGTTGATGCTTCTGTTGACAATGAGCATGACTTGCTTGCTGACCTTGCCAGACGTGCTTTGCTTGATGCTGGGATCAACTTGGATGACGCCAGCACCACTGCCAACCTTCGTGACTTTGGGATTGTGAGTGGATGCCTCTCCTTCCCGATGGACAATCTGCAAGGTGAGCTTTTGAATCTCTATCAAGTCCACGTTGAGAACCGTGTGGGTGCCCAGAGGTTCAGAGATTCAAGACCCTGGTCAGAAAGACCAAGAGCTGTGTCCCCTGAAGCCAGTGACCCGAGGGTCTACAGCGACCCTGCTTCCTTTGTGGCCAACCAGCTTGGTCTTGGTCCTGTCAGATACAGCCTTGATGCAGCTTGTGCGAGTGCGCTGTACTGCCTCAAGTTGGCTTCTGATCACTTGCTCTCCCGTTCTGCAGATGTCATGCTGTGTGGTGCCACATGCTTCCCAGACCCGTTTTTCATTCTCTCTGGGTTCTCCACATTCCAAGCGATGCCATTGGGTGGACCAGATGACAACCCACTCTCTGTGCCACTCCGTCAAGGCAGCCAAGGACTCACACCTGGAGAAGGTGGAGCCATCATGGTTCTGAAGCGTTTGGAAGATGCTGTGAGGGATGGTGATAGGATCTATGGCACCTTGCTTGGGACAAGTCTCAGCAATGCTGGTTGTGGTTTGCCACTTTCACCTCACCTGCCGTCTGAGAAAAGCTGCATGGAGGATTTGTACACGTCAGTTGGCATAGATCCATCTGAGGTTCAGTATGTCGAGTGTCATGCCACCGGAACTCCGCAAGGAGATGTGGTTGAAGTTGAGGCTCTGAGACATTGCTTCAGAGGCAACACTGACCACCCACCGAGGATGGGTTCCACCAAAGGAAACTTTGGTCACACCTTGGTTGCAGCTGGGTTTGCTGGAATGGCCAAAGTGTTGCTTTCCATGCAGCATGGCACGATCCCACCCACGCCTGGTGTTGATAGGAGCAACTGCATAGATCCGCTGGTCGTTGATGAGGCCATACCCTGGCCTTACAGCTCAGCTCAAGCGAGAGCTGGCAAACCTGGAGATGAATTGAAGTGTGCTTCCCTCTCAGCCTTTGGATTTGGTGGAACAAATGCTCATTGTGTGTTCAGAGAACACAGACAGATTGCTGCCACTGCGACAGCGTCTCCGGTCCTTCCTGAAGTCACCCCTGGACCCATTGCAATCATTGGGATGGATGCGACGTTTGGCACCCTCAAAGGACTTGATGCGTTTGAACAAGCGATCTACAAAGGCACGGATGGAGCATCTGATCTGCCATCCAAGAGATGGAGGTTCCTTGGTGCTGACACAGATTTCTTGACTGCAATGGGTCTGGATGCAGTCCCGAGAGGGTGCTATGTGAGGGATGTTGATGTGGACTACAAAAGACTCAGAAGTCCCATGATCCCTGAAGATGTCCTCAGACCCCAACAGCTTCTGGCAGTTGCCACGATGGATAGGGCACTTCAAGATGCTGGCATGGCCACGGGTGGAAAAGTTGCTGTCCTGGTGGGGTTGGGCACTGACACTGAGCTTTACAGACACCGTGCAAGGGTGACACTCAAGGAAAGGCTTGACCCAGCAGCTTTCTCCCCTGAACAAGTTCAAGAAATGATGGATTACATCAATGATTGTGGAACCTCAACCAGCTACACTTCTTACATTGGGAATCTTGTGGCCACCAGAGTTTCCTCACAGTGGGGATTCACTGGTCCTTCTTTCACGGTCACTGAAGGTGCAAACTCAGTCTATCGTTGCCTTGAGCTGGGAAAGTTCCTTTTGGACACCCACCAAGTGGATGCAGTTGTGGTTGCTGGAGTTGATCTCTGTGCAACTGCTGAGAACCTTTACCTCAAGGCAAGAAGGTCTGCCATAAGCAGACAAGACCATCCACGTGCCAACTTTGAGGCTTCTGCTGATGGATACTTTGCTGGAGAGGGCAGTGGTGCTCTGGTCTTGAAGAGGCAAGCTGATGTTGGCTCAGATGACAAGGTCTATGCCAGTGTTGCTGGCCTCACATGTGCAGCGCAGCCTGCTGAAGCAGTTTCTCCTCTTCTCCTTCAAGTTCACAATGATGACAATGAGAAAAGGGTTGTGGAGATGGTGGAACTCGCAGCTGACTCTGGTCGTCATGCTCCCCACTTGGCCAACTCTCCTTTGAGTGCTGAATCACAGCTTGAGCAAGTGTCTAAACTCTTGGCTCATCAAGTCCCTGGTTCAGTCGCGATTGGAAGTGTTCGTGCCAATGTTGGAGATGTTGGATATGCGAGTGGTGCAGCTTCTCTCATAAAGACTGCGCTTTGCCTCCACAACCGTTACTTGCCTGCAAACCCACAGTGGGAAAGACCTGTGGCTCCAGTCTCAGAGGCTCTTTTCACCTGTCCAAGGTCCCGTGCTTGGCTCAAGAACCCTGGTGAGTCCAGACTTGCTGCAGTGGCCAGTGCTTCTGAGAGTGGGTCTTGCTTTGGAGTGCTTCTCACAGATGAGTATGCCACACATGAGTCCAGCAACAGATTGTCATTGGATGACGCTGCACCCAAACTCATAGCGATTCGTGGAGACACTGTTGATGACATCATGGCAAAAGTCAATGCTGAACTTGCGTTGCTCCGTGCTCATGCAGAAACTGGGTCTGCCACTGACGATGACCCAGCTGCAGCTGTTGCTTTCACTGCTCATCGTTTGAGGTTCTTGAGGCTTGTTGGTGAAACAGTTGCCAGTCACGGTGCCACAGCGACCTTGTGTTTGGCTCTGCTCACAACTCCAGAAAAGCTGGAGAAAGAATTGGAGTTGGCAGCCAAGGGTGTTCCAAGATCAGCCAAGGCTGGCAGAAACTGGATGTCACCATCTGGTTCTGCTTTTGCACCAACACCTGTCACCAGTGATCGTGTTGCGTTCATGTATGGTGAAGGGAGGTCTCCCTACTATGGTGTTGGGTTGGACCTTCACAGACTCTGGCCTGCTTTGCATGAGAGGATCAATGACAAGACAGCTGCACTTTGGGAGAATGGAGACTCCTGGCTCATGCCCAGAGCGGTTGATGCTGACTCTCAGAGGGCTGTCCAGACGGCTTTTGATGCTGACCAGATAGAGATGTTTAGGACGGGAATCTTTGTTTCCATTTGCCTCACAGACTATGCTCGTGATGTCCTTGGAGTCCAACCCAAGGCTTGCTTTGGACTCTCCCTTGGAGAAATCTCCATGCTCTTTGCACTTTCAAGGAGAAACTGTGGACTTTCTGACCAGCTCACTCAGAGGCTCAGAACCTCTCCGGTCTGGAGCACACAGCTTGCTGTGGAGTTCCAAGCCTTGAGGAAACTTTGGAATGTCCCTGCTGATGCTCCAGTTGAGTCCTTCTGGCAAGGCTACTTGGTTCGTGCCAGCAGAGCAGAGATTGAAAAGGCCATTGGACCGGACAACAGATTTGTTCGTTTGCTCATTGTCAACGACTCCAGCAGTGCCCTCATTGCTGGCAAACCTGCTGAGTGTCTGAGGGTGCTTGAGCGTCTTGGAGGTCGTTTGCCACCCATGCCAGTCAAGCAAGGCATGATTGGGCACTGCCCAGAAGTGGCTCCCTATACTCCTGGAATAGCTCACATCCACGAAATCTTGGAGATTCCTGACAGCCCTGTCAAGATGTATACCTCAGTCACCAATGCTGAGCTGAGAGGAGGCAGCAACTCTTCCATCACAGAGTTCGTTCAGAAGTTGTACACCAGAATAGCGGATTTCCCTGGCATTGTTGACAAGGTCAGCCGTGATGGCCATGATGTTTTCGTGGAAGTTGGTCCGAATAACATGAGGTCAGCAGCTGTCAGTGACATTCTTGGGAAGGCTGCAACTCCTCATGTCAGTGTGGCTCTTGATCGTCCAAGTGAGTCAGCTTGGACACAGACACTCAAATCTCTTGCCCTGCTCACTGCCCACAGAGTGCCTCTTCACAACCCGACTCTCTTTGCGGATCTTTACCACCCAACCTTCCTCACAGCCATAGATTCTGCAATGCAAGAACCACCTCCCAAGCCCAACAGATTCCTGAGGTCTGTTGAAGTCAATGGTTACTTCTGCCCTGATGGCATAAGCAAACAAGTTGCAGCTGCAAGTGCCAAACCCAGCACACATTGCATGGTTCGTCTCCATCCAGCCAAAGCTGTTGTGGTTGCAGCTGCCGGAGCTGTGGTTGCTGATTCAACACCGGTTGTCAAAGCCAAGCAGACTTCCTCATCTTTGCTTGTTGGAGACGATGCCTTCCTCAGATGCTATGATGTGGATTGGCCTCTCTACATGGGAGCGATGGCTGAAGGAATCTCCTCTGTTGACCTTGTGGTTGCAGCTGCAGAAGCTAGGATGCTTGCATCATTTGGAGCAGCGAGGCTTCCGATGGATCAAGTTGAACTCCAGATCCGTGAGATCCAACAGAGAACCTCCAATGCCTTTGCTGTCAACCTCATGCCTGGTCCTGATGAAGCTGCAACGGTGGATGCCCTTCTGAGAACGGGAGTCAGCATTGTGGAGGCGTCTGGTTACACGGGTGCGCTCTCTGCGGATCTGGTGAGATACCGTGTGACCGGTCTCAGAAGGACCTCCTGTGGTGCTTCTGTGTCAGCGACTCACCGTGTTGTGGCCAAAGTTTCAAGAACTGAGGTGGCTGAACATTTCCTGAGACCAGCACCTGCAGCTGTTCTTGAGGCTTTGGTGGCAGCCAAACAAATCACTCCTGAGCAAGCTGCGCTTGCCAGCAGAGTCGCGATGGCTGACGATGTCGCGGTGGAGGCAGATTCTGGAGGGCACACTGACAACCGTCCAATCCATGTGCTCCTTCCTTTGGTTGTGGCTCAGAGGAACAGATGGAGGCATCTGGTTGACACGCCAGTGCGTGTGGGAGCTGGAGGTGGGATAGCATGTCCGAGAGCAGCGTTGCTTGCCTTCTCCTTGGGTGCAGCCTTTGTGGTCACTGGAAGTGTCAACCAGCTTGCTCGTGAAGCTGGGACCTCTGATGCAGTCAGACTCCTTTTGGCGACTGCCACCTATAGTGATGTGGCGATGGCTCCTGGTGGAGTCCAAGTGTTGAAGAAACAAACCATGTTCGCTGCGAGAGCAACGATGTTGGCTCAGCTCCAAGCCAAGTTTGGTTCCTTTGATGCTGTGCCAGAACCGCAACTGAGAAAACTGGAGAGATCAGTGTTCAAGCAGAGTGTTGCTGATGTTTGGGCAGCTGCAAGGGAAAAGTTTGGGGTTGATGCCACGGCTGCAAGTCCGCAAGAGAGGATGGCTCTCTGTGTCAGATGGTACATGTCTCAAAGCTCACGTTGGGCAACAGAGGCCACTTCAGCAAGGAAAGCGGACTATCAGATTTGGTGTGGTCCTGCAATAGGCAGCTTCAATGACTTCGTCAGAGGCACCAAACTTGATGCCACGGCTGGGACTGGTGAGTTCCCGAGAGTTGTGGACATCAACCAGCACATCTTGCTGGGAGCCTCTCATTACAGAAGGGTTCAACAGCAA

CAGCAAGACGATGACGTTGAGTACATCATTGTTTGA

SEQ ID NO: 7 - аминокислотная последовательность приведенного в качестве примера белка PFA3:

MTSSKKTPVWEMSKEELLDGKTVVFDYNELLEFAEGDVGQVFGPEFDIIDKYRRRVRLPAREYLLVSRVTLMDAEVNNFRVGSRMVTEYDVPVNGELSEGGDVPWAVLVESGQCDLMLISYMGIDFQCKGDRVYRLLNTSLTFFGVAHEGETLVYDIRVTGFAKGAGGEISMFFFEYDCFVDGRLLIEMRDGCAGFFTDAELAAGKGVLKTKAELAARAQIQKQDIAPFAPAPCSHKTSLDAREMRLLVDRQWARVFGSGMAGIDYKLCARKMLMIDRVTHLDPRGGAHGLGLLIGEKVLERDHWYFPCHFVRDEVMAGSLVSDGCSQLLKVYMLWLGLHTTVGAFDFRPVSGHANKVRCRGQISPHKGKLVYVMEIKEMGFDAKTGDPFAIADVDIIDVNFEEGQAFAGVEDLHSYGQGDLRKKIVVDFKGIALSLQKRKEQQKESMTVTTTTTTTSRVIAPPSGCLKGDPTAPTSVTWHPMAEGNGGPGPTPSFSPSAYPPRAVCFSPFPNNPLDNDHTPGQMPLTWFNMSEFMCGKVSNCLGPEFARFDASKTSRSPAFDLALVTRVTSVADMEHGPFYNVDVNPGQGTMVGEFDCPADAWFFGASSRDDHMPYSILMEIALQTSGVLTSVLKAPLTMDKDDILFRNLDADAELVGDAMPDVRGKTIRNFTKCTGYSMLGKMGIHRFTFELSVDGAVFYKGSTSFGWFVPEVFESQTGLDNGKPRLPWYRENNVAVDTLSAPASASSAQGQLQLQRRGSQAQFLDTIHLAGSGAGVHGQGYAHGEKAVNKQDWFFSCHFWFDPVMPGSLGIESMFQLVEAWCVKQGLAARHGIAHPVFAHAPGATSWKYRGQLTPKNDRMDSEVHIKSVAAFSSWVDVVADGFLFVDGLRVYSADNLRVRIQTGAGHVEEQEVAAKATTKNSSIADVDVADLQALKQALLTLERPLQLDAGSEVPACAVSDLGDRGFMETYGVVAPLYSGAMAKGIASADLVIAMGQRKMLGSFGAGGLPMHVVRAGIEKIQAALPAGPYAVNLIHSPFDANLEKGNVDLFLEKGVRVVEASAFMELTPQVVRYRATGLSRDARGGSVRTAHKIIGKVSRTELAEMFIRPAPQAILDKLVASGEITPEQAALALEVPMADDIAVEADSGGHTDNRPIHVILPLILSLRNRLQRELKYPARHRVRVGAGGGIGCPQAALGAFHMGAAFVVTGTVNQLSRQAGTCDNVRRQLSRATYSDITMAPAADMFEQGVELQVLKKGTMFPSRAKKLFELFHKYDSFEAMPADELARVEKRIFSKSLAEVWAETKDFYITRLNNPEKIRKAENEDPKLKMSLCFRWYLGLSSFWANNGIADRTMDYQIWCGPAIGAFNDFIADSYLDVAVS

GEFPDVVQINLQILSGAAYLQRLLSVKLAPRIDVDTEDDLFTYRPDHAL

SEQ ID NO: 8 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера гена PFA3, указанного в описании настоящей патентной заявки, как PFA3 v1, выделенного из траустохидрида Schizochytrium sp. (как представлено под ATCC Accession No. PTA 9695):

ATGACATCATCGAAGAAGACTCCCGTGTGGGAGATGAGCAAGGAGGAGCTGCTGGACGGCAAGACGGTGGTCTTCGACTACAACGAGCTGCTCGAATTCGCCGAGGGCGACGTGGGCCAAGTGTTCGGACCCGAGTTCGACATCATCGACAAGTACCGGCGTCGCGTGCGGCTGCCGGCGCGCGAGTACCTGCTCGTGTCGCGCGTGACGCTGATGGACGCCGAGGTGAACAACTTCCGCGTCGGGTCGCGCATGGTGACCGAGTACGACGTGCCCGTGAACGGGGAGCTGTCGGAGGGCGGGGACGTGCCGTGGGCGGTGCTGGTGGAGTCGGGGCAGTGCGACCTGATGCTCATCTCGTACATGGGCATCGACTTCCAGTGCAAGGGCGACCGCGTGTACCGCCTGCTCAACACATCGCTCACCTTCTTCGGGGTGGCGCACGAGGGCGAGACGCTGGTGTACGACATCCGCGTCACGGGGTTCGCCAAGGGCGCGGGCGGGGAGATCTCGATGTTCTTCTTCGAGTACGACTGCTTCGTGGACGGCCGCCTGCTGATCGAGATGCGCGACGGGTGCGCCGGGTTCTTCACGGACGCCGAGCTGGCCGCCGGCAAGGGCGTGCTTAAGACCAAGGCGGAGCTGGCGGCGCGCGCGCAGATCCAGAAGCAGGACATCGCGCCCTTTGCGCCGGCGCCGTGCTCGCACAAGACCTCGCTGGACGCGCGCGAGATGCGGCTGCTCGTGGACCGCCAGTGGGCGCGCGTCTTCGGCAGCGGCATGGCGGGCATCGACTACAAGTTGTGCGCTCGCAAGATGCTCATGATCGACCGCGTCACGCACCTCGACCCGCGCGGCGGCGCGCACGGCCTCGGGCTGCTGATCGGGGAGAAGGTGCTGGAGCGCGACCACTGGTACTTCCCCTGCCACTTTGTGCGCGACGAGGTGATGGCCGGGTCGCTGGTCAGCGACGGCTGCTCGCAGCTCCTCAAGGTGTACATGCTGTGGCTCGGCCTGCACACGACCGTGGGCGCGTTCGACTTTCGTCCCGTGAGCGGGCACGCCAACAAGGTGCGGTGCCGCGGGCAGATCTCACCGCACAAGGGCAAGCTCGTGTACGTGATGGAGATCAAGGAAATGGGCTTTGACGCGAAGACGGGCGATCCGTTTGCGATCGCGGACGTGGACATCATCGACGTCAACTTCGAGGAGGGACAGGCGTTTGCGGGAGTGGAAGACCTGCACAGCTACGGCCAGGGCGACCTCCGCAAGAAGATCGTCGTCGACTTCAAGGGCATCGCGCTCTCCCTGCAGAAGCGGAAGGAGCAGCAGAAGGAAAGCATGACCGTGACTACGACGACGACGACGACGAGCCGGGTGATTGCGCCGCCCAGCGGGTGCCTCAAGGGCGACCCGACGGCGCCGACGAGCGTGACGTGGCACCCGATGGCGGAGGGCAACGGCGGGCCCGGACCGACGCCGTCGTTCTCGCCGTCCGCGTACCCGCCGCGGGCGGTGTGCTTCTCGCCGTTCCCCAACAACCCGCTTGACAACGACCACACGCCGGGCCAGATGCCGTTGACCTGGTTCAACATGTCCGAATTCATGTGCGGCAAAGTGTCCAACTGCCTGGGCCCCGAGTTTGCGCGCTTCGACGCGAGCAAGACGAGCCGCAGCCCGGCCTTTGACCTGGCGCTCGTGACGCGGGTGACGAGCGTGGCGGACATGGAGCACGGGCCGTTCTACAACGTGGACGTCAACCCGGGCCAGGGCACGATGGTGGGCGAGTTCGACTGTCCCGCGGACGCGTGGTTCTTCGGCGCCTCGAGCCGCGACGACCACATGCCGTACTCGATCCTGATGGAGATCGCGCTGCAGACGTCGGGCGTCCTCACCTCGGTGCTCAAGGCGCCGCTGACGATGGACAAGGACGACATCCTCTTCCGCAACCTCGACGCAGACGCCGAGCTCGTGGGCGACGCCATGCCGGACGTGCGCGGCAAGACGATCCGCAACTTCACCAAGTGCACAGGCTACAGCATGCTCGGCAAGATGGGCATCCACCGCTTCACCTTTGAGCTCAGCGTCGACGGCGCCGTCTTCTACAAGGGCAGCACCTCGTTTGGCTGGTTCGTCCCCGAGGTCTTCGAGTCGCAGACCGGTCTCGACAACGGCAAGCCGCGCCTGCCTTGGTACCGCGAGAACAACGTCGCCGTCGACACGCTCTCCGCGCCCGCCTCCGCTTCCTCCGCGCAAGGTCAGCTGCAGCTGCAGCGACGCGGGTCGCAGGCGCAGTTCCTGGACACAATCCACCTGGCGGGCAGCGGCGCCGGCGTGCACGGCCAGGGCTACGCGCACGGGGAGAAGGCCGTGAACAAGCAAGATTGGTTCTTCTCGTGCCACTTCTGGTTCGACCCCGTGATGCCCGGGTCCCTGGGCATCGAGTCGATGTTCCAGCTCGTCGAGGCGTGGTGCGTGAAGCAGGGACTCGCGGCGCGGCACGGCATCGCTCACCCAGTGTTCGCGCACGCGCCCGGGGCCACGAGCTGGAAGTACCGCGGGCAGCTAACCCCCAAGAACGACCGCATGGACAGCGAGGTGCACATCAAGTCGGTGGCGGCCTTCTCCTCCTGGGTCGACGTCGTCGCGGACGGGTTCCTCTTCGTCGACGGCCTCCGCGTCTACTCGGCAGACAACCTCCGCGTCCGCATCCAGACCGGCGCCGGCCACGTTGAAGAGCAAGAGGTTGCTGCCAAGGCCACAACCAAGAACAGCAGTATTGCTGATGTGGACGTGGCGGACCTGCAAGCGCTCAAGCAGGCGTTGCTGACGCTGGAGCGACCGCTGCAGCTGGACGCGGGGAGCGAGGTGCCCGCCTGCGCGGTGAGCGACCTGGGCGATAGGGGCTTCATGGAGACGTACGGGGTGGTGGCGCCGCTGTACAGCGGGGCGATGGCCAAGGGCATCGCGTCGGCGGACCTGGTGATCGCGATGGGCCAGCGCAAGATGCTGGGGTCGTTTGGCGCGGGCGGGCTCCCGATGCACGTCGTGCGCGCGGGGATTGAGAAGATCCAGGCAGCGCTGCCAGCGGGGCCATACGCGGTCAACCTGATTCACTCGCCTTTTGACGCCAACCTGGAGAAGGGCAACGTGGACCTCTTCCTGGAGAAGGGCGTGCGCGTCGTGGAGGCGTCGGCCTTCATGGAGCTCACGCCCCAGGTGGTGCGCTACCGCGCGACGGGCCTCTCTCGCGACGCGCGCGGCGGCTCCGTGCGCACGGCCCACAAGATCATCGGCAAGGTCAGCCGCACCGAGCTGGCCGAGATGTTTATCCGGCCCGCGCCGCAAGCCATTCTCGACAAGCTTGTGGCGTCCGGCGAGATCACCCCCGAGCAGGCGGCGCTGGCGCTCGAGGTGCCCATGGCGGACGACATCGCCGTCGAGGCCGATTCGGGCGGGCACACCGACAACCGCCCCATCCACGTCATCCTGCCCCTCATCCTCAGCCTGCGCAACCGCCTCCAGCGCGAGCTCAAGTACCCTGCGCGACACCGCGTGCGCGTCGGCGCCGGGGGCGGCATCGGGTGCCCGCAAGCGGCTCTGGGCGCCTTCCACATGGGCGCCGCGTTTGTGGTGACGGGCACGGTCAACCAGCTGAGCCGGCAGGCCGGGACATGCGACAATGTGCGGCGGCAGCTGTCGCGCGCGACGTACTCGGACATCACGATGGCGCCGGCGGCGGACATGTTCGAGCAGGGCGTCGAGCTGCAGGTGCTCAAGAAGGGCACGATGTTTCCCTCGCGCGCCAAGAAGCTGTTCGAGCTGTTTCACAAGTACGACTCGTTCGAGGCGATGCCGGCGGACGAGCTGGCGCGCGTCGAGAAGCGCATCTTCAGCAAGTCACTCGCCGAGGTGTGGGCCGAGACCAAGGACTTCTACATCACGCGGCTCAACAACCCGGAGAAGATCCGCAAGGCGGAGAACGAGGACCCCAAGCTCAAGATGTCACTCTGCTTCCGCTGGTACCTCGGGCTCAGCTCGTTCTGGGCCAACAACGGCATCGCGGACCGCACGATGGACTACCAGATCTGGTGCGGCCCTGCCATCGGCGCCTTCAACGACTTCATCGCCGACTCGTACCTCGACGTGGCCGTCTCGGGCGAGTTCCCCGACGTCGTGCAGATCAACCTGCAGATCCTGTCGGGCGCAGCCTACCTCCAGCGCCTCCTCTCCGTCAAGCTCGCACCGCGGATCGACGTCGACACCGAGGACGACCTCTTCACCTACCGC

CCCGACCACGCACTCTAA

SEQ ID NO: 9 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера оптимизированного гена растения PFA3, указанного в описании настоящей патентной заявки, как PFA3 v2:

ATGACATCTTCAAAGAAAACTCCTGTTTGGGAAATGAGCAAGGAAGAGCTGTTGGATGGCAAGACGGTTGTCTTTGACTACAACGAGCTGTTGGAGTTTGCGGAGGGTGATGTTGGTCAAGTGTTTGGACCAGAGTTTGACATCATTGACAAGTACAGAAGGCGTGTGAGGCTTCCAGCCAGAGAATACTTGCTTGTTTCAAGAGTGACTCTCATGGATGCCGAGGTGAATAACTTCAGAGTTGGCTCCAGAATGGTCACTGAGTATGATGTTCCAGTCAATGGTGAGTTGTCAGAGGGAGGTGATGTTCCCTGGGCAGTTCTTGTTGAAAGTGGGCAGTGTGACTTGATGCTCATCTCCTACATGGGGATTGACTTCCAGTGCAAAGGGGACCGTGTTTACAGATTGCTCAACACATCTCTCACCTTCTTTGGGGTTGCCCATGAAGGAGAAACCCTTGTGTATGACATCAGAGTCACTGGTTTCGCCAAGGGTGCTGGTGGGGAAATCTCAATGTTCTTTTTCGAGTATGACTGCTTTGTTGATGGCAGATTGCTCATAGAGATGAGAGATGGTTGTGCTGGCTTCTTTACTGATGCCGAACTTGCCGCTGGAAAAGGTGTGCTCAAAACGAAGGCTGAGCTTGCTGCACGTGCTCAGATCCAGAAACAAGACATTGCACCCTTTGCACCTGCACCGTGCAGTCACAAAACCAGCTTGGATGCCAGAGAAATGAGACTGCTTGTTGATAGGCAATGGGCAAGGGTCTTTGGTTCTGGAATGGCTGGCATAGACTACAAGTTGTGTGCGAGAAAGATGCTGATGATTGACAGAGTCACACACCTTGATCCGCGTGGAGGTGCTCACGGTCTTGGGCTTCTCATTGGGGAGAAAGTGCTTGAGAGGGACCACTGGTACTTCCCCTGCCACTTTGTGAGGGATGAGGTCATGGCTGGTTCTCTTGTCTCAGATGGATGCTCTCAGCTTCTCAAGGTTTACATGTTGTGGCTTGGCCTTCACACCACTGTTGGTGCGTTCGACTTTCGTCCAGTCAGTGGTCATGCCAACAAAGTGAGGTGTCGTGGACAGATTTCACCGCACAAGGGGAAACTTGTTTATGTCATGGAGATCAAAGAAATGGGCTTTGATGCCAAAACTGGAGATCCATTTGCCATAGCTGATGTTGACATCATTGATGTCAACTTTGAAGAGGGACAAGCGTTTGCTGGAGTTGAGGATCTTCACAGCTATGGCCAAGGAGATTTGAGGAAAAAGATAGTTGTGGATTTCAAGGGAATTGCGTTGTCACTGCAGAAAAGGAAGGAGCAACAGAAAGAGAGCATGACTGTCACCACTACGACCACGACAACCAGCAGAGTGATTGCTCCTCCAAGTGGATGCCTCAAAGGTGATCCCACTGCTCCCACCTCTGTCACGTGGCATCCAATGGCTGAGGGAAATGGAGGTCCTGGACCCACTCCGTCCTTCTCTCCTTCAGCGTATCCTCCCAGAGCTGTTTGCTTCTCTCCTTTCCCCAACAATCCGCTTGACAATGATCATACACCTGGCCAAATGCCGTTGACCTGGTTCAACATGTCTGAGTTCATGTGTGGAAAAGTGAGCAACTGCTTGGGTCCTGAGTTTGCCAGATTTGATGCTTCCAAGACATCCAGATCACCAGCTTTTGACCTGGCTCTTGTGACAAGGGTGACGAGTGTGGCTGACATGGAACATGGTCCTTTCTACAATGTGGATGTCAACCCTGGCCAAGGCACGATGGTGGGTGAGTTTGATTGTCCTGCAGATGCTTGGTTCTTTGGAGCCTCAAGCAGAGACGATCACATGCCGTACAGCATCTTGATGGAGATTGCTCTTCAGACTTCTGGAGTCCTCACATCTGTGCTCAAAGCTCCGCTCACAATGGACAAAGATGACATCCTTTTCAGAAACCTTGATGCAGATGCAGAACTTGTGGGTGATGCCATGCCTGATGTCAGAGGGAAAACCATAAGGAACTTCACCAAATGCACGGGATACTCCATGCTTGGCAAGATGGGAATCCATCGTTTCACCTTCGAACTCTCTGTTGACGGAGCAGTTTTCTACAAAGGGAGCACCTCTTTTGGTTGGTTTGTTCCTGAGGTCTTTGAGAGCCAGACTGGATTGGACAATGGCAAGCCGAGGTTGCCTTGGTATAGGGAAAACAATGTGGCAGTGGACACACTCTCAGCACCTGCGTCAGCTTCTAGTGCCCAAGGTCAGCTTCAGCTTCAGAGGAGAGGGTCACAAGCGCAGTTCCTGGACACAATTCATCTTGCTGGGAGTGGAGCTGGAGTGCATGGCCAAGGTTATGCTCATGGGGAGAAAGCTGTGAACAAGCAAGATTGGTTCTTTTCTTGCCATTTCTGGTTTGACCCAGTGATGCCTGGGTCTTTGGGAATTGAGTCCATGTTCCAGCTTGTGGAAGCGTGGTGTGTCAAACAAGGCTTGGCTGCAAGGCATGGAATTGCTCATCCAGTCTTTGCACATGCACCTGGTGCCACCAGCTGGAAGTACAGAGGTCAGTTGACCCCAAAGAATGACAGAATGGACAGTGAAGTTCACATCAAGAGTGTTGCTGCCTTCTCCTCATGGGTTGATGTGGTTGCTGATGGGTTCCTCTTCGTTGATGGCCTCAGAGTCTATTCAGCAGACAACCTGAGGGTCAGAATCCAGACTGGAGCTGGCCATGTTGAAGAGCAAGAAGTTGCTGCCAAAGCCACCACAAAGAACTCCAGCATTGCTGATGTGGATGTGGCTGATCTTCAAGCTCTCAAACAAGCGTTGCTGACACTGGAGAGACCATTGCAGTTGGATGCTGGAAGTGAGGTGCCAGCCTGTGCTGTCAGCGATTTGGGAGACCGTGGATTCATGGAGACTTATGGGGTGGTTGCTCCGTTGTACAGTGGTGCGATGGCCAAGGGAATAGCCTCTGCGGATCTGGTCATAGCAATGGGTCAGAGGAAGATGTTGGGGAGCTTTGGAGCTGGTGGGTTGCCAATGCACGTTGTCCGTGCTGGGATTGAAAAGATCCAAGCTGCACTTCCCGCTGGTCCGTATGCTGTCAACCTCATCCACTCACCGTTCGATGCCAACCTGGAAAAGGGCAATGTTGATCTTTTCCTGGAAAAGGGAGTTCGTGTGGTTGAGGCGTCTGCCTTCATGGAACTCACACCACAAGTGGTCCGTTACAGAGCCACGGGACTCTCCAGAGATGCGAGAGGTGGCTCAGTGAGGACAGCACACAAGATCATAGGAAAGGTTTCCAGAACAGAGCTTGCGGAGATGTTCATCAGACCTGCACCTCAAGCAATTCTGGACAAACTTGTTGCGTCTGGTGAAATCACCCCTGAGCAAGCTGCGTTGGCTCTTGAAGTTCCAATGGCTGATGACATTGCAGTTGAGGCTGACAGTGGAGGGCACACTGACAACCGTCCCATTCATGTCATTCTGCCGTTGATCCTCAGTCTGAGGAATAGGCTCCAGAGGGAACTCAAGTACCCTGCCAGACACCGTGTTAGGGTTGGTGCTGGTGGAGGCATAGGTTGTCCTCAAGCTGCACTTGGAGCCTTCCACATGGGAGCTGCGTTTGTTGTGACTGGCACTGTCAACCAGCTGTCCCGTCAAGCTGGAACATGTGACAACGTGAGGCGTCAGCTCTCTCGTGCCACTTACTCTGACATCACGATGGCACCAGCTGCAGACATGTTTGAACAAGGAGTTGAACTGCAAGTTCTCAAGAAAGGAACGATGTTCCCATCTCGTGCCAAGAAACTCTTTGAACTGTTCCACAAGTATGATTCCTTTGAAGCAATGCCTGCGGATGAATTGGCTCGTGTTGAGAAGAGGATCTTCTCCAAGTCCCTTGCAGAAGTTTGGGCAGAGACCAAAGATTTCTACATCACTCGTCTCAACAATCCTGAAAAGATCAGAAAGGCTGAGAATGAGGACCCCAAGCTCAAGATGTCCCTCTGCTTCCGTTGGTACTTGGGTCTCAGCTCATTCTGGGCAAACAATGGCATAGCTGACCGTACGATGGATTACCAGATTTGGTGTGGACCTGCCATAGGAGCCTTCAACGATTTCATTGCAGACAGCTATCTTGATGTTGCAGTCTCTGGTGAGTTCCCTGATGTTGTGCAGATCAACCTTCAAATCCTGTCTGGTGCTGCGTATCTCCAGAGATTGCTCAGTGTCAAACTTGCACCAAGGATAGATGTGGACACTGAAGATGACCTCTTCACCTACAGA

CCAGATCATGCACTCTGA

SEQ ID NO: 10 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера гена HetI:

ATGCTTCAGCACACTTGGCTTCCGAAGCCTCCCAATCTGACCCTCTTGTCAGATGAGGTTCATCTCTGGAGGATTCCTCTTGACCAGCCTGAGTCACAACTTCAAGACCTTGCTGCCACCCTGAGCAGTGATGAATTGGCGAGGGCAAACAGATTCTACTTTCCAGAACACAGAAGGCGTTTCACTGCTGGGAGAGGCATCCTCAGATCCATCTTGGGTGGATACTTGGGAGTGGAACCGGGTCAAGTCAAGTTTGATTATGAGTCCCGTGGGAAACCGATCCTTGGTGACAGATTTGCTGAGAGTGGACTCCTGTTCAACTTGTCTCACAGCCAGAACCTTGCCTTGTGTGCTGTCAACTACACGCGTCAAATAGGCATTGATCTTGAATATCTGCGTCCAACATCTGACTTGGAGTCTCTTGCAAAGAGGTTCTTTCTCCCAAGAGAATATGAACTCTTGAGGTCACTCCCTGATGAGCAGAAACAGAAGATTTTCTTTCGTTACTGGACTTGCAAAGAGGCTTATCTCAAAGCAACGGGAGATGGAATAGCCAAACTTGAAGAGATCGAGATAGCACTCACCCCAACAGAACCTGCCAAGCTCCAAACAGCTCCTGCGTGGTCTCTGTTGGAGCTTGTGCCAGATGACAATTGTGTT

GCAGCTGTGGCTGTTGCGGGTTTTGGTTGGCAGCCCAAGTTCTGGCATTACTGA

SEQ ID NO: 11 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера гена SzACS2, выделенного из Schizochytrium ATCC Accession No. 20888:

ATGGCTCCCACTCCCGACGCCACCGCGCCTCTGAACAAGCCGAGCGACTATGCCGTCTACCACGAGGAAGACGGCCCCTTCTGGACCGCCGATTCCAGCGGCGTCTCGCGCGTGAACTTTAGCGAGACCGGCGTGGGATCCGAGGGCGTCATCCCTGCGCTCACGCTCATCGACGTCTTCGAGAGGGCCGTCAAGCGCGGCGGAAACAGGATCGCCTTCCGCACGGAAAACATGCCCACGCTCCGCCGCGGCGAAGAGGCCCCGGACGCGCTGCCGCTCAAGGACTGGAAGTCCTGGTCCTGGAAACAGTACAAGGCCGACGTCCACCGCATCGCCAGGGCTCTCATGGACCTCGGCGTTGAGCAGCATGACGCCGTCTCCATTTTTGGCTTTAACTCGCCCGAATGGTTTCTCAGTGCCGTCGGCGCCGTGCACGCAGGTGCCAAGATTGCCGGCATTTACCCCTCAGACACGCCCGCCCAGGTCCAGTACAAGGCCTTCCACAGTGACACCGCTGTTGCCGTTGTCGAAAACGAGCAGTGCTTCAAGAAGTTCGCCGAGGTCGTCGAGGACCTTCCTTACCTCAAGGCCATTGTTTGCTGGGACTATGAAGCCACAGACATCACGCGCGAGGACGGCTCCGTCGTCGAGGTCCTCACCTTTGCCGAGTTCCTCAAGCGCGGCGACACCGTCGAGGCGGCCGCCCTTGACGAGCGCATCTCCAAGATCGAGCCCACCATGTGCGCTGCCCTTATTTACACCAGCGGTACTACCGGCCGCCCCAAGGCCGTTATGATTTCGCACGACAACCTTGTTTTCGAGGCCAGCGCCGTCGTCCCCAACCTCGGAGGAGCCTGTACGACCACTGCTGAGGAGCGCATTCTCTCGTACCTGCCTCTCTCGCACGTCGCTGGTATGATGGTTGATATTATTGCCCCCATCATTGCCACCGCCTTCCACAAGGGCCGCATCTGCGTCTGCTTTGCTCGCCCGTACGATTTGCGCACCGGCACGCTGGGCCAGCGCCTCAACGCCGTGGAGCCCACCATCTTCCTTGGCGTGCCCCGTGTGTGGGAAAAGATTCAGGAAAAGCTCATGGCCGTCGGTGCCAAAACCACCGGCCTCAAGAAGAAGCTCTCTACGGCCGCCAAGAAGCGTGGTCTTGAATTCCAGGAGGAGCAGCAAATCGGCCGCTCCGGTGCCAACCCTGGCTTTGGCCCCCTTGGCATCTACAAGAAGCTCCTCGGCCTCATCAAGGGCAAGCTGGGCCTCACCAAGTGCAAGTTTGCCTTTGCTGGTGCCGCGCCCATGACCCGTGAGACCCTTCAGTACTTTGGCGCGCTGAACATCAACATTAACGAGGTCTACGGCATGTCCGAGTGCTCCGGTGCCGCCACCTGGTCCACGGACAAGGCCCACGAGTGGGGCACTGTTGGCTACGAGATGCCCAGTTGCGAGGTCCGCGTCTTCAAGATTGCCGAGGACGGTACCAAGACCGAGTGCCCGCGCGCCGCCGACATTATGCATGCTACCGAGGAGGAGCAGGGCGAAGTTTGCTTCCGCGGCCGTAACATCATGATGGGCTACCTTGCCAACCCCAAGCTTGGCGACGACCACGTTGCCGAGATCGAGGAGAAGAACGCTGCCGCTATCGACTCCGAGGGCTGGCTCCACAGTGGTGATAAGGGCGCCATTTCTACCCGCGGCATGCTCAAGATCACGGGCCGCTACAAGGAGCTCATCATCGGCGCCGGTGGCGAGAACGTGGCGCCCGTCCCTATTGAGGACGCCATCAAGGCGCGCATGCCTTTTGTTTCCAACGCCATGATGGTCGGAGATAAGCGCAAGTTCATGGCTGTCCTCCTTACCCTCAAGACGGTTGGCGCCACGGGCGAGCTTCCCGGTACGAACAAGCTCATGGGCGCTGCCGCCGACTATGGTGAGACCATCGAGGACGCCTGCGACAACGAGGCGCTCATTGAGGAGATCACGCAGCAGCTCAAGGAGATCGGTGATGATGGCGATGTCACGCCCTCGAACGCGGCTCGCATCCAAAAGTTCACCATTCTCCCGCTCGACTTTTCCGTCTCCACGGACGAGCTCACGGCCACGCTCAAGCTCAAGCGCTCCGTGGTCGCAGACAAGTACGAAGACATCATCGAGGCCTTTTACGAGTCCAAGAGCGTTTTTGTGCCGTACTCGACCGTTGGCGCCTACGCCACGGGCGGCCCGGTCGACGACTCCGTTGTCGATGGCTCCTTCAAGGGCGACTTTAGCATGATTGGCGACGATGATCCGGATCTTCAAAAC

GTCGATGTCCTCGAGGCGATTGACGAGGACAATTAA

SEQ ID NO: 12 - нуклеотидная последовательность полинуклеотида рандоминизированного «спейсера», который использован в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения.

SEQ ID NO: 13 - нуклеотидная последовательность приведенного в качестве примера 5ʹукороченного гена PFA3, указанного в описании настоящей патентной заявки, как PFA3 v3:

ATGAGCAAGGAGGAGCTGCTGGACGGCAAGACGGTGGTCTTCGACTACAACGAGCTGCTCGAATTCGCCGAGGGCGACGTGGGCCAAGTGTTCGGACCCGAGTTCGACATCATCGACAAGTACCGGCGTCGCGTGCGGCTGCCGGCGCGCGAGTACCTGCTCGTGTCGCGCGTGACGCTGATGGACGCCGAGGTGAACAACTTCCGCGTCGGGTCGCGCATGGTGACCGAGTACGACGTGCCCGTGAACGGGGAGCTGTCGGAGGGCGGGGACGTGCCGTGGGCGGTGCTGGTGGAGTCGGGGCAGTGCGACCTGATGCTCATCTCGTACATGGGCATCGACTTCCAGTGCAAGGGCGACCGCGTGTACCGCCTGCTCAACACATCGCTCACCTTCTTCGGGGTGGCGCACGAGGGCGAGACGCTGGTGTACGACATCCGCGTCACGGGGTTCGCCAAGGGCGCGGGCGGGGAGATCTCGATGTTCTTCTTCGAGTACGACTGCTTCGTGGACGGCCGCCTGCTGATCGAGATGCGCGACGGGTGCGCCGGGTTCTTCACGGACGCCGAGCTGGCCGCCGGCAAGGGCGTGCTTAAGACCAAGGCGGAGCTGGCGGCGCGCGCGCAGATCCAGAAGCAGGACATCGCGCCCTTTGCGCCGGCGCCGTGCTCGCACAAGACCTCGCTGGACGCGCGCGAGATGCGGCTGCTCGTGGACCGCCAGTGGGCGCGCGTCTTCGGCAGCGGCATGGCGGGCATCGACTACAAGTTGTGCGCTCGCAAGATGCTCATGATCGACCGCGTCACGCACCTCGACCCGCGCGGCGGCGCGCACGGCCTCGGGCTGCTGATCGGGGAGAAGGTGCTGGAGCGCGACCACTGGTACTTCCCCTGCCACTTTGTGCGCGACGAGGTGATGGCCGGGTCGCTGGTCAGCGACGGCTGCTCGCAGCTCCTCAAGGTGTACATGCTGTGGCTCGGCCTGCACACGACCGTGGGCGCGTTCGACTTTCGTCCCGTGAGCGGGCACGCCAACAAGGTGCGGTGCCGCGGGCAGATCTCACCGCACAAGGGCAAGCTCGTGTACGTGATGGAGATCAAGGAAATGGGCTTTGACGCGAAGACGGGCGATCCGTTTGCGATCGCGGACGTGGACATCATCGACGTCAACTTCGAGGAGGGACAGGCGTTTGCGGGAGTGGAAGACCTGCACAGCTACGGCCAGGGCGACCTCCGCAAGAAGATCGTCGTCGACTTCAAGGGCATCGCGCTCTCCCTGCAGAAGCGGAAGGAGCAGCAGAAGGAAAGCATGACCGTGACTACGACGACGACGACGACGAGCCGGGTGATTGCGCCGCCCAGCGGGTGCCTCAAGGGCGACCCGACGGCGCCGACGAGCGTGACGTGGCACCCGATGGCGGAGGGCAACGGCGGGCCCGGACCGACGCCGTCGTTCTCGCCGTCCGCGTACCCGCCGCGGGCGGTGTGCTTCTCGCCGTTCCCCAACAACCCGCTTGACAACGACCACACGCCGGGCCAGATGCCGTTGACCTGGTTCAACATGTCCGAATTCATGTGCGGCAAAGTGTCCAACTGCCTGGGCCCCGAGTTTGCGCGCTTCGACGCGAGCAAGACGAGCCGCAGCCCGGCCTTTGACCTGGCGCTCGTGACGCGGGTGACGAGCGTGGCGGACATGGAGCACGGGCCGTTCTACAACGTGGACGTCAACCCGGGCCAGGGCACGATGGTGGGCGAGTTCGACTGTCCCGCGGACGCGTGGTTCTTCGGCGCCTCGAGCCGCGACGACCACATGCCGTACTCGATCCTGATGGAGATCGCGCTGCAGACGTCGGGCGTCCTCACCTCGGTGCTCAAGGCGCCGCTGACGATGGACAAGGACGACATCCTCTTCCGCAACCTCGACGCAGACGCCGAGCTCGTGGGCGACGCCATGCCGGACGTGCGCGGCAAGACGATCCGCAACTTCACCAAGTGCACAGGCTACAGCATGCTCGGCAAGATGGGCATCCACCGCTTCACCTTTGAGCTCAGCGTCGACGGCGCCGTCTTCTACAAGGGCAGCACCTCGTTTGGCTGGTTCGTCCCCGAGGTCTTCGAGTCGCAGACCGGTCTCGACAACGGCAAGCCGCGCCTGCCTTGGTACCGCGAGAACAACGTCGCCGTCGACACGCTCTCCGCGCCCGCCTCCGCTTCCTCCGCGCAAGGTCAGCTGCAGCTGCAGCGACGCGGGTCGCAGGCGCAGTTCCTGGACACAATCCACCTGGCGGGCAGCGGCGCCGGCGTGCACGGCCAGGGCTACGCGCACGGGGAGAAGGCCGTGAACAAGCAAGATTGGTTCTTCTCGTGCCACTTCTGGTTCGACCCCGTGATGCCCGGGTCCCTGGGCATCGAGTCGATGTTCCAGCTCGTCGAGGCGTGGTGCGTGAAGCAGGGACTCGCGGCGCGGCACGGCATCGCTCACCCAGTGTTCGCGCACGCGCCCGGGGCCACGAGCTGGAAGTACCGCGGGCAGCTAACCCCCAAGAACGACCGCATGGACAGCGAGGTGCACATCAAGTCGGTGGCGGCCTTCTCCTCCTGGGTCGACGTCGTCGCGGACGGGTTCCTCTTCGTCGACGGCCTCCGCGTCTACTCGGCAGACAACCTCCGCGTCCGCATCCAGACCGGCGCCGGCCACGTTGAAGAGCAAGAGGTTGCTGCCAAGGCCACAACCAAGAACAGCAGTATTGCTGATGTGGACGTGGCGGACCTGCAAGCGCTCAAGCAGGCGTTGCTGACGCTGGAGCGACCGCTGCAGCTGGACGCGGGGAGCGAGGTGCCCGCCTGCGCGGTGAGCGACCTGGGCGATAGGGGCTTCATGGAGACGTACGGGGTGGTGGCGCCGCTGTACAGCGGGGCGATGGCCAAGGGCATCGCGTCGGCGGACCTGGTGATCGCGATGGGCCAGCGCAAGATGCTGGGGTCGTTTGGCGCGGGCGGGCTCCCGATGCACGTCGTGCGCGCGGGGATTGAGAAGATCCAGGCAGCGCTGCCAGCGGGGCCATACGCGGTCAACCTGATTCACTCGCCTTTTGACGCCAACCTGGAGAAGGGCAACGTGGACCTCTTCCTGGAGAAGGGCGTGCGCGTCGTGGAGGCGTCGGCCTTCATGGAGCTCACGCCCCAGGTGGTGCGCTACCGCGCGACGGGCCTCTCTCGCGACGCGCGCGGCGGCTCCGTGCGCACGGCCCACAAGATCATCGGCAAGGTCAGCCGCACCGAGCTGGCCGAGATGTTTATCCGGCCCGCGCCGCAAGCCATTCTCGACAAGCTTGTGGCGTCCGGCGAGATCACCCCCGAGCAGGCGGCGCTGGCGCTCGAGGTGCCCATGGCGGACGACATCGCCGTCGAGGCCGATTCGGGCGGGCACACCGACAACCGCCCCATCCACGTCATCCTGCCCCTCATCCTCAGCCTGCGCAACCGCCTCCAGCGCGAGCTCAAGTACCCTGCGCGACACCGCGTGCGCGTCGGCGCCGGGGGCGGCATCGGGTGCCCGCAAGCGGCTCTGGGCGCCTTCCACATGGGCGCCGCGTTTGTGGTGACGGGCACGGTCAACCAGCTGAGCCGGCAGGCCGGGACATGCGACAATGTGCGGCGGCAGCTGTCGCGCGCGACGTACTCGGACATCACGATGGCGCCGGCGGCGGACATGTTCGAGCAGGGCGTCGAGCTGCAGGTGCTCAAGAAGGGCACGATGTTTCCCTCGCGCGCCAAGAAGCTGTTCGAGCTGTTTCACAAGTACGACTCGTTCGAGGCGATGCCGGCGGACGAGCTGGCGCGCGTCGAGAAGCGCATCTTCAGCAAGTCACTCGCCGAGGTGTGGGCCGAGACCAAGGACTTCTACATCACGCGGCTCAACAACCCGGAGAAGATCCGCAAGGCGGAGAACGAGGACCCCAAGCTCAAGATGTCACTCTGCTTCCGCTGGTACCTCGGGCTCAGCTCGTTCTGGGCCAACAACGGCATCGCGGACCGCACGATGGACTACCAGATCTGGTGCGGCCCTGCCATCGGCGCCTTCAACGACTTCATCGCCGACTCGTACCTCGACGTGGCCGTCTCGGGCGAGTTCCCCGACGTCGTGCAGATCAACCTGCAGATCCTGTCGGGCGCAGCCTACCTCCAGCGCCTCCTCTCCGTCAAGCTCGCACCGCGGATCGAC

GTCGACACCGAGGACGACCTCTTCACCTACCGCCCCGACCACGCACTCTAA

SEQ ID NO: 14 - аминокислотная последовательность приведенного в качестве примера 5ʹ усеченного белка PFA3 (PFA3v3):

MSKEELLDGKTVVFDYNELLEFAEGDVGQVFGPEFDIIDKYRRRVRLPAREYLLVSRVTLMDAEVNNFRVGSRMVTEYDVPVNGELSEGGDVPWAVLVESGQCDLMLISYMGIDFQCKGDRVYRLLNTSLTFFGVAHEGETLVYDIRVTGFAKGAGGEISMFFFEYDCFVDGRLLIEMRDGCAGFFTDAELAAGKGVLKTKAELAARAQIQKQDIAPFAPAPCSHKTSLDAREMRLLVDRQWARVFGSGMAGIDYKLCARKMLMIDRVTHLDPRGGAHGLGLLIGEKVLERDHWYFPCHFVRDEVMAGSLVSDGCSQLLKVYMLWLGLHTTVGAFDFRPVSGHANKVRCRGQISPHKGKLVYVMEIKEMGFDAKTGDPFAIADVDIIDVNFEEGQAFAGVEDLHSYGQGDLRKKIVVDFKGIALSLQKRKEQQKESMTVTTTTTTTSRVIAPPSGCLKGDPTAPTSVTWHPMAEGNGGPGPTPSFSPSAYPPRAVCFSPFPNNPLDNDHTPGQMPLTWFNMSEFMCGKVSNCLGPEFARFDASKTSRSPAFDLALVTRVTSVADMEHGPFYNVDVNPGQGTMVGEFDCPADAWFFGASSRDDHMPYSILMEIALQTSGVLTSVLKAPLTMDKDDILFRNLDADAELVGDAMPDVRGKTIRNFTKCTGYSMLGKMGIHRFTFELSVDGAVFYKGSTSFGWFVPEVFESQTGLDNGKPRLPWYRENNVAVDTLSAPASASSAQGQLQLQRRGSQAQFLDTIHLAGSGAGVHGQGYAHGEKAVNKQDWFFSCHFWFDPVMPGSLGIESMFQLVEAWCVKQGLAARHGIAHPVFAHAPGATSWKYRGQLTPKNDRMDSEVHIKSVAAFSSWVDVVADGFLFVDGLRVYSADNLRVRIQTGAGHVEEQEVAAKATTKNSSIADVDVADLQALKQALLTLERPLQLDAGSEVPACAVSDLGDRGFMETYGVVAPLYSGAMAKGIASADLVIAMGQRKMLGSFGAGGLPMHVVRAGIEKIQAALPAGPYAVNLIHSPFDANLEKGNVDLFLEKGVRVVEASAFMELTPQVVRYRATGLSRDARGGSVRTAHKIIGKVSRTELAEMFIRPAPQAILDKLVASGEITPEQAALALEVPMADDIAVEADSGGHTDNRPIHVILPLILSLRNRLQRELKYPARHRVRVGAGGGIGCPQAALGAFHMGAAFVVTGTVNQLSRQAGTCDNVRRQLSRATYSDITMAPAADMFEQGVELQVLKKGTMFPSRAKKLFELFHKYDSFEAMPADELARVEKRIFSKSLAEVWAETKDFYITRLNNPEKIRKAENEDPKLKMSLCFRWYLGLSSFWANNGIADRTMDYQIWCGPAIGAFNDFIADSYLDVAVSGEFPDVVQINL

QILSGAAYLQRLLSVKLAPRIDVDTEDDLFTYRPDHAL

SEQ ID NOs: 15-38 - нуклеотидные последовательности нескольких плазмид, использованных в конкретных примерах, приведенных в описании настоящей патентной заявки.

СПОСОБ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Краткое описание нескольких вариантов воплощения настоящего изобретения

Классический путь синтеза LC PUFA в эукариотических организмах включает удлинение и десатурацию насыщенных или мононенасыщенных жирных кислот. Путь синтеза LC PUFA через синтазы PUFA очень отличается от классического пути. В частности, синтазы PUFA используют малонил-CoA в качестве источника углерода, и конечные PUFA продуцируются без выделения интермедиатов в каких-либо значительных количествах. Также во время синтеза синтазы PUFA добавляют соответствующие цис двойные связи при использовании механизма, не требующего кислорода. Например, NADPH может быть использован в качестве восстановителя во время цикла синтеза.

В описании настоящей патентной заявки приведены относительно недорогие композиции и способы эффективного и продуктивного получения длинно-цепочечных или более ненасыщенных PUFA (наряду с количеством липидов, например, TAG и PLs, которыми богаты такие PUFA) в растениях, семенах растений или маслах растений. Такие жирные кислоты и способы их получения применимы в различных контекстах, включая пищевое и промышленное применение. Система обеспечения и улучшения продуцирования PUFA в организмах-хозяевах (например, растениях) обеспечением рекомбинантных организмов-хозяев, генетически модифицированных системой синтаз PUFA (например, содержащих компоненты синтаз PUFA обнаруженных в морской водоросли траустохидриде Schizochytrium и фосфопантетеин трансферазы (HetI) из цианобактерий рода Nostoc, например, также содержащих 2 изозим ацил-CoA-синтетазу Schizochytrium), как приведено в описании настоящей патентной заявки, обеспечивает значительные положительные эффекты по сравнению с традиционными подходами получения этих жирных кислот.

Морская водоросль траустохидрид Schizochytrium (как представлено под ATCC Accession No. PTA 9695) продуцирует масло с высоким соотношением ω3/ω6, которая также может быть использована в качестве источников генов синтаз PUFA для трансформации культур. Дополнительно, Schizochytrium может продуцировать масло, содержащее значительные уровни EPA дополнительно к DHA. Способность продуцировать значительные количества EPA контрастирует с некоторыми другими штаммами Thraustochytrium (например, Schizochytrium sp. ATCC Accession No. 20888). Патент США, публикационный № US2013/0150599A1; международная заявка PCT публикационный № WO2013/016546. Система синтаз PUFA Schizochytrium может функционировать, когда они гетерологически экспрессированы в широкий ряд культивируемых растений, как показано в описании настоящей патентной заявки, при использовании в качестве примера: канолы, сои и модельного растения, арабидопсиса, для получения коммерчески значимых уровней ω3 LC PUFA (например, DHA и EPA). Соответственно, этот набор в генах может в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения позволяет получить значительно больше DHA и EPA, чем наборы генов других синтаз PUFA в растениях.

Также в описании настоящей патентной заявки приведена полезность различных конструкций конструктов, включая диверсификацию различных специфических промоторов и терминаторов семян, применение спейсерных элементов, изменение транскрипционно-активных ориентаций, различное относительное положение генов в T-ДНК, и применение нативных и модифицированных последовательностей генов. Эти конструкции конструктов могут быть использованы для дополнительного повышения количества продуцируемых LC PUFA в зафиксированных событиях, и наследуемости признака ω3 LC PUFA в последующих поколениях.

Приведенные в описании настоящей патентной заявки примеры канолы, сои, и арабидопсиса трансформируют векторами, несущими гены, кодирующие три полипептидных компонента синтаз PUFA (то есть, PFA1, PFA2 и PFA3) из водоросли траустохидриды Schizochytrium, вместе с фосфопантетеин трансферазой (HetI) из Nostoc. В некоторых примерах каждый из четырех генов содержится в одном конструкте под контролем специфических промоторов семян, и управляется множеством специфических промоторов семян различных конфигураций. В экспериментах по трансформации растений имели место события, когда содержались все четыре трансгена и экспрессировали все четыре полипептида в семенах. ω3 LC PUFA DHA и EPA продуцируются в липидах семян в результате трансгенных событий. Также были определены ω6 LC PUFA DPA. В событиях с канолой при валовом анализе T1 семян было выявлено содержание вплоть до 2,9% DHA и 1,0% EPA (3,9% общих ω3 LC PUFA) и 1,1% DHA+2,0% EPA. При проведении анализа только одного семени T1 семян в семенах канолы выявили вплоть до 4,6% DHA и 3,7% EPA. В случае сои было выявлено содержание вплоть до 1,9% DHA и 2,2% EPA при проведении анализа только одного семени T1 семян.

II. Аббревиатура

ACS ацетил- CoA-синтетаза

DGAT диацилглицерин ацилтрансфераза

DHA докозагексаеновая кислота

DPA докозапентаеновая кислота

EPA эйкозапентаеновая кислота

FAME сложный метиловый эфир жирной кислоты

HPLC высокоэффективная жидкостная хроматография

LC PUFA длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота

LPAT лизофосфатидил ацилтрансфераза

LPCAT лизофосфатидилхолин ацилтрансфераза

P1P2P3H PFA1, PFA2, и PFA3 гены, экспрессируемые при использовании HetI

P1P2P3H ACS PFA1, PFA2 и PFA3 экспрессируемые при использовании HetI и SzACS2

PDAT фосфолипид:диацилглицерин ацилтрансфераза

PL фосфолипид

PPTаза фосфопантетеин трансфераза

PTU единица транскрипции растения

PUFA полиненасыщенная жирная кислота

SzACS2 изозим 2 ацил-CoA-синтетаза Schizochytrium

TAG триглицерид

III. Термины

Обратное скрещивание: Для введения нуклеотидной последовательности в растение могут быть использованы способы обратного скрещивания. Технологию обратного скрещивания широко используют на протяжении десятилетий для введения новых признаков в растения. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. В типовом протоколе обратного скрещивания интересующую оригинальную разновидность (рекуррентный родитель) скрещивают со второй разновидностью (не рекуррентный родитель), которая несет интересующий для передачи ген. Далее полученный в результате этого скрещивания потомок снова скрещивают с рекуррентным родителем, процесс повторяют до получения растения, в котором по существу все заданные морфологические и физиологические характеристики рекуррентного растения восстановлены в трансформированном растении дополнительно к перемещенному гену из не рекуррентного родителя.

Выделенный: Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «выделенный» биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок), по существу отделенный, полученный из или очищенный от других биологических компонентов клетки организма, в которой компонент естественным образом присутствует (то есть другие хромосомные и экстра хромосомные ДНК и РНК, и белки), с осуществлением при этом химического или функционального изменения в компоненте (например, нуклеиновая кислота может быть выделена из хромосомы разрушением химических связей, соединяющих нуклеиновую кислоту с остальной ДНК в хромосоме). Молекулы нуклеиновой кислоты и белки, которые были «выделены» включают молекулы нуклеиновой кислоты и белки, очищенные при использовании стандартных способов очистки. Термин также включает в объем понятия нуклеиновые кислоты и белки, полученные рекомбинантной экспрессий в клетка-хозяине, наряду с химически синтезированными молекулами нуклеиновой кислоты, белками и пептидами.

Молекула нуклеиновой кислоты: Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «молекула нуклеиновой кислоты» может относиться к полимерной форме нуклеотида, которая может включать обе, и смысловую, и антисмысловую нити РНК, кДНК, геномной ДНК, синтетические формы и смешанные полимеры, указанные выше. Нуклеотид может относиться к рибонуклеотидам, дезоксирибонуклеотидам или модифицированной форме любого из типов нуклеотидов. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «молекула нуклеиновой кислоты» является синонимом «нуклеиновой кислоты» и «полинуклеотида». Если не указано иное, как правило, молекула нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 10 оснований в длину. Термин включает в объем понятия одно- и двухцепочечные нити ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может включать один или оба естественным образом присутствующие и модифицированные нуклеотиды, связанные вместе природными и/или не природными нуклеотидными связями.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы химически или биохимически или могут содержать не природные нуклеотидные основания или дериватизированные нуклеотидные основания, что легко понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Такие модификации включают, например, метки, метелирование, замещение одного или более природного нуклеотида аналогом, внутринуклеотидные модификации (например, ненагруженные связи: например, метил фосфат, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и тому подобное; нагруженные связи: например, фосфортиоаты, фосфордитиоаты и тому подобное; боковые функциональные группы (pendent moieties): например, пептиды; интеркалятор: например, акридин, псорален и тому подобное; хелаторы; алкиляторы; и модифицированные связи: например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и тому подобное). Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «молекула нуклеиновой кислоты» также включает в объем понятия любую топологическую конформацию, включая одноцепочечную конформацию, двухцепочечную конформацию, конформацию частичного дуплекса, триплекса, шпилечную конформацию, кольцевую конформацию и закрытую конформацию.

Функционально связанный: Первая нуклеотидная последовательность функционально связана со второй нуклеотидной последовательностью, где первая нуклеотидная последовательность находится в функциональной связи со второй нуклеотидной последовательностью. В случае, когда рекомбинантно полученные функционально связанные нуклеотидные последовательности соприкасаются, тогда необходимо соединить две кодирующие белок области в одной рамке считывания (например, полицистронная ORF). Однако нуклеиновые кислоты не обязательно должны быть соприкасающимися для того, чтобы быть функционально связанными.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «функционально связанный» при использовании в отношении регуляторной последовательности и кодирующей последовательности означает, что регуляторная последовательность воздействует на экспрессию связанной кодирующей последовательности. «Регуляторные последовательности» или «контрольные элементы» относится к нуклеотидным последовательностям, которые влияют на время и уровень/величину транскрипции, РНК процессинг или стабильность, или трансляцию, связанную с кодирующей последовательностью. Регуляторные последовательности могут включать промоторы; трансляцию лидерных последовательностей; интроны; энхансеры; структуры типа петля-на-стебле; последовательности-связывающий репрессор (repressor binding sequences); терминирующие последовательности; и последовательности узнавания полиаденелирования (polyadenylation recognition sequences). Конкретные регуляторные последовательности могут быть расположены выше и/или ниже кодирующей последовательности, функционально связанной с ними. Также конкретные регуляторные последовательности, функционально связанные с кодирующей последовательностью, могут быть расположены на связанной комплементарной цепи двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты.

Промотор: Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «промотор» относится к области ДНК, которая может располагаться выше начала транскрипции, и которая может быть вовлечена в узнавание и связывание РНК полимераз и других белков для инициирования транскрипции. Промотор может быть функционально связан с кодирующей последовательностью для экспрессии в клетке, или промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность, которая может быть функционально связана с кодирующей последовательностью для экспрессии в клетке. «Промотор растения» может представлять промотор, способный инициировать транскрипцию в клетке растения. Примеры промоторов, регулируемых развитием (under developmental control), включают промоторы, предпочтительно инициирующие транскрипцию в определенных тканях, таких как листья, корни, семена, волокна, сосуды ксилемы, трахеиды или склеренхима. Такие промоторы указываются, как «ткане-предпочтительные». Промоторы, которые инициируют транскрипцию только в определенных тканях, указываются, как «ткане-специфические». «Клетко-специфический» промотор инициирует экспрессию в клетках определенного типа в одном или более органе, например, сосудистых клетках корней или листьев. «Индуцируемый» промотор может представлять промотор, который может регулироваться окружающей средой (under environmental control). Примеры условий окружающей среды, которые могут инициировать транскрипцию индуцируемыми промоторами, включают анаэробные условия и присутствие света. Ткане-специфический, ткане-предпочтительный, клетко-специфический и индуцируемый промоторы составляют класс «не конститутивных» промоторов. «Конститутивный» промотор представляет промотор, который может быть активным в подавляющем большинстве клеток организма при подавляющем большинстве условий окружающей среды.

В вариантах воплощения настоящего изобретения может быть использован любой индуцируемый промотор. Смотрите, Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361 366. При использовании индуцируемого промотора уровень транскрипции увеличивается в ответ на индуцирующий агент. Приведенные в качестве примера индуцируемые промоторы включают без ограничения: промоторы из системы ACEI, которые отвечают на медь; In2 ген из кукурузы, который отвечает на антидоты к бензолсульфонамидным гербицидам; Tet репрессор из Tn10; и индуцируемый промотор из гена стериодного гормона, транскрипционная активность которых может быть индуцирована глюкокортикостероидным гормоном (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).

Приведенные в качестве примера конститутивные промоторы включают без ограничения: промоторы из вирусов растений, такие как 35S промотор из CaMV; промоторы из генов актина риса; промоторы убихитина; pEMU; MAS; гистонный промотор H3 кукурузы; и ALS промотор, Xba1/NcoI 5' фрагмент структурного гена ALS3 Brassica napus (или нуклеотидная последовательность, аналогичная таковой указанного Xba1/NcoI фрагмента) (International Patent Publication No. WO 96/30530).

Дополнительно в вариантах воплощения настоящего изобретения может быть использован любой ткане-специфический или ткане-предпочтительный промотор. Растения, трансформированные молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей кодирующую последовательность, функционально связанную с ткане-специфическим промотором, могут продуцировать продукт из кодирующей последовательности исключительно или предпочтительно в специфической ткани. Приведенные в качестве примера ткане-специфические или ткане-предпочтительные промоторы включают без ограничения: корень-предпочтительный промотор, такой как из гена фазеолина; лист-специфический и светоидуцируемый промотор, такой как из cab или rubisco; пыльник-специфический промотор, такой как из LAT52; пыльца-специфический промотор, такой как из Zm13; микроспоро-предпочтительный промотор, такой как apg, и семя-специфический промотор (например, промотор из PvDlec2, LfKCS3, FAE1, BoACP или BnaNapinC).

Гетерологичный: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «гетерологичный» относится к нуклеиновым кислотам (например, полинуклеотидам, ДНК, РНК и генам) и означает различного происхождения. Например, в случае, когда клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, не встречающейся в природе в нетрансформированной клетке-хозяине, в таком случае нуклеиновая кислота является гетерологичной (и экзогенной) по отношению к клетке-хозяину. Дополнительно, различные элементы (например, промотор, энхансер, кодирующая последовательность, терминатор и тому подобное) трансформирующей нуклеиновой кислоты могут быть гетерологичными друг к другу и/или к трансформированному хозяину. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин гетерологичный также может быть применен к одной или более нуклеиновой кислоте(ам), которая идентична последовательности нуклеиновой кислоты, уже присутствующей в клетке-хозяине, но которая в настоящий момент связана с различными дополнительными последовательностями и/или присутствует в различных копиях и тому подобное.

Нативный: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «нативный» относится к форме полинуклеотида или гену в его природной локализации в организме или в геноме организма в природе с его собственными регуляторными последовательностями, в случае их наличия.

Эндогенный: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «эндогенный» относится к полинуклеотидам, генам или полипептидам, которые расположены в организме или геноме, которые в норме содержит молекула в природе.

Трансформация: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «трансформация» или «трансдукция» относится к перемещению одной или более молекулы нуклеиновой кислот(ы) в клетку. Клетка, «трансформированная» при использовании молекулы нуклеиновой кислоты, преобразована в клетку, где молекула нуклеиновой кислоты становится стабильно реплицируемой клеткой, либо введена молекулой нуклеиновой кислоты в клеточный геном, либо при использовании липосомальной репликации. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «трансформация» включает в объем понятия все технологии, при использовании которых молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в такую клетку. Примеры включают без ограничения: трансфекцию вирусными клетками; трансформацию плазмидными векторами; электропорацию (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); lipofection (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); микроинъекцией (Mueller et al. (1978) Клетка 15:579-85); Agrobacterium mediated transfer (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); direct DNA uptake; and microprojectile bombardment (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

Трансген: экзогенная нуклеотидная последовательность, интегрируемая в геном хозяина. В некоторых примерах трансген может содержать регуляторные последовательности, функционально связанные с кодирующей последовательностью трансгена (например, промотор).

Вектор: молекула нуклеиновой кислоты, вводимая в клетку, например, для получения трансформированной клетки. Вектор может содержать нуклеотидные последовательности, которые позволяют ему реплицироваться в клетке-хозяине, как точка начала репликации. Примеры векторов включают без ограничения: плазмиду; космиду; бактериофаг или вирус, который несет экзогенную ДНК в клетку. Вектор может также содержать один или более ген, антисмысловую молекулу и/или селектируемый маркер генов и другие генетические элементы, известные из предшествующего уровня техники. Вектор может преобразовывать, трансформировать или инфицировать клетку, вызывая, таким образом, в клетке экспрессию молекул нуклеиновой кислоты и/или белков, кодируемых вектором. Вектор необязательно содержит материалы, способствующие проникновению молекулы нуклеиновой кислоты в клетку (например, липосома и белковая оболочка).

Экспрессия: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «экспрессия» может относиться к транскрипции и стабильному накоплению mРНК, кодируемой полинуклеотидом, или к трансляции такой mРНК в полипептид. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «сверхэкспрессия» относится к экспрессии, которая сильнее эндогенной экспрессии того же самого или близкородственного гена. Гетерологичный ген сверхэкспрессируется, если его экспрессия сильнее, чем близкородственного эндогенного гена (например, гомолог).

Экзогенный: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «экзогенный» относится к нуклеиновым кислотам (например, полинуклеотидам, ДНК, РНК и генам) одной или более нуклеиновой кислоте(ам), которые в норме не присутствуют в специфической среде или контексте. Например, если клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, не встречающейся в природе в нетрансформированной клетке-хозяине, в таком случае нуклеиновая кислота является экзогенной к клетке-хозяину. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин экзогенный также относится к одной или более нуклеиновой кислоте(ам), которая идентична последовательности нуклеиновой кислоты, уже присутствующей в клетке-хозяине, но которая расположена в различных клеточных или геномных контекстах, в отличие от нуклеиновой кислоты с той же последовательностью, уже присутствующей в клетке-хозяине. Например, нуклеиновая кислота, интегрируемая в геном клетки-хозяина в отличающейся локализации по сравнению с той же последовательностью, в норме интегрированной в геном клетки-хозяина, является экзогенной к клетке-хозяину. Дополнительно, нуклеиновая кислота (например, молекула ДНК), присутствующая в плазмиде или векторе в клетке-хозяине, является экзогенной к клетке-хозяину, когда нуклеиновая кислота с той же последовательностью только в норме присутствует в геноме клетки-хозяина.

Идентичность последовательности: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «идентичность последовательности» или «идентичность» в контексте двух из последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептидной последовательности может относиться к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми, когда выровнены для максимального соответствия в заданном окне сравнения выравнивания.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «процент идентичности последовательности» может относиться к показателю, определенному сравнением двух оптимально выровненных последовательностей (например, нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности) в окне сравнения, где часть последовательности в окне сравнения может содержать дополнения и удаления (то есть гэпы) по сравнению с контрольной последовательностью (которая не содержит дополнения и удаления) для оптимального выравнивая двух последовательностей. Процент рассчитывают определением числа позиций, при которых идентичный нуклеотид или аминокислотный остаток имеет место в обеих последовательностях, с получением числа совпавших позиций делением числа совпавших позиций на общее число позиций в окне сравнения и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательности.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Различные программы и алгоритмы выравнивая описаны, например в: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Детальное описание способов выравнивания последовательности и расчетов гомологии могут быть найдены, например, в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

Национальный центр информации по биотехнологии (The National Center for Biotechnology Information) (NCBI) Основное средство поиска локального выравнивания (Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST™; Altschul et al. (1990)) доступно в нескольких источниках, включая Национальный центр информации по биотехнологии (Bethesda, MD) и интернет, для использования применительно к нескольким программа анализа последовательностей. Описание определения идентичности последовательности при использовании этой программы доступно в интернете в BLAST™ через «help». Для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот может быть применена функция «Blast 2 sequences» (BLASTN) программы BLAST ™ с использованием параметров по умолчанию. Чем больше нуклеотидные последовательности схожи с контрольными последовательностями, тем больший процент идентичности они будут показывать при оценке этим методом.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «по существу идентичный» может относиться к нуклеотидным последовательностям, которые имеют более чем 85% идентичности. Например, по существу идентичная нуклеотидная последовательность может быть по меньшей мере на 85,5%; по меньшей мере на 86%; по меньшей мере на 87%; по меньшей мере на 88%; по меньшей мере на 89%; по меньшей мере на 90%; по меньшей мере на 91%; по меньшей мере на 92%; по меньшей мере на 93%; по меньшей мере на 94%; по меньшей мере на 95%; по меньшей мере на 96%; по меньшей мере на 97%; по меньшей мере на 98%; по меньшей мере на 99%; или по меньшей мере на 99,5% идентична контрольной последовательности.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения наличие гетерологичной нуклеиновой кислоты в растении может быть определено при использовании зонда нуклеиновой кислоты. Зонд может представлять молекулу ДНК или молекулу РНК. Зонды РНК могут быть синтезированны при использовании средств, известных из предшествующего уровня техники, например, при использовании матрицы молекулы ДНК. Зонд может содержать все или часть нуклеотидной последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты и дополнительную соприкасающуюся нуклеотидную последовательность из генома растения. В описании настоящей патентной заявки она указана, как «соприкасающийся зонд». Дополнительная соприкасающаяся нуклеотидная последовательность указана, как «выше» или «ниже» гетерологичной нуклеиновой кислоты, в зависимости от того, представляет ли соприкасающаяся нуклеотидная последовательность из хромосомы растения 5ʹ или 3ʹ конец гетерологичной нуклеиновой кислоты, как это обычно понимается. Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, процесс получения дополнительной соприкасающейся нуклеотидной последовательности для включения в зонд может повторяться почти неограниченно (ограничиваясь только длиной хромосомы), идентифицируя, таким образом, дополнительную нуклеиновую кислоту в хромосоме. В вариантах воплощения настоящего изобретения может быть использован любой или все из указанных выше вариантов зондов.

Зонд может содержать нуклеотидную последовательность, которая не соприкасается с таковой гетерологичной нуклеиновой кислоты; этот зонд указан в описании настоящей патентной заявки, как «несоприкасающийся зонд». Последовательность несоприкасающегося зонда расположена достаточно близко к последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты на хромосоме, таким образом несоприкасающийся зонд, как правило, генетически связан с гетерологичной нуклеиновой кислотой. Зонд также может быть определен, как точная копия гетерологичной нуклеиновой кислоты. Также зонд может быть определен, как молекула нуклеиновой кислоты, содержащую или состоящую из нуклеотидной последовательности, которая по существу идентична клонированному сегменту хромосомной ДНК, содержащейся в гетерологичной нуклеиновой кислоте.

Последовательность олигонуклеотидного зонда может быть получена синтетически или клонированием. Подходящие векторы клонирования хорошо известны специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Олигонуклеотидный зонд может быть меченым или не меченым. Существует множество разновидностей техник для мечения молекул нуклеиновой кислоты, включая, например, и без ограничений: введение радиоактивной метки при использовании ник-трансляции; случайное праймирование; наращивание «хвоста» терминальной дезокситрансферазой; и тому подобное, где используют меченые нуклеотиды, например, при использовании радиоактивного 32P. Другие метки, которые могут быть использованы, включают, например и без ограничений: флуорофор; ферменты; субстраты для ферментов; кофакторы ферментов; ингибиторы ферментов и тому подобное. В качестве альтернативы, применение метки, обеспечивающей обнаруживаемый сигнал, ее самой или совместно с другими реакционноспособными агентами может быть заменено лигандами, с которыми связываются рецепторы, где рецепторы метят (например, при использовании указанных выше меток) для обеспечения обнаруживаемых сигналов, либо ими самими либо совместно с другими реагентами. Смотрите, например, Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045 9.

Также зонд может быть определен, как молекула нуклеиновой кислоты, которая «по существу гибридизуема» или «специфически комплементарна» точной копии нуклеиновой кислоты («целевая ДНК»). Используемые в описании настоящей патентной заявки термины «по существу гибридизуемаʺ и «специфически комплементарна» указывают на достаточную степень комплементарности, таким образом, что происходит стабильное и специфическое связывание между молекулой нуклеиновой кислоты и целевой ДНК. Для того чтобы быть по существу гибридизуемой, молекула нуклеиновой кислоты должна быть на 100% комплементарной ее целевой последовательности. Молекула нуклеиновой кислоты по существу гибридизуема, когда она имеет достаточную степень комплементарности во избежание неспецифического связывания нуклеиновой кислоты с нецелевыми последовательностями при условиях, когда желательно специфическое связывание, например, в жестких условиях гибридизации.

В результате условия гибридизации, в частности по степени жесткости, будут варьировать в зависимости от природы выбранного способа гибридизации, композиции и длины гибридизуемых нуклеотидных последовательностей. Как правило, температура гибридизации и ионная сила (в частности концентрация Na+ и/или Mg++) буфера гибридизации будут определять жесткость условий гибридизации, также на жесткость условий гибридизации влияет время, через которое проводят промывку. Расчет условий гибридизации, необходимых для достижения конкретных степеней жесткости, известны специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение и описаны, например, в Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; and Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Более подробная инструкция и руководство по гибридизации нуклеиновых кислот могут быть найдены, например, в Tijssen, «Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays», in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; and Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley Interscience, NY, 1995.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «жесткость условий» включает в объем понятия условия, при которых гибридизаци я происходит только при наличии менее чем 25% неспаренностей между гибридизуемой молекулой и целевой ДНК. «Жесткость условий» включает дополнительные конкретные уровни жесткости. Следовательно, используемый в описании настоящей патентной заявки термин условия «средней (moderate) жесткости» относится к таковым, при которых молекулы с более чем 25% неспаренностей последовательности не гибридизованы; условия «умеренной (medium) жесткости» относятся к таковым, при которых молекулы с более чем 15% неспаренностей не будут гибридизоваться; и условия «высокой жесткости» относятся к таковым, при которых последовательности с более чем 10% неспаренностей не будут гибридизоваться. Условия «с очень высокой жесткостью» относятся к таковым, при которых последовательности с более чем 6% неспаренностей не будут гибридизоваться.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения жесткость условий - гибридизация при температуре 65°C в 6x цитратно-солевом (SSC) буфере, 5x растворе Денхардта, 0,5% SDS, и 100 μг ДНК измельченных молок лососевых рыб, с последующими последовательными промывками в течение 15-30 минут при температуре 65°C в 2x SSC буфере и 0,5% SDS, далее 1x SSC буфером и 0,5% SDS, и наконец 0,2x SSC буфером и 0,5% SDS.

В отношении всех приведенных выше зондов, зонд может содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, например, промоторы; сигналы транскрипции; и/или векторы последовательностей.

Оптимизированный: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «оптимизированная» нуклеиновая кислота, кодирующая белок, относится к нуклеиновой кислоте, где гетерологичная нуклеотидная последовательность была изменена для отображения сдвига кодонов целевого организма-хозяина. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нуклеотидная последовательность может быть дополнительно изменена для удаления генетических элементов, которые могут помешать генной экспрессии.

Следует понимать, что в виду избыточности генетического кода, множественные последовательности ДНК могут быть предназначены для кодирования одной аминокислотной последовательности. Следовательно, оптимизированные последовательности ДНК могут быть предназначены, например, для удаления излишних сайтов рестрикции и нежелательных вторичных структур РНК, оптимизируя при этом нуклеотидную последовательность кодирующей области, таким образом композиция кодона напоминает полную композицию кодона хозяина, в которой экспрессируется ДНК. Руководство, относящееся к конструированию и получению синтетических последовательностей ДНК, может быть найдено, например, в Международных патентных заявках International Patent Application №№ WO2013016546, WO2011146524, и WO1997013402; и патентах США № 6,166,302 and 5,380,831,

Консервативная замена: Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «консервативная замена» относится к замене, при которой аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком того же класса. Неконсервативная аминокислотная замена происходит, когда остатки не совпадают по классам, например, замена основной аминокислоты на нейтральную или не полярную аминокислоту. Классы аминокислот, которые могут быть определены для целей осуществления консервативной замены, известны из предшествующего уровня техники.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения консервативная замена включает замену первой алифатической аминокислоты на вторую, отличающуюся алифатическую аминокислоту. Например, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; Val; и Met, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; Val; и Met. В конкретных примерах в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; и Val, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; и Val. В конкретных примерах, включающих замену гидрофобных алифатических аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Ala; Pro; Ile; Leu; и Val, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Ala; Pro; Ile; Leu; и Val.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения консервативная замена включает замену первой ароматической аминокислоты на вторую, отличающуюся ароматическую аминокислоту. Например, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из His; Phe; Trp; и Tyr, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из His; Phe; Trp; и Tyr. В конкретных примерах, включающих замену ненагруженных ароматических аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Phe; Trp; и Tyr, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Phe; Trp; и Tyr.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения консервативная замена включает замену первой гидрофобной аминокислоты на вторую, отличающуюся гидрофобную аминокислоту. Например, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Ala; Val; Ile; Leu; Met; Phe; Tyr; и Trp, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Ala; Val; Ile; Leu; Met; Phe; Tyr; и Trp. В конкретных примерах, включающих замену не ароматических гидрофобных аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Ala; Val; Ile; Leu; и Met, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Ala; Val; Ile; Leu; и Met.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения консервативная замена включает замену первой полярной аминокислоты на вторую, отличающуюся полярную аминокислоту. Например, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Ser; Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; и Glu, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Ser; Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; и Glu. В конкретных примерах, включающих замену ненагруженных полярных аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Ser; Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; и Pro, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Ser; Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; и Pro. В конкретных примерах, включающих замену нагруженных полярных аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из His; Arg; Lys; Asp; и Glu, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из His; Arg; Lys; Asp; и Glu. В других примерах, включающих замену нагруженных полярных аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Arg; Lys; Asp; и Glu, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Arg; Lys; Asp; и Glu. В конкретных примерах, включающих замену положительно заряженных (основных) полярных аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из His; Arg; и Lys, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из His; Arg; и Lys. В дополнительных примерах, включающих замену положительно заряженных полярных аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет Arg или Lys, первая аминокислота может быть заменена на другую аминокислоту, выбранную из Arg и Lys. В конкретных примерах, включающих замену отрицательно заряженных (кислых) полярных аминокислот, в случае, когда первая аминокислота представляет Asp или Glu, первая аминокислота может быть заменена на другую аминокислоту, выбранную из Asp и Glu.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения консервативная замена включает замену первой электрически нейтральной аминокислоты на вторую, отличающуюся электрически нейтральную аминокислоту. Например, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Gly; Ser; Thr; Cys; Asn; Gln; и Tyr, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Gly; Ser; Thr; Cys; Asn; Gln; и Tyr.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения консервативная замена включает замену первой неполярной аминокислоты на вторую, отличающуюся неполярную аминокислоту. Например, в случае, когда первая аминокислота представляет одну из Ala; Val; Leu; Ile; Phe; Trp; Pro; и Met, первая аминокислота может быть заменена на вторую, отличающуюся аминокислоту, выбранную из Ala; Val; Leu; Ile; Phe; Trp; Pro; и Met.

Во многих примерах выбор конкретной второй аминокислоты, используемой в консервативной замене для замены первой аминокислоты, может быть сделан для максимизации числа указанных классов, к которым принадлежат обе, и первая и вторая аминокислоты. Следовательно, в случае, когда первая аминокислота представляет Ser (полярная неароматическая и электрически нейтральная аминокислота), вторая аминокислота может представлять другую полярную аминокислоту (то есть Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; или Glu); другую неароматическую аминокислоту (то есть Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; Glu; Ala; Ile; Leu; Val; или Met); или другую электрически нейтральную аминокислоту (то есть Gly; Thr; Cys; Asn; Gln; или Tyr). Однако может быть предпочтительно, чтобы вторая аминокислота в этом случае представляла одну из Thr; Asn; Gln; Cys; и Gly, поскольку эти аминокислоты относятся ко всем классификациям по признаку полярности, не ароматичности и электрической нейтральности. Дополнительный критерий, который необязательно может быть использован при выборе конкретной второй аминокислоты, используемой в консервативной замене, известен из предшествующего уровня техники. Например, в случае, когда Thr; Asn; Gln; Cys; и Gly доступны для использования в консервативной замене на Ser, Cys может быть исключен из выбора во избежание образования нежелательных поперечных сшивок и/или дисульфидных связей. Аналогично, Gly может быть исключен из выбора, поскольку в нем отсутствует боковая алкильная цепь. В этом случае может быть выбран Thr, например, для сохранения функциональности боковой цепи с гидроксильной группой. Однако выбор конкретной второй аминокислоты, используемой в консервативной замене, в конечном счете находится в ведении квалифицированного специалиста-практика.

PUFA: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «полиненасыщенная жирная кислота» или «PUFA» относится к жирной кислоте с цепью из атомов углерода длинной по меньшей мере 16 атомов углерода (например, по меньшей мере 18 атомов углерода, по меньшей мере 20 атомов углерода и 22 или большего числа атомов углерода) по меньшей мере с 3 или более двойными связями (например, 4 или более двойных связей, 5 или более двойных связей, и 6 или более двойных связей), где все двойные связи находятся в цис конфигурации.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота» или «LC PUFA» относится к жирной кислоте с цепью из атомов углерода длинной по меньшей мере 20 или более атомов углерода, содержащей 3 или более двойных связи, или 22 или более атомов углерода, содержащей 3 или более двойные связи (например, 4 или более двойные связи, 5 или более двойных связей, и 6 или более двойных связей). Расчет LC PUFA из ω6 серии включает, например, и без ограничений, дигомо-гамма-линоленовую кислоту (C20:3 n 6), арахидоновую кислоту (C20:4 n 6), адреновую кислоту (также называемую докозатетраеновой кислотой или DTA; C22:4 n 6), и докозапентаеновую кислоту (C22:5 n 6). LC PUFA ω3 серии включает, например и без ограничений, эйкозатриеновую кислоту (C20:3 n 3), эйкозатетраеновую кислоту (C20:4 n 3), эйкозапентаеновую кислоту (C20:5 n 3), докозапентаеновую кислоту (C22:5 n 3) и докозагексаеновую кислоту (C22:6 n 3). LC PUFA также включает жирные кислоты с более чем 22 атомами углерода и 4 или более двойными связями, например и без ограничений, C28:8 (n 3).

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «синтазы PUFA» или «PFA» относится к ферменту, продуцирующему PUFA (например, LC PUFA), наряду с доменом такого фермента в системе или комплексе. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин синтазы PUFA включает в объем понятия, например и без ограничений, PKS системы PUFA или PKS аналогичные системы для получения PUFA. Некоторые специфические синтазы PUFA приведены в описании настоящей патентной заявки под дополнительными названиями («Schizochytrium синтазы PUFA», PFA1, PFA2 и PFA3; например, из Schizochytrium sp. ATCC Accession No. PTA 9695). Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «система синтаз PUFA» относится к одной или более синтазе PUFA и любым гетерологичным добавочным ферментам, которые могут влиять на функцию синтаз PUFA (например, PPTаза или ACS).

PPTаза: используемые в описании настоящей патентной заявки термины «фосфопантетеин трансфераза» или «PPTаза» относится к ферменту, который активирует синтазы PUFA переносом кофактора (например, 4 фосфопантетеин) из коэнзима A (CoA) в один или более ACP домен, присутствующий в синтазах PUFA. Один из примеров PPTазы, которая может активировать один или более ACP домен синтаз PUFA, используемый в вариантах воплощения настоящего изобретения, представляет HetI белок Nostoc sp. (например, HetI из PCC 7120; ранее называемый Anabaena sp. PCC 7120), указанный в описании настоящей патентной заявки, как «NoHetI».

ACS: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «ацил-CoA-синтетаза», «ACoAS» или «ACS» относится к ферменту, катализирующему превращение длинноцепочечных полиненасыщенных свободных жирных кислот (FFA) в ацил-CoA. Специфические ацил-CoA-синтетазы, используемые в приведенных в описании настоящей патентной заявки вариантах воплощения настоящего изобретения, получены из Schizochytrium ATCC Accession No. 20888, указанные также под дополнительным названием; например, «SzACS2».

Растение: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «растение» включает в объем понятия любой потомок, клетку, ткань, маслосемена или его часть.

Признак или фенотип: используемые в описании настоящей патентной заявки термины «признак» и «фенотип» взаимозаменяемы. Для целей описания настоящей патентной конкретные интересующие признаки включают признак ω3 LC PUFA, как может быть экспрессировано, например, в масличных культурах.

Функциональный пищевой продукт: используемый в описании настоящей патентной заявки термин «функциональный пищевой продукт» относится к пищевому продукту, который аналогичен по внешнему виду традиционному пищевому продукту, потребляемому, как часть обычного рациона и имеющему повышенную пищевую ценность и/или специфическую пищевую пользу, на основе модификации пропорции компонентов, которые, как правило, присутствуют в не модифицированном источнике материала традиционного пищевого продукта.

Если ясно не указано иное или не подразумевается иное, используемый в описании настоящей патентной заявки единственное число означает «по меньшей мере один».

Если ясно не указано иное, все технические и научные термины, используемые в описании настоящей патентной заявки, имеют общепринятый смысл, известный специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Определения общепринятых терминов в молекулярной биологии могут быть найдены, например, в Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0 19 854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0 632 02182-9); and Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 56081 569-8). Все проценты приведены по массе и все пропорции смеси растворителя приведены по объему, если ясно не указано иное. Все температуры приведены в градусах Цельсия.

IV. Система гетерологичных синтаз PUFA Schizochytrium

Варианты воплощения настоящего изобретения включают организмы-хозяева (например, растения), которые генетически модифицированы для экспрессии синтаз PUFA. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения организм генетически модифицирован для экспрессии системы гетерологичных синтаз PUFA, например, системы функционального гетерологичного белка, содержащей синтазы PUFA и по меньшей мере один акцессорный белок. Приведенные в описании настоящей патентной заявки генетические модификации также могут быть использованы в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения для улучшения продуцирования PUFA в организме-хозяине, который эндогенно экспрессирует синтазы PUFA.

Система синтаз PUFA может содержать несколько многофункциональных белков (и может включать однофункциональные белки), которые могут действовать вместе для осуществления обоих, и итеративного процессинга цепи жирной кислоты, и не итеративного процессинга, включая транс-цис изомеризацию и реакцию восстановления еноил в выбранных циклах. Эти белки указаны в описании настоящей патентной заявки, как ядро ферментной системы синтаз PUFA или ядро синтаз PUFA. Основная и более подробная информация о доменах и мотивах, содержащихся в этих белках, может быть найдена, например в: патентах США №№ 6,140,486 и 6,566,583; патентных публикациях США №№ 2002/0194641, 2004/0235127, и 2005/0100995; международной патентной публикации №№ WO 2006/135866; и Metz et al. (2001) Science 293:290 3. Домены функциональных синтаз PUFA могут быть обнаружены, как единственный белок (например, домен и белок являются синонимами) или как один из двух или более доменов в единственном белке.

Из предшествующего уровня техники известны многочисленные примеры полипептидов с активностью синтаз PUFA (и полинуклеотиды и кодирующие их гены) и они могут быть скомбинированы в генетически модифицированном хозяине, содержащем гетерологичные синтазы PUFA по настоящему изобретению. Такие белки (или домены) синтаз PUFA включают обе, и бактериальную и не бактериальную синтазы PUFA. Не бактериальные синтазы PUFA могут представлять эукариотическую PFA. Конкретные бактериальные синтазы PUFA описаны, например, в патентной публикации США № 2008/0050505. По настоящему изобретению могут быть получены генетически модифицированные растения, в которые введены функциональные домены не бактериальных синтаз PUFA с функциональными доменами бактериальных синтаз PUFA, наряду с функциональными доменами или белками из других PKS систем (например, итеративных или модулярных I типа, II типа и III типа) и/или FAS систем синтаз PUFA.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения гетерологичные синтазы PUFA содержат биологически активные домены, которые, как правило, содержатся на трех, четырех или более белках, выбранных из группы, состоящей из: по меньшей мере один домен еноил-ACP редуктазы (ER); множественный домен(ы) ацил-переносящего белка (ACP) (например, по меньшей мере от одного до четырех или по меньшей мере пять доменов ACP, и в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вплоть до шести, семи, восьми, девяти, десяти или более чем десяти доменов ACP); по меньшей мере два домена β-кетоацил-ACP синтаза (KS); по меньшей мере один домен ацилтрансферазы (AT); по меньшей мере один домен β кетоацил-ACP-редуктазы (KR); по меньшей мере два домена FabA, такая как β-гидроксиацил-ACP-дегидрата (DH); по меньшей мере один домен фактора длины цепи (CLF); и по меньшей мере один домен малонил-CoA:ACP-ацилтрансферазы (MAT). В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения гетерологичные синтазы PUFA также содержат по меньшей мере один участок, содержащий консервативный мотив активного сайта дегидратазы.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения система гетерологичных синтаз PUFA содержит синтазы PUFA (например, PFA1, PFA2, и PFA3) из водорослей траустохидрид Schizochytrium. Например, система гетерологичных синтаз PUFA по вариантам воплощения настоящего изобретения может содержать, например и без ограничений, по меньшей мере один белок, содержащий аминокислотные последовательности по меньшей мере с 80% (например, по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; и по меньшей мере с 99%) идентичностью SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:7; и/или SEQ ID NO:14. В конкретных примерах система гетерологичных синтаз PUFA содержит по меньшей мере один белок, содержащий SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:7; и/или SEQ ID NO:14. В конкретных примерах система гетерологичных синтаз PUFA содержит по меньшей мере один белок с аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:7; и SEQ ID NO:14.

Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения включают систему гетерологичных синтаз PUFA, которая содержит по меньшей мере один функциональный эквивалент SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:7; и/или SEQ ID NO:14. Например, система может содержать вариант, часть, фрагмент, или производное SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:7; и/или SEQ ID NO:14, где такой полипептид обладает активностью синтаз PUFA. Например, последовательности других полипептидов синтаз PUFA (и гены, кодирующие их) могут быть найдены в литературе и в базах данных по биоинформатике, доступных из предшествующего уровня техники. Такие последовательности могут быть найдены, например, при использовании поиска в BLAST, публично доступной базе данных с известными генами или полипептидными последовательностями синтаз PUFA. В таком методе идентичность может быть основана на методе выравнивания ClustalW при использовании стандартных параметров GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.1, и Gonnet 250 серий матрицы сравнения аминокислот.

Дополнительно, ген или полипептидные последовательности синтаз PUFA, приведенные в описании настоящей патентной заявки, могут быть использованы для идентификации других природных гомологов синтаз PUFA. Например, каждый из фрагментов нуклеиновой кислоты синтаз PUFA, приеденный в описании настоящей патентной заявки, может быть использован для выделения генов, кодирующих гомологичные белки. Выделение гомологичных генов при использовании протоколов, описывающих введение последовательностей хорошо известно из предшествующего уровня техники. Примеры протоколов, описывающих введение последовательностей включают, например и без ограничений: методы гидридизации нуклеиновой кислоты; методы амплификации ДНК и РНК, как приведено на примерах различных использований технологий амплификации нуклеиновой кислоты (например, полимеразная цепная реакция (PCR), лигазная цепная реакция (LCR), и амплификация с замещением цепей (SDA); и методы библиотеки конструкций и скрининга при использовании комплементации.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения гетерологичные синтазы PUFA содержат домен Schizochytrium синтаз PUFA (например, ER домены, ACP домены, KS домены, AT домены, KR домены, DH домены, CLF домены, MAT домены, и консервативные мотивы активного сайта дегидратазы), где домен скомбинирован с одним или более доменом различных синтаз PUFA с образованием полных синтаз PUFA с синтазной активностью.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированные организмы, содержащие гетерологичные синтазы PUFA, могут быть дополнительно модифицированы по меньшей мере одним доменом или биологически активным ферментом другой синтазы PUFA. В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения любые домены синтаз PUFA могут быть модифицированы другими природными структурами для модификации или усиления функции этого домена в системе синтаз PUFA (например, для модификации типов PUFA или их соотношений при продуцировании системой).

Фосфопантетеин трансферазы

Фосфопантетеин трансферазы (PPTазы) представляют семейство ферментов, участвующих в синтезе жирных кислот, синтезе поликетидов и не рибосомальном синтезе пептидов. В частности, ACP домены, присутствующие в синтазных ферментах PUFA, требуют активации путем присоединения кофактора (4 фосфопантетеин) от коэнзима A к ацилпереносящему белку (ACP). Присоединение этого кофактора осуществляется PPTазами. В случае, когда эндогенные PPTазы организма-хозяина неспособны активировать ACP домены синтаз PUFA, необходимо обеспечить PPTазы, способные осуществить эту функцию.

Одним из примеров PPTазы, продемонстрировавшей способность распознавать ACP домены в качестве субстратов, является белок HetI Nostoc sp. HetI присутствует в кластере генов в Nostoc, отвечающем за синтез определенных жирных кислот в этом организме. Black and Wolk (1994) J. Bacteriol. 176:2282 92; Campbell et al. (1997) Arch. Microbiol. 167:251 8. HetI способен активировать ACP домены белка HglE, присутствующего в этом кластере.

В вариантах воплощения настоящего изобретения система синтаз PUFA содержит по меньшей мере один домен PPTазы или 4' фосфопантетеин трансферазы в качестве акцессорного домена или белка для синтаз PUFA. Из предшествующего уровня техники известны многочисленные примеры полипептидов с PPTазной активностью и они могут быть использованы в генетически модифицированном организме по настоящему изобретению в случае, когда они способны активировать ACP домены конкретной синтазы PUFA. Примеры полипептидов, которые могут быть включены в такую систему гетерологичных синтаз PUFA, включают, например и без ограничений, по меньшей мере один белок, содержащий аминокислотные последовательности по меньшей мере с 80% (например, по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; и по меньшей мере с 99% идентичностью полипептиду, кодируемому SEQ ID NO:10 (белок NoHetI). В конкретных примерах система гетерологичных синтаз PUFA включает полипептид, кодируемый SEQ ID NO:10.

Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения включают систему гетерологичных синтаз PUFA, которая содержит функциональный эквивалент полипептида, кодируемого SEQ ID NO:10. Например, система может содержать вариант, часть, фрагмент или производное полипептида, кодируемого SEQ ID NO:10, где такой полипептид обладает фосфопантетеин трансферазной активностью. Например, последовательности других PPTаз (и гены, кодирующие их) могут быть найдены в литературе и в базах данных по биоинформатике, доступных из предшествующего уровня техники. Такие последовательности могут быть найдены, например, при использовании поиска через BLAST публично доступной базы данных с известными генами или полипептидными последовательностями синтаз PUFA. В таком методе идентичность может быть основана на методе выравнивания ClustalW при использовании стандартных параметров GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.1, и Gonnet 250 серий матриц сравнения аминокислот. Последовательности PPTаз, приведенные в описании настоящей патентной заявки, могут быть использованы для идентификации других природных гомологов PPTазы. Например, нуклеиновые кислоты PPTазы по настоящему изобретению (например, SEQ ID NO:10) могут быть использованы для выделения генов, кодирующих гомологичные белки.

Согласно приведенному выше, в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированный организм (например, растение) и/или потомок, клетка, ткани или его часть содержит гетерологичные синтазы PUFA (например, синтазу PUFA из водорослей траустохидрид Schizochytrium) и гетерологичные PPTазы (например, PPTазы NoHetI).

Ацил-CoA-синтетазы

Белки ацил-CoA-синтетазы (ACS или в качестве альтернативы, ACoAS) катализируют превращение длинноцепочечных PUFA свободных жирных кислот (FFAs) в ацил-CoA. Из предшествующего уровня техники известны и могут быть использованы в вариантах воплощения настоящего изобретения многочисленные примеры полипептидов с ACoAS активностью. Например, Schizochytrium sp. ATCC Accession No. 20888 имеет одну или более ACoAS, которая способна превращать продукты свободных жирных кислот этой синтазы PUFA в ацил-CoA, включая полипептид, кодируемый SEQ ID NO:11 (SzACS2 белок).

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения система гетерологичных синтаз PUFA включает, например и без ограничений, по меньшей мере один белок, содержащий аминокислотные последовательности по меньшей мере с 80% (например, по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; и по меньшей мере с 99%) идентичностью полипептиду, кодируемому SEQ ID NO:11. В конкретных примерах система гетерологичных синтаз PUFA включает полипептид, кодируемый SEQ ID NO:11.

Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения включают систему гетерологичных синтаз PUFA, которая содержит функциональный эквивалент полипептида, кодируемого SEQ ID NO:11. Например, система может содержать вариант, часть, фрагмент или производное полипептида, кодируемого SEQ ID NO:11, где такой полипептид обладает ацил-CoA-синтетазной активностью. Например, последовательности других ACoAS (и гены, кодирующие их) могут быть найдены в литературе и в базах данных по биоинформатике, доступных из предшествующего уровня техники. Такие последовательности могут быть найдены, например, при использовании поиска через BLAST публично доступной базы данных с известными генами или полипептидными последовательностями синтаз PUFA. В таком методе идентичность может быть основана на методе выравнивания ClustalW при использовании стандартных параметров GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.1, и Gonnet 250 серий матриц сравнения аминокислот. Последовательности ACoAS, приведенные в описании настоящей патентной заявки, могут быть использованы для идентификации других природных гомологов ACoAS. Например, нуклеиновые кислоты ACoAS, приведенные в описании настоящей патентной заявки (например, SEQ ID NO:11) могут быть использованы для выделения генов, кодирующих гомологичные белки.

Согласно приведенному выше, в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированный организм (например, растение) и/или потомок, клетка, ткани или его часть содержит гетерологичные синтазы PUFA (например, синтазы PUFA из Траустохидрид Schizochytrium sp.); гетерологичные PPTазы (например, PPTаза NoHetI); и гетерологичные ACoAS (например, Schizochytrium ACoAS из ATCC Accession No. 20888).

Функциональные эквиваленты включают без ограничения для добавления или замены аминокислотные остатки в референсных аминокислотных последовательностях (то есть SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:7; полипептида, кодируемого SEQ ID NO:10; полипептида, кодируемого SEQ ID NO:11; или SEQ ID NO:14), но которые в результате приводят к молчащему изменению с получением, таким образом функционально эквивалентного генного продукта. Например, консервативные аминокислотные замены могут быть сделаны на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы используемых остатков.

В синтазах PUFA, PPTазах, и/или ACoAS могут быть сделаны сайт-направленные мутации (при использовании технологий случайного мутагенеза, хорошо известных специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение) с получением в результате мутантных ферментов, которые могут быть подвергнуты анализу для подтверждения экспрессированной активности. Например, SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:7; полипептида, кодируемого SEQ ID NO:10; полипептида, кодируемого SEQ ID NO:11; или SEQ ID NO:14 может быть выравнена через гомологи и другие родственные белки, где указаны идентичные аминокислотные остатки и консервативные остатки. Консервативные изменения в вариабельных позициях могут быть внесены для получения полипептида с сохранением функции; например, активности синтаз PUFA, фосфопантетеин трансферазной активности и ацил-CoA-синтетазной активности.

В описании настоящей патентной заявки приведены варианты воплощения настоящего изобретения, в которых эффект экспрессии системы гетерологичных синтаз PUFA обеспечивается, например, трансгенным организмом (например, растением), содержащим один или более полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один компонент системы гетерологичных синтаз PUFA.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения гетерологичный полинуклеотид кодирует по меньшей мере один компонент системы гетерологичных синтаз PUFA, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий синтазы PUFA из Траустохидрид Schizochytrium sp. Например, гетерологичный полинуклеотид по вариантам воплощения настоящего изобретения может кодировать, например и без ограничений, по меньшей мере один белок, содержащий аминокислотные последовательности по меньшей мере с 80% (например, по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; по меньшей мере с 99%; и 100%) идентичностью SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:7; и/или SEQ ID NO:14.

В некоторых примерах полинуклеотид, кодирующий синтазы PUFA из Траустохидрид Schizochytrium sp., содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 70% (например, по меньшей мере с 71%; по меньшей мере с 72%; по меньшей мере с 73%; по меньшей мере с 74%; по меньшей мере с 75%; по меньшей мере с 76%; по меньшей мере с 77%; по меньшей мере с 78%; по меньшей мере с 79%; по меньшей мере с 80%; по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; по меньшей мере с 99%; и 100%) идентичностью SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; и/или SEQ ID NO:13.

В конкретных примерах гетерологичный полинуклеотид, кодирующий синтазы PUFA из Траустохидрид Schizochytrium sp., гибридизуется в жестких условиях (например, очень жестких условиях) с SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5 и/или SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:13.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения гетерологичный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один компонент системы гетерологичных синтаз PUFA, содержит полинуклеотид, кодирующий фосфопантетеин трансферазу (HetI) из цианобактерий рода Nostoc. Например, гетерологичный полинуклеотид по вариантам воплощения настоящего изобретения может кодировать, например и без ограничений, по меньшей мере один белок, содержащий аминокислотные последовательности по меньшей мере с 80% (например, по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; по меньшей мере с 99%; и 100%) идентичностью полипептиду, кодируемому SEQ ID NO:10 (то есть NoHetI).

В некоторых примерах полинуклеотид, кодирующий фосфопантетеин трансферазу (HetI) из цианобактерий рода Nostoc, содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 70% (например, по меньшей мере с 71%; по меньшей мере с 72%; по меньшей мере с 73%; по меньшей мере с 74%; по меньшей мере с 75%; по меньшей мере с 76%; по меньшей мере с 77%; по меньшей мере с 78%; по меньшей мере с 79%; по меньшей мере с 80%; по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; по меньшей мере с 99%; и 100%) идентичностью SEQ ID NO:10.

В конкретных примерах полинуклеотид, кодирующий Nostoc фосфопантетеин трансферазу (NoHetI), гибридизуется в жестких условиях (например, очень жестких условиях) с SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения гетерологичный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один компонент системы гетерологичных синтаз PUFA, содержит полинуклеотид, кодирующий ACoAS из Schizochytrium. Например, гетерологичный полинуклеотид по вариантам воплощения настоящего изобретения может кодировать, например и без ограничений, по меньшей мере один белок, содержащий аминокислотные последовательности по меньшей мере с 80% (например, по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; по меньшей мере с 99%; и 100%) идентичностью полипептиду, кодируемому SEQ ID NO:11 (то есть SzACS2).

В некоторых примерах полинуклеотид, кодирующий гетерологичный ACoAS из Schizochytrium (например, ATCC Accession No. 20888), содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 70% (например, по меньшей мере с 71%; по меньшей мере с 72%; по меньшей мере с 73%; по меньшей мере с 74%; по меньшей мере с 75%; по меньшей мере с 76%; по меньшей мере с 77%; по меньшей мере с 78%; по меньшей мере с 79%; по меньшей мере с 80%; по меньшей мере с 81%; по меньшей мере с 82%; по меньшей мере с 83%; по меньшей мере с 84%; по меньшей мере с 85%; по меньшей мере с 86%; по меньшей мере с 87%; по меньшей мере с 88%; по меньшей мере с 89%; по меньшей мере с 90%; по меньшей мере с 91%; по меньшей мере с 92%; по меньшей мере с 93%; по меньшей мере с 94%; по меньшей мере с 95%; по меньшей мере с 96%; по меньшей мере с 97%; по меньшей мере с 98%; по меньшей мере с 99%; и 100%) идентичностью SEQ ID NO:11.

В конкретных примерах полинуклеотид, кодирующий гетерологичную ACoAS, гибридизуется в жестких условиях (например, очень жестких условиях) с SEQ ID NO:11.

В вариантах воплощения настоящего изобретения один или более полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один компонент гетерологичных синтаз PUFA, может содержать по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий синтазы PUFA из Траустохидрид Schizochytrium sp., либо с, либо без полинуклеотида, кодирующего фосфопантетеин трансферазу (HetI) из цианобактерий рода Nostoc и/или гетерологичного полинуклеотида, кодирующего ACoAS из Schizochytrium. В некоторых примерах по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий указанные компоненты, присутствует в одной молекуле нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах по меньшей мере один полинуклеотид присутствует во множестве молекул нуклеиновых кислот.

Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения включают векторы (например, плазмиды), содержащие один или более полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один компонент гетерологичных синтаз PUFA. В примерах такие векторы содержат регуляторные последовательности, которые функционально связаны с полинуклеотидами, осуществляя, таким образом, экспрессию полинуклеотидов в целевом организме-хозяине. Конкретные примеры таких векторов включают рекомбинантные векторы экспрессии, такие как pDAB101429 (SEQ ID NO:15); pDAB101454 (SEQ ID NO:16); pDAB101496 (SEQ ID NO:17); pDAB109525 (SEQ ID NO:18); pDAB109584 (SEQ ID NO:19); pDAB109588 (SEQ ID NO:20); pDAB112210 (SEQ ID NO:21); pDAB112206 (SEQ ID NO:22); pDAB107962 (SEQ ID NO:23); pDAB109591 (SEQ ID NO:24); pDAB109592 (SEQ ID NO:25); pDAB107960 (SEQ ID NO:26); pDAB110132 (SEQ ID NO:27); pDAB107961 (SEQ ID NO:28); pDAB110151 (SEQ ID NO:29); pDAB112285 (SEQ ID NO:30); pDAB117501 (SEQ ID NO:31); pDAB117502 (SEQ ID NO:32); pDAB112200 (SEQ ID NO:33); pDAB112201 (SEQ ID NO:34); pDAB112203 (SEQ ID NO:35); pDAB112205 (SEQ ID NO:36); pDAB112208 (SEQ ID NO:37); и pDAB112209 (SEQ ID NO:38).

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения известные методы в технологии рекомбинатной ДНК могут быть использованы для улучшения контроля экспрессии гетерологичных полинуклеотидов, например и без ограничений, манипуляцией числа копий полинуклеотидов в клетке-хозяине; манипулированием эффективности, с которой эти полинуклеотиды транскрибируются; манипулированием эффективности, с которой полученные в результате транскрипты транслируются; и манипулированием эффективности пост трансляционных модификаций. В качестве дополнительных примеров промоторные последовательности могут быть генетически сконструированы для повышения уровня экспрессии в хозяине, по сравнению с референсным промотором. Следовательно, технологии, используемые для контроля экспрессии молекул нуклеиновой кислоты, включают, например и без ограничений, интеграцию молекул нуклеиновой кислоты в одной или более хромосоме клетки-хозяина; добавление вектора стабильности последовательностей в плазмиды; замены или модификации сигналов контроля транскрипции (например, промоторы, операторы и энхансеры); замены или модификации сигналов контроля трансляции (например, сайтов связывания рибосом и последовательности Шайна-Дельгардо); модификация молекул нуклеиновой кислоты для соответствия частоте использования кодона клетки-хозяина; и делеция последовательностей, которые дестабилизируют транскрипты.

V. Способы получения генетически модифицированных организмов

Для получения очень высокого выхода одной или более заданной полиненасыщенной жирной кислоты организм-хозяин (например, растение) может быть генетически модифицирован для введения в организм системы гетерологичных синтаз PUFA. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения этот процесс используют для получения генетически модифицированного растения, которое содержит систему гетерологичных синтаз PUFA. Некоторые примеры также включают способы улучшения или усиления эффективности такой генетической модификации, например, для улучшения или усиления продуцирования и/или накопления конечного продукта системы синтаз PUFA; например, LC PUFA, такой как DHA и EPA. Приведенные в описании настоящей патентной заявки варианты воплощения настоящего изобретения позволяют осуществить экспрессию одной или более указанной выше синтазы PUFA Schizochytrium и PPTаз для повышения продуцирования и/или накопления PUFA в гетерологичном хозяине. Также варианты воплощения настоящего изобретения позволяют осуществить экспрессию ACS в хозяине.

Способы экспрессии генов в генетически модифицированном организме, включая, например и без ограничений, растения, известны из предшествующего уровня техники. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения кодирующие области для гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих экспрессируемый компонент системы синтаз PUFA, представляют кодон, оптимизированный для целевой клетки-хозяина. Экспрессия генов в рекомбинантных клетках-хозяевах, включая, например и без ограничений, клетки растений, может нуждаться в промоторе, функционально связанном с интересующей кодирующей областью, и/или транскрипциональном терминаторе. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие компонент системы синтаз PUFA, функционально связаны со специфическим промотором семян (например, PvDlec2, LfKCS3, FAE1, BoACP и BnaNapinC). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие компонент системы синтаз PUFA, функционально связаны со специфическим промотором листа (например, убихитин и CsVMV). Другие не ограничивающие примеры промоторов, которые могут быть использованы в конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения, включают промотор ацил-переносящего белка (международная патентная публикация № WO 1992/18634) и Phaseolus vulgaris промотор бета-фазеолина (и усеченные версии). Смотрите, например, Slightom et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1897-1901; Sengupta Gopalan et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320 4; van der Geest et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:553-7; и Bustos et al. (1991) EMBO J. 10:1469-79.

Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения включают рекомбинантный вектор (например, плазмиду), содержащий один или более гетерологичный полинуклеотид, кодирующий компонент системы синтаз PUFA. Рекомбинантный вектор представляет сконструированную (например, искусственно полученную) молекулу нуклеиновой кислоты, которую используют в качестве инструмента для выбранного манипулирования нуклеотидной последовательностью и/или для введения такой нуклеотидной последовательности в клетку-хозяина. Следовательно, рекомбинантный вектор может быть подходящим для использования в клонировании, секвенировании и/или других манипуляциях с полинуклеотидом, таких как экспрессирование и/или доставка полинуклеотида в клетку-хозяина с получением рекомбинатной клетки. Вектор может содержать нуклеотидные последовательности, которые в природе не располагаются рядом с клонируемым или доставляемым полинуклеотидом. Также вектор может содержать регуляторные нуклеотидные последовательности (например, промоторы, не транслируемые области), которые в природе не располагаются рядом с полинуклеотидом или которые не используют для экспрессии полинуклеотида. Интегрированный полинуклеотид может находиться под контролем промотора хромосом, под контролем нативного или плазмидного промотора или контролем комбинации из нескольких промоторов. Вектор может представлять либо РНК, либо ДНК и может быть либо прокариотическим, либо эукариотическим. Вектор может сохраняться как экстрахромосомный элемент (например, плазмида) или он может быть интегрирован в хромосому рекомбинантного организма (например, микроб и клетка растения). Вектор целиком может располагаться в клетке-хозяине или при определенных условиях чужая ДНК (например, лишние плазмидные последовательности) может быть удалена, оставляя после себя один или более гетерологичный полинуклеотид, кодирующий компонент системы синтаз PUFA. Единственная или множество копий гетерологичных полинуклеотидов могут быть интегрированы в геном хозяина. Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один селектируемый маркер.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения рекомбинантный вектор, содержащий один или более гетерологичный полинуклеотид, кодирующий компонент системы синтаз PUFA, представляет вектор экспрессии, например, вектор экспрессии растения. В таких вариантах воплощения настоящего изобретения по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий продуцируемый продукт (например, синтазы PUFA Schizochytrium, NoHetI и SzACS2), может быть вставлен в рекомбинантный вектор таким образом, что функционально связывает полинуклеотид(ы) с регуляторными последовательностями в векторы, которые осуществляет транскрипцию и трансляцию нуклеотидной последовательности в рекомбинантной клетке-хозяине. Векторы, используемые для трансформации разновидности организма-хозяина и клеток, известны из предшествующего уровня техники. Как правило, вектор содержит селектируемый маркер и последовательности, позволяющие автономную репликацию или хромосомную интеграцию в заданном хозяине.

Подходящие способы трансформация клеток-хозяев включают любые способы, при использовании которых ДНК может быть введена в клетку, такие как трансформация протобластов (Смотрите, например, Патент США 5,508,184) при использовании дессикационно/ингибиторно-опосредованного захвата ДНК (Смотрите, например, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183 8), при использовании электропорации (Смотрите, например, Патент США 5,384,253), при перемешивании с карбидо-кремниевыми волокнами (Смотрите, например, Патенты США 5,302,523 и 5,464,765), при использовании опосредованной агробактерией трансформации (Смотрите, например, Патенты США 5,563,055; 5,591,616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981,840; и 6,384,301), и при использовании ускорения частиц, покрытых ДНК (Смотрите, например, Патенты США 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; и 6,403,865). При использовании таких технологий, как эти, клетки практически любого вида могут быть стабильно трансформированы, включая оба вида, и однодольные и двудольные растения. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения трансформирование ДНК представляет интегрирование в геном клетки-хозяина. В случае многоклеточных видов, трансгенные клетки могут быть регенерированы в трансгенном организме. Любая из этих технологий может быть использована для получения трансгенных однодольных или двудольных растений, например, содержащих один или более гетерологичный полинуклеотид, кодирующий компонент системы синтаз PUFA в геноме трансгенного растения.

Самый широко используемый способ введения вектора экспрессии в растения основывается на природной системе трансформации при использовании агробактерий. A. tumefaciens и A. rhizogenes представляют патогенные для растений почвенные бактерии, которые генетически трансформируют клетки растений. Ti и Ri плазмиды A. tumefaciens и A. rhizogenes, соответственно, несут гены, ответственные за генетическую трансформацию растения. Ti (опухоль-индуцирующий) плазмиды содержат большой сегмент, известный как T-ДНК, которая переносена в траснформированные растения. Другой сегмент Ti плазмиды, vir область, отвечает за перенос T-ДНК. Область T-ДНК ограничена терминальными повторами. В модифицированных бинарных векторах делетированы опухоль-индуцирующие гены, и функции vir области используются для переноса чужеродной ДНК, ограниченной T- ДНК пограничными последовательностями. T область также может содержать селектируемый маркер для эффективной регенерации трансгенных растений и клеток, и сайт множественного клонирования для вставки последовательностей для переноса таких dsРНК, кодирующих нуклеиновую кислоту.

Следовательно, в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вектор трансформации растений получен из Ti плазмиды A. tumefaciens (Смотрите, например, Патенты США № 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, и 5,501,967; и Европейские патент EP 0 122 791) или Ri плазмиды A. rhizogenes. Дополнительные векторы трансформации растений включают, например и без ограничений, таковые, описанные Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; в Европейском патенте EP 0 120 516, и таковые, полученные из любых указанных выше. Другие бактерии, такие как Sinorhizobium, Rhizobium, и Mesorhizobium, которые взаимодействуют с растениями природно, могут быть модифицированы для опосредованного переноса гена во множество различных растений. Эти ассоциативные микроорганизмы растительных симбиозов могут переносить гены за счет присоединения обоих, и обезоруженной Ti плазмиды, и подходящего бинарного вектора.

Для обеспечения экзогенной ДНК в клетку-реципиент, трансформированные клетки, как правило, идентифицируют для дальнейшего культивирования и регенерации растения. Для улучшения способности идентифицировать трансформированные клетки желательно использовать селектируемый или скринируемый маркерный ген, как указано выше, при использовании вектора трансформации, используемого для получения трансформантов. В случае, когда используют селектируемый маркер, трансформированные клетки идентифицируют в популяции потенциально трансформированных клеток, воздействуя на клетки селективным агентом или агентами. В случае, когда используют скринируемый маркер, клетки могут быть подвергнуты скринингу по заданному признаку маркерного гена.

Клетки, перенесшие воздействие селективного агента, или клетки, которые были положительно оценены в ходе скринингового анализа, могут быть культивированы в среде, поддерживающей регенерацию растений. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения любая подходящая для культивирования растительных тканей среда (например, среда MS и N6) может быть модифицирована введением дополнительных веществ, таких как регуляторы роста. Ткани могут быть выдержаны на основной среде с регуляторами роста до момента, когда ткани будет достаточно для начала работ по регенерации растения или последующих повторных циклов ручной селекции, до момента, когда морфология тканей будет подходящей для регенерации (например, по меньшей мере 2 недели), затем их переносят в среду, способствующую формированию побегов. Культуры переносят периодически до достаточного формирования побегов. Как только побеги сформируются, их переносят в среду, способствующую формированию корней. Сразу после достаточного формирования корней растения могут быть перенесены в почву для дальнейшего роста и развития.

Для подтверждения наличия интересующей молекулы нуклеиновой кислоты (например, гетерологичного полинуклеотида, кодирующего компонент системы синтаз PUFA) в регенерируемых растениях может быть проведено множество различных анализов. Такие анализы включают, например: молекулярно-биологический анализ, такой как саузерн- и норзен-блоттинг, ПЦР и секвенирование нуклеиновой кислоты; биохимический анализ, такой как детектирование присутствия белкового продукта, например, при использовании иммунологических средств (ELISA и/или вестерн-блоттинг) или при использовании ферментативной функции; анализ частей растений, такой как анализ листьев или анализ корней; и анализ фенотипа целого регенерированного растения.

События интеграции могут быть подвергнуты анализу при использовании, например, ПЦР-амплификации, например, с олигонуклеотидными праймерами, специфичными к интересующей молекуле нуклеиновой кислоты. ПЦР-генотипирование включает без ограничения полимеразно-цепную (ПЦР) амплификацию геномной ДНК, полученной из выделенной каллусной ткани растения-хозяина, прогнозируемо содержащего интересующую молекулу нуклеиновой кислоты, интегрированную в геном, с последующим проведением стандартного клонирования и анализа последовательности продуктов ПЦР-амплификации. Способы ПЦР-генотипирования хорошо описаны (например, в Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53) и могут быть применены к геномной ДНК, полученной из растений любых видов (например, Z. mays или G. max) или типа ткани, включая культуры-клеток.

Трансгенное растение, полученное при использовании способов трансформации, опосредованной агробактерией, как правило, содержат единственную рекомбинантную последовательность ДНК, вставленную в одну хромосому. Единственная рекомбинантная последовательность ДНК указана в описании настоящей патентной заявки, как «трансгенное событие» или «событие интеграции». Такие трансгенные растения являются гетерозиготными для вставленной экзогенной последовательности. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения трансгенное растение, гомозиготное относительно трансгена, может быть получено половым скрещиванием (самоопылением) независимого сегрегантого трансгенного растения, которое содержит единственную последовательность экзогенного гена, например, растение T0 с получением семян Tl. Одно из четырех полученных семян Tl будет гомозиготным относительно трансгена. Проращивание семян Tl позволяет получить растения, которые могут быть протестированы на гетерозиготность, как правило, при использовании анализа SNP или анализа термальной амплификации, которые позволяют провести различие между гетерозиготами и гомозиготами (то есть анализ зиготности).

Дополнительно к прямой трансформации растения рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты трансгенные растения могут быть получены скрещиванием первого растения, имеющего по меньшей мере одно трансгенное событие, со вторым растением, не имеющим такого события. Например, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая один или более гетерологичный полинуклеотид(ы), кодирующий компонент системы синтаз PUFA, может быть введена в линию первого растения, которое подлежит трансформации с получением трансгенного растения, это трансгенное растение может быть скрещено с растением второй линии для интрогрессии полинуклеотида(ов) в растение второй линии.

Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения включают нацеливание экспрессии полипептидов системы гетерологичных синтаз PUFA в одну или более органеллу хозяина. Например, в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения экспрессия системы гетерологичных синтаз PUFA нацелена на пластиду растения. Разновидности целевых (в смысле на которые направлено) последовательностей пластид известны из предшествующего уровня техники и могут быть использованы в вариантах воплощения настоящего изобретения, где гетерологичный хозяин представляет растение или клетку растения, и где желательно нацеливание на пластиду.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения экспрессия системы гетерологичных синтаз PUFA нацелена на цитозоль. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения ацил-CoA-синтетазы (ACoAS) экспрессированы в цитозоль для превращения LC PUFA свободных жирных кислот в ацил-CoAs, которая в свою очередь может быть использована ацилтрансферазами. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения экспрессия системы гетерологичных синтаз PUFA нацелена на обе, и на пластиду, и на цитозоль растенияю

Конкретные варианты воплощения настоящего изобретения включают применение нацеливания на органеллы (например, на пластиду или хлоропласт в растениях) по меньшей мере одной синтазы PUFA Schizochytrium Синтаза при использовании PPTазы NoHetI. Нацеливание генных продуктов на пластиду или хлоропласт контролируется сигнальной последовательностью, находящейся на аминотерминальном конце различных белков, которая отщепляется во время введения полученного в результате зрелого белка. Смотрите, например, Comai et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15104-9. Эти сигнальные последовательности могут быть слиты с гетерологичными генными продуктами для оказания воздействия на введение гетерологичных продуктов в хлоропласт. Van den Broeck et al. (1985) Nature 313:358-63. ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть выделена, например, из cДНК, кодирующей белок RUBISCO, белок CAB, синтазный фермент EPSP, белок GS2, и многие другие белки, которые, как известно, расположены в хлоропласте.

Альтернативные средства для локализации генов в хлоропластах или пластидах, используемые в конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения, включают трансформацию хлоропласта или пластиды. Могут быть получены рекомбинантные растения, в которых для введения полипептидов системы гетерологичных синтаз PUFA могут быть сделаны изменения только в ДНК хлоропластов. Из предшествующего уровня техники известны промоторы, которые функционируют в хлоропластах. Hanley Bowden et al. (1987) Trends in Biochem. Sci. 12:67-70. Способы и композиции для получения клеток, содержащих хлоропласты, в которые вставлена гетерологичный ДНК, как описано, например, в Патентах США №№ 5,693,507 и 5,451,513.

Указанные выше генетические манипуляции с рекомбинантным хозяином могут быть проведены при использовании стандартных генетических технологий и скринингов и могут быть получены в любой клетке-хозяине, которая подходит для генетической манипулиции. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения рекомбинантный хозяин представляет высшее растение, включая оба, и двудольное, и однодольное растения и сырьевые растения, включая продовольственные культуры и растения, используемые для получения масел. Следовательно, растение любого вида или клетка растения может быть выбрана, как описано ниже.

VI. Трансгенные растения

Конкретные варианты воплощения настоящего изобретения включают любое растение или клетку растения, экспрессирующую систему гетерологичных синтаз PUFA, например, систему функционального гетерологичного белка, содержащую синтазы PUFA и по меньшей мере один акцессорный белок. Конкретные варианты воплощения настоящего изобретения включают клетку растения, содержащую гетерологичный полинуклеотид, кодирующий синтазы PUFA Schizochytrium, и полинуклеотид, кодирующий PPTазу NoHetI, эта клетка растения также может содержать полинуклеотид, кодирующий ACoAS Schizochytrium. В некоторых примерах такое трансгенное растение дополнительно генетически модифицировано для экспрессии дополнительного полипептида (например, ACoAS, GPAT, LPAAT, DAGAT и ацетил-CoA- карбоксилазы (ACCase)) для улучшения продуцирования и/или накопления PUFA или других биологически активных продуктов синтаз PUFA хозяином.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение (и/или клетка растения) представляет, например и без ограничений, выбранное из группы, состоящей из: высших растений; двудольных растений; однодольных растений; сырьевых растений (например, продовольственные культуры и растения, используемые для получения масел); сои; рапса; льна; кукурузы; сафлора; подсолнечника; табака; растений семейства Fabaceae (Leguminosae, семейства бобовых (legume family), семейства гороховых, семейства бобовых (bean family) или семейства бобовых (pulse family)); растений рода соя культурная (например, G. albicans, G. aphyonota, G. arenari, G. argyrea, G. canescens, G. clandestine, G. curvata, G. cyrtoloba, G. falcate, G. gracei, G. hirticaulis, G. hirticaulis subsp. leptosa, G. lactovirens, G. latifolia, G. latrobeana, G. microphylla, G. montis douglas, G. peratosa, G. pescadrensis, G. pindanica, G. pullenii, G. rubiginosa, G. stenophita, G. syndetika, G. tabacina, G. tomentella, G. soja, and G. max (sojabean)); peanut; Phaseolus vulgaris, Vicia faba; и Pisum sativum.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение представляет растение, которое, как известно, продуцирует соединения, используемые в качестве фармацевтических агентов, агентов, придающих вкус и аромат, нутрицевтических агентов, ингредиентов функциональных пищевых продуктов или косметически активных агентов, или растение, которое генетически сконструировано для получения этих соединений/агентов.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение представляет масличную культуру, где маслосемена и/или масло из них содержит LC PUFA, полученные при использовании системы гетерологичных синтаз PUFA. В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения такие масла содержат определяемое количество по меньшей мере одной целевой или незаменимые LC PUFA, которые представляют продукт синтаз PUFA (например, DHA и EPA). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения такие масла могут быть по существу свободны от промежуточных или побочных продуктов, которые не являются целевыми продуктами или незаменимыми PUFA, и которые не получены природно при использовании системы эндогенной FAS в растениях дикого типа (например, растения дикого типа продуцируют такие коротко- или среднецепочечные PUFA, такие как PUFA с 18 атомами углерода, через систему FAS, но эти будут новыми или дополнительными жирными кислотами, полученными в растении в результате генетической модификации гетерологичными синтазами PUFA).

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения трансгенное растение или семена, экспрессирующие систему гетерологичных синтаз PUFA, приведенную в описании настоящей патентной заявки, также могут содержать по меньшей мере одно другое трансгенное событие в этом геноме, включая без ограничения: ген, кодирующий инсектицидный белок (например, инсектицидный белок Bacillus thuringiensis); ген толерантности к гербицидам (например, ген, обеспечивающий устойчивость к глифосату); и ген, вносящий вклад в заданный фенотип трансгенного растения, такой как повышенный выход, измененный метаболизм жирной кислоты или восстановление мужской цитоплазматической стерильности. В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере одну синтазу PUFA Schizochytrium, комбинируют с такими дополнительными трансгенами, либо при использовании технологии рекомбинантной ДНК, либо традиционной селекции растения уже содержащего дополнительный трансген(ы).

Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения также включают части растения, экспрессирующие систему гетерологичных синтаз PUFA, приведенных в описании настоящей патентной заявки. Такие части растений включают любые части растений, включая, например и без ограничений, семена (включая зрелые семена и незрелые семена); ткани; пыльцу; зародыши; цветки; плоды; побеги; листья; корни; стебли; и экспланты. Конкретные варианты воплощения настоящего изобретения включают потомоков растения, экспрессирующего систему гетерологичных синтаз PUFA, приведенных в описании настоящей патентной заявки.

VII. Товарные продукты Commodity products

Варианты воплощения настоящего изобретения включают продукты, полученные при использовании или из растений, потомков, частей растений или клеток, приведенных в описании настоящей патентной заявки, включая, например и без ограничений, масла, полученные из них. Следовательно, некоторые варианты воплощения настоящего изобретения включают товарные продукты, содержащие один или более полипептид и/или полинуклеотид системы гетерологичных синтаз ПНЖК, приведенной в описании настоящей патентной заявки, где товарные продукты получены из рекомбинантного растения или семян, экспрессирующих систему гетерологичных синтаз ПНЖК. Товарный продукт, содержащий один или более полипептид и/или полинуклеотид системы гетерологичных синтаз ПНЖК, приведенной в описании настоящей патентной заявки, включает, например и без ограничений: муку; масла; дробленое или цельное зерно или семена; и любой пищевой продукт, содержащий муку; масло; или дробленое или цельное зерно рекомбинантного растения или семена, содержащие один или более полипептид и/или полинуклеотид. Детектирование полипептидов и/или полинуклеотидов системы гетерологичных синтаз ПНЖК, приведенной в описании настоящей патентной заявки, в одном или более сырьевом растении или растительном товарном продукте по настоящему изобретению является доказательством того, что сырье или товарный продукт состоит из трансгенного растения, экспрессирующего систему гетерологичных синтаз ПНЖК. Например, детектирование полипептидов и/или полинуклеотидов системы гетерологичных синтаз ПНЖК, приведенной в описании настоящей патентной заявки, в качестве постороннего вещества в масле является de facto доказательством того, что масло было получено из трансгенного растения, экспрессирующего систему гетерологичных синтаз ПНЖК.

Варианты воплощения настоящего изобретения позволяют получить коммерчески ценные липиды, богатые одной или более заданной (целевой или незаменимой) ПНЖК, путем конструирования генетически модифицированных растений с применением системы гетерологичных синтаз ПНЖК, которые продуцируют ПНЖК, которые в ином случае не производятся этим видом растений. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированный организм по настоящему изобретению продуцирует одну или более полиненасыщенную жирную кислоту, включая без ограничения EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 или n-3) и любую их комбинацию. Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения включают, в частности маслосемена и масла, полученные из генетически модифицированных растений, приведенных в описании настоящей патентной заявки, содержащих эти ПНЖК.

Неизвестны растения, эндогенно содержащие синтазы ПНЖК и, следовательно, варианты воплощения настоящего изобретения обеспечивают возможность получения растений с уникальными возможностями продуцирования жирных кислот. Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения позволяют создать любое из множества «дизайнерских масел («designer oils»)», содержащих новые комбинации жирных кислот из растений в различных соотношениях и формах. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения применение системы гетерологичных синтаз ПНЖК, приведенной в описании настоящей патентной заявки, позволяет расширить пределы продуцирования ПНЖК, и успешно получить такую ПНЖК в температурных пределах, используемых при выращивании большинства культивируемых растений.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения товарный продукт-растение «по существу свободен от» промежуточных или побочных продуктов системы синтеза ПНЖК. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «по существу свободен от» означает, что любой промежуточный или побочный продукт жирных кислот (не целевая ПНЖК), который может быть получен в генетически модифицированном растение (и/или частях растения, и/или масляной фракции семян), являющийся результатом введения или присутствия гетерологичной системы ПНЖК (например, которая не продуцируется растением дикого типа или родительским растением, используемым в качестве реципиента для указанной генетической модификации), присутствует в количестве, например и без ограничений: менее чем 10% по массе от общих жирных кислот; менее чем 9% по массе от общих жирных кислот; менее чем 8% по массе от общих жирных кислот; менее чем 7% по массе от общих жирных кислот; менее чем 6% по массе от общих жирных кислот; менее чем 5% по массе от общих жирных кислот; менее чем 4% по массе от общих жирных кислот; менее чем 3% по массе от общих жирных кислот; менее чем 2% по массе от общих жирных кислот; менее чем 1% по массе от общих жирных кислот; и менее чем 0,5% по массе от общих жирных кислот.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, или его часть, которая экспрессирует систему гетерологичных синтаз ПНЖК, или масло, или семена, полученные из генетически модифицированного растения, потомка, клетки, ткани, или его части, содержит определяемое количество DHA (докозагексаеновая кислота (C22:6, n-3)), DPA(n-6) (докозапентаеновая кислота (C22:5 n-6)), и/или EPA (эйкозапентаеновая кислота (C20:5, n-3)).

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, или его часть, которая экспрессирует систему гетерологичных синтаз ПНЖК, или масло, или семена, полученные из генетически модифицированного растения, потомка, клетки, ткани, или его части, содержит, например и без ограничений; по меньшей мере 0,01%, по меньшей мере 0,02%, по меньшей мере 0,03%, по меньшей мере 0,04%, по меньшей мере 0,05%, по меньшей мере 0,06%, по меньшей мере 0,07%, по меньшей мере 0,08%, по меньшей мере 0,09%, по меньшей мере 0,1%, по меньшей мере 0,2%, по меньшей мере 0,3%, по меньшей мере 0,4%, по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 0,6%, по меньшей мере 0,7%, по меньшей мере 0,8%, по меньшей мере 0,9%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 2,5%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 3,5%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 4,5%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 5,5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 6,5%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 7,5%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 8,5%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 9,5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 10,5%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 11,5%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 12,5%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 13,5%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 14,5% или по меньшей мере 15% DHA по массе от общих жирных кислот. Используемые пределы могут быть выбраны между любыми из этих значений, например, от 0,01% до 15%, от 0,05% до 10% и от 1% до 5% DHA по массе от общих жирных кислот.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, или его часть, которая экспрессирует систему гетерологичных синтаз ПНЖК, или масло, или семена, полученные из генетически модифицированного растения, потомка, клетки, ткани, или его части, содержит, например и без ограничений; по меньшей мере 0,01%, по меньшей мере 0,02%, по меньшей мере 0,03%, по меньшей мере 0,04%, по меньшей мере 0,05%, по меньшей мере 0,06%, по меньшей мере 0,07%, по меньшей мере 0,08%, по меньшей мере 0,09%, по меньшей мере 0,1%, по меньшей мере 0,2%, по меньшей мере 0,3%, по меньшей мере 0,4%, по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 0,6%, по меньшей мере 0,7%, по меньшей мере 0,8%, по меньшей мере 0,9%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 2,5%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 3,5%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 4,5%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 5,5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 6,5%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 7,5%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 8,5%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 9,5%, и/или по меньшей мере 10% EPA по массе от общих жирных кислот. Используемые пределы могут быть выбраны между любыми из этих значений, например, от 0,01% до 10%, от 0,05% до 5% и от 0,1% до 5% EPA по массе от общих жирных кислот.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, или его часть, которая экспрессирует систему гетерологичных синтаз ПНЖК, или масло, или семена, полученные из генетически модифицированного растения, потомка, клетки, ткани, или его части, содержит, например и без ограничений; по меньшей мере 0,01%, по меньшей мере 0,02%, по меньшей мере 0,03%, по меньшей мере 0,04%, по меньшей мере 0,05%, по меньшей мере 0,06%, по меньшей мере 0,07%, по меньшей мере 0,08%, по меньшей мере 0,09%, по меньшей мере 0,1%, по меньшей мере 0,2%, по меньшей мере 0,3%, по меньшей мере 0,4%, по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 0,6%, по меньшей мере 0,7%, по меньшей мере 0,8%, по меньшей мере 0,9%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 2,5%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 3,5%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 4,5%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 5,5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 6,5%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 7,5%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 8,5%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 9,5%, и/или по меньшей мере 10% DPA(n 6) по массе общих жирных кислот. Используемые пределы могут быть выбраны между любыми из этих значений, например, 0,01% до 10%, от 0,01% до 5%, от 0,01% до 1%, от 0,01% до 0,05%, от 0,05% до 5% и от 0,1% до 5% DPA(n 6) по массе от общих жирных кислот.

Процент ПНЖК представляет процент по массе от общих жирных кислот, если ясно не указано иное. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения общие жирные кислоты определяют при использовании анализа с использованием газовой хроматографии (GC) препарата сложного метилового эфира жирной кислоты (FAME), хотя определение общих жирных кислот не ограничивается этим методом.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, или его часть, которая экспрессирует систему гетерологичных синтаз ПНЖК, или масло, или семена, полученные из генетически модифицированного растения, потомка, клетки, ткани, или его части, содержит соотношение EPA:DHA, например и без ограничений; по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 9,5:1, по меньшей мере 9:1, по меньшей мере 8,5:1, по меньшей мере 8:1, по меньшей мере 7,5:1, по меньшей мере 7:1, по меньшей мере 6,5:1, по меньшей мере 6:1, по меньшей мере 5,5:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 4,5:1, по меньшей мере 4:1, по меньшей мере 3,5:1, по меньшей мере 3:1, по меньшей мере 2,5:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 1,5:1, по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 1:1,5, по меньшей мере 1:2, по меньшей мере 1:2,5, по меньшей мере 1:3, по меньшей мере 1:3,5, по меньшей мере 1:4, по меньшей мере 1:4,5, по меньшей мере 1:5, по меньшей мере 1:5,5, по меньшей мере 1:6, по меньшей мере 1:6,5, по меньшей мере 1:7, по меньшей мере 1:7,5, по меньшей мере 1:8, по меньшей мере 1:8,5, по меньшей мере 1:9, по меньшей мере 1:10, по меньшей мере 1:11, по меньшей мере 1:12, по меньшей мере 1:13, по меньшей мере 1:14, по меньшей мере 1:15, по меньшей мере 1:16, по меньшей мере 1:17, по меньшей мере 1:18, по меньшей мере 1:19, по меньшей мере 1:20, по меньшей мере 1:21, по меньшей мере 1:22, по меньшей мере 1:23, по меньшей мере 1:24, по меньшей мере 1:25, по меньшей мере 1:26, по меньшей мере 1:27, по меньшей мере 1:28, по меньшей мере 1:29 или по меньшей мере 1:30 по массе общих жирных кислот. Используемые пределы могут быть выбраны между любыми из этих значений, например, соотношение EPA:DHA 10:1, от 5:1 до 1:1, от 2:1 до 1:1, от 1 до 1:30, от 1:1 до 1:25, от 1:1 до 1:20, от 1:1 до 1:15, от 1:1 до 1:10, от 1:1 до 1:5, от 1:1 до 1:3 и от 1:1 до 1:2 по массе общих жирных кислот.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, или его часть, которая экспрессирует систему гетерологичных синтаз ПНЖК, или масло, или семена, полученные из генетически модифицированного растения, потомка, клетки, ткани, или его части, содержит соотношение DPA(n 6):DHA, например и без ограничений; по меньшей мере 1:1, по меньшей мере 1:1,5, по меньшей мере 1:2, по меньшей мере 1:2,5, по меньшей мере 1:3, по меньшей мере 1:3,5, по меньшей мере 1:4, по меньшей мере 1:4,5, по меньшей мере 1:5, по меньшей мере 1:5,5, по меньшей мере 1:6, по меньшей мере 1:6,5, по меньшей мере 1:7, по меньшей мере 1:7,5, по меньшей мере 1:8, по меньшей мере 1:8,5, по меньшей мере 1:9, или по меньшей мере 1:10 по массе от общих жирных кислот. Используемые пределы могут быть выбраны между любыми из этих значений, например, соотношение DPA(n 6):DHA от 1:1 до 1:10, от 1:1 до 1:5, от 1:1 до 1:3 и от 1:1 до 1:2 по массе от общих жирных кислот.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения генетически модифицированное растение, потомок, клетка, ткани, или его часть, которая экспрессирует систему гетерологичных синтаз ПНЖК, или масло, или семена, полученные из генетически модифицированного растения, потомка, клетки, ткани, или его части, содержит, например и без ограничений, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% триглицеридов по массе масла. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения масло, полученное из генетически модифицированного растения, потомка, клетки, ткани, или его части, или семян по настоящему изобретению, содержит от 70% до 99% триглицеридов по массе масла, от 75% до 99% триглицеридов по массе масла, от 80% до 99% триглицеридов по массе масла, от 85% до 99% триглицеридов по массе масла или от 90% до 99% триглицеридов по массе масла. Такие триглицериды могут включать ДЦ ПНЖК, которые получены при использовании систем гетерологичных синтаз ПНЖК.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения, когда целевой продукт системы гетерологичных синтаз ПНЖК представляет ДЦ ПНЖК, такие как DHA, DPA (n 6 или n 3) или EPA, промежуточные продукты и побочные продукты, которые не присутствуют в существенных количествах в общих липидах генетически модифицированного растения, экспрессирующего систему, включающую, например и без ограничений: гамма линоленовую кислоту (GLA; 18:3, 6); стеаридоновую кислоту (STA или SDA; 18:4, 3); дигомо-гамма- линоленовую кислоту (DGLA или HGLA; 20:3, 6), арахидоновую кислоту (ARA, C20:4, 6); эйкозатриеновую кислоту (ETA; 20:3, n9), и различные другие промежуточные или побочные продукты, такие как 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); мидовую кислоту (20:3; Δ5,8,11); или 20:4 (Δ5,1,14,17).

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения ПНЖК, полученные при использовании системы гетерологичных синтаз ПНЖК, извлечены из генетически модифицированного растения, экспрессирующего систему при использовании процессов очистки, которые экстрагируют соединения из растения, потомка, клетки, ткани или его части. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения ПНЖК получены заготовкой растения, потомка, клетки, ткани или его часть. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения ПНЖК извлекают получением масла из растения, потомка, и ткани или его части (например, из маслосемян). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения растение, потомок, клетка, ткани, или его часть потребляется в его природном состоянии или прошла дополнительную технологическую обработку с получением пищевого продукта.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения масла из генетически модифицированного растения, экспрессирующего систему гетерологичных синтаз ПНЖК, могут быть использованы не в кулинарных или не в пищевых процессах и композициях. Некоторые из применений представляют промышленное, косметическое или медицинское (например, масла могут быть использованы в защитном барьере против инфекций и для усиления выживаемости трансплантата (Патент США 6,210,700)). Масла из генетически модифицированного растения, экспрессирующего систему гетерологичных синтаз ПНЖК, также могут быть использованы в любом применении, для которого масла по настоящему изобретению подходят. Как правило, масла могут быть использованы для замены, например, минеральных масел, сложных эфиров, жирных кислот или животных жиров в различных применениях, таких как смазочные масла, присадки к смазочным маслам, смазочно-охлаждающие жидкости, гидравлические жидкости и огнестойкие жидкости гидросистем. Масла также могут быть использованы в качестве сырьевых материалов в процессе получения модифицированных масел. Примеры технологий для модифицирования масел включают фракционирование, гидрогенизирование, изменение содержания олеиновой кислоты или линоленовой кислоты в масле, и другие технологии модификации, известные специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Примеры косметических применений масел из генетически модифицированного растения, экспрессирующего систему гетерологичных синтаз ПНЖК, включают применения в качестве эмолента в косметических композициях; в качестве заменителя технического вазелина; в качестве составной части мыла, в качестве сырьевого материала в процессе получения мыла; в качестве составной части растворов для перорального применения; в качестве составной части композиций против старения; и в качестве составной части препаратов для кожи и волос в виде пены в аэрозольной упаковке.

Следующие примеры приведены для иллюстрации некоторых конкретных признаков и/или вариантов воплощения настоящего изобретения. Примеры не ограничивают описание конкретных признаков или приведенных в качестве примера вариантов воплощения настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Материалы и Методы

Если не указано иное, молекулярно-биологические и биохимические манипуляции, описанные в следующих Примерах, были осуществлены при использовании стандартной методики, описанной, например в, Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; и аналогичное им.

Оптимизированные полинуклеотиды растения.

Множественные последовательности ДНК со сдвигом кодонов в каноле были сконструированы и синтезированы с получением в трансгенных растениях ферментов синтаз PUFA. Таблицу частот использования кодона A для канолы (Капуста декоративная Brassica napus L.) рассчитали по кодирующим белок последовательностям, полученным из последовательностей, депонированных в GenBank (доступно в интернете ncbi.nlm.nih.gov). Нормализованный набор кодонов канолы был рассчитан после исключения любого синонимичного кодона, используемого менее чем в около 10% от общих использований кодона для этой аминокислоты. Нормализованное представление для каждого кодона было рассчитано при использовании формулы:

Нормализованный % C1=1/(%C1+%C2+%C3…) × %C1×100,

где C1 представляет интересующий кодон и %C1, %C2, и %C3… представляет начальные показатели % использования оставшихся синонимичных кодонов.

Для получения кодон-оптимизированной последовательности ДНК канолы, кодирующей аминокислотную последовательность белка PFA1 SEQ ID NO:1, белка PFA2 SEQ ID NO:4, и белка PFA3 SEQ ID NO:7, были сделаны замены кодонов в экспериментально определенной (нативной) последовательности ДНК PFA1 (SEQ ID NO:2), последовательности ДНК PFA2 (SEQ ID NO:5) и последовательности ДНК PFA3 (SEQ ID NO:8) таким образом, что полученные в результате последовательности ДНК имели общий набор кодонов из Таблицы кодон-оптимизированных сдвигов в каноле.

Были сделаны дополнительные уточнения последовательностей для удаления нежелательных сайтов узнавания ферментов рестрикции, потенциальных сайтов сращивания интрона в растении, длинных отрезков A/T или C/G остатков и других мотивов, которые могут препятствовать стабильности mРНК, транскрипции, или трансляции кодирующей области в клетках растений. Для введения заданных сайтов узнавания ферментов рестрикции и для удаления длинных внутренних открытых рамок считывания (рамок, иных чем +1) были сделаны Другие изменения. Все эти изменения были сделаны в рамках сохранения нормализованного набора кодонов со сдвигом в каноле. Синтезировали полинуклеотиды, содержащие полученные в результате кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности ДНК канолы. Таблица 1.

Экстракция липидов и анализ

Семена с расщеплением анализировали при использовании метода анализа FAME для идентификации событий трансгенных растений (полученных из сои, канолы и арабидопсиса), которые содержали LC PUFA по сравнению с контрольными растениями, выращенными в тех же условиях. Провели количественный анализ содержания LC PUFA (%по массе по FAME) и сравнили с негативным контрольным растением. Анализ FAME провели на одном семени или провели валовый анализ семян каждого отдельного трансгенного события, которые были исследованы при использовании приведенного ниже протокола.

Анализ арабидопсиса и канолы. Образцы трансгенного семени (образцы либо одного семени канола, либо образцы семян навалом арабидопсиса) гомогенизировали в гептане, содержащем тригептадеканоин (Nu ChekTM Prep, Elysian, MN) в качестве триглицеридного внутреннего стандарта при использовании стальной шаровой мельницы. Перед гомогенизацией в метанол добавили раствор 0,25 M свеже полученного метилата натрия (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Экстракцию и дериватизацию провели при температуре 40°C при постоянном перемешивании. FAME экстракцию повторили три раза и слои гептана объединили перед анализом. Валовый анализ семян Арабидопсиса и анализ семени канолы состоял из 10 мг аликвот для Арабидопсиса или 8-12 семян для канолы, соответственно. Для завершения реакции дериватизации масло семян канолы навалом и одно семя сои сначала три раза экстрагировали гептаном. Затем аликвоту комбинированного масляного экстракта дериватизировали в FAME. Завершение реакции верифицировали проверкой на наличие эндогенный FAME в четвертой экстракции/дериватизации. Полученные в результате FAME проанализировали при использовании газовой хроматографии и детектора ионизации в пламени на газовом хроматографе Agilent 6890 Gas Chromatograph (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) и капиллярной колонке BPX 70™ (15 м × 0,25 мм × 0,25 μм) от SGE (Austin, TX). Каждый пик FAME идентифицировали по времени удержания и количественным анализом при инжекции контрольной смеси рапсового масла от Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) в качестве калибровочного стандарта с добавлением подходящих длинноцепочечных жирных кислот (Nu Chek Prep, Elysian MN). Результаты продуцирования DHA и других LC PUFA в Арабидопсисе, сое и каноле описаны ниже.

Пример 2: Экспрессия генов синтаз PUFA в растениях

Сконструировали бинарные векторы, содержащие единицы транскрипции растения (PTU), содержащие нативные и кодон-оптимизированные трансгены системы синтаз PUFA (PFA1, PFA2, и PFA3), функционально связанные с промотором и 3ʹ-UTR. Полученные в результате бинарные векторы также содержали PTU, содержащие HetI трансген, функционально связанный с промотором и 3ʹ UTR. Только один бинарный вектор включал трансген SzACS2, функционально связанный с промотором и 3ʹ-UTR (pDAB101429). Различные комбинации промотора и последовательности 3ʹ-UTR ввели в бинарные векторы для экспрессии системы синтаз PUFA и HetI трансгенов. Для изменения и варьирования уровней экспрессии трансгена использовали различные регуляторные элементы гена, введенные в конструкцию из PTU. Аналогично, PTU располагали в бинарном векторе в различных ориентациях для тестирования влияния ориентации PTU на изменение или варьирование уровней экспрессии трансгенов.

Протестировали три различные ориентации PTU. Бинарные векторы, содержащие PTU, расположенные в первой ориентации, имели конфигурацию голова-хвост.

Бинарные векторы, содержащие PTU, расположенные во второй ориентации, были сконструированы для использования bi-направленности 3ʹ-UTR. PTU PFA1 и HetI разделили одной 3ʹ-UTR, и ориентировали в следующей конфигурации; промотор:: интересующий ген:: 3ʹUTR:: интересующий ген:: промотор. Аналогично, PTU PFA3 и PFA2 разделили одной 3ʹ-UTR, и ориентировали в следующей конфигурации; промотор:: интересующий ген:: 3ʹUTR:: интересующий ген:: промотор.

Наконец, в третьей ориентации ввели последовательность спейсера рандомной ДНК (SEQ ID NO:12). Спейсер рандомной ДНК расположен между двумя PTU, ориентированными против хода транскрипции спейсера рандомной ДНК, и двумя PTU, ориентированными по ходу транскрипции спейсера рандомной ДНК. Оба набора PTU сконструировали в ориентации голова-голова. Соответственно, ориентация представляет следующее; ← PFA1 PTU:: HetI PTU →:: спейсер рандомной ДНК:: ← PFA3 PTU:: PFA 2 PTU →.

ПЕРВАЯ ОРИЕНТАЦИЯ

pDAB101429. Плазмида pDAB101429 (SEQ ID NO:15) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU ацил-CoA-синтетазы, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил- трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит усеченный промотор гена фитогемаглютинин-L Phaseolus vulgaris (промотор v2 PvDlec2; GenBank Номер доступа X06336), 5' -нетранслируемая область гена AT2S3 Арабидопсиса Arabidopsis thaliana (2S 5'-UTR; GenBank Номер доступа NM_118850), Синтаза полиненасыщенной жирной кислоты PFA1 v2 Schizochytrium sp. и 3' -нетранслируемая область v1 терминатора гена 2S альбумина Арабидопсиса Arabidopsis thaliana (At2S SSP терминатор v1; GenBank Номер доступа M22035). Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2, 5'-UTR 2S, v2 PFA2 Синтазы полиненасыщенной жирной кислоты Schizochytrium sp., и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2, 5'-UTR 2S, v2 PFA3 Синтазы полиненасыщенной жирной кислоты Schizochytrium sp. и v1 терминатор At2S SSP. PTU ацил-CoA-синтетаза содержит v2 промотор PvDlec2, 5'-UTR 2S, ацил-CoA-синтетазы Schizochytrium sp. (v3 SzACS 2) и v1 терминатор At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v2 промотор PvDlec2, 5'-UTR 2S, HetI 4'-фосфопантетеин-трансферазы (NoHetI v3) Nostoc sp. и v1 терминатор At2S SSP. Эти пять PTU были размещены в ориентации голова-хвост в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растений (pDAB7333). Порядок генов: v2 PFA1, v2 PFA2, v2 PFA3, v3 SzACS 2, v3 NoHetI. Бинарный вектор трансформации растения также содержит PTU фосфинотрицин- ацетил- трансферазы: Промотор вируса мозаики прожилок кассавы (промотор v2 CsVMV; Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129 -1139; 1996), ген фосфинотрицин- ацетил- трансферазы (v5 PAT; Wohlleben et al., Gene 70:25 -37; 1988) и 3ʹ-нетранслируемую область ORF1 Agrobacterium tumefaciens (v4 3'-UTR AtuORF1; Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814 1822; 1990) дополнительно к другим регуляторным элементам, таким как усиливающие последовательности (Toro et al., PNAS 85(22): -8558 8562; 1988) и T-ДНК пограничные последовательности (A граница T-ДНК и B граница T-ДНК; Gardner et al., Science 231:725-727; 1986 and International Publication No. WO 2001/025459 A1). Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB101454. Плазмида pDAB101454 (SEQ ID NO:16) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и одну PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU содержит v2 промотор PvDlec2 синтаз PUFA; 5'-UTR 2S; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; v1 терминатор и At2S SSP. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU содержит v2 промотор PvDlec2 синтазы PUFA; 5'-UTR 2S; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и терминатор v1 At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 NoHetI; и терминатор v1 At2S SSP. Эти четыре PTU, указанные выше, размещены в ориентации голова-хвост в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v2 PFA2, v2 PFA3, v3 NoHetI. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин- ацетил- трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB101496. Плазмида pDAB101496 (SEQ ID NO:17) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; терминатор v1 и At2S SSP. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v4 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; и 23/24 3' -нетранслируемую область открытой рамки считывания Ti плазмиды Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1 GenBank Номер доступа AF242881.1). Третья PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 PFA3 (SEQ ID NO:13, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:14) Schizochytrium sp.; и терминатор v1 At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит промотор v5 PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v3 NoHetI; и v1 3'-UTR AtuORF23. Эти четыре PTU разместили в ориентации голова-хвост в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v2 PFA2, v3 PFA3, v3 NoHetI. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил- трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB109525. Плазмида pDAB109525 (SEQ ID NO:18) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит промотор v2 PvDlec2; 5'-UTR 2S; PFA1 v1 Schizochytrium sp.; и терминатор v1 At2S SSP. Вторая PTU синтазы PUFA содержит промотор v2 PvDlec2; 5'-UTR 2S; PFA2 v1 Schizochytrium sp.; и терминатор v1 At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит промотор v2 PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 PFA3 Schizochytrium sp.; и терминатор v1 At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит промотор v2 PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 NoHetI; и терминатор v1 At2S SSP. Эти четыре PTU разместили в ориентации голова-хвост в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов:v1 PFA1, v1 PFA2, v3 PFA3, v3 NoHetI. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Затем выделили рекомбинантные плазмиды, содержащие четыре PTU, и протестировали их для введения расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB109584. Плазмида pDAB109584 (SEQ ID NO:19) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы PTU и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит промотор гена капусты декоративной Brassica napus napin (промотор v1 BnaNapinC; GenBank Номер доступа M64633.1). 5' -нетранслируемую область гена капусты декоративной Brassica napus napin (v1 5'-UTR BnaNapinC; GenBank Номер доступа M64633.1), v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и 5' -нетранслируемую область гена капусты декоративной Brassica napus napin (v1 3'-UTR BnaNapinC; GenBank Номер доступа M64633.1). Вторая PTU синтазы PUFA содержит усеченный промотор бета-фазеолина Phaseolus vulgaris (v4 промотор PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1); 5' -нетранслируемую область бета-фазеолина Phaseolus vulgaris (5ʹ-UTR PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1); v2 PFA2 Schizochytrium sp., 3' -нетранслируемую область бета-фазеолина Phaseolus vulgaris (v1 3'-UTR PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1); и 3ʹ-MAR бета-фазеолина Phaseolus vulgaris (v2 3'-MAR PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1). Третья PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит промотор гена ацилпереносящего белка капусты декоративной Brassica oleracea (BoACP промотор v1; международный публикационный № WO 1992/18634); 5' -нетранслируемую область ацилпереносящего белка капусты декоративной Brassica oleracea (v2 5'-UTR BoACP; Международный публикационный № WO 1992/18634); v3 NoHetI; и 3ʹ -нетранслируемую область гена ацилпереносящего белка капусты декоративной Brassica napus napin (v1 3'-UTR BnACP05; GenBank Номер доступа X64114.1). Эти четыре PTU разместили в ориентации голова-хвост в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v2 PFA2, v3 PFA3, v3 NoHetI. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB109588. Плазмида pDAB109588 (SEQ ID NO:20) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит промотор бета-фазеолина Phaseolus vulgaris (v3 промотор PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1); 5ʹ-UTR PvPhas; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v1 промотор BnaNapinC; v1 5'-UTR BnaNapinC; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; и v1 3'-UTR BnaNapinC. Третья PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит промотор v1 BoACP; 5' -нетранслируемую область гена ацилпереносящего белка капусты декоративной Brassica oleracea (v1 5'-UTR BoACP; Международный публикационный № WO 1992/18634); v3 NoHetI; и v1 3'- UTR AtuORF23. Эти четыре PTU были размещены в ориентации голова-хвост в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v2 PFA2, v2 PFA3, v3 NoHetI. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB112210. Плазмида pDAB112210 (SEQ ID NO:21) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы, и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v1 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v1 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 NoHetI; и v1 терминатор At2S SSP. Эти четыре PTU разместили в ориентации голова-хвост в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v1 PFA1, v1 PFA2, v1 PFA3, v1 NoHetI. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как укзаано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB112206. Плазмида pDAB112206 (SEQ ID NO:22) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтаз PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Вторая PTU синтаз PUFA содержит v4 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. Третья PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит усеченный промотор бета-фазеолина Phaseolus vulgaris (v6 промотор PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1); 5ʹ-UTR PvPhas; v3 NoHetI; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. Эти четыре PTU, указанные выше, разместили в ориентации голова-хвост в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v2 PFA2, v3 PFA3, v3 NoHetI. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

ВТОРАЯ ОРИЕНТАЦИЯ

pDAB107962. Плазмида pDAB107962 (SEQ ID NO:23) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтаз PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v3 NoHetI; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v1 3'-UTR AtuORF23. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v1 3'-UTR AtuORF23. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост, и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между двумя PTU; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v2 PFA3 и v1 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v1 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB109591. Плазмида pDAB109591 (SEQ ID NO:24) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; v3 NoHetI; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v1 3'-UTR AtuORF23. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; 3'- v1 UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v1 3'-UTR AtuORF23. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU; v3 NoHetI и v3 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v3 PFA3 и v2 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v3 PFA3, v2 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB109592. Плазмида pDAB109592 (SEQ ID NO:25) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v1 промотор BnaNapinC; v1 5'-UTR BnaNapinC; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 3'-UTR BnaNapinC, PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v1 промотор BoACP; 5' -нетранслируемая область ацилпереносящего белка капусты декоративной Brassica oleracea (v2 5'-UTR BoACP; Международный публикационный № WO 1992/18634); v3 NoHetI; v1 3'-UTR BnACP05; и v1 3'-UTR AtuORF23. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v6 промотор PvPhas; 5'-нетранслируемую область бета-фазеолин Phaseolus vulgaris (5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1); v2 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v1 3'-UTR AtuORF23. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU; v3 NoHetI и v3 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v3 PFA3 и v2 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v3 PFA3, v2 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Затем выделили рекомбинантные плазмиды, содержащие четыре PTU, и протестировали их для введения расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB107960. Плазмида pDAB107960 (SEQ ID NO:26) содержит три PTU синтазы PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v1 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP, PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; v3 NoHetI; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; v1 3'-UTR AtuORF23. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v1 3'-UTR AtuORF23. v1 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между двумя PTU; v3 NoHetI и v3 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v3 PFA3 и v1 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между двумя PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v1 PFA1, v3 NoHetI, v3 PFA3, v1 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB110132. Плазмида pDAB110132 (SEQ ID NO:27) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы, и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит промотор бета-фазеолина Phaseolus vulgaris (v3 промотор PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1); 5'-нетранслируемую область бета-фазеолина Phaseolus vulgaris (5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1); v2 PFA1 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v1 промотор BoACP; v2 5'-UTR BoACP; v3 NoHetI; v1 3'-UTR BnACP05; и v1 3'-UTR AtuORF23. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v1 промотор BnaNapinC; v1 5'-UTR BnaNapinC; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR BnaNapinC; и v1 3'-UTR AtuORF23, v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v2 PFA3 и v1 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v1 PFA2, pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB107961. Плазмида pDAB107961 (SEQ ID NO:28) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v3 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; v1 PFA1 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит BoACP v1 промотор; v2 5'-UTR BoACP; v3 NoHetI; v1 3'-UTR BnACP05; и v1 3'-UTR AtuORF23. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v3 PFA3 Schizochytrium sp.; и At2S SSP терминатор v1. Третья PTU синтазы PUFA содержит v1 промотор BnaNapinC; v1 5'-UTR BnaNapinC; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR BnaNapinC; и v1 3'-UTR AtuORF23. v1 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU; v3 NoHetI и v3 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v3 PFA3 и v1 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v1 PFA1, v3 NoHetI, v3 PFA3, v1 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК

pDAB110151. Плазмида pDAB110151 (SEQ ID NO:29) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и фосфинотрицин-ацетил-трансферазы PTU. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v1 промотор BnaNapinC; v1 5'-UTR BnaNapinC; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 3'-UTR BnaNapinC, PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; v3 NoHetI; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v1 3'-UTR AtuORF23. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v1 промотор BnaNapinC; v1 5'-UTR BnaNapinC; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v2 PFA3 и v1 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v1 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB112285. Плазмида pDAB112285 (SEQ ID NO:30) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP, PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; v3 NoHetI; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v3 3'-UTR AtuORF25/26. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и v1 3'-UTR AtuORF23. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF25/26 разместили между PTU; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v2 PFA3 и v1 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v1 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин- ацетил- трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB117501. Плазмида pDAB117501 (SEQ ID NO:31) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v1 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v6 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; v3 NoHetI; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; GenBank Номер доступа J01263.1; и v3 3'-UTR AtuORF25/26. Вторая PTU синтазы PUFA содержит промотор гена альфа-прайм субъединиц бета-конглицина и 5'-нетранслируемую область сои культурной Glycine max (SSPRO2745.1; GenBank Номер доступа GU723691,1); v1 PFA3 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. Третья PTU синтазы PUFA содержит v1 промотор BnaNapinC; v1 5'-UTR BnaNapinC; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR BnaNapinC, v1 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF25/26 разместили между PTU; v3 NoHetI и v1 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v1 PFA3 и v1 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v1 PFA1, v3 NoHetI, v1 PFA3, v1 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB117502. Плазмида pDAB117502 (SEQ ID NO:32) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v3 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas промотор PvPhas; v1 PFA1 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v1 промотор BnaNapinC; v1 5'-UTR BnaNapinC; v3 NoHetI; v1 3'-UTR BnaNapinC; и v1 3'-UTR AtuORF25/26. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; Schizochytrium sp. v1 PFA3; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2745.1; v1 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. v1 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF25/26 разместили между PTU; v3 NoHetI и v1 PFA3 разместили в ориентации голова-голова; v1 PFA3 и v1 PFA2 разместили в ориентации хвост-хвост и 3ʹ-UTR AtuORF23 разместили между PTU в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v1 PFA1, v3 NoHetI, v1 PFA3, v1 PFA2, pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

ТРЕТЬЯ ОРИЕНТАЦИЯ

pDAB112200. Плазмида pDAB112200 (SEQ ID NO:33) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP, PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v4 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v3 NoHetI; v1 3'-UTR AtuORF23; и спейсер рандомной ДНК. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP. Третья PTU синтазы PUFA содержит v5 промотор PvPhas; 5ʹ-UTR PvPhas; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; и v1 3'-UTR AtuORF23, v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации голова-голова; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации хвост-хвост со спейсером рандомной ДНК, размещенным между двумя PTU; v2 PFA3 и v2 PFA2 разместили в ориентации голова-голова в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v2 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB112201. Плазмида pDAB112201 (SEQ ID NO:34) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит промотор гена и 5'-нетранслируемую область 3 кетоацил-CoA синтазы Lesquerella fendleri (v2 промотор LfKCS3; GenBank Номер доступа AF367052.1); v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и 3' -нетранслируемую область гена 3 кетоацил-CoA синтазы (SSTER2742.1; GenBank Номер доступа AF367052.1). PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v1 промотор BoACP; v2 5'-UTR BoACP; v3 NoHetI; v1 3'-UTR BnACP05; и спейсер рандомной ДНК. Вторая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор LfKCS3; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и SSTER2742.1. Третья PTU синтазы PUFA содержит v1 промотор BoACP; v2 5'-UTR BoACP; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; и v1 3'-UTR BnACP05. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации голова-голова; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации хвост-хвост со спейсером рандомной ДНК, размещенным между двумя PTU; v2 PFA3 и v2 PFA2 разместили в ориентации голова-голова в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v2 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB112203. Плазмида pDAB112203 (SEQ ID NO:35) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин трансферазы PTU и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2745.1; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит промотор гена и 5' -нетранслируемую область ингибитора 3 трипсина Кунитца сои культурной Glycine max (SSPRO2743.1; GenBank Номер доступа AF233296.1); v3 NoHetI; 3'-нетранслируемую область гена ингибитора 3 трипсина Кунитца сои культурной Glycine max (SSTER2744.1; GenBank Номер доступа AF233296.1); и спейсер рандомной ДНК. Вторая PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2745.1; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. Третья PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2743.1; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; и SSTER2744.1, v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации голова-голова; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации хвост-хвост со спейсером рандомной ДНК, размещенным между двумя PTU; v2 PFA3 и v2 PFA2 разместили в ориентации голова-голова в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v2 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB112205. Плазмида pDAB112205 (SEQ ID NO:36) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин трансферазы PTU и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и v1 терминатор At2S SSP, PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v1 промотор BoACP; v2 5'-UTR BoACP; v3 NoHetI; v1 3'-UTR BnACP05; и спейсер рандомной ДНК. Вторая PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2743.1; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и SSTER2744.1. Третья PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2745.1; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации голова-голова; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации хвост-хвост со спейсером рандомной ДНК, размещенным между двумя PTU; v2 PFA3 и v2 PFA2 разместили в ориентации голова-голова в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v2 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB112208. Плазмида pDAB112208 (SEQ ID NO:37) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2743.1; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и SSTER2744.1. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит SSPRO2745.1; v3 NoHetI; v1 3'-UTR PvPhas; v2 3'-MAR PvPhas; и спейсер рандомной ДНК. Вторая PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2743.1; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; и SSTER2744.1. Третья PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2745.1; v2 PFA2 Schizochytrium sp.; и v2 3'-MAR PvPhas. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации голова-голова; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации хвост-хвост со спейсером рандомной ДНК, размещенным между двумя PTU; v2 PFA3 и v2 PFA2 разместили в ориентации голова-голова в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v2 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

pDAB112209. Плазмида pDAB112209 (SEQ ID NO:38) содержит три PTU синтаз PUFA, одну PTU фосфопантетеин-трансферазы и PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы. В частности, первая PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2743.1; v2 PFA1 Schizochytrium sp.; и SSTER2744.1. PTU фосфопантетеин-трансферазы содержит v1 промотор BoACP; v2 5'-UTR BoACP; v3 NoHetI; BnACP05 3' UTR v1; и спейсер рандомной ДНК. Вторая PTU синтазы PUFA содержит SSPRO2745.1; v2 PFA3 Schizochytrium sp.; v1 3'-UTR PvPhas; и v2 3'-MAR PvPhas. Третья PTU синтазы PUFA содержит v2 промотор PvDlec2; 5'-UTR 2S; Schizochytrium sp. v2 PFA2; и v1 терминатор At2S SSP. v2 PFA1 и v3 NoHetI разместили в ориентации голова-голова; v3 NoHetI и v2 PFA3 разместили в ориентации хвост-хвост со спейсером рандомной ДНК, размещенным между двумя PTU; v2 PFA3 и v2 PFA2 разместили в ориентации голова-голова в пограничных областях T-ДНК бинарного вектора трансформации растения, pDAB7333. Порядок генов: v2 PFA1, v3 NoHetI, v2 PFA3, v2 PFA2. pDAB7333 также содержит PTU фосфинотрицин-ацетил-трансферазы, как указано выше. Были выделены рекомбинантные плазмиды и протестированы для введения PTU расщеплением ферментами рестрикции и секверированием ДНК.

Трансформация агробактерии Agrobacterium tumefaciens.

Выбранными бинарными конструктами трансформировали штаммы агробактерии для трансформации растений. Штаммы, выбранные для трансформации, представляли призводные штамма EHA 105 A. tumefaciens. Далее двумя штаммами AGL1 и DA2552 A. Tumefaciens (смотрите, международную патентную публикацию № WO2012016222) трансформировали при использовании бинарных конструктов и подтвердили расщеплением ферментами рестрикции и секвенированием.

События T₀ трансформированного Арабидопсиса при использовании агробактерии Agrobacterium tumefaciens, содержащего бинарные плазмиды, кодирующие гены синтаз PUFA и HetI (и в некоторых случаях SzACS2) под контролем элементов экспрессии растения, как указано выше, генерировали по существу при использовании метода погружения в краситель, как описано в Clough and Bent (1998) Plant J. 16(6):735 43. Были получены события T₀ Арабидопсис и выбраны для выращивания до зрелости и самоопыления. Полученные в результате семена T₁ собрали и высеяли. Трансформированные T₁ растения были выбраны при использовании распыления фосфинотрицина для отбора этих растений, содержащих функциональный ген pat в качестве селектируемого маркера. Взяли образцы тканей листьев T₁ растений, перенесших обработку и провели анализ количественных ПЦР реакций, специфичных для гена pat, для идентификации этих растений, содержащих единичную копию селектируемого маркера (и связанные с трансгенами). Эти растения выращивали до созревания и семена T₂ собрали и анализировали на содержание LC PUFA (как % общих экстрагируемых FAME).

Трансформация канолы

Проращивание семян. Семена канолы дикого типа (разновидность DH12075; ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1456120/) поверхностно стерилизовали в 10% Clorox в течение 10 минут и трижды промыли стерильной дистиллированной водой (во время этого процесса семена находились в металлических ситах). Семена проращивали на ½ MS среде для канолы (1/2X MS, 2% сахарозы, 0,8% агара), находящейся в фитатреях, 25 семян на фитатрей, и поместили в вегетационную камеру Percival Growth Chamber™ с установленным режимом роста при температуре 25°C, с фотопериодом 16 часов света, 8 часов темноты; и проращивали в течение 5 дней.

Предварительная обработка. На 5 день сегменты гипокотиля около 3 мм в длину асептически отделили, удалили корни и части побегов (высыхание гипокотиля предотвратили помещением сегментов гипокотиля в 10 мл стерильной воды MILLIQ® в процессе отделения). Сегменты гипокотиля поместили вертикально на стерильную фильтровальную бумагу на MSK1D1 среду индукции каллуса (1X MS, 1 мг/л кинетина, 1 мг/л 2,4 D, 3% сахарозы, 0,7% PHYTAGAR®) в течение 3 дней предварительной обработки в вегетационной камере Percival Growth Chamber™ с установленным режимом роста при температуре 22-23°C, и с фотопериодом 16 часов света, 8 часов темноты.

Совместное культивирование с агробактериями. За день перед обработкой агробактериями инокулировали колбы со средой YEP, содержащей подходящие антибиотики. Сегменты гипокотиля переместили с фильтровальной бумаги в пустые 100×25 мм чашки Петри, содержащие 10 мл жидкой M среды, для предотвращения высыхания сегментов гипокотиля. На этой стадии при использовании шпателя выкопали и переместили сегменты. Жидкую M среду удалили при использовании пипетки и в чашку Петри добавили 40 мл суспензии агробактерий (500 сегментов на 40 мл раствора агробактерий). Сегменты обрабатывали в течение 30 минут с периодическим перемешиванием с образованием вихря в чашке Петри, таким образом, гипокотиль остается погруженным в раствор агробактерий.

По окончанию периода обработки раствор агробактерий удалили при использовании пипетки в лабораторный стакан для отходов, автоклавировали и утилизировали (раствор агробактерий полностью удалили для предотвращения чрезмерного роста агробактерий. Обработанный гипокотиль переместили при использовании пинцета обратно в оригинальные планшеты, содержащие MSK1D1, с фильтровальной бумагой (были приняты меры для обеспечения не высыхания сегментов). Сегменты гипокотиля вместе с контрольными сегментами вернули в вегетационную камеру Percival Growth Chamber™ при пониженной интенсивности освещения (укрывание планшетов алюминиевой фольгой), и обработанный гипокотиль культивировали совместно с агробактериями в течение 3 дней.

Индукция каллуса на селективной среде. Через 3 дня после совместного культивирования сегменты гипокотиля переместили по отдельности при использовании пинцета на среду MSK1D1H1 для индукции каллуса (1X MS, 1 мг/л Кинетина, 1 мг/л 2,4 D, 0,5 гм/л MES, 5 мг/л AgNo3, 300 мг/л TIMENTIN®, 200 мг/л Carbenicillin™, 1 мг/л Herbiace™, 3% сахарозы, 0,7% PHYTAGAR®). Сегменты гипокотиля заякорили на среде, но не внедрили в среду.

Селекция и регенерация побегов. После 7 дней на среде для индукции каллуса прошедшие каллусообразование сегменты гипокотиля переместили в среду для регенерации побегов 1 Shoot Regeneration Medium 1 с селекцией MSB3Z1H1 (1X MS, 3 мг/л BAP, 1 мг/л желатина, 0,5 гм/л MES, 5 мг/л AgNO3, 300 мг/л TIMENTIN®, 200 мг/л Carbenicillin™, 1 мг/л Herbiace™, 3% сахарозы, 0,7% PHYTAGAR®). Через 14 дней гипокотили с побегами переместили в среду 2 для регенерации с повышенной селекцией MSB3Z1H3 (1X MS, 3 мг/л BAP, 1 мг/л желатина, 0,5 гм/л MES, 5 мг/л AgNO3, 300 мг/л TIMENTIN®, 200 мг/л Carbenicillin™, 3 мг/л Herbiace™, 3% сахарозы, 0.7% PHYTAGAR®).

Элонгация побегов. Через 14 дней сегменты с побегами переместили в среду для элонгации побегов MSMESH5 (1X MS, 300 мг/л TIMENTIN®, 5 мг/л Herbiace™, 2% сахарозы, 0,7% TC Agar™). Выделили уже увеличившиеся в длину побеги и переместили в MSMESH5. Через 14 дней остальные побеги, которые не увеличились в длину в первом раунде, поместили на MSMESH5 и переместили на свежую селективную среду с той же композицией. На этой стадии все остальные сегменты гипокотиля утилизировали. Выделили побеги, которые увеличились в длину на среде MSB3Z1H3 после 2 недель, и переместили в среду MSMESH5. Выделили остальные побеги, которые не увеличились в длину в первом раунде на MSMESH5, переместили в свежую селективную среду с той же композицией. На этой стадии все остальные сегменты гипокотиля утилизировали.

Индукция корней. Через 14 дней побеги переместили в среду MSMEST (1X MS, 0,5 г/л MES, 300 мг/л TIMENTIN®, 2% сахарозы, 0,7% TC Agar™) для индукции корней. Побеги, которые не дали корней при первом переносе на среду MSMEST, переместили на второй или третий цикл на среду MSMEST до момента появления корней у растений.

ПЦР анализ. Образцы для ПЦР были забраны после культивирования на среде MSMESH5 по меньшей мере в течение 14 дней. Ткани листьев зеленых побегов протестировали при использовании ПЦР на присутствие селектируемого маркера pat гена. Все хлоротические побеги удалили и не подвергали ПЦР анализу. Образцы, подходящие для проведения реакции ПЦР, сохранили, и побеги оставили на среде MSMEST для элонгации и развития корней. Побеги, не подходящие для проведения анализа ПЦР, утилизировали. Растения, давшие корни на средах MSMESH5 или MSMEST и подходящие для ПЦР, направили на пересадку в почву. После укоренения растения канолы T₀ дополнительно проанализировали на события, которые содержали все PTU кассеты трансгена, и эти растения переместили в теплицу, вырастили до зрелости и собрали семена T₁ для анализа композиции жирных кислот.

Трансформация сои

Семядольный узел сои. Провели агробактерия-опосредованную трансформацию сои (соя культурная Glycine max c.v., Maverick) при использовании штамма агробактерии, несущий бинарный вектор согласно модифицированной процедуре Zeng et al. (2004) Plant Cell Rep. 22(7): 478-82. Протокол модифицировали для включения в качестве селективного агента гербицида глюфосината. Дополнительно, другая включенная модификация представляла проращивание стерилизованных семян сои на базальной среде B5 (Gamborg et al. (1968) Exp Клетка Res. 50(1):151-8), загущенной 3 г/л Phytagel™ (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.). Конечной модификацией в задействованном протоколе было использование эксплантов семядольных узлов, которые получили из 5-6 всходов, инфицированных агробактериями, как описано в by Zhang et al. (1999) Plant Cell Tiss. Org. 56: 37-46. Как описано в Zeng et al. (2004), совместное культивирование проводили в течение 5 дней на среде для совместного культивирования. Инициацию побегов, инициацию элонгации и среду для корнеобразования обогатили 50 мг/л Cefotaxime™, 50 мг/л TIMENTIN®, и 50 мг/л Vancomycin™, и загустили 3 г/л Phytagel™.

Продольный раскол семян сои при использовании метода трансформации. Провели агробактерия-опосредованную трансформацию сои (соя культурная Glycine max c.v., Maverick) при использовании штамма агробактерии, несущий бинарный вектор, согласно модифицированной процедуре Paz et al. (2005) Plant Cell Rep. 25:206-13. Кратко, семена сои разрезали на половинки вдоль рубчика для разделения семени и удаления оболочки семени. Из семядольного узла удалили рубчик и любые боковые побеги/почки. Полученные в результате экспланты половинок семян инфицировали агробактериями. Инициацию побегов, инициацию элонгации и среду для корнеобразования обогатили 50 мг/л Cefotaxime™, 50 мг/л TIMENTIN®, и 50 мг/л Vancomycin™, и загустили 3 г/л Phytagel™. Провели селекцию с глюфосинатом для ингибирования роста не трансформированных побегов.

Продольный раскол сои с рубчиком при использовании метода трансформации. Провели агробактерия-опосредованную трансформацию сои (соя культурная Glycine max c.v., Maverick) при использовании штамма агробактерии, несущего бинарный вектор, при использовании протокола трансформации эксплантов сои с продольным расколом семян с частичным рубчиком, описанным в предварительной заявке на патент США № 61/739,349. После трансформации ткани сои культивировали при использовании методов культивирования тканей, описанных в предварительной заявке на патент США № 61/739,349. Провели селекцию с глюфосинатом для ингибирования роста не трансформированных побегов. Селекционированные побеги переместили в среду для корнеобразования для развития корней и затем переместили в почвенную смесь для адаптации всходов.

Обработали поверхность терминальных листочков селекционированных всходов (технология окрашивания листа) глюфосинатом для обнаружения предполагаемых трансформантов. Прошедшие скрининг всходы переместили в теплицу, провели акклиматизацию и затем окрасили листья глюфосинатом для подтверждения толерантности. Провели забор образцов этих предполагаемых трансформированных растений T₀, для подтверждения наличия трансгенов в PTU использовали молекулярный анализ. Идентифицированным растениям T₀ позволили самоопылиться в теплице с получением семян T₁ для анализа композиции жирных кислот.

Липидный анализ зрелых семян T1 из трансгенных событий сои.

В теплице до зрелости вырастили растения T₀ с 3 конструктами pDAB101454, pDAB101496 и pDAB107960. Селекцию растений провели по наличию копий v5 PAT и сопутствующему наличию четырех генов для продуцирования DHA. Эти растения подвергли самоопылению и полученные в результате семена T₁ собрали на стадии зрелости. Отдельные семена анализировали при использовании FAME газовой хроматографии и детектора ионизации для определения содержания LC PUFA и DHA в семенах сои T₁. Двенадцать зрелых цельных семян растения были по отдельности проанализированы измельчением семян прессом и гомогенизацией при использовании стальных шаров и шаровой мельницы (Spex SamplePrep, LLC). Ткани обезжирили три раза гексаном, объединенные фракции гексана выпарили до сухости и взвесили остаток, взвешенный остаток восстановили гептаном для FAME анализа. Известное количество масляного остатка трансметилировали 0,25 M свеже полученного метилата натрия (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) в метаноле в присутствии суррогата, тригептадеканоина (Nu Chek Prep, Elysian, MN). Реакцию провели при умеренном нагревании (40°C) и постоянном перемешивании, полученные в результате FAME экстрагировали гептаном. Завершение реакции подтвердили восстановлением прореагировавшего суррогата эфира метил гептадеканоата. FAME экстракты проанализировали при использовании газовой хроматографии и детектора ионизации в пламени на газовом хроматографе Agilent 6890 Gas Chromatograph (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) и капиллярной колонке BPX 70™ (15 м × 0,25 мм × 0,25 μм) от SGE (Austin, TX). Каждый пик FAME идентифицировали по времени удержания и количественным анализом при инжекции контрольной смеси рапсового масла от Matreya LLC (Pleasant Gap, PA). Калибровочный стандарт содержал добавленные по отдельности стандарты DHA (C22:6), EPA (C20:5), DPA(n 6) (C22:5), эфиры метил γ- линоленоата (C18:3) и арахидоната от Nu Chek. Полученные данные проанализировали при использовании программного обеспечения ChemStation4 software (Agilent).

DHA составила 60% общего содержания LC PUFA в этих семенах T₂, содержащих LC PUFA. В семенах сои T₂ были определены только две новых LC PUFA, DHA и DPA (n 6). Ожидаемые жирные кислоты в семенах сои определялись на нормальных уровнях, за исключением того, что общие C₁₈ жирные кислоты были пропорционально ниже из-за наличия LC PUFA. В этих трансгенных семенах сои две другие жирные кислоты (γ-линоленовая и арахидоновая кислоты) были определены на низком уровне (менее чем 1% вместе).

Молекулярное подтверждение трансформантов растений

Анализ числа копий и определение кодирующей области. Растения T₀ идентифицировали и селекционировали по трансформациям, указанным выше. Эти трансформанты дополнительно анализировали для идентификации растений, содержащих каждый из PTU кассет экспрессии трансгена. Анализ с гидролизными зондами, аналогичный TAQMAN®, провели на начальном этапе скрининга и подтвердили присутствие PFA1, PFA2, PFA3, HetI, SzACS2, и трансгенов pat и отсутствие гена VirD2 агробактерии. Анализ был проведен, как указано выше, в международных патентных публикациях № WO2013016546 и WO2011146524. Полученные данные этих исследований при использовании количественной ПЦР использовали для определения присутствия трансгенов и копий. События, содержащие все PTU, были отобраны для последующей работы с растениями T1.

Определение белков синтазы PUFA в семенах канолы и арабидопсиса. Для обнаружения полипептидов синтазы PUFA в образцах семян канолы и арабидопсиса были разработаны методы количественного вестерн-блоттинга. Антигены полнодлинных PFA1 и PFA3 были рекомбинантно экспрессированы при использовании N терминального HIS tag и частично очищены при использовании кобальт-аффинной хроматографии. Антигены полнодлинного PFA2 не содержали HIS tag, и были выделены из телец включения. N терминальный PFA2 фрагмент и PFA3 фрагмент, которые дублируют друг друга предсказанным ER доменом, также были рекомбинантно экспрессированны как антигены. Все эти фрагменты были представлены, как кусочки геля для выработки поликлональных антител у кроликов. Антигены полнодлинного HetI были рекомбинантно экспрессированны при использовании N терминального 6X His tag в клетках BL21(DE3) Escherichia coli (Invitrogen; Carlsbad, CA), и были полностью очищены при использовании кобальт-аффинной хроматографии. Антигены были представлены, как TBS забуференный раствор белков в концентрации около 2 мг/мл для продуцирования поликлональных антител у кроликов. Все антисыворотки были очищены при использовании антитело против G белка аффинной хроматографии.

Рекомбинантные референсные стандарты PFA1, PFA2, PFA3, и HetI были гетерологично экспрессированны и продуцированы Arctic Express(DE3) RIL (Invitrogen; Carlsbad, CA), и очищены при использовании His ComAC очистки. Концентрации белка определили денситометрией с использованием стандартной кривой BSA для количественного определения в геле денатурацией SDS PAGE и окрашиванием кумассином синим.

Образцы семян для анализа получили дроблением сухих семян арабидопсиса при использовании двух стальных шаров в Kleco Bead Beater™ (Garcia Machine, Visalia, CA), или обработкой делипидизированного жмыха, полученного в результате валового FAME анализа семян канолы, как указано выше. В образцы семян добавили экстракционный буфер (50 мM Tris, 10 мM EDTA, 2% SDS) и пробирки, содержащие образцы и экстракционный буфер, аккуратно перемешивали при использовании качалки в течение 15-30 минут. Образцы центрифугировали в течение 30 минут при 3,000×g. Супернатант собирали и использовали для анализа.

Количество общих растворимых белков в экстракте семян определили при использовании Pierce 660 nm Protein Assay™ (Thermo Scientific, Rockford, IL). Образцы нормализовали до 1,55 мг/мл общих растворимых белков, и обрабатывали в LDS буфере для образцов (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 мM DTT для нормализованного ввода образца 20 μг общих растворимых белков на дорожку. Образцы подвергли электрофорезу в 3-8% трис-ацетатных гелях (Invitrogen, Carlsbad, CA), и переместили на нитроцеллюлозные мембраны. Пятна блокировали в блокирующем буфере и проводили пробы с антителами против различных полипептидов синтазы PUFA (PFA1, PFA2, и PFA3). Для определения использовали вторичные антикроличьи, меченные флуоресцином антитела, козьи антикроличьи антитела AF 633™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Пятна визуализировали на Typhoon Trio Plus Fluorescent Imager™ (GE Healthcare, New Brunswick NJ). Полученные в результате SDS PAGE вестерн блотты экстрактов зрелых семян арабидопсиса T₂, семян сои T₁ и семян канолы T₁ образовывали полосы соответствующего размера при исследовании с использованием специфической антисыворотки к PFA1, PFA2, PFA3 и HetI.

При SDS PAGE детекции вестерн блотты полипептидoв синтаз PUFA PFA1, PFA2, PFA3, и HetI в экстрактах семян сои T₁ для события 101454[267] 26702,001 образовывали полосы ожидаемой молекулярной массы.

Также при SDS PAGE детекции вестерн блотты полипептидoв синтаз PUFA PFA1, PFA2, PFA3 и HetI в экстрактах семян канолы T₁ для следующих событий: 6580[2]-016.Sx001; 6580[2]-017.Sx001; 6580[2]-017.Sx002; 6580[2]-018.Sx001; 6580[2]-019.Sx001; 6580[2]-020.Sx001; 6580[2]-021,Sx001; 6580[2]-021,Sx002; 6580[2]-024.Sx001; 6580[2]-039.Sx001; и 6580[2]-039.Sx002, образовывали полосы ожидаемой молекулярной массы.

Далее провели количественную оценку SDS PAGE вестерн блоттов специфических белков синтаз PUFA по 5 точечным стандартным кривым (100 нг, 50 нг, 25 нг, 12,5 нг и 6,25 нг) для каждого полипептида. В Таблице 2 и Таблице 3 приведены результаты для арабидопсиса и канолы, соответственно.

Пример 3: Продуцирование LC PUFA семенами арабидопсиса, трансформированными синтазой PUFA.

Данные содержания DHA и других LC PUFA в масле, полученном из семян трансгенных событий арабидопсиса T₁, генерированных конструктами, кодирующими гены синтаз PUFA, приведены в Таблице 4. Время удержания DHA и EPA HPLC определили при использовании аутентичных ¹⁴C меченных стандартов. ФИГУРА 2. Количественное определение PUFA провели при использовании 1-¹⁴C меченной стандартной кривой DHA. Содержание LC PUFA каждого анализированного события приведено на ФИГУРЕ 3. Эти данные указывают на то, что тип конфигурации конструкта PTU и применение специфических комбинаций регуляторных элементов для экспрессии генов синтаз PUFA и HetI могут быть использованы для изменения числа трансгенных событий, полученных для продуцирования LC PUFA в семенях T₂ арабидопсиса.

Например, только 22% всех единичных копий событий pDAB101454 продуцировали DHA, в то время как 65% pDAB101496 событий и 79% pDAB112206 событий продуцировали DHA. По сравнению с pDAB101454, бинарный вектор pDAB101496 содержит диверсефицированные регуляторные элементы. Аналогично, по сравнению с pDAB101454, конструкт pDAB112206 содержит оба, и диферсифицированные регуляторные элементы, и измененную конфигурацию PTU. Другой конструкт pDAB109584 имеет дополнительную диферсификацию регуляторного элемента и также содержит версию нативной кодирующей последовательности гена PFA3, а не версии «оптимизированного растения». В этом случае 82% всех единичных копий событий продуцируют LC PUFA.

Дополнительные модификации регуляторных элементов, конфигураций конструктов и применение нативных последовательностей гена во второй ориентации конфигурации PTU в результате позволяет получить конструкты, которые продуцируют трансгенные растения арабидопсиса с 61-80% всех единичных копий событий, продуцирующих LC PUFA. Вторая ориентация конфигурации PTU также продуцирует трансгенные растения с более высокой пропорцией событий (41-62%) с содержанием LC PUFA >1% в семенах T₂ арабидопсиса. Присутствие нативных последовательностей гена (по сравнению с оптимизированным растением) синтаз PUFA также повышает пропорцию >1% событий LC PUFA. Например, pDAB109525 и pDAB112210, содержащие нативные последовательности гена, имели 60% и 54%, соответственно, единичных копий событий с >1% LC PUFA. В противоположность pDAB101454, которая содержит все оптимизированные гены растения (в том же формате с использованием тех же регуляторных элементов), имели только 5% событий с >1% LC PUFA.

Максимальное содержание LC PUFA в семенах T₂ событий при использовании различных конструктов составляет в пределах 0,71-2,14%. Максимальное содержание DHA составляет в пределах 0,39-1,59%. Самый высокий уровень DHA получили при использовании конструктов во второй ориентации конфигурации PTU, например, pDAB109591, pDAB107962 и pDAB107960. Эти конструкты содержали две различных комбинации промотор/терминатор для управления четырьмя трансгенами, и либо одним, либо тремя нативными генами синтаз PUFA.

Максимальное содержание EPA составляет в пределах 0-1,17% от всех конструктов и всех генерированных событий. Конструкты pDAB112203 (третья ориентация конфигурации PTU), pDAB112200 (третья ориентация конфигурации PTU), pDAB112201 (третья ориентация конфигурации PTU) и pDAB101496 (первая ориентация конфигурации PTU) были эффективны для достижения относительно высоких уровней EPA по сравнению с другими конструктами. События, продуцирующие LC PUFA при использовании этих конструктов, имели относительно высокую пропорцию EPA (39-56% LC PUFA) по сравнению с DHA (37-45% LC PUFA), при этом другие конструкты, как правило, имели более низкую пропорцию EPA (9-27% LC PUFA) и более высокую пропорцию DHA (60-76% LC PUFA).

Эти данные показали, что отбор конфигураций конструкта и регуляторных элементов гена в результате улучшает эффективность продуцирования обеих ω3 LC PUFA, DHA и EPA, в семенах арабидопсиса, и что отбор конфигураций конструкта и регуляторных элементов гена может быть использован для повышения эффективности продуцирования обеих ω3 LC PUFA, DHA и EPA, в культивируемых растениях.

Семена T₃ арабидопсиса.

Из семян T₂ событий арабидопсиса с высоким продуцированием LC PUFA вырастили растения и провели забор образцов тканей листьев растений T₂ при использовании количественных ПЦР реакций для гена pat и других трансгенов. Идентифицировали содержащие две копии трансгенов растения (то есть гомозиготы) и вырастили их до зрелости. Полученные в результате семена T₃ собрали и проанализировали на содержание LC PUFA. Конструкты pDAB101454 и pDAB101429, содержавшие повторы элементов экспрессии промотор/терминатор и использовавшие все последовательности гена синтаз PUFA «оптимизированного растения», продемонстрировали очень плохую стабильность признака LC PUFA в последующем поколении семян T₃, с малой детекцией или отсутствием детекции LC PUFA в потомка семян T₃. Другие события, трансформированные при использовании конструктов с различными конфигурациями PTU и/или диверсифицированными экспрессирующими элементами (pDAB109588, pDAB101496), продуцировали трансгенные линии арабидопсиса с определяемыми варьирующими уровнями LC PUFA в поколении семян T₃ (Таблица 5, ФИГУРА 4). Линии с конструктом с полностью диферсифицированными комбинациями промотор/терминатор (pDAB109584) или со всеми нативными последовательностями гена синтаз PUFA (pDAB109525) в формате первой ориентации PTU показали очень хорошую стабильность в поколении семян T₃. Комбинирование использования дивесифицированных комбинаций промотор/терминатор и/или применение одной или трех нативных последовательностей синтаз PUFA в формате второй ориентации или третьей ориентации PTU также приводит к высокой стабильности в поколении семян T₃ (например, для конструктов pDAB107960 and pDAB107961). Это привело к получению в отдельных гомозиготных линиях семян T₃, содержащих вплоть до 1,77% DHA, вплоть до 1,1% EPA, и вплоть до 2,57% общих LC PUFA.

Содержание общих LC PUFA, DHA и EPA приведено в % от общих FAME

1. Данные проанализированных с использованием валового анализа семян T₃ 5-20 отдельных гомозиготных растений.

Полный жирнокислотный профиль приведенных для примера отдельных линий T₃ арабидопсиса, являющихся гомозиготными, для продуцирующих DHA трансгенов приведен в Таблице 6, в сравнении со средним липидным профилем для нулевых сиблингов T_3. Продуцирование LC PUFA, управляемое синтазами, ассоциировалось со снижением содержания нативных длинных жирных кислот, в частности эйкозеновой кислоты (22:1), и небольшим повышением содержания олеиновой (18:1) и линолевой кислоты (18:2). Не наблюдалось значительных изменений содержания насыщенных жирных кислот, пальмитиновой (16:0) и стеариновой кислоты (18:0).

Вырастили отобранные гомозиготные T₃ линии с высоким продуцированием DHA и провели анализ полученных от них семян T₄. Провели анализ десяти линий, трансформированных pDAB109591, pDAB109584, pDAB109525, pDAB109592, pDAB107960, и pDAB107961. Эти линии продолжали продуцировать DHA (вплоть до 1,85%) и EPA (вплоть до 1,00%) в поколении семян T₄, что указывает на стабильную передачу признака ω3 LC PUFA через три поколения самоопыленных семян.

Пример 4: Продуцирование LC PUFA в семенах канолы, трансформированных при использовании синтаз PUFA Schizochytrium.

При использовании бинарных конструктов pDAB101496, pDAB109584, pDAB109592, pDAB107960, pDAB107961, pDAB107962 и pDAB117501 (все содержат гены синтаз PUFA PFA1, PFA2, PFA3 и PPTазу Nostoc NoHetI) получили трансгенную канолу и подтвердили содержание копии T - трансгена при использовании молекулярного подтверждения.

Собрали семена T₁ от отдельных трансгенных растений T₀ канолы, и провели валовый анализ около 10 семян каждого образца T₁ на содержание LC PUFA, как указано выше.

Из проанализированных образцов семян T₁ каждого конструкта высокая пропорция (81-93%) содержала LC PUFA. Таблица 7. Максимальное содержание DHA, определенное в образцах семян T₁ канолы, составило 3,04% для pDAB107960. Максимальное определенное содержание EPA составило 1,97% для pDAB101496. Максимальное комбинированное содержание ω3 LC PUFA (DHA+EPA) для pDAB107960 составило 4,20%.

Для получения ранних свидетельств расщепления трансгенного признака провели анализ 48 семян образцов отобранных семян T₁ на содержание LC PUFA. Ожидалось, что события с T-ДНК вставкой(ами) в единичном локусе дадут около 25% нулевых семян при менделевском расщеплении. Из 42 семян T₁, которые были проанализированы из событий с pDAB101496, 24 имели от 12 до 35% семян без LC PUFA (средняя пропорция нулевых семян составила 24% от всех 24 образцов). Таблица 8. В единичных семенах T₁ канолы детектировали вплоть до 5,41% DHA, вплоть до 3,72% EPA и вплоть до 7,33% комбинированных ω3 LC PUFA (DHA+EPA).

В теплице вырастили около 60-75 растений из отобранных образцов семян T₁ канолы. Провели забор образцов листьев всходов на стадии 4-5 листочков для проведения анализа ДНК для определения числа копий трансгенов в каждом растение после расщепления поколения T₁. Анализ числа копий провели при использовании анализа гидролизными зондами трансгенов при использовании указанного выше протокола. После проведения этих анализов идентифицировали трансгенные растения, как гомозиготные, гетерозиготные и нулевые. Провели анализ Саузерна геномной ДНК, экстрагированной из образцов листьев гомозиготных растений 9 линий, зондируя наличие трансгена PFA1, трансгена pat (на каждом конце T-ДНК) и гена SpecR из плазмидного скелета. Исчерченность при анализе Саузерна растений T₁ с 6580[1]-035.Sx001 и 6580[1]-035.Sx002 была сходной, что указывает на то, что события, скорее всего, имеет клональное происхождение, как 6580[1]-052.Sx001 и 6580[1]-057.Sx001. Результаты анализа Саузерна приведены в Таблице 9.

Растения канолы, представлявшие гомозиготные для трансгенов с pDAB101496 (и включая некоторые гетерозиготные и нулевые растения), вырастили до зрелости, собрали семена T₂, провели валовый анализ образцов семян на содержание LC PUFA. Таблица 10. Все десять отобранных pDAB101496 линий канолы продуцировали DHA и EPA в семенах T₂. Максимально LC PUFA содержали 3,26% DHA (линия 6580[1]-035. Sx002) и 1,42% EPA (линия 6580[1]-035.Sx001). Количество ω3 LC PUFA (DHA и EPA) в линиях составило 80-88% (среднее 85%) общих LC PUFA, остальные 12-20% представляли ω6 DPA. Гемизиготные T₁ растения продуцировали меньше LC PUFA из-за ожидаемого расщепления признака синтаз PUFA в семенах T₂. ФИГУРА 5. Полные профили FAME гомозиготных и нулевых семян канолы линии 6580[1]-035.Sx002 приведены в Таблице 10. Эта линия продуцировала 3,3% DHA и 1,3% EPA. Это было слабое увеличение содержания альфа-линоленовой (C18:3) и линоленовой (C18:2) кислот, и снижение содержания олеиновой кислоты (C18:1). Дополнительно к ожидаемым LC PUFA, DHA, EPA и DPA также были определены низкие уровни новых ω6 жирных кислот, таких как гамма-линоленовая и арахидоновая кислота (0,4 и 0,7%, соответственно).

Провели анализ LC PUFA одного семени партий семян T₂ сиблинговых гомозиготных и гемизиготных растений канолы линии 6580[1]-035.Sx002, которые продемонстрировали более высокие уровни продуцирования DHA и EPA при валовом анализе семян. ФИГУРА 5. Семена гомозиготных растений имели достаточно однородное содержание DHA с коэффициентом вариации (CVs) менее 14%. Проанализированные четыре образца 48 отдельных семян растений гомозиготных к трансгенам имели среднее содержание DHA 3,70% (SD=0,44, CV=14%), 3,67% (SD=0,31, CV=8%), 3,11% (SD=0,36, CV=12%) и 3,11% (SD=0,35, CV=11%). Семена гетерозиготных растений содержали в среднем 15 нулевых семян на 48 образцов семян, что близко к показателю 12 семян, ожидаемому при менделевском расщеплении единичного локуса. Содержание DHA в отдельных семенах из этих гемизиготных растений варьировало вплоть до максимального показателя 5,81%. ФИГУРА 5.

В теплице вырастили растения из семян T₂ гомозиготных линий, полученные из четырех событий канолы, трансформированных при использовании pDAB101496 с получением семян T₃. Все линии продолжали продуцировать DHA и EPA в собранных семенах T₃. Линии, полученные из событий [6]-274.Sx001 и 6580[1]-035.Sx002, по существу имели стабильное продуцирование LC PUFA, продуцирование в T₃ измерили проведением валового анализа для отдельных растений, среднее составило 3,16% DHA (пределы 2,73-3,61%, около 13 растений трех линий T₂) и 0,78% EPA (пределы 0,48-1,13%), и 3,34% DHA (пределы 2,85-3,89% около 53 растений 8 линий T₂), и 1,12% EPA (пределы 0,75-1,71%), соответственно.

Пример 5: Продуцирование LC PUFA в семенах сои, трансформированных синтазой PUFA.

В теплице до зрелости вырастили растения трансгенных событий сои T₀, которые были получены при использовании бинарных конструктов pDAB101454 (101454[16] 341,001 и 101454[267]26702,001), pDAB101496 (101454[330]33007,001, 101454[333]33308,001, и 101454[334]33402,001), и pDAB10796 (107960[12]-626,001, 107960[12]-641,001, 107960[12]-644,001, 107960[26]-655,001, и 107960[26]-733,001). События сои отбирали по наличию копий трансгена pat и сопутствующему наличию трансгенов синтаз PUFA и HetI. Отобранные трансгенные растения подвергли самоопылению и после созревания собрали полученные в результате семена T₁. Получили отдельные семена и провели анализ при использовании FAME газовой хроматографии и детектора ионизации для определения содержания LC PUFA и DHA. Двенадцать зрелых цельных семян растения были по отдельности проанализированы измельчением семян прессом и гомогенизацией при использовании стальных шаров и шаровой мельницы. Ткани обезжирили три раза гексаном, объединенные фракции гексана выпарили до сухости и взвесили остаток, взвешенный остаток восстановили гептаном для FAME анализа, как указано ранее в Примерах. Содержание масла (сумма масс отдельных FAME, деленная массу семян) трансгенных семян и число семян, продуцированных трангенными линиями T₁, незначительно отличалось от такового не трансгенных контрольных культиваров Maverick выращенных в теплице в то же самое время при тех же условиях. Средний и максимальный уровень (%) содержания LC PUFA отдельных семян T₁ отобранных событий приведены в Таблице 11. Содержание DHA составляет вплоть до 2,0% и общих PUFA до 5,1%. Дополнительно, в семенах T₁ сои определили 3 новых, неэндогенных LC PUFA; DHA, EPA, и DPA (n 6). Таблица 11.

DHA и EPA составили от 90% до 99% от общего содержания LC PUFA в этих семенах, содержащих LC PUFA T_1. Самое высокое содержание LC PUFA (5,1%) было достигнуто при использовании конструкта 107960 в событии 107960[12]-626,001.

Полный липидный профиль отдельных семян T₁ событий сои 101454[16]-341,Sx001, pDAB101496{330}33007,001, 107960[12] 626,001 и 107960[12]-641,001 приведены в Таблице 12. Для сравнения добавили два отдельных семени контроля Maverick. Приведены все детектированные FAME.

Пример 6: Липидный анализ зрелых семян T₂ трансгенных событий сои.

Для оценки наследования признака LC PUFA и его стабильности в последующих поколениях протестировали несколько приведенных в качестве примера событий с тремя конструктами 101454[16]-341,Sx001, 107960[12]-641,001, 107960[12]-644,001 и pDAB101496{334}33402,001, отобранных по содержанию в них LC PUFA, для выращивания в теплице. Семена T₁ прорастили в теплице и проростки T₁ проанализировали на присутствие PAT, PFA1 и трансгена NoHetI. Растения T₁ с трансгенами вырастили до зрелости и в результате самоопыления получили семена T₂, которые собрали для последующего анализа масел. Для каждого растения T₂ проанализировали от 5 до 11 семян T₂ по отдельности при использовании FAME способом, описанным в Примере 1. Полученные результаты по семенам T₁ приведены как контроль в Таблице 13 и выделены полужирным шрифтом. Линии T₁ событий 107960[12]-644,001 и pDAB101496{334}33402,001 не были гомозиготными и, следовательно, некоторые семена T₂ поколения после расщепления не содержат LC PUFA (минимум LC PUFA составил 0). Семена T₂ события 101454[16]-341,Sx001 показали стабильное содержание LC PUFA (2,2-5,6%) сравнимое с T₁ (3%). Наблюдалось небольшое увеличение среднего PUFA из-за отбора гомозиготных растений по локусу трансгена, с исключением, таким образом семян нулевых сиблингов (sib null) в потомке T₂. Подавляющая часть LC PUFA представляет n3 (норма=0,9) и разделение между EPA (0,6-2,4%) и DHA (1,3-2,7%). Семена T₂ события 107960[12]-641,001 показали схожий тренд при сравнении с родительскими семенами. Содержание LC PUFA (1,5-2,1%) сравнимо с семенами T₁ (3,2%). Все линии, отобранные по событию pDAB101496{334}33402,001, имели семена T₂ без LC PUFA, что указывает на то, что растения T₁ не фиксировали локус трансгена. Среднее содержание LC PUFA семян T₂ (0,1-1,1%) сравнимо с T₁ (0,6%). Для всех конструктов признак LC PUFA наследовался в следующих поколениях без значительных отличий в количестве накопленной LC PUFA.

Пример 7: Продуцирование LC PUFA в семенах канолы с pDAB101496, выращенных в поле.

Семена T₂ канола партий нескольких гомозиготных растений T_1, полученных из шести pDAB101496 (SEQ ID NO:17) событий канола, продуцирующих от среднего до высокого уровня DHA (как указано выше), были независимо объединены. Эти семена вырастили в поле в Миннесоте (Minnesota) и Северной Дакоте (North Dakota) в 2013. В качестве контроля использовали семена канолы, полученные из нетрансформированных растений, и коммерчески доступные линии канолы использовали в качестве проверки. Четыре повторяющихся участка (1,2×6 м) засадили каждый полученными семенами и собрали после созревания полученные в результате семена (семена T₃ в случае трансгенных образцов) с каждого участка, провели анализ на содержание LC PUFA. Содержание LC PUFA в собранных семенах канолы с каждого экспериментального участка определили при использовании FAME экстракций трижды 10 образцов аликвот семян из навала каждого из четырех повторяющихся полей. Таблица 14.

Среди четырех полевых участков, засаженных полученными семенами, максимальное содержание DHA и EPA составило 4,27% и 0,65%, соответственно, для события 6580[1]-035.Sx002. Максимальное содержание DHA отдельного участка составило 4,54%. Те же линии семян T₂, которые были ссыпаны в навал для каждого события для выращивания в поле, также вырастили в теплице для сравнения содержания LC PUFA полученных в результате семян T₃. Содержание DHA линий pDAB101496, выращенных на верхних четырех полях (the top four field) в среднем составило на 22% выше, чем у эквивалентных линий, выращенных в теплице. Таблица 14.

Не наблюдалось значительных различий в зерне, полученном из трансгенных линий канолы, продуцирующих DHA, по сравнению с не трансгенными растениями DH12075. Таблица 15. Все линии, выращенные в поле, продуцировали семена со средним содержанием масла >40% г масла/г семян. Не наблюдалось значительных различий между трансгенными и не трансгенными контролями в содержании хлорофилла в семенах или в % белка в семенах на грамм муки после экстракции масла. Время цветения и время созревания были неизменны между трансгенными линиями и контрольными растениями.

Партии зерна с опытного поля были объединены и измельчены для экстракции масла, содержащего LC PUFA, все полученное масло прошло рафинирование, отбеливание и дезодорирование при использовании стандартных способов. Была проведена технологическая обработка двух партий с выходом 1,2 кг RBD масла, содержащего 3,02% DHA и 1,0% EPA и 1,0 кг RBD масла, содержащего 4,1% DHA и 0,7% EPA. Это показало, что зерно из трансгенных растений канолы, экспрессирующих синтазу PUFA и HetI, может быть подвергнуто технологической обработке с получением масла канолы, в высокой степени богатого DHA и EPA.

Пример 8: Стабильность признака LC PUFA для pDAB107960 события канолы во множестве поколений семян.

Для плазмиды pDAB107960 провели тестирование на арабидопсисе, комбинируя применение диверсифицированных комбинаций промотор/терминатор и используя три нативные последовательности синтаз PUFA в формате второй ориентации PTU, что привело к появлению соответствующего стабильного признака LC PUFA в поколении семян T₃. Таблица 5. События канолы, генерированные при использовании pDAB107960, были аналогично протестированы на стабильность признака LC PUFA в третьем поколении семян, полученных в результате самоопыления культивируемого растения.

В теплице вырастили растения из семян T₁ девяти pDAB107960 событий канолы, отобранных при использовании анализа одного семени T₁, как указано выше. Растения гомозиготные по трансгенам pDAB107960 и сегрегантные,0 как единичный менделевский локус, вырастили до зрелости, и собрали из растений семена T₂, образцы семян проанализировали на содержание LC PUFA. Все растения девяти отобранных pDAB107960 случаев канолы продуцировали DHA и E000000000000000PA в семенах T₂. Таблица 16. Семена T₂ семи событий (113 растений) вырастили в теплице до зрелости и собрали из этих растений семена T₃. Образцы семян снова проанализировали на содержание LC PUFA в каждом потомке растения. Все 113 растений T₂ канолы семи отобранных pDAB107960 событий продуцировали DHA и EPA в семенах T₃. Таблица 16. Семена T₃, полученные из шести событий (137 растений), вырастили в теплице до зрелости и собрали из этих растений семена T₄. Все 137 растений канолы T₃ из шести отобранных pDAB107960 событий продуцировали DHA и EPA в семенах T₄. Таблица 16. Пять из шести протестированных событий поддержали аналогично высокие уровни DHA в каждом поколении семян, продемонстрировав стабильность признака DHA через множество событий.

Число копий трансгенов в шести единичных локусах pDAB107960 событий канолы, взятых для поколения семян T₄, определили как указано выше. События 107960[6]-106, 107960[6]-107, 107960[7]-111 и 107960[6]-353 имели две копии всех трансгенов, при этом события 107960[7]-085 и 107960[6]-352 имели одну копию всех трансгенов (PFA1, PFA2, PFA3, NoHetI). Следовательно, признак LC PUFA был обеспечен либо одной, либо двумя копиями набора трансгенов и остался стабильным во всех трех поколениях семян.

Полные FAME профили образцов навала семян T₄ из двух растений T₃, полученных в двух разных событиях (107960[7]-085 и 107960[6]-353), приведены в Таблице 17. Эти семена содержали 4,4% и 4,6% DHA, и 0,6% и 0,7% EPA, соответственно. Наблюдалось совместное снижение содержания (8%) олеиновой кислоты (C18:1) и небольшое повышение содержания (+2%) линолевой кислоты (18:2), а также наблюдалось незначительное изменение иных профилей, вызванное присутствием новых LC PUFA. Дополнительно к ожидаемым LC PUFA, DHA, EPA, и DPA(n 6) также были определены низкие уровни новых ω6 жирных кислот, гамма-линоленовой (GLA, 18:3) и арахидоновой кислоты (ARA, 20:4) (всего около 1%).

Пример 9: Продуцирование LC PUFA в семенах T₄ Канола с pDAB107960, выращенных в поле.

Семена T₃ канолы партий нескольких гомозиготных растений T_2, полученных из шести различных pDAB107960 событий канолы, продуцирующих около 3% DHA (как указано выше), были независимо объединены. Эти семена вырастили в поле в Северной Дакоте (North Dakota) в 2014.

В качестве контроля использовали семена канолы, полученные из нетрансформированных растений DH12075, и коммерчески доступные линии канолы использовали в качестве проверки. Четыре повторяющихся участка (1,2×6 м) засадили каждый полученными семенами и собрали после созревания полученные в результате семена (семена T₄ в случае трансгенных образцов) с каждого участка, провели анализ на содержание LC PUFA при использовании анализа FAME, как указано выше. Трижды провели FAME экстракции 10 семян технических повторов образцов семян из навала каждого из четырех повторяющихся полевых участков. Таблица 18.

Максимальное содержание DHA и EPA (среднее четырех участков, засаженных полученными семенами) составило 3,98% и 0,88% для события 107960[6]-353 и 107960[6]-106, соответственно, в зоне 1. Максимальное содержание DHA на отдельном участке составило 4,69% в зоне 1 для каждого 107960[6]-353. Те же линии семян T₃, которые были ссыпаны в навал для каждого события для выращивания в поле, также вырастили в теплице для сравнения содержания LC PUFA полученных в результате семян T₄. Таблица 16. Среднее содержание DHA всех событий pDAB107960, выращенных на шести полях в обоих зонах, составило 3,24%, при этом среднее содержание DHA всех эквивалентных событий, выращенных в теплице, составило 3,06%. Следовательно, содержание DHA канолы, выращенной в поле, в среднем было на +6% выше, чем у эквивалентного материала, выращенного в теплице.

--->

Список последовательностей

<110> Dow AgroSciences LLC and DSM IP ASSESTS B.V.

Walsh, Terence A

Gachotte, Daniel J

Larsen, Cory M

Bevan, Scott A

Merlo, P Ann Owens

Metz, James G

Zirkle, Ross

<120> ПОЛУЧЕНИЕ ОМЕГА 3 ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНЫХ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ИЗ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ СИНТАЗ PUFA ТРАУСТОХИДРИДОВ

<130> 2971-p11958US(72907)

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2607

<212> PRT

<213> Schizochytrium sp.

<400> 1

Met Asp Thr Arg Ile Ala Ile Val Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Glu Asn Val Arg Glu Ser Trp Glu Ala Ile Arg Asp Gly Leu Asp

20 25 30

Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Tyr

35 40 45

Asn Pro Glu Lys Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly

50 55 60

Phe Ile Pro Glu Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met

65 70 75 80

Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys

85 90 95

Val Lys Glu Ala Leu Thr Asp Ala Asn Ile Pro Ala Phe Ser Ser Gly

100 105 110

Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ala

115 120 125

Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Asp Lys Val

130 135 140

Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Glu Glu Asp Val Ala Ala Ala Val Asp

145 150 155 160

Lys Tyr Lys Ala Ser Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly

165 170 175

Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Cys Asn Thr Phe Asn Met

180 185 190

Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ser Leu Ile

195 200 205

Ala Val Lys Val Ala Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Gly Asp Cys Asp Ala

210 215 220

Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Ile Gly Met Tyr Met

225 230 235 240

Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro Ser Val Lys Ala

245 250 255

Tyr Asp Ala Ala Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu Gly Ser Ala Met

260 265 270

Leu Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Thr Val

275 280 285

His Ala Val Ile Lys Gly Cys Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Ala Ala

290 295 300

Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu Ala Leu Arg Arg

305 310 315 320

Ala Tyr Ala Arg Ala Asn Val Asp Pro Ala Thr Val Thr Leu Val Glu

325 330 335

Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Lys Ile Glu Leu Thr Ala

340 345 350

Leu Ser Asn Leu Phe Ser Lys Ala Phe Ser Ala Asn Gly Gly Gly Ala

355 360 365

Glu Glu Ala Glu Gln Val Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly

370 375 380

His Leu Lys Ala Val Ala Gly Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Val Leu

385 390 395 400

Ala Leu Lys His Lys Thr Leu Pro Gln Thr Ile Asn Val Asp Lys Pro

405 410 415

Pro Ser Leu Val Asp Gly Thr Pro Ile Gln Gln Ser Pro Leu Tyr Val

420 425 430

Asn Thr Met Asn Arg Pro Trp Phe Thr Pro Val Gly Val Pro Arg Arg

435 440 445

Ala Gly Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val

450 455 460

Leu Glu Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Ser Ala Tyr Arg Tyr Asn Asn

465 470 475 480

Leu Pro Gln Val Ala Leu Leu His Ala Gly Asp Val Ala Thr Leu Ala

485 490 495

Ala Thr Val Arg Ala Lys Leu Ala Leu Ala Thr Ala Glu Gln Glu Glu

500 505 510

Ala Arg Val Val Lys Asn Ala Asp Tyr Ile Ala Tyr His Arg Phe Leu

515 520 525

Asp Glu Cys Lys Leu Arg Gly Ala Val Pro Gln Ala His Ala Arg Val

530 535 540

Gly Leu Leu Val Arg Asp Leu Ser Ser Leu Ile Ala Val Leu Glu Ala

545 550 555 560

Ala Ala Ala Lys Leu Ala Gly Glu Glu Ser Ala Thr Glu Trp Thr Val

565 570 575

Ser Val Ala Thr Gly Glu Ala Ala Phe Arg Val Arg Gly Val Ala Thr

580 585 590

Glu Ala Asn Val Ala Ala Leu Phe Ser Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Thr

595 600 605

His Met Phe Ser Asp Val Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Glu Ser

610 615 620

Val Ala Ala Met Asp Arg Ala Gln Arg Glu Arg Phe Gly Arg Pro Ala

625 630 635 640

Lys Arg Val Ser Ser Val Leu Tyr Pro Arg Lys Pro Tyr Gly Asp Glu

645 650 655

Pro Arg Gln Asp His Lys Glu Ile Ser Gln Thr Arg Tyr Ser Gln Pro

660 665 670

Ala Thr Leu Ala Cys Ser Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala

675 680 685

Gly Leu Ala Pro Ser Phe Ala Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala

690 695 700

Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Ser Leu Asp Arg Asp Ala Val Phe Asp Leu

705 710 715 720

Val Cys Ala Arg Ala Lys Ala Met Ser Asp Phe Thr Ala Gln Ala Ser

725 730 735

Ser Ser Gly Gly Ala Met Ala Ala Val Ile Gly Ala Lys Ala Asp Gln

740 745 750

Leu Ser Leu Gly Gly Ala Pro Asp Val Trp Leu Ala Asn Ser Asn Ser

755 760 765

Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr Gly Thr Ala Glu Ala Val Ala Ala Ala

770 775 780

Ser Asp Lys Leu Arg Cys Ser Gly Asn Phe Arg Val Val Pro Leu Ala

785 790 795 800

Cys Glu Ala Ala Phe His Ser Pro His Met Arg Gly Ala Glu Gln Thr

805 810 815

Phe Ala Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Val Ser Ala Pro Ala Ala Ala

820 825 830

Arg Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Gly Ala Ala Val Thr Ser Pro Ala

835 840 845

Asp Val Lys Thr Asn Leu Gly Lys His Met Thr Ser Pro Val Gln Phe

850 855 860

Val Gln Gln Val Arg Ala Met His Ala Ala Gly Ala Arg Val Phe Val

865 870 875 880

Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val Leu Ser Arg Leu Val Lys Glu Thr Leu

885 890 895

Gly Glu Ala Gly Asp Val Val Thr Val Ala Val Asn Pro Asp Ser Ala

900 905 910

Lys Asp Ser Asp Thr Gln Leu Arg Gln Ala Ala Leu Thr Leu Ala Val

915 920 925

Ala Gly Val Pro Leu Lys Asp Phe Asp Arg Trp Gln Leu Pro Asp Ala

930 935 940

Thr Arg Leu Glu Pro Val Lys Lys Lys Lys Thr Thr Leu Arg Leu Ser

945 950 955 960

Ala Ala Thr Tyr Val Ser Ala Lys Thr Leu Arg Gln Arg Glu Ala Val

965 970 975

Leu Asn Asp Gly Tyr Thr Val Ser Gly Ala Thr Ala Val Val Lys Glu

980 985 990

Val Asp Thr Ala Asn Glu Glu Arg Leu Val Arg Gln Ala Gln Asp Leu

995 1000 1005

Gln Arg Gln Leu Ala Glu Ala Ser Thr Ala Ala Gln Ala Ala Gln

1010 1015 1020

Ser Lys Val Ala Glu Leu Glu Arg Thr Ile Gln Asp Leu Glu Arg

1025 1030 1035

Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Glu Lys Gly Glu Asn Ser Asp Ser

1040 1045 1050

Asn Ala Ala Ala Glu Val Leu Arg Arg His Lys Glu Leu Leu Gln

1055 1060 1065

Arg Met Leu Gln Asp Cys Asp Glu Gln Ala Val Pro Val Ala Thr

1070 1075 1080

Val Val Pro Thr Pro Thr Ser Ser Pro Thr Pro Thr Ser Ser Pro

1085 1090 1095

Val Ser Gly Asn Ser Lys Ser Thr Arg Gly Ser Ala Asp Leu Gln

1100 1105 1110

Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala

1115 1120 1125

Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp

1130 1135 1140

Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile

1145 1150 1155

Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val

1160 1165 1170

Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala

1175 1180 1185

Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala

1190 1195 1200

Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala

1205 1210 1215

Ser Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala

1220 1225 1230

Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu

1235 1240 1245

Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly

1250 1255 1260

Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly

1265 1270 1275

Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr

1280 1285 1290

Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val

1295 1300 1305

Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala

1310 1315 1320

Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro

1325 1330 1335

Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val

1340 1345 1350

Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val

1355 1360 1365

Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile

1370 1375 1380

Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val

1385 1390 1395

Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly

1400 1405 1410

Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly

1415 1420 1425

Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser

1430 1435 1440

Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ala Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu

1445 1450 1455

Gln Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu

1460 1465 1470

Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met

1475 1480 1485

Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu

1490 1495 1500

Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp

1505 1510 1515

Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp

1520 1525 1530

Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro

1535 1540 1545

Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr

1550 1555 1560

Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu

1565 1570 1575

Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr

1580 1585 1590

Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala

1595 1600 1605

Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu

1610 1615 1620

Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu

1625 1630 1635

Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala

1640 1645 1650

Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ala Val

1655 1660 1665

Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Thr Ala

1670 1675 1680

Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val

1685 1690 1695

Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met

1700 1705 1710

Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser

1715 1720 1725

Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly

1730 1735 1740

Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val

1745 1750 1755

Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser

1760 1765 1770

Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Leu Leu Pro

1775 1780 1785

Thr Leu Phe Gly Ser Glu Cys Glu Asp Leu Ser Leu Thr Phe Pro

1790 1795 1800

Val Ile Thr Thr Leu Pro Leu Pro Ala Glu Leu Val Leu Ala Glu

1805 1810 1815

Gly Gly Ala Arg Pro Val Val Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Leu

1820 1825 1830

Thr Ser Ser Leu Val Ser Ser Leu Gly Asp Arg Ala Val Leu Leu

1835 1840 1845

Gln Val Gln Ser Ser Ser Ala Cys Ser Pro Arg Ser Thr Thr His

1850 1855 1860

Lys Leu Val Thr Val Ala Asp Arg Ser Glu Ala Ala Leu Gln Ala

1865 1870 1875

Ala Leu Thr Ser Val Glu Ala Gln Phe Gly Lys Val Gly Gly Phe

1880 1885 1890

Val Phe Gln Phe Gly Asp Asp Asp Val Gln Ala Gln Leu Gly Trp

1895 1900 1905

Ala Leu Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Thr Ser Leu Ser Glu Gln

1910 1915 1920

Ile Glu Gly Gly Arg Thr Phe Phe Val Ala Val Ala Arg Leu Asp

1925 1930 1935

Gly Gln Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Thr Thr Ala Thr Val Asp

1940 1945 1950

Leu Ser Arg Ala Gln Gln Gly Ser Val Phe Gly Leu Cys Lys Thr

1955 1960 1965

Leu Asp Leu Glu Trp Pro Ala Val Phe Cys Arg Gly Ile Asp Leu

1970 1975 1980

Ala Ala Asp Leu Asp Ala Ala Gln Ala Ala Arg Cys Leu Leu Gly

1985 1990 1995

Glu Leu Ser Asp Pro Asp Val Ala Val Arg Glu Ser Gly Tyr Ser

2000 2005 2010

Ala Ser Gly Gln Arg Cys Thr Thr Thr Thr Lys Ser Leu Thr Thr

2015 2020 2025

Gly Lys Pro His Gln Pro Ile Ser Ser Ser Asp Leu Phe Leu Val

2030 2035 2040

Ser Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu Cys Val Arg Glu Leu

2045 2050 2055

Ala Gln Arg Val Gly Gly Gly Thr Tyr Val Leu Ile Gly Arg Ser

2060 2065 2070

Glu Leu Pro Thr Thr Glu Pro Ala Trp Ala Val Gly Val Glu Ser

2075 2080 2085

Gly Lys Pro Leu Glu Lys Ala Ala Leu Ala Phe Leu Lys Ala Glu

2090 2095 2100

Phe Ala Ala Gly Arg Gly Ala Lys Pro Thr Pro Met Leu His Lys

2105 2110 2115

Lys Leu Val Gly Ala Val Val Gly Ala Arg Glu Val Arg Ala Ser

2120 2125 2130

Leu Ala Glu Ile Thr Ala Gln Gly Ala Thr Ala Val Tyr Glu Ser

2135 2140 2145

Cys Asp Val Ser Ser Ala Ala Lys Val Arg Glu Met Val Glu Arg

2150 2155 2160

Val Gln Gln Gln Gly Gly Arg Arg Val Ser Gly Val Phe His Ala

2165 2170 2175

Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Asn Lys Ser Leu Ala

2180 2185 2190

Asp Phe Ser Ala Val Tyr Asp Thr Lys Val Gly Gly Leu Ile Asn

2195 2200 2205

Leu Leu Ala Cys Val Asp Leu Ala Gln Leu Arg His Leu Val Leu

2210 2215 2220

Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Val Gly Gln Ser Asp

2225 2230 2235

Tyr Ala Met Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Leu Ala Ala His Leu

2240 2245 2250

Ser Ala Val His Pro Gln Leu Cys Ala Arg Ser Ile Cys Phe Gly

2255 2260 2265

Pro Trp Asp Gly Gly Met Val Thr Pro Ala Leu Lys Ala Asn Phe

2270 2275 2280

Ile Arg Met Gly Ile Gln Ile Ile Pro Arg Gln Gly Gly Ala Gln

2285 2290 2295

Thr Val Ala Asn Met Leu Val Ser Ser Ser Pro Gly Gln Leu Leu

2300 2305 2310

Val Gly Asn Trp Gly Val Pro Pro Val Val Pro Ser Ala Thr Glu

2315 2320 2325

His Thr Val Leu Gln Thr Leu Arg Gln Ser Asp Asn Pro Phe Leu

2330 2335 2340

Asp Ser His Val Ile Gln Gly Arg Arg Val Leu Pro Met Thr Leu

2345 2350 2355

Ala Val Gly Tyr Met Ala His Gln Ala Gln Ser Ile Tyr Ala Gly

2360 2365 2370

His Gln Leu Trp Ala Val Glu Asp Ala Gln Leu Phe Lys Gly Ile

2375 2380 2385

Ala Ile Asp Asn Gly Ala Asp Val Pro Val Arg Val Glu Leu Ser

2390 2395 2400

Arg Arg Lys Glu Glu Gln Glu Asp Ala Gly Lys Val Lys Val Lys

2405 2410 2415

Val Gln Val Leu Leu Lys Ser Gln Val Asn Gly Lys Ser Val Pro

2420 2425 2430

Ala Tyr Lys Ala Thr Val Val Leu Ser Pro Ala Pro Arg Pro Ser

2435 2440 2445

Val Ile Thr Arg Asp Phe Asp Leu Thr Pro Asp Pro Ala Cys Thr

2450 2455 2460

Glu His Asp Leu Tyr Asp Gly Lys Thr Leu Phe His Gly Lys Ala

2465 2470 2475

Phe Gln Gly Ile Glu Gln Val Leu Ser Ala Thr Pro Lys Gln Leu

2480 2485 2490

Thr Ala Lys Cys Arg Asn Leu Pro Leu Thr Pro Glu Gln Arg Gly

2495 2500 2505

Gln Phe Val Val Asn Leu Ser Gln Gln Asp Pro Phe Gln Ala Asp

2510 2515 2520

Ile Ala Phe Gln Ala Met Leu Val Trp Ala Arg Met Leu Arg Gln

2525 2530 2535

Ser Ala Ala Leu Pro Asn Asn Cys Glu Arg Phe Asp Phe Tyr Lys

2540 2545 2550

Pro Met Ala Pro Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Ser Val Lys Leu Ala

2555 2560 2565

Ser Ala Ser Pro Leu Val Asp Ser Val Cys Lys Cys Thr Val Ala

2570 2575 2580

Met His Asp Glu Gln Gly Glu Val Tyr Phe Ser Ala Arg Ala Ser

2585 2590 2595

Val Val Leu Asn Lys Thr Leu Thr Tyr

2600 2605

<210> 2

<211> 7824

<212> ДНК

<213> Schizochytrium sp.

<400> 2

atggatactc gcatcgcgat cgtggggatg tcggcgatcc tgccgagcgg ggagaacgtg 60

cgcgagagct gggaggcgat ccgcgatggg ctggattgcc tgagcgatct gccggcggac 120

cgcgtggacg tgacggccta ctacaacccg gagaagacga ccaaggacaa gatctactgc 180

aagcgcggcg ggttcatccc ggagtacgac ttcgacgcgc gtgagttcgg gctcaacatg 240

ttccagatgg aggactcgga cgccaaccag acgatctcgc tgctcaaggt gaaggaggcg 300

ctgacggacg ccaacatccc ggcgttctcg agcggtaaga agaacatcgg ctgcgtgctg 360

ggcatcggcg gcggccagaa ggcgagccac gagttctact cgcggctcaa ctacgtggtc 420

gtggacaagg tgctgcgcaa gatgggcctg ccggaggaag acgtggcggc ggcggtggac 480

aagtacaagg cgagtttccc cgagtggcgc ctcgactctt tccccgggtt cctgggcaac 540

gtcacggcgg ggcgctgctg caataccttc aacatggagg gcatgaactg cgtcgtggac 600

gcggcctgcg cgtcgtcgct gatcgcggtc aaagtggcga tcgaggagct gctctacggc 660

gactgcgatg cgatgatcgc gggtgccacc tgcacggaca actcgatcgg gatgtacatg 720

gccttctcca agacgcccgt gttttccacg gacccgagcg tcaaggcgta cgacgccgcc 780

accaaaggca tgctcatcgg cgagggctcg gcgatgctcg tgctgaagcg ctacgcggac 840

gccgtgcgcg acggcgacac cgtgcacgcc gtcatcaagg ggtgcgcgtc ctcgagcgac 900

ggcaaggcgg cgggcatcta cacgccgaca atctcgggcc aggaggaggc cctgcgccgc 960

gcctacgccc gcgccaatgt cgacccggcc actgtgacgc tggtggaggg ccacggcacg 1020

ggtacgccgg tgggcgacaa gatcgagctg acggcgctga gcaacctctt ctccaaggcg 1080

ttttctgcca acggtggcgg cgcggaggaa gcagagcagg tggcggtggg cagcatcaag 1140

tcgcagatcg ggcacctcaa ggcggtggcc gggctggccg ggctggtcaa ggtggtgctg 1200

gcgctcaagc acaagacgct gccgcagacg atcaacgtcg acaagccgcc gtcgctggtg 1260

gacgggaccc cgatccagca gtcgccgctg tacgtcaaca cgatgaaccg cccctggttc 1320

acgcccgtag gggtgccgcg ccgcgccggc gtgtcgtcgt ttgggtttgg cggtgccaac 1380

taccacgccg tgctggagga gtttgagccc gagcacgaga gcgcgtaccg gtacaacaac 1440

ctgccgcagg tggcgctgct gcacgcgggg gacgtcgcga ccttggcggc gacggttcgc 1500

gccaagctgg cgctggccac cgccgagcag gaagaggcgc gtgtggtgaa gaacgcggac 1560

tacatcgcgt accaccggtt cctggacgag tgcaagttgc gcggcgctgt gccgcaggcg 1620

cacgcgcggg tgggactgct cgtacgggac ctgagctcgc tcatcgccgt gctcgaggcc 1680

gctgccgcca agctcgcggg cgaagagagc gcgacggagt ggacggtcag cgttgctacg 1740

ggcgaggcgg ccttccgcgt gcgcggtgtg gctacggagg ccaacgtggc ggcgctgttc 1800

tcgggccagg gcgcgcagta cacgcacatg ttcagcgacg tggcgatgaa ctggcccccg 1860

ttccgcgaga gcgtcgccgc catggaccgc gcccagcgcg agcgcttcgg gcggcctgcc 1920

aagcgcgtga gcagcgtgct gtacccgcgc aagccgtacg gcgacgaacc gcggcaggac 1980

cacaaggaga tctcgcaaac gcgctactcg cagcccgcaa cgctcgcgtg ctcggtcggc 2040

gcctttgaca tcttcaaagc ggcgggactg gcgccgagct ttgcggcggg ccactcgctg 2100

ggcgagtttg cggcgctcta cgcggccggg tcgctcgatc gcgacgccgt cttcgacctg 2160

gtctgcgcgc gcgccaaggc catgagcgac ttcacggccc aggccagcag cagcggtggc 2220

gccatggcgg ccgtgattgg cgccaaggcg gaccagctct cgctgggtgg cgcgcccgac 2280

gtgtggctcg ccaacagcaa ctcgccctcg cagaccgtga tcacgggaac cgccgaagca 2340

gtggctgcgg cctctgacaa gttgcgctgc agcggcaact tccgcgtcgt gcctctggcc 2400

tgcgaggcgg ccttccactc gccgcacatg cgcggcgcgg agcagacgtt tgcgtcggcg 2460

ctcgcgcagg cgcccgtgtc ggcaccggcg gctgctcggt tctactctaa cgtgacgggg 2520

ggcgccgcgg taacctcgcc cgcggacgtc aaaacgaacc tgggcaagca catgacgagc 2580

cctgtgcagt tcgtgcagca ggtgcgagcc atgcacgcgg cgggcgcgcg tgtgtttgtg 2640

gagtttgggc ccaagcaggt cctgtcgcgc ctcgtcaagg agacccttgg cgaggccggc 2700

gacgtggtca cggtcgccgt caacccagac tcggccaagg acagcgacac gcagctgcgc 2760

caggcggcgc tcacgttggc ggtcgccggc gtgccgctca aggactttga ccgctggcag 2820

ctgccggatg ccacgcgcct cgagcctgtc aagaagaaga agaccacgtt gcggctctcg 2880

gcagccacct acgtctccgc caagacgttg cgccagcgcg aggccgtgct caacgacggc 2940

tacactgtca gtggtgccac ggcggtagtc aaggaagtgg acacggccaa cgaggagcgt 3000

ctcgtccgcc aagcccagga tctccagcgc cagctcgcgg aggcctcgac ggcagcccag 3060

gcggcgcagt ccaaggtcgc ggagctcgag cgcacgatcc aggacttgga gcgcaaggtg 3120

cagcagcagc agcaagagaa gggtgagaac tcagacagca acgctgccgc cgaagtgctg 3180

cggcgccaca aggagctgct ccagcgcatg ctgcaggact gtgacgagca ggcagtgccc 3240

gtagccacgg tggttccgac acctacgtcc tccccgacgc ctacatcctc acccgtatcc 3300

ggcaacagca agagcactcg tggcagtgct gatctgcaag cgctgctggc caaggcggag 3360

actgtggtga tggctgtgct ggctgccaag actggctacg aggccgacat ggttgaggcg 3420

gacatggacc tggaggccga gctcggcatc gactcgatca agcgcgtgga gatcctttcc 3480

gaggtgcagg gccagctggg cgtcgaggcc aaggacgtgg atgcgctgag ccgcacgcgc 3540

acggtcggtg aggttgtgga cgccatgaag gcggagatcg tggctgcctc tggtggtagt 3600

gctcctgcgg ttccttcggc gcccgctgct tctgcagctc cgactcccgc tgcttcgact 3660

gcgccttctg ctgatctgca agcgctgctg tccaaggcgg agactgtggt gatggctgtg 3720

ctggcggcca agactggcta cgaggccgac atggtcgagg cggacatgga cctggaggcc 3780

gagctcggca tcgactcgat caagcgcgtg gagatcctct cggaggtgca gggccagctg 3840

ggcgtcgagg ccaaggacgt ggatgcgctg agccgcacgc gcacggtcgg tgaggttgtg 3900

gatgccatga aggcggaaat cgtggctgcc tctgctggta gtgctcctgc tcctgctgtt 3960

ccttcggcgc ccgctgcttc tgcagctccg actcccgctg cttcgactgc gccttctgct 4020

gatctgcaag cgctgctgtc caaggcggag acggtggtga tggctgtgct ggcggccaag 4080

actggctacg aggccgacat ggtcgaggcg gacatggacc tggaggccga gctcggcatc 4140

gactcgatca agcgcgtgga gatcctctcg gaggtgcagg gccagctggg cgtcgaggcc 4200

aaggacgtgg atgcgctgag ccgcacgcgc acggtcggtg aggttgtgga tgccatgaag 4260

gcggaaatcg tggctgcctc tggtggtagt gctcctgctc ctgcggttcc ttcggcgccc 4320

gctgcttctg cagctccgac tcccgcggct gcgacagcgc cttctgctga tctgcaagcg 4380

ctgctggcca aggcggagac tgtggtgatg gctgtgctgg cggccaagac tggctacgag 4440

gccgacatgg tcgaggcgga catggacctg gaggccgagc tcggcatcga ctcgatcaag 4500

cgcgtggaga tcctttccga ggtgcagggc cagctgggcg tcgaggccaa ggacgtagat 4560

gcgctgagcc gcacgcgcac ggtcggtgag gttgtggatg ccatgaaggc ggagatcgtg 4620

gctgcctctg ctggtagtgc tcctgctcct gctgttcctt cggcgcccgc tgcttctgca 4680

gctccgactc ccgctgcttc gactgcgcct tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag 4740

gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc 4800

gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc 4860

ctctcggagg tgcagggcca gctgggcgtc gaggccaagg acgtggatgc gctgagccgc 4920

acgcgcacgg tcggtgaggt tgtggatgcc atgaaggcgg aaatcgtggc tgcctctggt 4980

ggtagtgctc ctgctgctgc tgttccttcg gcgcccgctg cttctgcagc tccgactcct 5040

gcgactgcgc cttctgctga tctgcaagcg ctgctgtcca aggcggagac tgtggtgatg 5100

gctgtgctgg cggccaagac tggctacgag gccgacatgg tcgaggcgga catggacctg 5160

gaggccgagc tcggcatcga ctcgatcaag cgcgtggaga tcctttccga ggtgcagggc 5220

cagctgggcg tcgaggccaa ggacgtagat gcgctgagcc gcacgcgcac ggtcggtgaa 5280

gtggtggacg ccatgaaggc ggagatcgtg gctgcctctg gtggtagtgc tcctgctgct 5340

ccttcggcgc ccgcgcttct tccaacgctg tttggttccg agtgcgagga cctgtctctg 5400

acctttcccg tgataacgac cctgccgctt cctgcagagc ttgtgctggc cgagggcggc 5460

gctcgccctg tagtcgtggt ggatgatgga tctgcactca cctcgtcgct ggtgtcctcg 5520

ctcggcgatc gtgcggtgct gctgcaggtg cagtcttcct ctgcctgctc gccgcgctcg 5580

accacgcaca agttggtgac cgtagcagac cgctctgaag cggcgctaca ggcggcgctc 5640

acgtccgtcg aggcgcagtt cggcaaggtg ggtggctttg tgttccagtt cggcgacgac 5700

gacgtgcaag cgcagctcgg ctgggcgctg ctcgcggcca agcacctcaa aacttcgctg 5760

tcagaacaga tcgagggcgg tcgcaccttt ttcgtggccg tcgcgcggct cgacggccag 5820

ctggggctct ccggcaagtc gacgaccgct accgttgatc tctcccgcgc gcagcagggc 5880

agcgtgttcg gcctgtgcaa gacactcgac ctggagtggc ccgctgtctt ctgccgcgga 5940

atcgacctgg ccgccgacct cgacgccgca caggccgcgc ggtgcctgct gggcgagctg 6000

tcagaccccg acgtggccgt gcgcgagtct ggttactccg cctcgggcca gcgctgcacg 6060

acaactacga agtcgctgac tacgggcaag ccgcaccagc cgatctcctc gtcggacctc 6120

tttctggtgt cgggcggcgc gcgcggcatc accccgctgt gcgtgcgcga gctggcgcag 6180

cgcgtgggcg gcggcacgta cgtgctcatc ggccgctcgg agctgcccac gacggagcct 6240

gcctgggcgg tcggcgtgga gtctggcaag ccgctggaga aggccgcgct ggcgttcctg 6300

aaggcggagt ttgcagcggg ccgcggggcc aagccgacgc cgatgctgca caagaagctc 6360

gtgggcgccg tggtcggagc gcgcgaggtg cgagcctcgc tcgccgagat cactgcacag 6420

ggcgccacgg ctgtgtacga gtcgtgcgac gtgagctctg ccgccaaggt gcgtgagatg 6480

gtagagcgcg tgcagcagca gggcgggcgg cgcgtgtcgg gcgtgttcca cgcgtcgggc 6540

gtgctgcgcg acaagctcgt ggagaacaag tcgctggcgg acttcagcgc cgtgtacgac 6600

accaaggtgg gcggcctcat caacctgctg gcctgcgtgg acctggcgca gctgcgtcac 6660

ctcgtgctct tcagctcgct cgcgggcttc cacggcaacg tcgggcagtc ggactacgca 6720

atggccaacg aggcgctcaa caagctggcg gcgcacctgt cggcggtgca cccgcagctg 6780

tgcgcgcgct cgatctgctt cggaccgtgg gacggcggca tggtgacccc cgcgctcaag 6840

gccaacttca tccgcatggg catccagatc atcccgcgcc aaggcggcgc gcagaccgtc 6900

gccaacatgc tcgtcagtag ctcccccggt cagctgctcg tgggcaactg gggcgtgcca 6960

cccgtcgtgc cgagtgccac cgagcacacc gtgctgcaga cgctccgcca gagcgacaac 7020

cccttcctcg actcgcacgt gatccagggc cgccgcgtgc tgcccatgac cctggccgtg 7080

ggctacatgg cgcaccaggc gcagagcatc tacgcgggcc accagctgtg ggccgtcgag 7140

gacgcccagc tcttcaaggg catcgccatc gacaatggcg ccgacgtgcc cgtgcgcgtg 7200

gagctgtcgc gccgcaagga ggagcaggag gacgccggca aggtcaaggt caaggtgcag 7260

gtgctgctca aatcgcaggt caacggcaag tcggtgcccg cgtacaaggc gaccgtcgtg 7320

ctgtcccctg cgccgcgccc cagcgtcatc acgcgtgact tcgacctcac cccggacccg 7380

gcctgcacgg agcacgacct ctacgacggc aagacgctct tccacggcaa ggccttccag 7440

ggcatcgagc aggtgctctc ggcgacgccc aagcagctca ccgccaagtg ccgcaatttg 7500

cccctcacgc ccgagcagcg cggccagttc gtcgttaacc tcagccagca ggacccgttc 7560

caggcggaca ttgcgttcca ggcgatgctc gtctgggcgc gcatgctgcg ccaatcggcg 7620

gccctgccca acaactgcga gcgcttcgac ttttacaagc cgatggcccc gggcgccacc 7680

tactacacgt cggtcaagct ggcctcggcc tcacccttgg tggactctgt gtgcaagtgc 7740

accgtggcga tgcacgatga gcaaggtgag gtgtactttt ctgctcgtgc cagcgtcgtc 7800

ctcaacaaga ccctcacgta ctaa 7824

<210> 3

<211> 7824

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Растение с оптимизированным PFA1 синтаз PUFA

<400> 3

atggatacca gaattgccat tgtgggaatg agtgcgatcc ttccgagtgg tgagaatgtt 60

agagagagct gggaggccat cagagatggc ttggattgtc tgtctgatct gcctgcggat 120

cgtgtggatg tgactgccta ttacaatcca gagaaaacga ccaaggacaa aatctactgc 180

aaaagaggtg ggttcatccc tgagtatgac tttgatgctc gtgagtttgg cctcaacatg 240

ttccagatgg aagattctga tgcgaaccag accatctcat tgctcaaggt gaaggaagct 300

ctcaccgatg ccaacatacc tgctttctca agtggcaaaa agaacattgg ttgtgttctt 360

ggcataggtg gaggtcagaa ggcgtcacat gagttctact ccagactcaa ctatgttgtg 420

gttgacaaag tgctcagaaa gatgggtttg ccagaggaag atgtggcagc tgcggtggac 480

aagtacaagg cgagcttccc agagtggagg cttgattctt ttcctggttt cttgggcaat 540

gttaccgctg gcagatgttg caacaccttc aacatggagg gcatgaactg tgtcgttgac 600

gctgcctgtg cttcaagcct gattgcggtc aaggtggcaa tagaagagct tctctatggt 660

gactgtgatg ccatgattgc tggtgccacc tgcacagaca attcaatagg gatgtacatg 720

gccttctcca agacgcctgt tttctctacg gacccgagtg tcaaagcgta tgatgctgcc 780

accaaaggca tgttgattgg tgaaggatct gcgatgcttg ttctgaagag atatgcggat 840

gctgtcagag atggtgacac tgttcatgct gtcatcaagg gctgtgcttc ctcaagtgat 900

ggaaaagcag ctggaatcta cacaccgaca atcagcggac aagaagaggc tctccgtaga 960

gcctatgcac gtgccaatgt ggacccagcc actgtcactc ttgttgaagg acatggaact 1020

ggcactccgg ttggggacaa gattgaactc acagctctga gcaatctctt ctccaaagcg 1080

ttttctgcga atggaggtgg agctgaggaa gctgagcaag ttgctgttgg cagcatcaag 1140

agccagatag ggcacctcaa agcggttgct ggattggctg gattggtcaa agtggtcctt 1200

gctctcaagc acaagacatt gcctcagacg atcaatgtgg acaagccacc ttcactggtg 1260

gatgggacac cgattcaaca gtcccctttg tacgtcaaca ccatgaaccg tccctggttc 1320

actccggttg gggttccgag gagagctggc gtttcctcat ttggttttgg aggtgcgaac 1380

taccatgctg tgcttgaaga gtttgaacct gaacatgaga gtgcttaccg ttacaacaat 1440

cttccccaag ttgctctcct tcatgctggg gatgttgcaa ctcttgctgc cacagttagg 1500

gcaaaactgg cattggccac tgctgagcaa gaagaggcta gagttgtgaa gaacgctgat 1560

tacattgcat accataggtt ccttgatgaa tgtaagttga gaggagctgt tccccaagcc 1620

cacgcaaggg ttggacttct ggtgagggac ctgtcctctc tcattgcggt tttggaagca 1680

gctgcagcca aacttgctgg agaagagtca gcaacggaat ggacggtctc agttgccact 1740

ggtgaggctg cattcagagt taggggtgtt gccacagagg ccaatgttgc tgcacttttc 1800

tctggccaag gagcgcagta cactcacatg ttctcagatg ttgccatgaa ctggcctccg 1860

ttcagagaga gtgttgctgc gatggacaga gcgcagagag aacgttttgg gaggccagcc 1920

aaaagagtct ccagtgttct ctatccgaga aaaccttatg gagatgagcc aaggcaagat 1980

cacaaagaga tttctcagac gcgttactct cagccagcaa ccctcgcttg ctctgtcggt 2040

gcctttgaca tcttcaaagc agctggattg gctccttctt ttgcagctgg acattccctg 2100

ggagagtttg cagctctcta tgcagctggt tcattggatc gtgatgctgt gtttgacttg 2160

gtttgcgcta gggcaaaggc catgtctgat ttcactgctc aagccagctc cagtggaggt 2220

gctatggcag cggtcatagg agccaaggct gatcagctca gccttggtgg agcacctgat 2280

gtttggctgg ccaatagcaa cagtccatca cagacggtga tcacgggaac tgctgaagca 2340

gtggcagctg catctgacaa acttcgttgt agtggaaact tcagagtggt tcctcttgct 2400

tgtgaagctg ccttccattc accacacatg cgtggagcag agcagacatt tgcgtctgcg 2460

cttgctcaag ctccagtgtc cgcacctgca gctgccagat tctacagcaa cgtcactggt 2520

ggagctgcag tcacctctcc tgctgatgtc aaaacgaacc ttgggaaaca catgacttct 2580

cctgtgcagt ttgtgcagca agtccgtgcc atgcacgcag ctggagcaag ggtgtttgtt 2640

gagttcggtc ccaagcaagt cctttctcgt ttggtcaaag agacccttgg ggaagctgga 2700

gacgtggtca cggtggctgt caacccagac tcagccaagg attcagacac ccagctgaga 2760

caagcagctc tcaccttggc tgtggctggt gttccactca aagactttga cagatggcag 2820

cttcccgatg ccactcgtct tgagcctgtc aagaaaaaga aaacaacctt gaggttgagt 2880

gctgccacct atgtctctgc caagaccttg aggcagaggg aggctgtgct caatgatggt 2940

tacactgtga gtggtgccac agcggttgtc aaagaagtgg acactgcaaa cgaagagaga 3000

cttgtcagac aagcacaaga cctccagcgt cagcttgctg aagcaagcac tgcagcccaa 3060

gcagctcaat ccaaggtcgc tgaattggag aggacaatcc aagacttgga gaggaaggtt 3120

caacagcaac agcaagagaa aggtgagaac tctgactcca atgcagctgc ggaagtgctt 3180

aggagacaca aggaactgct ccagaggatg ctccaagatt gtgatgagca agcagttccc 3240

gtggcaacag tcgttccaac acccacttct tcccctacac caacatcctc accagttagc 3300

ggaaacagca agtccaccag aggatcagcc gacctccaag cactcctggc gaaagctgag 3360

acggtcgtga tggcagtttt ggctgcaaag actggctacg aggcagacat ggtggaagca 3420

gatatggatt tggaggctga gcttgggatt gattccatca aaagggtgga gatcctgagt 3480

gaagtccaag ggcagctcgg agttgaagcg aaggatgttg atgccctttc acgtacaagg 3540

accgtcggag aggttgtgga tgccatgaag gctgagattg ttgctgcatc tggtgggtca 3600

gcacctgctg tcccctctgc accagctgca tcagcggctc cgacacctgc tgcgagtacc 3660

gctccgagtg ctgatcttca ggctctcctg tctaaagccg agacggttgt gatggctgtg 3720

ctcgcagcga aaactggtta cgaggctgac atggtggaag ctgacatgga ccttgaagcg 3780

gagttgggaa tagatagcat caaacgtgtt gaaatcttgt ctgaggtcca aggacagttg 3840

ggtgtggaag ccaaagatgt cgatgcgctt tcaagaacca gaaccgtcgg tgaggtcgtg 3900

gacgccatga aggctgagat tgtggctgcc tctgctggct ccgctcctgc tccagcagtt 3960

ccttctgcac ctgcagcgtc agcggctcca actccagctg catccacggc tccttctgca 4020

gacctccaag ccttgctgtc caaagccgaa acagttgtga tggctgtcct tgctgcaaag 4080

actggttacg aagccgacat ggttgaagct gacatggatt tggaagccga acttggaata 4140

gattccatca aaagagtgga gatactctct gaggtgcaag gtcagctcgg agttgaagcg 4200

aaagacgttg atgccctcag taggaccaga actgttgggg aagttgtcga tgcgatgaag 4260

gctgagattg tcgctgccag cggtggatct gcacctgcac ctgcggtccc gtcagctcca 4320

gcagccagcg cagctccgac tcctgcagct gccacagcac cgagtgcgga tctgcaggca 4380

ttgcttgcga aggctgaaac agttgtcatg gctgtcctgg ctgcgaaaac tggctatgag 4440

gctgatatgg tggaagccga catggacctt gaggctgaat tgggcattga cagcatcaag 4500

cgtgttgaga ttctcagtga agtccaagga cagctcggag tggaggcgaa ggatgtggat 4560

gccctctcaa ggaccagaac agttggtgag gtcgttgatg cgatgaaggc agagattgtt 4620

gctgccagtg ctggttctgc tcccgcaccc gctgtcccaa gcgcaccagc tgcctccgcc 4680

gctcccacac cagctgcctc tactgcacca agtgcggacc ttcaagctct cctgagcaag 4740

gctgagacag ttgtgatggc agtccttgct gcgaaaactg gctatgaggc agacatggtg 4800

gaagcggaca tggatctgga agctgaactt ggaattgact ccatcaaacg tgttgaaatc 4860

ctctctgagg ttcaaggtca gcttggggtg gaggccaaag atgttgatgc tctttccaga 4920

acaaggacgg tgggagaggt ggttgatgcc atgaaggctg agatagtggc agcgtcagga 4980

gggtcagcac ctgcagctgc cgttccgtcc gcaccagcag cctctgcagc tcccacgcca 5040

gccaccgctc ctagtgctga tttgcaagcc ctcctttcaa aagctgaaac tgttgtcatg 5100

gctgttttgg ctgccaagac tggctacgag gctgacatgg ttgaggctga catggacttg 5160

gaagccgagc ttgggattga tagcatcaag cgtgtggaaa tcctttctga ggttcaaggt 5220

cagctgggtg ttgaggccaa agatgtcgat gcgttgtcaa ggaccagaac ggttggagaa 5280

gtggtcgatg ccatgaaggc tgagatagtt gctgcctctg gaggttcagc tcctgcagct 5340

ccgtcagcac ctgccctcct tccaactttg tttggttctg agtgtgaaga tttgagcttg 5400

actttcccag tcatcacaac cctgcctctt cctgctgaac ttgtgctggc tgaaggtgga 5460

gcacgtcctg tggttgtggt tgacgatggc tctgcactca ccagttctct tgtgtcctca 5520

cttggtgatc gtgctgtgct cttgcaagtt cagtccagct ctgcctgttc acccagaagc 5580

accacgcaca agttggtcac tgttgcagac cgttctgaag ctgcattgca agctgcgctc 5640

acatcagttg aagcacagtt tggaaaagtg ggaggttttg tgttccagtt tggtgatgac 5700

gatgtccaag cgcagcttgg ttgggcactg cttgctgcca aacatctcaa aacgtccttg 5760

tcagaacaga tagaaggtgg gaggaccttc tttgttgccg ttgcgaggtt ggatggtcag 5820

ttggggttgt ctggaaagtc cacgactgcc actgttgatc tctccagagc gcagcaaggc 5880

tcagtctttg gactctgcaa aacccttgac ttggaatggc ctgctgtttt ctgcagagga 5940

atcgaccttg cagctgactt ggatgctgca caagctgcca gatgtctttt gggtgagctt 6000

tcagacccag atgtggcagt gagggagtct ggttactccg catctgggca aagatgcacc 6060

acaaccacaa agtctctcac cacgggaaaa ccacatcaac cgatctcttc cagtgatttg 6120

ttcctggtct ctggaggtgc tcgtggaatc acacctcttt gtgtgagaga attggcacag 6180

agggtgggag gtggaaccta tgtcctcatt gggagaagtg agctgcccac cacggaacct 6240

gcctgggctg ttggtgttga gtcagggaaa cctcttgaga aggctgcgct ggcgttcctc 6300

aaagctgagt ttgcagctgg aaggggagcg aagccgacac cgatgctcca caagaaactt 6360

gttggagctg ttgtgggagc tagagaggtc cgtgcgagcc tggcagagat aactgctcaa 6420

ggtgccacag ctgtctatga gtcctgtgat gtcagctctg cagccaaggt tcgtgaaatg 6480

gttgagaggg ttcaacagca aggagggaga agggtcagcg gtgtgtttca tgcaagtggt 6540

gttttgagag acaagttggt tgagaacaag tcactggctg atttcagtgc tgtgtatgac 6600

acaaaggttg gtggactcat caacctcctt gcctgtgtgg atcttgcaca gcttaggcac 6660

ctggtgctct tcagctccct tgctgggttc cacggcaatg ttggtcagag tgactatgca 6720

atggccaatg aggctctcaa caagctggct gcacatctgt ctgctgtgca tccccaactt 6780

tgtgcgagat ccatttgctt tggtccgtgg gatggaggga tggtgacgcc tgcactcaag 6840

gccaacttca tcagaatggg cattcagatt atccctcgtc aaggtggagc acagacagtt 6900

gcgaacatgc ttgtcagctc cagccctggt cagctccttg ttgggaactg gggagtgcca 6960

cctgtggttc caagtgccac tgagcacact gttttgcaga ctcttcgtca gagcgacaac 7020

cccttcttgg attcacatgt cattcaaggg agaagggttt tgccgatgac actggctgtc 7080

ggctacatgg ctcaccaagc tcagagcatc tacgctggac atcagctttg ggcagttgag 7140

gatgcccagc ttttcaaagg catagccatt gacaatggag ctgatgttcc ggttagggtt 7200

gagttgtcaa ggagaaagga ggaacaagag gatgctggca aggtcaaggt caaggttcaa 7260

gtgcttctca aatctcaagt caatggcaag tcagtccctg cttacaaggc gactgtcgtg 7320

ctttcccctg ctccacgtcc cagtgtcatc acccgtgact ttgatctcac tcctgaccca 7380

gcctgcaccg aacatgacct ctatgatggc aagacgctct tccacggcaa agccttccaa 7440

ggaatagaac aagttctttc tgcgacgcca aaacagctca ctgccaaatg cagaaacctt 7500

ccactcacac cggagcagcg tggccagttt gtggtcaatc tcagccagca agacccattc 7560

caagctgaca ttgctttcca agccatgctt gtttgggcta ggatgttgag acagtctgct 7620

gcgctgccca ataactgtga aaggtttgat ttctacaaac cgatggctcc tggagcaact 7680

tactatacca gtgtcaaact ggcttcagct tcaccattgg tggattctgt gtgcaaatgc 7740

actgttgcca tgcacgatga gcaaggtgaa gtgtacttct ctgcgagagc cagtgttgtc 7800

ctcaacaaga cactcacata ctga 7824

<210> 4

<211> 1925

<212> PRT

<213> Schizochytrium sp.

<400> 4

Met Pro Cys Asp Asn Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala

1 5 10 15

Gly Cys Lys Asn Gln Asp Glu Phe Trp Asp Thr Leu Met Arg Lys Glu

20 25 30

Ile Asn Ser Ser Pro Ile Ser Ala Glu Arg Leu Gly Thr Arg Tyr Arg

35 40 45

Asp Leu His Phe His Pro Gln Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys

50 55 60

Asn Asp Arg Tyr Gly Cys Val Asp Ala Ser Val Asp Asn Glu His Asp

65 70 75 80

Leu Leu Ala Asp Leu Ala Arg Arg Ala Leu Leu Asp Ala Gly Ile Asn

85 90 95

Leu Asp Asp Ala Ser Thr Thr Ala Asn Leu Arg Asp Phe Gly Ile Val

100 105 110

Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu

115 120 125

Asn Leu Tyr Gln Val His Val Glu Asn Arg Val Gly Ala Gln Arg Phe

130 135 140

Arg Asp Ser Arg Pro Trp Ser Glu Arg Pro Arg Ala Val Ser Pro Glu

145 150 155 160

Ala Ser Asp Pro Arg Val Tyr Ser Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asn

165 170 175

Gln Leu Gly Leu Gly Pro Val Arg Tyr Ser Leu Asp Ala Ala Cys Ala

180 185 190

Ser Ala Leu Tyr Cys Leu Lys Leu Ala Ser Asp His Leu Leu Ser Arg

195 200 205

Ser Ala Asp Val Met Leu Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Asp Pro Phe

210 215 220

Phe Ile Leu Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Asp Asp Asn Pro Leu Ser Val Pro Leu Arg Gln Gly Ser Gln Gly

245 250 255

Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ala Ile Met Val Leu Lys Arg Leu Glu

260 265 270

Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Arg Ile Tyr Gly Thr Leu Leu Gly Thr

275 280 285

Ser Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu Pro Leu Ser Pro His Leu Pro

290 295 300

Ser Glu Lys Ser Cys Met Glu Asp Leu Tyr Thr Ser Val Gly Ile Asp

305 310 315 320

Pro Ser Glu Val Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Gln

325 330 335

Gly Asp Val Val Glu Val Glu Ala Leu Arg His Cys Phe Arg Gly Asn

340 345 350

Thr Asp His Pro Pro Arg Met Gly Ser Thr Lys Gly Asn Phe Gly His

355 360 365

Thr Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala Lys Val Leu Leu Ser

370 375 380

Met Gln His Gly Thr Ile Pro Pro Thr Pro Gly Val Asp Arg Ser Asn

385 390 395 400

Cys Ile Asp Pro Leu Val Val Asp Glu Ala Ile Pro Trp Pro Tyr Ser

405 410 415

Ser Ala Gln Ala Arg Ala Gly Lys Pro Gly Asp Glu Leu Lys Cys Ala

420 425 430

Ser Leu Ser Ala Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Cys Val Phe

435 440 445

Arg Glu His Arg Gln Ile Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ser Pro Val Leu

450 455 460

Pro Glu Val Thr Pro Gly Pro Ile Ala Ile Ile Gly Met Asp Ala Thr

465 470 475 480

Phe Gly Thr Leu Lys Gly Leu Asp Ala Phe Glu Gln Ala Ile Tyr Lys

485 490 495

Gly Thr Asp Gly Ala Ser Asp Leu Pro Ser Lys Arg Trp Arg Phe Leu

500 505 510

Gly Ala Asp Thr Asp Phe Leu Thr Ala Met Gly Leu Asp Ala Val Pro

515 520 525

Arg Gly Cys Tyr Val Arg Asp Val Asp Val Asp Tyr Lys Arg Leu Arg

530 535 540

Ser Pro Met Ile Pro Glu Asp Val Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala

545 550 555 560

Val Ala Thr Met Asp Arg Ala Leu Gln Asp Ala Gly Met Ala Thr Gly

565 570 575

Gly Lys Val Ala Val Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Thr Glu Leu Tyr

580 585 590

Arg His Arg Ala Arg Val Thr Leu Lys Glu Arg Leu Asp Pro Ala Ala

595 600 605

Phe Ser Pro Glu Gln Val Gln Glu Met Met Asp Tyr Ile Asn Asp Cys

610 615 620

Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr

625 630 635 640

Arg Val Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr

645 650 655

Glu Gly Ala Asn Ser Val Tyr Arg Cys Leu Glu Leu Gly Lys Phe Leu

660 665 670

Leu Asp Thr His Gln Val Asp Ala Val Val Val Ala Gly Val Asp Leu

675 680 685

Cys Ala Thr Ala Glu Asn Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ser Ala Ile

690 695 700

Ser Arg Gln Asp His Pro Arg Ala Asn Phe Glu Ala Ser Ala Asp Gly

705 710 715 720

Tyr Phe Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ala Leu Val Leu Lys Arg Gln Ala

725 730 735

Asp Val Gly Ser Asp Asp Lys Val Tyr Ala Ser Val Ala Gly Leu Thr

740 745 750

Cys Ala Ala Gln Pro Ala Glu Ala Val Ser Pro Leu Leu Leu Gln Val

755 760 765

His Asn Asp Asp Asn Glu Lys Arg Val Val Glu Met Val Glu Leu Ala

770 775 780

Ala Asp Ser Gly Arg His Ala Pro His Leu Ala Asn Ser Pro Leu Ser

785 790 795 800

Ala Glu Ser Gln Leu Glu Gln Val Ser Lys Leu Leu Ala His Gln Val

805 810 815

Pro Gly Ser Val Ala Ile Gly Ser Val Arg Ala Asn Val Gly Asp Val

820 825 830

Gly Tyr Ala Ser Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu

835 840 845

His Asn Arg Tyr Leu Pro Ala Asn Pro Gln Trp Glu Arg Pro Val Ala

850 855 860

Pro Val Ser Glu Ala Leu Phe Thr Cys Pro Arg Ser Arg Ala Trp Leu

865 870 875 880

Lys Asn Pro Gly Glu Ser Arg Leu Ala Ala Val Ala Ser Ala Ser Glu

885 890 895

Ser Gly Ser Cys Phe Gly Val Leu Leu Thr Asp Glu Tyr Ala Thr His

900 905 910

Glu Ser Ser Asn Arg Leu Ser Leu Asp Asp Ala Ala Pro Lys Leu Ile

915 920 925

Ala Ile Arg Gly Asp Thr Val Asp Asp Ile Met Ala Lys Val Asn Ala

930 935 940

Glu Leu Ala Leu Leu Arg Ala His Ala Glu Thr Gly Ser Ala Thr Asp

945 950 955 960

Asp Asp Pro Ala Ala Ala Val Ala Phe Thr Ala His Arg Leu Arg Phe

965 970 975

Leu Arg Leu Val Gly Glu Thr Val Ala Ser His Gly Ala Thr Ala Thr

980 985 990

Leu Cys Leu Ala Leu Leu Thr Thr Pro Glu Lys Leu Glu Lys Glu Leu

995 1000 1005

Glu Leu Ala Ala Lys Gly Val Pro Arg Ser Ala Lys Ala Gly Arg

1010 1015 1020

Asn Trp Met Ser Pro Ser Gly Ser Ala Phe Ala Pro Thr Pro Val

1025 1030 1035

Thr Ser Asp Arg Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro

1040 1045 1050

Tyr Tyr Gly Val Gly Leu Asp Leu His Arg Leu Trp Pro Ala Leu

1055 1060 1065

His Glu Arg Ile Asn Asp Lys Thr Ala Ala Leu Trp Glu Asn Gly

1070 1075 1080

Asp Ser Trp Leu Met Pro Arg Ala Val Asp Ala Asp Ser Gln Arg

1085 1090 1095

Ala Val Gln Thr Ala Phe Asp Ala Asp Gln Ile Glu Met Phe Arg

1100 1105 1110

Thr Gly Ile Phe Val Ser Ile Cys Leu Thr Asp Tyr Ala Arg Asp

1115 1120 1125

Val Leu Gly Val Gln Pro Lys Ala Cys Phe Gly Leu Ser Leu Gly

1130 1135 1140

Glu Ile Ser Met Leu Phe Ala Leu Ser Arg Arg Asn Cys Gly Leu

1145 1150 1155

Ser Asp Gln Leu Thr Gln Arg Leu Arg Thr Ser Pro Val Trp Ser

1160 1165 1170

Thr Gln Leu Ala Val Glu Phe Gln Ala Leu Arg Lys Leu Trp Asn

1175 1180 1185

Val Pro Ala Asp Ala Pro Val Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu

1190 1195 1200

Val Arg Ala Ser Arg Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Gly Pro Asp

1205 1210 1215

Asn Arg Phe Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Ser Ser Ala

1220 1225 1230

Leu Ile Ala Gly Lys Pro Ala Glu Cys Leu Arg Val Leu Glu Arg

1235 1240 1245

Leu Gly Gly Arg Leu Pro Pro Met Pro Val Lys Gln Gly Met Ile

1250 1255 1260

Gly His Cys Pro Glu Val Ala Pro Tyr Thr Pro Gly Ile Ala His

1265 1270 1275

Ile His Glu Ile Leu Glu Ile Pro Asp Ser Pro Val Lys Met Tyr

1280 1285 1290

Thr Ser Val Thr Asn Ala Glu Leu Arg Gly Gly Ser Asn Ser Ser

1295 1300 1305

Ile Thr Glu Phe Val Gln Lys Leu Tyr Thr Arg Ile Ala Asp Phe

1310 1315 1320

Pro Gly Ile Val Asp Lys Val Ser Arg Asp Gly His Asp Val Phe

1325 1330 1335

Val Glu Val Gly Pro Asn Asn Met Arg Ser Ala Ala Val Ser Asp

1340 1345 1350

Ile Leu Gly Lys Ala Ala Thr Pro His Val Ser Val Ala Leu Asp

1355 1360 1365

Arg Pro Ser Glu Ser Ala Trp Thr Gln Thr Leu Lys Ser Leu Ala

1370 1375 1380

Leu Leu Thr Ala His Arg Val Pro Leu His Asn Pro Thr Leu Phe

1385 1390 1395

Ala Asp Leu Tyr His Pro Thr Phe Leu Thr Ala Ile Asp Ser Ala

1400 1405 1410

Met Gln Glu Pro Pro Pro Lys Pro Asn Arg Phe Leu Arg Ser Val

1415 1420 1425

Glu Val Asn Gly Tyr Phe Cys Pro Asp Gly Ile Ser Lys Gln Val

1430 1435 1440

Ala Ala Ala Ser Ala Lys Pro Ser Thr His Cys Met Val Arg Leu

1445 1450 1455

His Pro Ala Lys Ala Val Val Val Ala Ala Ala Gly Ala Val Val

1460 1465 1470

Ala Asp Ser Thr Pro Val Val Lys Ala Lys Gln Thr Ser Ser Ser

1475 1480 1485

Leu Leu Val Gly Asp Asp Ala Phe Leu Arg Cys Tyr Asp Val Asp

1490 1495 1500

Trp Pro Leu Tyr Met Gly Ala Met Ala Glu Gly Ile Ser Ser Val

1505 1510 1515

Asp Leu Val Val Ala Ala Ala Glu Ala Arg Met Leu Ala Ser Phe

1520 1525 1530

Gly Ala Ala Arg Leu Pro Met Asp Gln Val Glu Leu Gln Ile Arg

1535 1540 1545

Glu Ile Gln Gln Arg Thr Ser Asn Ala Phe Ala Val Asn Leu Met

1550 1555 1560

Pro Gly Pro Asp Glu Ala Ala Thr Val Asp Ala Leu Leu Arg Thr

1565 1570 1575

Gly Val Ser Ile Val Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Ala Leu Ser

1580 1585 1590

Ala Asp Leu Val Arg Tyr Arg Val Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ser

1595 1600 1605

Cys Gly Ala Ser Val Ser Ala Thr His Arg Val Val Ala Lys Val

1610 1615 1620

Ser Arg Thr Glu Val Ala Glu His Phe Leu Arg Pro Ala Pro Ala

1625 1630 1635

Ala Val Leu Glu Ala Leu Val Ala Ala Lys Gln Ile Thr Pro Glu

1640 1645 1650

Gln Ala Ala Leu Ala Ser Arg Val Ala Met Ala Asp Asp Val Ala

1655 1660 1665

Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His

1670 1675 1680

Val Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Gln Arg Asn Arg Trp Arg His

1685 1690 1695

Leu Val Asp Thr Pro Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Ala

1700 1705 1710

Cys Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Phe Ser Leu Gly Ala Ala Phe

1715 1720 1725

Val Val Thr Gly Ser Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu Ala Gly Thr

1730 1735 1740

Ser Asp Ala Val Arg Leu Leu Leu Ala Thr Ala Thr Tyr Ser Asp

1745 1750 1755

Val Ala Met Ala Pro Gly Gly Val Gln Val Leu Lys Lys Gln Thr

1760 1765 1770

Met Phe Ala Ala Arg Ala Thr Met Leu Ala Gln Leu Gln Ala Lys

1775 1780 1785

Phe Gly Ser Phe Asp Ala Val Pro Glu Pro Gln Leu Arg Lys Leu

1790 1795 1800

Glu Arg Ser Val Phe Lys Gln Ser Val Ala Asp Val Trp Ala Ala

1805 1810 1815

Ala Arg Glu Lys Phe Gly Val Asp Ala Thr Ala Ala Ser Pro Gln

1820 1825 1830

Glu Arg Met Ala Leu Cys Val Arg Trp Tyr Met Ser Gln Ser Ser

1835 1840 1845

Arg Trp Ala Thr Glu Ala Thr Ser Ala Arg Lys Ala Asp Tyr Gln

1850 1855 1860

Ile Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Val Arg

1865 1870 1875

Gly Thr Lys Leu Asp Ala Thr Ala Gly Thr Gly Glu Phe Pro Arg

1880 1885 1890

Val Val Asp Ile Asn Gln His Ile Leu Leu Gly Ala Ser His Tyr

1895 1900 1905

Arg Arg Val Gln Gln Gln Gln Gln Asp Asp Asp Val Glu Tyr Ile

1910 1915 1920

Ile Val

1925

<210> 5

<211> 5778

<212> ДНК

<213> Schizochytrium sp.

<400> 5

atgccgtgcg ataacattgc ggtcgtgggc atggcggtgc agtatgccgg atgcaagaac 60

caggacgagt tctgggatac gctgatgcgt aaggagatca actcgagccc gatctcggcg 120

gagcgcctcg gtacgcgcta ccgcgacctc cacttccacc cgcagcgcag caagtacgcc 180

gacaccttct gcaacgatcg ctacggctgc gtcgatgcca gcgtcgacaa cgagcacgac 240

ctcctcgccg acctggcccg gcgcgccctg ctcgacgccg gaattaacct cgacgacgcc 300

agcaccaccg ccaacctacg cgacttcggc atcgtgagcg gctgcctgtc gttccccatg 360

gacaatctgc agggcgagct gctcaatctg taccaagtgc atgtggagaa ccgcgtgggc 420

gcccagcgct tccgcgactc gcgcccctgg tcggagcgcc cgcgcgctgt ctcgcccgag 480

gccagcgacc cgcgcgtgta ctccgacccg gcgtccttcg tggccaacca gctcggcctg 540

gggcccgtgc gctacagcct cgatgcagcc tgcgcgtcgg cgctgtactg cctcaagctg 600

gcgtccgacc acttgctctc gcgcagcgcg gacgtgatgc tgtgcggcgc cacatgcttt 660

ccggacccgt tcttcattct ctcggggttc tccaccttcc aggcgatgcc gctgggcgga 720

ccggacgata acccactgtc cgtgccgctg cggcagggca gccagggcct gacgcccgga 780

gagggcggcg ccatcatggt gctgaagcgc ctcgaggacg ccgtgcgcga cggcgaccgc 840

atctacggca ccttgctcgg cacgagtctg agcaacgccg ggtgcggcct gccgctgagc 900

ccgcacctgc cgagcgagaa gtcgtgcatg gaggacctgt acacgagcgt cggcatcgac 960

ccaagcgagg tgcagtacgt ggagtgccac gccacgggca ctccgcaggg cgacgtcgtg 1020

gaggtagagg cgctgcgcca ctgctttcga ggtaacacgg accacccgcc gcgcatgggc 1080

tccaccaagg gcaactttgg ccacactctc gtggcggccg ggttcgcagg catggccaag 1140

gtgctgctgt cgatgcagca cggcacgatc ccgcccacgc ccggtgtcga ccgctccaac 1200

tgcatcgacc cgctcgtcgt ggacgaggcc atcccttggc cgtactcgtc ggcgcaggcg 1260

cgggcaggca aaccaggcga tgagctcaag tgcgcctcgc tctccgcctt tggctttggt 1320

ggaaccaacg cgcactgtgt cttccgtgag caccgccaaa ttgctgctac tgcgacagcc 1380

tcgccggtgc ttcccgaggt gactcctgga ccgattgcca tcatcgggat ggacgcgacg 1440

tttggtaccc tcaagggcct ggacgcgttt gagcaggcca tctacaaggg cacggacggc 1500

gccagcgacc tgccgagcaa gcgctggcgg ttcctgggcg ccgacacgga cttcttgacc 1560

gccatgggcc tcgacgccgt gccgcgcggg tgctacgtgc gcgacgtgga cgtggactac 1620

aagcggctgc ggtcgccgat gatccctgag gacgtcctgc gcccgcaaca gctgctggcg 1680

gtggctacga tggaccgcgc gctgcaggac gctggaatgg cgacgggagg caaggtggcg 1740

gtgctggtgg ggctcggcac ggacaccgag ctgtaccggc accgcgcgcg cgtgacactc 1800

aaggagcggc tcgacccggc cgcgttctcg cccgagcagg tgcaggagat gatggactac 1860

atcaacgact gcggcacctc gacgtcgtac acgtcgtaca tcggcaacct cgtggccacg 1920

cgcgtgtcct cgcagtgggg ctttacgggc ccgtccttca ccgtcaccga aggcgcaaac 1980

tcggtctacc gctgcctcga gctgggcaag ttcctgctcg acacgcacca ggtggacgcc 2040

gtcgtggtgg ccggcgtcga cctctgtgcc accgccgaga acctttacct caaggcgcgc 2100

cgctccgcca tcagccgaca ggaccaccct cgcgccaact ttgaggccag cgccgacggg 2160

tactttgccg gcgagggcag cggcgccctg gtcctcaagc gccaggccga cgttggctca 2220

gacgacaagg tctacgccag tgtcgcgggc ctcacgtgcg ccgcgcagcc cgctgaagcc 2280

gtgtcgccgc tactactcca agtccacaac gacgacaacg agaagagggt ggtggagatg 2340

gtggagctcg ccgccgactc gggtcgccat gcgccgcact tggccaactc gccgctgagc 2400

gccgagtcgc agctggagca agtgtccaag ttgctcgcgc accaggtgcc gggctcggtg 2460

gccatcggca gcgtgcgcgc caacgtggga gacgtcgggt acgcctcggg cgccgcgagc 2520

ctcatcaaga cggcgctgtg cctccacaac cgctacctcc cggccaaccc gcagtgggag 2580

cggccggtgg cgccggtctc cgaggcgctg tttacttgcc cgcgctcgcg tgcctggctg 2640

aagaacccgg gcgagtcgcg actggcggct gtcgccagtg cctccgagag cgggtcctgc 2700

tttggcgtgc tcctcacaga cgagtacgcc actcatgaga gcagcaaccg cctctcgctg 2760

gatgacgccg cccccaagct catcgcgatc cgtggcgaca ccgttgacga tatcatggcc 2820

aaggtcaacg ccgagctggc gctcctccga gcgcacgccg aaaccgggtc tgctactgac 2880

gacgacccag ctgctgctgt cgctttcact gctcatcgct tgcgcttttt gcggctcgta 2940

ggggagacgg tggctagtca cggtgccacg gcgaccttgt gtttggccct gctgacaacg 3000

ccggagaagc tggagaagga gttggagctg gcagccaagg gtgtaccgcg aagcgccaag 3060

gccgggcgca actggatgtc gccatcgggc agcgcctttg cgccgacacc tgtgaccagc 3120

gaccgcgtcg cgttcatgta cggcgagggc cgcagcccct actacggcgt cgggctcgac 3180

ctgcaccgcc tgtggccggc tttgcacgag cgcatcaacg acaagaccgc ggcgctgtgg 3240

gagaacggcg actcgtggct catgccgcgc gcggtggatg ccgactcgca gcgcgccgtg 3300

cagacggcct ttgacgcgga ccagatcgag atgttccgca cgggcatctt cgtgtccatc 3360

tgcctcaccg actacgcgcg cgacgtgctc ggggtgcagc ccaaggcgtg cttcggcctc 3420

agcctcggcg agatctccat gctctttgcg ctgtcgcgac gcaactgcgg cctgtcggac 3480

cagctcacgc agcgcctacg cacctcgccg gtgtggtcga cacagctggc ggtggagttc 3540

caggccttgc gcaagctatg gaacgtgccg gcggacgccc ccgtggagtc cttctggcag 3600

ggctacttgg ttcgcgccag ccgcgccgaa atcgagaagg cgatcgggcc cgacaaccgc 3660

ttcgtgcgcc tgctgatcgt caacgactcg agcagcgcgc tgatcgccgg caaacctgcc 3720

gagtgtctgc gcgtgctgga gcgcctgggc gggcggttgc cgccgatgcc cgtcaagcaa 3780

ggcatgattg ggcactgccc cgaagtggcg ccctacacgc cgggcatcgc gcacatccac 3840

gagattttgg agattccgga cagccccgtc aagatgtaca cctcggtcac caacgccgag 3900

ctgcgcgggg gcagcaacag cagcatcacc gagttcgtgc agaagttgta cacgcgcatc 3960

gccgactttc cgggcatcgt cgacaaggtc agccgtgacg gccacgatgt cttcgtcgag 4020

gtggggccga acaacatgcg ctccgccgcg gtcagtgaca ttcttggcaa ggctgccacc 4080

ccgcatgtct ccgtggcgct ggaccgcccc agtgagtcgg cgtggacgca gaccctcaag 4140

tcgctggcgc tgctgaccgc ccaccgcgtg cccctgcaca acccgactct gtttgcggac 4200

ctgtaccacc ccacgttcct gacggctatc gactctgcga tgcaggagcc cccgcccaag 4260

cccaaccgct tccttcgcag cgtagaggtc aacgggtact tttgccccga cggcatcagc 4320

aagcaggttg ctgctgcaag tgccaaaccc tcgacgcatt gcatggttcg tttgcaccca 4380

gccaaggcag ttgtggttgc tgctgctggt gctgtggttg ctgattcgac gcccgtggtc 4440

aaggccaagc agacgtcgtc gtcgttgttg gttggggatg acgcctttct gcgctgctac 4500

gacgtggact ggccgctcta catgggcgcc atggcggaag gcatctcgtc ggtagacctg 4560

gtggtcgctg ccgccgaggc ccgcatgctg gcatcattcg gagcggcccg cttgcctatg 4620

gaccaggtgg aactccagat ccgtgagatc cagcaacgca cctccaacgc ctttgctgtc 4680

aacctgatgc cgggtcctga cgaggccgcg acggtggacg cgctgctgcg cacgggcgtc 4740

tcaatcgtcg aggcatcggg ctacaccggc gcgctctctg cagacctggt gcgctaccgt 4800

gtcacgggtc tgcgacgaac tagttgcggt gcttctgtgt cggcgactca ccgtgtggtc 4860

gccaaggtgt cgcgcaccga ggtggccgag cactttctgc gcccggcgcc ggccgccgta 4920

ctagaggctt tggtcgccgc caaacagatt acgcccgagc aggccgcgct ggccagccgc 4980

gtcgccatgg ccgacgacgt cgcggtggag gccgactcgg gcgggcacac cgacaaccga 5040

ccgatccacg tgctgctgcc gctcgtggtg gcgcagcgca accgctggcg ccacctggtg 5100

gacacgccag tgcgcgtcgg cgccggcggc gggatcgcct gtccgcgcgc cgcgctgctc 5160

gccttttccc tgggcgccgc ctttgtggtc accgggtccg tcaaccaact ggcccgcgag 5220

gctggcacca gcgacgcggt ccgactactg ctggcgacgg ccacctactc ggacgtggcc 5280

atggcgccgg gcggcgtcca ggtgctcaag aagcagacca tgttcgccgc gcgggccacg 5340

atgctcgccc agctgcaggc caagttcggc tcctttgacg ccgtgccgga gccgcagctg 5400

cgcaagctcg agcgctccgt gttcaagcag tccgtggcgg acgtgtgggc tgctgcacgc 5460

gaaaagtttg gtgtcgacgc taccgctgca agtccgcagg agaggatggc gctctgtgtg 5520

cgctggtaca tgtcgcagtc gtcgcgatgg gctaccgagg cgacgtccgc gcgcaaggcg 5580

gactaccaga tctggtgcgg ccccgccatc ggcagcttca acgacttcgt tcgcggcacc 5640

aagctggacg cgaccgctgg caccggcgag tttccgcgcg tcgtggacat caaccagcac 5700

atcctcctcg gagcctcgca ctaccgccgc gtgcagcaac aacaacagga cgacgacgta 5760

gaatacatca tcgtataa 5778

<210> 6

<211> 5778

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Растение с оптимизированным PFA2 синтаз PUFA

<400> 6

atgccgtgtg acaacattgc tgtggttgga atggcagttc agtatgctgg atgcaagaac 60

caggacgagt tctgggacac actgatgagg aaggagatca acagctcacc gatctcagcg 120

gagaggcttg ggacaagata cagagacctc cacttccatc ctcagaggag caagtatgca 180

gacaccttct gcaatgacag atatggttgt gttgatgctt ctgttgacaa tgagcatgac 240

ttgcttgctg accttgccag acgtgctttg cttgatgctg ggatcaactt ggatgacgcc 300

agcaccactg ccaaccttcg tgactttggg attgtgagtg gatgcctctc cttcccgatg 360

gacaatctgc aaggtgagct tttgaatctc tatcaagtcc acgttgagaa ccgtgtgggt 420

gcccagaggt tcagagattc aagaccctgg tcagaaagac caagagctgt gtcccctgaa 480

gccagtgacc cgagggtcta cagcgaccct gcttcctttg tggccaacca gcttggtctt 540

ggtcctgtca gatacagcct tgatgcagct tgtgcgagtg cgctgtactg cctcaagttg 600

gcttctgatc acttgctctc ccgttctgca gatgtcatgc tgtgtggtgc cacatgcttc 660

ccagacccgt ttttcattct ctctgggttc tccacattcc aagcgatgcc attgggtgga 720

ccagatgaca acccactctc tgtgccactc cgtcaaggca gccaaggact cacacctgga 780

gaaggtggag ccatcatggt tctgaagcgt ttggaagatg ctgtgaggga tggtgatagg 840

atctatggca ccttgcttgg gacaagtctc agcaatgctg gttgtggttt gccactttca 900

cctcacctgc cgtctgagaa aagctgcatg gaggatttgt acacgtcagt tggcatagat 960

ccatctgagg ttcagtatgt cgagtgtcat gccaccggaa ctccgcaagg agatgtggtt 1020

gaagttgagg ctctgagaca ttgcttcaga ggcaacactg accacccacc gaggatgggt 1080

tccaccaaag gaaactttgg tcacaccttg gttgcagctg ggtttgctgg aatggccaaa 1140

gtgttgcttt ccatgcagca tggcacgatc ccacccacgc ctggtgttga taggagcaac 1200

tgcatagatc cgctggtcgt tgatgaggcc ataccctggc cttacagctc agctcaagcg 1260

agagctggca aacctggaga tgaattgaag tgtgcttccc tctcagcctt tggatttggt 1320

ggaacaaatg ctcattgtgt gttcagagaa cacagacaga ttgctgccac tgcgacagcg 1380

tctccggtcc ttcctgaagt cacccctgga cccattgcaa tcattgggat ggatgcgacg 1440

tttggcaccc tcaaaggact tgatgcgttt gaacaagcga tctacaaagg cacggatgga 1500

gcatctgatc tgccatccaa gagatggagg ttccttggtg ctgacacaga tttcttgact 1560

gcaatgggtc tggatgcagt cccgagaggg tgctatgtga gggatgttga tgtggactac 1620

aaaagactca gaagtcccat gatccctgaa gatgtcctca gaccccaaca gcttctggca 1680

gttgccacga tggatagggc acttcaagat gctggcatgg ccacgggtgg aaaagttgct 1740

gtcctggtgg ggttgggcac tgacactgag ctttacagac accgtgcaag ggtgacactc 1800

aaggaaaggc ttgacccagc agctttctcc cctgaacaag ttcaagaaat gatggattac 1860

atcaatgatt gtggaacctc aaccagctac acttcttaca ttgggaatct tgtggccacc 1920

agagtttcct cacagtgggg attcactggt ccttctttca cggtcactga aggtgcaaac 1980

tcagtctatc gttgccttga gctgggaaag ttccttttgg acacccacca agtggatgca 2040

gttgtggttg ctggagttga tctctgtgca actgctgaga acctttacct caaggcaaga 2100

aggtctgcca taagcagaca agaccatcca cgtgccaact ttgaggcttc tgctgatgga 2160

tactttgctg gagagggcag tggtgctctg gtcttgaaga ggcaagctga tgttggctca 2220

gatgacaagg tctatgccag tgttgctggc ctcacatgtg cagcgcagcc tgctgaagca 2280

gtttctcctc ttctccttca agttcacaat gatgacaatg agaaaagggt tgtggagatg 2340

gtggaactcg cagctgactc tggtcgtcat gctccccact tggccaactc tcctttgagt 2400

gctgaatcac agcttgagca agtgtctaaa ctcttggctc atcaagtccc tggttcagtc 2460

gcgattggaa gtgttcgtgc caatgttgga gatgttggat atgcgagtgg tgcagcttct 2520

ctcataaaga ctgcgctttg cctccacaac cgttacttgc ctgcaaaccc acagtgggaa 2580

agacctgtgg ctccagtctc agaggctctt ttcacctgtc caaggtcccg tgcttggctc 2640

aagaaccctg gtgagtccag acttgctgca gtggccagtg cttctgagag tgggtcttgc 2700

tttggagtgc ttctcacaga tgagtatgcc acacatgagt ccagcaacag attgtcattg 2760

gatgacgctg cacccaaact catagcgatt cgtggagaca ctgttgatga catcatggca 2820

aaagtcaatg ctgaacttgc gttgctccgt gctcatgcag aaactgggtc tgccactgac 2880

gatgacccag ctgcagctgt tgctttcact gctcatcgtt tgaggttctt gaggcttgtt 2940

ggtgaaacag ttgccagtca cggtgccaca gcgaccttgt gtttggctct gctcacaact 3000

ccagaaaagc tggagaaaga attggagttg gcagccaagg gtgttccaag atcagccaag 3060

gctggcagaa actggatgtc accatctggt tctgcttttg caccaacacc tgtcaccagt 3120

gatcgtgttg cgttcatgta tggtgaaggg aggtctccct actatggtgt tgggttggac 3180

cttcacagac tctggcctgc tttgcatgag aggatcaatg acaagacagc tgcactttgg 3240

gagaatggag actcctggct catgcccaga gcggttgatg ctgactctca gagggctgtc 3300

cagacggctt ttgatgctga ccagatagag atgtttagga cgggaatctt tgtttccatt 3360

tgcctcacag actatgctcg tgatgtcctt ggagtccaac ccaaggcttg ctttggactc 3420

tcccttggag aaatctccat gctctttgca ctttcaagga gaaactgtgg actttctgac 3480

cagctcactc agaggctcag aacctctccg gtctggagca cacagcttgc tgtggagttc 3540

caagccttga ggaaactttg gaatgtccct gctgatgctc cagttgagtc cttctggcaa 3600

ggctacttgg ttcgtgccag cagagcagag attgaaaagg ccattggacc ggacaacaga 3660

tttgttcgtt tgctcattgt caacgactcc agcagtgccc tcattgctgg caaacctgct 3720

gagtgtctga gggtgcttga gcgtcttgga ggtcgtttgc cacccatgcc agtcaagcaa 3780

ggcatgattg ggcactgccc agaagtggct ccctatactc ctggaatagc tcacatccac 3840

gaaatcttgg agattcctga cagccctgtc aagatgtata cctcagtcac caatgctgag 3900

ctgagaggag gcagcaactc ttccatcaca gagttcgttc agaagttgta caccagaata 3960

gcggatttcc ctggcattgt tgacaaggtc agccgtgatg gccatgatgt tttcgtggaa 4020

gttggtccga ataacatgag gtcagcagct gtcagtgaca ttcttgggaa ggctgcaact 4080

cctcatgtca gtgtggctct tgatcgtcca agtgagtcag cttggacaca gacactcaaa 4140

tctcttgccc tgctcactgc ccacagagtg cctcttcaca acccgactct ctttgcggat 4200

ctttaccacc caaccttcct cacagccata gattctgcaa tgcaagaacc acctcccaag 4260

cccaacagat tcctgaggtc tgttgaagtc aatggttact tctgccctga tggcataagc 4320

aaacaagttg cagctgcaag tgccaaaccc agcacacatt gcatggttcg tctccatcca 4380

gccaaagctg ttgtggttgc agctgccgga gctgtggttg ctgattcaac accggttgtc 4440

aaagccaagc agacttcctc atctttgctt gttggagacg atgccttcct cagatgctat 4500

gatgtggatt ggcctctcta catgggagcg atggctgaag gaatctcctc tgttgacctt 4560

gtggttgcag ctgcagaagc taggatgctt gcatcatttg gagcagcgag gcttccgatg 4620

gatcaagttg aactccagat ccgtgagatc caacagagaa cctccaatgc ctttgctgtc 4680

aacctcatgc ctggtcctga tgaagctgca acggtggatg cccttctgag aacgggagtc 4740

agcattgtgg aggcgtctgg ttacacgggt gcgctctctg cggatctggt gagataccgt 4800

gtgaccggtc tcagaaggac ctcctgtggt gcttctgtgt cagcgactca ccgtgttgtg 4860

gccaaagttt caagaactga ggtggctgaa catttcctga gaccagcacc tgcagctgtt 4920

cttgaggctt tggtggcagc caaacaaatc actcctgagc aagctgcgct tgccagcaga 4980

gtcgcgatgg ctgacgatgt cgcggtggag gcagattctg gagggcacac tgacaaccgt 5040

ccaatccatg tgctccttcc tttggttgtg gctcagagga acagatggag gcatctggtt 5100

gacacgccag tgcgtgtggg agctggaggt gggatagcat gtccgagagc agcgttgctt 5160

gccttctcct tgggtgcagc ctttgtggtc actggaagtg tcaaccagct tgctcgtgaa 5220

gctgggacct ctgatgcagt cagactcctt ttggcgactg ccacctatag tgatgtggcg 5280

atggctcctg gtggagtcca agtgttgaag aaacaaacca tgttcgctgc gagagcaacg 5340

atgttggctc agctccaagc caagtttggt tcctttgatg ctgtgccaga accgcaactg 5400

agaaaactgg agagatcagt gttcaagcag agtgttgctg atgtttgggc agctgcaagg 5460

gaaaagtttg gggttgatgc cacggctgca agtccgcaag agaggatggc tctctgtgtc 5520

agatggtaca tgtctcaaag ctcacgttgg gcaacagagg ccacttcagc aaggaaagcg 5580

gactatcaga tttggtgtgg tcctgcaata ggcagcttca atgacttcgt cagaggcacc 5640

aaacttgatg ccacggctgg gactggtgag ttcccgagag ttgtggacat caaccagcac 5700

atcttgctgg gagcctctca ttacagaagg gttcaacagc aacagcaaga cgatgacgtt 5760

gagtacatca ttgtttga 5778

<210> 7

<211> 1435

<212> PRT

<213> Schizochytrium sp.

<400> 7

Met Thr Ser Ser Lys Lys Thr Pro Val Trp Glu Met Ser Lys Glu Glu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Gly Lys Thr Val Val Phe Asp Tyr Asn Glu Leu Leu Glu

20 25 30

Phe Ala Glu Gly Asp Val Gly Gln Val Phe Gly Pro Glu Phe Asp Ile

35 40 45

Ile Asp Lys Tyr Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg Glu Tyr Leu

50 55 60

Leu Val Ser Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn Asn Phe Arg

65 70 75 80

Val Gly Ser Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val Asn Gly Glu

85 90 95

Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val Glu Ser Gly

100 105 110

Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp Phe Gln Cys

115 120 125

Lys Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Ser Leu Thr Phe Phe

130 135 140

Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile Arg Val Thr

145 150 155 160

Gly Phe Ala Lys Gly Ala Gly Gly Glu Ile Ser Met Phe Phe Phe Glu

165 170 175

Tyr Asp Cys Phe Val Asp Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met Arg Asp Gly

180 185 190

Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asp Ala Glu Leu Ala Ala Gly Lys Gly Val

195 200 205

Leu Lys Thr Lys Ala Glu Leu Ala Ala Arg Ala Gln Ile Gln Lys Gln

210 215 220

Asp Ile Ala Pro Phe Ala Pro Ala Pro Cys Ser His Lys Thr Ser Leu

225 230 235 240

Asp Ala Arg Glu Met Arg Leu Leu Val Asp Arg Gln Trp Ala Arg Val

245 250 255

Phe Gly Ser Gly Met Ala Gly Ile Asp Tyr Lys Leu Cys Ala Arg Lys

260 265 270

Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Leu Asp Pro Arg Gly Gly Ala

275 280 285

His Gly Leu Gly Leu Leu Ile Gly Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp His

290 295 300

Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Arg Asp Glu Val Met Ala Gly Ser

305 310 315 320

Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys Val Tyr Met Leu Trp

325 330 335

Leu Gly Leu His Thr Thr Val Gly Ala Phe Asp Phe Arg Pro Val Ser

340 345 350

Gly His Ala Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln Ile Ser Pro His Lys

355 360 365

Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu Met Gly Phe Asp Ala

370 375 380

Lys Thr Gly Asp Pro Phe Ala Ile Ala Asp Val Asp Ile Ile Asp Val

385 390 395 400

Asn Phe Glu Glu Gly Gln Ala Phe Ala Gly Val Glu Asp Leu His Ser

405 410 415

Tyr Gly Gln Gly Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val Val Asp Phe Lys Gly

420 425 430

Ile Ala Leu Ser Leu Gln Lys Arg Lys Glu Gln Gln Lys Glu Ser Met

435 440 445

Thr Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Arg Val Ile Ala Pro Pro

450 455 460

Ser Gly Cys Leu Lys Gly Asp Pro Thr Ala Pro Thr Ser Val Thr Trp

465 470 475 480

His Pro Met Ala Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Pro Thr Pro Ser Phe

485 490 495

Ser Pro Ser Ala Tyr Pro Pro Arg Ala Val Cys Phe Ser Pro Phe Pro

500 505 510

Asn Asn Pro Leu Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Gln Met Pro Leu Thr

515 520 525

Trp Phe Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys Val Ser Asn Cys Leu

530 535 540

Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Ala Ser Lys Thr Ser Arg Ser Pro

545 550 555 560

Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Thr Ser Val Ala Asp Met

565 570 575

Glu His Gly Pro Phe Tyr Asn Val Asp Val Asn Pro Gly Gln Gly Thr

580 585 590

Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Phe Gly Ala

595 600 605

Ser Ser Arg Asp Asp His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu Ile Ala

610 615 620

Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr

625 630 635 640

Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asp Ala Glu

645 650 655

Leu Val Gly Asp Ala Met Pro Asp Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn

660 665 670

Phe Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Lys Met Gly Ile His

675 680 685

Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Ala Val Phe Tyr Lys Gly

690 695 700

Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Glu Ser Gln Thr

705 710 715 720

Gly Leu Asp Asn Gly Lys Pro Arg Leu Pro Trp Tyr Arg Glu Asn Asn

725 730 735

Val Ala Val Asp Thr Leu Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Gln

740 745 750

Gly Gln Leu Gln Leu Gln Arg Arg Gly Ser Gln Ala Gln Phe Leu Asp

755 760 765

Thr Ile His Leu Ala Gly Ser Gly Ala Gly Val His Gly Gln Gly Tyr

770 775 780

Ala His Gly Glu Lys Ala Val Asn Lys Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys

785 790 795 800

His Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser

805 810 815

Met Phe Gln Leu Val Glu Ala Trp Cys Val Lys Gln Gly Leu Ala Ala

820 825 830

Arg His Gly Ile Ala His Pro Val Phe Ala His Ala Pro Gly Ala Thr

835 840 845

Ser Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Asp Arg Met Asp

850 855 860

Ser Glu Val His Ile Lys Ser Val Ala Ala Phe Ser Ser Trp Val Asp

865 870 875 880

Val Val Ala Asp Gly Phe Leu Phe Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Ser

885 890 895

Ala Asp Asn Leu Arg Val Arg Ile Gln Thr Gly Ala Gly His Val Glu

900 905 910

Glu Gln Glu Val Ala Ala Lys Ala Thr Thr Lys Asn Ser Ser Ile Ala

915 920 925

Asp Val Asp Val Ala Asp Leu Gln Ala Leu Lys Gln Ala Leu Leu Thr

930 935 940

Leu Glu Arg Pro Leu Gln Leu Asp Ala Gly Ser Glu Val Pro Ala Cys

945 950 955 960

Ala Val Ser Asp Leu Gly Asp Arg Gly Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val

965 970 975

Val Ala Pro Leu Tyr Ser Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala

980 985 990

Asp Leu Val Ile Ala Met Gly Gln Arg Lys Met Leu Gly Ser Phe Gly

995 1000 1005

Ala Gly Gly Leu Pro Met His Val Val Arg Ala Gly Ile Glu Lys

1010 1015 1020

Ile Gln Ala Ala Leu Pro Ala Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile

1025 1030 1035

His Ser Pro Phe Asp Ala Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu

1040 1045 1050

Phe Leu Glu Lys Gly Val Arg Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met

1055 1060 1065

Glu Leu Thr Pro Gln Val Val Arg Tyr Arg Ala Thr Gly Leu Ser

1070 1075 1080

Arg Asp Ala Arg Gly Gly Ser Val Arg Thr Ala His Lys Ile Ile

1085 1090 1095

Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro

1100 1105 1110

Ala Pro Gln Ala Ile Leu Asp Lys Leu Val Ala Ser Gly Glu Ile

1115 1120 1125

Thr Pro Glu Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Val Pro Met Ala Asp

1130 1135 1140

Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg

1145 1150 1155

Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Leu Ser Leu Arg Asn Arg

1160 1165 1170

Leu Gln Arg Glu Leu Lys Tyr Pro Ala Arg His Arg Val Arg Val

1175 1180 1185

Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala Ala Leu Gly Ala

1190 1195 1200

Phe His Met Gly Ala Ala Phe Val Val Thr Gly Thr Val Asn Gln

1205 1210 1215

Leu Ser Arg Gln Ala Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Arg Gln Leu

1220 1225 1230

Ser Arg Ala Thr Tyr Ser Asp Ile Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp

1235 1240 1245

Met Phe Glu Gln Gly Val Glu Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr

1250 1255 1260

Met Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Phe Glu Leu Phe His Lys

1265 1270 1275

Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Asp Glu Leu Ala Arg Val

1280 1285 1290

Glu Lys Arg Ile Phe Ser Lys Ser Leu Ala Glu Val Trp Ala Glu

1295 1300 1305

Thr Lys Asp Phe Tyr Ile Thr Arg Leu Asn Asn Pro Glu Lys Ile

1310 1315 1320

Arg Lys Ala Glu Asn Glu Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys

1325 1330 1335

Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala Asn Asn Gly

1340 1345 1350

Ile Ala Asp Arg Thr Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala

1355 1360 1365

Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Ile Ala Asp Ser Tyr Leu Asp Val

1370 1375 1380

Ala Val Ser Gly Glu Phe Pro Asp Val Val Gln Ile Asn Leu Gln

1385 1390 1395

Ile Leu Ser Gly Ala Ala Tyr Leu Gln Arg Leu Leu Ser Val Lys

1400 1405 1410

Leu Ala Pro Arg Ile Asp Val Asp Thr Glu Asp Asp Leu Phe Thr

1415 1420 1425

Tyr Arg Pro Asp His Ala Leu

1430 1435

<210> 8

<211> 4308

<212> ДНК

<213> Schizochytrium sp.

<400> 8

atgacatcat cgaagaagac tcccgtgtgg gagatgagca aggaggagct gctggacggc 60

aagacggtgg tcttcgacta caacgagctg ctcgaattcg ccgagggcga cgtgggccaa 120

gtgttcggac ccgagttcga catcatcgac aagtaccggc gtcgcgtgcg gctgccggcg 180

cgcgagtacc tgctcgtgtc gcgcgtgacg ctgatggacg ccgaggtgaa caacttccgc 240

gtcgggtcgc gcatggtgac cgagtacgac gtgcccgtga acggggagct gtcggagggc 300

ggggacgtgc cgtgggcggt gctggtggag tcggggcagt gcgacctgat gctcatctcg 360

tacatgggca tcgacttcca gtgcaagggc gaccgcgtgt accgcctgct caacacatcg 420

ctcaccttct tcggggtggc gcacgagggc gagacgctgg tgtacgacat ccgcgtcacg 480

gggttcgcca agggcgcggg cggggagatc tcgatgttct tcttcgagta cgactgcttc 540

gtggacggcc gcctgctgat cgagatgcgc gacgggtgcg ccgggttctt cacggacgcc 600

gagctggccg ccggcaaggg cgtgcttaag accaaggcgg agctggcggc gcgcgcgcag 660

atccagaagc aggacatcgc gccctttgcg ccggcgccgt gctcgcacaa gacctcgctg 720

gacgcgcgcg agatgcggct gctcgtggac cgccagtggg cgcgcgtctt cggcagcggc 780

atggcgggca tcgactacaa gttgtgcgct cgcaagatgc tcatgatcga ccgcgtcacg 840

cacctcgacc cgcgcggcgg cgcgcacggc ctcgggctgc tgatcgggga gaaggtgctg 900

gagcgcgacc actggtactt cccctgccac tttgtgcgcg acgaggtgat ggccgggtcg 960

ctggtcagcg acggctgctc gcagctcctc aaggtgtaca tgctgtggct cggcctgcac 1020

acgaccgtgg gcgcgttcga ctttcgtccc gtgagcgggc acgccaacaa ggtgcggtgc 1080

cgcgggcaga tctcaccgca caagggcaag ctcgtgtacg tgatggagat caaggaaatg 1140

ggctttgacg cgaagacggg cgatccgttt gcgatcgcgg acgtggacat catcgacgtc 1200

aacttcgagg agggacaggc gtttgcggga gtggaagacc tgcacagcta cggccagggc 1260

gacctccgca agaagatcgt cgtcgacttc aagggcatcg cgctctccct gcagaagcgg 1320

aaggagcagc agaaggaaag catgaccgtg actacgacga cgacgacgac gagccgggtg 1380

attgcgccgc ccagcgggtg cctcaagggc gacccgacgg cgccgacgag cgtgacgtgg 1440

cacccgatgg cggagggcaa cggcgggccc ggaccgacgc cgtcgttctc gccgtccgcg 1500

tacccgccgc gggcggtgtg cttctcgccg ttccccaaca acccgcttga caacgaccac 1560

acgccgggcc agatgccgtt gacctggttc aacatgtccg aattcatgtg cggcaaagtg 1620

tccaactgcc tgggccccga gtttgcgcgc ttcgacgcga gcaagacgag ccgcagcccg 1680

gcctttgacc tggcgctcgt gacgcgggtg acgagcgtgg cggacatgga gcacgggccg 1740

ttctacaacg tggacgtcaa cccgggccag ggcacgatgg tgggcgagtt cgactgtccc 1800

gcggacgcgt ggttcttcgg cgcctcgagc cgcgacgacc acatgccgta ctcgatcctg 1860

atggagatcg cgctgcagac gtcgggcgtc ctcacctcgg tgctcaaggc gccgctgacg 1920

atggacaagg acgacatcct cttccgcaac ctcgacgcag acgccgagct cgtgggcgac 1980

gccatgccgg acgtgcgcgg caagacgatc cgcaacttca ccaagtgcac aggctacagc 2040

atgctcggca agatgggcat ccaccgcttc acctttgagc tcagcgtcga cggcgccgtc 2100

ttctacaagg gcagcacctc gtttggctgg ttcgtccccg aggtcttcga gtcgcagacc 2160

ggtctcgaca acggcaagcc gcgcctgcct tggtaccgcg agaacaacgt cgccgtcgac 2220

acgctctccg cgcccgcctc cgcttcctcc gcgcaaggtc agctgcagct gcagcgacgc 2280

gggtcgcagg cgcagttcct ggacacaatc cacctggcgg gcagcggcgc cggcgtgcac 2340

ggccagggct acgcgcacgg ggagaaggcc gtgaacaagc aagattggtt cttctcgtgc 2400

cacttctggt tcgaccccgt gatgcccggg tccctgggca tcgagtcgat gttccagctc 2460

gtcgaggcgt ggtgcgtgaa gcagggactc gcggcgcggc acggcatcgc tcacccagtg 2520

ttcgcgcacg cgcccggggc cacgagctgg aagtaccgcg ggcagctaac ccccaagaac 2580

gaccgcatgg acagcgaggt gcacatcaag tcggtggcgg ccttctcctc ctgggtcgac 2640

gtcgtcgcgg acgggttcct cttcgtcgac ggcctccgcg tctactcggc agacaacctc 2700

cgcgtccgca tccagaccgg cgccggccac gttgaagagc aagaggttgc tgccaaggcc 2760

acaaccaaga acagcagtat tgctgatgtg gacgtggcgg acctgcaagc gctcaagcag 2820

gcgttgctga cgctggagcg accgctgcag ctggacgcgg ggagcgaggt gcccgcctgc 2880

gcggtgagcg acctgggcga taggggcttc atggagacgt acggggtggt ggcgccgctg 2940

tacagcgggg cgatggccaa gggcatcgcg tcggcggacc tggtgatcgc gatgggccag 3000

cgcaagatgc tggggtcgtt tggcgcgggc gggctcccga tgcacgtcgt gcgcgcgggg 3060

attgagaaga tccaggcagc gctgccagcg gggccatacg cggtcaacct gattcactcg 3120

ccttttgacg ccaacctgga gaagggcaac gtggacctct tcctggagaa gggcgtgcgc 3180

gtcgtggagg cgtcggcctt catggagctc acgccccagg tggtgcgcta ccgcgcgacg 3240

ggcctctctc gcgacgcgcg cggcggctcc gtgcgcacgg cccacaagat catcggcaag 3300

gtcagccgca ccgagctggc cgagatgttt atccggcccg cgccgcaagc cattctcgac 3360

aagcttgtgg cgtccggcga gatcaccccc gagcaggcgg cgctggcgct cgaggtgccc 3420

atggcggacg acatcgccgt cgaggccgat tcgggcgggc acaccgacaa ccgccccatc 3480

cacgtcatcc tgcccctcat cctcagcctg cgcaaccgcc tccagcgcga gctcaagtac 3540

cctgcgcgac accgcgtgcg cgtcggcgcc gggggcggca tcgggtgccc gcaagcggct 3600

ctgggcgcct tccacatggg cgccgcgttt gtggtgacgg gcacggtcaa ccagctgagc 3660

cggcaggccg ggacatgcga caatgtgcgg cggcagctgt cgcgcgcgac gtactcggac 3720

atcacgatgg cgccggcggc ggacatgttc gagcagggcg tcgagctgca ggtgctcaag 3780

aagggcacga tgtttccctc gcgcgccaag aagctgttcg agctgtttca caagtacgac 3840

tcgttcgagg cgatgccggc ggacgagctg gcgcgcgtcg agaagcgcat cttcagcaag 3900

tcactcgccg aggtgtgggc cgagaccaag gacttctaca tcacgcggct caacaacccg 3960

gagaagatcc gcaaggcgga gaacgaggac cccaagctca agatgtcact ctgcttccgc 4020

tggtacctcg ggctcagctc gttctgggcc aacaacggca tcgcggaccg cacgatggac 4080

taccagatct ggtgcggccc tgccatcggc gccttcaacg acttcatcgc cgactcgtac 4140

ctcgacgtgg ccgtctcggg cgagttcccc gacgtcgtgc agatcaacct gcagatcctg 4200

tcgggcgcag cctacctcca gcgcctcctc tccgtcaagc tcgcaccgcg gatcgacgtc 4260

gacaccgagg acgacctctt cacctaccgc cccgaccacg cactctaa 4308

<210> 9

<211> 4308

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Растение с оптимизированным PFA3 синтаз PUFA

<400> 9

atgacatctt caaagaaaac tcctgtttgg gaaatgagca aggaagagct gttggatggc 60

aagacggttg tctttgacta caacgagctg ttggagtttg cggagggtga tgttggtcaa 120

gtgtttggac cagagtttga catcattgac aagtacagaa ggcgtgtgag gcttccagcc 180

agagaatact tgcttgtttc aagagtgact ctcatggatg ccgaggtgaa taacttcaga 240

gttggctcca gaatggtcac tgagtatgat gttccagtca atggtgagtt gtcagaggga 300

ggtgatgttc cctgggcagt tcttgttgaa agtgggcagt gtgacttgat gctcatctcc 360

tacatgggga ttgacttcca gtgcaaaggg gaccgtgttt acagattgct caacacatct 420

ctcaccttct ttggggttgc ccatgaagga gaaacccttg tgtatgacat cagagtcact 480

ggtttcgcca agggtgctgg tggggaaatc tcaatgttct ttttcgagta tgactgcttt 540

gttgatggca gattgctcat agagatgaga gatggttgtg ctggcttctt tactgatgcc 600

gaacttgccg ctggaaaagg tgtgctcaaa acgaaggctg agcttgctgc acgtgctcag 660

atccagaaac aagacattgc accctttgca cctgcaccgt gcagtcacaa aaccagcttg 720

gatgccagag aaatgagact gcttgttgat aggcaatggg caagggtctt tggttctgga 780

atggctggca tagactacaa gttgtgtgcg agaaagatgc tgatgattga cagagtcaca 840

caccttgatc cgcgtggagg tgctcacggt cttgggcttc tcattgggga gaaagtgctt 900

gagagggacc actggtactt cccctgccac tttgtgaggg atgaggtcat ggctggttct 960

cttgtctcag atggatgctc tcagcttctc aaggtttaca tgttgtggct tggccttcac 1020

accactgttg gtgcgttcga ctttcgtcca gtcagtggtc atgccaacaa agtgaggtgt 1080

cgtggacaga tttcaccgca caaggggaaa cttgtttatg tcatggagat caaagaaatg 1140

ggctttgatg ccaaaactgg agatccattt gccatagctg atgttgacat cattgatgtc 1200

aactttgaag agggacaagc gtttgctgga gttgaggatc ttcacagcta tggccaagga 1260

gatttgagga aaaagatagt tgtggatttc aagggaattg cgttgtcact gcagaaaagg 1320

aaggagcaac agaaagagag catgactgtc accactacga ccacgacaac cagcagagtg 1380

attgctcctc caagtggatg cctcaaaggt gatcccactg ctcccacctc tgtcacgtgg 1440

catccaatgg ctgagggaaa tggaggtcct ggacccactc cgtccttctc tccttcagcg 1500

tatcctccca gagctgtttg cttctctcct ttccccaaca atccgcttga caatgatcat 1560

acacctggcc aaatgccgtt gacctggttc aacatgtctg agttcatgtg tggaaaagtg 1620

agcaactgct tgggtcctga gtttgccaga tttgatgctt ccaagacatc cagatcacca 1680

gcttttgacc tggctcttgt gacaagggtg acgagtgtgg ctgacatgga acatggtcct 1740

ttctacaatg tggatgtcaa ccctggccaa ggcacgatgg tgggtgagtt tgattgtcct 1800

gcagatgctt ggttctttgg agcctcaagc agagacgatc acatgccgta cagcatcttg 1860

atggagattg ctcttcagac ttctggagtc ctcacatctg tgctcaaagc tccgctcaca 1920

atggacaaag atgacatcct tttcagaaac cttgatgcag atgcagaact tgtgggtgat 1980

gccatgcctg atgtcagagg gaaaaccata aggaacttca ccaaatgcac gggatactcc 2040

atgcttggca agatgggaat ccatcgtttc accttcgaac tctctgttga cggagcagtt 2100

ttctacaaag ggagcacctc ttttggttgg tttgttcctg aggtctttga gagccagact 2160

ggattggaca atggcaagcc gaggttgcct tggtataggg aaaacaatgt ggcagtggac 2220

acactctcag cacctgcgtc agcttctagt gcccaaggtc agcttcagct tcagaggaga 2280

gggtcacaag cgcagttcct ggacacaatt catcttgctg ggagtggagc tggagtgcat 2340

ggccaaggtt atgctcatgg ggagaaagct gtgaacaagc aagattggtt cttttcttgc 2400

catttctggt ttgacccagt gatgcctggg tctttgggaa ttgagtccat gttccagctt 2460

gtggaagcgt ggtgtgtcaa acaaggcttg gctgcaaggc atggaattgc tcatccagtc 2520

tttgcacatg cacctggtgc caccagctgg aagtacagag gtcagttgac cccaaagaat 2580

gacagaatgg acagtgaagt tcacatcaag agtgttgctg ccttctcctc atgggttgat 2640

gtggttgctg atgggttcct cttcgttgat ggcctcagag tctattcagc agacaacctg 2700

agggtcagaa tccagactgg agctggccat gttgaagagc aagaagttgc tgccaaagcc 2760

accacaaaga actccagcat tgctgatgtg gatgtggctg atcttcaagc tctcaaacaa 2820

gcgttgctga cactggagag accattgcag ttggatgctg gaagtgaggt gccagcctgt 2880

gctgtcagcg atttgggaga ccgtggattc atggagactt atggggtggt tgctccgttg 2940

tacagtggtg cgatggccaa gggaatagcc tctgcggatc tggtcatagc aatgggtcag 3000

aggaagatgt tggggagctt tggagctggt gggttgccaa tgcacgttgt ccgtgctggg 3060

attgaaaaga tccaagctgc acttcccgct ggtccgtatg ctgtcaacct catccactca 3120

ccgttcgatg ccaacctgga aaagggcaat gttgatcttt tcctggaaaa gggagttcgt 3180

gtggttgagg cgtctgcctt catggaactc acaccacaag tggtccgtta cagagccacg 3240

ggactctcca gagatgcgag aggtggctca gtgaggacag cacacaagat cataggaaag 3300

gtttccagaa cagagcttgc ggagatgttc atcagacctg cacctcaagc aattctggac 3360

aaacttgttg cgtctggtga aatcacccct gagcaagctg cgttggctct tgaagttcca 3420

atggctgatg acattgcagt tgaggctgac agtggagggc acactgacaa ccgtcccatt 3480

catgtcattc tgccgttgat cctcagtctg aggaataggc tccagaggga actcaagtac 3540

cctgccagac accgtgttag ggttggtgct ggtggaggca taggttgtcc tcaagctgca 3600

cttggagcct tccacatggg agctgcgttt gttgtgactg gcactgtcaa ccagctgtcc 3660

cgtcaagctg gaacatgtga caacgtgagg cgtcagctct ctcgtgccac ttactctgac 3720

atcacgatgg caccagctgc agacatgttt gaacaaggag ttgaactgca agttctcaag 3780

aaaggaacga tgttcccatc tcgtgccaag aaactctttg aactgttcca caagtatgat 3840

tcctttgaag caatgcctgc ggatgaattg gctcgtgttg agaagaggat cttctccaag 3900

tcccttgcag aagtttgggc agagaccaaa gatttctaca tcactcgtct caacaatcct 3960

gaaaagatca gaaaggctga gaatgaggac cccaagctca agatgtccct ctgcttccgt 4020

tggtacttgg gtctcagctc attctgggca aacaatggca tagctgaccg tacgatggat 4080

taccagattt ggtgtggacc tgccatagga gccttcaacg atttcattgc agacagctat 4140

cttgatgttg cagtctctgg tgagttccct gatgttgtgc agatcaacct tcaaatcctg 4200

tctggtgctg cgtatctcca gagattgctc agtgtcaaac ttgcaccaag gatagatgtg 4260

gacactgaag atgacctctt cacctacaga ccagatcatg cactctga 4308

<210> 10

<211> 714

<212> ДНК

<213> Nostoc sp.

<400> 10

atgcttcagc acacttggct tccgaagcct cccaatctga ccctcttgtc agatgaggtt 60

catctctgga ggattcctct tgaccagcct gagtcacaac ttcaagacct tgctgccacc 120

ctgagcagtg atgaattggc gagggcaaac agattctact ttccagaaca cagaaggcgt 180

ttcactgctg ggagaggcat cctcagatcc atcttgggtg gatacttggg agtggaaccg 240

ggtcaagtca agtttgatta tgagtcccgt gggaaaccga tccttggtga cagatttgct 300

gagagtggac tcctgttcaa cttgtctcac agccagaacc ttgccttgtg tgctgtcaac 360

tacacgcgtc aaataggcat tgatcttgaa tatctgcgtc caacatctga cttggagtct 420

cttgcaaaga ggttctttct cccaagagaa tatgaactct tgaggtcact ccctgatgag 480

cagaaacaga agattttctt tcgttactgg acttgcaaag aggcttatct caaagcaacg 540

ggagatggaa tagccaaact tgaagagatc gagatagcac tcaccccaac agaacctgcc 600

aagctccaaa cagctcctgc gtggtctctg ttggagcttg tgccagatga caattgtgtt 660

gcagctgtgg ctgttgcggg ttttggttgg cagcccaagt tctggcatta ctga 714

<210> 11

<211> 2346

<212> ДНК

<213> Schizochytrium sp.

<400> 11

atggctccca ctcccgacgc caccgcgcct ctgaacaagc cgagcgacta tgccgtctac 60

cacgaggaag acggcccctt ctggaccgcc gattccagcg gcgtctcgcg cgtgaacttt 120

agcgagaccg gcgtgggatc cgagggcgtc atccctgcgc tcacgctcat cgacgtcttc 180

gagagggccg tcaagcgcgg cggaaacagg atcgccttcc gcacggaaaa catgcccacg 240

ctccgccgcg gcgaagaggc cccggacgcg ctgccgctca aggactggaa gtcctggtcc 300

tggaaacagt acaaggccga cgtccaccgc atcgccaggg ctctcatgga cctcggcgtt 360

gagcagcatg acgccgtctc catttttggc tttaactcgc ccgaatggtt tctcagtgcc 420

gtcggcgccg tgcacgcagg tgccaagatt gccggcattt acccctcaga cacgcccgcc 480

caggtccagt acaaggcctt ccacagtgac accgctgttg ccgttgtcga aaacgagcag 540

tgcttcaaga agttcgccga ggtcgtcgag gaccttcctt acctcaaggc cattgtttgc 600

tgggactatg aagccacaga catcacgcgc gaggacggct ccgtcgtcga ggtcctcacc 660

tttgccgagt tcctcaagcg cggcgacacc gtcgaggcgg ccgcccttga cgagcgcatc 720

tccaagatcg agcccaccat gtgcgctgcc cttatttaca ccagcggtac taccggccgc 780

cccaaggccg ttatgatttc gcacgacaac cttgttttcg aggccagcgc cgtcgtcccc 840

aacctcggag gagcctgtac gaccactgct gaggagcgca ttctctcgta cctgcctctc 900

tcgcacgtcg ctggtatgat ggttgatatt attgccccca tcattgccac cgccttccac 960

aagggccgca tctgcgtctg ctttgctcgc ccgtacgatt tgcgcaccgg cacgctgggc 1020

cagcgcctca acgccgtgga gcccaccatc ttccttggcg tgccccgtgt gtgggaaaag 1080

attcaggaaa agctcatggc cgtcggtgcc aaaaccaccg gcctcaagaa gaagctctct 1140

acggccgcca agaagcgtgg tcttgaattc caggaggagc agcaaatcgg ccgctccggt 1200

gccaaccctg gctttggccc ccttggcatc tacaagaagc tcctcggcct catcaagggc 1260

aagctgggcc tcaccaagtg caagtttgcc tttgctggtg ccgcgcccat gacccgtgag 1320

acccttcagt actttggcgc gctgaacatc aacattaacg aggtctacgg catgtccgag 1380

tgctccggtg ccgccacctg gtccacggac aaggcccacg agtggggcac tgttggctac 1440

gagatgccca gttgcgaggt ccgcgtcttc aagattgccg aggacggtac caagaccgag 1500

tgcccgcgcg ccgccgacat tatgcatgct accgaggagg agcagggcga agtttgcttc 1560

cgcggccgta acatcatgat gggctacctt gccaacccca agcttggcga cgaccacgtt 1620

gccgagatcg aggagaagaa cgctgccgct atcgactccg agggctggct ccacagtggt 1680

gataagggcg ccatttctac ccgcggcatg ctcaagatca cgggccgcta caaggagctc 1740

atcatcggcg ccggtggcga gaacgtggcg cccgtcccta ttgaggacgc catcaaggcg 1800

cgcatgcctt ttgtttccaa cgccatgatg gtcggagata agcgcaagtt catggctgtc 1860

ctccttaccc tcaagacggt tggcgccacg ggcgagcttc ccggtacgaa caagctcatg 1920

ggcgctgccg ccgactatgg tgagaccatc gaggacgcct gcgacaacga ggcgctcatt 1980

gaggagatca cgcagcagct caaggagatc ggtgatgatg gcgatgtcac gccctcgaac 2040

gcggctcgca tccaaaagtt caccattctc ccgctcgact tttccgtctc cacggacgag 2100

ctcacggcca cgctcaagct caagcgctcc gtggtcgcag acaagtacga agacatcatc 2160

gaggcctttt acgagtccaa gagcgttttt gtgccgtact cgaccgttgg cgcctacgcc 2220

acgggcggcc cggtcgacga ctccgttgtc gatggctcct tcaagggcga ctttagcatg 2280

attggcgacg atgatccgga tcttcaaaac gtcgatgtcc tcgaggcgat tgacgaggac 2340

aattaa 2346

<210> 12

<211> 996

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная спейсерная последовательность

<400> 12

gttatcgaac aagacatcta taagccctaa gccaatgtcc ccgattcctg gaatcatctc 60

gtcatgtccc ccgcttgcac tttagctgag catgtagaaa gtacgtacgc gacttcatcc 120

ttacttgatg atcgccccaa gtatcctagt taagaacctc atatcctctg caaagtgtga 180

ttctacgctt gggttatcga ccaccctgaa gagcgttatc gcactttttt caacagaagt 240

acgccaattc tcaatggcac gcactctgaa cggctcactg gggtcagttt gtatggccct 300

tgagcacgct cgtaagcgcg ggaagcggct actcccccag attacgaagc aagcgtaacg 360

gggatattga tcatggtgac tatctgatgt ttagattcaa tagcccccat agttttcaaa 420

tgcgtacttt tagtcacccc tgggaatctc gcctgggacc tggtgatgta aaggtttcgc 480

actttcgttt ctgtgttgtc cctatctacg atgaagtaat acgtagtggc acgcgtgatt 540

tgtaaagtga aaactcacta agggttccaa catgtgagtt aataaacctc ttcacgaccc 600

tacgttgaca tccaaaacta caatatctta catcatacaa cgctgatcta ttacgtttca 660

cgagacggag gttgtgaggg aatcgtaact ggtgtcactc gctgtggctc atgtcgattc 720

attttgctaa taaaccacgt aatgagtatt ggctgatcac aaagctgagt gtactaccaa 780

atcagagatc aacttgcata gcaattttcg acgatttgca agttgccgac ccgtgtactc 840

gtaatgctag cttccaaagt gacacttatc tacgaacaag tcaatatctg agggagaatg 900

gttattgact cgtaaattag aaaagtcatc gcaagttaaa agtcaacggc ccaagagatc 960

gcgatgccgt gcctaatcca aggctgtaga gtagtc 996

<210> 13

<211> 4275

<212> ДНК

<213> Schizochytrium sp.

<400> 13

atgagcaagg aggagctgct ggacggcaag acggtggtct tcgactacaa cgagctgctc 60

gaattcgccg agggcgacgt gggccaagtg ttcggacccg agttcgacat catcgacaag 120

taccggcgtc gcgtgcggct gccggcgcgc gagtacctgc tcgtgtcgcg cgtgacgctg 180

atggacgccg aggtgaacaa cttccgcgtc gggtcgcgca tggtgaccga gtacgacgtg 240

cccgtgaacg gggagctgtc ggagggcggg gacgtgccgt gggcggtgct ggtggagtcg 300

gggcagtgcg acctgatgct catctcgtac atgggcatcg acttccagtg caagggcgac 360

cgcgtgtacc gcctgctcaa cacatcgctc accttcttcg gggtggcgca cgagggcgag 420

acgctggtgt acgacatccg cgtcacgggg ttcgccaagg gcgcgggcgg ggagatctcg 480

atgttcttct tcgagtacga ctgcttcgtg gacggccgcc tgctgatcga gatgcgcgac 540

gggtgcgccg ggttcttcac ggacgccgag ctggccgccg gcaagggcgt gcttaagacc 600

aaggcggagc tggcggcgcg cgcgcagatc cagaagcagg acatcgcgcc ctttgcgccg 660

gcgccgtgct cgcacaagac ctcgctggac gcgcgcgaga tgcggctgct cgtggaccgc 720

cagtgggcgc gcgtcttcgg cagcggcatg gcgggcatcg actacaagtt gtgcgctcgc 780

aagatgctca tgatcgaccg cgtcacgcac ctcgacccgc gcggcggcgc gcacggcctc 840

gggctgctga tcggggagaa ggtgctggag cgcgaccact ggtacttccc ctgccacttt 900

gtgcgcgacg aggtgatggc cgggtcgctg gtcagcgacg gctgctcgca gctcctcaag 960

gtgtacatgc tgtggctcgg cctgcacacg accgtgggcg cgttcgactt tcgtcccgtg 1020

agcgggcacg ccaacaaggt gcggtgccgc gggcagatct caccgcacaa gggcaagctc 1080

gtgtacgtga tggagatcaa ggaaatgggc tttgacgcga agacgggcga tccgtttgcg 1140

atcgcggacg tggacatcat cgacgtcaac ttcgaggagg gacaggcgtt tgcgggagtg 1200

gaagacctgc acagctacgg ccagggcgac ctccgcaaga agatcgtcgt cgacttcaag 1260

ggcatcgcgc tctccctgca gaagcggaag gagcagcaga aggaaagcat gaccgtgact 1320

acgacgacga cgacgacgag ccgggtgatt gcgccgccca gcgggtgcct caagggcgac 1380

ccgacggcgc cgacgagcgt gacgtggcac ccgatggcgg agggcaacgg cgggcccgga 1440

ccgacgccgt cgttctcgcc gtccgcgtac ccgccgcggg cggtgtgctt ctcgccgttc 1500

cccaacaacc cgcttgacaa cgaccacacg ccgggccaga tgccgttgac ctggttcaac 1560

atgtccgaat tcatgtgcgg caaagtgtcc aactgcctgg gccccgagtt tgcgcgcttc 1620

gacgcgagca agacgagccg cagcccggcc tttgacctgg cgctcgtgac gcgggtgacg 1680

agcgtggcgg acatggagca cgggccgttc tacaacgtgg acgtcaaccc gggccagggc 1740

acgatggtgg gcgagttcga ctgtcccgcg gacgcgtggt tcttcggcgc ctcgagccgc 1800

gacgaccaca tgccgtactc gatcctgatg gagatcgcgc tgcagacgtc gggcgtcctc 1860

acctcggtgc tcaaggcgcc gctgacgatg gacaaggacg acatcctctt ccgcaacctc 1920

gacgcagacg ccgagctcgt gggcgacgcc atgccggacg tgcgcggcaa gacgatccgc 1980

aacttcacca agtgcacagg ctacagcatg ctcggcaaga tgggcatcca ccgcttcacc 2040

tttgagctca gcgtcgacgg cgccgtcttc tacaagggca gcacctcgtt tggctggttc 2100

gtccccgagg tcttcgagtc gcagaccggt ctcgacaacg gcaagccgcg cctgccttgg 2160

taccgcgaga acaacgtcgc cgtcgacacg ctctccgcgc ccgcctccgc ttcctccgcg 2220

caaggtcagc tgcagctgca gcgacgcggg tcgcaggcgc agttcctgga cacaatccac 2280

ctggcgggca gcggcgccgg cgtgcacggc cagggctacg cgcacgggga gaaggccgtg 2340

aacaagcaag attggttctt ctcgtgccac ttctggttcg accccgtgat gcccgggtcc 2400

ctgggcatcg agtcgatgtt ccagctcgtc gaggcgtggt gcgtgaagca gggactcgcg 2460

gcgcggcacg gcatcgctca cccagtgttc gcgcacgcgc ccggggccac gagctggaag 2520

taccgcgggc agctaacccc caagaacgac cgcatggaca gcgaggtgca catcaagtcg 2580

gtggcggcct tctcctcctg ggtcgacgtc gtcgcggacg ggttcctctt cgtcgacggc 2640

ctccgcgtct actcggcaga caacctccgc gtccgcatcc agaccggcgc cggccacgtt 2700

gaagagcaag aggttgctgc caaggccaca accaagaaca gcagtattgc tgatgtggac 2760

gtggcggacc tgcaagcgct caagcaggcg ttgctgacgc tggagcgacc gctgcagctg 2820

gacgcgggga gcgaggtgcc cgcctgcgcg gtgagcgacc tgggcgatag gggcttcatg 2880

gagacgtacg gggtggtggc gccgctgtac agcggggcga tggccaaggg catcgcgtcg 2940

gcggacctgg tgatcgcgat gggccagcgc aagatgctgg ggtcgtttgg cgcgggcggg 3000

ctcccgatgc acgtcgtgcg cgcggggatt gagaagatcc aggcagcgct gccagcgggg 3060

ccatacgcgg tcaacctgat tcactcgcct tttgacgcca acctggagaa gggcaacgtg 3120

gacctcttcc tggagaaggg cgtgcgcgtc gtggaggcgt cggccttcat ggagctcacg 3180

ccccaggtgg tgcgctaccg cgcgacgggc ctctctcgcg acgcgcgcgg cggctccgtg 3240

cgcacggccc acaagatcat cggcaaggtc agccgcaccg agctggccga gatgtttatc 3300

cggcccgcgc cgcaagccat tctcgacaag cttgtggcgt ccggcgagat cacccccgag 3360

caggcggcgc tggcgctcga ggtgcccatg gcggacgaca tcgccgtcga ggccgattcg 3420

ggcgggcaca ccgacaaccg ccccatccac gtcatcctgc ccctcatcct cagcctgcgc 3480

aaccgcctcc agcgcgagct caagtaccct gcgcgacacc gcgtgcgcgt cggcgccggg 3540

ggcggcatcg ggtgcccgca agcggctctg ggcgccttcc acatgggcgc cgcgtttgtg 3600

gtgacgggca cggtcaacca gctgagccgg caggccggga catgcgacaa tgtgcggcgg 3660

cagctgtcgc gcgcgacgta ctcggacatc acgatggcgc cggcggcgga catgttcgag 3720

cagggcgtcg agctgcaggt gctcaagaag ggcacgatgt ttccctcgcg cgccaagaag 3780

ctgttcgagc tgtttcacaa gtacgactcg ttcgaggcga tgccggcgga cgagctggcg 3840

cgcgtcgaga agcgcatctt cagcaagtca ctcgccgagg tgtgggccga gaccaaggac 3900

ttctacatca cgcggctcaa caacccggag aagatccgca aggcggagaa cgaggacccc 3960

aagctcaaga tgtcactctg cttccgctgg tacctcgggc tcagctcgtt ctgggccaac 4020

aacggcatcg cggaccgcac gatggactac cagatctggt gcggccctgc catcggcgcc 4080

ttcaacgact tcatcgccga ctcgtacctc gacgtggccg tctcgggcga gttccccgac 4140

gtcgtgcaga tcaacctgca gatcctgtcg ggcgcagcct acctccagcg cctcctctcc 4200

gtcaagctcg caccgcggat cgacgtcgac accgaggacg acctcttcac ctaccgcccc 4260

gaccacgcac tctaa 4275

<210> 14

<211> 1424

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Усеченный PFA3

<400> 14

Met Ser Lys Glu Glu Leu Leu Asp Gly Lys Thr Val Val Phe Asp Tyr

1 5 10 15

Asn Glu Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Val Gly Gln Val Phe Gly

20 25 30

Pro Glu Phe Asp Ile Ile Asp Lys Tyr Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro

35 40 45

Ala Arg Glu Tyr Leu Leu Val Ser Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu

50 55 60

Val Asn Asn Phe Arg Val Gly Ser Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val

65 70 75 80

Pro Val Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val

85 90 95

Leu Val Glu Ser Gly Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly

100 105 110

Ile Asp Phe Gln Cys Lys Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr

115 120 125

Ser Leu Thr Phe Phe Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr

130 135 140

Asp Ile Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Gly Ala Gly Gly Glu Ile Ser

145 150 155 160

Met Phe Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Phe Val Asp Gly Arg Leu Leu Ile

165 170 175

Glu Met Arg Asp Gly Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asp Ala Glu Leu Ala

180 185 190

Ala Gly Lys Gly Val Leu Lys Thr Lys Ala Glu Leu Ala Ala Arg Ala

195 200 205

Gln Ile Gln Lys Gln Asp Ile Ala Pro Phe Ala Pro Ala Pro Cys Ser

210 215 220

His Lys Thr Ser Leu Asp Ala Arg Glu Met Arg Leu Leu Val Asp Arg

225 230 235 240

Gln Trp Ala Arg Val Phe Gly Ser Gly Met Ala Gly Ile Asp Tyr Lys

245 250 255

Leu Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Leu Asp

260 265 270

Pro Arg Gly Gly Ala His Gly Leu Gly Leu Leu Ile Gly Glu Lys Val

275 280 285

Leu Glu Arg Asp His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Arg Asp Glu

290 295 300

Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys

305 310 315 320

Val Tyr Met Leu Trp Leu Gly Leu His Thr Thr Val Gly Ala Phe Asp

325 330 335

Phe Arg Pro Val Ser Gly His Ala Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln

340 345 350

Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu

355 360 365

Met Gly Phe Asp Ala Lys Thr Gly Asp Pro Phe Ala Ile Ala Asp Val

370 375 380

Asp Ile Ile Asp Val Asn Phe Glu Glu Gly Gln Ala Phe Ala Gly Val

385 390 395 400

Glu Asp Leu His Ser Tyr Gly Gln Gly Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val

405 410 415

Val Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Ser Leu Gln Lys Arg Lys Glu Gln

420 425 430

Gln Lys Glu Ser Met Thr Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Arg

435 440 445

Val Ile Ala Pro Pro Ser Gly Cys Leu Lys Gly Asp Pro Thr Ala Pro

450 455 460

Thr Ser Val Thr Trp His Pro Met Ala Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly

465 470 475 480

Pro Thr Pro Ser Phe Ser Pro Ser Ala Tyr Pro Pro Arg Ala Val Cys

485 490 495

Phe Ser Pro Phe Pro Asn Asn Pro Leu Asp Asn Asp His Thr Pro Gly

500 505 510

Gln Met Pro Leu Thr Trp Phe Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys

515 520 525

Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Ala Ser Lys

530 535 540

Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Thr

545 550 555 560

Ser Val Ala Asp Met Glu His Gly Pro Phe Tyr Asn Val Asp Val Asn

565 570 575

Pro Gly Gln Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala

580 585 590

Trp Phe Phe Gly Ala Ser Ser Arg Asp Asp His Met Pro Tyr Ser Ile

595 600 605

Leu Met Glu Ile Ala Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu

610 615 620

Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu

625 630 635 640

Asp Ala Asp Ala Glu Leu Val Gly Asp Ala Met Pro Asp Val Arg Gly

645 650 655

Lys Thr Ile Arg Asn Phe Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly

660 665 670

Lys Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Ala

675 680 685

Val Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val

690 695 700

Phe Glu Ser Gln Thr Gly Leu Asp Asn Gly Lys Pro Arg Leu Pro Trp

705 710 715 720

Tyr Arg Glu Asn Asn Val Ala Val Asp Thr Leu Ser Ala Pro Ala Ser

725 730 735

Ala Ser Ser Ala Gln Gly Gln Leu Gln Leu Gln Arg Arg Gly Ser Gln

740 745 750

Ala Gln Phe Leu Asp Thr Ile His Leu Ala Gly Ser Gly Ala Gly Val

755 760 765

His Gly Gln Gly Tyr Ala His Gly Glu Lys Ala Val Asn Lys Gln Asp

770 775 780

Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser

785 790 795 800

Leu Gly Ile Glu Ser Met Phe Gln Leu Val Glu Ala Trp Cys Val Lys

805 810 815

Gln Gly Leu Ala Ala Arg His Gly Ile Ala His Pro Val Phe Ala His

820 825 830

Ala Pro Gly Ala Thr Ser Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys

835 840 845

Asn Asp Arg Met Asp Ser Glu Val His Ile Lys Ser Val Ala Ala Phe

850 855 860

Ser Ser Trp Val Asp Val Val Ala Asp Gly Phe Leu Phe Val Asp Gly

865 870 875 880

Leu Arg Val Tyr Ser Ala Asp Asn Leu Arg Val Arg Ile Gln Thr Gly

885 890 895

Ala Gly His Val Glu Glu Gln Glu Val Ala Ala Lys Ala Thr Thr Lys

900 905 910

Asn Ser Ser Ile Ala Asp Val Asp Val Ala Asp Leu Gln Ala Leu Lys

915 920 925

Gln Ala Leu Leu Thr Leu Glu Arg Pro Leu Gln Leu Asp Ala Gly Ser

930 935 940

Glu Val Pro Ala Cys Ala Val Ser Asp Leu Gly Asp Arg Gly Phe Met

945 950 955 960

Glu Thr Tyr Gly Val Val Ala Pro Leu Tyr Ser Gly Ala Met Ala Lys

965 970 975

Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Met Gly Gln Arg Lys Met

980 985 990

Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Met His Val Val Arg Ala

995 1000 1005

Gly Ile Glu Lys Ile Gln Ala Ala Leu Pro Ala Gly Pro Tyr Ala

1010 1015 1020

Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ala Asn Leu Glu Lys Gly

1025 1030 1035

Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys Gly Val Arg Val Val Glu Ala

1040 1045 1050

Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Pro Gln Val Val Arg Tyr Arg Ala

1055 1060 1065

Thr Gly Leu Ser Arg Asp Ala Arg Gly Gly Ser Val Arg Thr Ala

1070 1075 1080

His Lys Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met

1085 1090 1095

Phe Ile Arg Pro Ala Pro Gln Ala Ile Leu Asp Lys Leu Val Ala

1100 1105 1110

Ser Gly Glu Ile Thr Pro Glu Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Val

1115 1120 1125

Pro Met Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His

1130 1135 1140

Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Leu Ser

1145 1150 1155

Leu Arg Asn Arg Leu Gln Arg Glu Leu Lys Tyr Pro Ala Arg His

1160 1165 1170

Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala

1175 1180 1185

Ala Leu Gly Ala Phe His Met Gly Ala Ala Phe Val Val Thr Gly

1190 1195 1200

Thr Val Asn Gln Leu Ser Arg Gln Ala Gly Thr Cys Asp Asn Val

1205 1210 1215

Arg Arg Gln Leu Ser Arg Ala Thr Tyr Ser Asp Ile Thr Met Ala

1220 1225 1230

Pro Ala Ala Asp Met Phe Glu Gln Gly Val Glu Leu Gln Val Leu

1235 1240 1245

Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Phe Glu

1250 1255 1260

Leu Phe His Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Asp Glu

1265 1270 1275

Leu Ala Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Ser Lys Ser Leu Ala Glu

1280 1285 1290

Val Trp Ala Glu Thr Lys Asp Phe Tyr Ile Thr Arg Leu Asn Asn

1295 1300 1305

Pro Glu Lys Ile Arg Lys Ala Glu Asn Glu Asp Pro Lys Leu Lys

1310 1315 1320

Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp

1325 1330 1335

Ala Asn Asn Gly Ile Ala Asp Arg Thr Met Asp Tyr Gln Ile Trp

1340 1345 1350

Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Ile Ala Asp Ser

1355 1360 1365

Tyr Leu Asp Val Ala Val Ser Gly Glu Phe Pro Asp Val Val Gln

1370 1375 1380

Ile Asn Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala Ala Tyr Leu Gln Arg Leu

1385 1390 1395

Leu Ser Val Lys Leu Ala Pro Arg Ile Asp Val Asp Thr Glu Asp

1400 1405 1410

Asp Leu Phe Thr Tyr Arg Pro Asp His Ala Leu

1415 1420

<210> 15

<211> 37281

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pDAB101429

<400> 15

aattacaacg gtatatatcc tgccagtcag catcatcaca ccaaaagtta ggcccgaata 60

gtttgaaatt agaaagctcg caattgaggt ctacaggcca aattcgctct tagccgtaca 120

atattactca ccggatccta accggtttaa ttaaggcgcg ccatgcccgg gcaagcggcc 180

gcacaagttt gtacaaaaaa gcaggcttct agacctaggc tcagcaactc atccagtcaa 240

gttcgagtca gtgagttggg cggccgcagc ttatagtaaa gatttttttg ttaataaaat 300

gaaagttaat atttatggat ttatttgaac atatttacaa gtttttgtta ataaatttat 360

ttacagaagt gttaaatttg aaaatgtgtt aaatgagagt taatatttat ggatataata 420

ttactttatt taaaaataaa atgaatttat attaaaatat gatttggtaa aagatattat 480

aaagaggaac ttggatgaga aagacgacga tgggcaaaag ttgcatggca caccgctttt 540

gttcagtaac atctgcactg tggcgccttt ttcacactca ccatgcatgc tgccacgtca 600

gctttcacac tatgacacca ctggccatac acgttgccac ctcagctttc tcctcttctc 660

actatgacac gactggccat gcatgcatgc atgctgccac ctcagctccc gcctcttcac 720

ccgtgtcttt ctctcatgtc gcagtgctgc gtgccaacct cttctctcta taaatagaga 780

gaagagaatg atggttaaac tcaaaccaaa acaagaaaac atacacaaat agcaaaacgg 840

atccacaacc aaaaatggat accagaattg ccattgtggg aatgagtgcg atccttccga 900

gtggtgagaa tgttagagag agctgggagg ccatcagaga tggcttggat tgtctgtctg 960

atctgcctgc ggatcgtgtg gatgtgactg cctattacaa tccagagaaa acgaccaagg 1020

acaaaatcta ctgcaaaaga ggtgggttca tccctgagta tgactttgat gctcgtgagt 1080

ttggcctcaa catgttccag atggaagatt ctgatgcgaa ccagaccatc tcattgctca 1140

aggtgaagga agctctcacc gatgccaaca tacctgcttt ctcaagtggc aaaaagaaca 1200

ttggttgtgt tcttggcata ggtggaggtc agaaggcgtc acatgagttc tactccagac 1260

tcaactatgt tgtggttgac aaagtgctca gaaagatggg tttgccagag gaagatgtgg 1320

cagctgcggt ggacaagtac aaggcgagct tcccagagtg gaggcttgat tcttttcctg 1380

gtttcttggg caatgttacc gctggcagat gttgcaacac cttcaacatg gagggcatga 1440

actgtgtcgt tgacgctgcc tgtgcttcaa gcctgattgc ggtcaaggtg gcaatagaag 1500

agcttctcta tggtgactgt gatgccatga ttgctggtgc cacctgcaca gacaattcaa 1560

tagggatgta catggccttc tccaagacgc ctgttttctc tacggacccg agtgtcaaag 1620

cgtatgatgc tgccaccaaa ggcatgttga ttggtgaagg atctgcgatg cttgttctga 1680

agagatatgc ggatgctgtc agagatggtg acactgttca tgctgtcatc aagggctgtg 1740

cttcctcaag tgatggaaaa gcagctggaa tctacacacc gacaatcagc ggacaagaag 1800

aggctctccg tagagcctat gcacgtgcca atgtggaccc agccactgtc actcttgttg 1860

aaggacatgg aactggcact ccggttgggg acaagattga actcacagct ctgagcaatc 1920

tcttctccaa agcgttttct gcgaatggag gtggagctga ggaagctgag caagttgctg 1980

ttggcagcat caagagccag atagggcacc tcaaagcggt tgctggattg gctggattgg 2040

tcaaagtggt ccttgctctc aagcacaaga cattgcctca gacgatcaat gtggacaagc 2100

caccttcact ggtggatggg acaccgattc aacagtcccc tttgtacgtc aacaccatga 2160

accgtccctg gttcactccg gttggggttc cgaggagagc tggcgtttcc tcatttggtt 2220

ttggaggtgc gaactaccat gctgtgcttg aagagtttga acctgaacat gagagtgctt 2280

accgttacaa caatcttccc caagttgctc tccttcatgc tggggatgtt gcaactcttg 2340

ctgccacagt tagggcaaaa ctggcattgg ccactgctga gcaagaagag gctagagttg 2400

tgaagaacgc tgattacatt gcataccata ggttccttga tgaatgtaag ttgagaggag 2460

ctgttcccca agcccacgca agggttggac ttctggtgag ggacctgtcc tctctcattg 2520

cggttttgga agcagctgca gccaaacttg ctggagaaga gtcagcaacg gaatggacgg 2580

tctcagttgc cactggtgag gctgcattca gagttagggg tgttgccaca gaggccaatg 2640

ttgctgcact tttctctggc caaggagcgc agtacactca catgttctca gatgttgcca 2700

tgaactggcc tccgttcaga gagagtgttg ctgcgatgga cagagcgcag agagaacgtt 2760

ttgggaggcc agccaaaaga gtctccagtg ttctctatcc gagaaaacct tatggagatg 2820

agccaaggca agatcacaaa gagatttctc agacgcgtta ctctcagcca gcaaccctcg 2880

cttgctctgt cggtgccttt gacatcttca aagcagctgg attggctcct tcttttgcag 2940

ctggacattc cctgggagag tttgcagctc tctatgcagc tggttcattg gatcgtgatg 3000

ctgtgtttga cttggtttgc gctagggcaa aggccatgtc tgatttcact gctcaagcca 3060

gctccagtgg aggtgctatg gcagcggtca taggagccaa ggctgatcag ctcagccttg 3120

gtggagcacc tgatgtttgg ctggccaata gcaacagtcc atcacagacg gtgatcacgg 3180

gaactgctga agcagtggca gctgcatctg acaaacttcg ttgtagtgga aacttcagag 3240

tggttcctct tgcttgtgaa gctgccttcc attcaccaca catgcgtgga gcagagcaga 3300

catttgcgtc tgcgcttgct caagctccag tgtccgcacc tgcagctgcc agattctaca 3360

gcaacgtcac tggtggagct gcagtcacct ctcctgctga tgtcaaaacg aaccttggga 3420

aacacatgac ttctcctgtg cagtttgtgc agcaagtccg tgccatgcac gcagctggag 3480

caagggtgtt tgttgagttc ggtcccaagc aagtcctttc tcgtttggtc aaagagaccc 3540

ttggggaagc tggagacgtg gtcacggtgg ctgtcaaccc agactcagcc aaggattcag 3600

acacccagct gagacaagca gctctcacct tggctgtggc tggtgttcca ctcaaagact 3660

ttgacagatg gcagcttccc gatgccactc gtcttgagcc tgtcaagaaa aagaaaacaa 3720

ccttgaggtt gagtgctgcc acctatgtct ctgccaagac cttgaggcag agggaggctg 3780

tgctcaatga tggttacact gtgagtggtg ccacagcggt tgtcaaagaa gtggacactg 3840

caaacgaaga gagacttgtc agacaagcac aagacctcca gcgtcagctt gctgaagcaa 3900

gcactgcagc ccaagcagct caatccaagg tcgctgaatt ggagaggaca atccaagact 3960

tggagaggaa ggttcaacag caacagcaag agaaaggtga gaactctgac tccaatgcag 4020

ctgcggaagt gcttaggaga cacaaggaac tgctccagag gatgctccaa gattgtgatg 4080

agcaagcagt tcccgtggca acagtcgttc caacacccac ttcttcccct acaccaacat 4140

cctcaccagt tagcggaaac agcaagtcca ccagaggatc agccgacctc caagcactcc 4200

tggcgaaagc tgagacggtc gtgatggcag ttttggctgc aaagactggc tacgaggcag 4260

acatggtgga agcagatatg gatttggagg ctgagcttgg gattgattcc atcaaaaggg 4320

tggagatcct gagtgaagtc caagggcagc tcggagttga agcgaaggat gttgatgccc 4380

tttcacgtac aaggaccgtc ggagaggttg tggatgccat gaaggctgag attgttgctg 4440

catctggtgg gtcagcacct gctgtcccct ctgcaccagc tgcatcagcg gctccgacac 4500

ctgctgcgag taccgctccg agtgctgatc ttcaggctct cctgtctaaa gccgagacgg 4560

ttgtgatggc tgtgctcgca gcgaaaactg gttacgaggc tgacatggtg gaagctgaca 4620

tggaccttga agcggagttg ggaatagata gcatcaaacg tgttgaaatc ttgtctgagg 4680

tccaaggaca gttgggtgtg gaagccaaag atgtcgatgc gctttcaaga accagaaccg 4740

tcggtgaggt cgtggacgcc atgaaggctg agattgtggc tgcctctgct ggctccgctc 4800

ctgctccagc agttccttct gcacctgcag cgtcagcggc tccaactcca gctgcatcca 4860

cggctccttc tgcagacctc caagccttgc tgtccaaagc cgaaacagtt gtgatggctg 4920

tccttgctgc aaagactggt tacgaagccg acatggttga agctgacatg gatttggaag 4980

ccgaacttgg aatagattcc atcaaaagag tggagatact ctctgaggtg caaggtcagc 5040

tcggagttga agcgaaagac gttgatgccc tcagtaggac cagaactgtt ggggaagttg 5100

tcgatgcgat gaaggctgag attgtcgctg ccagcggtgg atctgcacct gcacctgcgg 5160

tcccgtcagc tccagcagcc agcgcagctc cgactcctgc agctgccaca gcaccgagtg 5220

cggatctgca ggcattgctt gcgaaggctg aaacagttgt catggctgtc ctggctgcga 5280

aaactggcta tgaggctgat atggtggaag ccgacatgga ccttgaggct gaattgggca 5340

ttgacagcat caagcgtgtt gagattctca gtgaagtcca aggacagctc ggagtggagg 5400

cgaaggatgt ggatgccctc tcaaggacca gaacagttgg tgaggtcgtt gatgcgatga 5460

aggcagagat tgttgctgcc agtgctggtt ctgctcccgc acccgctgtc ccaagcgcac 5520

cagctgcctc cgccgctccc acaccagctg cctctactgc accaagtgcg gaccttcaag 5580

ctctcctgag caaggctgag acagttgtga tggcagtcct tgctgcgaaa actggctatg 5640

aggcagacat ggtggaagcg gacatggatc tggaagctga acttggaatt gactccatca 5700

aacgtgttga aatcctctct gaggttcaag gtcagcttgg ggtggaggcc aaagatgttg 5760

atgctctttc cagaacaagg acggtgggag aggtggttga tgccatgaag gctgagatag 5820

tggcagcgtc aggagggtca gcacctgcag ctgccgttcc gtccgcacca gcagcctctg 5880

cagctcccac gccagccacc gctcctagtg ctgatttgca agccctcctt tcaaaagctg 5940

aaactgttgt catggctgtt ttggctgcca agactggcta cgaggctgac atggttgagg 6000

ctgacatgga cttggaagcc gagcttggga ttgatagcat caagcgtgtg gaaatccttt 6060

ctgaggttca aggtcagctg ggtgttgagg ccaaagatgt cgatgcgttg tcaaggacca 6120

gaacggttgg agaagtggtc gatgccatga aggctgagat agttgctgcc tctggaggtt 6180

cagctcctgc agctccgtca gcacctgccc tccttccaac tttgtttggt tctgagtgtg 6240

aagatttgag cttgactttc ccagtcatca caaccctgcc tcttcctgct gaacttgtgc 6300

tggctgaagg tggagcacgt cctgtggttg tggttgacga tggctctgca ctcaccagtt 6360

ctcttgtgtc ctcacttggt gatcgtgctg tgctcttgca agttcagtcc agctctgcct 6420

gttcacccag aagcaccacg cacaagttgg tcactgttgc agaccgttct gaagctgcat 6480

tgcaagctgc gctcacatca gttgaagcac agtttggaaa agtgggaggt tttgtgttcc 6540

agtttggtga tgacgatgtc caagcgcagc ttggttgggc actgcttgct gccaaacatc 6600

tcaaaacgtc cttgtcagaa cagatagaag gtgggaggac cttctttgtt gccgttgcga 6660

ggttggatgg tcagttgggg ttgtctggaa agtccacgac tgccactgtt gatctctcca 6720

gagcgcagca aggctcagtc tttggactct gcaaaaccct tgacttggaa tggcctgctg 6780

ttttctgcag aggaatcgac cttgcagctg acttggatgc tgcacaagct gccagatgtc 6840

ttttgggtga gctttcagac ccagatgtgg cagtgaggga gtctggttac tccgcatctg 6900

ggcaaagatg caccacaacc acaaagtctc tcaccacggg aaaaccacat caaccgatct 6960

cttccagtga tttgttcctg gtctctggag gtgctcgtgg aatcacacct ctttgtgtga 7020

gagaattggc acagagggtg ggaggtggaa cctatgtcct cattgggaga agtgagctgc 7080

ccaccacgga acctgcctgg gctgttggtg ttgagtcagg gaaacctctt gagaaggctg 7140

cgctggcgtt cctcaaagct gagtttgcag ctggaagggg agcgaagccg acaccgatgc 7200

tccacaagaa acttgttgga gctgttgtgg gagctagaga ggtccgtgcg agcctggcag 7260

agataactgc tcaaggtgcc acagctgtct atgagtcctg tgatgtcagc tctgcagcca 7320

aggttcgtga aatggttgag agggttcaac agcaaggagg gagaagggtc agcggtgtgt 7380

ttcatgcaag tggtgttttg agagacaagt tggttgagaa caagtcactg gctgatttca 7440

gtgctgtgta tgacacaaag gttggtggac tcatcaacct ccttgcctgt gtggatcttg 7500

cacagcttag gcacctggtg ctcttcagct cccttgctgg gttccacggc aatgttggtc 7560

agagtgacta tgcaatggcc aatgaggctc tcaacaagct ggctgcacat ctgtctgctg 7620

tgcatcccca actttgtgcg agatccattt gctttggtcc gtgggatgga gggatggtga 7680

cgcctgcact caaggccaac ttcatcagaa tgggcattca gattatccct cgtcaaggtg 7740

gagcacagac agttgcgaac atgcttgtca gctccagccc tggtcagctc cttgttggga 7800

actggggagt gccacctgtg gttccaagtg ccactgagca cactgttttg cagactcttc 7860

gtcagagcga caaccccttc ttggattcac atgtcattca agggagaagg gttttgccga 7920

tgacactggc tgtcggctac atggctcacc aagctcagag catctacgct ggacatcagc 7980

tttgggcagt tgaggatgcc cagcttttca aaggcatagc cattgacaat ggagctgatg 8040

ttccggttag ggttgagttg tcaaggagaa aggaggaaca agaggatgct ggcaaggtca 8100

aggtcaaggt tcaagtgctt ctcaaatctc aagtcaatgg caagtcagtc cctgcttaca 8160

aggcgactgt cgtgctttcc cctgctccac gtcccagtgt catcacccgt gactttgatc 8220

tcactcctga cccagcctgc accgaacatg acctctatga tggcaagacg ctcttccacg 8280

gcaaagcctt ccaaggaata gaacaagttc tttctgcgac gccaaaacag ctcactgcca 8340

aatgcagaaa ccttccactc acaccggagc agcgtggcca gtttgtggtc aatctcagcc 8400

agcaagaccc attccaagct gacattgctt tccaagccat gcttgtttgg gctaggatgt 8460

tgagacagtc tgctgcgctg cccaataact gtgaaaggtt tgatttctac aaaccgatgg 8520

ctcctggagc aacttactat accagtgtca aactggcttc agcttcacca ttggtggatt 8580

ctgtgtgcaa atgcactgtt gccatgcacg atgagcaagg tgaagtgtac ttctctgcga 8640

gagccagtgt tgtcctcaac aagacactca catactgatg agtagttagc ttaatcactt 8700

aggtcaccca gtccaagccc ggcctagcac gatgatcatg agtgttgcta ttgatgtatg 8760

ttaatactat acacagtcat cgtgtgtgtt ttataaaact gtaagcttag gatgtttgag 8820

gctaatgtaa ttagcactac accgtaataa atgagaggtt tactttatgt tttaataatg 8880

ttcttaccct tgctgctctc taaactgtaa tggcgtacgg ttagctaaac taaagtaaaa 8940

atcgattcgc ttgagtaaaa ttagtgaccg ggaaagatca tcgactacta ctgctcagag 9000

atgtaatcgg taattaagac ttcaagctca ataattaatt aggagtaaat ctggcttcga 9060

atttttaaat tgtcaacttc caaagaagga ttggcaagac tcaatctcaa ttgcccaaca 9120

aacatatggc tctttacaaa tttggaatct ctttttgatg gcaagaacgt cgtaattcct 9180

ctgtcgatct catgtaatta ccaaactcat ctacttatta ctttctttat atgcacttac 9240

tgatgcggcc gcttaattaa tctgacctga ccactagacc tgagtgagta cagatgtgct 9300

actagtgcta gcctcgaggt cgacacaact ttgtatacaa aagttgtcta gacctaggct 9360

cagcaactca tccagtcaag ttcgagtcag tgagttgggc ggccgcagct tatagtaaag 9420

atttttttgt taataaaatg aaagttaata tttatggatt tatttgaaca tatttacaag 9480

tttttgttaa taaatttatt tacagaagtg ttaaatttga aaatgtgtta aatgagagtt 9540

aatatttatg gatataatat tactttattt aaaaataaaa tgaatttata ttaaaatatg 9600

atttggtaaa agatattata aagaggaact tggatgagaa agacgacgat gggcaaaagt 9660

tgcatggcac accgcttttg ttcagtaaca tctgcactgt ggcgcctttt tcacactcac 9720

catgcatgct gccacgtcag ctttcacact atgacaccac tggccataca cgttgccacc 9780

tcagctttct cctcttctca ctatgacacg actggccatg catgcatgca tgctgccacc 9840

tcagctcccg cctcttcacc cgtgtctttc tctcatgtcg cagtgctgcg tgccaacctc 9900

ttctctctat aaatagagag aagagaatga tggttaaact caaaccaaaa caagaaaaca 9960

tacacaaata gcaaaacgga tccacaacca aaaatgccgt gtgacaacat tgctgtggtt 10020

ggaatggcag ttcagtatgc tggatgcaag aaccaggacg agttctggga cacactgatg 10080

aggaaggaga tcaacagctc accgatctca gcggagaggc ttgggacaag atacagagac 10140

ctccacttcc atcctcagag gagcaagtat gcagacacct tctgcaatga cagatatggt 10200

tgtgttgatg cttctgttga caatgagcat gacttgcttg ctgaccttgc cagacgtgct 10260

ttgcttgatg ctgggatcaa cttggatgac gccagcacca ctgccaacct tcgtgacttt 10320

gggattgtga gtggatgcct ctccttcccg atggacaatc tgcaaggtga gcttttgaat 10380

ctctatcaag tccacgttga gaaccgtgtg ggtgcccaga ggttcagaga ttcaagaccc 10440

tggtcagaaa gaccaagagc tgtgtcccct gaagccagtg acccgagggt ctacagcgac 10500

cctgcttcct ttgtggccaa ccagcttggt cttggtcctg tcagatacag ccttgatgca 10560

gcttgtgcga gtgcgctgta ctgcctcaag ttggcttctg atcacttgct ctcccgttct 10620

gcagatgtca tgctgtgtgg tgccacatgc ttcccagacc cgtttttcat tctctctggg 10680

ttctccacat tccaagcgat gccattgggt ggaccagatg acaacccact ctctgtgcca 10740

ctccgtcaag gcagccaagg actcacacct ggagaaggtg gagccatcat ggttctgaag 10800

cgtttggaag atgctgtgag ggatggtgat aggatctatg gcaccttgct tgggacaagt 10860

ctcagcaatg ctggttgtgg tttgccactt tcacctcacc tgccgtctga gaaaagctgc 10920

atggaggatt tgtacacgtc agttggcata gatccatctg aggttcagta tgtcgagtgt 10980

catgccaccg gaactccgca aggagatgtg gttgaagttg aggctctgag acattgcttc 11040

agaggcaaca ctgaccaccc accgaggatg ggttccacca aaggaaactt tggtcacacc 11100

ttggttgcag ctgggtttgc tggaatggcc aaagtgttgc tttccatgca gcatggcacg 11160

atcccaccca cgcctggtgt tgataggagc aactgcatag atccgctggt cgttgatgag 11220

gccataccct ggccttacag ctcagctcaa gcgagagctg gcaaacctgg agatgaattg 11280

aagtgtgctt ccctctcagc ctttggattt ggtggaacaa atgctcattg tgtgttcaga 11340

gaacacagac agattgctgc cactgcgaca gcgtctccgg tccttcctga agtcacccct 11400

ggacccattg caatcattgg gatggatgcg acgtttggca ccctcaaagg acttgatgcg 11460

tttgaacaag cgatctacaa aggcacggat ggagcatctg atctgccatc caagagatgg 11520

aggttccttg gtgctgacac agatttcttg actgcaatgg gtctggatgc agtcccgaga 11580

gggtgctatg tgagggatgt tgatgtggac tacaaaagac tcagaagtcc catgatccct 11640

gaagatgtcc tcagacccca acagcttctg gcagttgcca cgatggatag ggcacttcaa 11700

gatgctggca tggccacggg tggaaaagtt gctgtcctgg tggggttggg cactgacact 11760

gagctttaca gacaccgtgc aagggtgaca ctcaaggaaa ggcttgaccc agcagctttc 11820

tcccctgaac aagttcaaga aatgatggat tacatcaatg attgtggaac ctcaaccagc 11880

tacacttctt acattgggaa tcttgtggcc accagagttt cctcacagtg gggattcact 11940

ggtccttctt tcacggtcac tgaaggtgca aactcagtct atcgttgcct tgagctggga 12000

aagttccttt tggacaccca ccaagtggat gcagttgtgg ttgctggagt tgatctctgt 12060

gcaactgctg agaaccttta cctcaaggca agaaggtctg ccataagcag acaagaccat 12120

ccacgtgcca actttgaggc ttctgctgat ggatactttg ctggagaggg cagtggtgct 12180

ctggtcttga agaggcaagc tgatgttggc tcagatgaca aggtctatgc cagtgttgct 12240

ggcctcacat gtgcagcgca gcctgctgaa gcagtttctc ctcttctcct tcaagttcac 12300

aatgatgaca atgagaaaag ggttgtggag atggtggaac tcgcagctga ctctggtcgt 12360

catgctcccc acttggccaa ctctcctttg agtgctgaat cacagcttga gcaagtgtct 12420

aaactcttgg ctcatcaagt ccctggttca gtcgcgattg gaagtgttcg tgccaatgtt 12480

ggagatgttg gatatgcgag tggtgcagct tctctcataa agactgcgct ttgcctccac 12540

aaccgttact tgcctgcaaa cccacagtgg gaaagacctg tggctccagt ctcagaggct 12600

cttttcacct gtccaaggtc ccgtgcttgg ctcaagaacc ctggtgagtc cagacttgct 12660

gcagtggcca gtgcttctga gagtgggtct tgctttggag tgcttctcac agatgagtat 12720

gccacacatg agtccagcaa cagattgtca ttggatgacg ctgcacccaa actcatagcg 12780

attcgtggag acactgttga tgacatcatg gcaaaagtca atgctgaact tgcgttgctc 12840

cgtgctcatg cagaaactgg gtctgccact gacgatgacc cagctgcagc tgttgctttc 12900

actgctcatc gtttgaggtt cttgaggctt gttggtgaaa cagttgccag tcacggtgcc 12960

acagcgacct tgtgtttggc tctgctcaca actccagaaa agctggagaa agaattggag 13020

ttggcagcca agggtgttcc aagatcagcc aaggctggca gaaactggat gtcaccatct 13080

ggttctgctt ttgcaccaac acctgtcacc agtgatcgtg ttgcgttcat gtatggtgaa 13140

gggaggtctc cctactatgg tgttgggttg gaccttcaca gactctggcc tgctttgcat 13200

gagaggatca atgacaagac agctgcactt tgggagaatg gagactcctg gctcatgccc 13260

agagcggttg atgctgactc tcagagggct gtccagacgg cttttgatgc tgaccagata 13320

gagatgttta ggacgggaat ctttgtttcc atttgcctca cagactatgc tcgtgatgtc 13380

cttggagtcc aacccaaggc ttgctttgga ctctcccttg gagaaatctc catgctcttt 13440

gcactttcaa ggagaaactg tggactttct gaccagctca ctcagaggct cagaacctct 13500

ccggtctgga gcacacagct tgctgtggag ttccaagcct tgaggaaact ttggaatgtc 13560

cctgctgatg ctccagttga gtccttctgg caaggctact tggttcgtgc cagcagagca 13620

gagattgaaa aggccattgg accggacaac agatttgttc gtttgctcat tgtcaacgac 13680

tccagcagtg ccctcattgc tggcaaacct gctgagtgtc tgagggtgct tgagcgtctt 13740

ggaggtcgtt tgccacccat gccagtcaag caaggcatga ttgggcactg cccagaagtg 13800

gctccctata ctcctggaat agctcacatc cacgaaatct tggagattcc tgacagccct 13860

gtcaagatgt atacctcagt caccaatgct gagctgagag gaggcagcaa ctcttccatc 13920

acagagttcg ttcagaagtt gtacaccaga atagcggatt tccctggcat tgttgacaag 13980

gtcagccgtg atggccatga tgttttcgtg gaagttggtc cgaataacat gaggtcagca 14040

gctgtcagtg acattcttgg gaaggctgca actcctcatg tcagtgtggc tcttgatcgt 14100

ccaagtgagt cagcttggac acagacactc aaatctcttg ccctgctcac tgcccacaga 14160

gtgcctcttc acaacccgac tctctttgcg gatctttacc acccaacctt cctcacagcc 14220

atagattctg caatgcaaga accacctccc aagcccaaca gattcctgag gtctgttgaa 14280

gtcaatggtt acttctgccc tgatggcata agcaaacaag ttgcagctgc aagtgccaaa 14340

cccagcacac attgcatggt tcgtctccat ccagccaaag ctgttgtggt tgcagctgcc 14400

ggagctgtgg ttgctgattc aacaccggtt gtcaaagcca agcagacttc ctcatctttg 14460

cttgttggag acgatgcctt cctcagatgc tatgatgtgg attggcctct ctacatggga 14520

gcgatggctg aaggaatctc ctctgttgac cttgtggttg cagctgcaga agctaggatg 14580

cttgcatcat ttggagcagc gaggcttccg atggatcaag ttgaactcca gatccgtgag 14640

atccaacaga gaacctccaa tgcctttgct gtcaacctca tgcctggtcc tgatgaagct 14700

gcaacggtgg atgcccttct gagaacggga gtcagcattg tggaggcgtc tggttacacg 14760

ggtgcgctct ctgcggatct ggtgagatac cgtgtgaccg gtctcagaag gacctcctgt 14820

ggtgcttctg tgtcagcgac tcaccgtgtt gtggccaaag tttcaagaac tgaggtggct 14880

gaacatttcc tgagaccagc acctgcagct gttcttgagg ctttggtggc agccaaacaa 14940

atcactcctg agcaagctgc gcttgccagc agagtcgcga tggctgacga tgtcgcggtg 15000

gaggcagatt ctggagggca cactgacaac cgtccaatcc atgtgctcct tcctttggtt 15060

gtggctcaga ggaacagatg gaggcatctg gttgacacgc cagtgcgtgt gggagctgga 15120

ggtgggatag catgtccgag agcagcgttg cttgccttct ccttgggtgc agcctttgtg 15180

gtcactggaa gtgtcaacca gcttgctcgt gaagctggga cctctgatgc agtcagactc 15240

cttttggcga ctgccaccta tagtgatgtg gcgatggctc ctggtggagt ccaagtgttg 15300

aagaaacaaa ccatgttcgc tgcgagagca acgatgttgg ctcagctcca agccaagttt 15360

ggttcctttg atgctgtgcc agaaccgcaa ctgagaaaac tggagagatc agtgttcaag 15420

cagagtgttg ctgatgtttg ggcagctgca agggaaaagt ttggggttga tgccacggct 15480

gcaagtccgc aagagaggat ggctctctgt gtcagatggt acatgtctca aagctcacgt 15540

tgggcaacag aggccacttc agcaaggaaa gcggactatc agatttggtg tggtcctgca 15600

ataggcagct tcaatgactt cgtcagaggc accaaacttg atgccacggc tgggactggt 15660

gagttcccga gagttgtgga catcaaccag cacatcttgc tgggagcctc tcattacaga 15720

agggttcaac agcaacagca agacgatgac gttgagtaca tcattgtttg agtagttagc 15780

ttaatcactt aggtcaccca gtccaagccc ggcctagcac gatgatcatg agtgttgcta 15840

ttgatgtatg ttaatactat acacagtcat cgtgtgtgtt ttataaaact gtaagcttag 15900

gatgtttgag gctaatgtaa ttagcactac accgtaataa atgagaggtt tactttatgt 15960

tttaataatg ttcttaccct tgctgctctc taaactgtaa tggcgtacgg ttagctaaac 16020

taaagtaaaa atcgattcgc ttgagtaaaa ttagtgaccg ggaaagatca tcgactacta 16080

ctgctcagag atgtaatcgg taattaagac ttcaagctca ataattaatt aggagtaaat 16140

ctggcttcga atttttaaat tgtcaacttc caaagaagga ttggcaagac tcaatctcaa 16200

ttgcccaaca aacatatggc tctttacaaa tttggaatct ctttttgatg gcaagaacgt 16260

cgtaattcct ctgtcgatct catgtaatta ccaaactcat ctacttatta ctttctttat 16320

atgcacttac tgatgcggcc gcttaattaa tctgacctga ccactagacc tgagtgagta 16380

cagatgtgct actagtgcta gcctcgaggt cgaccaactt ttctatacaa agttgtctag 16440

acctaggact aggcactgag tgactcactg acctgactga gtgactggcg gccgcagctt 16500

atagtaaaga tttttttgtt aataaaatga aagttaatat ttatggattt atttgaacat 16560

atttacaagt ttttgttaat aaatttattt acagaagtgt taaatttgaa aatgtgttaa 16620

atgagagtta atatttatgg atataatatt actttattta aaaataaaat gaatttatat 16680

taaaatatga tttggtaaaa gatattataa agaggaactt ggatgagaaa gacgacgatg 16740

ggcaaaagtt gcatggcaca ccgcttttgt tcagtaacat ctgcactgtg gcgccttttt 16800

cacactcacc atgcatgctg ccacgtcagc tttcacacta tgacaccact ggccatacac 16860

gttgccacct cagctttctc ctcttctcac tatgacacga ctggccatgc atgcatgcat 16920

gctgccacct cagctcccgc ctcttcaccc gtgtctttct ctcatgtcgc agtgctgcgt 16980

gccaacctct tctctctata aatagagaga agagaatgat ggttaaactc aaaccaaaac 17040

aagaaaacat acacaaatag caaaacggat ccacaaccaa aaatgacatc ttcaaagaaa 17100

actcctgttt gggaaatgag caaggaagag ctgttggatg gcaagacggt tgtctttgac 17160

tacaacgagc tgttggagtt tgcggagggt gatgttggtc aagtgtttgg accagagttt 17220

gacatcattg acaagtacag aaggcgtgtg aggcttccag ccagagaata cttgcttgtt 17280

tcaagagtga ctctcatgga tgccgaggtg aataacttca gagttggctc cagaatggtc 17340

actgagtatg atgttccagt caatggtgag ttgtcagagg gaggtgatgt tccctgggca 17400

gttcttgttg aaagtgggca gtgtgacttg atgctcatct cctacatggg gattgacttc 17460

cagtgcaaag gggaccgtgt ttacagattg ctcaacacat ctctcacctt ctttggggtt 17520

gcccatgaag gagaaaccct tgtgtatgac atcagagtca ctggtttcgc caagggtgct 17580

ggtggggaaa tctcaatgtt ctttttcgag tatgactgct ttgttgatgg cagattgctc 17640

atagagatga gagatggttg tgctggcttc tttactgatg ccgaacttgc cgctggaaaa 17700

ggtgtgctca aaacgaaggc tgagcttgct gcacgtgctc agatccagaa acaagacatt 17760

gcaccctttg cacctgcacc gtgcagtcac aaaaccagct tggatgccag agaaatgaga 17820

ctgcttgttg ataggcaatg ggcaagggtc tttggttctg gaatggctgg catagactac 17880

aagttgtgtg cgagaaagat gctgatgatt gacagagtca cacaccttga tccgcgtgga 17940

ggtgctcacg gtcttgggct tctcattggg gagaaagtgc ttgagaggga ccactggtac 18000

ttcccctgcc actttgtgag ggatgaggtc atggctggtt ctcttgtctc agatggatgc 18060

tctcagcttc tcaaggttta catgttgtgg cttggccttc acaccactgt tggtgcgttc 18120

gactttcgtc cagtcagtgg tcatgccaac aaagtgaggt gtcgtggaca gatttcaccg 18180

cacaagggga aacttgttta tgtcatggag atcaaagaaa tgggctttga tgccaaaact 18240

ggagatccat ttgccatagc tgatgttgac atcattgatg tcaactttga agagggacaa 18300

gcgtttgctg gagttgagga tcttcacagc tatggccaag gagatttgag gaaaaagata 18360

gttgtggatt tcaagggaat tgcgttgtca ctgcagaaaa ggaaggagca acagaaagag 18420

agcatgactg tcaccactac gaccacgaca accagcagag tgattgctcc tccaagtgga 18480

tgcctcaaag gtgatcccac tgctcccacc tctgtcacgt ggcatccaat ggctgaggga 18540

aatggaggtc ctggacccac tccgtccttc tctccttcag cgtatcctcc cagagctgtt 18600

tgcttctctc ctttccccaa caatccgctt gacaatgatc atacacctgg ccaaatgccg 18660

ttgacctggt tcaacatgtc tgagttcatg tgtggaaaag tgagcaactg cttgggtcct 18720

gagtttgcca gatttgatgc ttccaagaca tccagatcac cagcttttga cctggctctt 18780

gtgacaaggg tgacgagtgt ggctgacatg gaacatggtc ctttctacaa tgtggatgtc 18840

aaccctggcc aaggcacgat ggtgggtgag tttgattgtc ctgcagatgc ttggttcttt 18900

ggagcctcaa gcagagacga tcacatgccg tacagcatct tgatggagat tgctcttcag 18960

acttctggag tcctcacatc tgtgctcaaa gctccgctca caatggacaa agatgacatc 19020

cttttcagaa accttgatgc agatgcagaa cttgtgggtg atgccatgcc tgatgtcaga 19080

gggaaaacca taaggaactt caccaaatgc acgggatact ccatgcttgg caagatggga 19140

atccatcgtt tcaccttcga actctctgtt gacggagcag ttttctacaa agggagcacc 19200

tcttttggtt ggtttgttcc tgaggtcttt gagagccaga ctggattgga caatggcaag 19260

ccgaggttgc cttggtatag ggaaaacaat gtggcagtgg acacactctc agcacctgcg 19320

tcagcttcta gtgcccaagg tcagcttcag cttcagagga gagggtcaca agcgcagttc 19380

ctggacacaa ttcatcttgc tgggagtgga gctggagtgc atggccaagg ttatgctcat 19440

ggggagaaag ctgtgaacaa gcaagattgg ttcttttctt gccatttctg gtttgaccca 19500

gtgatgcctg ggtctttggg aattgagtcc atgttccagc ttgtggaagc gtggtgtgtc 19560

aaacaaggct tggctgcaag gcatggaatt gctcatccag tctttgcaca tgcacctggt 19620

gccaccagct ggaagtacag aggtcagttg accccaaaga atgacagaat ggacagtgaa 19680

gttcacatca agagtgttgc tgccttctcc tcatgggttg atgtggttgc tgatgggttc 19740

ctcttcgttg atggcctcag agtctattca gcagacaacc tgagggtcag aatccagact 19800

ggagctggcc atgttgaaga gcaagaagtt gctgccaaag ccaccacaaa gaactccagc 19860

attgctgatg tggatgtggc tgatcttcaa gctctcaaac aagcgttgct gacactggag 19920

agaccattgc agttggatgc tggaagtgag gtgccagcct gtgctgtcag cgatttggga 19980

gaccgtggat tcatggagac ttatggggtg gttgctccgt tgtacagtgg tgcgatggcc 20040

aagggaatag cctctgcgga tctggtcata gcaatgggtc agaggaagat gttggggagc 20100

tttggagctg gtgggttgcc aatgcacgtt gtccgtgctg ggattgaaaa gatccaagct 20160

gcacttcccg ctggtccgta tgctgtcaac ctcatccact caccgttcga tgccaacctg 20220

gaaaagggca atgttgatct tttcctggaa aagggagttc gtgtggttga ggcgtctgcc 20280

ttcatggaac tcacaccaca agtggtccgt tacagagcca cgggactctc cagagatgcg 20340

agaggtggct cagtgaggac agcacacaag atcataggaa aggtttccag aacagagctt 20400

gcggagatgt tcatcagacc tgcacctcaa gcaattctgg acaaacttgt tgcgtctggt 20460

gaaatcaccc ctgagcaagc tgcgttggct cttgaagttc caatggctga tgacattgca 20520

gttgaggctg acagtggagg gcacactgac aaccgtccca ttcatgtcat tctgccgttg 20580

atcctcagtc tgaggaatag gctccagagg gaactcaagt accctgccag acaccgtgtt 20640

agggttggtg ctggtggagg cataggttgt cctcaagctg cacttggagc cttccacatg 20700

ggagctgcgt ttgttgtgac tggcactgtc aaccagctgt cccgtcaagc tggaacatgt 20760

gacaacgtga ggcgtcagct ctctcgtgcc acttactctg acatcacgat ggcaccagct 20820

gcagacatgt ttgaacaagg agttgaactg caagttctca agaaaggaac gatgttccca 20880

tctcgtgcca agaaactctt tgaactgttc cacaagtatg attcctttga agcaatgcct 20940

gcggatgaat tggctcgtgt tgagaagagg atcttctcca agtcccttgc agaagtttgg 21000

gcagagacca aagatttcta catcactcgt ctcaacaatc ctgaaaagat cagaaaggct 21060

gagaatgagg accccaagct caagatgtcc ctctgcttcc gttggtactt gggtctcagc 21120

tcattctggg caaacaatgg catagctgac cgtacgatgg attaccagat ttggtgtgga 21180

cctgccatag gagccttcaa cgatttcatt gcagacagct atcttgatgt tgcagtctct 21240

ggtgagttcc ctgatgttgt gcagatcaac cttcaaatcc tgtctggtgc tgcgtatctc 21300

cagagattgc tcagtgtcaa acttgcacca aggatagatg tggacactga agatgacctc 21360

ttcacctaca gaccagatca tgcactctga gtagttagct taatcactta ggtcacccag 21420

tccaagcccg gcctagcacg atgatcatga gtgttgctat tgatgtatgt taatactata 21480

cacagtcatc gtgtgtgttt tataaaactg taagcttagg atgtttgagg ctaatgtaat 21540

tagcactaca ccgtaataaa tgagaggttt actttatgtt ttaataatgt tcttaccctt 21600

gctgctctct aaactgtaat ggcgtacggt tagctaaact aaagtaaaaa tcgattcgct 21660

tgagtaaaat tagtgaccgg gaaagatcat cgactactac tgctcagaga tgtaatcggt 21720

aattaagact tcaagctcaa taattaatta ggagtaaatc tggcttcgaa tttttaaatt 21780

gtcaacttcc aaagaaggat tggcaagact caatctcaat tgcccaacaa acatatggct 21840

ctttacaaat ttggaatctc tttttgatgg caagaacgtc gtaattcctc tgtcgatctc 21900

atgtaattac caaactcatc tacttattac tttctttata tgcacttact gatgcggccg 21960

cttaattaat cacgagtgga tgactgtcac gactgactca tgactgacta ctagtgctag 22020

cctcgaggtc gacacaactt tgtataataa agttgtctag acctaggcga gtcatgagtc 22080

gtgacatgac gtcatgctca tcagactgcg gccgcagctt atagtaaaga tttttttgtt 22140

aataaaatga aagttaatat ttatggattt atttgaacat atttacaagt ttttgttaat 22200

aaatttattt acagaagtgt taaatttgaa aatgtgttaa atgagagtta atatttatgg 22260

atataatatt actttattta aaaataaaat gaatttatat taaaatatga tttggtaaaa 22320

gatattataa agaggaactt ggatgagaaa gacgacgatg ggcaaaagtt gcatggcaca 22380

ccgcttttgt tcagtaacat ctgcactgtg gcgccttttt cacactcacc atgcatgctg 22440

ccacgtcagc tttcacacta tgacaccact ggccatacac gttgccacct cagctttctc 22500

ctcttctcac tatgacacga ctggccatgc atgcatgcat gctgccacct cagctcccgc 22560

ctcttcaccc gtgtctttct ctcatgtcgc agtgctgcgt gccaacctct tctctctata 22620

aatagagaga agagaatgat ggttaaactc aaaccaaaac aagaaaacat acacaaatag 22680

caaaacggat ccacaaccaa aaatgcccac tccagatgcc actgcgcctc tcaacaagcc 22740

gtcagactat gctgtgtacc acgaagagga tggtcctttc tggactgctg attcctctgg 22800

tgtcagcaga gtgaacttct ctgaaactgg tgtgggatct gaaggtgtca ttcctgcgct 22860

cacactgatt gatgtgtttg agcgtgcggt caaacgtggt ggcaatagga ttgcattcag 22920

aacagagaac atgccaacct tgaggcgtgg agaagaggct cctgatgctt tgccgctcaa 22980

agattggaag tcctggtctt ggaaacagta caaagctgat gttcacagaa ttgcgagggc 23040

tctgatggat ttgggagttg agcagcacga tgcggtctcc atctttggct tcaactcacc 23100

agaatggttc ctcagtgctg tcggtgcagt tcatgctggt gccaagatcg ctggaatcta 23160

cccttcagac actcctgctc aagtgcagta caaagccttc cactctgaca ctgctgttgc 23220

agttgtggag aacgaacagt gcttcaagaa attcgcagag gtggttgagg atctccctta 23280

cctcaaagcc attgtttgtt gggattatga agccacagac atcacaaggg aagatggttc 23340

agtggttgaa gtcctgacct ttgctgagtt cctgaagaga ggtgacactg tggaagcagc 23400

tgcacttgat gagagaatca gcaagattga gcccaccatg tgtgctgccc tgatctacac 23460

cagtggcaca actgggagac ccaaagctgt catgatctcc catgacaacc ttgtctttga 23520

agcatctgct gtggtcccga acttgggagg ggcatgcacg accactgctg aggaaaggat 23580

tctttcctac cttcctttgt ctcatgttgc tggaatgatg gttgacatca ttgctccaat 23640

catagcgaca gcgttccaca aaggaaggat ctgtgtttgt tttgccagac cgtatgattt 23700

gagaactgga acccttgggc aaagactcaa tgcagtggag ccaaccatat tccttggtgt 23760

gccacgtgtg tgggaaaaga tccaagagaa attgatggct gttggtgcca aaaccactgg 23820

tctcaagaag aaactcagca cggcagccaa gaaacgtggg cttgaatttc aagaggaaca 23880

acagataggg agaagtggtg ccaaccctgg ctttggaccg cttggaatct acaagaaact 23940

tttgggcctc atcaaaggaa agttggggct gaccaaatgc aagtttgcct ttgctggcgc 24000

agctccaatg acccgtgaaa cccttcagta ctttggagcg ctgaacatca acatcaatga 24060

ggtctatgga atgtctgaat gcagtggggc tgccacctgg tcaactgaca aagctcatga 24120

gtggggcact gttggctatg agatgccctc ctgtgaagtc agagtgttca agattgcgga 24180

ggatggcacc aagacagagt gcccaagagc tgctgacatc atgcatgcca cagaagagga 24240

acaaggtgaa gtttgcttcc gtggaaggaa catcatgatg ggatacttgg ccaacccgaa 24300

acttggtgat gaccatgttg ctgagattga agagaagaat gcagctgcca tagatagcga 24360

agggtggctt cactctggtg acaagggagc aatttccaca aggggaatgc tcaagataac 24420

gggcagatac aaggagctta tcataggtgc tggtggggag aatgtggctc ctgttcccat 24480

tgaagatgcc atcaaggcga ggatgccttt tgtttcaaat gcaatgatgg ttggagacaa 24540

gaggaagttc atggctgtcc ttctgacttt gaaaacggtt ggagcaactg gagagcttcc 24600

tggcacaaac aagctcatgg gagcagctgc ggactatggt gagaccattg aggatgcctg 24660

tgacaatgag gcgctcattg aagagataac gcagcaactc aaagagatag gtgacgatgg 24720

agatgtcacg ccaagcaatg cagcccgtat acaaaagttc acgattttgc cactcgactt 24780

cagtgtctcc acagatgaac tgacagcaac gttgaaattg aagagaagtg tggttgcaga 24840

caagtatgag gacatcatag aggctttcta tgagagcaag tctgtctttg tgccttactc 24900

aacagttgga gcttatgcaa cgggtggacc agttgatgac tctgttgtgg atggatcatt 24960

caaaggtgac tttagcatga ttggggatga cgatccggat cttcagaatg tggatgtcct 25020

tgaagcaatt gatgaggaca actgagtagt tagcttaatc acttaggtca cccagtccaa 25080

gcccggccta gcacgatgat catgagtgtt gctattgatg tatgttaata ctatacacag 25140

tcatcgtgtg tgttttataa aactgtaagc ttaggatgtt tgaggctaat gtaattagca 25200

ctacaccgta ataaatgaga ggtttacttt atgttttaat aatgttctta cccttgctgc 25260

tctctaaact gtaatggcgt acggttagct aaactaaagt aaaaatcgat tcgcttgagt 25320

aaaattagtg accgggaaag atcatcgact actactgctc agagatgtaa tcggtaatta 25380

agacttcaag ctcaataatt aattaggagt aaatctggct tcgaattttt aaattgtcaa 25440

cttccaaaga aggattggca agactcaatc tcaattgccc aacaaacata tggctcttta 25500

caaatttgga atctcttttt gatggcaaga acgtcgtaat tcctctgtcg atctcatgta 25560

attaccaaac tcatctactt attactttct ttatatgcac ttactgatgc ggccgcttaa 25620

ttaatctgat catggatgct acgtcacggc agtacaggac tatcactaga cctaggagct 25680

gtgctgggta actcacatga gtcactggtc acatcagcgg ccgcagctta tagtaaagat 25740

ttttttgtta ataaaatgaa agttaatatt tatggattta tttgaacata tttacaagtt 25800

tttgttaata aatttattta cagaagtgtt aaatttgaaa atgtgttaaa tgagagttaa 25860

tatttatgga tataatatta ctttatttaa aaataaaatg aatttatatt aaaatatgat 25920

ttggtaaaag atattataaa gaggaacttg gatgagaaag acgacgatgg gcaaaagttg 25980

catggcacac cgcttttgtt cagtaacatc tgcactgtgg cgcctttttc acactcacca 26040

tgcatgctgc cacgtcagct ttcacactat gacaccactg gccatacacg ttgccacctc 26100

agctttctcc tcttctcact atgacacgac tggccatgca tgcatgcatg ctgccacctc 26160

agctcccgcc tcttcacccg tgtctttctc tcatgtcgca gtgctgcgtg ccaacctctt 26220

ctctctataa atagagagaa gagaatgatg gttaaactca aaccaaaaca agaaaacata 26280

cacaaatagc aaaacggatc cacaaccaaa aatgcttcag cacacttggc ttccgaagcc 26340

tcccaatctg accctcttgt cagatgaggt tcatctctgg aggattcctc ttgaccagcc 26400

tgagtcacaa cttcaagacc ttgctgccac cctgagcagt gatgaattgg cgagggcaaa 26460

cagattctac tttccagaac acagaaggcg tttcactgct gggagaggca tcctcagatc 26520

catcttgggt ggatacttgg gagtggaacc gggtcaagtc aagtttgatt atgagtcccg 26580

tgggaaaccg atccttggtg acagatttgc tgagagtgga ctcctgttca acttgtctca 26640

cagccagaac cttgccttgt gtgctgtcaa ctacacgcgt caaataggca ttgatcttga 26700

atatctgcgt ccaacatctg acttggagtc tcttgcaaag aggttctttc tcccaagaga 26760

atatgaactc ttgaggtcac tccctgatga gcagaaacag aagattttct ttcgttactg 26820

gacttgcaaa gaggcttatc tcaaagcaac gggagatgga atagccaaac ttgaagagat 26880

cgagatagca ctcaccccaa cagaacctgc caagctccaa acagctcctg cgtggtctct 26940

gttggagctt gtgccagatg acaattgtgt tgcagctgtg gctgttgcgg gttttggttg 27000

gcagcccaag ttctggcatt actgagtagt tagcttaatc acttaggtca cccagtccaa 27060

gcccggccta gcacgatgat catgagtgtt gctattgatg tatgttaata ctatacacag 27120

tcatcgtgtg tgttttataa aactgtaagc ttaggatgtt tgaggctaat gtaattagca 27180

ctacaccgta ataaatgaga ggtttacttt atgttttaat aatgttctta cccttgctgc 27240

tctctaaact gtaatggcgt acggttagct aaactaaagt aaaaatcgat tcgcttgagt 27300

aaaattagtg accgggaaag atcatcgact actactgctc agagatgtaa tcggtaatta 27360

agacttcaag ctcaataatt aattaggagt aaatctggct tcgaattttt aaattgtcaa 27420

cttccaaaga aggattggca agactcaatc tcaattgccc aacaaacata tggctcttta 27480

caaatttgga atctcttttt gatggcaaga acgtcgtaat tcctctgtcg atctcatgta 27540

attaccaaac tcatctactt attactttct ttatatgcac ttactgatgc ggccgcttaa 27600

ttaactactg tcactgaggc cgtagacgag tacggactga tctaactagt gctagcctcg 27660

aggtcgacac ccagctttct tgtacaaagt ggttgcggcc gcttaattaa atttaaattc 27720

aattaatgca atcttgattt tcaacaacga aggtaatggc gtaaaagaaa aaatgtatgt 27780

tattgtattg atctttcatg atgttgaagc gtgccataat atgatgatgt ataattaaaa 27840

tattaactgt cgcattttat tgaaatggca ctgttatttc aaccatatct ttgattctgt 27900

tacatgacac gactgcaaga agtaaataat agacgccgtt gttaaagaat tgctatcata 27960

tgtgcctaac tagagggaat ttgagcgtca gacctaatca aatattacaa aatatctcac 28020

tctgtcgcca gcaatggtgt aatcagcgca gacaaatggc gtaaagatcg cggaaaaacc 28080

tccccgagtg gcatgatagc tgcctctgta ttgctgattt agtcagcctt atttgactta 28140

agggtgccct cgttagtgac aaattgcttt caaggagaca gccatgcccc acactttgtt 28200

gaaaaacaaa ttgcctttgg ggagacggta aagccagttg ctcttcaata aggaatgtcg 28260

aggaggcaat gtaaccgcct ctggtagtac acttctctaa tccaaaaatc aatttgtatt 28320

caagataccg caaaaaactt atggtttaaa ccctgcagga ctagtccaga aggtaattat 28380

ccaagatgta gcatcaagaa tccaatgttt acgggaaaaa ctatggaagt attatgtaag 28440

ctcagcaaga agcagatcaa tatgcggcac atatgcaacc tatgttcaaa aatgaagaat 28500

gtacagatac aagatcctat actgccagaa tacgaagaag aatacgtaga aattgaaaaa 28560

gaagaaccag gcgaagaaaa gaatcttgaa gacgtaagca ctgacgacaa caatgaaaag 28620

aagaagataa ggtcggtgat tgtgaaagag acatagagga cacatgtaag gtggaaaatg 28680

taagggcgga aagtaacctt atcacaaagg aatcttatcc cccactactt atccttttat 28740

atttttccgt gtcatttttg cccttgagtt ttcctatata aggaaccaag ttcggcattt 28800

gtgaaaacaa gaaaaaattt ggtgtaagct attttctttg aagtactgag gatacaactt 28860

cagagaaatt tgtaagtttg taggtaccag atctggatcc caaaccatgt ctccggagag 28920

gagaccagtt gagattaggc cagctacagc agctgatatg gccgcggttt gtgatatcgt 28980

taaccattac attgagacgt ctacagtgaa ctttaggaca gagccacaaa caccacaaga 29040

gtggattgat gatctagaga ggttgcaaga tagataccct tggttggttg ctgaggttga 29100

gggtgttgtg gctggtattg cttacgctgg gccctggaag gctaggaacg cttacgattg 29160

gacagttgag agtactgttt acgtgtcaca taggcatcaa aggttgggcc taggatctac 29220

attgtacaca catttgctta agtctatgga ggcgcaaggt tttaagtctg tggttgctgt 29280

tataggcctt ccaaacgatc catctgttag gttgcatgag gctttgggat acacagcccg 29340

gggtacattg cgcgcagctg gatacaagca tggtggatgg catgatgttg gtttttggca 29400

aagggatttt gagttgccag ctcctccaag gccagttagg ccagttaccc aaatctgagt 29460

agttagctta atcacctaga gctcgatcgg cggcaatagc ttcttagcgc catcccgggt 29520

tgatcctatc tgtgttgaaa tagttgcggt gggcaaggct ctctttcaga aagacaggcg 29580

gccaaaggaa cccaaggtga ggtgggctat ggctctcagt tccttgtgga agcgcttggt 29640

ctaaggtgca gaggtgttag cgggatgaag caaaagtgtc cgattgtaac aagatatgtt 29700

gatcctacgt aaggatatta aagtatgtat tcatcactaa tataatcagt gtattccaat 29760

atgtactacg atttccaatg tctttattgt cgccgtatgt aatcggcgtc acaaaataat 29820

ccccggtgac tttcttttaa tccaggatga aataatatgt tattataatt tttgcgattt 29880

ggtccgttat aggaattgaa gtgtgcttga ggtcggtcgc caccactccc atttcataat 29940

tttacatgta tttgaaaaat aaaaatttat ggtattcaat ttaaacacgt atacttgtaa 30000

agaatgatat cttgaaagaa atatagttta aatatttatt gataaaataa caagtcaggt 30060

attatagtcc aagcaaaaac ataaatttat tgatgcaagt ttaaattcag aaatatttca 30120

ataactgatt atatcagctg gtacattgcc gtagatgaaa gactgagtgc gatattatgg 30180

tgtaatacat aggaattcgt ttaaacgatc tgcgtctaat tttcggtcca acttgcacag 30240

gaaagacgtc gaccgcggta gctcttgccc agcagactgg gcttccagtc ctttcgctcg 30300

atcgggtcca atgttgtcct cagctgtgaa ccggaagcgg acgaccaaca gtggaagaac 30360

tgaaaggaac gagccgtcta taccttgatg atcggcctct ggtgaagggt atcatcgcag 30420

ccaagcaagc tcatgaaagg ctgatggggg aggtgtataa ttatgaggcc cacggcgggc 30480

ttattcttta gggaggatct atctcgttgc tcaagtgcat ggcgcaaagc agttattgga 30540

gtgcggattt tcgttggcat attattcgcc acgagttagc agacgaagag accttcatga 30600

acgtggccaa ggccagagtt aagcagatgt tacgccctgc tgcaggcctt tctattatcc 30660

aatagttggt tgatctttgg aaagagcctc ggctgaggcc catactgaaa gagatcgatg 30720

gatatcgata tgccatgttg tttgctagcc agaaccagat cacatccgat atgctattgc 30780

agcttgacgc agatatggag gataagttga ttcatgggat cgctcaggag tagctcatcc 30840

atgcacgccg acaagaacag aaattccgtc gagttaacgc agccgcttac gacggattcg 30900

aaggtcatcc attcggaatg tattagtttg caccagctcc gcgtcacacc tgtcttcatt 30960

tgaataagat gttagcaatt gtttttagct ttgtcttgtt gtggcagggc ggcaagtgct 31020

tcagacatca ttctgttttc aaattttatg ctggagaaca gcttcttaat tcctttggaa 31080

ataatagact gcgtcttaaa attcagatgt ctggatatag atatgattgt aaaataacct 31140

atttaagtgt catttagaac ataagtttta tgaatgttct tccattttcg tcatcgaacg 31200

aataagagta aatacacctt ttttaacatt acaaataagt tcttatacgt tgtttataca 31260

ccgggaatca tttccattat tttcgcgcaa aagtcacgga tattcgtgaa agcgacataa 31320

actgcgaaat ttgcggggag tgtcttgagt ttgcctcgag gctagcgcat gcacatagac 31380

acacacatca tctcattgat gcttggtaat aattgtcatt agattgtttt tatgcataga 31440

tgcactcgaa atcagccaat tttagacaag tatcaaacgg atgtgacttc agtacattaa 31500

aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgatttaca attgaatata 31560

tcctgcccca gccagccaac agctcgattt acaattgaat atatcctgcc ggccggccca 31620

cgcgtgtcga ggaattctga tctggccccc atttggacgt gaatgtagac acgtcgaaat 31680

aaagatttcc gaattagaat aatttgttta ttgctttcgc ctataaatac gacggatcgt 31740

aatttgtcgt tttatcaaaa tgtactttca ttttataata acgctgcgga catctacatt 31800

tttgaattga aaaaaaattg gtaattactc tttctttttc tccatattga ccatcatact 31860

cattgctgat ccatgtagat ttcccggaca tgaagccatt tacaattgaa tatatcctgc 31920

cgccgctgcc gctttgcacc cggtggagct tgcatgttgg tttctacgca gaactgagcc 31980

ggttaggcag ataatttcca ttgagaactg agccatgtgc accttccccc caacacggtg 32040

agcgacgggg caacggagtg atccacatgg gacttttaaa catcatccgt cggatggcgt 32100

tgcgagagaa gcagtcgatc cgtgagatca gccgacgcac cgggcaggcg cgcaacacga 32160

tcgcaaagta tttgaacgca ggtacaatcg agccgacgtt cacgcggaac gaccaagcaa 32220

gcttggctgc catttttggg gtgaggccgt tcgcggccga ggggcgcagc ccctgggggg 32280

atgggaggcc cgcgttagcg ggccgggagg gttcgagaag ggggggcacc ccccttcggc 32340

gtgcgcggtc acgcgcacag ggcgcagccc tggttaaaaa caaggtttat aaatattggt 32400

ttaaaagcag gttaaaagac aggttagcgg tggccgaaaa acgggcggaa acccttgcaa 32460

atgctggatt ttctgcctgt ggacagcccc tcaaatgtca ataggtgcgc ccctcatctg 32520

tcagcactct gcccctcaag tgtcaaggat cgcgcccctc atctgtcagt agtcgcgccc 32580

ctcaagtgtc aataccgcag ggcacttatc cccaggcttg tccacatcat ctgtgggaaa 32640

ctcgcgtaaa atcaggcgtt ttcgccgatt tgcgaggctg gccagctcca cgtcgccggc 32700

cgaaatcgag cctgcccctc atctgtcaac gccgcgccgg gtgagtcggc ccctcaagtg 32760

tcaacgtccg cccctcatct gtcagtgagg gccaagtttt ccgcgaggta tccacaacgc 32820

cggcggccgc ggtgtctcgc acacggcttc gacggcgttt ctggcgcgtt tgcagggcca 32880

tagacggccg ccagcccagc ggcgagggca accagcccgg tgagcgtcgg aaagggtcga 32940

cggatctttt ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat 33000

ccatcctttt tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg 33060

tgtatccaac ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt 33120

tccttcttca ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga 33180

ggctggccgg ctaccgccgg cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga tgaaaccaag 33240

ccaaccagga agggcagccc acctatcaag gtgtactgcc ttccagacga acgaagagcg 33300

attgaggaaa aggcggcggc ggccggcatg agcctgtcgg cctacctgct ggccgtcggc 33360

cagggctaca aaatcacggg cgtcgtggac tatgagcacg tccgcgagct ggcccgcatc 33420

aatggcgacc tgggccgcct gggcggcctg ctgaaactct ggctcaccga cgacccgcgc 33480

acggcgcggt tcggtgatgc cacgatcctc gccctgctgg cgaagatcga agagaagcag 33540

gacgagcttg gcaaggtcat gatgggcgtg gtccgcccga gggcagagcc atgacttttt 33600

tagccgctaa aacggccggg gggtgcgcgt gattgccaag cacgtcccca tgcgctccat 33660

caagaagagc gacttcgcgg agctggtatt cgtgcagggc aagattcgga ataccaagta 33720

cgagaaggac ggccagacgg tctacgggac cgacttcatt gccgataagg tggattatct 33780

ggacaccaag gcaccaggcg ggtcaaatca ggaataaggg cacattgccc cggcgtgagt 33840

cggggcaatc ccgcaaggag ggtgaatgaa tcggacgttt gaccggaagg catacaggca 33900

agaactgatc gacgcggggt tttccgccga ggatgccgaa accatcgcaa gccgcaccgt 33960

catgcgtgcg ccccgcgaaa ccttccagtc cgtcggctcg atggtccagc aagctacggc 34020

caagatcgag cgcgacagcg tgcaactggc tccccctgcc ctgcccgcgc catcggccgc 34080

cgtggagcgt tcgcgtcgtc tcgaacagga ggcggcaggt ttggcgaagt cgatgaccat 34140

cgacacgcga ggaactatga cgaccaagaa gcgaaaaacc gccggcgagg acctggcaaa 34200

acaggtcagc gaggccaagc aggccgcgtt gctgaaacac acgaagcagc agatcaagga 34260

aatgcagctt tccttgttcg atattgcgcc gtggccggac acgatgcgag cgatgccaaa 34320

cgacacggcc cgctctgccc tgttcaccac gcgcaacaag aaaatcccgc gcgaggcgct 34380

gcaaaacaag gtcattttcc acgtcaacaa ggacgtgaag atcacctaca ccggcgtcga 34440

gctgcgggcc gacgatgacg aactggtgtg gcagcaggtg ttggagtacg cgaagcgcac 34500

ccctatcggc gagccgatca ccttcacgtt ctacgagctt tgccaggacc tgggctggtc 34560

gatcaatggc cggtattaca cgaaggccga ggaatgcctg tcgcgcctac aggcgacggc 34620

gatgggcttc acgtccgacc gcgttgggca cctggaatcg gtgtcgctgc tgcaccgctt 34680

ccgcgtcctg gaccgtggca agaaaacgtc ccgttgccag gtcctgatcg acgaggaaat 34740

cgtcgtgctg tttgctggcg accactacac gaaattcata tgggagaagt accgcaagct 34800

gtcgccgacg gcccgacgga tgttcgacta tttcagctcg caccgggagc cgtacccgct 34860

caagctggaa accttccgcc tcatgtgcgg atcggattcc acccgcgtga agaagtggcg 34920

cgagcaggtc ggcgaagcct gcgaagagtt gcgaggcagc ggcctggtgg aacacgcctg 34980

ggtcaatgat gacctggtgc attgcaaacg ctagggcctt gtggggtcag ttccggctgg 35040

gggttcagca gccagcgctt tactggcatt tcaggaacaa gcgggcactg ctcgacgcac 35100

ttgcttcgct cagtatcgct cgggacgcac ggcgcgctct acgaactgcc gataaacaga 35160

ggattaaaat tgacaattgt gattaaggct cagattcgac ggcttggagc ggccgacgtg 35220

caggatttcc gcgagatccg attgtcggcc ctgaagaaag ctccagagat gttcgggtcc 35280

gtttacgagc acgaggagaa aaagcccatg gaggcgttcg ctgaacggtt gcgagatgcc 35340

gtggcattcg gcgcctacat cgacggcgag atcattgggc tgtcggtctt caaacaggag 35400

gacggcccca aggacgctca caaggcgcat ctgtccggcg ttttcgtgga gcccgaacag 35460

cgaggccgag gggtcgccgg tatgctgctg cgggcgttgc cggcgggttt attgctcgtg 35520

atgatcgtcc gacagattcc aacgggaatc tggtggatgc gcatcttcat cctcggcgca 35580

cttaatattt cgctattctg gagcttgttg tttatttcgg tctaccgcct gccgggcggg 35640

gtcgcggcga cggtaggcgc tgtgcagccg ctgatggtcg tgttcatctc tgccgctctg 35700

ctaggtagcc cgatacgatt gatggcggtc ctgggggcta tttgcggaac tgcgggcgtg 35760

gcgctgttgg tgttgacacc aaacgcagcg ctagatcctg tcggcgtcgc agcgggcctg 35820

gcgggggcgg tttccatggc gttcggaacc gtgctgaccc gcaagtggca acctcccgtg 35880

cctctgctca cctttaccgc ctggcaactg gcggccggag gacttctgct cgttccagta 35940

gctttagtgt ttgatccgcc aatcccgatg cctacaggaa ccaatgttct cggcctggcg 36000

tggctcggcc tgatcggagc gggtttaacc tacttccttt ggttccgggg gatctcgcga 36060

ctcgaaccta cagttgtttc cttactgggc tttctcagcc cccgagcgct tagtgggaat 36120

ttgtacccct tatcgaaccg ggagcacagg atgacgccta acaattcatt caagccgaca 36180

ccgcttcgcg gcgcggctta attcaggagt taaacatcat gagggaagcg gtgatcgccg 36240

aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc gaaccgacgt 36300

tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca cacagtgata 36360

ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga gctttgatca 36420

acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc gctgtagaag 36480

tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag cgcgaactgc 36540

aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca gccacgatcg 36600

acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc ttggtaggtc 36660

cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag gcgctaaatg 36720

aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga aatgtagtgc 36780

ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg aaggatgtcg 36840

ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata cttgaagcta 36900

ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat 36960

ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataatgt ctaacaattc 37020

gttcaagccg acgccgcttc gcggcgcggc ttaactcaag cgttagagag ctggggaaga 37080

ctatgcgcga tctgttgaag gtggttctaa gcctcgtctt gcgatggcat ttcgatccat 37140

tcccattccg cgctcaagat ggcttcccct cggcagttca tcagggctaa atcaatctag 37200

ccgacttgtc cggtgaaatg ggctgcactc caacagaaac aatcaaacaa acatacacag 37260

cgacttattc acacgagctc a 37281

<210> 16

<211> 33672

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pDAB101454

<400> 16

aattacaacg gtatatatcc tgccagtcag catcatcaca ccaaaagtta ggcccgaata 60

gtttgaaatt agaaagctcg caattgaggt ctacaggcca aattcgctct tagccgtaca 120

atattactca ccggatccta accggtttaa ttaaggcgcg ccatgcccgg gcaagcggcc 180

gcacaagttt gtacaaaaaa gcaggcttct agacctaggc tcagcaactc atccagtcaa 240

gttcgagtca gtgagttggg cggccgcagc ttatagtaaa gatttttttg ttaataaaat 300

gaaagttaat atttatggat ttatttgaac atatttacaa gtttttgtta ataaatttat 360

ttacagaagt gttaaatttg aaaatgtgtt aaatgagagt taatatttat ggatataata 420

ttactttatt taaaaataaa atgaatttat attaaaatat gatttggtaa aagatattat 480

aaagaggaac ttggatgaga aagacgacga tgggcaaaag ttgcatggca caccgctttt 540

gttcagtaac atctgcactg tggcgccttt ttcacactca ccatgcatgc tgccacgtca 600

gctttcacac tatgacacca ctggccatac acgttgccac ctcagctttc tcctcttctc 660

actatgacac gactggccat gcatgcatgc atgctgccac ctcagctccc gcctcttcac 720

ccgtgtcttt ctctcatgtc gcagtgctgc gtgccaacct cttctctcta taaatagaga 780

gaagagaatg atggttaaac tcaaaccaaa acaagaaaac atacacaaat agcaaaacgg 840

atccacaacc aaaaatggat accagaattg ccattgtggg aatgagtgcg atccttccga 900

gtggtgagaa tgttagagag agctgggagg ccatcagaga tggcttggat tgtctgtctg 960

atctgcctgc ggatcgtgtg gatgtgactg cctattacaa tccagagaaa acgaccaagg 1020

acaaaatcta ctgcaaaaga ggtgggttca tccctgagta tgactttgat gctcgtgagt 1080

ttggcctcaa catgttccag atggaagatt ctgatgcgaa ccagaccatc tcattgctca 1140

aggtgaagga agctctcacc gatgccaaca tacctgcttt ctcaagtggc aaaaagaaca 1200

ttggttgtgt tcttggcata ggtggaggtc agaaggcgtc acatgagttc tactccagac 1260

tcaactatgt tgtggttgac aaagtgctca gaaagatggg tttgccagag gaagatgtgg 1320

cagctgcggt ggacaagtac aaggcgagct tcccagagtg gaggcttgat tcttttcctg 1380

gtttcttggg caatgttacc gctggcagat gttgcaacac cttcaacatg gagggcatga 1440

actgtgtcgt tgacgctgcc tgtgcttcaa gcctgattgc ggtcaaggtg gcaatagaag 1500

agcttctcta tggtgactgt gatgccatga ttgctggtgc cacctgcaca gacaattcaa 1560

tagggatgta catggccttc tccaagacgc ctgttttctc tacggacccg agtgtcaaag 1620

cgtatgatgc tgccaccaaa ggcatgttga ttggtgaagg atctgcgatg cttgttctga 1680

agagatatgc ggatgctgtc agagatggtg acactgttca tgctgtcatc aagggctgtg 1740

cttcctcaag tgatggaaaa gcagctggaa tctacacacc gacaatcagc ggacaagaag 1800

aggctctccg tagagcctat gcacgtgcca atgtggaccc agccactgtc actcttgttg 1860

aaggacatgg aactggcact ccggttgggg acaagattga actcacagct ctgagcaatc 1920

tcttctccaa agcgttttct gcgaatggag gtggagctga ggaagctgag caagttgctg 1980

ttggcagcat caagagccag atagggcacc tcaaagcggt tgctggattg gctggattgg 2040

tcaaagtggt ccttgctctc aagcacaaga cattgcctca gacgatcaat gtggacaagc 2100

caccttcact ggtggatggg acaccgattc aacagtcccc tttgtacgtc aacaccatga 2160

accgtccctg gttcactccg gttggggttc cgaggagagc tggcgtttcc tcatttggtt 2220

ttggaggtgc gaactaccat gctgtgcttg aagagtttga acctgaacat gagagtgctt 2280

accgttacaa caatcttccc caagttgctc tccttcatgc tggggatgtt gcaactcttg 2340

ctgccacagt tagggcaaaa ctggcattgg ccactgctga gcaagaagag gctagagttg 2400

tgaagaacgc tgattacatt gcataccata ggttccttga tgaatgtaag ttgagaggag 2460

ctgttcccca agcccacgca agggttggac ttctggtgag ggacctgtcc tctctcattg 2520

cggttttgga agcagctgca gccaaacttg ctggagaaga gtcagcaacg gaatggacgg 2580

tctcagttgc cactggtgag gctgcattca gagttagggg tgttgccaca gaggccaatg 2640

ttgctgcact tttctctggc caaggagcgc agtacactca catgttctca gatgttgcca 2700

tgaactggcc tccgttcaga gagagtgttg ctgcgatgga cagagcgcag agagaacgtt 2760

ttgggaggcc agccaaaaga gtctccagtg ttctctatcc gagaaaacct tatggagatg 2820

agccaaggca agatcacaaa gagatttctc agacgcgtta ctctcagcca gcaaccctcg 2880

cttgctctgt cggtgccttt gacatcttca aagcagctgg attggctcct tcttttgcag 2940

ctggacattc cctgggagag tttgcagctc tctatgcagc tggttcattg gatcgtgatg 3000

ctgtgtttga cttggtttgc gctagggcaa aggccatgtc tgatttcact gctcaagcca 3060

gctccagtgg aggtgctatg gcagcggtca taggagccaa ggctgatcag ctcagccttg 3120

gtggagcacc tgatgtttgg ctggccaata gcaacagtcc atcacagacg gtgatcacgg 3180

gaactgctga agcagtggca gctgcatctg acaaacttcg ttgtagtgga aacttcagag 3240

tggttcctct tgcttgtgaa gctgccttcc attcaccaca catgcgtgga gcagagcaga 3300

catttgcgtc tgcgcttgct caagctccag tgtccgcacc tgcagctgcc agattctaca 3360

gcaacgtcac tggtggagct gcagtcacct ctcctgctga tgtcaaaacg aaccttggga 3420

aacacatgac ttctcctgtg cagtttgtgc agcaagtccg tgccatgcac gcagctggag 3480

caagggtgtt tgttgagttc ggtcccaagc aagtcctttc tcgtttggtc aaagagaccc 3540

ttggggaagc tggagacgtg gtcacggtgg ctgtcaaccc agactcagcc aaggattcag 3600

acacccagct gagacaagca gctctcacct tggctgtggc tggtgttcca ctcaaagact 3660

ttgacagatg gcagcttccc gatgccactc gtcttgagcc tgtcaagaaa aagaaaacaa 3720

ccttgaggtt gagtgctgcc acctatgtct ctgccaagac cttgaggcag agggaggctg 3780

tgctcaatga tggttacact gtgagtggtg ccacagcggt tgtcaaagaa gtggacactg 3840

caaacgaaga gagacttgtc agacaagcac aagacctcca gcgtcagctt gctgaagcaa 3900

gcactgcagc ccaagcagct caatccaagg tcgctgaatt ggagaggaca atccaagact 3960

tggagaggaa ggttcaacag caacagcaag agaaaggtga gaactctgac tccaatgcag 4020

ctgcggaagt gcttaggaga cacaaggaac tgctccagag gatgctccaa gattgtgatg 4080

agcaagcagt tcccgtggca acagtcgttc caacacccac ttcttcccct acaccaacat 4140

cctcaccagt tagcggaaac agcaagtcca ccagaggatc agccgacctc caagcactcc 4200

tggcgaaagc tgagacggtc gtgatggcag ttttggctgc aaagactggc tacgaggcag 4260

acatggtgga agcagatatg gatttggagg ctgagcttgg gattgattcc atcaaaaggg 4320

tggagatcct gagtgaagtc caagggcagc tcggagttga agcgaaggat gttgatgccc 4380

tttcacgtac aaggaccgtc ggagaggttg tggatgccat gaaggctgag attgttgctg 4440

catctggtgg gtcagcacct gctgtcccct ctgcaccagc tgcatcagcg gctccgacac 4500

ctgctgcgag taccgctccg agtgctgatc ttcaggctct cctgtctaaa gccgagacgg 4560

ttgtgatggc tgtgctcgca gcgaaaactg gttacgaggc tgacatggtg gaagctgaca 4620

tggaccttga agcggagttg ggaatagata gcatcaaacg tgttgaaatc ttgtctgagg 4680

tccaaggaca gttgggtgtg gaagccaaag atgtcgatgc gctttcaaga accagaaccg 4740

tcggtgaggt cgtggacgcc atgaaggctg agattgtggc tgcctctgct ggctccgctc 4800

ctgctccagc agttccttct gcacctgcag cgtcagcggc tccaactcca gctgcatcca 4860

cggctccttc tgcagacctc caagccttgc tgtccaaagc cgaaacagtt gtgatggctg 4920

tccttgctgc aaagactggt tacgaagccg acatggttga agctgacatg gatttggaag 4980

ccgaacttgg aatagattcc atcaaaagag tggagatact ctctgaggtg caaggtcagc 5040

tcggagttga agcgaaagac gttgatgccc tcagtaggac cagaactgtt ggggaagttg 5100

tcgatgcgat gaaggctgag attgtcgctg ccagcggtgg atctgcacct gcacctgcgg 5160

tcccgtcagc tccagcagcc agcgcagctc cgactcctgc agctgccaca gcaccgagtg 5220

cggatctgca ggcattgctt gcgaaggctg aaacagttgt catggctgtc ctggctgcga 5280

aaactggcta tgaggctgat atggtggaag ccgacatgga ccttgaggct gaattgggca 5340

ttgacagcat caagcgtgtt gagattctca gtgaagtcca aggacagctc ggagtggagg 5400

cgaaggatgt ggatgccctc tcaaggacca gaacagttgg tgaggtcgtt gatgcgatga 5460

aggcagagat tgttgctgcc agtgctggtt ctgctcccgc acccgctgtc ccaagcgcac 5520

cagctgcctc cgccgctccc acaccagctg cctctactgc accaagtgcg gaccttcaag 5580

ctctcctgag caaggctgag acagttgtga tggcagtcct tgctgcgaaa actggctatg 5640

aggcagacat ggtggaagcg gacatggatc tggaagctga acttggaatt gactccatca 5700

aacgtgttga aatcctctct gaggttcaag gtcagcttgg ggtggaggcc aaagatgttg 5760

atgctctttc cagaacaagg acggtgggag aggtggttga tgccatgaag gctgagatag 5820

tggcagcgtc aggagggtca gcacctgcag ctgccgttcc gtccgcacca gcagcctctg 5880

cagctcccac gccagccacc gctcctagtg ctgatttgca agccctcctt tcaaaagctg 5940

aaactgttgt catggctgtt ttggctgcca agactggcta cgaggctgac atggttgagg 6000

ctgacatgga cttggaagcc gagcttggga ttgatagcat caagcgtgtg gaaatccttt 6060

ctgaggttca aggtcagctg ggtgttgagg ccaaagatgt cgatgcgttg tcaaggacca 6120

gaacggttgg agaagtggtc gatgccatga aggctgagat agttgctgcc tctggaggtt 6180

cagctcctgc agctccgtca gcacctgccc tccttccaac tttgtttggt tctgagtgtg 6240

aagatttgag cttgactttc ccagtcatca caaccctgcc tcttcctgct gaacttgtgc 6300

tggctgaagg tggagcacgt cctgtggttg tggttgacga tggctctgca ctcaccagtt 6360

ctcttgtgtc ctcacttggt gatcgtgctg tgctcttgca agttcagtcc agctctgcct 6420

gttcacccag aagcaccacg cacaagttgg tcactgttgc agaccgttct gaagctgcat 6480

tgcaagctgc gctcacatca gttgaagcac agtttggaaa agtgggaggt tttgtgttcc 6540

agtttggtga tgacgatgtc caagcgcagc ttggttgggc actgcttgct gccaaacatc 6600

tcaaaacgtc cttgtcagaa cagatagaag gtgggaggac cttctttgtt gccgttgcga 6660

ggttggatgg tcagttgggg ttgtctggaa agtccacgac tgccactgtt gatctctcca 6720

gagcgcagca aggctcagtc tttggactct gcaaaaccct tgacttggaa tggcctgctg 6780

ttttctgcag aggaatcgac cttgcagctg acttggatgc tgcacaagct gccagatgtc 6840

ttttgggtga gctttcagac ccagatgtgg cagtgaggga gtctggttac tccgcatctg 6900

ggcaaagatg caccacaacc acaaagtctc tcaccacggg aaaaccacat caaccgatct 6960

cttccagtga tttgttcctg gtctctggag gtgctcgtgg aatcacacct ctttgtgtga 7020

gagaattggc acagagggtg ggaggtggaa cctatgtcct cattgggaga agtgagctgc 7080

ccaccacgga acctgcctgg gctgttggtg ttgagtcagg gaaacctctt gagaaggctg 7140

cgctggcgtt cctcaaagct gagtttgcag ctggaagggg agcgaagccg acaccgatgc 7200

tccacaagaa acttgttgga gctgttgtgg gagctagaga ggtccgtgcg agcctggcag 7260

agataactgc tcaaggtgcc acagctgtct atgagtcctg tgatgtcagc tctgcagcca 7320

aggttcgtga aatggttgag agggttcaac agcaaggagg gagaagggtc agcggtgtgt 7380

ttcatgcaag tggtgttttg agagacaagt tggttgagaa caagtcactg gctgatttca 7440

gtgctgtgta tgacacaaag gttggtggac tcatcaacct ccttgcctgt gtggatcttg 7500

cacagcttag gcacctggtg ctcttcagct cccttgctgg gttccacggc aatgttggtc 7560

agagtgacta tgcaatggcc aatgaggctc tcaacaagct ggctgcacat ctgtctgctg 7620

tgcatcccca actttgtgcg agatccattt gctttggtcc gtgggatgga gggatggtga 7680

cgcctgcact caaggccaac ttcatcagaa tgggcattca gattatccct cgtcaaggtg 7740

gagcacagac agttgcgaac atgcttgtca gctccagccc tggtcagctc cttgttggga 7800

actggggagt gccacctgtg gttccaagtg ccactgagca cactgttttg cagactcttc 7860

gtcagagcga caaccccttc ttggattcac atgtcattca agggagaagg gttttgccga 7920

tgacactggc tgtcggctac atggctcacc aagctcagag catctacgct ggacatcagc 7980

tttgggcagt tgaggatgcc cagcttttca aaggcatagc cattgacaat ggagctgatg 8040

ttccggttag ggttgagttg tcaaggagaa aggaggaaca agaggatgct ggcaaggtca 8100

aggtcaaggt tcaagtgctt ctcaaatctc aagtcaatgg caagtcagtc cctgcttaca 8160

aggcgactgt cgtgctttcc cctgctccac gtcccagtgt catcacccgt gactttgatc 8220

tcactcctga cccagcctgc accgaacatg acctctatga tggcaagacg ctcttccacg 8280

gcaaagcctt ccaaggaata gaacaagttc tttctgcgac gccaaaacag ctcactgcca 8340

aatgcagaaa ccttccactc acaccggagc agcgtggcca gtttgtggtc aatctcagcc 8400

agcaagaccc attccaagct gacattgctt tccaagccat gcttgtttgg gctaggatgt 8460

tgagacagtc tgctgcgctg cccaataact gtgaaaggtt tgatttctac aaaccgatgg 8520

ctcctggagc aacttactat accagtgtca aactggcttc agcttcacca ttggtggatt 8580

ctgtgtgcaa atgcactgtt gccatgcacg atgagcaagg tgaagtgtac ttctctgcga 8640

gagccagtgt tgtcctcaac aagacactca catactgatg agtagttagc ttaatcactt 8700

aggtcaccca gtccaagccc ggcctagcac gatgatcatg agtgttgcta ttgatgtatg 8760

ttaatactat acacagtcat cgtgtgtgtt ttataaaact gtaagcttag gatgtttgag 8820

gctaatgtaa ttagcactac accgtaataa atgagaggtt tactttatgt tttaataatg 8880

ttcttaccct tgctgctctc taaactgtaa tggcgtacgg ttagctaaac taaagtaaaa 8940

atcgattcgc ttgagtaaaa ttagtgaccg ggaaagatca tcgactacta ctgctcagag 9000

atgtaatcgg taattaagac ttcaagctca ataattaatt aggagtaaat ctggcttcga 9060

atttttaaat tgtcaacttc caaagaagga ttggcaagac tcaatctcaa ttgcccaaca 9120

aacatatggc tctttacaaa tttggaatct ctttttgatg gcaagaacgt cgtaattcct 9180

ctgtcgatct catgtaatta ccaaactcat ctacttatta ctttctttat atgcacttac 9240

tgatgcggcc gcttaattaa tctgacctga ccactagacc tgagtgagta cagatgtgct 9300

actagtgcta gcctcgaggt cgacacaact ttgtatacaa aagttgtcta gacctaggct 9360

cagcaactca tccagtcaag ttcgagtcag tgagttgggc ggccgcagct tatagtaaag 9420

atttttttgt taataaaatg aaagttaata tttatggatt tatttgaaca tatttacaag 9480

tttttgttaa taaatttatt tacagaagtg ttaaatttga aaatgtgtta aatgagagtt 9540

aatatttatg gatataatat tactttattt aaaaataaaa tgaatttata ttaaaatatg 9600

atttggtaaa agatattata aagaggaact tggatgagaa agacgacgat gggcaaaagt 9660

tgcatggcac accgcttttg ttcagtaaca tctgcactgt ggcgcctttt tcacactcac 9720

catgcatgct gccacgtcag ctttcacact atgacaccac tggccataca cgttgccacc 9780

tcagctttct cctcttctca ctatgacacg actggccatg catgcatgca tgctgccacc 9840

tcagctcccg cctcttcacc cgtgtctttc tctcatgtcg cagtgctgcg tgccaacctc 9900

ttctctctat aaatagagag aagagaatga tggttaaact caaaccaaaa caagaaaaca 9960

tacacaaata gcaaaacgga tccacaacca aaaatgccgt gtgacaacat tgctgtggtt 10020

ggaatggcag ttcagtatgc tggatgcaag aaccaggacg agttctggga cacactgatg 10080

aggaaggaga tcaacagctc accgatctca gcggagaggc ttgggacaag atacagagac 10140

ctccacttcc atcctcagag gagcaagtat gcagacacct tctgcaatga cagatatggt 10200

tgtgttgatg cttctgttga caatgagcat gacttgcttg ctgaccttgc cagacgtgct 10260

ttgcttgatg ctgggatcaa cttggatgac gccagcacca ctgccaacct tcgtgacttt 10320

gggattgtga gtggatgcct ctccttcccg atggacaatc tgcaaggtga gcttttgaat 10380

ctctatcaag tccacgttga gaaccgtgtg ggtgcccaga ggttcagaga ttcaagaccc 10440

tggtcagaaa gaccaagagc tgtgtcccct gaagccagtg acccgagggt ctacagcgac 10500

cctgcttcct ttgtggccaa ccagcttggt cttggtcctg tcagatacag ccttgatgca 10560

gcttgtgcga gtgcgctgta ctgcctcaag ttggcttctg atcacttgct ctcccgttct 10620

gcagatgtca tgctgtgtgg tgccacatgc ttcccagacc cgtttttcat tctctctggg 10680

ttctccacat tccaagcgat gccattgggt ggaccagatg acaacccact ctctgtgcca 10740

ctccgtcaag gcagccaagg actcacacct ggagaaggtg gagccatcat ggttctgaag 10800

cgtttggaag atgctgtgag ggatggtgat aggatctatg gcaccttgct tgggacaagt 10860

ctcagcaatg ctggttgtgg tttgccactt tcacctcacc tgccgtctga gaaaagctgc 10920

atggaggatt tgtacacgtc agttggcata gatccatctg aggttcagta tgtcgagtgt 10980

catgccaccg gaactccgca aggagatgtg gttgaagttg aggctctgag acattgcttc 11040

agaggcaaca ctgaccaccc accgaggatg ggttccacca aaggaaactt tggtcacacc 11100

ttggttgcag ctgggtttgc tggaatggcc aaagtgttgc tttccatgca gcatggcacg 11160

atcccaccca cgcctggtgt tgataggagc aactgcatag atccgctggt cgttgatgag 11220

gccataccct ggccttacag ctcagctcaa gcgagagctg gcaaacctgg agatgaattg 11280

aagtgtgctt ccctctcagc ctttggattt ggtggaacaa atgctcattg tgtgttcaga 11340

gaacacagac agattgctgc cactgcgaca gcgtctccgg tccttcctga agtcacccct 11400

ggacccattg caatcattgg gatggatgcg acgtttggca ccctcaaagg acttgatgcg 11460

tttgaacaag cgatctacaa aggcacggat ggagcatctg atctgccatc caagagatgg 11520

aggttccttg gtgctgacac agatttcttg actgcaatgg gtctggatgc agtcccgaga 11580

gggtgctatg tgagggatgt tgatgtggac tacaaaagac tcagaagtcc catgatccct 11640

gaagatgtcc tcagacccca acagcttctg gcagttgcca cgatggatag ggcacttcaa 11700

gatgctggca tggccacggg tggaaaagtt gctgtcctgg tggggttggg cactgacact 11760

gagctttaca gacaccgtgc aagggtgaca ctcaaggaaa ggcttgaccc agcagctttc 11820

tcccctgaac aagttcaaga aatgatggat tacatcaatg attgtggaac ctcaaccagc 11880

tacacttctt acattgggaa tcttgtggcc accagagttt cctcacagtg gggattcact 11940

ggtccttctt tcacggtcac tgaaggtgca aactcagtct atcgttgcct tgagctggga 12000

aagttccttt tggacaccca ccaagtggat gcagttgtgg ttgctggagt tgatctctgt 12060

gcaactgctg agaaccttta cctcaaggca agaaggtctg ccataagcag acaagaccat 12120

ccacgtgcca actttgaggc ttctgctgat ggatactttg ctggagaggg cagtggtgct 12180

ctggtcttga agaggcaagc tgatgttggc tcagatgaca aggtctatgc cagtgttgct 12240

ggcctcacat gtgcagcgca gcctgctgaa gcagtttctc ctcttctcct tcaagttcac 12300

aatgatgaca atgagaaaag ggttgtggag atggtggaac tcgcagctga ctctggtcgt 12360

catgctcccc acttggccaa ctctcctttg agtgctgaat cacagcttga gcaagtgtct 12420

aaactcttgg ctcatcaagt ccctggttca gtcgcgattg gaagtgttcg tgccaatgtt 12480

ggagatgttg gatatgcgag tggtgcagct tctctcataa agactgcgct ttgcctccac 12540

aaccgttact tgcctgcaaa cccacagtgg gaaagacctg tggctccagt ctcagaggct 12600

cttttcacct gtccaaggtc ccgtgcttgg ctcaagaacc ctggtgagtc cagacttgct 12660

gcagtggcca gtgcttctga gagtgggtct tgctttggag tgcttctcac agatgagtat 12720

gccacacatg agtccagcaa cagattgtca ttggatgacg ctgcacccaa actcatagcg 12780

attcgtggag acactgttga tgacatcatg gcaaaagtca atgctgaact tgcgttgctc 12840

cgtgctcatg cagaaactgg gtctgccact gacgatgacc cagctgcagc tgttgctttc 12900

actgctcatc gtttgaggtt cttgaggctt gttggtgaaa cagttgccag tcacggtgcc 12960

acagcgacct tgtgtttggc tctgctcaca actccagaaa agctggagaa agaattggag 13020

ttggcagcca agggtgttcc aagatcagcc aaggctggca gaaactggat gtcaccatct 13080

ggttctgctt ttgcaccaac acctgtcacc agtgatcgtg ttgcgttcat gtatggtgaa 13140

gggaggtctc cctactatgg tgttgggttg gaccttcaca gactctggcc tgctttgcat 13200

gagaggatca atgacaagac agctgcactt tgggagaatg gagactcctg gctcatgccc 13260

agagcggttg atgctgactc tcagagggct gtccagacgg cttttgatgc tgaccagata 13320

gagatgttta ggacgggaat ctttgtttcc atttgcctca cagactatgc tcgtgatgtc 13380

cttggagtcc aacccaaggc ttgctttgga ctctcccttg gagaaatctc catgctcttt 13440

gcactttcaa ggagaaactg tggactttct gaccagctca ctcagaggct cagaacctct 13500

ccggtctgga gcacacagct tgctgtggag ttccaagcct tgaggaaact ttggaatgtc 13560

cctgctgatg ctccagttga gtccttctgg caaggctact tggttcgtgc cagcagagca 13620

gagattgaaa aggccattgg accggacaac agatttgttc gtttgctcat tgtcaacgac 13680

tccagcagtg ccctcattgc tggcaaacct gctgagtgtc tgagggtgct tgagcgtctt 13740

ggaggtcgtt tgccacccat gccagtcaag caaggcatga ttgggcactg cccagaagtg 13800

gctccctata ctcctggaat agctcacatc cacgaaatct tggagattcc tgacagccct 13860

gtcaagatgt atacctcagt caccaatgct gagctgagag gaggcagcaa ctcttccatc 13920

acagagttcg ttcagaagtt gtacaccaga atagcggatt tccctggcat tgttgacaag 13980

gtcagccgtg atggccatga tgttttcgtg gaagttggtc cgaataacat gaggtcagca 14040

gctgtcagtg acattcttgg gaaggctgca actcctcatg tcagtgtggc tcttgatcgt 14100

ccaagtgagt cagcttggac acagacactc aaatctcttg ccctgctcac tgcccacaga 14160

gtgcctcttc acaacccgac tctctttgcg gatctttacc acccaacctt cctcacagcc 14220

atagattctg caatgcaaga accacctccc aagcccaaca gattcctgag gtctgttgaa 14280

gtcaatggtt acttctgccc tgatggcata agcaaacaag ttgcagctgc aagtgccaaa 14340

cccagcacac attgcatggt tcgtctccat ccagccaaag ctgttgtggt tgcagctgcc 14400

ggagctgtgg ttgctgattc aacaccggtt gtcaaagcca agcagacttc ctcatctttg 14460

cttgttggag acgatgcctt cctcagatgc tatgatgtgg attggcctct ctacatggga 14520

gcgatggctg aaggaatctc ctctgttgac cttgtggttg cagctgcaga agctaggatg 14580

cttgcatcat ttggagcagc gaggcttccg atggatcaag ttgaactcca gatccgtgag 14640

atccaacaga gaacctccaa tgcctttgct gtcaacctca tgcctggtcc tgatgaagct 14700

gcaacggtgg atgcccttct gagaacggga gtcagcattg tggaggcgtc tggttacacg 14760

ggtgcgctct ctgcggatct ggtgagatac cgtgtgaccg gtctcagaag gacctcctgt 14820

ggtgcttctg tgtcagcgac tcaccgtgtt gtggccaaag tttcaagaac tgaggtggct 14880

gaacatttcc tgagaccagc acctgcagct gttcttgagg ctttggtggc agccaaacaa 14940

atcactcctg agcaagctgc gcttgccagc agagtcgcga tggctgacga tgtcgcggtg 15000

gaggcagatt ctggagggca cactgacaac cgtccaatcc atgtgctcct tcctttggtt 15060

gtggctcaga ggaacagatg gaggcatctg gttgacacgc cagtgcgtgt gggagctgga 15120

ggtgggatag catgtccgag agcagcgttg cttgccttct ccttgggtgc agcctttgtg 15180

gtcactggaa gtgtcaacca gcttgctcgt gaagctggga cctctgatgc agtcagactc 15240

cttttggcga ctgccaccta tagtgatgtg gcgatggctc ctggtggagt ccaagtgttg 15300

aagaaacaaa ccatgttcgc tgcgagagca acgatgttgg ctcagctcca agccaagttt 15360

ggttcctttg atgctgtgcc agaaccgcaa ctgagaaaac tggagagatc agtgttcaag 15420

cagagtgttg ctgatgtttg ggcagctgca agggaaaagt ttggggttga tgccacggct 15480

gcaagtccgc aagagaggat ggctctctgt gtcagatggt acatgtctca aagctcacgt 15540

tgggcaacag aggccacttc agcaaggaaa gcggactatc agatttggtg tggtcctgca 15600

ataggcagct tcaatgactt cgtcagaggc accaaacttg atgccacggc tgggactggt 15660

gagttcccga gagttgtgga catcaaccag cacatcttgc tgggagcctc tcattacaga 15720

agggttcaac agcaacagca agacgatgac gttgagtaca tcattgtttg agtagttagc 15780

ttaatcactt aggtcaccca gtccaagccc ggcctagcac gatgatcatg agtgttgcta 15840

ttgatgtatg ttaatactat acacagtcat cgtgtgtgtt ttataaaact gtaagcttag 15900

gatgtttgag gctaatgtaa ttagcactac accgtaataa atgagaggtt tactttatgt 15960

tttaataatg ttcttaccct tgctgctctc taaactgtaa tggcgtacgg ttagctaaac 16020

taaagtaaaa atcgattcgc ttgagtaaaa ttagtgaccg ggaaagatca tcgactacta 16080

ctgctcagag atgtaatcgg taattaagac ttcaagctca ataattaatt aggagtaaat 16140

ctggcttcga atttttaaat tgtcaacttc caaagaagga ttggcaagac tcaatctcaa 16200

ttgcccaaca aacatatggc tctttacaaa tttggaatct ctttttgatg gcaagaacgt 16260

cgtaattcct ctgtcgatct catgtaatta ccaaactcat ctacttatta ctttctttat 16320

atgcacttac tgatgcggcc gcttaattaa tctgacctga ccactagacc tgagtgagta 16380

cagatgtgct actagtgcta gcctcgaggt cgaccaactt ttctatacaa agttgtctag 16440

acctaggact aggcactgag tgactcactg acctgactga gtgactggcg gccgcagctt 16500

atagtaaaga tttttttgtt aataaaatga aagttaatat ttatggattt atttgaacat 16560

atttacaagt ttttgttaat aaatttattt acagaagtgt taaatttgaa aatgtgttaa 16620

atgagagtta atatttatgg atataatatt actttattta aaaataaaat gaatttatat 16680

taaaatatga tttggtaaaa gatattataa agaggaactt ggatgagaaa gacgacgatg 16740

ggcaaaagtt gcatggcaca ccgcttttgt tcagtaacat ctgcactgtg gcgccttttt 16800

cacactcacc atgcatgctg ccacgtcagc tttcacacta tgacaccact ggccatacac 16860

gttgccacct cagctttctc ctcttctcac tatgacacga ctggccatgc atgcatgcat 16920

gctgccacct cagctcccgc ctcttcaccc gtgtctttct ctcatgtcgc agtgctgcgt 16980

gccaacctct tctctctata aatagagaga agagaatgat ggttaaactc aaaccaaaac 17040

aagaaaacat acacaaatag caaaacggat ccacaaccaa aaatgacatc ttcaaagaaa 17100

actcctgttt gggaaatgag caaggaagag ctgttggatg gcaagacggt tgtctttgac 17160

tacaacgagc tgttggagtt tgcggagggt gatgttggtc aagtgtttgg accagagttt 17220

gacatcattg acaagtacag aaggcgtgtg aggcttccag ccagagaata cttgcttgtt 17280

tcaagagtga ctctcatgga tgccgaggtg aataacttca gagttggctc cagaatggtc 17340

actgagtatg atgttccagt caatggtgag ttgtcagagg gaggtgatgt tccctgggca 17400

gttcttgttg aaagtgggca gtgtgacttg atgctcatct cctacatggg gattgacttc 17460

cagtgcaaag gggaccgtgt ttacagattg ctcaacacat ctctcacctt ctttggggtt 17520

gcccatgaag gagaaaccct tgtgtatgac atcagagtca ctggtttcgc caagggtgct 17580

ggtggggaaa tctcaatgtt ctttttcgag tatgactgct ttgttgatgg cagattgctc 17640

atagagatga gagatggttg tgctggcttc tttactgatg ccgaacttgc cgctggaaaa 17700

ggtgtgctca aaacgaaggc tgagcttgct gcacgtgctc agatccagaa acaagacatt 17760

gcaccctttg cacctgcacc gtgcagtcac aaaaccagct tggatgccag agaaatgaga 17820

ctgcttgttg ataggcaatg ggcaagggtc tttggttctg gaatggctgg catagactac 17880

aagttgtgtg cgagaaagat gctgatgatt gacagagtca cacaccttga tccgcgtgga 17940

ggtgctcacg gtcttgggct tctcattggg gagaaagtgc ttgagaggga ccactggtac 18000

ttcccctgcc actttgtgag ggatgaggtc atggctggtt ctcttgtctc agatggatgc 18060

tctcagcttc tcaaggttta catgttgtgg cttggccttc acaccactgt tggtgcgttc 18120

gactttcgtc cagtcagtgg tcatgccaac aaagtgaggt gtcgtggaca gatttcaccg 18180

cacaagggga aacttgttta tgtcatggag atcaaagaaa tgggctttga tgccaaaact 18240

ggagatccat ttgccatagc tgatgttgac atcattgatg tcaactttga agagggacaa 18300

gcgtttgctg gagttgagga tcttcacagc tatggccaag gagatttgag gaaaaagata 18360

gttgtggatt tcaagggaat tgcgttgtca ctgcagaaaa ggaaggagca acagaaagag 18420

agcatgactg tcaccactac gaccacgaca accagcagag tgattgctcc tccaagtgga 18480

tgcctcaaag gtgatcccac tgctcccacc tctgtcacgt ggcatccaat ggctgaggga 18540

aatggaggtc ctggacccac tccgtccttc tctccttcag cgtatcctcc cagagctgtt 18600

tgcttctctc ctttccccaa caatccgctt gacaatgatc atacacctgg ccaaatgccg 18660

ttgacctggt tcaacatgtc tgagttcatg tgtggaaaag tgagcaactg cttgggtcct 18720

gagtttgcca gatttgatgc ttccaagaca tccagatcac cagcttttga cctggctctt 18780

gtgacaaggg tgacgagtgt ggctgacatg gaacatggtc ctttctacaa tgtggatgtc 18840

aaccctggcc aaggcacgat ggtgggtgag tttgattgtc ctgcagatgc ttggttcttt 18900

ggagcctcaa gcagagacga tcacatgccg tacagcatct tgatggagat tgctcttcag 18960

acttctggag tcctcacatc tgtgctcaaa gctccgctca caatggacaa agatgacatc 19020

cttttcagaa accttgatgc agatgcagaa cttgtgggtg atgccatgcc tgatgtcaga 19080

gggaaaacca taaggaactt caccaaatgc acgggatact ccatgcttgg caagatggga 19140

atccatcgtt tcaccttcga actctctgtt gacggagcag ttttctacaa agggagcacc 19200

tcttttggtt ggtttgttcc tgaggtcttt gagagccaga ctggattgga caatggcaag 19260

ccgaggttgc cttggtatag ggaaaacaat gtggcagtgg acacactctc agcacctgcg 19320

tcagcttcta gtgcccaagg tcagcttcag cttcagagga gagggtcaca agcgcagttc 19380

ctggacacaa ttcatcttgc tgggagtgga gctggagtgc atggccaagg ttatgctcat 19440

ggggagaaag ctgtgaacaa gcaagattgg ttcttttctt gccatttctg gtttgaccca 19500

gtgatgcctg ggtctttggg aattgagtcc atgttccagc ttgtggaagc gtggtgtgtc 19560

aaacaaggct tggctgcaag gcatggaatt gctcatccag tctttgcaca tgcacctggt 19620

gccaccagct ggaagtacag aggtcagttg accccaaaga atgacagaat ggacagtgaa 19680

gttcacatca agagtgttgc tgccttctcc tcatgggttg atgtggttgc tgatgggttc 19740

ctcttcgttg atggcctcag agtctattca gcagacaacc tgagggtcag aatccagact 19800

ggagctggcc atgttgaaga gcaagaagtt gctgccaaag ccaccacaaa gaactccagc 19860

attgctgatg tggatgtggc tgatcttcaa gctctcaaac aagcgttgct gacactggag 19920

agaccattgc agttggatgc tggaagtgag gtgccagcct gtgctgtcag cgatttggga 19980

gaccgtggat tcatggagac ttatggggtg gttgctccgt tgtacagtgg tgcgatggcc 20040

aagggaatag cctctgcgga tctggtcata gcaatgggtc agaggaagat gttggggagc 20100

tttggagctg gtgggttgcc aatgcacgtt gtccgtgctg ggattgaaaa gatccaagct 20160

gcacttcccg ctggtccgta tgctgtcaac ctcatccact caccgttcga tgccaacctg 20220

gaaaagggca atgttgatct tttcctggaa aagggagttc gtgtggttga ggcgtctgcc 20280

ttcatggaac tcacaccaca agtggtccgt tacagagcca cgggactctc cagagatgcg 20340

agaggtggct cagtgaggac agcacacaag atcataggaa aggtttccag aacagagctt 20400

gcggagatgt tcatcagacc tgcacctcaa gcaattctgg acaaacttgt tgcgtctggt 20460

gaaatcaccc ctgagcaagc tgcgttggct cttgaagttc caatggctga tgacattgca 20520

gttgaggctg acagtggagg gcacactgac aaccgtccca ttcatgtcat tctgccgttg 20580

atcctcagtc tgaggaatag gctccagagg gaactcaagt accctgccag acaccgtgtt 20640

agggttggtg ctggtggagg cataggttgt cctcaagctg cacttggagc cttccacatg 20700

ggagctgcgt ttgttgtgac tggcactgtc aaccagctgt cccgtcaagc tggaacatgt 20760

gacaacgtga ggcgtcagct ctctcgtgcc acttactctg acatcacgat ggcaccagct 20820

gcagacatgt ttgaacaagg agttgaactg caagttctca agaaaggaac gatgttccca 20880

tctcgtgcca agaaactctt tgaactgttc cacaagtatg attcctttga agcaatgcct 20940

gcggatgaat tggctcgtgt tgagaagagg atcttctcca agtcccttgc agaagtttgg 21000

gcagagacca aagatttcta catcactcgt ctcaacaatc ctgaaaagat cagaaaggct 21060

gagaatgagg accccaagct caagatgtcc ctctgcttcc gttggtactt gggtctcagc 21120

tcattctggg caaacaatgg catagctgac cgtacgatgg attaccagat ttggtgtgga 21180

cctgccatag gagccttcaa cgatttcatt gcagacagct atcttgatgt tgcagtctct 21240

ggtgagttcc ctgatgttgt gcagatcaac cttcaaatcc tgtctggtgc tgcgtatctc 21300

cagagattgc tcagtgtcaa acttgcacca aggatagatg tggacactga agatgacctc 21360

ttcacctaca gaccagatca tgcactctga gtagttagct taatcactta ggtcacccag 21420

tccaagcccg gcctagcacg atgatcatga gtgttgctat tgatgtatgt taatactata 21480

cacagtcatc gtgtgtgttt tataaaactg taagcttagg atgtttgagg ctaatgtaat 21540

tagcactaca ccgtaataaa tgagaggttt actttatgtt ttaataatgt tcttaccctt 21600

gctgctctct aaactgtaat ggcgtacggt tagctaaact aaagtaaaaa tcgattcgct 21660

tgagtaaaat tagtgaccgg gaaagatcat cgactactac tgctcagaga tgtaatcggt 21720

aattaagact tcaagctcaa taattaatta ggagtaaatc tggcttcgaa tttttaaatt 21780

gtcaacttcc aaagaaggat tggcaagact caatctcaat tgcccaacaa acatatggct 21840

ctttacaaat ttggaatctc tttttgatgg caagaacgtc gtaattcctc tgtcgatctc 21900

atgtaattac caaactcatc tacttattac tttctttata tgcacttact gatgcggccg 21960

cttaattaat cacgagtgga tgactgtcac gactgactca tgactgacta ctagtgctag 22020

cctcgaggtc gacacaactt tgtataataa agttgtctag acctaggagc tgtgctgggt 22080

aactcacatg agtcactggt cacatcagcg gccgcagctt atagtaaaga tttttttgtt 22140

aataaaatga aagttaatat ttatggattt atttgaacat atttacaagt ttttgttaat 22200

aaatttattt acagaagtgt taaatttgaa aatgtgttaa atgagagtta atatttatgg 22260

atataatatt actttattta aaaataaaat gaatttatat taaaatatga tttggtaaaa 22320

gatattataa agaggaactt ggatgagaaa gacgacgatg ggcaaaagtt gcatggcaca 22380

ccgcttttgt tcagtaacat ctgcactgtg gcgccttttt cacactcacc atgcatgctg 22440

ccacgtcagc tttcacacta tgacaccact ggccatacac gttgccacct cagctttctc 22500

ctcttctcac tatgacacga ctggccatgc atgcatgcat gctgccacct cagctcccgc 22560

ctcttcaccc gtgtctttct ctcatgtcgc agtgctgcgt gccaacctct tctctctata 22620

aatagagaga agagaatgat ggttaaactc aaaccaaaac aagaaaacat acacaaatag 22680

caaaacggat ccacaaccaa aaatgcttca gcacacttgg cttccgaagc ctcccaatct 22740

gaccctcttg tcagatgagg ttcatctctg gaggattcct cttgaccagc ctgagtcaca 22800

acttcaagac cttgctgcca ccctgagcag tgatgaattg gcgagggcaa acagattcta 22860

ctttccagaa cacagaaggc gtttcactgc tgggagaggc atcctcagat ccatcttggg 22920

tggatacttg ggagtggaac cgggtcaagt caagtttgat tatgagtccc gtgggaaacc 22980

gatccttggt gacagatttg ctgagagtgg actcctgttc aacttgtctc acagccagaa 23040

ccttgccttg tgtgctgtca actacacgcg tcaaataggc attgatcttg aatatctgcg 23100

tccaacatct gacttggagt ctcttgcaaa gaggttcttt ctcccaagag aatatgaact 23160

cttgaggtca ctccctgatg agcagaaaca gaagattttc tttcgttact ggacttgcaa 23220

agaggcttat ctcaaagcaa cgggagatgg aatagccaaa cttgaagaga tcgagatagc 23280

actcacccca acagaacctg ccaagctcca aacagctcct gcgtggtctc tgttggagct 23340

tgtgccagat gacaattgtg ttgcagctgt ggctgttgcg ggttttggtt ggcagcccaa 23400

gttctggcat tactgagtag ttagcttaat cacttaggtc acccagtcca agcccggcct 23460

agcacgatga tcatgagtgt tgctattgat gtatgttaat actatacaca gtcatcgtgt 23520

gtgttttata aaactgtaag cttaggatgt ttgaggctaa tgtaattagc actacaccgt 23580

aataaatgag aggtttactt tatgttttaa taatgttctt acccttgctg ctctctaaac 23640

tgtaatggcg tacggttagc taaactaaag taaaaatcga ttcgcttgag taaaattagt 23700

gaccgggaaa gatcatcgac tactactgct cagagatgta atcggtaatt aagacttcaa 23760

gctcaataat taattaggag taaatctggc ttcgaatttt taaattgtca acttccaaag 23820

aaggattggc aagactcaat ctcaattgcc caacaaacat atggctcttt acaaatttgg 23880

aatctctttt tgatggcaag aacgtcgtaa ttcctctgtc gatctcatgt aattaccaaa 23940

ctcatctact tattactttc tttatatgca cttactgatg cggccgctta attaactact 24000

gtcactgagg ccgtagacga gtacggactg atctaactag tgctagcctc gaggtcgaca 24060

cccagctttc ttgtacaaag tggttgcggc cgcttaatta aatttaaatt caattaatgc 24120

aatcttgatt ttcaacaacg aaggtaatgg cgtaaaagaa aaaatgtatg ttattgtatt 24180

gatctttcat gatgttgaag cgtgccataa tatgatgatg tataattaaa atattaactg 24240

tcgcatttta ttgaaatggc actgttattt caaccatatc tttgattctg ttacatgaca 24300

cgactgcaag aagtaaataa tagacgccgt tgttaaagaa ttgctatcat atgtgcctaa 24360

ctagagggaa tttgagcgtc agacctaatc aaatattaca aaatatctca ctctgtcgcc 24420

agcaatggtg taatcagcgc agacaaatgg cgtaaagatc gcggaaaaac ctccccgagt 24480

ggcatgatag ctgcctctgt attgctgatt tagtcagcct tatttgactt aagggtgccc 24540

tcgttagtga caaattgctt tcaaggagac agccatgccc cacactttgt tgaaaaacaa 24600

attgcctttg gggagacggt aaagccagtt gctcttcaat aaggaatgtc gaggaggcaa 24660

tgtaaccgcc tctggtagta cacttctcta atccaaaaat caatttgtat tcaagatacc 24720

gcaaaaaact tatggtttaa accctgcagg actagtccag aaggtaatta tccaagatgt 24780

agcatcaaga atccaatgtt tacgggaaaa actatggaag tattatgtaa gctcagcaag 24840

aagcagatca atatgcggca catatgcaac ctatgttcaa aaatgaagaa tgtacagata 24900

caagatccta tactgccaga atacgaagaa gaatacgtag aaattgaaaa agaagaacca 24960

ggcgaagaaa agaatcttga agacgtaagc actgacgaca acaatgaaaa gaagaagata 25020

aggtcggtga ttgtgaaaga gacatagagg acacatgtaa ggtggaaaat gtaagggcgg 25080

aaagtaacct tatcacaaag gaatcttatc ccccactact tatcctttta tatttttccg 25140

tgtcattttt gcccttgagt tttcctatat aaggaaccaa gttcggcatt tgtgaaaaca 25200

agaaaaaatt tggtgtaagc tattttcttt gaagtactga ggatacaact tcagagaaat 25260

ttgtaagttt gtaggtacca gatctggatc ccaaaccatg tctccggaga ggagaccagt 25320

tgagattagg ccagctacag cagctgatat ggccgcggtt tgtgatatcg ttaaccatta 25380

cattgagacg tctacagtga actttaggac agagccacaa acaccacaag agtggattga 25440

tgatctagag aggttgcaag atagataccc ttggttggtt gctgaggttg agggtgttgt 25500

ggctggtatt gcttacgctg ggccctggaa ggctaggaac gcttacgatt ggacagttga 25560

gagtactgtt tacgtgtcac ataggcatca aaggttgggc ctaggatcta cattgtacac 25620

acatttgctt aagtctatgg aggcgcaagg ttttaagtct gtggttgctg ttataggcct 25680

tccaaacgat ccatctgtta ggttgcatga ggctttggga tacacagccc ggggtacatt 25740

gcgcgcagct ggatacaagc atggtggatg gcatgatgtt ggtttttggc aaagggattt 25800

tgagttgcca gctcctccaa ggccagttag gccagttacc caaatctgag tagttagctt 25860

aatcacctag agctcgatcg gcggcaatag cttcttagcg ccatcccggg ttgatcctat 25920

ctgtgttgaa atagttgcgg tgggcaaggc tctctttcag aaagacaggc ggccaaagga 25980

acccaaggtg aggtgggcta tggctctcag ttccttgtgg aagcgcttgg tctaaggtgc 26040

agaggtgtta gcgggatgaa gcaaaagtgt ccgattgtaa caagatatgt tgatcctacg 26100

taaggatatt aaagtatgta ttcatcacta atataatcag tgtattccaa tatgtactac 26160

gatttccaat gtctttattg tcgccgtatg taatcggcgt cacaaaataa tccccggtga 26220

ctttctttta atccaggatg aaataatatg ttattataat ttttgcgatt tggtccgtta 26280

taggaattga agtgtgcttg aggtcggtcg ccaccactcc catttcataa ttttacatgt 26340

atttgaaaaa taaaaattta tggtattcaa tttaaacacg tatacttgta aagaatgata 26400

tcttgaaaga aatatagttt aaatatttat tgataaaata acaagtcagg tattatagtc 26460

caagcaaaaa cataaattta ttgatgcaag tttaaattca gaaatatttc aataactgat 26520

tatatcagct ggtacattgc cgtagatgaa agactgagtg cgatattatg gtgtaataca 26580

taggaattcg tttaaacgat ctgcgtctaa ttttcggtcc aacttgcaca ggaaagacgt 26640

cgaccgcggt agctcttgcc cagcagactg ggcttccagt cctttcgctc gatcgggtcc 26700

aatgttgtcc tcagctgtga accggaagcg gacgaccaac agtggaagaa ctgaaaggaa 26760

cgagccgtct ataccttgat gatcggcctc tggtgaaggg tatcatcgca gccaagcaag 26820

ctcatgaaag gctgatgggg gaggtgtata attatgaggc ccacggcggg cttattcttt 26880

agggaggatc tatctcgttg ctcaagtgca tggcgcaaag cagttattgg agtgcggatt 26940

ttcgttggca tattattcgc cacgagttag cagacgaaga gaccttcatg aacgtggcca 27000

aggccagagt taagcagatg ttacgccctg ctgcaggcct ttctattatc caatagttgg 27060

ttgatctttg gaaagagcct cggctgaggc ccatactgaa agagatcgat ggatatcgat 27120

atgccatgtt gtttgctagc cagaaccaga tcacatccga tatgctattg cagcttgacg 27180

cagatatgga ggataagttg attcatggga tcgctcagga gtagctcatc catgcacgcc 27240

gacaagaaca gaaattccgt cgagttaacg cagccgctta cgacggattc gaaggtcatc 27300

cattcggaat gtattagttt gcaccagctc cgcgtcacac ctgtcttcat ttgaataaga 27360

tgttagcaat tgtttttagc tttgtcttgt tgtggcaggg cggcaagtgc ttcagacatc 27420

attctgtttt caaattttat gctggagaac agcttcttaa ttcctttgga aataatagac 27480

tgcgtcttaa aattcagatg tctggatata gatatgattg taaaataacc tatttaagtg 27540

tcatttagaa cataagtttt atgaatgttc ttccattttc gtcatcgaac gaataagagt 27600

aaatacacct tttttaacat tacaaataag ttcttatacg ttgtttatac accgggaatc 27660

atttccatta ttttcgcgca aaagtcacgg atattcgtga aagcgacata aactgcgaaa 27720

tttgcgggga gtgtcttgag tttgcctcga ggctagcgca tgcacataga cacacacatc 27780

atctcattga tgcttggtaa taattgtcat tagattgttt ttatgcatag atgcactcga 27840

aatcagccaa ttttagacaa gtatcaaacg gatgtgactt cagtacatta aaaacgtccg 27900

caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa tttgatttac aattgaatat atcctgcccc 27960

agccagccaa cagctcgatt tacaattgaa tatatcctgc cggccggccc acgcgtgtcg 28020

aggaattctg atctggcccc catttggacg tgaatgtaga cacgtcgaaa taaagatttc 28080

cgaattagaa taatttgttt attgctttcg cctataaata cgacggatcg taatttgtcg 28140

ttttatcaaa atgtactttc attttataat aacgctgcgg acatctacat ttttgaattg 28200

aaaaaaaatt ggtaattact ctttcttttt ctccatattg accatcatac tcattgctga 28260

tccatgtaga tttcccggac atgaagccat ttacaattga atatatcctg ccgccgctgc 28320

cgctttgcac ccggtggagc ttgcatgttg gtttctacgc agaactgagc cggttaggca 28380

gataatttcc attgagaact gagccatgtg caccttcccc ccaacacggt gagcgacggg 28440

gcaacggagt gatccacatg ggacttttaa acatcatccg tcggatggcg ttgcgagaga 28500

agcagtcgat ccgtgagatc agccgacgca ccgggcaggc gcgcaacacg atcgcaaagt 28560

atttgaacgc aggtacaatc gagccgacgt tcacgcggaa cgaccaagca agcttggctg 28620

ccatttttgg ggtgaggccg ttcgcggccg aggggcgcag cccctggggg gatgggaggc 28680

ccgcgttagc gggccgggag ggttcgagaa gggggggcac cccccttcgg cgtgcgcggt 28740

cacgcgcaca gggcgcagcc ctggttaaaa acaaggttta taaatattgg tttaaaagca 28800

ggttaaaaga caggttagcg gtggccgaaa aacgggcgga aacccttgca aatgctggat 28860

tttctgcctg tggacagccc ctcaaatgtc aataggtgcg cccctcatct gtcagcactc 28920

tgcccctcaa gtgtcaagga tcgcgcccct catctgtcag tagtcgcgcc cctcaagtgt 28980

caataccgca gggcacttat ccccaggctt gtccacatca tctgtgggaa actcgcgtaa 29040

aatcaggcgt tttcgccgat ttgcgaggct ggccagctcc acgtcgccgg ccgaaatcga 29100

gcctgcccct catctgtcaa cgccgcgccg ggtgagtcgg cccctcaagt gtcaacgtcc 29160

gcccctcatc tgtcagtgag ggccaagttt tccgcgaggt atccacaacg ccggcggccg 29220

cggtgtctcg cacacggctt cgacggcgtt tctggcgcgt ttgcagggcc atagacggcc 29280

gccagcccag cggcgagggc aaccagcccg gtgagcgtcg gaaagggtcg acggatcttt 29340

tccgctgcat aaccctgctt cggggtcatt atagcgattt tttcggtata tccatccttt 29400

ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa 29460

cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc 29520

actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg 29580

gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg atgaaaccaa gccaaccagg 29640

aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg aacgaagagc gattgaggaa 29700

aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg gcctacctgc tggccgtcgg ccagggctac 29760

aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc tggcccgcat caatggcgac 29820

ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg acgacccgcg cacggcgcgg 29880

ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg aagagaagca ggacgagctt 29940

ggcaaggtca tgatgggcgt ggtccgcccg agggcagagc catgactttt ttagccgcta 30000

aaacggccgg ggggtgcgcg tgattgccaa gcacgtcccc atgcgctcca tcaagaagag 30060

cgacttcgcg gagctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga 30120

cggccagacg gtctacggga ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa 30180

ggcaccaggc gggtcaaatc aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat 30240

cccgcaagga gggtgaatga atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat 30300

cgacgcgggg ttttccgccg aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc 30360

gccccgcgaa accttccagt ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga 30420

gcgcgacagc gtgcaactgg ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg 30480

ttcgcgtcgt ctcgaacagg aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg 30540

aggaactatg acgaccaaga agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag 30600

cgaggccaag caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct 30660

ttccttgttc gatattgcgc cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc 30720

ccgctctgcc ctgttcacca cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa 30780

ggtcattttc cacgtcaaca aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc 30840

cgacgatgac gaactggtgt ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg 30900

cgagccgatc accttcacgt tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg 30960

ccggtattac acgaaggccg aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt 31020

cacgtccgac cgcgttgggc acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct 31080

ggaccgtggc aagaaaacgt cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct 31140

gtttgctggc gaccactaca cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac 31200

ggcccgacgg atgttcgact atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga 31260

aaccttccgc ctcatgtgcg gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt 31320

cggcgaagcc tgcgaagagt tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga 31380

tgacctggtg cattgcaaac gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc 31440

agccagcgct ttactggcat ttcaggaaca agcgggcact gctcgacgca cttgcttcgc 31500

tcagtatcgc tcgggacgca cggcgcgctc tacgaactgc cgataaacag aggattaaaa 31560

ttgacaattg tgattaaggc tcagattcga cggcttggag cggccgacgt gcaggatttc 31620

cgcgagatcc gattgtcggc cctgaagaaa gctccagaga tgttcgggtc cgtttacgag 31680

cacgaggaga aaaagcccat ggaggcgttc gctgaacggt tgcgagatgc cgtggcattc 31740

ggcgcctaca tcgacggcga gatcattggg ctgtcggtct tcaaacagga ggacggcccc 31800

aaggacgctc acaaggcgca tctgtccggc gttttcgtgg agcccgaaca gcgaggccga 31860

ggggtcgccg gtatgctgct gcgggcgttg ccggcgggtt tattgctcgt gatgatcgtc 31920

cgacagattc caacgggaat ctggtggatg cgcatcttca tcctcggcgc acttaatatt 31980

tcgctattct ggagcttgtt gtttatttcg gtctaccgcc tgccgggcgg ggtcgcggcg 32040

acggtaggcg ctgtgcagcc gctgatggtc gtgttcatct ctgccgctct gctaggtagc 32100

ccgatacgat tgatggcggt cctgggggct atttgcggaa ctgcgggcgt ggcgctgttg 32160

gtgttgacac caaacgcagc gctagatcct gtcggcgtcg cagcgggcct ggcgggggcg 32220

gtttccatgg cgttcggaac cgtgctgacc cgcaagtggc aacctcccgt gcctctgctc 32280

acctttaccg cctggcaact ggcggccgga ggacttctgc tcgttccagt agctttagtg 32340

tttgatccgc caatcccgat gcctacagga accaatgttc tcggcctggc gtggctcggc 32400

ctgatcggag cgggtttaac ctacttcctt tggttccggg ggatctcgcg actcgaacct 32460

acagttgttt ccttactggg ctttctcagc ccccgagcgc ttagtgggaa tttgtacccc 32520

ttatcgaacc gggagcacag gatgacgcct aacaattcat tcaagccgac accgcttcgc 32580

ggcgcggctt aattcaggag ttaaacatca tgagggaagc ggtgatcgcc gaagtatcga 32640

ctcaactatc agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg 32700

tacatttgta cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc 32760

tggttacggt gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt 32820

tggaaacttc ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg 32880

ttgtgcacga cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag 32940

aatggcagcg caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc 33000

tggctatctt gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg 33060

aggaactctt tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa 33120

cgctatggaa ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt 33180

cccgcatttg gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact 33240

gggcaatgga gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt 33300

atcttggaca agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcact 33360

acgtgaaagg cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg tctaacaatt cgttcaagcc 33420

gacgccgctt cgcggcgcgg cttaactcaa gcgttagaga gctggggaag actatgcgcg 33480

atctgttgaa ggtggttcta agcctcgtct tgcgatggca tttcgatcca ttcccattcc 33540

gcgctcaaga tggcttcccc tcggcagttc atcagggcta aatcaatcta gccgacttgt 33600

ccggtgaaat gggctgcact ccaacagaaa caatcaaaca aacatacaca gcgacttatt 33660

cacacgagct ca 33672

<210> 17

<211> 34011

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pDAB101496

<400> 17

aattacaacg gtatatatcc tgccagtcag catcatcaca ccaaaagtta ggcccgaata 60

gtttgaaatt agaaagctcg caattgaggt ctacaggcca aattcgctct tagccgtaca 120

atattactca ccggatccta accggtttaa ttaaggcgcg ccatgcccgg gcaagcggcc 180

gcacaagttt gtacaaaaaa gcaggcttct agacctaggc tcagcaactc atccagtcaa 240

gttcgagtca gtgagttggg cggccgcagc ttatagtaaa gatttttttg ttaataaaat 300

gaaagttaat atttatggat ttatttgaac atatttacaa gtttttgtta ataaatttat 360

ttacagaagt gttaaatttg aaaatgtgtt aaatgagagt taatatttat ggatataata 420

ttactttatt taaaaataaa atgaatttat attaaaatat gatttggtaa aagatattat 480

aaagaggaac ttggatgaga aagacgacga tgggcaaaag ttgcatggca caccgctttt 540

gttcagtaac atctgcactg tggcgccttt ttcacactca ccatgcatgc tgccacgtca 600

gctttcacac tatgacacca ctggccatac acgttgccac ctcagctttc tcctcttctc 660

actatgacac gactggccat gcatgcatgc atgctgccac ctcagctccc gcctcttcac 720

ccgtgtcttt ctctcatgtc gcagtgctgc gtgccaacct cttctctcta taaatagaga 780

gaagagaatg atggttaaac tcaaaccaaa acaagaaaac atacacaaat agcaaaacgg 840

atccacaacc aaaaatggat accagaattg ccattgtggg aatgagtgcg atccttccga 900

gtggtgagaa tgttagagag agctgggagg ccatcagaga tggcttggat tgtctgtctg 960

atctgcctgc ggatcgtgtg gatgtgactg cctattacaa tccagagaaa acgaccaagg 1020

acaaaatcta ctgcaaaaga ggtgggttca tccctgagta tgactttgat gctcgtgagt 1080

ttggcctcaa catgttccag atggaagatt ctgatgcgaa ccagaccatc tcattgctca 1140

aggtgaagga agctctcacc gatgccaaca tacctgcttt ctcaagtggc aaaaagaaca 1200

ttggttgtgt tcttggcata ggtggaggtc agaaggcgtc acatgagttc tactccagac 1260

tcaactatgt tgtggttgac aaagtgctca gaaagatggg tttgccagag gaagatgtgg 1320

cagctgcggt ggacaagtac aaggcgagct tcccagagtg gaggcttgat tcttttcctg 1380

gtttcttggg caatgttacc gctggcagat gttgcaacac cttcaacatg gagggcatga 1440

actgtgtcgt tgacgctgcc tgtgcttcaa gcctgattgc ggtcaaggtg gcaatagaag 1500

agcttctcta tggtgactgt gatgccatga ttgctggtgc cacctgcaca gacaattcaa 1560

tagggatgta catggccttc tccaagacgc ctgttttctc tacggacccg agtgtcaaag 1620

cgtatgatgc tgccaccaaa ggcatgttga ttggtgaagg atctgcgatg cttgttctga 1680

agagatatgc ggatgctgtc agagatggtg acactgttca tgctgtcatc aagggctgtg 1740

cttcctcaag tgatggaaaa gcagctggaa tctacacacc gacaatcagc ggacaagaag 1800

aggctctccg tagagcctat gcacgtgcca atgtggaccc agccactgtc actcttgttg 1860

aaggacatgg aactggcact ccggttgggg acaagattga actcacagct ctgagcaatc 1920

tcttctccaa agcgttttct gcgaatggag gtggagctga ggaagctgag caagttgctg 1980

ttggcagcat caagagccag atagggcacc tcaaagcggt tgctggattg gctggattgg 2040

tcaaagtggt ccttgctctc aagcacaaga cattgcctca gacgatcaat gtggacaagc 2100

caccttcact ggtggatggg acaccgattc aacagtcccc tttgtacgtc aacaccatga 2160

accgtccctg gttcactccg gttggggttc cgaggagagc tggcgtttcc tcatttggtt 2220

ttggaggtgc gaactaccat gctgtgcttg aagagtttga acctgaacat gagagtgctt 2280

accgttacaa caatcttccc caagttgctc tccttcatgc tggggatgtt gcaactcttg 2340

ctgccacagt tagggcaaaa ctggcattgg ccactgctga gcaagaagag gctagagttg 2400

tgaagaacgc tgattacatt gcataccata ggttccttga tgaatgtaag ttgagaggag 2460

ctgttcccca agcccacgca agggttggac ttctggtgag ggacctgtcc tctctcattg 2520

cggttttgga agcagctgca gccaaacttg ctggagaaga gtcagcaacg gaatggacgg 2580

tctcagttgc cactggtgag gctgcattca gagttagggg tgttgccaca gaggccaatg 2640

ttgctgcact tttctctggc caaggagcgc agtacactca catgttctca gatgttgcca 2700

tgaactggcc tccgttcaga gagagtgttg ctgcgatgga cagagcgcag agagaacgtt 2760

ttgggaggcc agccaaaaga gtctccagtg ttctctatcc gagaaaacct tatggagatg 2820

agccaaggca agatcacaaa gagatttctc agacgcgtta ctctcagcca gcaaccctcg 2880

cttgctctgt cggtgccttt gacatcttca aagcagctgg attggctcct tcttttgcag 2940

ctggacattc cctgggagag tttgcagctc tctatgcagc tggttcattg gatcgtgatg 3000

ctgtgtttga cttggtttgc gctagggcaa aggccatgtc tgatttcact gctcaagcca 3060

gctccagtgg aggtgctatg gcagcggtca taggagccaa ggctgatcag ctcagccttg 3120

gtggagcacc tgatgtttgg ctggccaata gcaacagtcc atcacagacg gtgatcacgg 3180

gaactgctga agcagtggca gctgcatctg acaaacttcg ttgtagtgga aacttcagag 3240

tggttcctct tgcttgtgaa gctgccttcc attcaccaca catgcgtgga gcagagcaga 3300

catttgcgtc tgcgcttgct caagctccag tgtccgcacc tgcagctgcc agattctaca 3360

gcaacgtcac tggtggagct gcagtcacct ctcctgctga tgtcaaaacg aaccttggga 3420

aacacatgac ttctcctgtg cagtttgtgc agcaagtccg tgccatgcac gcagctggag 3480

caagggtgtt tgttgagttc ggtcccaagc aagtcctttc tcgtttggtc aaagagaccc 3540

ttggggaagc tggagacgtg gtcacggtgg ctgtcaaccc agactcagcc aaggattcag 3600

acacccagct gagacaagca gctctcacct tggctgtggc tggtgttcca ctcaaagact 3660

ttgacagatg gcagcttccc gatgccactc gtcttgagcc tgtcaagaaa aagaaaacaa 3720

ccttgaggtt gagtgctgcc acctatgtct ctgccaagac cttgaggcag agggaggctg 3780

tgctcaatga tggttacact gtgagtggtg ccacagcggt tgtcaaagaa gtggacactg 3840

caaacgaaga gagacttgtc agacaagcac aagacctcca gcgtcagctt gctgaagcaa 3900

gcactgcagc ccaagcagct caatccaagg tcgctgaatt ggagaggaca atccaagact 3960

tggagaggaa ggttcaacag caacagcaag agaaaggtga gaactctgac tccaatgcag 4020

ctgcggaagt gcttaggaga cacaaggaac tgctccagag gatgctccaa gattgtgatg 4080

agcaagcagt tcccgtggca acagtcgttc caacacccac ttcttcccct acaccaacat 4140

cctcaccagt tagcggaaac agcaagtcca ccagaggatc agccgacctc caagcactcc 4200

tggcgaaagc tgagacggtc gtgatggcag ttttggctgc aaagactggc tacgaggcag 4260

acatggtgga agcagatatg gatttggagg ctgagcttgg gattgattcc atcaaaaggg 4320

tggagatcct gagtgaagtc caagggcagc tcggagttga agcgaaggat gttgatgccc 4380

tttcacgtac aaggaccgtc ggagaggttg tggatgccat gaaggctgag attgttgctg 4440

catctggtgg gtcagcacct gctgtcccct ctgcaccagc tgcatcagcg gctccgacac 4500

ctgctgcgag taccgctccg agtgctgatc ttcaggctct cctgtctaaa gccgagacgg 4560

ttgtgatggc tgtgctcgca gcgaaaactg gttacgaggc tgacatggtg gaagctgaca 4620

tggaccttga agcggagttg ggaatagata gcatcaaacg tgttgaaatc ttgtctgagg 4680

tccaaggaca gttgggtgtg gaagccaaag atgtcgatgc gctttcaaga accagaaccg 4740

tcggtgaggt cgtggacgcc atgaaggctg agattgtggc tgcctctgct ggctccgctc 4800

ctgctccagc agttccttct gcacctgcag cgtcagcggc tccaactcca gctgcatcca 4860

cggctccttc tgcagacctc caagccttgc tgtccaaagc cgaaacagtt gtgatggctg 4920

tccttgctgc aaagactggt tacgaagccg acatggttga agctgacatg gatttggaag 4980

ccgaacttgg aatagattcc atcaaaagag tggagatact ctctgaggtg caaggtcagc 5040

tcggagttga agcgaaagac gttgatgccc tcagtaggac cagaactgtt ggggaagttg 5100

tcgatgcgat gaaggctgag attgtcgctg ccagcggtgg atctgcacct gcacctgcgg 5160

tcccgtcagc tccagcagcc agcgcagctc cgactcctgc agctgccaca gcaccgagtg 5220

cggatctgca ggcattgctt gcgaaggctg aaacagttgt catggctgtc ctggctgcga 5280

aaactggcta tgaggctgat atggtggaag ccgacatgga ccttgaggct gaattgggca 5340

ttgacagcat caagcgtgtt gagattctca gtgaagtcca aggacagctc ggagtggagg 5400

cgaaggatgt ggatgccctc tcaaggacca gaacagttgg tgaggtcgtt gatgcgatga 5460

aggcagagat tgttgctgcc agtgctggtt ctgctcccgc acccgctgtc ccaagcgcac 5520

cagctgcctc cgccgctccc acaccagctg cctctactgc accaagtgcg gaccttcaag 5580

ctctcctgag caaggctgag acagttgtga tggcagtcct tgctgcgaaa actggctatg 5640

aggcagacat ggtggaagcg gacatggatc tggaagctga acttggaatt gactccatca 5700

aacgtgttga aatcctctct gaggttcaag gtcagcttgg ggtggaggcc aaagatgttg 5760

atgctctttc cagaacaagg acggtgggag aggtggttga tgccatgaag gctgagatag 5820

tggcagcgtc aggagggtca gcacctgcag ctgccgttcc gtccgcacca gcagcctctg 5880

cagctcccac gccagccacc gctcctagtg ctgatttgca agccctcctt tcaaaagctg 5940

aaactgttgt catggctgtt ttggctgcca agactggcta cgaggctgac atggttgagg 6000

ctgacatgga cttggaagcc gagcttggga ttgatagcat caagcgtgtg gaaatccttt 6060

ctgaggttca aggtcagctg ggtgttgagg ccaaagatgt cgatgcgttg tcaaggacca 6120

gaacggttgg agaagtggtc gatgccatga aggctgagat agttgctgcc tctggaggtt 6180

cagctcctgc agctccgtca gcacctgccc tccttccaac tttgtttggt tctgagtgtg 6240

aagatttgag cttgactttc ccagtcatca caaccctgcc tcttcctgct gaacttgtgc 6300

tggctgaagg tggagcacgt cctgtggttg tggttgacga tggctctgca ctcaccagtt 6360

ctcttgtgtc ctcacttggt gatcgtgctg tgctcttgca agttcagtcc agctctgcct 6420

gttcacccag aagcaccacg cacaagttgg tcactgttgc agaccgttct gaagctgcat 6480

tgcaagctgc gctcacatca gttgaagcac agtttggaaa agtgggaggt tttgtgttcc 6540

agtttggtga tgacgatgtc caagcgcagc ttggttgggc actgcttgct gccaaacatc 6600

tcaaaacgtc cttgtcagaa cagatagaag gtgggaggac cttctttgtt gccgttgcga 6660

ggttggatgg tcagttgggg ttgtctggaa agtccacgac tgccactgtt gatctctcca 6720

gagcgcagca aggctcagtc tttggactct gcaaaaccct tgacttggaa tggcctgctg 6780

ttttctgcag aggaatcgac cttgcagctg acttggatgc tgcacaagct gccagatgtc 6840

ttttgggtga gctttcagac ccagatgtgg cagtgaggga gtctggttac tccgcatctg 6900

ggcaaagatg caccacaacc acaaagtctc tcaccacggg aaaaccacat caaccgatct 6960

cttccagtga tttgttcctg gtctctggag gtgctcgtgg aatcacacct ctttgtgtga 7020

gagaattggc acagagggtg ggaggtggaa cctatgtcct cattgggaga agtgagctgc 7080

ccaccacgga acctgcctgg gctgttggtg ttgagtcagg gaaacctctt gagaaggctg 7140

cgctggcgtt cctcaaagct gagtttgcag ctggaagggg agcgaagccg acaccgatgc 7200

tccacaagaa acttgttgga gctgttgtgg gagctagaga ggtccgtgcg agcctggcag 7260

agataactgc tcaaggtgcc acagctgtct atgagtcctg tgatgtcagc tctgcagcca 7320

aggttcgtga aatggttgag agggttcaac agcaaggagg gagaagggtc agcggtgtgt 7380

ttcatgcaag tggtgttttg agagacaagt tggttgagaa caagtcactg gctgatttca 7440

gtgctgtgta tgacacaaag gttggtggac tcatcaacct ccttgcctgt gtggatcttg 7500

cacagcttag gcacctggtg ctcttcagct cccttgctgg gttccacggc aatgttggtc 7560

agagtgacta tgcaatggcc aatgaggctc tcaacaagct ggctgcacat ctgtctgctg 7620

tgcatcccca actttgtgcg agatccattt gctttggtcc gtgggatgga gggatggtga 7680

cgcctgcact caaggccaac ttcatcagaa tgggcattca gattatccct cgtcaaggtg 7740

gagcacagac agttgcgaac atgcttgtca gctccagccc tggtcagctc cttgttggga 7800

actggggagt gccacctgtg gttccaagtg ccactgagca cactgttttg cagactcttc 7860

gtcagagcga caaccccttc ttggattcac atgtcattca agggagaagg gttttgccga 7920

tgacactggc tgtcggctac atggctcacc aagctcagag catctacgct ggacatcagc 7980

tttgggcagt tgaggatgcc cagcttttca aaggcatagc cattgacaat ggagctgatg 8040

ttccggttag ggttgagttg tcaaggagaa aggaggaaca agaggatgct ggcaaggtca 8100

aggtcaaggt tcaagtgctt ctcaaatctc aagtcaatgg caagtcagtc cctgcttaca 8160

aggcgactgt cgtgctttcc cctgctccac gtcccagtgt catcacccgt gactttgatc 8220

tcactcctga cccagcctgc accgaacatg acctctatga tggcaagacg ctcttccacg 8280

gcaaagcctt ccaaggaata gaacaagttc tttctgcgac gccaaaacag ctcactgcca 8340

aatgcagaaa ccttccactc acaccggagc agcgtggcca gtttgtggtc aatctcagcc 8400

agcaagaccc attccaagct gacattgctt tccaagccat gcttgtttgg gctaggatgt 8460

tgagacagtc tgctgcgctg cccaataact gtgaaaggtt tgatttctac aaaccgatgg 8520

ctcctggagc aacttactat accagtgtca aactggcttc agcttcacca ttggtggatt 8580

ctgtgtgcaa atgcactgtt gccatgcacg atgagcaagg tgaagtgtac ttctctgcga 8640

gagccagtgt tgtcctcaac aagacactca catactgatg agtagttagc ttaatcactt 8700

aggtcaccca gtccaagccc ggcctagcac gatgatcatg agtgttgcta ttgatgtatg 8760

ttaatactat acacagtcat cgtgtgtgtt ttataaaact gtaagcttag gatgtttgag 8820

gctaatgtaa ttagcactac accgtaataa atgagaggtt tactttatgt tttaataatg 8880

ttcttaccct tgctgctctc taaactgtaa tggcgtacgg ttagctaaac taaagtaaaa 8940

atcgattcgc ttgagtaaaa ttagtgaccg ggaaagatca tcgactacta ctgctcagag 9000

atgtaatcgg taattaagac ttcaagctca ataattaatt aggagtaaat ctggcttcga 9060

atttttaaat tgtcaacttc caaagaagga ttggcaagac tcaatctcaa ttgcccaaca 9120

aacatatggc tctttacaaa tttggaatct ctttttgatg gcaagaacgt cgtaattcct 9180

ctgtcgatct catgtaatta ccaaactcat ctacttatta ctttctttat atgcacttac 9240

tgatgcggcc gcttaattaa tctgacctga ccactagacc tgagtgagta cagatgtgct 9300

actagtgcta gcctcgaggt cgacacaact ttgtatacaa aagttgtcta ggatctgctt 9360

ttacatgcga gacacatctt ctaaagtaat tttaataata gttactatat tcaagatttc 9420

atatatcaaa tactcaatat tacttctaaa aaattaatta gatataatta aaatattact 9480

tttttaattt taagtttaat tgttgaattt gtgactattg atttattatt ctactatgtt 9540

taaattgttt tatagatagt ttaaagtaaa tataagtaat gtagtagagt gttagagtgt 9600

taccctaaac cataaactat aagatttatg gtggactaat tttcatatat ttcttattgc 9660

ttttaccttt tcttggtatg taagtccgta actggaatta ctgtgggttg ccatgacact 9720

ctgtggtctt ttggttcatg catggatctt gcgcaagaaa aagacaaaga acaaagaaaa 9780

aagacaaaac agagagacaa aacgcaatca cacaaccaac tcaaattagt cactggctga 9840

tcaagatcgc cgcgtccatg tatgtctaaa tgccatgcaa agcaacacgt gcttaacatg 9900

cactttaaat ggctcaccca tctcaaccca cacacaaaca cattgccttt ttcttcatca 9960

tcaccacaac cacctgtata tattcattct cttccgccac ctcaatttct tcacttcaac 10020

acacgtcaac ctgcatatgc gtgtcatccc atgcccaaat ctccatgcat gttccaacca 10080

ccttctctct tatataatac ctataaatac ctctaatatc actcacttct ttcatcatcc 10140

atccatccag agtactacta ctctactact ataatacccc aacccaactc atattcaata 10200

ctactctagg atccacaacc aaaaatgccg tgtgacaaca ttgctgtggt tggaatggca 10260

gttcagtatg ctggatgcaa gaaccaggac gagttctggg acacactgat gaggaaggag 10320

atcaacagct caccgatctc agcggagagg cttgggacaa gatacagaga cctccacttc 10380

catcctcaga ggagcaagta tgcagacacc ttctgcaatg acagatatgg ttgtgttgat 10440

gcttctgttg acaatgagca tgacttgctt gctgaccttg ccagacgtgc tttgcttgat 10500

gctgggatca acttggatga cgccagcacc actgccaacc ttcgtgactt tgggattgtg 10560

agtggatgcc tctccttccc gatggacaat ctgcaaggtg agcttttgaa tctctatcaa 10620

gtccacgttg agaaccgtgt gggtgcccag aggttcagag attcaagacc ctggtcagaa 10680

agaccaagag ctgtgtcccc tgaagccagt gacccgaggg tctacagcga ccctgcttcc 10740

tttgtggcca accagcttgg tcttggtcct gtcagataca gccttgatgc agcttgtgcg 10800

agtgcgctgt actgcctcaa gttggcttct gatcacttgc tctcccgttc tgcagatgtc 10860

atgctgtgtg gtgccacatg cttcccagac ccgtttttca ttctctctgg gttctccaca 10920

ttccaagcga tgccattggg tggaccagat gacaacccac tctctgtgcc actccgtcaa 10980

ggcagccaag gactcacacc tggagaaggt ggagccatca tggttctgaa gcgtttggaa 11040

gatgctgtga gggatggtga taggatctat ggcaccttgc ttgggacaag tctcagcaat 11100

gctggttgtg gtttgccact ttcacctcac ctgccgtctg agaaaagctg catggaggat 11160

ttgtacacgt cagttggcat agatccatct gaggttcagt atgtcgagtg tcatgccacc 11220

ggaactccgc aaggagatgt ggttgaagtt gaggctctga gacattgctt cagaggcaac 11280

actgaccacc caccgaggat gggttccacc aaaggaaact ttggtcacac cttggttgca 11340

gctgggtttg ctggaatggc caaagtgttg ctttccatgc agcatggcac gatcccaccc 11400

acgcctggtg ttgataggag caactgcata gatccgctgg tcgttgatga ggccataccc 11460

tggccttaca gctcagctca agcgagagct ggcaaacctg gagatgaatt gaagtgtgct 11520

tccctctcag cctttggatt tggtggaaca aatgctcatt gtgtgttcag agaacacaga 11580

cagattgctg ccactgcgac agcgtctccg gtccttcctg aagtcacccc tggacccatt 11640

gcaatcattg ggatggatgc gacgtttggc accctcaaag gacttgatgc gtttgaacaa 11700

gcgatctaca aaggcacgga tggagcatct gatctgccat ccaagagatg gaggttcctt 11760

ggtgctgaca cagatttctt gactgcaatg ggtctggatg cagtcccgag agggtgctat 11820

gtgagggatg ttgatgtgga ctacaaaaga ctcagaagtc ccatgatccc tgaagatgtc 11880

ctcagacccc aacagcttct ggcagttgcc acgatggata gggcacttca agatgctggc 11940

atggccacgg gtggaaaagt tgctgtcctg gtggggttgg gcactgacac tgagctttac 12000

agacaccgtg caagggtgac actcaaggaa aggcttgacc cagcagcttt ctcccctgaa 12060

caagttcaag aaatgatgga ttacatcaat gattgtggaa cctcaaccag ctacacttct 12120

tacattggga atcttgtggc caccagagtt tcctcacagt ggggattcac tggtccttct 12180

ttcacggtca ctgaaggtgc aaactcagtc tatcgttgcc ttgagctggg aaagttcctt 12240

ttggacaccc accaagtgga tgcagttgtg gttgctggag ttgatctctg tgcaactgct 12300

gagaaccttt acctcaaggc aagaaggtct gccataagca gacaagacca tccacgtgcc 12360

aactttgagg cttctgctga tggatacttt gctggagagg gcagtggtgc tctggtcttg 12420

aagaggcaag ctgatgttgg ctcagatgac aaggtctatg ccagtgttgc tggcctcaca 12480

tgtgcagcgc agcctgctga agcagtttct cctcttctcc ttcaagttca caatgatgac 12540

aatgagaaaa gggttgtgga gatggtggaa ctcgcagctg actctggtcg tcatgctccc 12600

cacttggcca actctccttt gagtgctgaa tcacagcttg agcaagtgtc taaactcttg 12660