Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТОРОЖЕВЫХ ЛИМФОУЗЛОВ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, патоморфологии, лабораторной диагностики, хирургии и может быть применено при диагностики сторожевых лимфоузлов рака желудка.

Рак желудка является одной из ведущих причин смерти, связанных с раком во всем мире. По данным GLOBOCAN за 2018 год, рак желудка, среди всех злокачественных новообразований, занимает 5-ое место в структуре заболеваемости (5,7%) и 3-е место в структуре смертности (8,2%) (Rawla Р, Barsouk A. Epidemiology of gastric cancer: global trends, risk factors and prevention. PrzGastroenterol. 2019; 14(1):26-38. doi:10.5114/pg.2018.80001). В структуре онкологической заболеваемости, 6-ое место занимает рак желудка (6,8%) и 3-е место в структуре смертности (А.Д. Каприн, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2018). Общая 5 летняя выживаемость у пациентов с местно-распространенным раком желудка в мире составляет около 20-30% ( L., Guillerm S., Hennequin С. Neoadjuvant or adjuvant therapy for gastric cancer. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2015; 7(8): 102-110). По данным мировой статистики около 50% пациентов с раком желудка имеют, к моменту выявлению, местно-распространенную форму заболевания [Chan ВА, Jang RW, Wong RK, et al. Improving Outcomes in Resectable Gastric Cancer: A Review of Current and Future Strategies. Oncology (Williston Park) 2016; 30:635-45].

Гастрэктомия с расширенной лимфодиссекцией является стандартом в лечении местно-распространенного и раннего рак желудка, позволяющая улучшить выживаемость больных (J.H. Lee, J.G. Kim, Н.K. Jung, et al. Clinical practice guidelines for gastric cancer in korea: an evidence-based approach. J. Gastric Cancer, 14 (2014), pp. 87-104). При раннем раке желудка частота регионарного метастазирования колеблется от 8% до 20% (J.Y. Park, K.W. Ryu, B.W. Eom, et al. Proposal of the surgical options for primary tumor control during sentinel node navigation surgery based on the discrepancy between preoperative and postoperative early gastric cancer diagnoses Ann. Surg. Oncol., 21 (2014), pp. 1123-1129), следовательно около 80% больных не имеют пользы от расширенной лимфодиссекции. Так как дооперационная диагностика метастазирования в регионарные лимфоузлы затруднительна, а проведение расширенной лимфодиссекцией сопровождается более высоким количеством осложнений, точная диагностика метастазирования на до и интраоперационных этапах является актуальным направлением исследований (Japanese Gastric Cancer Association.Japanese gastric cancer treatment guidelines 2014 (ver. 4). Gastric Cancer. 2017; 20:1-19). Точное определение статуса регионарных лимфоузлов необходимо для правильного выбора тактики неоадъювантной терапии.

Для биопсии сторожевого лимфоузла при раке желудка используются радиоизотопы, синий краситель, индационин зеленый, как самостоятельно, так и в комбинации.

Однако, известные методы имеют свои недостатки: метиленовый синий диффузно окрашивает прилежащие ткани и затрудняет визуализацию, при радиоизотопном методе не решен вопрос об интервале между введением РФП и исследованием. Использование РФП сопряжено с организационными сложностями обеспечения радиационной безопасности. Данный метод диагностики с успехом применяется при меланоме и раке молочной железы, но не стал стандартным методом диагностики при других онкологических заболеваниях.

Известен способ интраоперационной диагностики метастазов при помощи окрашивания гемотаксилин-эозином, которая является стандартной методикой при изучении гистологического материала.

Недостатком способа является продолжительное количество времени заготовки и исследования материала, а так же, высокий ложноотрицательный результат в 75% (Н. Ohdaira, Н. Nimura, Т. Fujita, et al. Tailoring treatment for early gastric cancer after endoscopic resection using sentinel node navigation with infrared ray electronic endoscopy combined with indocyanine green injection DigSurg, 26 (2009), pp. 276-281). Японское многоцентровое исследование доказало что, только у 24% больных метастазы в сигнальные лимфоузлы, были диагностированы при помощи стандартных срезов и окрашиваний (Kitagawa Y, Takeuchi Н, Takagi Y, Natsugoe S, Terashima M, Murakami N, Fujimura T, Tsujimoto H, Hayashi H, Yoshimizu N, Takagane A, Mohri Y, Nabeshima K, Uenosono Y, Kinami S, Sakamoto J, Morita S, Aikou T, Miwa K, Kitajima M. Sentinel node mapping for gastric cancer: a prospective multicenter trial in Japan. J ClinOncol. 2013 Oct 10; 31(29):3704-10). За счет того что желудок имеет разветвленную лимфодренажную систему, метастазы рака могут возникать в виде изолированных опухолевых клетках и микроскопически обнаружить их с помощью стандартных исследований сложно. В связи с этим, были усовершенствованы методы диагностики, такие как: серийные срезы с имуногистохимическим исследованием, ПЦР с обратной транскрипцией и амплификационный анализ нуклеиновых кислот (Ishii K, Kinami S, Funaki K, Fujita Н, Ninomiya I, Fushida S, Fujimura T, Nishimura G, Kayahara M. Detection of sentinel and non-sentinel lymph node micrometastases by complete serial sectioning and immunohistochemical analysis for gastric cancer. J ExpClin Cancer Res. 2008; 27:7; Ajisaka H, Miwa K. Micrometastases in sentinel nodes of gastric cancer. Br J Cancer. 2003; 89:676-680).

Однако, данные методики были разработаны для снижения ложноотрицательньгх показателей и являются дополнительными методами в диагностики сигнальных лимфоузлов, но являются очень трудоемкими, время-затратными и дорогими. В последнее время стало возможным сократить время при обнаружении метастазов до 40 мин при помощи молекулярных методов исследований (Yanagita S, Natsugoe S, Uenosono Y, Arigami T, Arima H, Kozono T, Funasako Y, Ehi K, Nakajo A, Ishigami S, et al. Detection of micrometastases in sentinel node navigation surgery for gastric cancer. SurgOncol. 2008; 17:203-210), что не приводит к снижению ложноотрицательного результата.

Известен метод исследования лимфоузлов с помощью полимеразно-цепной реакции в реальном времени с антигеном СЕА, CK 20 и компьютерной программы Maruyama (Т. Jagric, S. Potrc, A. Ivanecz, М. Horvat, М. Plankl, Т. MarsEvaluation of focused sentinel lymph node RT-qPCR screening for micrometastases with the use of the Maruyama computer programEurSurg, 45 (2013), pp. 270-276).

Однако, для данного метода необходима материально-техническая база, что делает невозможным его использование в большинстве больниц.

Проточная цитофлоуметрия - методика обеспечивающая быстрый многопараметрический анализ отдельных клеток в растворе, где каждая частица анализируется на предмет рассеяния видимого света и параметров флуоресценции. Данный метод с успехом используется в биологии, иммунологии, при диагностике гематологических заболеваний имеет чувствительность близкую к чувствительности молекулярных методов (V. Pillai, E.S. Cibas, D.M. DorfmanA simplified flow cytometricimmunophenotyping procedure for the diagnosis of effusions caused by epithelial malignances Am J Pathol, 139 (2013), pp. 672-681). Проточная цитометрия является более быстрым и доступным методом диагностики, чем полимеразно-цепная реакция.

В качестве прототипа предполагаемого изобретения принят способ биопсии сторожевого лимфоузла при раке желудка с проточной цитометрией (Т. Jagric, S. Potrc, A. Ivanecz, М. Horvat, М. Plankl, Т. MarsEvaluation of focused sentinel lymph node RT-qPCR screening for micrometastases with the use of the Maruyama computer programEurSurg, 45 (2013), pp. 270-276). Способ диагностики представляет собой введение красителя PatentBlue в 4-5 местах вокруг опухоли. Половина лимфоузлов отправлялась на стандартное гистологическое исследование, другая отправлялась на проточную цитометрию. Лимфоузлы помещались в фосфатный буферный раствор. При помощи EDTA окрашивали в течение 30 мин с ARC-Cy7 коньюгированным СЕА, CD326. Нежизнеспособные клетки окрашивались 7AAD. Установлен пороговый уровень не менее 300 СЕА позитивных событий на фоне 600000 клеток. Клетки анализировали на цитометре (ImageStreamXMark II; Amnis, Seattle, WA). при увеличении × 40 (разрешение пикселя 0,5 мкм). Лазер с длиной волны в 488 нм использовался для возбуждения пирроэритрина и 7AAD, а лазер на 642 нм использовался для возбуждения АРС-Су7. Изображения в светлых полях были получены с использованием светодиодного осветителя с ярким полем. Файлы изображений с 50000-100000 событий собраны и проанализированы с использованием программного обеспечения IDEAS (Амнис, Сиэтл, Вашингтон).

Недостатком известного способа является отсутствие в диагностической панели реагентов, позволяющих идентифицировать ядросодержащие клетки. 7-актиноаминомицин (7-ААД) прокрашивает нежизнесопосбные клетки и клеточные обломки (дебрис), однако не позволяет исключить примесь безъядерных клеток крови (недолизированные эритроциты), способных создавать неспецифический фон для эпителиальных антигенов. Также в качестве недостатков способа может быть обозначен высокий пороговый уровень - 0,05% (1 клетка на 2000 лейкоцитов, условно). Кроме того пересчет количества опухолевых/эпителиальных клеток требует переходной формулы через количество лейкоцитов (CD45+ клетки), поскольку эпителиальные клетки и CD45+ клетки это две независимые (непересекающиеся) по основным антигенам популяции. Еще одним недостатком является использование для определения сторожевого лимфатического узла красителя PatentBlue, что не позволяет точно визуализировать все пути лимфооттока от опухоли.

Техническим результатом заявленного способа является быстрое выявление злокачественных клеток в лимфоузлах при хирургическом лечении рака желудка.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что также как и в известном способе проводят визуализацию сторожевого лимфатического узла и путей лимфооттока с последующим исследованием лимфатического узла на проточном цитометре методом подсчета клеток в камере Горяева при реакции прямой иммунофлуоресценции (РИФ).

Особенность заявляемого способа заключается в том, что перед анализом на цитометре в пробу к клеткам добавляют 500 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора и проводят проточную цитометрию прямыми флуорохромными коньюгатами по 6 параметрам: флуоресцеинизотиоцианат, фикоэритрин, перидинин-хлорофилл протеин, фикоэритрин-Су77, аллофикоцианин, аллофикоцианин-Су7, с обязательным присутствием в пробе нуклеотропных красителей, общелейкоцитарного антигена и пан-эпителиальных маркеров, далее получают суспензию клеток материла биопсии лимфатического узла: биопсийный материал помещают в физиологический раствор или раствор Хенкса или питательную среду 199 с солями Хенкса с добавлением глутамина и гентамицина, ткань с небольшим количеством буферного раствора аккуратно измельчают в ступке и переносят в пробирку объемом 10 мл, клеточную взвесь отмывают от эритроцитов и разрушенных клеток центрифугированием 1000 оборотов в минуту при 200g, процедуру проводят дважды, далее к клеточному осадку добавляют 2 мл PBS-BSA, ресуспендируют, производят подсчет клеток в камере Горяева; после получения клеточной суспензии проводят прямую реакцию иммунофлуоресценции: клетки в количестве от 1000000-2000000 помещают в пробирки 12×75, объем клеточной суспензии 150 мкл мм с прямыми флуорохромными коньюгатами монокланальных антител и используют многопараметровой метод: 6-специфических параметров и 2 неспецифических - прямое и боковое светорассеяние проточной цитометрии и делят на образцы: первая проба анализируемый образец, вторая - изотипический контроль для оценки неспецифического связывания антигена, далее проводят иммунофлуоресценцию на двухлазерном проточном цитометре, причем из каждой пробы набирают от 2000000 до 10000000 клеток без ограничения области сбора и проводят анализ данных проточной цитометрии, после чего оценивают количество клеток, экспрессирующих пан-эпителиальные маркеры CD326 и BerEP4 в пределах всех анализируемых клеток образца с использованием программ FCSexpress Version 3.0 и Kaluza, и если количество детектированных клеток составляет выше 0,01%, т.е. 1 клетка на 10000 ядросодержащих клеток, то это свидетельствует о метастатическом поражении лимфатического узла.

В заявляемом способе вместо 7-ААД используют нуклеотропный краситель Syto16, что позволяет учитывать примесь безъядерных клеток крови (недолизированные эритроциты), способных создавать неспецифический фон для эпителиальных антигенов, избежать пересчета количества опухолевых/эпителиальных клеток с использованием переходной формулы через количество лейкоцитов (CD45+ клетки) и существенно снизить пороговый уровень «позитивности» (0,01% клеток эпителиальной природы в пределах ядросодержащих, жизнеспособных клеток). Кроме того анализ большого количества клеток повышается за счет использования программного приложения «Kaluza».

Изобретение поясняется подробным описанием, лабораторными исследованиями, таблицей, клиническими примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг.1 - Фотоиллюстрация сторожевого лимфатического узла и путей лимфооттока при помощи инфракрасного отечественного визуализатора после введение красителя ICG (флюоресцирующий сторожевой лимфоузел).

Фиг. 2 - Цитограмма в параметрах: экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 (ось абсцисс) против экспрессии пан-эпителиального антигена CD326/EPCAM (ось ординат). В верхнем левом квадранте четко визуализируется популяция эпителиальных опухолевых клеток (выделено красным цветом) составляющая 1,94% от всех ядросодержащих клеток образца (19401 клетки на 1×106 на проанализированных клеток). Больше порогового уровня - 0,01% (1 клетка на 10000 ядросодержащих клеток).

Фиг. 3 - Лимфатических узел с частично сохраненным фолликулярным рисунком строения, с обширными очагами некроза и кровоизлияний, среди которых определяются комплексы клеток рака - умеренно дифференцированной аденокарциномы желудка (стрелка). Окрашивание Гематоксилин-эозин, ×100.

Фиг. 4 - Цитограмма в параметрах: экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 (ось абсцисс) против экспрессии пан-эпителиального антигена CD326/EPCAM (ось ординат). Количество детектированных клеток (в выделенном окне) 2 клетки из 1×106, что меньше порогового уровня - 0,01% (1 клетка на 10000 ядросодержащих клеток) и свидетельствует об отсутствии метастатического поражения лимфатического узла. Непораженный лимфоузел.

Фиг. 5 - Лимфатический узел с сохраненным фолликулярным рисунком строения, реактивной фолликулярной гиперплазией - определяются фолликулы различного диаметра со светлыми центрами размножения, синусовым гистиоцитозом и полнокровием тонкостенных сосудов капиллярного типа. Опухоли не обнаружено. Окрашивание Гематоксилин-эозин, ×100.

Способ осуществляют следующим образом.

На первом этапе проводят визуализацию сторожевого лимфатического узла с помощью ICG с последующей его биопсией (Фиг. 1).

В соответствии с сущностью изобретения, перед анализом на цитометре в пробу к клеткам добавляют 500 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора. Детекцию опухолевых клеток в лимфатических узлах проводят на проточном цитофлуориметре по регистрации 6 параметров флуоресценции. При этом используют прямые флуорохромные коньюгаты МКА: флуоресцеинизотиоцианат (FITC), фикоэритрин (РЕ), перидинин-хлорофилл протеин (PerCP), фикоэритрин-Су7 (РЕ-Су7), аллофикоцианин (АРС), аллофикоцианин-Су7 (АРС-Су7), с обязательным присутствием в пробе нуклеотропных красителей, общелейкоцитарного антигена и пан-эпителиальных маркеров.

Выявление опухолевых клеток (в том числе единичных) методом проточной цитофлуориметрии, позволяет обнаружить порог обнаружения 10^-4.

Получение суспензии клеток материла биопсии лимфатического узла:

- биопсийный материал помещают в физиологический раствор, раствор Хенкса или питательную среду 199 с солями Хенкса с добавлением глутамина и гентамицина;

- ткань с небольшим количеством буферного раствора аккуратно измельчают в ступке и переносят в пробирку объемом 10 мл. В случае объема биопсийного материала более 1 см³ клеточная взвесь делят на 2 части (2 пробирки по 10,0 мл) к клеточной взвеси до полной пробирки добавляют PBS-BSA (фосфатно-солевой буфер с 0,9% NaCl);

- клеточная взвесь отмывают от эритроцитов и разрушенных клеток центрифугированием при 200g (1000 оборотов в минуту), процедуру проводят дважды;

- к клеточному осадку добавляют 2 мл PBS-BSA, аккуратно ресуспендируют;

- производят подсчет клеток в камере Горяева.

После получения клеточной суспензии - проводят прямую реакцию иммунофлуоресценции (РИФ): клетки в количестве от 1000000-2000000 помещают в пробирки 12×75 мм (объем клеточной суспензии 150 мкл) с прямыми флуорохромными коньюгатами монокланальных антител в соответствии с панелью (См. таблицу). Используют метод многопараметровой (6-специфических параметров и 2 неспецифических - прямое и боковое светорассеяние) проточной цитометрии.

Первая проба - анализируемый образец, вторая - изотипический контроль для оценки неспецифического связывания антигена.

1) Проводят сбор данных на 2-лазерном проточном цитометре: из каждой пробы набирали от 2000000 до 10000000 клеток (в зависимости от клеточности образца) без ограничения области сбора.

2) Анализ данных проточной цитометрии проводили с использованием программ FCSexpress Version 3.0 и Kaluza и оценивали количество клеток, экспрессирующих пан-эпителиальные маркеры (CD326 и BerEP4) в пределах всех анализируемых клеток образца.

В качестве порога использовали стандартную среднюю величину для оценки позитивности минимального поражения методом проточной цитометрии, и если количество детектированных клеток составляет выше 0,01% (1 клетка на 10000 ядросодержащих клеток), то это свидетельствует о метастатическом поражении лимфатического узла.

Способ подтвержден клиническими примерами.

Пример 1.

Больной П., 1949 г. р., находился на лечении в МРНЦ им. А.Ф. Цыба в 2019 г. с диагнозом: рак антрального отдела желудка ypT1bN1M0 Ист. Больному проведено 4 курса неоадъювантной полихимиотерапии по схеме FLOT и хирургическое лечение в объеме: резекция желудка дистальная субтотальная, ЛАЭ-D2. Во время хирургического лечения выполнена процедура биопсии сторожевого лимфоузла при помощи индацианина зеленого (ICG), отечественного инфракрасного визуализатора. Удаленный лимфоузел острым путем разделен на 2 равные части. Первая часть помещена в физиологический раствор с небольшим количеством буферного раствора и аккуратно измельчен. Клеточная взвесь отмыта от эритроцитов. Произведен подсчет клеток в камере Горяева и с клеточной суспензией проведена прямая реакция иммунофлуоресценции. Анализ данных проводился с использованием программ FCSexpress Version 3.0 и Kaluza. Количество детектированных клеток составляет - 1,94% от всех ядросодержащих клеток образца (19401 клетки на 1×106 проанализированных клеток), что больше порогового уровня - 0,01% (1 клетка на 10000 ядросодержащих клеток) и свидетельствует о метастатическом поражении лимфатического узла (Фиг. 2).

Другая половина лимфоузла отправлена на плановое гистологическое исследование: фиксация в 10% забуференном растворе формалина, заливка в парафин. Проводилось изучение серийных срезов на микротоме и окраска срезов гематоксилин-эозином. Диагностирован метастаз умереннодифференцированной аденокарциномы в лимфатический узел (Фиг. 3).

Таким образом, выявленный метастаз подтвержден с помощью планового гистологического исследования и при проведении проточной цитофлоуметрии.

Пример 2.

Больная Е., 1951 г. р., находилась на лечении в МРНЦ им А.Ф. Цыба в 2019 г с диагнозом: рак тела и антрального отдела желудка pT2N1M0 IIIC стадия. Больной проведено хирургическое лечение в объеме: резекция желудка дистальная субтотальная, ЛАЭ D2+12+16a1-2, холецистэктомия. Во время хирургического лечения выполнена процедура биопсии сторожевого лимфоузла при помощи индацианина зеленого (ICG), отечественного инфракрасного визуализатора. Удаленный лимфоузел острым путем разделен на 2 равные части. Первая часть помещена в физиологический раствор с небольшим количеством буферного раствора и аккуратно измельчен. Клеточная взвесь отмыта от эритроцитов. Произведен подсчет клеток в камере Горяева и с клеточной суспензией проведена прямая реакция иммунофлуоресценции. Анализ данных проводился с использованием программ FCSexpress Version 3.0 и Kaluza. Количество детектированных клеток (выделено красным цветом) 2 клетки из 1×106 проанализированных клеток, что меньше порогового уровня - 0,01% (1 клетка на 10000 ядросодержащих клеток) и свидетельствует об отсутствии метастатического поражения лимфатического узла (Фиг. 4).

Другая половина лимфоузла отправлена на плановое гистологическое исследование: фиксация в 10% забуференном растворе формалина, заливка в парафин. Проводилось изучение серийных срезов с окраской гематоксилин-эозином. При плановом исследовании серийных срезов данных за метастатическое поражение не выявлено (Фиг. 5).

На клинических примерах данного метода было продемонстрировано полное соответствие цитофлоуметрического и классического гистологического исследований по выявлению метастазов рака желудка в лимфатические узлы. Представленные результаты позволяют рассматривать данный метод биопсии лимфоузлов при хирургическом лечении рака желудка обоснованным и перспективным методом диагностики и выбора тактики лечения со стороны регионарных метастазов.

Предложенное изобретение является легко воспроизводимым, не сопровождается интра-пост операционными осложнениями, снижает нагрузку на морфологическую службу, ускоряет время проведения исследования по выявлению злокачественных клеток в лимфоузлах и ускоряет время реабилитации пациента после операции. А так же позволяет индивидуализировать назначение периоперационной и неоадъювантной химиотерапии рака желудка за счет более точного стадирования N-категории на дооперационном этапе. Предложенный способ может быть реализован в лечебных учреждениях со стандартным оборудованием в рамках рутинной клинической практики. Использование флюоресцентных маркеров позволяет отказаться от применения радиофармпрепаратов и связанных с ними организационных сложностей по обеспечению радиационной безопасности.

Предложенный способ позволяет учитывать примесь безъядерных клеток крови (недолизированные эритроциты), способных создавать неспецифический фон для эпителиальных антигенов, избежать пересчета количества опухолевых/эпителиальных клеток с использованием переходной формулы через количество лейкоцитов (CD45+ клетки) и существенно снизить пороговый уровень «позитивности» (0,01% клеток эпителиальной природы в пределах ядросодержащих, жизнеспособных клеток), тем самым снизить нагрузку на патоморфологическую службу лечебного учреждения, существенно уменьшить время выполнения исследования лимфоузла на предмет наличия злокачественных клеток.