Образование кости

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к образованию кости, в том числе восстановлению ран и переломов кости, а также к эластину.

Уровень техники изобретения

Ссылка на любой предшествующий уровень техники в настоящем описании не является признанием или предположением того, что данный предшествующий уровень техники является частью общих знаний в любой области, или того, что разумно было ожидать, что данный предшествующий уровень техники будет понятным, считаться соответствующим и/или комбинированным с другими частями предшествующего уровня техники специалистом в данной области техники.

По оценкам, ежегодно проводится до 2,2 миллиона процедур костной трансплантации [1]. В результате повреждения или резекции опухоли потеря больших количеств костной ткани может подавлять природную способность организма к заживлению костей, что приводит к несрастанию. Вместе с инфекцией, плохое заживление костей, связанное с большой потерей костной ткани, остается ключевыми проблемами для ортопедической медицины.

Несрастание приводит в результате к повторным хирургическим процедурам и длительным пребываниям в больнице, что представляет сложность как для Пациентов, так и для хирургов [2, 3]. Двумя основными причинами, которые приводят к несрастанию, являются недостаточность биологических факторов, требующихся для восстановления, и инфекция кости (остеомиелит) [3, 4].

Недостаточность биологических факторов может являться результатом большого размера дефекта кости, нехватки биологических факторов роста (которые могут быть дополнительно истощены вследствие обработки раны), а также нарушенного или уменьшенного кровоснабжения. Существующие способы лечения для восстановления остеогенных факторов и подходящего микроокружения включают костную трансплантацию [5], дистракционный остеогенез [6, 7], добавление факторов роста и подходы, связанные с тканевой инженерией. Тем не менее, все из этих способов имеют ограничения, и происходит непрерывный поиск более эффективных средств.

В WO 2012/068619, WO 2014/063194 и WO 2014/089610 обсуждается применение структурных характеристик тропоэластина для образования гидрогелей, остовов и т. п. Эти структуры можно затем адаптировать для применения в терапевтических целях с помощью прикрепления или высевания их с биологическими факторами или клетками, которые требуются для терапии в области или месте, где должна быть размещена структура. В тех случаях, когда для терапии требуется образование кости, в WO 2012/068619, WO 2014/063194 и WO 2014/089610 раскрыто, что терапию обеспечивают биологические факторы (например, костные морфогенетические белки) или клетки (остеоциты), прикрепленные к структурам на основе тропоэластина.

Существует потребность в новых подходах к образованию кости в терапевтических путях применения.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение направлено на решение одной или нескольких из вышеупомянутых потребностей или ограничений, или на обеспечение альтернативного подхода к образованию кости, и в одном варианте осуществления обеспечивает применение тропоэластина или композиций, содержащих его, для индуцирования образования кости или содействия таковому.

В другом варианте осуществления предусматриваются тропоэластин или содержащие его композиции для применения в индуцировании образования кости или содействия таковому.

В другом варианте осуществления предусматриваются тропоэластин или содержащие его композиции в изготовлении лекарственного препарата для применения в индуцировании образования кости или содействия таковому. Лекарственный препарат может принимать форму композиции, состава, остова, матрикса или гидрогеля, как описано ниже.

В другом варианте осуществления предусматривается способ индуцирования образования кости или содействия таковому, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, нуждающегося в образовании кости,

- предоставление индивидууму количества тропоэластина, эффективного для индуцирования образования кости или содействия таковому,

в результате чего у индивидуума индуцируется образование кости.

Как правило, тропоэластин доставляют в область или участок кости или связанной с костью ткани, в которых требуется образование кости.

В других вариантах осуществления предусматривается применение тропоэластина или содержащих его композиций для индуцирования анаболизма кости.

В другом варианте осуществления предусматриваются тропоэластин или содержащие его композиции для применения в индуцировании анаболизма кости.

В другом варианте осуществления предусматривается тропоэластин или содержащие его композиции в изготовлении лекарственного препарата для применения в индуцировании анаболизма кости. Лекарственный препарат может принимать форму композиции, состава, остова, матрикса или гидрогеля, как описано ниже.

В другом варианте осуществления предусматривается способ индуцирования анаболизма кости, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, нуждающегося в индуцировании анаболизма кости,

- предоставление индивидууму количества тропоэластина, эффективного для индуцирования анаболизма кости,

в результате чего у индивидуума индуцируется анаболизм кости.

Как правило, тропоэластин доставляют в область или участок кости или связанной с костью ткани, в которых требуется анаболизм кости.

В других вариантах осуществления предусматривается применение тропоэластина или содержащих его композиций для увеличения объема или плотности костной ткани.

В другом варианте осуществления предусматривается тропоэластин или содержащие его композиции для применения в увеличении объема или плотности костной ткани.

В другом варианте осуществления предусматривается тропоэластин или содержащие его композиции в изготовлении лекарственного препарата для применения в увеличении объема или плотности костной ткани. Лекарственный препарат может принимать форму композиции, состава, остова, матрикса или гидрогеля, как описано ниже.

В другом варианте осуществления предусматривается способ увеличения объема или плотности костной ткани, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, нуждающегося в увеличенном объеме или плотности костной ткани,

- предоставление индивидууму количества тропоэластина, эффективного для увеличения объема или плотности костной ткани,

в результате чего у индивидуума увеличивается объем или плотность костной ткани.

Как правило, тропоэластин доставляют в область или участок кости или связанной с костью ткани, в которых требуется увеличенный объем или плотность костной ткани.

Описанные выше способы или пути применения можно применять для укрепления кости, для восстановления дефекта кости, или для других клинических исходов, в которых необходимо образование кости.

В вышеописанных способах или путях применения тропоэластин можно предоставлять индивидууму или в область или участок кости или связанной с костью ткани в виде композиции, состава, остова, матрикса или гидрогеля, описанных ниже.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения и дополнительные варианты осуществления аспектов, описанные в предыдущих абзацах, станут очевидными из нижеследующего описания, приведенного в качестве примера и со ссылкой на прилагаемые графические материалы.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1 - биомеханическое поведение кости перед и после введения гидрогеля на основе тропоэластина.

Фигура 2 - подкожный участок инъекции гидрогелей на основе тропоэластина в различные моменты времени.

Фигура 3 - окрашивание имплантатов гематоксилином и эозином (H & E) через 1 и 2 недели после инъекции. Результаты окрашивания продемонстрировали уменьшение воспалительного ответа через 1 неделю (указано стрелкой). Трихромное окрашивание по Миллигану (MT) образцов на 2 неделе продемонстрировало инфильтрацию фибробластов и отложение коллагена.

Фигура 4 - остеотомия в модели восстановления кости у овцы (A) и последующее лечение с помощью инъецируемых тропоэластинсодержащих гелей (B и C). Черные стрелки указывают на область остеотомии.

Фигура 5 - модель восстановления кости у овцы. A. Обнаружено три различных типа ткани: трубчатая кость, губчатая кость и костный мозг. B. Контроль, окрашенный с помощью MT на 8 неделе. C. Испытываемые образцы (обработанные гелем на основе тропоэластина), окрашенные с помощью MT на 8 неделе. D. Незрелая грубоволокнистая кость образовалась в контрольных образцах и была плотнее на поверхностях, обращенных к периосту, по сравнению с участком эндоста. Костный мозг присутствовал в участке эндоста. E. В образцах, обработанных гелем на основе тропоэластина, образовалась прочная трубчатая кость на конце эндоста. Щель остеотомии уменьшилась с 3 мм до 1,8 мм.

Фигура 6 - CT-изображения областей остеотомии в модели восстановления кости у овцы. На изображениях, полученных через 0, 4 и 8 недель после операции, показана часть, подвергнутая остеотомии, с оставшейся самой большой щелью.

Фигура 7 - модель восстановления дефекта кости критического размера у кролика. A = участок повреждения перед лечением. B = участок повреждения после введения геля на основе тропоэластина в 0-й день.

Фигура 8. Результаты μCT, модель восстановления дефекта кости у кролика. OCc= контроль; OCte = обработанные тропоэластином. *= отличается значительно между двумя группами.

Фигура 9. Последовательность изоформы тропоэластина SHELδ26A

Подробное описание вариантов осуществления

Авторы изобретения предусматривают в данном документе тропоэластин и содержащие его композиции, которые подходят для применения в индуцировании продуцирования или образования кости или содействии таковому, и которые преимущественно обладают свойствами приклеивания к кости, являются инъецируемыми, ангиогенными, остеогенными и/или биоабсорбируемыми. В соответствии с настоящим изобретением тропоэластин применяют преимущественно для индцуцирования образования или продуцирования кости при применении в медицинской практике, где требуется продуцирование или образование кости.

A. Определения

Термин "содержать" и вариации термина, такие как "содержащий", "содержит" и "состоящий из", не предназначены для исключения дополнительных добавок, компонентов, целых чисел или стадий.

Термин "кость" обычно относится к минерализованной ткани, в основном содержащей смесь отложенного кальция и фосфата в форме гидроксиапатита, коллагена (в основном коллагена I типа) и костных клеток, таких как остеобласты, остеоциты и остеокласты, а также к ткани костного мозга. Кость представляет собой васкулизированную ткань.

Кость обычно находится в форме ''компактной кости'' (или "трубчатой кости") или "губчатой кости" (или "трабекулярной кости"). С общей анатомической точки зрения существуют явные различия между компактной и губчатой костью. В частности, компактная кость характеризуется пластинчатой структурой и обычно представляет собой плотное место костной ткани, которое не содержит полостей, тогда как губчатая кость содержит многочисленные взаимосвязанные полости, определенные сложными трабекулами. Как правило, компактная кость является более твердой, прочной и жесткой, чем трабекулярная кость. Более высокое соотношение площади поверхности и массы трабекулярной кости по сравнению с компактной костью означает, что трабекулярная кость является менее плотной, чем компактная кость, и обычно более мягкой, слабой и более гибкой, чем компактная кость. Трабекулярная кость является высоко васкулизированной и, как правило, обнаруживается на концах длинных костей, проксимальных к суставам, и внутри позвонков. Как правило, компактная кость образует "оболочку" вокруг трабекулярной кости и является основным компонентом длинных костей руки и ноги, а также других костей, где необходима ее превосходящая прочность и твердость. Основной анатомической и функциональной структурной единицей компактной кости является остеон, а основной анатомической структурной единицей трабекулярной кости является трабекула.

"Длинные кости" обычно представляют собой кости, в которых компактная кость обнаружена в диафизе, который представляет собой цилиндрическую часть кости, тогда как губчатая кость обнаружена в эпифизе, т. е. округлых концах кости. Примеры длинных костей включают плечевую, лучевую, локтевую, большеберцовую, малоберцовую и бедренную кости.

"Короткие кости" в целом представляют собой кости, в которых обычно существует сердцевина из губчатой кости, полностью окруженная компактной костью. Примеры включают кости кисти руки.

"Плоские кости" обычно имеют 2 слоя компактной кости, называемые пластинами, разделенных слоем губчатой кости. Примеры плоских костей включают теменную, лобную, затылочную и височную кости черепа, нижнюю и верхнюю челюсти.

"Эндохондральная оссификация" обычно относится к продуцированию кости в пределах хрящевой ткани, что обычно происходит при развитии костной системы плода. Данное продуцирование кости обычно происходит в основном центре оссификации в диафизе, а затем - во второстепенном центре оссификации в эпифизе. Эндохондральная оссификация обычно требуется для образования длинных и коротких костей.

"Внутримембранная оссификация" представляет собой другой важный процесс развития костной системы плода, хотя в отличие от эндохондральной оссификации внутримембранная оссификация обычно относится к продуцированию кости, которое не происходит в пределах хряща. Внутримембранная оссификация обычно требуется для образования плоских костей. Внутримембранная оссификация также является существенно важным процессом во время природного заживления переломов кости.

"Субхондральная кость" обычно представляет собой кость, расположенную под хрящом, и таким образом обычно обеспечивает поддержку для хрящевой суставной поверхности.

"Связанная с костью ткань" обычно относится к ткани, которая либо поддерживается костью (например, суставная ткань), либо ткани, которая соединена с костью, например связка или сухожилие. Связанная с костью ткань обычно является хрящевой.

"Индуцирование образования кости или содействие таковому" обычно относится к анаболическому процессу, конечным результатом которого является кость. Обычно они не включают катаболический процесс, который приводит к ремоделированию кости. Однако кость, являющаяся результатом индуцирования образования кости или содействия таковому, в соответствии с настоящим изобретением может быть ремоделирована посредством клинического вмешательства или без такового. В определенных вариантах осуществления индуцирование или стимулирование образования кости включают процесс, который с большей точностью напоминает внутримембранную оссификацию. Как описано в данном документе и проиллюстрировано в примерах, данный процесс обычно включает пролиферацию и дифференциацию остеобластов и минерализацию кальция. Для данного процесса может требоваться или не требоваться присутствие хрящевой ткани.

"Дефект кости" обычно представляет собой структурное нарушение кости, требующее восстановления. Дефект может принимать форму "отсутствующей части", под которой понимают трехмерный дефект, такой как, например, щель, полость, отверстие или другое существенное нарушение в структурной целостности кости или сустава. Дефект может являться результатом несчастного случая, заболевания, хирургической операции и/или несостоятельности протезирования. Дефект может представлять собой отсутствующую часть, имеющую объем, неподдающийся эндогенному или спонтанному восстановлению. Обычно он способен к некоторому спонтанному восстановлению, хотя и биомеханически незначительному. Другие дефекты, поддающиеся восстановлению, включают без ограничения несрастание переломов; полости кости; резекцию опухоли; свежие переломы (рассеянные или нерассеянные); черепные/лицевые аномалии; периодонтальные дефекты и нарушения; артродез позвонков; а также дефекты, полученные в результате заболеваний, таких как рак, артрит, в том числе остеоартрит, и других дегенеративных нарушений кости, таких как рассекающий остеохондрит.

"Восстановление" обычно относится к новому образованию кости, которое достаточно для по меньшей мере частичного заполнения отсутствующей части или неоднородности структуры при дефекте. Однако восстановление не означает или иным образом не приводит к процессу полного заживления или лечения, которое на 100% является эффективным при восстановлении дефекта до его физиологического/структурного/механического состояния перед дефектом.

Если кость ломается, то в поврежденных кровеносных сосудах возникает локализованное кровоизлияние с образованием кровяного сгустка. Также может возникнуть разрушение костного матрикса и гибель костных клеток, примыкающих к перелому. Во время восстановления кровяной сгусток, оставшиеся клетки и поврежденный костный матрикс могут быть удалены макрофагами. Периост (оболочка соединительной ткани, покрывающая кость) и эндост (тонкая сосудистая мембрана соединительной ткани, которая тянется вдоль поверхности костной ткани, образующей костномозговую полость длинных костей) вокруг перелома отвечают интенсивной пролиферацией остеопрогениторных клеток, которые образуют клеточную ткань, окружающую перелом и проникающую между концами сломанной кости. Затем незрелая кость образуется с помощью эндохондральной оссификации небольших фрагментов хряща, которые возникают в соединительной ткани перелома. В зависимости от характера повреждения или перелома кости, периост может являться в значительной степени неповрежденным после повреждения (т. е. все еще связанным с костью). В такой ситуации эндост может быть поврежден или может быть не поврежден в результате повреждения и, таким образом, может способствовать восстановлению или может не способствовать восстановлению. В других обстоятельствах может наблюдаться значительное разрушение периоста (например, значительная травма или хирургическая процедура), при котором периост больше не контактирует с поверхностью кости. При таких обстоятельствах вклад периоста в восстановление кости может быть невозможен без альтернативного вмешательства.

Кость также образуется с помощью внутримембранной оссификации. Восстановление прогрессирует таким образом, что неравномерно образованные трабекулы незрелой кости временно объединяют концы сломанной кости, образуя "костную мозоль". Нормальная нагрузка, прилагаемая к кости во время восстановления и во время возвращения к активности, способствует ремоделированию костной мозоли, влияя на ее структуру, и основная костная ткань мозоли таким образом постепенно реабсорбируется и замещается пластинчатой костью, что приводит в результате к восстановлению исходной структуры и функции кости.

"Тропоэластин" обычно представляет собой мономерный белок, из которого образуется эластин. Тропоэластин обычно не является сшитым ковалентно или иным образом. Тропоэластин может обратимо образовывать коацерват. Тропоэластин может являться синтетическим, например, его может быть получен в результате рекомбинантной экспрессии или другого синтеза, или может быть получен из природного источника, такого как аорта свиньи. Как общеизвестно из уровня техники, тропоэластин может существовать в форме множества фрагментов.

B. Образование кости

Следует понимать, что настоящее изобретение относится к индуцированию или стимулированию образования кости. В одном варианте осуществления предусматривается способ индуцирования образования кости или содействия таковому. Способ включает следующие стадии:

- обеспечение присутствия индивидуума, нуждающегося в образовании кости,

- предоставление индивидууму тропоэластина для индуцирования у индивидуума образования кости или содействия таковому,

в результате чего у индивидуума индуцируется образование кости.

Индивидуум может нуждаться в образовании кости в целях устранения или восстановления дефекта кости. Дефект кости может представлять собой перелом, такой как несрастание перелома или свежий перелом (рассеянный или нерассеянный). Дефект кости может привести в результате к незначительному повреждению периоста. При таком обстоятельстве может не возникать повреждения эндоста. В качестве альтернативы, дефект кости может включать повреждение как периоста, так и эндоста. Дефект кости может представлять собой перелом или микроперелом, полученные во время контролируемой хирургической процедуры или в результате травмы. Таким образом, в одном варианте осуществления предусматривается способ восстановления перелома кости, включающий следующие стадии:

- обеспечение присутствия индивидуума, нуждающегося в восстановлении перелома кости,

- предоставление индивидууму тропоэластина для восстановления у индивидуума перелома кости,

в результате чего у индивидуума обеспечивается восстановление перелома кости.

В другом варианте осуществления индивидуум нуждается в образовании кости для заполнения отсутствующей части в костной ткани. Отсутствующая часть обычно может представлять собой трехмерный дефект, такой как щель, полость или отверстие, являющийся результатом заболевания, хирургической операции и/или несостоятельности протезирования. Отсутствующая часть может иметь объем, неподдающийся эндогенному или спонтанному восстановлению. Например, отсутствующая часть может в два раза превышать диаметр исследуемой кости. Таким образом, в другом варианте осуществления предусматривается способ заполнения отсутствующей части в кости, включающий следующие стадии:

- обеспечение присутствия индивидуума, у которого в кости имеется отсутствующая часть,

- предоставление индивидууму тропоэластина для заполнения отсутствующей части в кости индивидуума,

в результате чего осуществляется заполнение отсутствующей части в кости.

Как правило, тропоэластин доставляют в область или участок кости или связанной с костью ткани, в которых требуется образование кости. В данном варианте осуществления тропоэластин доставляют с помощью местного введения тропоэластина в область или участок кости или связанной с костью ткани. Для местного введение обычно требуется непосредственный контакт области или участка кости или связанной с костью ткани с тропоэластином.

Тропоэластин может предусматриваться для непосредственного контакта с областью или участком кости или связанной с костью ткани с помощью применения тропоэластина в виде композиции, состава, остова или матрикса, описанных ниже, по отношению к области или участку кости или связанной с костью ткани. Более подробно, и как дополнительно описано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторое количество тропоэластина, содержащееся в составе, не является сшитым, связанным или иным образом ковалентно присоединенным к другим компонентам композиции или состава, например не является присоединенным к остову или матриксу. Это обеспечивает высвобождение по меньшей мере некоторого количества, если не всего тропоэластина, содержащегося в этих составах, из композиции в ткань в участке кости или связанную с костью ткань, которой требуется восстановление, в результате чего обеспечивается стимулирование тропоэластином элементов ткани в данной области для продуцирования кости. Непосредственный контакт тропоэластина этих составов с участком кости или связанной с костью ткани, требующей образования или разрастания кости, обеспечивает индуцирование тропоэластином образования или продуцирования кости в данной области.

Тропоэластин можно применять по отношению только к кости или по отношению к кости и связанной с костью ткани. Например, в случае хирургической процедуры тропоэластин можно применять только по отношению к кости. Примеры хирургических процедур, при которых тропоэластин можно применять соответственно для содействия остеоиндуктивному или остеокондуктивному окружению, включают: черепное, челюстное и зубное восстановление, артроскопию и менискэктомию колена; артроскопию и декомпрессию плеча; раскрытие запястного канала; артроскопию и хондропластику колена; артроскопию колена и восстановление передней крестообразной связки; полную замену колена; восстановление перелома шейки бедра; восстановление вертельного перелома; артроскопическое восстановление обоих менисков колена; полную замену бедра; артроскопию плеча/удаление дистальной части ключицы; восстановление сухожилия мышцы-вращателя плеча; восстановление перелома лучевой (кости)/локтевой кости; ламинэктомию; восстановление перелома лодыжки (двулодыжечного типа); артроскопию и обработку раны плеча; артродез позвонков поясницы; восстановление перелома дистальной части лучевой кости; операцию на межпозвоночном диске поясницы; разрез сухожильного влагалища Пальца; восстановление перелома лодыжки (малоберцовой кости); восстановление перелома тела бедренной кости; восстановление вертельного перелома. Другие примеры хирургических процедур, при которых может требоваться последующее индуцирование восстановления кости, включают кардиоторакальные операции, при которых требуется разрезание грудины (срединная стернотомия) для получения доступа к содержимому грудной полости.

Тропоэластин можно применять по отношению только к периосту или только эндосту или по отношению как к периосту, так и к эндосту. Например, при возникновении микроперелома или микросверления кости тропоэластин, как правило, будет применяться только по отношению к периосту. При возникновении полного перелома кости в результате травмы (такого как двусторонний перелом диафиза длинной кости) тропоэластин, как правило, будет применяться по отношению как к периосту, так и к эндосту.

Тропоэластин можно применять по отношению к только компактной кости или только губчатой кости или по отношению как к губчатой, так и компактной кости. Например, в случае поверхностного перелома кости, при котором повреждена только компактная кость, тропоэластин будет применяться только по отношению к компактной кости. При повреждении как компактной, так и губчатой кости, и если требуется остеоиндуктивное или остеокондуктивное окружение, - тропоэластин можно применять по отношению как к губчатой, так и компактной кости. В применениях с микросверлением в суставную поверхность, поддерживаемую губчатой костью, тропоэластин можно применять только по отношению к губчатой кости.

Если целью является восстановление дефекта в виде перелома, то тропоэластин можно применять с помощью непосредственного контакта с костью в области перелома, в том числе с одним или несколькими из периоста, эндоста или мозоли. В данном варианте осуществления тропоэластин можно вводить на периост или под него.

Если целью является заполнение отсутствующей части в кости, например, щели, полости, отверстия или т. п., то тропоэластин можно вводить на периост или под него.

В одном варианте осуществления способ предназначен для образования внутримембранной кости, или образования губчатой кости, или обоих.

Как описано в данном документе, настоящее изобретение дополнительно предусматривает индуцирование анаболизма кости. В частности, как проиллюстрировано в данном документе, авторы настоящего изобретения обнаружили улучшения в образовании кости, наблюдаемые при обработке тропоэластином, в результате механизма, в основном включающего анаболизм кости. Данное открытие является значимым, поскольку было обнаружено, что этой функцией обладают несколько других биологических факторов. Анаболизм кости особенно необходим там, где существует клиническая потребность в увеличении плотности кости или увеличении объема кости. Таким образом, в одном варианте осуществления предусматривается способ индуцирования анаболизма кости, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, нуждающегося в индуцировании анаболизма кости,

- предоставление индивидууму количества тропоэластина, эффективного для индуцирования анаболизма кости,

в результате чего у индивидуума индуцируется анаболизм кости.

В одном варианте осуществления индивидуум может нуждаться в лечении для увеличения плотности кости. Например, индивидуум может иметь форму остеопороза.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает увеличение объема костной ткани. В данном варианте осуществления результатом анаболизма могут являться увеличения в любом одном или нескольких размерах кости. Это лечение может быть особенно важным, если целью является улучшение объема неправильно образованной кости. Таким образом, предусматривается способ увеличения объема костной ткани, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, нуждающегося в увеличении объема костной ткани,

- предоставление индивидууму количества тропоэластина, эффективного для увеличения объема костной ткани,

в результате чего у индивидуума увеличивается объем костной ткани.

Если целью является восстановление дефекта в виде низкой плотности кости (например, вследствие остеопороза), то тропоэластин можно применять с помощью непосредственного контакта с костью, в том числе с одним или несколькими из периоста, эндоста или мозоли. В данном варианте осуществления тропоэластин можно вводить на периост или под него. В дополнительном варианте осуществления тропоэластин можно вводить в участок эндоста с помощью микросверления трубчатой кости.

В вышеописанных вариантах осуществления тропоэластин можно применять по отношению к субхондральной кости, т. е. прилегающей к ткани, связанной с костью, или его можно приводить в контакт с костью с обеспечением образования кости в отсутствие хрящевой ткани.

Тропоэластин можно применять по отношению к длинной кости, короткой кости или плоской кости.

В одном варианте осуществления способ может предусматривать введение дополнительного средства для влияния на продуцирование кости. Соединение может являться анаболическим в том смысле, что оно участвует в продуцировании новой кости, или катаболическим в том смысле, что оно вызывает резорбцию кости.

Для лечения перелома, в стерильной воде можно получать композицию, содержащую от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл тропоэластина, предпочтительно от 1,0 до 75 мг/мл тропоэластина, более предпочтительно от 2,0 до 50 мг/мл тропоэластина. Композицию предпочтительно получают в качестве инъецируемой композиции.

Композицию обычно вводят в участок повреждения. В одном варианте осуществления предпочтительно вводить непосредственно в мягкую ткань, прилегающую к перелому. В другом варианте осуществления ее можно вводить с помощью внутрикостной инъекции. Это можно осуществлять в солевом, инъецируемом керамическом или другом носителе с высокой вязкостью.

Предпочтительно, инъекция обеспечивает доставку тропоэластина по меньшей мере на одну, и более предпочтительно одну или несколько противоположных поверхностей, образованных в результате перелома. Обычно предпочтительно обеспечить равномерное применение тропоэластина по отношению ко всем соответствующим противоположным поверхностям.

С клинической точки зрения предпочтительным способом будет являться применение посредством хирургических способов только один раз с другими средствами или без них. Последующие дозы можно применять с помощью подкожной инъекции или местного применения. Введение последующих доз может являться предпочтительным способом предупреждения или лечения инфекции кости. В качестве альтернативы можно применять имплантат, который обеспечивает непрерывное введение in vivo с использованием тропоэластина. Одним примером этого может являться применение изобутирата ацетата сахарозы.

Инъекции, в том числе последующие инъекции, можно проводить более одного раза в неделю, а как правило дважды в неделю, т. е. ''два раза в неделю''. Инъекции можно вводить в течение периода, составляющего приблизительно от трех до четырех недель.

В одном варианте осуществления разовую дозу тропоэластина можно доставлять с помощью инъекции тропоэластина более или менее сразу после перелома.

В другом варианте осуществления тропоэластин можно применять в виде гидрогеля, порошка, Пасты, губки или остова. Предпочтительными могут являться ацеллюлярные коллагеновые губки или другие биорассасываемые носители. Они могут включать карбоксиметилцеллюлозу, коллагеновый порошок или несущую среду с высокой вязкостью, такую как изобутират ацетата сахарозы. Также ее можно доставлять посредством полимерных остовов, в том числе PLLA, PLGA, PGA, PCL. Также ее можно применять местно или с помощью непосредственной инъекции.

В одном варианте осуществления тропоэластин можно применять по отношению к перелому во время перелома или перед гипсованием для закрытых переломов. Для открытых переломов его можно вводить в щель перелома после обработки места раны. Для ран, где подозревается инфекция, его можно вводить рядом с заживающим переломом или в вышеупомянутое внутрикостное пространство.

Результаты лечения можно наблюдать относительно CD31- и TRAP-окрашивания области перелома. Обычно ожидается экспрессия этих молекул. Кроме того, может образовываться мозоль, хотя маловероятно, что мягкая ткань образуется к конечной точке, составляющей 3 недели. Предпочтительно, лечение должно привести к нормальному прогрессированию заживления эндохондральной кости. Оно включает постепенное замещение хрящевой мягкой мозоли грубоволокнистой костью, которая затем ремоделируется в пластинчатую/трубчатую кость.

Ожидается, что эффективное количество тропоэластина может варьироваться в зависимости от обстоятельств, в которых требуется образование кости. Специалистам в данной области техники было бы целесообразно соответствующим образом скорректировать количество, чтобы получить оптимальные результаты. Однако ожидается, что обычно эффективное количество средства будет находиться в диапазоне от 0,1 до 100000 мкг на кг веса тела, более предпочтительно от 1 до 10000 мкг на кг веса тела, и наиболее предпочтительно от приблизительно 10 до 1000 мкг.

В определенных вариантах осуществления тропоэластин можно обеспечивать в дозах, составляющих от приблизительно 0,5 мг до 2000 мг, предпочтительно от 0,5 до 100 мг, более предпочтительно от 1 до 50 мг.

C. Составы

C.1 Тропоэластин, активное средство для индуцирования образования кости

Тропоэластин, применяемый в настоящем изобретении для стимулирования, или индуцирования, или содействия образованию, или продуцирования кости, может быть получен с помощью очищения из подходящего источника (например, из человека или других животных) или получен с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК, таких как описаны например Maniatis, T. et al., [8].

Рекомбинантный тропоэластин может включать модификации (например, аминокислотные замены, делеции и добавления гетерологичных аминокислотных последовательностей), в результате чего осуществляется образование аналогов тропоэластина, которые могут, например, увеличивать биологическую активность или экспрессию соответствующего белка.

В предпочтительных вариантах осуществления в способах по настоящему изобретению применяется аналог SHELδ26A (WO 1999/03886) [9] для различных применений, описанных в данном документе, в том числе для индуцирования роста кости или содействия таковому, для увеличения анаболизма кости, для увеличения плотности или объема кости, или для восстановления перелома, или коррекции дефекта или отсутствующей части в костной ткани. Аминокислотная последовательность SHELδ26A показана под SEQ ID NO: 1 (см. также фигуру 9). В альтернативных вариантах осуществления изоформа тропоэластина представляет собой изоформу SHEL (WO 1994/14958) или протеаза-устойчивое производное изоформ SHEL или SHELδ26A (WO 2000/0403).

Аналоги тропоэластина обычно характеризуются последовательностью, которая является гомологичной последовательности тропоэластина человека. Процент идентичности между Парой последовательностей можно рассчитать с помощью алгоритма, реализованного в компьютерной программе BESTFIT [10]. Другой алгоритм, который рассчитывает расходимость последовательностей, был адаптирован для быстрого поиска базы данных и реализован в компьютерной программе BLAST [11]. По сравнению с последовательностью человека полипептидная последовательность тропоэластина может являться только на приблизительно 60% идентичной на аминокислотном уровне, на 70% или более идентичной, на 80% или более идентичной, на 90% или более идентичной, на 95% или более идентичной, на 97% или более идентичной, или на более чем 99% идентичной.

Консервативные аминокислотные замены (например, Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys, Gln/Asn) также можно учитывать при проведении сравнений, поскольку ожидается, что во многих случаях химическое сходство этих Пар аминокислотных остатков приведет в результате к функциональной равноценности. Аминокислотные замены, которые, как ожидается, сохранят биологическую функцию полипептида, сохранят химические свойства замещенных аминокислотных остатков, таких как гидрофобность, гидрофильность, заряд боковой цепи или размер.

Используемые кодоны также могут быть адаптированы для трансляции в гетерологичном хозяине с помощью принятия предпочтительных использований кодонов хозяина. Это могло бы привести в соответствие трансляционный аппарат гетерологичного хозяина без существенного изменения химической структуры полипептида.

Рекомбинантные формы тропоэластина можно получать, как показано в WO 1999/03886.

C.2 Составы, содержащие тропоэластин

Следует понимать, что тропоэластин доставляют в составы по настоящему изобретению с целью использования биологической активности тропоэластина в индуцировании образования кости. В данном контексте тропоэластин представляет собой активный ингредиент тропоэластин-содержащей композиции для индуцирования образования кости.

В особенно предпочтительном варианте осуществления единственным активным ингредиентом или средством для индуцирования восстановления кости в составе или композиции по настоящему изобретению является тропоэластин. В данном варианте осуществления состав не содержит клетки, такие как остеоциты, или факторы, такие как BMP, для индуцирования образования кости.

Как обсуждается выше, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторое количество тропоэластина, содержащееся в составе в соответствии с настоящим изобретением, не является сшитым, связанным или иным образом ковалентно присоединенным к другим компонентам композиции или состава, например не является присоединенным к остову или матриксу. Это обеспечивает высвобождение по меньшей мере некоторого количества, если не всего тропоэластина, содержащегося в этих составах, из композиции в ткань в участке кости или связанную с костью ткань, которой требуется восстановление, в результате чего обеспечивается стимулирование тропоэластином элементов ткани в данной области для продуцирования кости.

Предпочтительно, по меньшей мере некоторое количество тропоэластина, обеспеченное в составах, является практически мономерным (т. е. не является внутримолекулярно сшитым в какой-либо значительной степени с другими компонентами состава), так что тропоэластин, который доставляется в область повреждения, также является мономерным и может быть высвобожден из состава в область, требующую разрастания или продуцирования кости.

В одном варианте осуществления тропоэластин, обеспеченный в составе, состоит из мономеров, которые не являются ковалентно сшитыми.

В еще одном дополнительном варианте осуществления тропоэластин в составе может содержать как сшитые, так и несшитые формы белка, но как правило содержит больше несшитых форм белка.

В одном варианте осуществления не более чем приблизительно 50% тропоэластина, содержащегося в составе, является сшитым с биомолекулой и/или биополимером, таким как сахаридсодержащая молекула, например, олигосахарид, полисахарид или их производные. В других вариантах осуществления не более чем приблизительно 40%, 30%, 20%, 10% или 5% тропоэластина является сшитым.

В определенных вариантах осуществления количество молекул тропоэластина, не включенных в сшитый белковый матрикс или комплекс и оставшихся несвязанными, составляет предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%.

В определенных вариантах осуществления тропоэластин характеризуется определенной степенью чистоты в соответствии с количеством тропоэластина в композиции для введения, по сравнению с количествами других белков или молекул в композиции. В одном варианте осуществления тропоэластин находится в композиции, которая характеризуется по меньшей мере 75% чистотой, предпочтительно 85% чистотой, более предпочтительно более чем 90% или 95% чистотой. Фрагменты тропоэластина, т. е. усеченные формы изоформы тропоэластина, которые возникают непреднамеренно во время изготовления тропоэластина, в данном контексте можно считать примесью.

Дополнительно следует понимать, что в определенных вариантах осуществления тропоэластин может быть предусмотрен в виде композиции, которая состоит из или фактически состоит из тропоэластина, предпочтительно полноразмерной изоформы тропоэластина. В альтернативных вариантах осуществления тропоэластин будет составлять по меньшей мере 65% длины соответствующей изоформы тропоэластина, более 80% полной длины, более 90% или более 95% полной длины.

Как правило, составы на основе тропоэластина для применения в соответствии с настоящим изобретением характеризуются концентрацией тропоэластина, превышающей приблизительно 1,5 мг/мл (хотя можно также применять более низкие концентрации). Например, предпочтительными являются составы на основе тропоэластина, характеризующиеся концентрацией тропоэластина, составляющей от приблизительно 1,5 мг/мл до приблизительно 400 мг/мл. Более предпочтительно, состав будет характеризоваться концентрацией тропоэластина, составляющей от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 300 мг/мл, еще более предпочтительно от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл.

Как правило, состав по настоящему изобретению содержит компонент, определяющий механические или физические свойства состава. Примеры этих свойств, в случае гидрогелей в качестве примеров составов по настоящему изобретению, описаны ниже. Дополнительно описаны примеры компонентов, которые обычно представляют собой связывающие воду, длинноцепочечные или полимерные молекулы, в том числе гиалуроновую кислоту.

C.3 Гидрогели

Как правило, гидрогель для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит:

- полимерные гидрофильные молекулы, образующие остов и наделяющие гидрогель нижеописанными механическими свойствами;

- воду и

- тропоэластин для индуцирования продуцирования или образования кости или содействия таковым.

Нижеописанные примеры полимерных гидрофильных молекул включают карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гиалуроновую кислоту, ксантановую камедь, гуаровую камедь, β-глюкан, альгинаты, карбоксиметилдекстран.

В одном варианте осуществления гидрогель в соответствии с настоящим изобретением может обеспечивать значение прочности при растяжении, составляющее от 100 кПа до2 МПа. Прочность при растяжении обычно определяется как максимальное напряжение, которое материал может выдерживать при растяжении или вытягивании до того, как поперечное сечение материала начнет значительно растягиваться. Специалисту в данной области техники будут известны подходящие способы для испытания предела прочности материала. Гидрогель по настоящему изобретению может характеризоваться значением предела прочности, находящимся в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 45 кПа (например, от приблизительно 12 до приблизительно 40 кПа).

В другом варианте осуществления гидрогель характеризуется значением прочности при сжатии, составляющим от 50 кПа до 700 кПа. Прочность при сжатии представляет собой способность материала или структуры выдерживать толкающие усилия, направленные вдоль оси. Представлены данные (или график) зависимости силы от деформации для условий способа испытания. По определению, прочность при сжатии материала представляет собой значение одноосевого сжимающего напряжения, достигаемого при полном разрушении материала. Значение прочности при сжатии обычно получают экспериментально с помощью испытания на сжатие. Устройство, применяемое для этого эксперимента, является таким же, как применяется в испытании на растяжение. Однако вместо применения одноосевой растягивающей нагрузки применяют одноосевую сжимающую нагрузку. Как можно представить, образец укорачивается, а также растягивается латерально. Прочность при сжатии часто измеряют на универсальном испытательном устройстве; они варьируются от очень небольших настольных систем до систем с мощностью, составляющей более 53 МН. На измерение прочности при сжатии влияет конкретный способ испытания и условия измерения.

Прочность при сжатии гидрогелей можно определять с применением циклической нагрузки при заданном уровне растяжения (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75% уровне растяжения). Модуль упругости при сжатии гидрогелей может находится в диапазоне от приблизительно 1 кПа до приблизительно 500 кПа.

При сжатии гидрогели могут терять энергию. Потеря энергии может находится в диапазоне от приблизительно 5% до приблизительно 50%. В некоторых вариантах осуществления потеря энергии может составлять от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 35% (например, 23±3,2% или 24,1±7%) или от приблизительно 25% до приблизительно 30% (например, 30,5±6,4 или 26,9±2,3).

В одном варианте осуществления значение растяжения при разрыве гидрогеля составляет от приблизительно 130 до приблизительно 420 кПа. Испытание на растяжение при разрыве осуществляют с помощью растяжения образцов до их разрыва и определения значения растяжения в точке разрыва из кривых растяжение/напряжение.

В определенных вариантах осуществления составы на основе тропоэластина для применения в соответствии с настоящим изобретением могут характеризоваться модулем упругости, составляющим от приблизительно 500 Па до приблизительно 50 Па, от приблизительно 450 Па до приблизительно 100 Па, от приблизительно 400 Па до приблизительно 125 Па; от приблизительно 400 Па до приблизительно 150 Па или от приблизительно 385 Па до приблизительно 150 Па. Модуль упругости будет варьироваться в зависимости от концентрации и используемых компонентов.

В определенных вариантах осуществления гидрогели могут иметь экструдируемую длину, которая является практически когерентной и сохраняется практически без поддержки, составляющую по меньшей мере приблизительно 5 см, 10 см, 12 см, 15 см, 18 см, 20 см или 25 см при экструдировании через иглу 25G. Определенных вариантах осуществления могут иметь экструдируемую длину, которая является практически когерентной и сохраняется практически без поддержки, составляющую по меньшей мере приблизительно 5 см, 10 см, 12 см, 15 см, 18 см, 20 см или 25 см при экструдировании через иглу 27G. Определенные варианты осуществления могут иметь экструдируемую длину, которая является практически когерентной и сохраняется практически без поддержки, составляющую по меньшей мере приблизительно 5 см, 10 см, 12 см, 15 см, 18 см, 20 см или 25 см при экструдировании через иглу 30G или иглу 31G.

Определенные варианты осуществления могут иметь экструдируемую длину, составляющую по меньшей мере приблизительно 5 см, 10 см, 12 см, 15 см, 18 см, 20 см или 25 см через иглу с тонким калибром.

Гидрогели для применения в соответствии с настоящим изобретением могут также поддаваться разбуханию. Термин "поддающийся разбуханию'' относится к гидрогелям, которые практически нерастворимы в средстве, способствующем разбуханию, и способны поглощать значительное количество средства, способствующего разбуханию, в результате чего увеличиваясь в объеме при приведении в контакт со средством, способствующим разбуханию. Как используется в данном документе, термин "средство, способствующее разбуханию" относится к тем соединениям или веществам, которые приводят по меньшей мере к какой-либо степени разбухания. Как правило, средство, способствующее разбуханию, представляет собой водный раствор или органический растворитель, однако средство, способствующее разбуханию, также может представлять собой газ. В некоторых вариантах осуществления средство, способствующее разбуханию, представляет собой воду или физиологический раствор, например фосфатно-солевой буферный раствор или питательные среды.

В некоторых вариантах осуществления гидрогель содержит средство, способствующее разбуханию. В некоторых вариантах осуществления гидрогель может содержать более 50% (вес/об.), более 60% (вес/об.), более 70% (вес/об.), более 80% об., более 90% (вес/об.), более 91% (вес/об.), более 92% (вес/об.), более 93% (вес/об.), более 94% (вес/об.), более 95% (вес/об.), более 96% (вес/об.), более 97% об., более 98% (вес/об.), более 99% (вес/об.) или больше средства, способствующего разбуханию.

Термин ''коэффициент разбухания" используется в данном документе для обозначения веса средства, способствующего разбуханию, в разбухшем гидрогеле на сухой вес гидрогеля перед разбуханием. Например, содержание коэффициента разбухания может находится в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 10 грамм средства, способствующего разбуханию, на грамм тропоэластина в гидрогеле. В некоторых вариантах осуществления содержание коэффициента разбухания может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 5 грамм средства, способствующего разбухания на грамм тропоэластина в гидрогеле. В некоторых вариантах осуществления содержание коэффициента разбухания может составлять приблизительно 1,25, приблизительно 1,5, приблизительно 1,75, приблизительно 2, приблизительно 2,25, приблизительно 2,5, приблизительно 2,75, приблизительно 3, приблизительно 3,25, приблизительно 3,5, приблизительно 3,75, приблизительно 4, приблизительно 4,25, приблизительно 4,5, приблизительно 4,75 или приблизительно 5 грамм средства, способствующего разбуханию, на грамм тропоэластина в гидрогеле. В некоторых вариантах осуществления содержание коэффициента разбухания может составлять 1,2±0,2, 2,3±0,3 или 4,1±0,3 грамма средства, способствующего разбуханию, на грамм тропоэластина в гидрогеле.

В предпочтительных вариантах осуществления составы на основе тропоэластина, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой гидрогели, которые характеризуются подходящими свойствами стойкости, такими как поддержание состава в области доставки в течение достаточного периода для обеспечения высвобождения тропоэластина несколько раз, чтобы тропоэластин мог проявлять свой биологический эффект. Иначе говоря, гидрогель будет, как правило, характеризоваться ''временем удержания'' в области доставки, составляющим более чем 1 неделю, предпочтительно по меньшей мере 2 недели.

В определенных вариантах осуществления гидрогель обычно характеризуется функциональными свойствами (т. е. связыванием воды, механической прочностью, фазовым переходом и перекрестным сшиванием), подходящими для применения в качестве заполнителя кости для индуцирования восстановления раны кости или содействия таковому. В соответствии с настоящим изобретением, эти функциональные свойства преимущественно возникают из-за компонентов, отличных от тропоэластина. Эти компоненты могут являться полимерными и более подробно описаны ниже. Тропоэластин доставляют в гидрогель в целях содействия образованию кости.

Специалист в данной области техники поймет, что гидрогели можно применять в качестве остовов для путей применения в тканевой инженерии благодаря их биосовместимости и высокому содержанию воды, которые напоминают микроокружение природных тканей. Кроме того, специалист в данной области техники поймет, что существуют различные способы модификации механических свойств гидрогелей, в том числе растяжимости гидрогелей для обеспечения увеличенного времени удержания в области доставки, и за счет этого обеспечение увеличенного периода времени высвобождения активного средства (в данном случае тропоэластина в соответствии с настоящим изобретением), содержащегося в гидрогеле.

В одном варианте осуществления после образования гидрогеля гидрогель можно высушивать для обеспечения полимерной подложки, содержащей тропоэластин. В данном варианте осуществления полимерная подложка представляет собой компонент для обеспечения вышеупомянутых структуры и функции. Эту дегидрированную композицию затем можно продавать для применения при восстановлении кости и регидратировать в стерильных условиях перед клиническим применением.

Гидрогели, применяемые в настоящем изобретении, характеризуется свойствами текучести, которые обеспечивают возможность инъекции в место дефекта или раны кости. Это является отличительной чертой по сравнению с другими эластомерными заполнителями кости. В дополнение к способности к инъекции это позволяет гидрогелю протекать через поверхность соответствующей области кости, обеспечивая обширный и полный контакт с поверхностью кости, в результате чего осуществляется улучшение или ускорение восстановления кости.

В одном варианте осуществления характеристики фазового перехода компонентов, которые образуют гидрогель, способны обеспечивать твердение гидрогеля при температуре тела, в результате чего очевидно осуществляется образование подложки или трансплантата, которые находятся в обширном контакте с костной тканью в пределах области раны. Гидрогели для применения в соответствии с настоящим изобретением отличаются от других эластомерных заполнителей кости, которые помещают в участок раны в качестве твердой сборной структуры, которая таким образом имеет ограниченный и необширный контакт с поверхностью кости в пределах участка раны.

В определенных вариантах осуществления составы по настоящему изобретению в данном документе могут характеризоваться свойствами текучести при температурах от 20 до 37°C, предпочтительно при менее 45°C, обеспечивая доставку состава в определенную область с помощью инъекции.

Как правило, гидрогель, применяемый в настоящем изобретении для восстановления раны кости, представляет собой гидрогель, характеризующийся свойствами текучести, обеспечивающими возможность инъекции гидрогеля через иглу с калибром от 18G до 32G, предпочтительно от 26G до 31G, более предпочтительно 27G с минимальным противодавлением большого Пальца. Это инъекционное давление составляет менее 350 кПа, что значительно ниже допустимого диапазона давления для одноразовых шприцев.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления гидрогели по настоящему изобретению содержат гиалуроновую кислоту (HA) для применения в качестве остова. В этих обстоятельствах HA функционирует с обеспечением гидрогелю определенных механических свойств, давая возможность тропоэластину оставаться практически свободным (несшитым) таким образом, что тропоэластин обладает способностью функционировать как биологический фактор, стимулируя и индуцируя образование кости в области, куда вводится гидрогель.

В определенных вариантах осуществления, где гидрогель содержит тропоэластин и гиалуроновую кислоту, массовое соотношение тропоэластина и гиалуроновой кислоты составляет от 0,1:1 до приблизительно 500:1, предпочтительно от приблизительно 0,2:1 до приблизительно 100:1.

В еще других дополнительных вариантах осуществления гидрогель может содержать HA в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1% до приблизительно 15%. В определенных вариантах осуществления гидрогель может содержать HA в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%.

Гидрогель может содержать дериватизированную HA или недериватизированную HA для контроля степени, до которой HA перекрестно сшивается сама с собой и/или с мономерным белком.

В определенных вариантах осуществления HA может содержать по меньшей мере один сшиваемый фрагмент, такой как по меньшей мере один перекрестно сшиваемый фрагмент, например, карбоксильную группу, гидроксильную группу, амин, тиол, спирт, алкен, алкин, цианогруппу или азид, и/или их модификации, производные или комбинации.

В определенных вариантах осуществления HA может содержать спейсерную группу таким образом, что спейсерная группа способна связываться с той же и/или второй молекулой, например второй биомолекулой или биополимером.

Количество HA, используемой в гидрогеле, может находится в диапазоне от приблизительно 100 до 300 сахаридных единиц или остатков, например примерно 200 сахаридных единиц или остатков. В других вариантах осуществления гиалуроновую кислоту можно использовать в диапазоне от 200 до 20000 сахаридных единиц или остатков.

В определенных вариантах осуществления HA может являться низко- или высокомолекулярной, и при этом ее выбор будет варьироваться в зависимости от намерений специалиста в данной области техники по отношению к модификации вязкости гидрогеля. Например, использование гиалуроновой кислоты с более низкой молекулярной массой обеспечивает возможность модификации, осаждения и промывания гиалуроновой кислоты, и при этом гиалуроновая кислота остается достаточно низковязким раствором, который можно легко использовать в качестве сшивающего средства. Применение полисахаридов с более высокой молекулярной массой может обеспечивать дополнительные проблемы со способами использования (например, вязкий раствор, проблемы со смешиванием, аэрацией и т. д.), однако в определенных вариантах осуществления для достижения требуемых результатов можно использовать широкий диапазон значений молекулярной массы.

В определенных вариантах осуществления HA можно активировать и/или модифицировать с помощью активирующего средства, такого как EDC или аллилглицидиловый эфир, и/или модифицирующего средства, такого как NHS, HOBt или бромин.

Термин "гиалуроновая кислота" или "HA" может включать гиалуроновую кислоту и любую из ее гиалуронатных солей, в том числе, например, гиалуронат натрия (соль натрия), гиалуронат калия, гиалуронат магния и гиалуронат кальция. В данном документе можно применять гиалуроновую кислоту из различных источников. Например, гиалуроновую кислоту можно экстрагировать из животных тканей, собирать в качестве продукта бактериальной ферментации или получать в коммерческих количествах с помощью технологии биопроцесса.

В одном варианте осуществления гидрогели по настоящему изобретению содержат сополимер NIPAAm, NAS, HEMA-PLA и OEGMA(PNPHO; предпочтительно полимер, характеризующийся составом на основе 73% N-изопропилакриламида, 8% лактида, 5% этиленгликоля, 14% N-акрилоксисукцинимида).

В гидрогелях на основе PNPHO-тропоэластин, тропоэластин и PNPHO выполняют определенные роли. Тропоэластин служит источником биоактивной передачи сигнала для восстановления кости, а PNPHO выступает в качестве остова с обеспечением гидрогелю свойств стойкости.

Полимер PNPHO химически связан с тропоэластином (a) с целью регулирования физико-химических свойств этого биополимера для применения по отношению к кости, (b) для вызывания быстрого термоотверждения гидрогелевого заполнителя, чтобы локально его ограничить, а также (c) для придания инъецируемым гидрогелям свойств биорастворимости. Комбинация этих двух основных сегментов приводит в результате к образованию нового класса умных заполнителей кости с рядом благоприятных свойств для заживления кости.

Специалист в данной области техники поймет, что при изменении относительного соотношения тропоэластина и PNPHO можно модифицировать степень, до которой гидрогель обеспечивает тропоэластин в практически свободной форме. Иначе говоря, уменьшая содержание PNPHO (и увеличивая общее содержание тропоэластина) в гидрогеле можно увеличить количество свободного тропоэластина в гидрогеле, что является желательным для настоящего изобретения, поскольку тропоэластин должен характеризоваться способностью диффундировать из гидрогеля с целью проявления своего физиологического и биологического эффектов.

В одном варианте осуществления конечное молярное соотношение тропоэластина и PNPHO в гидрогеле составляет 10 (тропоэластин): 1 (PNPHO). В предпочтительном варианте осуществления конечное молярное соотношение тропоэластина и PNPHO в гидрогеле составляет 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, более предпочтительно 1:1.

Подходящие полисахариды, которые также можно включать в гидрогели, включают карбоксицеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу (HPC), гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC), гидроксипропилцеллюлозу, карбоксиметиламилозу ("CMA"), ксантановую камедь, гуаровую камедь, β-глюкан, альгинаты, карбоксиметилдекстран, производное гликозаминогликана, хондроитин-6-сульфат, дерматинсульфат, полимолочную кислоту (PLA) или биоматериалы, такие как полигликолиевая кислота (PGA), сополимер молочной и гликолевой кислоты (PLGA), трикальцийфосфат (TCP), 1-гидроксиапатит (PAH) и их фармацевтически приемлемые соли. В качестве альтернативы полисахарид может представлять собой пектин или его производное, в том числе линейные и разветвленные полисахариды.

Если остовные средства, применяемые в гидрогелях на основе тропоэластина, представляют собой карбоксиметилцеллюлозу или ксантановую камедь, то средство может быть предоставлено в количестве, составляющем от приблизительно 0,01 до 10 процентов (вес/об.), предпочтительно в количестве, составляющем от 0,5 до 3,5 процентов (вес/об.).

Остов может представлять собой сшитый или несшитый полисахарид, как правило имеющий замещение или дополнительную боковую цепь.

Дополнительный остов может включать остовы, полученные из полиметакрилатов, полиэтиленгликолей и (блок) сополимеров с полиэтиленгликолевыми субъединицами (например, полоксамер 188 и полоксамер 407). Альтернативные средства, включенные в гидрогели, включают поверхностно-активные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и полисорбаты или Пантотенол, полиэтиленгликоли, ксантановая камедь, гуаровая камедь, полисорбат 80, N-ацетилглюкозамин и их фармацевтически приемлемые соли.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения и дополнительные варианты осуществления аспектов, описанные в предыдущих абзацах, станут очевидными из нижеследующего описания, приведенного в качестве примера и со ссылкой на прилагаемые графические материалы.

Примеры

Пример 1. Биомеханические свойства геля на основе тропоэластина

Модель асептического острого перелома большеберцовой кости ex vivo применяли для оценки биомеханических свойств тропоэластина, предоставленного в гидрогеле на основе сополимера (NIPAAm, и NAS, и (HEMA-PLA) и OEGMA) (PNPHO) (гидрогель на основе TE-PNPHO). Вкратце, гидрогель на основе TE-PNPHO инъецировали в асептический перелом большеберцовой кости свежего трупа овцы. Гидрогель на основе тропоэластина приклеивался к кости и заполнял перелом, вступая в контакт с поверхностями перелома на периостеальных и эндостеальных краях и между ними, как показано на фигуре 1.

Испытание повторяли для 6 независимых переломов большеберцовой кости, и в каждом случае измеряли значения механической прочности костей. Неожиданно, после инъекции гидрогеля на основе тропоэластина 80% прочности кости восстанавливалось. Такое поведение моделировали на адгезионных свойствах инъецируемой ткани в сочетании с вязкоупругими характеристиками гидрогелей. Также провели контрольные измерения и подтвердили, что данный эффект возникал из-за присутствия тропоэластина, поскольку в отсутствие тропоэластина механическая прочность не восстанавливалась.

Пример 2. Способность проходить через иглу при инъекции, цитосовместимость и клеточная инфильтрация геля на основе тропоэластина

Исследования in vivo осуществляли с целью оценки способности проходить через иглу при инъекции, цитосовместимости и стабильности гидрогеля на основе тропоэластин-PNPHO, применяемого в соответствии с настоящим изобретением. Высокие адгезионные свойства ткани и быстрое время гелеобразования тропоэластина-PNPHO устраняют потребность в швах или любых других физических поддержках для удержания инъецированного гидрогеля на месте. Гидрогель удерживали в области инъекции в течение до 8 недель (фигура 2). Для гистохимической оценки цитосовместимости и биологических свойств in vivo имплантатов в различные точки времени использовали эксплантированные образцы.

Результаты образцов, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E), продемонстрировали замечательные свойства цитосовместимости гидрогелей на основе тропоэластина. Через неделю после инъекции наблюдали всего лишь легкую воспалительную реакцию на тропоэластин. Окрашивание образцов с помощью H&E, показанное на фигуре 3, продемонстрировало, что фиброзные ткани вокруг гидрогеля укладывались в течение периода от одной недели до двух недель после операции. На фигуре 3 трихромное окрашивание образцов по Миллигану (MT) на второй неделе продемонстрировало инфильтрацию дермальных фибробластов и отложение коллагена de novo в пределах гидрогелей на основе тропоэластина.

Пример 3. Модель восстановления кости у овцы

Модель у овцы получали в виде остеотомии от передней до задней поверхности через диафиз большеберцовой кости. Все овцы были в возрасте 2-3 года. После анестезии, для резекции 3 мм сегмента правой средней доли диафизарной большеберцовой кости каждой овцы применяли осциллирующую костную пилу (фигура 4A). Поврежденный участок кости стабилизировали с помощью стандартной 3,5 мм костной пластинки длиной 13 мм и закрепляли со смещением, составляющим 2,5 мм, к непросверленной части кортикальной большеберцовой кости с помощью подходящих винтов (фигура 4). Затем щель в кости заполняли с помощью тропоэластинсодержащих гидрогелей или оставляли пустым в качестве отрицательного контроля. Тропоэластинсодержащие гидрогели представляли собой либо гидрогель на основе PNPHO (гидрогель на основе TE-PNPHO) (фигура 4B) или гидрогель на основе HA (гидрогель на основе TE-HA) (фигура 4C). Тропоэластинсодержащие гели немедленно вводили в область остеотомии, где они полностью заполняли щель. Операционную рану закрывали с помощью 3/0 полидиоксаноновых подкожных и внутрикожных непрерывных швов.

Сканирование с помощью рентгеновской компьютерной томографии (CT) осуществляли через 0, 4 и 8 недель после операции. Образцы для гистологических анализов собирали на 8 неделе после операции.

Результаты

A. Контроли

Отбор образца был затруднен, так как кость разваливалась в случае сбора образцов в области остеотомии.

Наблюдаемые микроскопические характеристики: периост была слегка утолщен гиперпластическими клетками с минимальными количествами межклеточного коллагенового матрикса (фигура 5). Дефект в кости был заполнен незрелой грубоволокнистой костью с внутритрабекулярными пространствами, которые были заполнены недифференцированной сосудистой тканью. Умеренное ремоделирование швов костных трабекул присутствовало в виде рассеивания остеокластных областей резорбции и крупных остеобластов, выстилающих некоторые из костных швов

Незрелая грубоволокнистая кость образовалась и была плотнее на надкостнице по сравнению с участком эндоста. Ткань костного мозга присутствовала в участке эндоста. Прочность кости без механической пластинки являлась минимальной.

B. Испытываемые образцы

Отбор образцов был относительно легким, поскольку область остеотомии и кость держались вместе при получении/сборе образцов.

Наблюдаемые микроскопические характеристики (фигура 5): широкий просвет, составляющий около 5 мм, покрытый надкостничным слоем в основном из фиброзной ткани, содержал несколько небольших костных трабекул. Стенки просвета в основном состояли из кортикальной части от диафиза большеберцовой кости (перед распиливанием). Некоторое количество недавно образованной кости возникало в видимых глубоких углах просвета, но большая часть просвета содержала открытую умеренно плотную сосудисто-волокнистую ткань с редкими небольшими костными трабекулами. Дно просвета представляло собой плотную репаративную компактную кость около 3 мм толщиной. Эта дугообразная плотная кость по-видимому имела эндостеальное происхождение.

В участке эндоста образовывалась прочная трубчатая кость. Образование трубчатой кости в эндосте обеспечивало быстрое восстановление механической прочности ткани. Некоторое количество губчатой кости также наблюдали в области остеотомии вблизи периоста. Щель остеотомии уменьшалась с 3 мм до 1,8 мм. Эндостальная компактная трубчатая кость соединяла диафизарные сегменты большеберцовой кости. Значительная прочность была достигнута с помощью эндостеальной репаративной кости.

На CT-изображениях областей остеотомии (фигура 6), полученных через 0, 4 и 8 недель после операции, показаны четкие линии разреза кости сразу после операции, которые начинают размываться к 4 неделе и заполняться к 8 неделе по мере восстановления кости. Было показано, что обработка дефекта кости с помощью тропоэластинсодержащих гелей как ускоряет, так и улучшает заживление кости, что свидетельствует о том, что материалы являются как остеокондуктивными, так и остеоиндуктивными.

Обсуждение

Контрольные дефекты заполнялись открытой губчатой костью, которая заполняла область остеотомии до надкостничного фиброзного слоя и которую можно проследить, простирающейся от ткани костного мозга. Прочность кости без механической пластинки являлась минимальной.

Напротив, испытываемые образцы образовали плотную дугу из эндостеальной компактной кости, соединяющей диафизарные сегменты большеберцовой кости.

Хотя большая часть области остеотомии, не была заполнена остеогенной тканью, значительная прочность достигалась с помощью эндостеальной репаративной кости. Это обеспечило сбор образцов без разрушения после удаления механической пластинки и винтов.

Пример 4. Модель восстановления дефекта кости у кролика

Схема эксперимента

Животные: Новозеландские белые кролики возрастом 7-8 месяцев, 3,0-4,5 кг. N = 6/группа.

Группы 1 и 2

На медиальном мыщелке бедренной кости животных получали дефекты кости критического размера. Дефекты имели диаметр 3 мм, глубину 3 мм (полная толщина) (фигура 7A). В дефекты вводили цилиндрические трансплантаты, содержащие тропоэластин (группа 1, испытываемые животные) или носитель (группа 2, контрольные животные).

Восстановления дефектов оценивали на 4-й и 8-й неделях после повреждения и введения трансплантатов.

Анализ

Восстановление дефектов оценивали с использованием методик визуализации (μCT и MRI) и гистологических анализов (гематоксилин и эозин для определения нормальных гистологических характеристик, трихромного окрашивания по Массону (для оценки коллагеновых волокон) и иммуногистохимии (для выявления тропоэластина).

Результаты

Гель на основе тропоэластина удерживался в области инъекции (фигура 7). Кроме того, инъекция геля на основе тропоэластина в область повреждения у кроликов приводила в результате к образованию кости. Анализ μCT продемонстрировал увеличение объема кости на 4-й и 8-й неделях у испытываемых животных по сравнению с контрольными животными (фигура 8). Результаты из анализа μCT продемонстрировали, что инъекция геля на основе тропоэластина в дефекты кости критического размера значительно увеличивало восстановление кости по сравнению с контрольными группами (незаполненные отсутствующие части).

Пример 5. Синтез гидрогелей на основе TE-HA

Гидрогели, содержащие тропоэластин с гиалуроновой кислотой в качестве остова (гидрогели на основе TE-HA), получали с помощью объединения раствора рекомбинантного тропоэластина человека (200 мг/мл) с фосфатно-солевым буферным раствором, после чего следовало добавление дериватизированной HA до конечной концентрации, составляющей около 50 мг/мл. Комбинации тщательно смешивали, после чего следовало короткое центрифугирование для удаления пузырьков воздуха. Материал оставляли на 30 мин. при комнатной температуре до составления. Затем в ламинарном боксе стерильный шприц объемом 1 мл наполняли гидрогелем.

Таким способом получали сходные гидрогели, содержащие тропоэластин в конечной концентрации, составляющей от приблизительно 10 мг/мл до 100 мг/мл.

Все составы, полученные таким способом, характеризовались свойствами твердых материалов, которые экструдировались через иглы с тонким калибром 27G в виде когерентных нитей 10-20 см длиной.

Гидрогели на основе тропоэластина, полученные таким способом, содержали высокие уровни несшитого тропоэластина, так что тропоэластин мог свободно высвобождаться из гидрогеля в области доставки и был способен содействовать образованию кости.

Гидрогели на основе тропоэластина и гиалуроновой кислоты, полученные таким способом, применяли в различных экспериментах in vivo, и при этом они продемонстрировали увеличенное время стойкости и способность индуцировать образование кости (как показано в примере 3).

Пример 6. Синтез гидрогелей на основе TE-PNPHO

Гидрогели, содержащие тропоэластин с PNPHO в качестве остова (гидрогели на основе TE-PNPHO), получали с помощью объединения тропоэластина и PNPHO до конечной концентрации, составляющей 30 мг/мл тропоэластина и 10 мг/мл PNPHO (эквивалент молярному соотношению 1:1).

В одном способе сополимер на основе PNPHO растворяли в PBS в течение 24 ч. Раствор тропоэластина добавляли к раствору PNPHO и инкубировали при 4°C в течение еще 24 ч.

В качестве альтернативы, в то же время осуществляли растворение PNPHO и конъюгирование белка.

В третьем способе PNPHO растворяли и конъюгировали с белком, полученным в природных условиях на шейкере.

В дополнительном способе порошок конъюгата PNPHO-тропоэластин получали с помощью лиофилизации раствора PNPHO-тропоэластин. Порошок конъюгата растворяли в PBS на шейкере с образованием конечного полимерного раствора.

Раствор тропоэластин-PNPHO, образованный с помощью различных методик, превращали в гидрогель с помощью повышения температуры до 37°C. Гидрогели на основе тропоэластина, полученные таким способом, содержали высокие уровни несшитого тропоэластина, так что тропоэластин мог свободно высвобождаться из гидрогеля в области доставки и был способен содействовать образованию кости. Эти гидрогели применяли в различных экспериментах in vivo, и при этом они продемонстрировали увеличенное время стойкости и способность индуцировать образование кости (как показано в примерах 1-4).

SEQ ID NO:1 аминокислотная последовательность SHELδ26A:

Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys

ССЫЛКИ

1. Giannoudis, P.V., H. Dinopoulos, and E. Tsiridis, Bone substitutes: An update. Injury, 2005. 36(3, дополнение): p. S20-S27.

2. Panagiotis, M., Classification of non-union. Injury, 2005. 36(4, дополнение): p. S30-S37;

3. Zeckley, C., et al., The Aseptic Femoral and Tibial Shaft Non-Union in Healthy Patients - An Analysis of the Health-Related Quality of Life and the Socioeconomic Outcome. The Open Orthopaedics Journal, 2011. 5: p. 193-7;

4. Schindeler, A., et al., Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2008. 19(5): p. 459-466;

5. Pape, H., A. Evans, and P. Kobbe, Autologous bone graft: properties and techniques. Journal of orthopaedic trauma, 2010. 24(дополнен. 1): p. S36-40.;

6. Lavini, F., C. Dall'Oca, and P. Bartolozzi, Bone transport and compression-distraction in the treatment of bone loss of the lower limbs. Injury, 2010. 41(11): p. 1191-1195;

7. Bobroff, G., S. Gold, and D. Zinar, Ten year experience with use of Ilizarov bone transport for tibial defects. Bulletin (Hospital for Joint Diseases (Нью-Йорк, Нью-Йорк)), 2003. 61(3-4): p.101-7;

8. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press;

9. Wu et al., (1999) Journal of Biological Chemistry, 274: 21719-21724;

10. Smith & Waterman. J. Mol. Biol. 147:195-197, 1981; Pearson, Genomics 11 :635-650, 1991;

11. Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997;

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Elastagen Pty Ltd

<120> Formation of bone

<130> 50146093TPG

<150> AU2015903565

<151> 2015-09-01

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 698

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gly Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe

1 5 10 15

Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Gly Lys Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly

35 40 45

Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala

50 55 60

Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala

65 70 75 80

Lys Ala Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly

85 90 95

Val Ser Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro

100 105 110

Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val

115 120 125

Leu Pro Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro

130 135 140

Thr Gly Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe

145 150 155 160

Ala Gly Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val

165 170 175

Pro Leu Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly

180 185 190

Leu Pro Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly

195 200 205

Val Ala Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val

210 215 220

Gly Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe

225 230 235 240

Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val

245 250 255

Pro Gly Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val

260 265 270

Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala

275 280 285

Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly

290 295 300

Pro Gly Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val

305 310 315 320

Pro Gly Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala

325 330 335

Ala Val Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

340 345 350

Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile

355 360 365

Pro Thr Tyr Gly Val Gly Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly

370 375 380

Val Gly Gly Ile Pro Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val

385 390 395 400

Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln

405 410 415

Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala

420 425 430

Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val

435 440 445

Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly

450 455 460

Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly

465 470 475 480

Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly

485 490 495

Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala

500 505 510

Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly

515 520 525

Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly

530 535 540

Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Ala Val Pro Gly Ala

545 550 555 560

Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val

565 570 575

Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val

580 585 590

Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

595 600 605

Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu

610 615 620

Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile

625 630 635 640

Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu

645 650 655

Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala

660 665 670

Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys

675 680 685

Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys Arg Lys

690 695

<---