ПЕСТИЦИДНЫЕ ГЕНЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 62/095524, зарегистрированной 22 декабря 2014 года, содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Настоящее изобретение относится к способам и композициям для контроля вредителей, в частности, вредителей растений.

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ВИДЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА ПОСРЕДСТВОМ EFS-WEB

[0003] Официальная копия списка последовательностей подана в электронном виде посредством EFS-Web в виде списка последовательностей в формате ASCII с файлом под названием AgB006.PCT_SEQLIST.txt, созданном 14 декабря 2015 года, имеющим размер 956 KB и поданным одновременно с описанием. Список последовательностей, содержащийся в этом документе в формате ASCII, является частью описания и включен в настоящее описание путем ссылки в полном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Вредители, заболевания растений и сорняки могут представлять собой серьезную угрозу сельскохозяйственным культурам. Потери по причине вредителей и заболеваний оценивают в 37% сельскохозяйственной продукции по всему миру, при этом 13% - по причине насекомых, бактерий и других организмов.

[0005] Токсины являются детерминантами вирулентности, играющими важную роль в патогенности микробов и/или уклонении от иммунного ответа хозяина. Токсины грамположительных бактерий Bacillus, в частности Bacillus thuringiensis, используют в качестве инсектицидных белков (в целом, обозначаемых как токсины Bt). В современных стратегиях используют гены, экспрессирующие эти токсины, для получения трансгенных сельскохозяйственных культур. Трансгенные сельскохозяйственные культуры, экспрессирующие инсектицидные белковые токсины, используют для борьбы с повреждением культур насекомыми.

[0006] Хотя использование токсинов Bacillus является успешным в контроле насекомых, у некоторых целевых вредителей во многих частях света, где такие токсины широко используют, развилась резистентность к токсинам Bt. Одним из способов решения этой проблемы является высевание сельскохозяйственных культур Bt в рядах, чередующихся с обычными не-Bt сельскохозяйственными культурами (заказник). Альтернативным способом избежания или замедления развития резистентности насекомых является пакетирование инсектицидных генов с разными механизмами действия против насекомых в трансгенных растениях. В современной стратегии использования трансгенных сельскохозяйственных культур, экспрессирующих инсектицидные белковые токсины, значительный упор сделан на открытие новых токсинов, помимо уже полученных из бактерий B. thuringiensis. Новые токсины могут оказаться применимыми в качестве альтернатив полученным из B. thuringiensis для размещения в резистентных к насекомым и вредителям трансгенных растениях. Таким образом, необходимы новые белки-токсины.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0007] На фигуре 1 представлено выравнивание аминокислот SEQ ID NO: 8, 9, 123 и 124. Подчеркнуты области, в которых аминокислоты различаются между четырьмя полипептидами.

[0008] На фигуре 2 представлено выравнивание аминокислот SEQ ID NO: 25, 26, 125 и 126. Подчеркнуты области, в которых аминокислоты различаются между четырьмя полипептидами.

[0009] На фигуре 3 представлено выравнивание аминокислот SEQ ID NO: 72, 94, 127 и 128. Подчеркнуты области, в которых аминокислоты различаются между четырьмя полипептидами.

[0010] На фигуре 4 представлено выравнивание аминокислот SEQ ID NO: 70, 71, 129, 130 и 131. Подчеркнуты области, в которых аминокислоты различаются между пятью полипептидами.

[0011] На фигурах 5A-5H представлено выравнивание аминокислот SEQ ID NO: 6, 7, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и 159. Подчеркнуты области, консервативные в каждом из полипептидов. Консервативные области, присутствующие в этом выравнивании, приведены в таблице 4.

[0012] На фигуре 6 представлена взаимосвязь процента идентичности последовательности каждой из SEQ ID NO: 6 и 132-159.

[0013] На фигуре 7 представлено руководство по анализу (матрица размер × смертность), используемому в биологическом анализе западного кукурузного жука.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0014] Настоящее изобретение относится к композициям, имеющим пестицидную активность, и способам их применения. Композиции включают выделенные и рекомбинантные полипептидные последовательности, имеющие пестицидную активность, рекомбинантные и синтетические молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пестицидные полипептиды, конструкции ДНК, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, клетки-хозяева, содержащие векторы, и антитела против пестицидных полипептидов. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, представленные в настоящем описании, можно использовать в конструкциях ДНК или экспрессирующих кассетах для трансформации и экспрессии в интересующих организмах, включая микроорганизмы и растения.

[0015] Композиции и способы, представленные в настоящем описании, применимы для получения организмов с повышенной резистентностью или толерантностью к вредителям. Эти организмы и композиции, содержащие организмы, являются желательными для сельскохозяйственных целей. Настоящее изобретение также относится к трансгенным растениям и семенам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую пестицидный белок по изобретению. Такие растения резистентны к насекомым и другим вредителям.

[0016] Настоящее изобретение относится к способам получения различных полипептидов, представленных в настоящем описании, и применения этих полипептидов для контроля или уничтожения вредителя. Также включены способы и наборы для детекции полипептидов по изобретению в образце.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0017] Настоящее изобретение далее в настоящем описании будет более подробно описано со ссылкой на сопутствующие чертежи, на которых представлены некоторые, но не все, варианты осуществления изобретения. Фактически, настоящее изобретение будут осуществлять во множестве разных форм, и их не следует истолковывать в качестве ограничения вариантов осуществления, приведенных в настоящем описании; наоборот, эти варианты осуществления представлены таким образом, что настоящее описание будет удовлетворять соответствующим юридическим требованиям. Подобные числа относятся к подобным элементам на всем протяжении описания.

[0018] Многие модификации и другие варианты осуществления изобретения, приведенного в настоящем описании, будут очевидны специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение, пользуясь руководством, представленным в изложенном описании и прилагаемых чертежах. Таким образом, следует понимать, что изобретение не ограничено конкретными описываемыми вариантами осуществления, и что модификации и другие варианты осуществления должны быть включены в объем формулы изобретения. Хотя в настоящем описании используют конкретные термины, их используют исключительно в общем и описательном смысле, а не для ограничения.

I. Полинуклеотиды и полипептиды

[0019] Настоящее изобретение относится к композициям и способу придания пестицидной активности организму. Модифицированный организм проявляет резистентность или толерантность к вредителям. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным пестицидным белкам или их полипептидам, фрагментам и вариантам, сохраняющим пестицидную активность, и они включают приведенные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159. Пестицидные белки являются биологически активными (например, являются пестицидными) в отношении вредителей, включая насекомых, грибов, нематод и т.п. Полинуклеотиды, кодирующие пестицидные полипептиды, включая, например, SEQ ID NO: 1-159 или их активные фрагменты или варианты, можно использовать для получения трансгенных организмов, таких как растения и микроорганизмы. Трансформированные организмы отличаются геномами, содержащими по меньшей мере одну стабильно встроенную конструкцию ДНК, содержащую кодирующую последовательность пестицидного белка, представленного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность функционально связана с промотором, регулирующим экспрессию кодируемого пестицидного полипептида. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансформированным микроорганизмам, растительным клеткам, тканям растений, растениям, семенам и частям растений. Общие сведения о различных полипептидах, их активных вариантах и фрагментах и полинуклеотидах, кодирующих их, приведены ниже в таблице 1. Как указано в таблице 1, настоящее изобретение относится к различным формам полипептидов. Настоящее изобретение относится к полноразмерным пестицидным полипептидам, а также модифицированным версиям исходной полноразмерной последовательности (обозначаемым как варианты). В таблице 1 дополнительно приведены последовательности "CryBP1". Такие последовательности (SEQ ID NO: 24, 67 и 73) содержат акцессорные полипептиды, которые можно связывать с некоторыми из генов токсинов. В некоторых случаях последовательности CryBP1 можно использовать в отдельности или в комбинации с любым из пестицидных полипептидов, представленных в настоящем описании. В таблице 1 дополнительно приведены C'-концевые полипептиды Split-Cry (SEQ ID NO: 3, 74, 77, 80 и 91). Такие последовательности содержат последовательность нижележащего белка, имеющего гомологию с C'-концом класса Cry генов токсинов и, как правило, обнаруживаемого после гена Cry, не являющегося полноразмерным, и в котором отсутствует C'-концевая область.

Таблица 1. Общие сведения о SEQ ID NO, классе генов и их вариантах

i. Классы пестицидных белков

[0020] Пестицидные белки, представленные в настоящем описании, и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, применимы в способах воздействия на вредителей. Т.е. композиции и способы по изобретению находят применение в сельском хозяйстве для контроля или уничтожения вредителей, включая вредителей многих сельскохозяйственных культур. Пестицидные белки, представленные в настоящем описании, являются белками-токсинами из бактерий и проявляются активность в отношении конкретных вредителей. Пестицидные белки относятся к нескольким классам токсинов, включая токсины Cry, Cyt, BIN, Mtx. См., например, таблицу 1 на предмет классификации конкретных белков различных SEQ ID NO, представленных в настоящем описании. Кроме того, на всем протяжении настоящего описания сделаны ссылки на записи в базе данных Pfam. База данных Pfam является базой данных семейств белков, каждое из которых представлено посредством множественного выравнивания последовательностей и профиля скрытой марковской модели. Finn et al. (2014) Nucl. Acid Res. Выпуск базы данных 42:D222-D230.

[0021] Bacillus thuringiensis (Bt) является грамположительной бактерией, продуцирующей инсектицидные белки в виде кристаллических включений в течение фазы споруляции. Белковоподобные включения Bt названы кристаллическими белками или δ-эндотоксинами (или белками Cry), токсичными для членов класса Insecta и других беспозвоночных. Аналогично, белки Cyt являются параспоральными белками включений из Bt, проявляющими гемолитическую (цитолитическую) активность или имеющими очевидное сходство последовательности с известным белком Cyt. Эти токсины высокоспецифичны для их целевого организма, безвредны для людей, позвоночных и растений.

[0022] В структуре токсинов Cry обнаружено пять консервативных блоков аминокислот, сконцентрированных, в основном, в центре домена или в соединении между доменами. Токсин Cry состоит из трех доменов, каждый из которых имеет специфическую функцию. Домен I является пучком из семи α-спиралей, в котором центральная спираль полностью окружена шестью внешними спиралями. Этот домен вовлечен в образование канала в мембране. Домен II выглядит как треугольная колонна из трех антипараллельных β-листов, схожих с антигенсвязывающими областями иммуноглобулинов. Домен III содержит антипараллельные β-тяжи в форме β-сэндвича. N-концевая часть белка-токсина отвечает за его токсичность и специфичность и содержит пять консервативных областей. C-концевая часть, как правило, высококонсервативна и, вероятно, отвечает за образование кристаллов. См., например, патент США № 8878007.

[0023] Штаммы B. thuringiensis демонстрируют широкий спектр специфичности в отношении различных отрядов насекомых (Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera или Mallophaga и Acari) и других беспозвоночных (Nemathelminthes, Platyhelminthes и Sarocomastebrates). Белки Cry классифицируют по группам с учетом токсичности для различных групп насекомых и беспозвоночных. Как правило, белки Cry I демонстрируют токсичность по отношению к чешуекрылым, белки Cry II - по отношению к чешуекрылым и двукрылым, белки CryIII - по отношению к жесткокрылым, белки Cry IV - по отношению к двукрылым, и белки Cry V и Cry VI - по отношению к нематодам. Новые белки Cry можно идентифицировать и приписывать группе Cry с учетом идентичности аминокислотной последовательности. См., например, Bravo, A. (1997) J. of Bacteriol. 179:2793-2801; Bravo et al. (2013) Microb. Biotechnol. 6:17-26, включенные в настоящее описание путем ссылок.

[0024] Более 750 различных последовательностей генов cry классифицируют на 73 группы (Cry1-Cry73), при этом продолжают обнаруживать новых членов этого семейства генов (Crickmore et al. (2014) www.btnomenclature.info/). Семейство генов cry состоит из нескольких филогенетически неродственных семейств белков, имеющих различные механизмы действия: семейство трехдоменных токсинов Cry, семейство москитоцидных токсинов Cry, семейство бинарно-подобных токсинов и семейство токсинов Cyt (Bravo et al., 2005). Некоторые штаммы Bt продуцируют дополнительные инсектицидные токсины, названные токсинами VIP. Также см. Cohen et al. (2011) J. Mol. Biol. 413:4-814; Crickmore et al. (2014) Bacillus thuringiensis toxin nomenclature, found on the World Wide Web at lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/; Crickmore et al. (1988) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813; Gill et al. (1992) Ann. Rev. Entomol. 37: 807-636; Goldbert et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:2716-2712; Knowles et al. (1992) Proc. R. Soc. Ser. B. 248: 1-7; Koni et al. (1994) Microbiology 140: 1869-1880; Lailak et al. (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 435: 216-221; Lopez-Diaz et al. (2013) Environ. Microbiol. 15: 3030-3039; Perez et al. (2007) Cell. Microbiol. 9: 2931-2937; Promdonkoy et al. (2003) Biochem. J. 374: 255-259;Rigden (2009) FEBS Lett. 583: 1555-1560; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 775-806; Soberon et al. (2013) Peptides 41: 87-93; Thiery et al. (1998) J. Am. Mosq. Control Assoc. 14: 472-476; Thomas et al. (1983) FEBS Lett. 154: 362-368; Wirth et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 10536-10540; Wirth et al (2005) Appl. Environ. Microbiol. 71: 185-189; и Zhang et al. (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70: 2199-2204; каждая из которых включена в настоящее описание путем ссылки в полном объеме.

[0025] Cyt означает параспоральный кристаллический белок включения из Bacillus thuringiensis с цитолитической активностью или белок со сходством последовательности с известным белком Cyt. (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813). Ген обозначают как cyt. Эти белки отличаются по структуре и активности от белков Cry (Gill et al. (1992) Annu. Rev. Entomol. 37: 615-636). Впервые токсины Cyt обнаружены в подвиде B. thuringiensis israelensis (Goldberg et al. (1977) Mosq. News. 37: 355-358). Существует 3 семейства токсинов Cyt, включая 11 голотипов токсинов в существующей номенклатуре (Crickmore et al. (2014) Bacillus thuringiensis toxin nomenclature, found on the World Wide Web at lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Большинство изолятов B. thuringiensis с генами cyt демонстрируют активность в отношении двукрылых насекомых (в частности, комаров и мошек), но также есть гены cyt, описанные в штаммах B. thuringiensis, воздействующие на чешуекрылых или жесткокрылых насекомых (Guerchicoff et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 2716-2721).

[0026] Структура Cyt2A, разрешенная посредством рентгеноструктурной кристаллографии, имеет один домен, в котором два внешних слоя α-спирали завернуты вокруг смешанного β-листа. Дополнительные доступные кристаллические структуры токсинов Cyt подтверждают консервативную α-β структурную модель с двумя α-спиральными шпильками, фланкирующими кор β-листа, содержащий от семи до восьми β-тяжей. (Cohen et al. (2011) J. Mol. Biol. 413: 80 4-814) В исследованиях с мутагенезом идентифицировали остатки в β-листах как критичные для токсичности, в то время как мутации в спиральных доменах не влияют на токсичность (Adang et al.; Diversity of Bacillus thuringiensis Crystal Toxins and Mechanism of Action. в T. S. Dhadialla and S. S. Gill, eds, Advances in Insect Physiology, Vol. 47, Oxford: Academic Press, 2014, pp. 39-87.) Типичным доменом токсина Cyt является δ-эндотоксин, Bac_thur_toxin (Pfam PF01338).

[0027] Предложено множество моделей механизма действия токсинов Cyt, и он все еще является предметом активных исследований. Показано, что в случае некоторых белков Cyt (Cyt1A) необходимо наличие акцессорных белков для кристаллизации. Протоксины Cyt1A и Cyt2A процессируются пищеварительными протеазами по одинаковым участкам на N- и C-концах в стабильный кор токсина. Затем токсины Cyt взаимодействуют с ненасыщенными липидами мембраны, такими как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и сфингомиелин. В случае токсинов Cyt порообразование и разрушение мембраны, подобное действию детергентов, предложены в качестве неисключительных механизмов; и общепринято считают, что и то, и другое может происходить в зависимости от концентрации токсина, при этом более низкие концентрации способствуют образованию олигомерных пор, более высокие концентрации приводят к разрывам мембран. (Butko (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 2415-2422) В модели порообразования токсин Cyt связывается с мембраной клетки, индуцируя образование катионселективных каналов в пузырьках мембраны, что приводит к коллоидно-осмотическому лизису клетки. (Knowles et al. (1989) FEBS Lett. 244: 259-262; Knowles et al. (1992) Proc. R. Soc. Ser. B. 248: 1-7 и Promdonkoy et al. (2003) Biochem. J. 374: 255-259). В детергентной модели происходит неспецифическая агрегация токсина на поверхности липидного бислоя, что приводит к разрушению мембраны и гибели клетки. (Butko (2003) выше; Manceva et al. (2005) Biochem. 44: 589-597).

[0028] Во множестве исследований показана синергическая активность между токсинами Cyt и другими токсинами B. thuringiensis, в частности, токсинами Cry, Bin и Mtx. Показано, что этот синергизм позволяет преодолевать резистентность насекомых к другому токсину. (Wirth 1997, Wirth 2005, Thiery 1998, Zhang 2006) Предполагают, что синергическое действие Cyt с токсинами Cry включает связывание Cyt1A с доменом II токсинов Cry в растворе или на мембране, способствующее образованию олигомера пре-поры токсина Cry. Образование этого олигомера не зависит от олигомеризации, связывания или инсерции Cyt. (Lailak 2013, Perez 2007, Lopez-Diaz 2013)

[0029] Ряд пестицидных белков, неродственных белкам Cry, продуцируется некоторыми штаммами B. thuringiensis и B. cereus в течение вегетативного роста (Estruch et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:5389-5394; Warren et al. (1994) WO 94/21795). Эти вегетативные инсектицидные белки, или Vip, не образуют параспоральные кристаллические белки и, по-видимому, секретируются из клетки. Vip в настоящее время исключены из номенклатуры белков Cry, т.к. они не являются кристалло-образующими белками. Термин VIP является неправильным в том смысле, что некоторые белки Cry B. thuringiensis также продуцируются в течение вегетативного роста, а также в течение стационарной фазы и фазы споруляции, прежде всего Cry3Aa. Как сообщают, гены Vip в геноме B. thuringiensis расположены в крупных плазмидах, также кодирующих гены cry (Mesrati et al. (2005) FEMS Microbiol. Lett. 244(2):353-8). Веб-сайт с номенклатурой токсинов Bt можно найти в сети интернет по адресу lifesci.sussex.ac.uk с путем "/home/Neil_Crickmore/Bt/" и на "btnomenclature.info/". См. также, Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3):775-806. Такие источники включены в настоящее описание путем ссылок.

[0030] К настоящему моменту идентифицировано четыре категории Vip. Некоторые гены Vip образуют бинарные двухкомпонентные белковые комплексы; компонент "A", как правило, является "активным", и компонент "B", как правило, является "связывающей" частью. (Pfam pfam.xfam.org/family/PF03495.) Белки Vip1 и Vip4, как правило, содержат белковые домены бинарного токсина B. Vip2, белки, как правило содержат белковые домены бинарного токсина A.

[0031] Белки Vip1 и Vip2 являются двумя компонентами бинарного токсина, проявляющими токсичность по отношению к жесткокрылым. Vip1Aa1 и Vip2Aa1 очень активны в отношении кукурузных жуков, в частности, Diabrotica virgifera и Diabrotica longicornis (Han et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:932-936; Warren GW (1997) "Vegetative insecticidal proteins: novel proteins for control of corn pests" в Carozzi NB, Koziel M (eds) Advances in insect control, the role of transgenic plants; Taylor & Francis Ltd, London, pp 109-21). Мембраносвязанный мультимер Vip1 массой 95 кДа обеспечивает путь для АДФ-рибозилазы Vip2 массой 52 кДа для проникновения в цитоплазму клеток-мишеней западного кукурузного жука (Warren (1997) выше). НАД-зависимая АДФ-рибозилтрансфераза Vip2, вероятно, модифицирует мономерный актин по остатку Arg177 для блокирования полимеризации, что приводит к утрате актинового цитоскелета и, в конечном итоге, гибели клетки по причине быстрого обмена субъединиц в актиновых филаментах in vivo (Carlier M.F. (1990) Adv. Biophys. 26:51-73).

[0032] Подобно токсинам Cry, активированные токсины Vip3A являются порообразующими белками, способными создавать стабильные ионные каналы в мембране (Lee et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:4648-4657). Белки Vip3 активны в отношении нескольких основных чешуекрылых вредителей (Rang et al. (2005) Appl. Environ. Microbiol. 71(10):6276-6281; Bhalla et al. (2005) FEMS Microbiol. Lett. 243:467-472; Estruch et al. (1998) WO 9844137; Estruch et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:5389-5394; Selvapandiyan et al. (2001) Appl. Environ Microbiol. 67:5855-5858; Yu et al. (1997) Appl. Environ Microbiol. 63:532-536). Vip3A активен в отношении Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens и Helicoverpa zea (Warren et al. (1996) WO 96/10083; Estruch et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:5389-5394). Подобно токсинам Cry, белки Vip3A должны активироваться протеазами перед распознаванием конкретных мембранных белков, отличающихся от распознаваемыми токсинами Cry, на поверхности эпителия средней кишки.

[0033] Семейство MTX белков-токсинов отличается наличием консервативного домена ETX_MTX2 (pfam 03318). Члены этого семейства обладают гомологией последовательности с москитоцидными токсинами Mtx2 и Mtx3 из Bacillus sphaericus, а также с эпсилон-токсином ETX из Clostridium perfringens (Cole et al. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 797-8; Thanabalu et al. (1996) Gene 170:85-9). MTX-подобные белки структурно отличаются от трехдоменных токсинов Cry, т.к. они имеют удлиненную и преимущественно основанную на β-листах структуру. Однако, считают, что, аналогично трехдоменным токсинам, MTX-подобные белки образуют поры в мембранах клеток-мишеней (Adang et al. (2014) выше). В отличие от трехдоменных белков Cry, MTX-подобные белки гораздо меньше в длину, в диапазоне от 267 аминокислот (Cry23) до 340 аминокислот (Cry15A).

[0034] К настоящему времени лишь 15 белкам, принадлежащим к семейству MTX-подобных токсинов, приписаны названия Cry, что делает его относительно небольшим классом по сравнению с семейством трехдоменных Cry (Crickmore et al. (2014) выше; Adang et al. (2014) выше). Члены семейства MTX-подобных токсинов включают Cry15, Cry23, Cry33, Cry38, Cry45, Cry46, Cry51, Cry60A, Cry60B и Cry64. Это семейство демонстрирует спектр инсектицидной активности, включая активность в отношении насекомых-вредителей отрядов Lepidoptera и Coleoptera. Некоторые члены этого семейства могут вступать в бинарное партнерство с другими белками, которые могут быть необходимыми для инсектицидной активности, или нет.

[0035] Cry15 является белком массой 34 кДа, идентифицированным в B. thuringiensis серовара thompsoni HD542. Cry15 в природе встречается в кристалле вместе с неродственным белком массой приблизительно 40 кДа. Ген, кодирующий Cry15 и его белок-партнер, организованы вместе в опероне. Показано, что Cry15 в отдельности имеет активность в отношении чешуекрылых насекомых-вредителей, включая Manduca sexta, Cydia pomonella и Pieris rapae, при этом показано, что наличие белка массой 40 кДа повышает активность Cry15 лишь в отношении C. pomonella (Brown K. и Whiteley H. (1992) J. Bacteriol. 174:549-557; Naimov et al. (2008) Appl. Environ. Microbiol. 74:7145-7151). Необходимы дальнейшие исследования для выяснения функции белка-партнера Cry15. Аналогично, Cry23 является белком массой 29 кДа, как показано, имеющим активность в отношении жесткокрылых вредителей Tribolium castaneum и Popillia japonica вместе со своим белком-партнером Cry37 (Donovan et al. (2000) патент США № 6063756).

[0036] Продолжают идентифицировать новых членов MTX-подобного семейства. Недавно в геноме Bacillus thuringiensis серовара tolworthi штамма Na205-3 идентифицирован ген токсина ETX_MTX. Обнаружено, что этот штамм является токсичным в отношении чешуекрылого вредителя Helicoverpa armigera, и он также содержал гомологи Cry1, Cry11, Vip1, Vip2 и Vip3 (Palma et al. (2014) Genome Announc. 2(2): e00187-14. опубликовано он-лайн Mar 13, 2014, doi: 10.1128/genomeA.00187-14; PMCID: PMC3953196). Т.к. MTX-подобные белки обладают уникальной доменной структурой относительно трехдоменных белков Cry, считают, что они обладают уникальным механизмом действия, что, таким образом, делает их важным инструментом в контроле насекомых и борьбе против резистентности насекомых.

[0037] Бактериальные клетки продуцируют большие количества токсинов с различной специфичностью в отношении организмов-хозяев и организмов-не-хозяев. Крупные семейства бинарных токсинов идентифицированы в многочисленных бактериальных семействах, включая токсины, имеющие активность в отношении насекомых-вредителей. (Poopathi and Abidha (2010) J. Physiol. Path. 1(3): 22-38). Lysinibacillus sphaericus (Ls), ранее известная как Bacillus sphaericus, (Ahmed et al. (2007) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57:1117-1125) хорошо известна как штамм для биологического контроля насекомых. Ls продуцирует несколько инсектицидных белков, включая очень мощный бинарный комплекс BinA/BinB. Этот бинарный комплекс образует параспоральный кристалл в клетках Ls и обладает сильной и специфической активностью в отношении двукрылых насекомых, в частности, комаров. В некоторых областях сообщают о резистентности насекомых к существующим москитоцидным штаммам Ls. Открытие новых бинарных токсинов со специфичностью к другой мишени или способностью преодолевать резистентность насекомых представляет особенный интерес.

[0038] Бинарный инсектицидный белковый комплекс Ls содержит два основных полипептида, полипептид массой 42 кДа и полипептид массой 51 кДа, обозначенные как BinA и BinB, соответственно (Ahmed et al. (2007), выше). Два полипептида действуют синергически, придавая токсичность к своим мишеням. Механизм действия включает связывание белков с рецепторами в средней кишке личинки. В некоторых случаях белки модифицируются посредством расщепления протеазами в кишке личинки с образованием активированных форм. Считают, что компонент BinB участвует в связывании, в то время как компонент BinA придает токсичность (Nielsen-LeRoux et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67(11):5049-5054). При раздельном клонировании и экспрессии компонент BinA является токсичным для личинок комаров, в то время как компонент BinB - нет. Однако совместное введение белков заметно повышает токсичность (Nielsen-LeRoux et al. (2001) выше).

[0039] Описано небольшое количество гомологов белков Bin из бактериальных источников. В Priest et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63(4):1195-1198 описывают попытки гибридизации для идентификации новых штаммов Ls, хотя большинство идентифицированных ими генов кодируют белки, идентичные известным белкам BinA/BinB. Белок BinA содержит определенный консервативный домен, известный как домен суперсемейства токсинов 10. Этот домен токсина исходно определяли по его наличию в BinA и BinB. Оба белка содержат домен, хотя сходство последовательности между BinA и BinB ограничено в этой области (<40%). Белок Cry49Aa, также имеющий инсектицидную активность, также содержит этот домен (описано ниже).

[0040] Бинарный токсин Cry48Aa/Cry49Aa Ls обладает способностью уничтожать личинки комара Culex quinquefasciatus. Эти белки относятся к структурному классу белков, имеющих некоторое сходство с белковым комплексом Cry B. thuringiensis (Bt). Также известно, что бинарный токсин Cry34/Cry35 Bt убивает насекомых, включая западного кукурузного жука, значительного вредителя кукурузы. Cry34, несколько вариантов которого идентифицировано, является небольшим полипептидом (14 кДа), в то время как Cry35 (также кодируемый несколькими вариантами) является полипептидом массой 44 кДа. Эти белки имеют некоторую гомологию последовательности с группой белков BinA/BinB, и считают, что они являются эволюционно родственными (Ellis et al. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68(3):1137-1145).

[0041] В настоящем описании представлены пестицидные белки из этих классов токсинов. Пестицидные белки классифицируют по их структуре, гомологии с известными токсинами и/или их пестицидной специфичности.

ii. Варианты и фрагменты пестицидных белков и полинуклеотиды, кодирующие их

[0042] Пестицидные белки или полипептиды по изобретению включают приведенные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159 и их фрагменты и варианты. Термины "пестицидный токсин", "пестицидный белок" или "пестицидный полипептид" означают токсин, белок или полипептид, имеющий активность в отношении одного или нескольких вредителей, включая насекомых, грибов, нематод и т.п., таким образом, что вредителя убивают или контролируют.

[0043] "Выделенный" или "очищенный" полипептид или белок или его биологически активная часть, по существу, не содержат компоненты, как правило, сопутствующие или взаимодействующие с полипептидом или белком, как обнаруживают в его природной среде. Таким образом, выделенный или очищенный полипептид или белок, по существу, не содержит другой клеточный материал или среду для культивирования при получении рекомбинантными способами или, по существу, не содержит химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Белок, по существу, не содержащий клеточный материал включает препараты белка, имеющие менее приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% или 1% (на сухую массу) белка-загрязнения. Если белок по изобретению или его биологически активную часть получают рекомбинантно, оптимально, чтобы среда для культивирования представляла менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% или 1% (на сухую массу) химических предшественников или химических веществ, не являющихся интересующим белком.

[0044] Термин "фрагмент" относится к части последовательности полипептида по изобретению. "Фрагменты" или "биологически активные части" включают полипептиды, содержащие достаточное количество смежных аминокислотных остатков для сохранения биологической активности (имеют пестицидную активность). Фрагменты пестицидных белков включают фрагменты, являющиеся более короткими, чем полноразмерные последовательности, как по причине использования альтернативного нижележащего участка начала, так и по причине процессинга, при котором образуется более короткий белок, имеющий пестицидную активность. Процессинг может происходить в организме, в котором белок экспрессируется, или во вредителе после потребления белка. Примеры фрагментов белков можно найти в таблице 1. Биологически активная часть пестицидного белка может являться полипептидом, составляющим, например, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 или более аминокислот в длину из любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159. Такие биологически активные части можно получать рекомбинантными способами и оценивать на пестицидную активность. В рамках изобретения фрагмент содержит по меньшей мере 8 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159.

[0045] Бактериальные гены, включая кодирующие пестицидные белки, представленные в настоящем описании, достаточно часто содержат множество метиониновых инициаторных кодонов вблизи начала открытой рамки считывания. Зачастую инициация трансляции в одном или нескольких из этих инициаторных кодонов будет приводить к образованию функционального белка. Эти инициаторные кодоны могут включать ATG кодоны. Однако, бактерии, такие как Bacillus sp., также распознают кодон GTG в качестве инициаторного кодона, и белки, инициирующие трансляцию в кодонах GTG, содержат метионин в качестве первой аминокислоты. В редких случаях трансляция в бактериальных системах может начинаться с кодона TTG, хотя в этом случае TTG кодирует метионин. Кроме того, не часто определяется a priori, какой из этих кодонов в природе используется в бактерии. Таким образом, следует понимать, что использование одного из альтернативных метиониновых кодонов также может приводить к образованию пестицидных белков. Эти пестицидные белки включены в настоящее изобретение, и их можно использовать в способах, представленных в настоящем описании. Следует понимать, что при экспрессии в растениях необходимо будет заменять альтернативный инициаторный кодон на ATG для правильной трансляции.

[0046] В различных вариантах осуществления пестицидные белки, представленные в настоящем описании, включают аминокислотные последовательности, предсказанные из полноразмерных нуклеотидных последовательностей, и аминокислотные последовательности, являющиеся более короткими, чем полноразмерные последовательности, по причине использования альтернативного нижележащего инициаторного участка. Таким образом, нуклеотидная последовательность по изобретению и/или векторы, клетки-хозяева и растения, содержащие нуклеотидную последовательность по изобретению (и способы получения и применения нуклеотидной последовательности по изобретению) могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую альтернативный инициаторный участок.

[0047] Установлено, что можно осуществлять модификации пестицидных полипептидов, представленных в настоящем описании, получая белки-варианты. Изменения, предусмотренные человеком, можно осуществлять способами сайт-специфического мутагенеза. Альтернативно, также можно идентифицировать нативные, еще неизвестные или еще неидентифицированные полинуклеотиды и/или полипептиды, структурно и/или функционально родственные последовательностям, представленным в настоящем описании, попадающие в объем настоящего изобретения. Можно осуществлять консервативные аминокислотные замены в неконсервативных областях, не изменяющие функцию пестицидных белков. Альтернативно, можно осуществлять модификации, улучшающие активность токсина. Например, предусмотрены различные варианты белков Cry. Модификация токсинов Cry посредством перестановки домена III в некоторых случаях приводит к получению гибридных токсинов с улучшенными токсичностями в отношении конкретных видов насекомых. Таким образом, перестановка домена III может представлять собой эффективную стратегию для улучшения токсичности токсинов Cry или для получения новых гибридных токсинов с токсичностью в отношении вредителей, у которых не наблюдают восприимчивость к родительским токсинам Cry. Сайт-специфический мутагенез последовательностей петли домена II может приводить к получению новых токсинов с повышенной инсектицидной активностью. Петлевые области домена II являются ключевыми связывающими областями исходных токсинов Cry, являющихся подходящими мишенями для мутагенеза и селекции токсинов Cry с улучшенными инсектицидными свойствами. Домен I токсина Cry можно модифицировать для встраивания участков расщепления протеаз для улучшения активности в отношении конкретных вредителей. С помощью стратегий перестановки трех разных доменов среди большого количества генов cry и способов высокопроизводительного скринингового биологического анализа можно получать новые Cry токсины с улучшенными или новыми токсичностями.

[0048] Как указано, фрагменты и варианты полипептидов, представленных в настоящем описании, будут сохранять пестицидную активность. Пестицидная активность включает способность композиции достигать наблюдаемого эффекта уменьшения распространенности или активности целевого вредителя, включая, например, гибель по меньшей мере одного вредителя или значительное снижение роста, питания или нормального физиологического развития вредителя. Такое снижение количества, роста, питания или нормального развития вредителя может включать любое статистически значимое снижение, включая, например, снижение на приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% или более. Пестицидная активность в отношении одного или более различных вредителей, представленных в настоящем описании, включая, например, пестицидную активность в отношении Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Nematodes, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera и т.д. или любого другого вредителя, представленного в настоящем описании. Установлено, что пестицидная активность может являться другой или улучшенной относительно активности нативного белка, или она может являться неизменной, при условии, что пестицидная активность сохраняется. Способы измерения пестицидной активности представлены где-либо в настоящем описании. См. также, Czapla и Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, каждый из которых включен в настоящее описание путем ссылки в полном объеме.

[0049] Варианты по настоящему изобретению включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% идентичную аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159, и сохраняющие пестицидную активность. В таблице 1 представлены неограничивающие примеры полипептидов-вариантов (и полинуклеотидов, кодирующих их) для каждой из SEQ ID NO: 1-159. Биологически активный вариант пестицидного полипептида, представленного в настоящем описании, может отличаться всего на приблизительно 1-15 аминокислотных остатков, всего на приблизительно 1-10, например, приблизительно 6-10, всего на 5, всего на 4, всего на 3, всего на 2 или всего на 1 аминокислотный остаток. В конкретных вариантах осуществления полипептиды могут содержать N'-концевое или C'-концевое укорачивание, которое может содержать по меньшей мере делецию 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 аминокислот или более с N'- или C'-конца полипептида.

[0050] В таблице 2 представлены белковые домены, обнаруживаемые в SEQ ID NO: 1-159 с учетом данных из PFAM. Описание доменов и положения в указанной SEQ ID NO представлены в таблице 2. В конкретных вариантах осуществления активный вариант, содержащий любую из SEQ ID NO: 1-159, может иметь по меньшей мере 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к любой из SEQ ID NO: 1-159 и дополнительно содержит по меньшей мере один из консервативных доменов, приведенных в таблице 2. Например, в одном из вариантов осуществления активный вариант будет иметь по меньшей мере, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 15 и дополнительно содержит нативные аминокислоты в положениях 78-329, нативные аминокислоты в положениях 554-708 или нативные аминокислоты в положениях 78-329 и положениях 554-708.

Таблица 2. Общие сведения о доменах по PFAM в каждой из SEQ ID NO: 1-159

[0051] Варианты SEQ ID NO: 8 содержат SEQ ID NO: 9, 123 и 124. На фигуре 1 представлено выравнивание аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, 9, 123 и 124, и в таблице 3 представлены общие сведения о типе модификации и проценте идентичности последовательности SEQ ID NO: 9, 123 и 124 по отношению к SEQ ID NO: 8.

[0052] Варианты SEQ ID NO: 25 содержат SEQ ID NO: 26, 125 и 126. На фигуре 2 представлено выравнивание аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, 26, 125 и 126, и в таблице 3 представлены общие сведения о типе модификации и проценте идентичности последовательности SEQ ID NO: 26, 125 и 126 по отношению к SEQ ID NO: 25.

[0053] Варианты SEQ ID NO: 72 содержат SEQ ID NO: 94, 127 и 128. На фигуре 3 представлено выравнивание аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72, 94, 127 и 128, и в таблице 3 представлены общие сведения о типе модификации и проценте идентичности последовательности SEQ ID NO: 94, 127 и 128 по отношению к SEQ ID NO: 72.

[0054] Варианты SEQ ID NO: 70 содержат SEQ ID NO: 71, 129, 130 и 131. На фигуре 4 представлено выравнивание аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70, 71, 129, 130 и 131. В таблице 3 представлены общие сведения о типе модификации и проценте идентичности последовательности SEQ ID NO: 71, 129, 130 и 131 по отношению к SEQ ID NO: 70.

Таблица 3. Общие сведения о вариантах SEQ ID NO: 8, 25, 72 и 70

[0055] Как показано на фигурах 5A-5H, каждая из SEQ ID NO: 6, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и 159 имеет общие мотивы, как показано ниже в таблице 4. На фигурах 5A-5H показано, где каждую консервативную последовательность обнаруживают в каждой из SEQ ID NO: 6 и 132-159.

Таблица 4. Консервативные области в SEQ ID NO: 6 и 132-159

[0056] В конкретных вариантах осуществления активный вариант, содержащий SEQ ID NO: 6 или 132-159, может иметь по меньшей мере 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к любой из SEQ ID NO: 6 и 132-159 и дополнительно содержит по меньшей мере один из консервативных доменов, приведенных в таблице 4. Например, в одном из вариантов осуществления активный вариант будет иметь по меньшей мере 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 6 или 132-159 и дополнительно содержат один или несколько аминокислотных доменов, приведенных в таблице 4 (т.е. по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 161, 162, 163, 164, 165, 166 и/или 167). В неограничивающем варианте осуществления активный вариант имеет по меньшей мере 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 6 или 132-159 и дополнительно содержит SEQ ID NO: 166. В другом варианте осуществления активный вариант SEQ ID NO: 6 или 132-159 содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 6 или 132-159, где активный вариант не является SEQ ID NO: 160.

[0057] На фигуре 6 представлена взаимосвязь процента идентичности последовательности между SEQ ID NO: 6, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и 159.

[0058] Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным или синтетическим нуклеиновым кислотам, кодирующим пестицидные полипептиды, представленные в настоящем описании. Особый интерес представляют последовательности нуклеиновой кислоты, сконструированные для экспрессии в интересующем растении. Например, последовательность нуклеиновой кислоты можно оптимизировать для повышения экспрессии в растении-хозяине. Пестицидный белок, представленный в настоящем описании, можно подвергать обратной трансляции для получения нуклеиновой кислоты, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в конкретном хозяине, например, сельскохозяйственной культуре. В другом варианте осуществления полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, представленные в настоящем описании, можно оптимизировать для повышения экспрессии в трансформированном хозяине. Например, полинуклеотиды можно синтезировать с использованием предпочтительных для растения кодонов для улучшенной экспрессии. См. обсуждение использования предпочтительных для хозяина кодонов, например, в Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11. В этой области доступны способы синтеза предпочтительных для растений генов. См., например, патенты США №№ 5380831 и 5436391, и Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, каждый из которых включен в настоящее описание путем ссылки. Экспрессия такой кодирующей последовательности трансформированным растением (например, двудольных или однодольным) будет приводить к получению пестицидного полипептида и придавать растению повышенную резистентность к вредителю. Рекомбинантные и синтетические молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пестицидные белки по изобретению, не включают природную бактериальную последовательность, кодирующую белок.

[0059] "Рекомбинантный полинуклеотид" или "рекомбинантная нуклеиновая кислота" содержат комбинацию двух или более химически соединенных сегментов нуклеиновой кислоты, не обнаруживаемых напрямую связанными в природе. Термин "напрямую связанный" означает, что два сегмента нуклеиновой кислоты являются непосредственно смежными и соединены друг с другом химической связью. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный полинуклеотид содержит интересующий полинуклеотид или его вариант или фрагмент таким образом, что дополнительный, химически соединенный сегмент нуклеиновой кислоты находится в 5'-, 3'-направлении или внутри интересующего полинуклеотида. Альтернативно, химически соединенный сегмент нуклеиновой кислоты рекомбинантного полинуклеотида можно получать посредством делеции последовательности. Дополнительный химически соединенный сегмент нуклеиновой кислоты или последовательность, делетированная для присоединения соединенных сегментов нуклеиновой кислоты, может иметь любую длину, включая например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 нуклеотидов или более. Различные способы получения таких рекомбинантных полинуклеотидов включают химический синтез и воздействие на выделенные сегменты полинуклеотидов способами генетической инженерии. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный полинуклеотид может содержать рекомбинантную последовательность ДНК или рекомбинантную последовательность РНК. "Фрагмент рекомбинантного полинуклеотида или нуклеиновой кислоты" содержит по меньшей мере один из комбинации двух или более химически соединенных аминокислотных сегментов, не обнаруживаемых напрямую связанными в природе.

[0060] Фрагменты полинуклеотида (РНК или ДНК) могут кодировать фрагменты белка, сохраняющие активность. В конкретных вариантах осуществления фрагмент рекомбинантного полинуклеотида или конструкция рекомбинантного полинуклеотида содержит по меньшей мере одно соединение двух или более химически соединенных или функционально связанных сегментов нуклеиновой кислоты, не обнаруживаемых напрямую связанными в природе. Фрагмент полинуклеотида, кодирующего биологически активную часть полипептида, сохраняющего пестицидную активность, будет кодировать по меньшей мере 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175 или 180 смежных аминокислот или вплоть до общего количества аминокислот, присутствующих в полноразмерном полипептиде, приведенном в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159. В конкретных вариантах осуществления такие полипептидные фрагменты являются активными фрагментами. В некоторых вариантах осуществления полипептидный фрагмент содержит рекомбинантный полипептидный фрагмент. В рамках изобретения фрагмент рекомбинантного полипептида содержит по меньшей мере один из комбинации двух или более химически соединенных аминокислотных сегментов, не обнаруживаемых напрямую связанными в природе.

[0061] В рамках изобретения термин "варианты" должен означать, по существу, схожие последовательности. В случае полинуклеотидов вариант содержит делецию и/или инсерцию одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких внутренних участках в нативном полинуклеотиде и/или замену одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких участках в нативном полинуклеотиде. В рамках изобретения "нативный" полинуклеотид или полипептид содержит природную нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно.

[0062] Варианты конкретного полинуклеотида по изобретению (т.е. референсный полинуклеотид) также можно оценивать посредством сравнения полипептида, кодируемого вариантом полинуклеотида, и полипептида, кодируемого референсным полинуклеотидом, для определения процента идентичности последовательности между ними двумя. Таким образом, например, описывают выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид с указанным процентом идентичности последовательности по отношению к полипептиду SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159. Процент идентичности последовательности между любыми двумя полипептидами можно вычислять с использованием программ для выравнивания последовательностей и параметров, описываемых где-либо в настоящем описании. Если любую указанную пару полинуклеотидов по изобретению оценивают посредством сравнения процента идентичности последовательности между двумя полипептидами, которые они кодируют, процент идентичности последовательности между двумя кодируемыми полипептидами составляет по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159. В других вариантах осуществления вариант полинуклеотида, представленный в настоящем описании, отличается от нативной последовательности по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов.

iii. Сравнение последовательностей

[0063] В рамках изобретения термин "идентичность" или "процент идентичности" при использовании в отношении конкретной пары выровненных аминокислотных последовательностей относится к проценту идентичности аминокислотных последовательностей, получаемому посредством подсчета количества идентичных совпадений при выравнивании и разделения этого количества идентичных совпадений на длину выровненных последовательности. В рамках изобретения термин "сходство" или "процент сходства" при использовании в отношении конкретной пары выровненных аминокислотных последовательностей относится к сумме баллов, получаемых из матрицы замен для каждой пары аминокислот при выравнивании, разделенной на длину выровненных последовательностей.

[0064] Если не указано иначе, идентичность и сходство вычисляют посредством алгоритмов глобального выравнивания и подсчета Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453), включенных в программу "needle", распространяемую как часть пакета программ EMBOSS (Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A., EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 2000, Trends in Genetics 16, (6) pp. 276-277, версии 6.3.1, доступные, помимо прочих источников, в EMBnet embnet.org/resource/emboss и emboss.sourceforge.net) с использованием штрафа за пропуск по умолчанию и матриц замен (EBLOSUM62 для белка и EDNAFULL для ДНК). Также можно использовать эквивалентные программы. Термин "эквивалентная программа" означает любую программу для сравнения последовательности, с помощью которой для любых двух интересующих последовательностей получают выравнивание, имеющее совпадения идентичных нуклеотидных остатков и идентичный процент идентичности последовательности при сравнении с соответствующим выравниванием, генерируемым с помощью Needle из EMBOSS версии 6.3.1.

[0065] В этой области известны дополнительные математические алгоритмы, и их можно использовать для сравнения двух последовательностей. См., например, алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифицированный в Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм встроен в программы BLAST по Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Поиски BLAST nucleotide можно осуществлять с использованием программы BLASTN, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных пестицид-подобным молекулам нуклеиновой кислоты по изобретению. Поиски BLAST protein можно осуществлять с использованием программы BLASTP для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам пестицидного белка по изобретению. Для получения выравнивания с пропусками в целях сравнения можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно, можно использовать Psi-Blast для осуществления итеративного поиска, с помощью которого определяют отдаленную взаимосвязь между молекулами. См. Altschul et al. (1997), выше. При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и Psi-Blast можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTX и BLASTN). Выравнивание также можно осуществлять вручную посредством осмотра.

[0066] Две последовательности являются "оптимально выровненными", когда их выравнивают по баллам сходства с использованием определенной матрицы замен аминокислот (например, BLOSUM62), штрафа за пропуск и штрафа за удлинение пропуска для получения наибольших баллов, возможных для этой пары последовательностей. Матрицы замен аминокислот и их применение в количественном анализе сходства между двумя последовательностями хорошо известны в этой области и описаны, например, в Dayhoff et al. (1978) "A model of evolutionary change in proteins." в "Atlas of Protein Sequence and Structure," Vol. 5, Suppl. 3 (ed. M. O. Dayhoff), pp. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. и Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. Матрицу BLOSUM62 часто используют в качестве матрицы замен по умолчанию при выравнивании последовательностей. Штраф за пропуск налагается за включение пропуска в одну аминокислоту в одну из выровненных последовательностей, и штраф за удлинение пропуска налагается за каждое дополнительное пустое положение аминокислоты, включаемое в уже открытый пропуск. Выравнивание определяют по положениям аминокислот каждой последовательности, на которых выравнивание начинают и заканчивают и, необязательно, по включению пропуска или множества пропусков в одной или нескольких последовательностях таким образом, чтобы достигать наиболее высоких возможных баллов. Хотя оптимальное выравнивание и балльную оценку можно осуществлять вручную, способ облегчают с помощью компьютеризованного алгоритма выравнивания, такого как, например, gapped BLAST 2.0, описываемый в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, и общедоступный на веб-сайте National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Оптимальные выравнивания, включая множественные выравнивания, можно осуществлять с использованием, например, PSI-BLAST, доступного на www.ncbi.nlm.nih.gov и описываемого Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

[0067] Что касается аминокислотной последовательности, оптимально выравниваемой с референсной последовательностью, аминокислотный остаток "соответствует" положению в референсной последовательности, с которым остаток спаривают при выравнивании. "Положение" обозначают номером, последовательно идентифицирующим каждую аминокислоту в референсной последовательности с учетом его положения относительно N-конца. Например, в SEQ ID NO: 1 положение 1 представляет собой M, положение 2 представляет собой A, положение 3 представляет собой N и т.д. Когда тестовую последовательность оптимально выравнивают с SEQ ID NO: 1, остаток в тестовой последовательности, выравниваемый с N в положении 3, указывают как "соответствующий положению 3" SEQ ID NO: 1. Вследствие делеций, инсерций, укорочений, слияний и т.д. при определении оптимального выравнивания, в основном, необходимо учитывать номер аминокислотного остатка в тестовой последовательности, т.к. определение путем простого подсчета с N-конца не обязательно будет таким же, как номер его соответствующего положения в референсной последовательности. Например, в случае делеции в выровненной тестовой последовательности, не будет аминокислоты, соответствующей положению в референсной последовательности в месте делеции. Если есть инсерция в выровненной референсной последовательности, эта инсерция не будет соответствовать какому-либо положению аминокислоты в референсной последовательности. В случае укорочений или слияний могут быть тяжи аминокислот в референсной или выровненной последовательности, не соответствующих какой-либо аминокислоте в соответствующей последовательности.

iv. Антитела

[0068] Также включены антитела против полипептидов по настоящему изобретению или против их вариантов или фрагментов. Способы получения антител хорошо известны в этой области (см., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; и патент США № 4196265). Эти антитела можно использовать в наборах для детекции и выделения полипептидов-токсинов. Таким образом, настоящее изобретение относится к наборам, содержащим антитела, специфически связывающиеся с полипептидами, представленными в настоящем описании, включая, например, полипептиды, имеющие последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159.

II. Вредители

[0069] Композиции и способы, представленные в настоящем описании, применимы против множества вредителей. "Вредители" включают, в качестве неограничивающих примеров, насекомых, грибы, бактерии, нематоды, акариды, простейшие-патогены, печеночные двуустки, паразитирующие на животных, и т.п. Особенно интересующими вредителями являются насекомые-вредители, в частности, насекомые-вредители, вызывающие значительное повреждение сельскохозяйственных растений. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera или нематод. В неограничивающих вариантах осуществления насекомое-вредитель включает западного кукурузного жука, Diabrotica virgifera virgifera; совку травяную, Spodoptera frugiperda; колорадского жука, Leptinotarsa decemlineata; совку хлопковую, Helicoverpa zea (в Северной Америке некоторые виды атакуют хлопок и называются коробочным червем); мотылька кукурузного, Ostrinia nubilalis; совку-ипсилон, Agrotis ipsilon; моль капустную, Plutella xylostella; совку бархатных бобов, Anticarsia gemmatalis; огневку кукурузную юго-западную, Diatraea grandiosella; коробочного червя, Helicoverpa armigera (обнаруживаемые по всему миру за пределами США); зеленого овощного клопа, Nezara viridula; зеленого щитника, Chinavia halaris; коричневого мраморного щитника, Halyomorpha halys; и коричневого щитника, Euschistus servus. В других вариантах осуществления вредитель включает нематоду, включая, в качестве неограничивающих примеров, Meloidogyne hapla (северную галловую нематоду); Meloidogyne enterolobii, Meloidogyne arenaria (арахисовую галловую нематоду) и Meloidogyne javanica.

[0070] В рамках изобретения термин "насекомые-вредители" относится к насекомым и другим схожим вредителям, таким как, например, из отряда Acari, включая в качестве неограничивающих примеров, клещей и иксодовых клещей. Насекомые-вредители по настоящему изобретению включают, в качестве неограничивающих примеров, насекомых отряда Lepidoptera, например Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tinsola bisselliella, Trichoplusia hi, Udea rubigalis, Xylomyges curiails и Yponomeuta padella.

[0071] Насекомые-вредители также включают насекомых, выбранных из отрядов Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, Coleoptera.

[0072] Насекомые-вредители основных сельскохозяйственных культур включают, в качестве неограничивающих примеров: Кукуруза: Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Helicoverpa zeae, совка хлопковая; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Diatraea grandiosella, огневка кукурузная юго-западная; Elasmopalpus lignosellus, малый мотылек кукурузный; Diatraea saccharalis, тростниковая огневка; западный кукурузный жук, например, Diabrotica virgifera virgifera; северный кукурузный жук, например, Diabrotica longicornis barberi; южный кукурузный жук, например, Diabrotica undecimpunctata howardi; Melanotus spp., проволочники; Cyclocephala borealis, северный масковый хрущ (личинка хруща); Cyclocephala immaculata, южный масковый хрущ (личинка хруща); Popillia japonica, хрущик японский; Chaetocnema pulicaria, земляная кукурузная блошка; Sphenophorus maidis, долгоносик кукурузный; Rhopalosiphum maidis, тля кукурузная листовая; Anuraphis maidiradicis, тля кукурузная корневая; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus sanguinipes, мигрирующий кузнечик; Hylemya platura, личинка мухи ростковой; Agromyza parvicornis, минирующая мушка; Anaphothrips obscrurus, трипс злаковый; Solenopsis milesta, муравей-вор; Tetranychus urticae, клещик паутинный двупятнистый; Сорго: Chilo partellus, огневка-травянка; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Helicoverpa zea, совка хлопковая; Elasmopalpus lignosellus, малый мотылек кукурузный; Feltia subterranea, granulate cutworm; Phyllophaga crinita, личинка хруща; Eleodes, Conoderus и Aeolus spp., проволочники; Oulema melanopus, пьявица красногрудая; Chaetocnema pulicaria, земляная кукурузная блошка; Sphenophorus maidis, долгоносик кукурузный; Rhopalosiphum maidis; тля кукурузная листовая; Sipha flava, желтая тля сахарного тростника; клоп-черепашка пшеничный североамериканский, например, Blissus leucopterus leucopterus; Contarinia sorghicola, галлица сорговая; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный клещ; Tetranychus urticae, клещ двупятнистый паутинный; Пшеница: Pseudaletia unipunctata, походный червь; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Elasmopalpus lignosellus, малый мотылек кукурузный; Agrotis orthogonia, совка прямоугольная; Elasmopalpus lignosellus, малый мотылек кукурузный; Oulema melanopus, пьявица красногрудая; Hypera punctata, слоник листовой бобовый; южный кукурузный жук, например, Diabrotica undecimpunctata howardi; русская пшеничная тля; Schizaphis graminum, тля злаковая обыкновенная; Macrosiphum avenae, тля листовая; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Melanoplus sanguinipes, мигрирующий кузнечик; Mayetiola destructor, гессенская мушка; Sitodiplosis mosellana, wheat midge; Meromyza americana, личинка американской меромизы; Hylemya coarctata, муха озимая; Frankliniella fusca, американский табачный трипс; Cephus cinctus, пилильщик хлебный американский; Aceria tulipae, луковичный клещ тюльпанов; Подсолнечник: Cylindrocupturus adspersus, sunflower stem weevil; Smicronyx fulus, красный долгоносик подсолнечника; Smicronyx sordidus, серый долгоносик подсолнечника; Suleima helianthana, листовертка подсолнечника; Homoeosoma electellum, огневка подсолнечниковая; Zygogramma exclamationis, совка подсолнечниковая восклицательная; Bothyrus gibbosus, жук морковный; Neolasioptera murtfeldtiana, галлица подсолнечниковая; Хлопок: Heliothis virescens, табачная листовертка; Helicoverpa zea, коробочный червь; Spodoptera exigua, совка малая; Pectinophora gossypiella, розовый коробочный червь; долгоносик хлопковый, например, Anthonomus grandis; Aphis gossypii, тля хлопковая; Pseudatomoscelis seriatus, слепняк хлопковый; Trialeurodes abutilonea, белокрылка окаймленная; Lygus lineolaris, клоп луговой; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Thrips tabaci, трипс луковый; Franklinkiella fusca, табачный трипс; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный клещ; Tetranychus urticae, клещик двупятнистый паутинный; Рис: Diatraea saccharalis, огневка сахарного тростника; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Helicoverpa zea, совка хлопковая; Colaspis brunnea, grape colaspis; Lissorhoptrus oryzophilus, долгоносик рисовый водяной; Sitophilus oryzae, долгоносик рисовый; Nephotettix nigropictus, рисовая цикадка; клоп-черепашка пшеничный североамериканский, например, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, зеленый овощной клоп; Соя: Pseudoplusia includens, соевая совка; Anticarsia gemmatalis, совка бархатных бобов; Plathypena scabra, совка клеверная; Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Spodoptera exigua, совка малая; Heliothis virescens, табачная листовертка; Helicoverpa zea, коробочный червь; Epilachna varivestis, зерновка бобовая мексиканская; Myzus persicae, тля персиковая зеленая; Empoasca fabae, цикадка картофельная; Acrosternum hilare, зеленый овощной клоп; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Hylemya platura, личинка мухи ростковой; Sericothrips variabilis, соевый трипс; Thrips tabaci, трипс луковый; Tetranychus turkestani, клещик паутинный атлантический; Tetranychus urticae, клещик двупятнистый паутинный; Ячмень: Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Schizaphis graminum, тля злаковая обыкновенная; клоп-черепашка пшеничный североамериканский, например, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, зеленый овощной клоп; Euschistus servus, коричневый щитник; Hylemya platura, личинка мухи ростковой; Mayetiola destructor, гессенская мушка; Petrobia latens, петробия многоядная; Рапс: Vrevicoryne brassicae, тля капустная; Phyllotreta cruciferae, блошка крестоцветная; Phyllotreta striolata, блошка полосатая; Phyllotreta nemorum, блошка земляная светлоногая; Meligethes aeneus, рапсовый цветоед; и рапсовые цветоеды Meligethes rufimanus, Meligethes nigrescens, Meligethes canadianus, и Meligethes viridescens; Картофель: Leptinotarsa decemlineata, колорадский жук.

[0073] Способы и композиции, представленные в настоящем описании, могут являться эффективными против Hemiptera, таких как Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Lygus rugulipennis Popp, Lygus pabulinus, Calocoris norvegicus, Orthops compestris, Plesiocoris rugicollis, Cyrtopeltis modestus, Cyrtopeltis notatus, Spanagonicus albofasciatus, Diaphnocoris chlorinonis, Labopidicola allii, Pseudatomoscelis seriatus, Adelphocoris rapidus, Poecilocapsus lineatus, Blissus leucopterus, Nysius ericae, Nysius raphanus, Euschistus servus, Nezara viridula, Eurygaster, Coreidae, Pyrrhocoridae, Tinidae, Blostomatidae, Reduviidae и Cimicidae. Интересующие вредители также включают Araecerus fasciculatus, ложнослоника кофейного; Acanthoscelides obtectus, зерновку фасолевую; Bruchus rufmanus, зерновку бобовую; Bruchus pisorum, зерновку гороховую; Zabrotes subfasciatus, зерновку бобовую мексиканскую; Diabrotica balteata, блошку окаймленную; Cerotoma trifurcata, жука-листоеда; Diabrotica virgifera, мексиканского кукурузного жука; Epitrix cucumeris, блошку картофельную; Chaetocnema confinis, блошка бататная; Hypera postica, долгоносика люцернового; Anthonomus quadrigibbus, цветоеда яблонного четырехбугорчатого; Sternechus paludatus, долгоносика стеблевого бобового; Hypera brunnipennis, долгоносика египетского люцернового; Sitophilus granaries, долгоносика амбарного; Craponius inaequalis, долгоносика виноградного; Sitophilus zeamais, кукурузного долгоносика; Conotrachelus nenuphar, долгоносика сливового; Euscepes postfaciatus, западно-индийской блошки бататной; Maladera castanea, хрущика азиатского садового; Rhizotrogus majalis, хруща европейского; Macrodactylus subspinosus, бронзовку золотистую; Tribolium confusum, хрущака малого мучного; Tenebrio obscurus, хрущака темного; Tribolium castaneum, хрущака каштанового; Tenebrio molitor, мучного хрущака большого.

[0074] Нематоды включают паразитарных нематод, таких как галловые, цистообразующие и ранящие нематоды, включая Heterodera spp., Meloidogyne spp. и Globodera spp.; в частности, членов цистообразующих нематод, включая, в качестве неограничивающих примеров, Heterodera glycines (соевую цистообразующую нематоду); Heterodera schachtii (свекловичную нематоду); Heterodera avenae (овсяную нематоду); и Globodera rostochiensis и Globodera pailida (картофельные нематоды). Ранящие нематоды включают Pratylenchus spp.

[0075] Насекомых-вредителей можно тестировать на пестицидную активность композиций по изобретению на ранних стадиях развития, например, личинки или другие незрелые формы. Насекомых можно держать в полной темноте при от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C и при относительной влажности от приблизительно 30% до приблизительно 70%. Можно осуществлять биологические анализы, как описано в Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83 (6): 2480-2485. См., также раздел "Примеры" в настоящем описании.

III. Экспрессирующие кассеты

[0076] Полинуклеотиды, кодирующие пестицидные белки, представленные в настоящем описании, можно предоставлять в экспрессирующих кассетах для экспрессии в интересующем организме. Кассета будет включать 5'- и 3'-регуляторные последовательности, функционально связанные с полинуклеотидом, кодирующим пестицидный полипептид, представленный в настоящем описании, что делает возможной экспрессию полинуклеотида. Кассета дополнительно может содержать по меньшей мере один дополнительный ген или генетический элемент, подлежащий котрансформации в организм. При включении дополнительных генов или элементов компоненты являются функционально связанными. Альтернативно, дополнительные гены или элементы можно предоставлять на множестве экспрессирующих кассет. Такую экспрессирующую кассету получают с множеством участков рестрикции и/или участков рекомбинации для инсерции полинуклеотидов, подлежащих транскрипционной регуляции регуляторных областей. Экспрессирующая кассета дополнительно может содержать ген селективного маркера.

[0077] Экспрессирующая кассета будет включать в 5'-3'-направлении транскрипции область инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), пестицидный полинуклеотид по изобретению и область терминации транскрипции и трансляции (т.е. область терминации), функциональные в интересующем организме, т.е. растении или бактериях. Промоторы по изобретению могут направлять или регулировать экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. Регуляторные области (т.е. промоторы, области регуляции транскрипции и области терминации трансляции) могут являться эндогенными или гетерологичными клетке-хозяину или друг другу. В рамках изобретения "гетерологичной" по отношению к последовательности является последовательность, происходящая из другого биологического вида или, если она получена из того же вида, то, по существу, преднамеренно модифицированная человеком из своей нативной формы в композицию и/или геномный локус. В рамках изобретения химерный ген содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с областью инициации транскрипции, гетерологичной кодирующей последовательности.

[0078] Подходящие области терминации доступны в Ti-плазмиде A. tumefaciens, такие как области терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

[0079] Дополнительные регуляторные сигналы включают, в качестве неограничивающих примеров, участки инициации транскрипции, операторы, активаторы, энхансеры, другие регуляторные элементы, участки связывания рибосомы, инициаторный кодон, сигналы терминации и т.п. См., например, патенты США №№ 5039523 и 4853331; EPO 0480762A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) (далее в настоящем описании "Sambrook 11"); Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, N.Y., и цитируемые в них ссылки.

[0080] При получении экспрессирующей кассеты различные фрагменты ДНК можно обрабатывать таким образом, чтобы получать последовательности ДНК в правильной ориентации и, при необходимости, в правильной рамке считывания. С этой целью можно использовать адаптеры или линкеры для соединения фрагментов ДНК или можно включать другие манипуляции для получения подходящих участков рестрикции, удаления лишней ДНК, удаления участков рестрикции или т.п. С этой целью можно включать мутагенез in vitro, репарацию с помощью праймеров, рестрикцию, отжиг, повторные замены, например, транзиции и трансверзии.

[0081] В практическом осуществлении изобретения можно использовать ряд промоторов. Промоторы можно выбирать с учетом желаемого результата. Нуклеиновые кислоты можно комбинировать с конститутивными, индуцибельными, ткане-предпочтительными или другими промоторами для экспрессии в интересующем организме. См., например, промоторы, приведенные в WO 99/43838 и в патентах США №№: 8575425; 7790846; 8147856; 8,586832; 7772369; 7534939; 6072050; 5659026; 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611; включенных в настоящее описание путем ссылки.

[0082] В случае экспрессии в растениях конститутивные промоторы также включают промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); актина риса (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); убиквитина (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 и Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730). Индуцибельные промоторы включают промоторы, регулирующие экспрессию связанных с патогенезом белков (белков PR), индуцируемых после инфицирования патогеном. См., например, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; и Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116; и WO 99/43819, каждый из которых включен в настоящее описание путем ссылки. Также можно использовать промоторы, экспрессируемые локально или вблизи участка патогенной инфекции (Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; и Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977; Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200; патент США № 5750386 (нематодо-индуцибельные); и цитируемые в них ссылки).

[0083] В конструкциях по изобретению можно использовать повреждение-индуцибельные промоторы. Такие повреждение-индуцибельные промоторы включают промотор pin II (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 и wun2 (патент США № 5428148); win1 и win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); системина (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); гена MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141-150); и т.п., включенных в настоящее описание путем ссылок.

[0084] Ткане-предпочтительные промоторы для использования в изобретении включают приведенные в Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; и Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505.

[0085] Предпочтительные для листьев промоторы включают приведенные в Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; и Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

[0086] Известны предпочтительные для корней промоторы, и они включают описываемые в Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (специфический для корня сои ген глутаминсинтетазы); Keller and Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (корне-специфический контрольный элемент); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (ген маннопинсинтазы (MAS) Agrobacterium tumefaciens); и Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (цитозольная глутаминсинтетаза (GS)); Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641; Leach and Aoyagi (1991) Plant Science (Limerick) 79(1):69-76 (rolC и rolD); Teeri et al. (1989) EMBO J. 8(2):343-350; Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772 (промотор гена VfENOD-GRP3); и Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691 (промотор rolB). См. также патенты США №№ 5837876; 5750386; 5633363; 5459252; 5401836; 5110732 и 5023179.

[0087] "Семя-предпочтительные" промоторы включают "семя-специфические" промоторы (промоторы, активные в течение развития семян, такие как промоторы запасных белков семян), а также промоторы "прорастания семян" (промоторы, активные в течение прорастания семян). См. Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108. Семя-предпочтительные промоторы включают, в качестве неограничивающих примеров, Cim1 (цитокинин-индуцируемая передача сигнала); cZ19B1 (зеин кукурузы массой 19 кДа); milps (миоинозитол-1-фосфатсинтетаза) (см. WO 00/11177 и патент США № 6225529). Гамма-зеин имеет эндосперм-специфический промотор. Глобулин 1 (Glb-1) имеет типичный эмбрио-специфический промотор. В случае двудольных растений семя-специфические промоторы включают, в качестве неограничивающих примеров, промоторы β-фазеолина фасоли, напина, β-конглицина, лектина сои, круциферина и т.п. В случае однодольных растений семя-специфические промоторы включают, в качестве неограничивающих примеров, промоторы зеина кукурузы массой 15 кДа, зеина массой 22 кДа, зеина массой 27 кДа, гамма-зеина, waxy, shrunken 1, shrunken 2, глобулина 1, и т.д. См. также WO 00/12733, где описывают семя-предпочтительные промоторы генов end1 и end2.

[0088] Что касается экспрессии в бактериальном хозяине, промоторы, функционирующие в бактериях, хорошо известны в этой области. Такие промоторы включают любой из промоторов генов кристаллических белков, включая промоторы любого из пестицидных белков по изобретению, и промоторы, специфические для сигма-факторов B. thuringiensis. Альтернативно, промоторы подвергнутых мутагенезу или рекомбинантных генов, кодирующих кристаллические белки, можно рекомбинантно конструировать и использовать для стимуляции экспрессии новых сегментов генов, представленных в настоящем описании.

[0089] Экспрессирующая кассета также может содержать ген селективного маркера для селекции трансформированных клеток. Гены селективных маркеров используют для селекции трансформированных клеток или тканей. Маркерные гены включают гены, кодирующие резистентность к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (NEO) и гигромицинфосфотрансферазу (HPT), а также гены, придающие резистентность к гербицидным соединениям, таким как глуфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Известны дополнительные селективные маркеры, и можно использовать любой из них. См., например, предварительную патентную заявку США № 62/094697, зарегистрированную 19 декабря 2014 года, включенную в настоящее описание путем ссылки в полном объеме, в которой описывают последовательности резистентности к глуфосинату, которые можно использовать в качестве селективных маркеров.

IV. Способы, клетки-хозяева и растительные клетки

[0090] Как указано, конструкции ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки или их активные варианты или фрагменты, можно использовать для трансформации интересующих растений или других интересующих организмов. Способы трансформации включают встраивание нуклеотидной конструкции в растение. Термин "встраивание" означает встраивание нуклеотидной конструкции в растение или другую клетку-хозяина таким образом, что конструкция получает доступ внутрь клетки растения или клетки-хозяина. В способах по изобретению не требуется конкретный способ встраивания нуклеотидной конструкции в растение или клетку-хозяина, лишь то, что нуклеотидная конструкция получает доступ внутрь по меньшей мере одной клетки растения или организма-хозяина. В этой области известны способы встраивания нуклеотидных конструкций в растения и другие клетки-хозяева, включая, в качестве неограничивающих примеров, способы стабильной трансформации, способы транзиторной трансформации и вирус-опосредованные способы.

[0091] С помощью способов получают трансформированные организмы, такие как растение, включая целые растения, а также органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), их семена, растительные клетки, ростки, эмбрионы и потомство. Растительные клетки могут являться дифференцированными или недифференцированными (например, каллюс, клетки суспензионной культуры, протопласты, клетки листьев, клетки корней, клетки флоэмы, пыльцу).

[0092] Термины "трансгенные растения", "трансформированные растения" или "стабильно трансформированные" растения, клетки или ткани относится к растениям, имеющим встроенный или интегрированный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один пестицидный полипептид по изобретению. Установлено, что другие экзогенные или эндогенные последовательности нуклеиновой кислоты или фрагменты ДНК также можно встраивать в растительную клетку. Agrobacterium-опосредованная и биолистическая трансформация остаются двумя преимущественно используемыми подходами. Однако трансформацию можно осуществлять посредством инфицирования, трансфекции, микроинъекции, электропорации, микропроекции, биолистики или бомбардировки частицами, электропорации, с помощью волокон диоксида кремния/углерода, ультразвуковым способом, PEG-опосредованным способом, совместным осаждением фосфатом кальция, способом с использованием поликатиона DMSO, способом с использованием DEAE-декстрана, Agrobacterium-опосредованным и вирус-опосредованным способом (колимовирусы, геминивирусы, РНК-вирусы растений), липосомо-опосредованным способом и т.п.

[0093] Способы трансформации, а также способы встраивания полипептидов или полинуклеотидных последовательностей в растения могут варьироваться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. однодольного или двудольного, подлежащих трансформации. Способы трансформации известны в этой области и включают приведенные в патентах США №№: 8575425; 7692068; 8802934 и 7541517; каждый из которых включен в настоящее описание путем ссылки. См., также, Rakoczy-Trojanowska, M. (2002) Cell Mol Biol Lett. 7:849-858; Jones et al. (2005) Plant Methods 1:5; Rivera et al. (2012) Physics of Life Reviews 9:308-345; Bartlett et al. (2008) Plant Methods 4:1-12; Bates, G.W. (1999) Methods in Molecular biology 111:359-366; Binns and Thomashow (1988) Annual Reviews in Microbiology 42:575-606; Christou, P. (1992) The Plant Journal 2:275-281; Christou, P. (1995) Euphytica 85:13-27; Tzfira et al. (2004) TRENDS in Genetics 20:375-383; Yao et al. (2006) Journal of Experimental Botany 57:3737-3746; Zupan and Zambryski (1995) Plant Physiology 107:1041-1047; и Jones et al. (2005) Plant Methods 1:5.

[0094] Трансформация может приводить к стабильному или транзиторному встраиванию нуклеиновой кислоты в клетку. Термин "стабильная трансформация" означает, что нуклеотидная конструкция, встраиваемая в клетку-хозяина, интегрируется в геном клетки-хозяина и способна наследоваться его потомством. Термин "транзиторная трансформация" означает, что полинуклеотид встраивают в клетку-хозяина, но он не интегрируется в геном клетки-хозяина.

[0095] В этой области известны способы трансформации хлоропластов. См., например, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Способ основан на доставке ДНК, содержащей селективный маркер, с помощью генной пушки и направления ДНК в пластидный геном посредством гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформацию пластид можно осуществлять посредством трансактивации молчащего трансгена пластидного происхождения посредством ткане-предпочтительной экспрессии кодируемой в ядре и направляемой пластидами РНК-полимеразы. Такую систему описывают в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

[0096] Трансформированные клетки можно выращивать в растениях общепринятыми способами. См., например, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Эти растения затем можно выращивать и опылять той же трансформированной линией или другой линией и идентифицировать полученный гибрид, имеющий конститутивную экспрессию желаемых фенотипических характеристик. Можно выращивать два или более поколения для обеспечения стабильного поддержания и наследования экспрессии желаемой фенотипической характеристики, а затем собирать семена для подтверждения достижения экспрессии желаемой фенотипической характеристики. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансформированным семенам (также обозначаемым как "трансгенные семена"), имеющим нуклеотидную конструкцию по изобретению, например, экспрессирующую кассету по изобретению, стабильно встроенную в их геном.

[0097] В конкретных вариантах осуществления последовательности, представленные в настоящем описании, можно направлять в конкретный участок в геноме клетки-хозяина или растительной клетки. Такие способы включают, в качестве неограничивающих примеров, мегануклеазы, сконструированные против интересующей растительной геномной последовательности (D'Halluin et al. 2013 Plant Biotechnol J); CRISPR-Cas9, TALEN и другие технологии для точного редактирования геномов (Feng, et al. Cell Research 23:1229-1232, 2013, Podevin, et al. Trends Biotechnology, публикация он-лайн, 2013, Wei et al., J Gen Genomics, 2013, Zhang et al (2013) WO 2013/026740); сайт-специфическую рекомбинацию Cre-lox (Dale et al. (1995) Plant J 7:649-659; Lyznik, et al. (2007) Transgenic Plant J 1:1-9; рекомбинацию FLP-FRT (Li et al. (2009) Plant Physiol 151:1087-1095); Bxb1-опосредованное встраивание (Yau et al. Plant J (2011) 701:147-166); встраивание, опосредованное цинковыми пальцами (Wright et al. (2005) Plant J 44:693-705); Cai et al. (2009) Plant Mol Biol 69:699-709) и гомологичную рекомбинацию (Lieberman-Lazarovich and Levy (2011) Methods Mol Biol 701: 51-65); Puchta (2002) Plant Mol Biol 48:173-182).

[0098] Последовательность, представленную в настоящем описании, можно использовать для трансформации любого вида растений, включая, в качестве неограничивающих примеров, однодольные и двудольные. Неограничивающие примеры интересующих растений включают кукурузу, сорго, пшеницу, подсолнечник, томат, крестоцветные растения, перцы, картофель, хлопок, рис, сою, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень и рапс, Brassica sp., люцерну, рожь, просо, сафлор, арахис, батат, маниок, кофе, кокос, ананас, цитрусовые, какао, чай, банан, авокадо, инжир, гуаву, манго, оливу, папайю, кешью, макадамию, миндаль, овес, овощи, декоративные растения и хвойные растения.

[0099] Овощи включают, в качестве неограничивающих примеров, томат, салат-латук, зеленую фасоль, лимскую фасоль, горох и членов рода Curcumis, таких как огурец, канталупа и мускусная дыня. Декоративные растения включают, в качестве неограничивающих примеров, азалию, гортензию, гибискус, розы, тюльпаны, нарциссы, петунии, гвоздики, пуансеттию и хризантему. Предпочтительно, растения по настоящему изобретению являются сельскохозяйственными культурами (например, кукурузой, сорго, пшеницей, подсолнечником, томатом, крестоцветными растениями, перцами, картофелем, хлопком, рисом, соей, сахарной свеклой, сахарным тростником, табаком, ячменем, рапсом и т.д.).

[0100] В рамках изобретения термин "растение" включает растительные клетки, протопласты растений, культуры клеток растительных тканей, из которых можно регенерировать растения, растительный каллюс, сгустки растительного материала и растительные клетки, интактные в растениях или частях растений, таких как эмбрионы, пыльца, семязачатки, семена, листья, цветы, ветви, плоды, зерна, початки, стержни початков, мякину, стебли, корни, кончики корней, пыльники и т.п. Термин "зерно" должен означать зрелое семя, произведенное сельхозпроизводителями в целях, иных, чем выращивание или воспроизведение видов. Потомство, варианты и мутанты регенерировавших растений также входят в объем изобретения, при условии, что эти части содержат встроенные полинуклеотиды. Кроме того, настоящее изобретение относится к обработанному растительному продукту или субпродукту, сохраняющему последовательности, представленные в настоящем описании, включая например, соевые продукты.

[0101] В другом варианте осуществления гены, кодирующие пестицидные белки, можно использовать для трансформации патогенных организмов насекомых. Такие организмы включают бакуловирусы, грибы, простейшие, бактерии и нематоды. Можно выбирать микроорганизмы-хозяева, как известно, занимающие "фитосферу" (филлоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан) одного или нескольких интересующих сельскохозяйственных культур. Эти микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они были способны успешно конкурировать в конкретной среде с микроорганизмами дикого типа, обеспечивать стабильное поддержание и экспрессию гена, экспрессирующего пестицидный белок, и, желательно, обеспечивать улучшенную защиту пестицида от деградации и инактивации в окружающей среде.

[0102] Такие микроорганизмы включают археи, бактерии, водоросли и грибы. Особенный интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например, Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes. Грибы включают дрожжей, например, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие бактериальные виды фитосферы, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli и Azotobacter vinlandir, и виды дрожжей фитосферы, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, Aureobasidium pollulans, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, и т.п.

[0103] Иллюстративные прокариоты, как грамотрицательные, так и грамположительные, включают Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella и Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, такие как Rhizobium; Spirillaceae, такие как Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, такие как Pseudomonas и Acetobacter; Azotobacteraceae и Nitrobacteraceae. Грибы включают Phycomycetes и Ascomycetes, например, дрожжи, такие как Saccharomyces и Schizosaccharomyces; и дрожжи Basidiomycetes, такие как Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces и т.п.

[0104] Гены, кодирующие пестицидные белки, можно встраивать посредством электротрансформации, PEG-индуцированной трансформации, теплового шока, трансдукции, конъюгации и т.п. В частности, гены, кодирующие пестицидные белки, можно клонировать в челночный вектор. Примером челночного вектора является pHT3101 (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218). Челночный вектор pHT3101, содержащий кодирующую последовательность гена конкретного пестицидного белка, например, можно трансформировать в колонизирующие корень Bacillus посредством электропорации (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218).

[0105] Системы экспрессии можно конструировать таким образом, что пестицидные белки секретируются вне цитоплазмы грамотрицательных бактерий, посредством слияния с подходящим сигнальным пептидом на амино-конце пестицидного белка. Сигнальные пептиды, распознаваемые E. coli, включают белок OmpA (Ghrayeb et al. (1984) EMBO J, 3: 2437-2442).

[0106] Пестицидные белки и их активные варианты можно ферментировать в бактериальном хозяине, и полученных бактерий, обработанных и используемых в качестве микробного спрея тем же образом, что и штаммы Bacillus thuringiensis, используют в качестве инсектицидных спреев. В случае пестицидных белков, секретируемых Bacillus, сигнал секреции удаляют или подвергают мутагенезу способами, известными в этой области. Такие мутации и/или делеции предотвращают секрецию пестицидных белков в среду для выращивания в течение ферментации. Пестицидные белки удерживаются внутри клетки, а затем клетки обрабатывают для получения инкапсулированных пестицидных белков.

[0107] Альтернативно, пестицидные белки получают посредством встраивания гетерологичных генов в клеточного хозяина. Экспрессия гетерологичного гена приводит, прямо или косвенно, к внутриклеточной продукции и поддержанию пестицида. Затем эти клетки обрабатывают в условиях, пролонгирующих активность токсина, продуцируемого в клетке, когда клетку наносят на окружающую среду целевых вредителей. Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти природно инкапсулированные пестицидные белки затем можно составлять общепринятыми способами для нанесения а окружающую среду целевого вредителя, например, почву, воду и листву растений. См., например патент США № 6468523, патентную публикацию США № 20050138685 и цитируемые в них ссылки. В настоящем изобретении трансформированный микроорганизм (включающий целые организмы, клетки, споры, пестицидные белки, пестицидные компоненты, влияющие на вредителя компоненты, мутанты, живые или мертвые клетки и компоненты клеток, включая смеси живых и мертвых клеток и компонентов клеток, и включая разрушенные клетки и компоненты клеток) или выделенный пестицидный белок можно составлять с приемлемым носителем в пестицидные или сельскохозяйственные композиции, представляющие собой, например, суспензию, раствор, эмульсию, опудривающее средство, диспергируемую гранулу, смачиваемый порошок и эмульгируемый концентрат, аэрозоль, пропитанную гранулу, вспомогательное средство, покрываемую пасту, а также инкапсуляции, например, в полимерных веществах.

[0108] Сельскохозяйственные композиции могут содержать полипептид, рекомбиногенный полипептид или его вариант или фрагмент, как представлено в настоящем описании. Сельскохозяйственную композицию, представленную в настоящем описании, можно наносить на окружающую среду растения или область культивирования или наносить на растение, часть растения, растительную клетку или семя.

[0109] Такие композиции, описываемые выше, можно получать посредством добавления поверхностно-активного средства, инертного носителя, консерванта, увлажнителя, пищевого стимулятора, аттрактанта, инкапсулирующего средства, связывающего средства, эмульгатора, красителя, УФ-протектора, буфера, добавки для повышения текучести или удобрений, доноров питательных микроэлементов или других препаратов, влияющих на рост растения. Один или несколько агрохимикатов, включая, в качестве неограничивающих примеров, гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды, акарициды, регуляторы роста растений, средства для сбора урожая и удобрения, можно комбинировать с носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными веществами, общепринято используемыми в этой области составления, или другими компонентами для облегчения обращения с продуктом и использования в отношении конкретных целевых вредителей. Подходящие носители и вспомогательные средства могут являться твердыми или жидкими веществами и соответствовать веществам, как правило, используемыми в составлении, например, природным или восстановленным минеральным веществам, растворителям, дисперсантам, увлажнителям, средствам, придающим липкость, связывающим средствам или удобрениям. Активные ингредиенты по настоящему изобретению, как правило, наносят в форме композиций, и их можно наносить на область сельскохозяйственной культуры, растение или семя, подлежащее обработке. Например, композиции по настоящему изобретению можно наносить на зерно в препарате для или в течение хранения в зернохранилище или силосной башне и т.д. Композиции по настоящему изобретению можно наносить одновременно или по очереди с другими соединениями. Способы нанесения активного ингредиента по настоящему изобретению или агрохимической композиции по настоящему изобретению, содержащей по меньшей мере один пестицидный белок, продуцируемый штаммами бактерий по настоящему изобретению, включают, в качестве неограничивающих примеров, некорневое внесение, дражирование семян и почвенное внесение. Количество нанесений и частота нанесений зависят от интенсивности заражения соответствующим вредителем.

[0110] Подходящие поверхностно-активные средства включают, в качестве неограничивающих примеров, анионные соединения, такие как карбоксилат, например, металла; карбоксилат длинноцепочечной жирной кислоты; N-ацилсаркозинат; сложные моно- или диэфиры фосфорной кислоты с этоксилатами жирных спиртов или соли таких сложных эфиров; сульфаты жирных спиртов, такие как додецилсульфат натрия, октадецилсульфат натрия или цетилсульфат натрия; этоксилированные сульфаты жирных спиртов; этоксилированные алкилфенолсульфаты; сульфонаты лигнина; нефтяные сульфонаты; алкиларилсульфонаты, такие как алкил-бензолсульфонаты или низший алкилнафталинсульфонаты, например, бутил-нафталинсульфонат; соли сульфонированных нафталин-формальдегидных конденсатов; соли сульфонированных фенол-формальдегидных конденсатов; более сложные сульфонаты, такие как амидсульфонаты, например, сульфонированный продукт конденсации олеиновой кислоты и N-метилтаурина; или диалкилсульфосукцинаты, например, сульфонат натрия диоктилсукцината. Неионные средства включают продукты конденсации сложных эфиров жирных кислот, жирных спиртов, амидов жирных кислот или жирные алкил- или алкенил-замещенные фенолы с этиленоксидом, жирные сложные эфиры простых эфиров многоатомных спиртов, например, сложные эфиры сорбитана и жирных кислот, продукты конденсации таких сложных эфиров с этиленоксидом, например, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, ацетиленовые гликоли, такие как 2,4,7,9-тетраэтил-5-децин-4,7-диол, или этоксилированные ацетиленовые гликоли. Примеры катионного поверхностно-активного средства включают, например, алифатический моно-, ди- или полиамин, такой как ацетат, нафтенат или олеат; или кислород-содержащий амин, такой как аминоксид полиоксиэтиленалкиламина; амид-соединенный амин, полученный посредством конденсации карбоновой кислоты с ди- или полиамином; или соль четвертичного аммония.

[0111] Неограничивающие примеры инертных материалов включают неорганические минералы, такие как каолин, филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты, или ботанические материалы, такие как пробка, измельченные стержни кукурузного початка, скорлупа арахиса, шелуха риса и скорлупа грецких орехов.

[0112] Композиции по настоящему изобретению могут находиться в подходящей форме для прямого нанесения или в виде концентрата первичной композиции, который необходимо разводить подходящим количеством воды или другого дилюента перед нанесением. Пестицидная концентрация будет варьироваться в зависимости от природы конкретного состава, в частности, является ли он концентратом или его используют напрямую. Композиция содержит от 1 до 98% твердого или жидкого инертного носителя, и от 0 до 50% или от 0,1 до 50% поверхностно-активного вещества (масс./масс., об./об., или масс./об., при необходимости или желании). Эти композиции будут вводить с отмеченной скоростью для коммерческого продукта, например, приблизительно 0,01-5,0 фунтов на акр в сухой форме и приблизительно 0,01-10 pts на акр в жидкой форме.

[0113] В дополнительном варианте осуществления композиции, а также трансформированные микроорганизмы и пестицидные белки, представленные в настоящем описании, можно обрабатывать перед составлением для продления пестицидной активности при нанесении на окружающую среду целевого вредителя при условии, что предварительная обработка не мешает пестицидной активности. Такую обработку можно осуществлять химическими способами, физическими способами или и теми, и другими, при условии, что обработка не влияет отрицательно на свойства композиций. Неограничивающие примеры химических реагентов включают галогенирующие средства; альдегиды, такие как формальдегид и глутаральдегид; противоинфекционные средства, такие как зефиран хлорид; спирты, такие как изопропанол и этанол; и гистологические фиксативы, такие как фиксатив Боуина и фиксатив Хелли (см., например, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.).

[0114] В одном из аспектов вредителей можно уничтожать, или можно снижать их количество в указанной области посредством нанесения пестицидных белков, представленных в настоящем описании, на область. Альтернативно, пестицидные белки можно наносить профилактически на область окружающей среды для предотвращения заражения восприимчивым вредителем. Предпочтительно, вредитель потребляет или контактирует с пестицидно эффективным количеством полипептида. Термин "пестицидно эффективное количество" означает количество пестицида, способное вызывать гибель по меньшей мере одного вредителя или значительно снижать рост, питание или нормальное физиологическое развитие вредителя. Это количество будет варьироваться в зависимости от таких факторов как, например, конкретные целевые вредители, подлежащие контролю, конкретное окружение, местность, растение, сельскохозяйственная культура или сельскохозяйственная область, подлежащая обработке, условия окружающей среды и способ, частота, концентрация, стабильность и количество нанесений композиции пестицидно эффективного полипептида. Составы или композиции также могут варьироваться в отношении климатических условий, экологических факторов и/или частоты нанесения и/или тяжести заражения вредителем.

[0115] Активные ингредиенты, как правило, наносят в форме композиций, и их можно наносить на область сельскохозяйственной культуры, растение или семя, подлежащее обработке. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам предоставления растению, растительной клетке, семени, части растения или области культивирования эффективного количества сельскохозяйственной композиции, содержащей полипептид, рекомбиногенный полипептид или его активный вариант или фрагмент. Термин "эффективное количество" означает количество белка или композиции, имеющей пестицидную активность, достаточную для уничтожения или контроля вредителя или приводящую к значительному снижению роста, питания или нормального физиологического развития вредителя. Такие снижения количества вредителей, роста вредителей, питания вредителей или нормального развития вредителей могут включать любое статистически значимое снижение, включая, например, снижение на приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% или более. Например, композиции можно наносить на зерно в препарате для или в течение хранения в зернохранилище или силосной башне и т.д. Композиции можно наносить одновременно или по очереди с другими соединениями. Способы нанесения активного ингредиента или агрохимической композиции, содержащей по меньшей мере один из полипептидов, рекомбиногенных полипептидов или их вариантов или фрагментов, как представлено в настоящем описании, включают, в качестве неограничивающих примеров, некорневое внесение, дражирование семян и почвенное внесение.

[0116] Настоящее изобретение относится к способам повышения урожая растения. Способы включают получение растения или растительной клетки, экспрессирующей полинуклеотид, кодирующий последовательность пестицидного полипептида, представленного в настоящем описании, и выращивание растения или его семени в поле, зараженном (или восприимчивым к заражению) вредителем, против которого указанный полипептид имеет пестицидную активность. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет пестицидную активность в отношении чешуекрылых, жесткокрылых, двукрылых, полужесткокрылых вредителей или нематод, и указанное поле заражено чешуекрылыми, полужесткокрылыми, жесткокрылыми, двукрылыми вредителями или нематодами. Как определено в настоящем описании, термин "урожай" растения относится к качеству и/или количеству биомассы, продуцируемой растением. Термин "биомасса" означает любой измеримый растительный продукт. Повышение продукции биомассы является любым улучшением в полевых условиях измеримого растительного продукта. Повышение урожая растения имеет несколько коммерческих приложений. Например, повышение биомассы листьев растений может повышать урожай листовых овощей для потребления человеком или животным. Кроме того, повышение биомассы листьев можно использовать для повышения получения получаемых из растений фармацевтических или промышленных продуктов. Повышение урожая может включать любое статистически значимое повышение, включая, в качестве неограничивающих примеров, повышение по меньшей мере на 1%, повышение по меньшей мере на 3%, повышение по меньшей мере на 5%, повышение по меньшей мере на 10%, повышение по меньшей мере на 20%, повышение по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 100% или большее повышение урожая по сравнению с растением, не экспрессирующим пестицидную последовательность. В конкретных способах урожай растения повышают в результате улучшенной резистентности растения, экспрессирующего пестицидный белок, представленный в настоящем описании, к вредителю. Экспрессия пестицидного белка приводит к снижению способности вредителя заражать или питаться.

[0117] Растения также можно обрабатывать одной или несколькими химическими композициями, включая один или несколько гербицидов, инсектицидов или фунгицидов, или комбинацией двух или более из них.

[0118] Неограничивающие варианты осуществления включают:

[0119] 1. Выделенный полипептид, имеющий пестицидную активность, содержащий

(a) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159; или

(b) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, процент идентичности последовательности, приведенный в таблице 1, по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159.

[0120] 2. Полипептид по варианту осуществления 1, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159.

[0121] 3. Композиция, содержащая полипептид по вариантам осуществления 1 или 2.

[0122] 4. Полипептид по варианту осуществления 2, дополнительно содержащий гетерологичные аминокислотные последовательности.

[0123] 5. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по варианту осуществления 1, где указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты не является природной последовательностью, кодирующей указанный полипептид.

[0124] 6. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 5, где указанная молекула нуклеиновой кислоты является синтетической последовательностью, сконструированной для экспрессии в растении.

[0125] 7. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 6, где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором, способным направлять экспрессию в растительной клетке.

[0126] 8. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 5, где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором, способным направлять экспрессию в бактериях.

[0127] 9. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 8.

[0128] 10. Клетка-хозяин по варианту осуществления 9, где указанная клетка-хозяин является бактериальной клеткой-хозяином.

[0129] 11. Конструкция ДНК, содержащая промотор, регулирующий экспрессию в растительной клетке, функционально связанный с рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159; или,

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, процент идентичности последовательности, приведенный в таблице 1, по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159.

[0130] 12. Конструкция ДНК по варианту осуществления 11, где указанная нуклеотидная последовательность является синтетической последовательностью ДНК, сконструированной для экспрессии в растении.

[0131] 13. Вектор, содержащий конструкцию ДНК по варианту осуществления 11.

[0132] 14. Клетка-хозяин, содержащая конструкцию ДНК по любому из вариантов осуществления 11-13.

[0133] 15. Клетка-хозяин по варианту осуществления 14, где клетка-хозяин является растительной клеткой.

[0134] 16. Трансгенное растение, содержащее клетку-хозяина по варианту осуществления 15.

[0135] 17. Композиция, содержащая клетку-хозяина по варианту осуществления 10.

[0136] 18. Композиция по варианту осуществления 17, где указанная композиция выбрана из группы, состоящей из порошка, измельченного в пыль порошка, пеллета, гранулы, спрея, эмульсии, коллоидного раствора и раствора.

[0137] 19. Композиция по варианту осуществления 17, где указанная композиция содержит от приблизительно 1% до приблизительно 99% по массе указанного полипептида.

[0138] 20. Способ контроля популяции вредителей, включающий приведение указанной популяции в контакт с пестицидным эффективным количеством композиции по варианту осуществления 3 или 17.

[0139] 21. Способ уничтожения популяции вредителей, включающий приведение указанной популяции в контакт с пестицидным эффективным количеством композиции по варианту осуществления 3 или 17.

[0140] 22. Способ получения полипептида с пестицидной активностью, включающий культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления 9 в условиях, в которых молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, экспрессируется.

[0141] 23. Растение, имеющее стабильно встроенную в его геном конструкцию ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий пестицидную активность, где указанная нуклеотидная последовательность содержит

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159; или,

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, процент идентичности последовательности, приведенный в таблице 1, по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159.

[0142] 24. Трансгенное семя растения по варианту осуществления 23.

[0143] 25. Способ защиты растения от насекомого-вредителя, включающий экспрессию в растении или его клетке нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность содержит

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159; или,

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, процент идентичности последовательности, приведенный в таблице 1, по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159.

[0144] 26. Способ по варианту осуществления 25, где указанное растение продуцирует пестицидный полипептид, имеющий пестицидную активность против чешуекрылого или жесткокрылого вредителя или полужесткокрылого вредителя.

[0145] 27. Способ повышения урожая растения, включающий выращивание в поле растения или его семени, имеющих стабильно встроенную в их геном конструкцию ДНК, содержащую промотор, регулирующий экспрессию в растении, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей пестицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность содержит

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159; или,

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, процент идентичности последовательности, приведенный в таблице 1, по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 и/или 159.

[0146] Следующие примеры представлены в иллюстративных целях, а не для ограничения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Обнаружение новых генов посредством секвенирования и анализа ДНК

[0147] Культуры микроорганизмов выращивали в жидкой культуре в стандартных лабораторных средах. Культуры выращивали до насыщения (от 16 до 24 часов) до получения ДНК. ДНК выделяли из бактериальных клеток посредством лизиса детергентами с последующим связыванием с силикагелевой матрицей и промывкой этаноловым буфером. Очищенную ДНК элюировали из силикагелевой матрицы с помощью слабощелочного водного буфера.

[0148] ДНК для секвенирования тестировали на чистоту и концентрацию посредством спектрофотометрии. Библиотеки для секвенирования получали с использованием набора для получения библиотек Nextera XT по протоколу производителя. Данные секвенирования получали с помощью HiSeq 2000 по руководству пользователя к Illumina HiSeq 2000 System.

[0149] Риды секвенирования собирали в предварительные геномы с использованием пакета программ CLC Bio Assembly Cell. После сборки распознавание генов осуществляли несколькими способами и полученные последовательности исследовали для идентификации новых гомологов пестицидных генов. Новые гены идентифицировали посредством BLAST, по доменной композиции и посредством попарного выравнивания относительно целевого набора пестицидных генов. Общие сведения о таких последовательностях приведены в таблице 1.

[0150] Гены, идентифицированные при поиске гомологии, амплифицировали из бактериальной ДНК посредством ПЦР и клонировали в бактериальные экспрессирующие векторы, содержащие слитые метки для очистки, находящиеся в рамке считывания. Клонированные гены экспрессировали в E. coli и очищали посредством хроматографии на колонках. Очищенные белки оценивали в исследованиях с биологическими пищевыми анализами насекомых для идентификации активных белков.

[0151] Пищевые биологические анализы насекомых осуществляли с использованием зародышей пшеницы и агарового искусственного корма, на который очищенный белок наносили посредством поверхностной обработки. Личинок насекомых наносили на обработанный корм и подвергали мониторингу на смертность.

[0152] Пищевые биологические анализы насекомых осуществляли с использованием жидкого сахарозного корма, содержащегося в мембранном саше, в который добавляли очищенный белок. Нимфам насекомых позволяли питаться на саше с кормом, и их подвергали мониторингу на смертность. Насекомые, тестируемые в биологических анализах, включали коричневого щитника (BSB), Euschistus servus, и зеленого овощного клопа (SGSB), Nezara viridula. Данные представлены ниже в таблице 5.

Таблица 5. Результаты биологического анализа

BSB=Коричневый щитник, SGSB=Зеленый овощной клоп

Пример 2. Гетерологичная экспрессия в E. coli

[0153] Каждую открытую рамку считывания, приведенную в таблицах 6 и 7, клонировали в экспрессирующий вектор E. coli, содержащий мальтозо-связывающий белок (pMBP). Экспрессирующий вектор трансформировали в BL21*RIPL. Культуру LB, дополненную карбенициллином, инокулировали в одной колонии и выращивали в течение ночи при 37°C с использованием 0,5% ночной культуры, свежую культуру инокулировали и выращивали до логарифмической фазы при 37°C. Культуру индуцировали с использованием 250 мМ IPTG в течение 18 часов при 16°C. Клетки осаждали и ресуспендировали в 10 мМ Трис, pH 7,4, и 150 мМ NaCl, дополненных ингибиторами протеаз. Экспрессию белка оценивали посредством SDS-PAGE.

Пример 3. Пестицидная активность в отношении жесткокрылых и чешуекрылых

[0154] Экспрессия белка: Каждую последовательность, приведенную в таблице 6, экспрессировали в E. coli, как описано в примере 2. 400 мл LB инокулировали и выращивали до OD600 0,6. Культуру индуцировали 0,25 мМ IPTG в течение ночи при 16°C. Клетки центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл буфера. Ресуспендированный осадок обрабатывали ультразвуком в течение 2 мин на льду.

[0155] Биологический анализ: Яйца совки травяной (FAW), совки хлопковой (CEW), мотылька кукурузного (ECB), огневки кукурузной юго-западной (SWCB) и капустной моли (DBM) приобретали в коммерческом инсектарии (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Яйца FAW, CEW, ECB и BCW инкубировали до вылупления, происходящего в пределах 12 часов с начала анализа. SWCB и DBM включали в анализ в виде новорожденных личинок. Анализы осуществляли в 24-луночных лотках, содержащих корм для множества видов чешуекрылых (Southland Products Inc., Lake Village, AR). Образцы обработанного ультразвуком лизата наносили на поверхность корма (поверх корма) и позволяли испаряться и впитываться в корм. В случае CEW, FAW, BCW, ECB и SWCB 125 мкл обработанного ультразвуком лизата добавляли на поверхность корма и сушили. В случае DBM 50 мкл разведения 1:2 обработанного ультразвуком лизата добавляли на поверхность корма. Планшеты для биологического анализа закрывали пленкой, вентилируемой благодаря проколам булавкой. Планшеты инкубировали при 26°C при относительной влажности (RH) 65% с циклом день:ночь 16:8 в Percival в течение 5 дней. Анализы оценивали на уровень смертности, ингибирование роста и ингибирование питания.

[0156] Для биологического анализа западного кукурузного жука конструкцию/лизат белка оценивали в биологическом анализе насекомых посредством нанесения объема 60 мкл на поверхность корма в лунках 24-луночного планшета (Cellstar, 24-луночный, Greiner Bio One) и позволяли ему высушиваться. Каждая лунка содержала 500 мкл корма (Marrone et al., 1985). От пятнадцати до двадцати новорожденных личинок помещали в каждую лунку с использованием тонкой кисти и планшет покрывали мембраной (Viewseal, Greiner Bio One). Биологический анализ хранили при температуре окружающей среды и оценивали на смертность и/или ингибирование роста/питания в день 4. На фигуре 7 представлено руководство для биологического анализа кукурузного жука.

[0157] В случае колорадского жука (CPB) листовой диск, полученный с помощью сверла для пробки № 8, вырезали из листа картофеля и погружали в конструкцию/лизат белка до тщательного увлажнения и помещали поверх фильтровального диска (Millipore, фильтр из стекловолокна, 13 мм). 60 мкл dH₂O добавляли на каждый фильтровальный диск и помещали в каждую лунку 24-луночного планшета (Cellstar, 24-луночный, Greiner Bio One). Диску листа позволяли сушиться и в каждую лунку с использованием тонкой помещали от пяти до семи личинок на первой личиночной стадии кисти. Планшет закрывали мембраной (Viewseal, Greiner Bio One) и протыкали небольшое отверстие в каждой мембране лунки. Конструкцию оценивали в четырех параллелях и анализировали на смертность и повреждение листьев в день 3.

[0158] В таблице 6 представлены общие сведения о пестицидной активности различных последовательностей в отношении жесткокрылых и чешуекрылых. Обозначения в таблице: "-" указано отсутствие наблюдаемой активности; "NT" - не тестировали; "S" - остановка роста; "SS" - незначительная остановка роста; "LF" - низкое питание.

Таблица 6. Общие сведения о пестицидной активности в отношении Coleoptera и Lepidoptera.

Пример 4. Пестицидная активность в отношении полужесткокрылых

[0159] Экспрессия белка: Каждую из последовательностей, приведенных в таблице 7, экспрессировали в E. coli, как описано в примере 2. 400 мл LB инокулировали и выращивали до OD600 0,6. Культуру индуцировали 0,25 мМ IPTG в течение ночи при 16°C. Клетки центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл буфера. Ресуспендированный осадок подвергали обработке ультразвуком в течение 2 мин на льду.

[0160] SGSB второй личиночной стадии получали из коммерческого инсектария (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). В биологическом анализе использовали соотношение 50% об./об. образца обработанного ультразвуком лизата и 20% сахарозы. Натянутый парафильм использовали в качестве питательной мембраны для подвергания SGSB воздействию смеси корма/образца. Планшеты инкубировали при 25°C:21°C, цикле день:ночь 16:8 при 65% RH в течение 5 дней.

[0161] Смертность оценивали для каждого образца. Результаты приведены в таблице 7. Пунктирной линией указано отсутствие определенной смертности. Белок (APG00034) демонстрировал 25% смертности зеленого овощного клопа (1 клоп из 4 умер). В отрицательных контролях (пустой вектор, экспрессирующий связывающий домен, и только буфер) не наблюдали смертность (0 клопов из 4).

Таблица 7. Общие сведения о пестицидной активности в отношении Hemiptera

Пример 5. Трансформация сои

[0162] Конструкции ДНК, содержащие каждую из SEQ ID NO: 1-159 или их активные варианты или фрагменты, функционально связанные с промотором, активным в растении, клонировали в трансформационные векторы и встраивали в Agrobacterium, как описано в предварительной заявке США № 62/094782, зарегистрированной 19 декабря 2015 года, включенной в настоящее описание путем ссылки в полном объеме.

[0163] За четыре дня до инокуляции несколько петель Agrobacterium наносили на свежую чашку среды YEP*, дополненной соответствующими антибиотиками** (спектиномицином, хлорамфениколом и канамицином). Бактерии выращивали в течение двух дней в темноте при 28°C. Через два дня несколько петель бактерий переносили в 3 мл жидкой среды YEP с антибиотиками в колбу Эрленмейера емкостью 125 мл. Колбы помещали на ротационный шейкер при 250 об./мин. и 28°C на ночь. За день до инокуляции 2-3 мл ночной культуры переносили в 125 мл YEP с антибиотиками в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл. Колбы помещают на ротационный шейкер при 250 об./мин. и 28°C на ночь.

[0164] Перед инокуляцией проверяют OD бактериальной культуры при OD 620. OD 0,8-1,0 свидетельствует о том, что культура находится в log-фазе. Культуру центрифугируют при 4000 об./мин. в течение 10 минут в пробирках Oak Ridge. Супернатант выбрасывают и осадок ресуспендируют в объеме среды для инфицирования сои (SI) для достижения желаемой OD. Культуры держали с периодическим перемешиванием до того, как они потребуются для инокуляции.

[0165] За два или три дня до инокуляции семена сои поверхностно стерилизовали газообразным хлором. В вытяжном шкафу чашку Петри с семенами помещают в стеклянный колпак с открытой крышкой. 1,75 мл 12 Н HCl медленно добавляют к 100 мл отбеливателя в колбе Эрленмейера емкостью 250 мл внутри стеклянного колпака. Крышку незамедлительно помещали поверх стеклянного колпака. Семенам позволяли стерилизоваться в течение 14-16 часов (в течение ночи). Снимают верх стеклянного колпака и снимают крышку чашки Петри. Затем чашку Петри с поверхностно стерилизованными семенами открывают в ламинарном шкафу в течение приблизительно 30 минут для удаления любого оставшегося газообразного хлора.

[0166] Семена пропитывали стерильной DI водой или средой для инфицирования сои (SI) в течение 1-2 дней. От двадцати до 30 семян покрывают жидкостью в чашке Петри 100×25 мм и инкубируют в темноте при 24°C. После пропитывания непроросшие семена выбрасывают.

[0167] Семядольные эксплантаты обрабатывают на стерильной бумажной печатной форме со стерильной фильтровальной бумагой, увлажненной с использованием среды SI способами по патенту США № 7473822, включенному в настоящее описание путем ссылки.

[0168] Как правило, инокулируют 16-20 семядолей на обработку. Среду SI, используемую для удержания эксплантатов, выбрасывают и заменяют 25 мл культуры Agrobacterium (OD 620=0,8-20). После погружения всех эксплантатов инокуляцию осуществляют в течение 30 минут с периодическим встряхиванием чашки. Через 30 минут культуру Agrobacterium удаляют.

[0169] Планшеты для совместного культивирования подготавливали, накладывая один кусок стерильной бумаги на среду для совместного культивирования сои (SCC). Без промокания инокулированные семядоли культивировали адаксиальной стороной вниз на фильтровальной бумаге. На каждом планшете можно культивировать приблизительно 20 эксплантатов. Планшеты закрывали парафильмом и культивировали при 24°C и приблизительно 120 мкмоль м^-2с^-1 (в инкубаторе Percival) в течение 4-5 дней.

[0170] После совместного культивирования семядоли 3 раза промывают в 25 мл промывочной среды для сои с 200 мг/л цефотаксима и тиментина. Семядоли промокают на стерильной фильтровальной бумаге, а затем переносят в среду для индукции побегов сои (SSI). Узловой конец эксплантата немного опускают в среду, при этом дистальный конец держат над поверхностью под углом приблизительно 45 градусов. На каждом планшете культивируют не более 10 эксплантатов. Планшеты заворачивают в ленту Micropore и культивируют в Percival при 24°C и приблизительно 120 мкмоль м^-2с^-1.

[0171] Эксплантаты переносят на свежую среду SSI через 14 дней. Появившиеся побеги с верхушки побега и семядольного узла выбрасывают. Индукцию побегов продолжают еще в течение 14 дней в тех же условиях.

[0172] Через 4 недель индукции побегов семядолю отделяют от нодального конца и делают параллельный разрез под областью индукции побега (подушечка побега). Площадь параллельного разреза помещают на среду для удлинения побегов сои (SSE) и эксплантаты культивируют в Percival при 24°C и приблизительно 120 мкмоль м^-2м^-1. Эту стадию повторяют каждые две недели в течение до 8 недель при условии, что побеги продолжают удлиняться.

[0173] Когда побеги достигают длины 2-3 см, их переносят на среду для укоренения сои (SR) в сосуд Plantcon и инкубируют в тех же условиях в течение 2 недель или до достижения корнями длины приблизительно 3-4 см. После этого растения переносят в почву.

[0174] Необходимо отметить, что все среды, упомянутые для трансформации сои, можно найти в Paz et al. (2010) Agrobacterium-mediated transformation of soybean and recovery of transgenic soybean plants; Plant Transformation Facility of Iowa State University, включенном в настоящее описание путем ссылки в полном объеме. (См. agron-www.agron.iastate.edu/ptf/protocol/Soybean.pdf.)

Пример 6. Трансформация кукурузы

[0175] Початки кукурузы лучше всего собирать через 8-12 дней после опыления. Эмбрионы выделяют из початков и эти эмбрионы размером 0,8-1,5 мм предпочтительны для использования в трансформация. Эмбрионы помещают щитком вверх на подходящие среды для инкубации, такие как среды DN62A5S (3,98 г/л солей N6; 1 мл/л (1000-кратного стока) витаминов N6; 800 мг/л L-аспарагина; 100 мг/л миоинозитола; 1,4 г/л L-пролина; 100 мг/л казаминовых кислот; 50 г/л сахарозы; 1 мл/L (из стока 1 мг/мл) 2,4-D). Однако среды и соли, иные, чем DN62A5S, подходят и известны в этой области. Эмбрионы инкубируют в течение ночи при 25°C в темноте. Однако, по существу, не обязательно инкубировать эмбрионы в течение ночи.

[0176] Полученные эксплантаты переносят на сито с квадратными отверстиями (30-40 на планшет), переносят на осмотические среды на приблизительно 30-45 минут, а затем переносят на планшет для инжекции (см., например, публикацию PCT № WO/0138514 и патент США № 5240842). Конструкции ДНК, сконструированные для экспрессии белков GRG по настоящему изобретению в растительных клетках, инъецировали в растительную ткань с использованием аэрозольного пучкового инжектора, с использованием условий, по существу, описанных в публикации PCT № WO/0138514. После инжекции эмбрионы инкубируют в течение приблизительно 30 мин на осмотических средах и помещают на инкубационные среды в течение ночи при 25°C в темноте. Для избежания чрезмерного повреждения подвергнутых инжекции эксплантатов, их инкубируют в течение по меньшей мере 24 часов перед переносом на среды для восстановления. Затем эмбрионы распределяют на среды для восстановления на приблизительно 5 дней при 25°C в темноте, а затем переносят на селективные среды. Эксплантаты инкубируют в селективных средах в течение до восьми недель, в зависимости от природы и характеристик конкретной используемой селекции. После периода селекции полученный каллюс переносят на среды для созревания эмбрионов до образования зрелых соматических эмбрионов. Затем полученные зрелые соматические эмбрионы переносят в область низкого освещения и инициируют регенерацию известными в этой области способами. Полученным побегам позволяют укореняться на средах для укоренения, и полученные растения переносят в горшки для рассады и выращивают как трансгенные растения.

Пример 7. Пестицидная активность в отношении нематоды

Анализ Heterodera glycine (цистообразующей нематоды сои) in vitro

[0177] Цистообразующие нематоды сои распределяют в 96-луночный планшет с общим объемом 100 мкл и 100 J2 на лунку. Интересующий белок, приведенный в любой из SEQ ID NO: 1-159, распределяют по лункам и держат при комнатной температуре для оценки. В конечном итоге, 96-луночный планшет, содержащий SCN J2, анализируют на подвижность. Данные представлены в виде % ингибирования по сравнению с контролями. Совпадения определены как превосходящие или равные 70% ингибированию.

Анализ Heterodera glycine (цистообразующей нематоды сои) на растении

[0178] Растения сои, экспрессирующие одну или несколько из SEQ ID NO: 1-159, получали как описано где-либо в настоящем описании. Саженцы сои возрастом 3 недели инокулируют 5000 яйцами SCN на растение. Это инфицирование поддерживают в течение 70 дней, а затем собирают для подсчета цист SCN, развившихся на растении. Данные представлены как % ингибирования по сравнению с контролями. Совпадения определены как превосходящие или равные 90% ингибированию.

Анализ Meloidogyne incognita (клубеньковой нематоды) in vitro

[0179] Клубеньковые нематоды распределяют в 96-луночный планшет с общим объемом 100 мкл и 100 J2 на лунку. Интересующий белок, содержащий любую из SEQ ID NO: 1-159, распределяют по лункам и держат при комнатной температуре для оценки. В конечном итоге, 96-луночный планшет, содержащий RKN J2, анализируют на подвижность. Данные представлены как % ингибирования по сравнению с контролями. Совпадения определены как превосходящие или равные 70% ингибированию.

Анализ Meloidogyne incognita (клубеньковой нематоды) на растении

[0180] Растения сои, экспрессирующие одну или несколько из SEQ ID NO: 1-159, получали как описано где-либо в настоящем описании. Сою возрастом 3 недели инокулируют 5000 яйцами RKN на растение. Это инфицирование поддерживают в течение 70 дней, а затем собирают для подсчета яиц RKN, развившихся на растении. Данные представлены как % ингибирования по сравнению с контролями. Совпадения определены как превосходящие или равные 90% ингибированию.

Пример 8. Дополнительные анализы на пестицидную активность

[0181] Различные полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 1-159, можно тестировать на пестицидную активность в отношении вредителя рядом способом. Одним из таких способов является осуществление пищевого анализа. В таком пищевом анализе вредителя подвергают воздействию образца, содержащего соединения, подлежащие тестированию, или контрольные образцы. Зачастую это осуществляют, помещая материал, подлежащий тестированию, или подходящее разведение такого материала, на материал, который вредитель будет потреблять, такой как искусственный корм. Материал, подлежащий тестированию, может состоять из жидкости, твердого вещества или суспензии. Материал, подлежащий тестированию, можно помещать на поверхность, а затем позволять ему высыхать. Альтернативно, материал, подлежащий тестированию, можно смешивать с расплавленным искусственным кормом, и затем помещать в камеру для анализа. Камера для анализа может являться, например, ванночкой, чашкой или лункой планшета для микротитрования.

[0182] Анализы сосущих вредителей (например, тли) могут включать отделение тестового материала от насекомого на отсеки, в идеале, частью, которая могут быть проколота сосательными частями сосущего насекомого, чтобы сделать возможным потребление тестового материала. Часто тестовый материал смешивают с пищевым стимулятором, таким как сахароза, чтобы способствовать потреблению тестируемого соединения.

[0183] Другие типы анализов могут включать микроинъекцию тестового материала в рот или кишечник вредителя, а также разработку трансгенных растений с последующим тестированием способности вредителя питаться на трансгенном растении. Тестирование растения может включать изоляцию частей растений, как правило, потребляемых, например, в небольших клетках, прикрепленных к листу, или изоляцию целых растениях в клетках, содержащих насекомых.

[0184] Другие способы и подходы анализа вредителей известны в этой области, и их можно найти, например, в Robertson and Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, Fla. Альтернативно, анализы, как правило, описывают в журналах Arthropod Management Tests и Journal of Economic Entomology или при обсуждении с членами Entomological Society of America (ESA). Любую из SEQ ID NO: 1-159 можно экспрессировать и использовать в анализе, как приведено в примерах 3 и 4 в настоящем описании.

[0185] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании, свидетельствуют об уровне знания специалистов в области, к которой относится изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в настоящее описание путем ссылок в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная путем ссылки.

[0186] Хотя описанное выше изобретение описано в некоторых подробностях посредством иллюстрации и примеров в целях ясности понимания, очевидно, что можно осуществлять на практике конкретные изменения и модификации в объеме формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Parks, Jessica

Roberts, Kira Bulazel

Thayer, Rebecca E

<120> ПЕСТИЦИДНЫЕ ГЕНЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 098699-0965873

<150> US 60/095,524

<151> 2014-12-22

<160> 167

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 885

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Bacillus sp., полученные из образца окружающей среды

<400> 1

Met Ala Asn Gly Thr Lys Lys His Val Ile Lys Lys Tyr Leu Glu Leu

1 5 10 15

Ile Lys Pro Ile Tyr Tyr Lys Gln Asn Ser Leu Leu Phe Ser Pro Phe

20 25 30

Ile Leu Ser Ile Pro Gly Cys Asp Ile Ser Gln His Gly Ser Ile Pro

35 40 45

Ala Met Lys Arg Asn Cys Phe Thr Leu Leu Leu Tyr Tyr Arg Arg Tyr

50 55 60

Val Met Ala Gln Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gln Ser Phe Ile Pro Tyr

65 70 75 80

Asn Val Leu Ala Asn Pro Val Thr Gly Asn Ser Ala Gly Thr Asp Trp

85 90 95

Gly Glu Trp Leu Ser Ser Leu Lys Glu Ala Trp Thr Glu Phe Gln Lys

100 105 110

Thr Gly Ser Asp Lys Phe Leu Gln Ser Val Leu Ser Thr Gly Tyr Asp

115 120 125

Ala Ala Gln Gly Gly Ser Phe Asn Tyr Ile Ala Val Leu Gln Ala Gly

130 135 140

Val Ala Ile Leu Gly Thr Val Leu Gly Ala Glu Phe Pro Gly Ile Thr

145 150 155 160

Ala Ile Ala Val Pro Ala Leu Thr Phe Leu Ile Lys Trp Val Trp Pro

165 170 175

Lys Leu Thr Gly Gly Ser Ala Gly Glu Ser Asp Thr Gln Lys Met Leu

180 185 190

Asp Leu Ile Asp Lys Glu Ile Gln Gln Lys Leu Asp Gln Ala Leu Ser

195 200 205

Gln Gln Asp Ile Asn Asn Trp Arg Ala Tyr Leu Thr Ser Ile Phe Glu

210 215 220

Ala Ala Thr Asn Leu Ser Gln Ser Ile Ile Asp Ala Gln Phe Thr Gly

225 230 235 240

Thr Glu Arg Ser Ser Asp Arg Gln Pro Arg Val Pro Thr Ser Ser Asp

245 250 255

Tyr Glu Asp Val Tyr Thr Lys Leu Asn Ile Ala Asp Ala Val Leu Ser

260 265 270

Pro Ser Thr Asn Asn Ile Leu Thr Gly Asn Phe Asp Val Leu Ala Ile

275 280 285

Pro Tyr Tyr Thr Ile Gly Ala Thr Val Arg Ile Thr Ala Tyr Gln Ser

290 295 300

Phe Val Lys Phe Ala Asn Gln Trp Ile Asp Val Val Tyr Pro Asp Gln

305 310 315 320

Thr Ser Asn Thr Trp Leu Lys Ala His Gln Asn Leu Asp Asn Ala Lys

325 330 335

Asp Lys Met Ile Ala Met Ile Gln Gln Tyr Thr Ala Asn Val Leu Arg

340 345 350

Val Phe Thr Asp Pro Lys Asn Met Pro Pro Leu Gly Lys Asp Lys Lys

355 360 365

Ser Ile Asn Ala Tyr Asn Lys Phe Val Arg Gly Met Val Ile Ser Gly

370 375 380

Leu Asp Leu Val Ala Val Trp Pro Ser Leu Tyr Pro Asp Asp Tyr Gln

385 390 395 400

Val Gln Thr Asp Leu Glu Lys Thr Arg Val Ile Phe Ser Asp Leu Ile

405 410 415

Gly Lys Asp Gln Thr Ile Ser Asn Asp Val Thr Leu Ile Asn Met Ala

420 425 430

Asp Gly Lys Asp Gly Ser Gly Ala Phe Asn Gln His Ala Ala Ile Asp

435 440 445

Leu Asn Ser Ile Phe Tyr Tyr His Glu Glu Leu Ser Ser Met Gln Leu

450 455 460

Gly Ile His Asp Gly Ser Arg Gly Asn Thr Thr Asn Cys Tyr Asp Tyr

465 470 475 480

Gly Ile Ile Ala Asn Tyr Pro Asn His Ser Tyr Phe Tyr Gly Asp Leu

485 490 495

Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ala Thr Phe Ser Ala Pro Leu Asn Val Leu

500 505 510

Asn Ala Gln Thr Gln Tyr Ser Ser Gly Tyr Val Asp Ser Glu Phe Ile

515 520 525

Tyr Asn Ser Asp Pro Ser Ala Tyr Gly Leu Gly Cys His Ile Leu Gly

530 535 540

Gly Cys Thr Lys Gly Asp Cys Tyr Asn Gln Ser Ser Cys Ser Glu Gly

545 550 555 560

Phe Gly Tyr Ser Cys Asn Thr Ser Leu Pro Ser Gln Lys Ile Asn Ala

565 570 575

Phe Tyr Pro Phe Lys Met Asn Leu Asn Arg Ser Gly Thr Ser Asp Lys

580 585 590

Leu Gly Leu Met Tyr Ser Leu Val Pro Leu Asp Leu Ser Pro Asn Asn

595 600 605

Val Phe Gly Glu Leu Asp Ser Asp Thr Arg Asn Val Ile Gly Lys Gly

610 615 620

Phe Pro Ala Glu Lys Gly Thr Leu Ser Tyr Gly Arg Gln Pro Met Leu

625 630 635 640

Val Arg Glu Trp Val Asn Gly Ala Asn Ala Val Lys Leu Ser Asp Val

645 650 655

Pro Leu Thr Leu Gln Met Thr Asn Met Thr Ser Gly Lys Tyr Tyr Ile

660 665 670

Arg Val Arg Tyr Ala Asn Thr Ser Asn Ala Glu Ile Ser Ile Asn Gln

675 680 685

Gln Val Tyr Ala Gly Asn Gln Asn Val Gln Asn Gly Gly Trp Ser Leu

690 695 700

Pro Ser Thr Thr Ala Ser Asn Val Ala Thr Asn Phe Pro Asn Gln Leu

705 710 715 720

Tyr Ile Thr Gly Ile Asn Gly Asn Tyr Val Leu Glu Asp Ile Thr Trp

725 730 735

Gly Val Asp Gly Gln Gly Lys Pro Ile Thr Ile Pro Ser Gly Asp Val

740 745 750

Thr Val Thr Leu Ser Arg Thr Asn Met Ser Gln Ser Gly Asp Leu Phe

755 760 765

Ile Asp Arg Val Glu Leu Val Pro Ala Ala Pro Gln Ser Asp Tyr Ile

770 775 780

Asn Tyr Ser Ile Thr Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asn Asn Phe Asp Thr

785 790 795 800

Ile Ile Trp Asp Gly Asn Gly Ala Gln Arg Ser Thr Ala Thr Val Thr

805 810 815

Val Ser Gly Leu Pro Asp Asn Asn Gly Ile Leu Ile Ser Gly Leu Ser

820 825 830

Ser Tyr Gly Trp Gln Pro Leu Gln Asp Val Asn Gly His Gly Asn Asn

835 840 845

Trp Val Thr Asn Gly Gly Pro Phe Thr Leu Ser Asn Asp His Thr Phe

850 855 860

Thr Ala Ile Ser Ile Cys Gly Phe Gln Asn Val Ser Ser Gly Lys Ile

865 870 875 880

Thr Gly Lys Leu Ser

885

<210> 2

<211> 777

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 2

Met Ala Asn Gly Thr Lys Lys His Val Ile Lys Lys Tyr Leu Glu Leu

1 5 10 15

Ile Lys Pro Ile Tyr Tyr Lys Gln Asn Ser Leu Leu Phe Ser Pro Phe

20 25 30

Ile Leu Ser Ile Pro Gly Cys Asp Ile Ser Gln His Gly Ser Ile Pro

35 40 45

Ala Met Lys Arg Asn Cys Phe Thr Leu Leu Leu Tyr Tyr Arg Arg Tyr

50 55 60

Val Met Ala Gln Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gln Ser Phe Ile Pro Tyr

65 70 75 80

Asn Val Leu Ala Asn Pro Val Thr Gly Asn Ser Ala Gly Thr Asp Trp

85 90 95

Gly Glu Trp Leu Ser Ser Leu Lys Glu Ala Trp Thr Glu Phe Gln Lys

100 105 110

Thr Gly Ser Asp Lys Phe Leu Gln Ser Val Leu Ser Thr Gly Tyr Asp

115 120 125

Ala Ala Gln Gly Gly Ser Phe Asn Tyr Ile Ala Val Leu Gln Ala Gly

130 135 140

Val Ala Ile Leu Gly Thr Val Leu Gly Ala Glu Phe Pro Gly Ile Thr

145 150 155 160

Ala Ile Ala Val Pro Ala Leu Thr Phe Leu Ile Lys Trp Val Trp Pro

165 170 175

Lys Leu Thr Gly Gly Ser Ala Gly Glu Ser Asp Thr Gln Lys Met Leu

180 185 190

Asp Leu Ile Asp Lys Glu Ile Gln Gln Lys Leu Asp Gln Ala Leu Ser

195 200 205

Gln Gln Asp Ile Asn Asn Trp Arg Ala Tyr Leu Thr Ser Ile Phe Glu

210 215 220

Ala Ala Thr Asn Leu Ser Gln Ser Ile Ile Asp Ala Gln Phe Thr Gly

225 230 235 240

Thr Glu Arg Ser Ser Asp Arg Gln Pro Arg Val Pro Thr Ser Ser Asp

245 250 255

Tyr Glu Asp Val Tyr Thr Lys Leu Asn Ile Ala Asp Ala Val Leu Ser

260 265 270

Pro Ser Thr Asn Asn Ile Leu Thr Gly Asn Phe Asp Val Leu Ala Ile

275 280 285

Pro Tyr Tyr Thr Ile Gly Ala Thr Val Arg Ile Thr Ala Tyr Gln Ser

290 295 300

Phe Val Lys Phe Ala Asn Gln Trp Ile Asp Val Val Tyr Pro Asp Gln

305 310 315 320

Thr Ser Asn Thr Trp Leu Lys Ala His Gln Asn Leu Asp Asn Ala Lys

325 330 335

Asp Lys Met Ile Ala Met Ile Gln Gln Tyr Thr Ala Asn Val Leu Arg

340 345 350

Val Phe Thr Asp Pro Lys Asn Met Pro Pro Leu Gly Lys Asp Lys Lys

355 360 365

Ser Ile Asn Ala Tyr Asn Lys Phe Val Arg Gly Met Val Ile Ser Gly

370 375 380

Leu Asp Leu Val Ala Val Trp Pro Ser Leu Tyr Pro Asp Asp Tyr Gln

385 390 395 400

Val Gln Thr Asp Leu Glu Lys Thr Arg Val Ile Phe Ser Asp Leu Ile

405 410 415

Gly Lys Asp Gln Thr Ile Ser Asn Asp Val Thr Leu Ile Asn Met Ala

420 425 430

Asp Gly Lys Asp Gly Ser Gly Ala Phe Asn Gln His Ala Ala Ile Asp

435 440 445

Leu Asn Ser Ile Phe Tyr Tyr His Glu Glu Leu Ser Ser Met Gln Leu

450 455 460

Gly Ile His Asp Gly Ser Arg Gly Asn Thr Thr Asn Cys Tyr Asp Tyr

465 470 475 480

Gly Ile Ile Ala Asn Tyr Pro Asn His Ser Tyr Phe Tyr Gly Asp Leu

485 490 495

Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ala Thr Phe Ser Ala Pro Leu Asn Val Leu

500 505 510

Asn Ala Gln Thr Gln Tyr Ser Ser Gly Tyr Val Asp Ser Glu Phe Ile

515 520 525

Tyr Asn Ser Asp Pro Ser Ala Tyr Gly Leu Gly Cys His Ile Leu Gly

530 535 540

Gly Cys Thr Lys Gly Asp Cys Tyr Asn Gln Ser Ser Cys Ser Glu Gly

545 550 555 560

Phe Gly Tyr Ser Cys Asn Thr Ser Leu Pro Ser Gln Lys Ile Asn Ala

565 570 575

Phe Tyr Pro Phe Lys Met Asn Leu Asn Arg Ser Gly Thr Ser Asp Lys

580 585 590

Leu Gly Leu Met Tyr Ser Leu Val Pro Leu Asp Leu Ser Pro Asn Asn

595 600 605

Val Phe Gly Glu Leu Asp Ser Asp Thr Arg Asn Val Ile Gly Lys Gly

610 615 620

Phe Pro Ala Glu Lys Gly Thr Leu Ser Tyr Gly Arg Gln Pro Met Leu

625 630 635 640

Val Arg Glu Trp Val Asn Gly Ala Asn Ala Val Lys Leu Ser Asp Val

645 650 655

Pro Leu Thr Leu Gln Met Thr Asn Met Thr Ser Gly Lys Tyr Tyr Ile

660 665 670

Arg Val Arg Tyr Ala Asn Thr Ser Asn Ala Glu Ile Ser Ile Asn Gln

675 680 685

Gln Val Tyr Ala Gly Asn Gln Asn Val Gln Asn Gly Gly Trp Ser Leu

690 695 700

Pro Ser Thr Thr Ala Ser Asn Val Ala Thr Asn Phe Pro Asn Gln Leu

705 710 715 720

Tyr Ile Thr Gly Ile Asn Gly Asn Tyr Val Leu Glu Asp Ile Thr Trp

725 730 735

Gly Val Asp Gly Gln Gly Lys Pro Ile Thr Ile Pro Ser Gly Asp Val

740 745 750

Thr Val Thr Leu Ser Arg Thr Asn Met Ser Gln Ser Gly Asp Leu Phe

755 760 765

Ile Asp Arg Val Glu Leu Val Pro Ala

770 775

<210> 3

<211> 527

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Bacillus sp. из образца окружающей среды

<400> 3

Met Ala Val Asn Gly Thr Gln Leu Ala Ser Thr Val Thr Thr Val Ser

1 5 10 15

Asn Asp Ile Val Gln Thr Arg Thr Met Val Gln Gly Leu Phe Ser Ala

20 25 30

Asp Asn Pro Thr Gln Leu Ala Pro Gly Val Thr Asp Tyr Trp Ile Asp

35 40 45

Tyr Val His Gln Gln Val Gln Ser Leu Pro Asn Ala Leu Ala Ser Glu

50 55 60

Lys Arg Glu Leu Asn Thr Arg Val Asn Gln Ala Lys Arg Leu Ser Lys

65 70 75 80

Ser Gln Asn Val Leu Gln Ser Asp Ser Met Gly Gly Ala Gly Trp Lys

85 90 95

Leu Gly Arg Lys Val Phe Ile Ser Pro Gly Asp Leu Gln Tyr Lys Gly

100 105 110

Pro Gln Leu Val Leu Pro Pro Ser Ser Leu Val Tyr Pro Ser Tyr Ala

115 120 125

Tyr Gln Thr Val Pro Glu Ser Ala Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Tyr

130 135 140

Leu Ser Val Phe Val Leu Gln Ala Asp Ser Leu His Ile Ile Ser Ser

145 150 155 160

Arg Tyr Gly Asn Ala Ile Ser His Val Val Asn Val Gly Tyr Ser Thr

165 170 175

Ser Met Pro Thr Ser Pro Asp Gly Val Leu Asn Ser Pro His Phe Phe

180 185 190

Gln Tyr Pro Ile Asp Val Gly Ala Val His Pro Asp Ala Asn Leu Gly

195 200 205

Ile Thr Val Gly Phe Thr Val Pro Thr Asn Gly Phe Ala Lys Ile Ser

210 215 220

Gln Val Ser Leu Thr Glu Ala Arg Pro Leu Thr Ala Ala Glu Val Arg

225 230 235 240

Arg Val Gln Asn Gln Asp Glu Gln Trp Phe Gln Pro Tyr Leu Arg Gln

245 250 255

Gln Ala Glu Ile Gln Thr Ser Leu Gln Val Ala Thr Asn Gln Leu Asn

260 265 270

Ala Ile Tyr Asn Ser Thr Asn Trp Ser Gly Ala Ile Gly Pro Asn Val

275 280 285

Thr Tyr Thr Asp Leu Ala Asn Val Thr Val Leu Glu Pro Thr Pro Ser

290 295 300

Gln Pro Arg Leu Ser Thr Asp Leu Pro Ile Gln Asp Pro Asp Ala Gln

305 310 315 320

Gln Lys Ala Ala Ile Phe Gln Ala Thr Gln Arg Ala Trp Met Gln Leu

325 330 335

Gln Ala Arg Asn Ile Val Pro Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly Gly Gln

340 345 350

Asn Trp Asn Val Glu Gly Thr Val Ser Phe Pro Gln Glu Asn Asn Lys

355 360 365

Pro Val Leu Thr Leu Ser Asp Trp Asp Ala Thr Val Ser Gln Met Ile

370 375 380

Ser Leu Pro Val His Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Arg Val Arg Val Arg

385 390 395 400

Ala Lys Gly Lys Gly Thr Ile Ser Ile Val Pro Pro Gly Asp Ala Lys

405 410 415

Arg Met Leu Phe Phe Asn Ser Pro Ser Phe Phe Ala Ile Gln Glu Phe

420 425 430

Tyr Phe Tyr Pro Asp Thr Ser Met Ser Gln Val Asn Leu Ile Ile Gln

435 440 445

Ser Glu Gly Ser Glu Phe Thr Val Asp Trp Val Glu Met Gln Glu Met

450 455 460

Lys Phe Thr Glu Glu Pro Leu Gly Val Asn Gly Gly Asn Ala Ala His

465 470 475 480

Thr Val Gly Ile Thr Lys Pro Val Gly His Leu Glu Ala Ser Asn Pro

485 490 495

Pro Met Glu Ser Gln Ser Thr Asn Ser Ser Ser Asn Cys Lys Cys Ser

500 505 510

Gln Ser Ser Ser Gln Ser Asn Ser Gly Cys Arg Cys Ser Gln Ser

515 520 525

<210> 4

<211> 660

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Bacillus sp. из образца окружающей среды

<400> 4

Met Asp Pro Asn Ala Lys Tyr Glu Ile Thr Asn Thr Lys Tyr Asn Leu

1 5 10 15

Ser His Thr Gly Asn Arg Tyr Ser Arg Phe Pro Leu Asp Asn Thr Gln

20 25 30

Tyr Lys Lys Leu Gln Asn Met Lys Tyr Glu Asn Met Ser Thr Ala Tyr

35 40 45

Gln Lys Asn Gly Asp Tyr Ala Lys Leu Pro Ile Ile Thr Ala Val Asp

50 55 60

Trp Ser Thr Ala Ser Ser Ala Leu Ile Leu Val Ala Gly Thr Leu Ile

65 70 75 80

Ser Ile Gly Ser Val Gly Val Gly Ala Ala Val Thr Thr Ile Gly Thr

85 90 95

Met Leu Pro Leu Phe Trp Ser Asp Leu Phe Gly Thr Pro Gly Glu Asn

100 105 110

Thr Trp Gln Asn Leu Ile Met Gln Gly Asn Ala Val Tyr Pro Val Gln

115 120 125

Asp Phe Thr Pro Tyr Phe Leu Gln Ser Leu Asn Asn Glu Ile Gly Arg

130 135 140

Ser Lys Ala Val Leu Glu Leu Phe Asp Asp Ile Phe Asn Tyr Trp Gln

145 150 155 160

Glu Tyr Asp Thr Pro Arg Ala Arg Glu Glu Val Ala Gln Gln Phe Arg

165 170 175

Asn Thr Asn Thr Thr Ile Val Gly Ser Leu Gly Val Ile Ser Asn Ala

180 185 190

Arg Glu Phe Asp Ile Ile Ser Leu Ala Thr Tyr Ala Ser Leu Ala Leu

195 200 205

Leu His Leu Thr Leu Leu Arg Gln Gly Val Lys Tyr Ala Asp Lys Trp

210 215 220

Gly Leu Ala Arg Glu Glu Gly Ala Tyr Tyr Lys Asn Leu Leu Lys Asp

225 230 235 240

Arg Ile Ala Thr Tyr Thr Asn Tyr Cys Gln Ser Arg Tyr Arg Ala Gly

245 250 255

Leu Asp Arg Leu Arg Thr Gly Thr Phe Tyr Gly Ala Trp Val Ser Phe

260 265 270

Asn Thr Tyr Arg Arg Glu Tyr Thr Ile Ser Val Leu Asn Ile Ile Ala

275 280 285

Met Phe Ser Thr Phe Asp Pro Asp Arg Tyr Pro Ser Asn Tyr Thr Thr

290 295 300

Asn Thr Gln Leu Thr Glu Lys Ile His Val Pro Thr Arg Asn Ser Ser

305 310 315 320

Glu Thr Phe Tyr Asn Gly Phe Pro Asp Leu Ser Asn Thr Glu Ala Lys

325 330 335

Leu Val Pro Thr Leu Ser Leu Phe Lys Ser Leu Ser Arg Leu Asp Phe

340 345 350

Tyr Ser Ser Tyr Thr Asn Gly Ile Tyr Phe Leu Asn Gly Ile Lys Asn

355 360 365

His Tyr Thr Tyr Ile Asp Gly Thr Asn Ala Gly Ser Leu Asn Ile Ile

370 375 380

Gly Asp Glu Arg His Ile Thr Tyr Leu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro

385 390 395 400

Leu Val His Gln Cys Glu Tyr Asp Gln Ile Leu Thr Ala Val Ile Asn

405 410 415

Thr Pro Asn Tyr Gly Ile Ser Arg Leu Ala Phe Thr Ser Arg Asn Leu

420 425 430

Pro Pro Tyr Asp Val Tyr Ser Ala Asp Asn Gly Ile Gln Pro Val Arg

435 440 445

Thr Ala Lys Val Leu Pro Ile Gln Pro Ser Ser Leu Pro Pro Ser Ile

450 455 460

Pro Pro Ser Leu Arg Pro Tyr Met Val Pro Ile Asn Tyr Gln Leu Ser

465 470 475 480

Asp Ile Thr Ala Ile Asn Thr Gly Pro Phe Asn Pro Asp Ile Leu Tyr

485 490 495

Asn Phe Ser Trp Met Val Ala Ser Asp Asn Asn Val Ile Gln Gly Gly

500 505 510

Asn His Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Ile Leu Gln Asn

515 520 525

Gly Ala Lys Val Arg Glu Gly Pro Gly His Thr Gly Gly Pro Ile Val

530 535 540

Glu Phe Gly Pro His Thr Pro Ala Asn Pro Pro Ala Leu Lys Ile Arg

545 550 555 560

Cys Gln Val Ser Pro Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Leu Asn Met Arg Ile

565 570 575

Arg Tyr Ala Ser Asn Ser Thr Ile Ala Thr Asn Leu Asp Phe Ile Ile

580 585 590

Gly Gly Glu Val Arg Asn Ser Met Ala Phe Pro Gly Thr Asn Ala Asp

595 600 605

Ile Thr Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Asn Asn Phe Asn Thr Val Glu Phe

610 615 620

Gln Ile Ile Asn Pro Lys Asn Val Gly Phe Met Asp Val Ser Ile Thr

625 630 635 640

Lys Ala Ser Asn Ile Asn Gly Thr Phe Leu Ile Asp Lys Ile Glu Phe

645 650 655

Tyr Val Arg Ser

660

<210> 5

<211> 659

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 5

Met Asp Pro Asn Ala Lys Tyr Glu Ile Thr Asn Thr Lys Tyr Asn Leu

1 5 10 15

Ser His Thr Gly Asn Arg Tyr Ser Arg Phe Pro Leu Asp Asn Thr Gln

20 25 30

Tyr Lys Lys Leu Gln Asn Met Lys Tyr Glu Asn Met Ser Thr Ala Tyr

35 40 45

Gln Lys Asn Gly Asp Tyr Ala Lys Leu Pro Ile Ile Thr Ala Val Asp

50 55 60

Trp Ser Thr Ala Ser Ser Ala Leu Ile Leu Val Ala Gly Thr Leu Ile

65 70 75 80

Ser Ile Gly Ser Val Gly Val Gly Ala Ala Val Thr Thr Ile Gly Thr

85 90 95

Met Leu Pro Leu Phe Trp Ser Asp Leu Phe Gly Thr Pro Gly Glu Asn

100 105 110

Thr Trp Gln Asn Leu Ile Met Gln Gly Asn Ala Val Tyr Pro Val Gln

115 120 125

Asp Phe Thr Pro Tyr Phe Leu Gln Ser Leu Asn Asn Glu Ile Gly Arg

130 135 140

Ser Lys Ala Val Leu Glu Leu Phe Asp Asp Ile Phe Asn Tyr Trp Gln

145 150 155 160

Glu Tyr Asp Thr Pro Arg Ala Arg Glu Glu Val Ala Gln Gln Phe Arg

165 170 175

Asn Thr Asn Thr Thr Ile Val Gly Ser Leu Gly Val Ile Ser Asn Ala

180 185 190

Arg Glu Phe Asp Ile Ile Ser Leu Ala Thr Tyr Ala Ser Leu Ala Leu

195 200 205

Leu His Leu Thr Leu Leu Arg Gln Gly Val Lys Tyr Ala Asp Lys Trp

210 215 220

Gly Leu Ala Arg Glu Glu Gly Ala Tyr Tyr Lys Asn Leu Leu Lys Asp

225 230 235 240

Arg Ile Ala Thr Tyr Thr Asn Tyr Cys Gln Ser Arg Tyr Arg Ala Gly

245 250 255

Leu Asp Arg Leu Arg Thr Gly Thr Phe Tyr Gly Ala Trp Val Ser Phe

260 265 270

Asn Thr Tyr Arg Arg Glu Tyr Thr Ile Ser Val Leu Asn Ile Ile Ala

275 280 285

Met Phe Ser Thr Phe Asp Pro Asp Arg Tyr Pro Ser Asn Tyr Thr Thr

290 295 300

Asn Thr Gln Leu Thr Glu Lys Ile His Val Pro Thr Arg Asn Ser Ser

305 310 315 320

Glu Thr Phe Tyr Asn Gly Phe Pro Asp Leu Ser Asn Thr Glu Ala Lys

325 330 335

Leu Val Pro Thr Leu Ser Leu Phe Lys Ser Leu Ser Arg Leu Asp Phe

340 345 350

Tyr Ser Ser Tyr Thr Asn Gly Ile Tyr Phe Leu Asn Gly Ile Lys Asn

355 360 365

His Tyr Thr Tyr Ile Asp Gly Thr Asn Ala Gly Ser Leu Asn Ile Ile

370 375 380

Gly Asp Glu Arg His Ile Thr Tyr Leu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro

385 390 395 400

Leu Val His Gln Cys Glu Tyr Asp Gln Ile Leu Thr Ala Val Ile Asn

405 410 415

Thr Pro Asn Tyr Gly Ile Ser Arg Leu Ala Phe Thr Ser Arg Asn Leu

420 425 430

Pro Pro Tyr Asp Val Tyr Ser Ala Asp Asn Gly Ile Gln Pro Val Arg

435 440 445

Thr Ala Lys Val Leu Pro Ile Gln Pro Ser Ser Leu Pro Pro Ser Ile

450 455 460

Pro Pro Ser Leu Arg Pro Tyr Met Val Pro Ile Asn Tyr Gln Leu Ser

465 470 475 480

Asp Ile Thr Ala Ile Asn Thr Gly Pro Phe Asn Pro Asp Ile Leu Tyr

485 490 495

Asn Phe Ser Trp Met Val Ala Ser Asp Asn Asn Val Ile Gln Gly Gly

500 505 510

Asn His Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Ile Leu Gln Asn

515 520 525

Gly Ala Lys Val Arg Glu Gly Pro Gly His Thr Gly Gly Pro Ile Val

530 535 540

Glu Phe Gly Pro His Thr Pro Ala Asn Pro Pro Ala Leu Lys Ile Arg

545 550 555 560

Cys Gln Val Ser Pro Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Leu Asn Met Arg Ile

565 570 575

Arg Tyr Ala Ser Asn Ser Thr Ile Ala Thr Asn Leu Asp Phe Ile Ile

580 585 590

Gly Gly Glu Val Arg Asn Ser Met Ala Phe Pro Gly Thr Asn Ala Asp

595 600 605

Ile Thr Lys Ile Asp Ile Pro Tyr Asn Asn Phe Asn Thr Val Glu Phe

610 615 620

Gln Ile Ile Asn Pro Lys Asn Val Gly Phe Met Asp Val Ser Ile Thr

625 630 635 640

Lys Ala Ser Asn Ile Asn Gly Thr Phe Leu Ile Asp Lys Ile Glu Phe

645 650 655

Tyr Val Arg

<210> 6

<211> 632

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Неизвестный организм из образца окружающей среды

<400> 6

Leu Asn Ser Lys Ser Ile Ile Glu Asn Glu Val Gln Glu Asn Gln Tyr

1 5 10 15

Ile Asp Ile Arg Asn Ile Cys Ser Ile Asn Gly Ser Ala Lys Phe Asp

20 25 30

Pro Asn Thr Asn Ile Thr Thr Leu Thr Glu Ala Ile Asn Ser Gln Ala

35 40 45

Gly Ala Ile Ala Gly Lys Thr Ala Leu Asp Met Arg Arg Asp Phe Thr

50 55 60

Leu Val Ala Asp Ile Tyr Leu Gly Ser Lys Ser Ser Gly Ala Asp Gly

65 70 75 80

Ile Ala Ile Ala Phe His Arg Gly Ser Ile Gly Phe Ile Gly Thr Met

85 90 95

Gly Gly Gly Leu Gly Ile Leu Gly Ala Pro Asn Gly Ile Gly Phe Glu

100 105 110

Ile Asp Thr Tyr Trp Lys Ala Ser Ser Asp Glu Thr Gly Asp Ser Phe

115 120 125

Gly His Gly Gln Met Asn Gly Pro His Ala Gly Phe Val Ser Thr Asn

130 135 140

Arg Asn Ala Ser Tyr Leu Thr Ala Leu Ala Pro Met Gln Arg Ile Pro

145 150 155 160

Ala Pro Asn Asp Lys Trp Arg Val Leu Thr Ile Asn Trp Asp Ala Arg

165 170 175

Asn Asn Lys Leu Thr Ala Ser Leu Gln Glu Lys Asn Asn Asp Ala Ser

180 185 190

Thr Arg Ser Ala Thr Pro Arg Tyr Gln Ala Trp Glu Leu Leu Asn Pro

195 200 205

Ala Phe Asp Leu Asn Gln Lys Tyr Thr Phe Val Ile Gly Ser Ala Thr

210 215 220

Gly Ala Ala Asn Asn Lys His Gln Ile Gly Val Thr Leu Phe Glu Ala

225 230 235 240

Tyr Phe Thr Lys Pro Thr Ile Val Ala Asn Pro Val Asp Ile Glu Ile

245 250 255

Gly Thr Ala Phe Asp Pro Leu Asn Tyr Glu Pro Ile Gly Leu Lys Ala

260 265 270

Thr Asp Glu Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys Asp Ile Thr Val Glu Phe

275 280 285

Asn Asp Val Asp Thr Ser Lys Pro Gly Ala Tyr Arg Val Thr Tyr Lys

290 295 300

Val Val Asn Ser Tyr Gly Glu Ser Asp Glu Lys Thr Ile Glu Val Val

305 310 315 320

Val Tyr Thr Lys Pro Thr Ile Thr Ala His Asp Val Ala Ile Lys Lys

325 330 335

Gly Leu Ala Phe Asp Pro Leu Asn Tyr Glu Pro Ile Gly Leu Lys Ala

340 345 350

Thr Asp Pro Ile Asp Gly Asp Ile Thr Asp Lys Ile Thr Val Lys Phe

355 360 365

Asn Asn Val Asp Thr Ser Lys Pro Gly Lys Tyr His Val Thr Tyr Lys

370 375 380

Val Ile Asn Ser Tyr Glu Lys Ile Asp Glu Lys Thr Ile Glu Ile Thr

385 390 395 400

Val Tyr Thr Lys Pro Thr Ile Val Ala Gln Asp Val Lys Ile Lys Lys

405 410 415

Asp Thr Ala Phe Asp Pro Leu Asn Tyr Glu Pro Ile Gly Leu Lys Ala

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Asp Gly Asp Ile Thr Asp Lys Ile Thr Val Glu Phe

435 440 445

Asn Asp Val Asp Thr Ser Lys Pro Gly Ala Tyr Ser Val Lys Tyr Lys

450 455 460

Val Val Asn Asn Tyr Glu Glu Ser Asp Glu Lys Thr Ile Ala Val Thr

465 470 475 480

Val Pro Val Ile Asp Asp Gly Trp Glu Asn Gly Asp Pro Thr Gly Trp

485 490 495

Lys Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ile Thr Leu Glu Glu Asp Glu Glu Asn

500 505 510

Ala Leu Asn Gly Lys Trp Val Phe Tyr Ala Asp Lys His Val Ala Ile

515 520 525

Tyr Lys Gln Val Glu Leu Lys Asn Asn Thr Pro Tyr Gln Ile Thr Val

530 535 540

Tyr Val Lys Pro Glu Asp Glu Glu Thr Val Ala His His Ile Val Lys

545 550 555 560

Val Ser Phe Lys Ser Asp Ser Ala Gly Gln Glu Ser Glu Glu Ile Ile

565 570 575

Asn Glu Arg Leu Ile Asp Ala Glu Gln Ile Gln Lys Gly Tyr Arg Lys

580 585 590

Leu Thr Ser Ile Pro Phe Thr Pro Thr Thr Ile Val Pro Asn Lys Lys

595 600 605

Pro Val Ile Ile Val Glu Asn Phe Leu Pro Gly Trp Ile Gly Gly Val

610 615 620

Arg Ile Ile Val Glu Pro Thr Lys

625 630

<210> 7

<211> 632

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 7

Met Asn Ser Lys Ser Ile Ile Glu Asn Glu Val Gln Glu Asn Gln Tyr

1 5 10 15

Ile Asp Ile Arg Asn Ile Cys Ser Ile Asn Gly Ser Ala Lys Phe Asp

20 25 30

Pro Asn Thr Asn Ile Thr Thr Leu Thr Glu Ala Ile Asn Ser Gln Ala

35 40 45

Gly Ala Ile Ala Gly Lys Thr Ala Leu Asp Met Arg Arg Asp Phe Thr

50 55 60

Leu Val Ala Asp Ile Tyr Leu Gly Ser Lys Ser Ser Gly Ala Asp Gly

65 70 75 80

Ile Ala Ile Ala Phe His Arg Gly Ser Ile Gly Phe Ile Gly Thr Met

85 90 95

Gly Gly Gly Leu Gly Ile Leu Gly Ala Pro Asn Gly Ile Gly Phe Glu

100 105 110

Ile Asp Thr Tyr Trp Lys Ala Ser Ser Asp Glu Thr Gly Asp Ser Phe

115 120 125

Gly His Gly Gln Met Asn Gly Pro His Ala Gly Phe Val Ser Thr Asn

130 135 140

Arg Asn Ala Ser Tyr Leu Thr Ala Leu Ala Pro Met Gln Arg Ile Pro

145 150 155 160

Ala Pro Asn Asp Lys Trp Arg Val Leu Thr Ile Asn Trp Asp Ala Arg

165 170 175

Asn Asn Lys Leu Thr Ala Ser Leu Gln Glu Lys Asn Asn Asp Ala Ser

180 185 190

Thr Arg Ser Ala Thr Pro Arg Tyr Gln Ala Trp Glu Leu Leu Asn Pro

195 200 205

Ala Phe Asp Leu Asn Gln Lys Tyr Thr Phe Val Ile Gly Ser Ala Thr

210 215 220

Gly Ala Ala Asn Asn Lys His Gln Ile Gly Val Thr Leu Phe Glu Ala

225 230 235 240

Tyr Phe Thr Lys Pro Thr Ile Val Ala Asn Pro Val Asp Ile Glu Ile

245 250 255

Gly Thr Ala Phe Asp Pro Leu Asn Tyr Glu Pro Ile Gly Leu Lys Ala

260 265 270

Thr Asp Glu Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys Asp Ile Thr Val Glu Phe

275 280 285

Asn Asp Val Asp Thr Ser Lys Pro Gly Ala Tyr Arg Val Thr Tyr Lys

290 295 300

Val Val Asn Ser Tyr Gly Glu Ser Asp Glu Lys Thr Ile Glu Val Val

305 310 315 320

Val Tyr Thr Lys Pro Thr Ile Thr Ala His Asp Val Ala Ile Lys Lys

325 330 335

Gly Leu Ala Phe Asp Pro Leu Asn Tyr Glu Pro Ile Gly Leu Lys Ala

340 345 350

Thr Asp Pro Ile Asp Gly Asp Ile Thr Asp Lys Ile Thr Val Lys Phe

355 360 365

Asn Asn Val Asp Thr Ser Lys Pro Gly Lys Tyr His Val Thr Tyr Lys

370 375 380

Val Ile Asn Ser Tyr Glu Lys Ile Asp Glu Lys Thr Ile Glu Ile Thr

385 390 395 400

Val Tyr Thr Lys Pro Thr Ile Val Ala Gln Asp Val Lys Ile Lys Lys

405 410 415

Asp Thr Ala Phe Asp Pro Leu Asn Tyr Glu Pro Ile Gly Leu Lys Ala

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Asp Gly Asp Ile Thr Asp Lys Ile Thr Val Glu Phe

435 440 445

Asn Asp Val Asp Thr Ser Lys Pro Gly Ala Tyr Ser Val Lys Tyr Lys

450 455 460

Val Val Asn Asn Tyr Glu Glu Ser Asp Glu Lys Thr Ile Ala Val Thr

465 470 475 480

Val Pro Val Ile Asp Asp Gly Trp Glu Asn Gly Asp Pro Thr Gly Trp

485 490 495

Lys Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ile Thr Leu Glu Glu Asp Glu Glu Asn

500 505 510

Ala Leu Asn Gly Lys Trp Val Phe Tyr Ala Asp Lys His Val Ala Ile

515 520 525

Tyr Lys Gln Val Glu Leu Lys Asn Asn Thr Pro Tyr Gln Ile Thr Val

530 535 540

Tyr Val Lys Pro Glu Asp Glu Glu Thr Val Ala His His Ile Val Lys

545 550 555 560

Val Ser Phe Lys Ser Asp Ser Ala Gly Gln Glu Ser Glu Glu Ile Ile

565 570 575

Asn Glu Arg Leu Ile Asp Ala Glu Gln Ile Gln Lys Gly Tyr Arg Lys

580 585 590

Leu Thr Ser Ile Pro Phe Thr Pro Thr Thr Ile Val Pro Asn Lys Lys

595 600 605

Pro Val Ile Ile Val Glu Asn Phe Leu Pro Gly Trp Ile Gly Gly Val

610 615 620

Arg Ile Ile Val Glu Pro Thr Lys

625 630

<210> 8

<211> 319

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Lysinibacillus sp., полученный из образца окружающей среды

<400> 8

Met Lys Asn Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Val Thr Ser Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Phe Ser Asn Asn Ala Ser Ala Ser Glu Asn Gln Gly

20 25 30

Leu Thr Gly Asn Asn Ile Gly Val Val Ser Ser Asn Ile Lys Ala Ala

35 40 45

Glu Gln Ser Gln Asn Lys Asn Ser Ala Tyr Gln Asp Ile Asp Glu Arg

50 55 60

Val Lys Lys Met Leu Ile Ser Ala Ala Phe Asp Gly Thr Glu Tyr Arg

65 70 75 80

Tyr His His Ile Lys Asp Thr Glu Leu Asn Gly Asn Ile Ile Glu Gly

85 90 95

Ser Met Ile Glu Asn Ala Gln Ile Leu Thr Ile Gly Glu Asn Ile Leu

100 105 110

Glu Asn Asn Leu Gly His Glu Val Thr Leu Phe Thr Ser Gly Tyr Glu

115 120 125

His Glu Phe Lys Glu Met Thr Ser Thr Thr Asn Thr Ser Gly Trp Thr

130 135 140

Phe Gly Tyr Asn Tyr Asn Ala Thr Leu Ser Val Met Met Val Ser Ala

145 150 155 160

Ser Gln Ser Phe Ser Val Asp Tyr Asn Met Ser Thr Ser Asn Thr Thr

165 170 175

Glu Lys Ser Gln Val Arg Lys Phe Thr Val Pro Pro Gln Gly Phe Pro

180 185 190

Val Pro Ala Gly Lys Lys Tyr Lys Val Glu Tyr Val Phe Glu Lys Ile

195 200 205

Thr Ile Ser Gly Arg Asn Arg Leu Asn Ala Asp Leu Tyr Gly Asp Ala

210 215 220

Thr Tyr Tyr Tyr Asn Asn Leu Pro Met Ser Pro Gln Leu Leu Tyr Ser

225 230 235 240

Ala Met Asn Phe Ala Ser Asp Thr Gln Gly Phe Glu Arg Val Ile Arg

245 250 255

Asp Asn Ala Glu Gly Asn Asp Arg Phe Gly Ile Arg Ala Thr Gly Glu

260 265 270

Gly Arg Phe Ser Thr Glu Phe Gly Thr Arg Leu Tyr Ala Lys Ile Thr

275 280 285

Asp Ile Thr Asp Ser Lys Lys Pro Val Thr Ile Glu Thr Lys Lys Ile

290 295 300

Pro Val Asn Phe Glu Thr Leu Ser Val Ala Thr Lys Ile Ile Glu

305 310 315

<210> 9

<211> 293

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 9

Met Ser Glu Asn Gln Gly Leu Thr Gly Asn Asn Ile Gly Val Val Ser

1 5 10 15

Ser Asn Ile Lys Ala Ala Glu Gln Ser Gln Asn Lys Asn Ser Ala Tyr

20 25 30

Gln Asp Ile Asp Glu Arg Val Lys Lys Met Leu Ile Ser Ala Ala Phe

35 40 45

Asp Gly Thr Glu Tyr Arg Tyr His His Ile Lys Asp Thr Glu Leu Asn

50 55 60

Gly Asn Ile Ile Glu Gly Ser Met Ile Glu Asn Ala Gln Ile Leu Thr

65 70 75 80

Ile Gly Glu Asn Ile Leu Glu Asn Asn Leu Gly His Glu Val Thr Leu

85 90 95

Phe Thr Ser Gly Tyr Glu His Glu Phe Lys Glu Met Thr Ser Thr Thr

100 105 110

Asn Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Tyr Asn Tyr Asn Ala Thr Leu Ser

115 120 125

Val Met Met Val Ser Ala Ser Gln Ser Phe Ser Val Asp Tyr Asn Met

130 135 140

Ser Thr Ser Asn Thr Thr Glu Lys Ser Gln Val Arg Lys Phe Thr Val

145 150 155 160

Pro Pro Gln Gly Phe Pro Val Pro Ala Gly Lys Lys Tyr Lys Val Glu

165 170 175

Tyr Val Phe Glu Lys Ile Thr Ile Ser Gly Arg Asn Arg Leu Asn Ala

180 185 190

Asp Leu Tyr Gly Asp Ala Thr Tyr Tyr Tyr Asn Asn Leu Pro Met Ser

195 200 205

Pro Gln Leu Leu Tyr Ser Ala Met Asn Phe Ala Ser Asp Thr Gln Gly

210 215 220

Phe Glu Arg Val Ile Arg Asp Asn Ala Glu Gly Asn Asp Arg Phe Gly

225 230 235 240

Ile Arg Ala Thr Gly Glu Gly Arg Phe Ser Thr Glu Phe Gly Thr Arg

245 250 255

Leu Tyr Ala Lys Ile Thr Asp Ile Thr Asp Ser Lys Lys Pro Val Thr

260 265 270

Ile Glu Thr Lys Lys Ile Pro Val Asn Phe Glu Thr Leu Ser Val Ala

275 280 285

Thr Lys Ile Ile Glu

290

<210> 10

<211> 803

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Bacillus sp. из образца окружающей среды

<400> 10

Met Asp Lys Lys Gln Lys Lys Ile Leu Ser Met Thr Leu Ala Leu Gly

1 5 10 15

Val Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Pro Ile Thr Ser Thr Ala Leu Ala Glu

20 25 30

Thr Glu Lys Glu Ser Ile Lys Lys Ser Ser Ala Lys Thr Ser Pro Gln

35 40 45

Met Asp Ser Arg Ala Trp Ile Asn Asn Pro Tyr Gln Gly Val Ser Met

50 55 60

Gly Gln Phe Leu Asn Ala Phe Asn Gly Asn Gln Trp Lys Pro Leu Leu

65 70 75 80

Glu Gln Ile His Asn Lys Gly Asp Ala Gly Ser Gly Thr Ile Ala Phe

85 90 95

Leu Lys Gly Met Met Thr Thr Gly Leu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Gly

100 105 110

Ser Leu Leu Ala Ser Val Trp Asp Ile Phe Ile Pro Gly Thr Gly Val

115 120 125

Lys Asp Asp Met Trp Leu Gln Ile Glu Lys Tyr Val Asp Glu Lys Ile

130 135 140

Asp Ser Lys Ile Asn Asp Tyr His Lys Tyr Leu Met Gly Ala Gln Phe

145 150 155 160

Asn Gly Ala Met Glu Lys Val Lys Glu Tyr Gln Arg Val Leu Gln Ile

165 170 175

Tyr Asn Asn Ser Lys Val Ser Val Lys Val Glu Glu Pro Glu Ala Pro

180 185 190

Val Arg Asp Ala Val Arg Lys Ala Asp Ser Glu Leu Ala Ser Tyr Ile

195 200 205

Ala Val Ile Gln Thr Pro Glu Lys Glu Thr Asp Ser Val Tyr Gln Gln

210 215 220

Ile Thr Ala Pro Ile Phe Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Leu Val

225 230 235 240

Leu Arg Asp Ile Ile Gln Phe Gly Glu Glu Trp Gly Ile Asp Lys Asp

245 250 255

Gln Leu Lys Gly Tyr Lys Asp Lys Gln Glu Lys Leu Ile Glu Asn Tyr

260 265 270

Thr Asp Tyr Ser Ile Lys Val Tyr Asn Asp Gly Leu Glu Lys Arg Ile

275 280 285

Asn Glu Ala Asp Lys Ile Phe Gly Pro Glu Asp Gly Tyr Gly Asn Pro

290 295 300

Ala Lys Pro Gly Pro Glu Glu Ala Tyr Thr Asn Thr His Arg Trp Asn

305 310 315 320

Tyr Ile Asn Glu Tyr Ile Arg Glu Tyr Thr Leu Ser Val Leu Asp Phe

325 330 335

Val Ala Leu Phe Pro Ser Thr Asn Pro Asn Ile Tyr Ser Arg Gly Ala

340 345 350

Met Gln Lys Asn Ser Arg Gln Ile Tyr Ser Ser Ile Ser Gly Thr Val

355 360 365

Thr Pro Asn Thr Gln Thr Trp Lys Asp Ile Asn Asn Arg Leu Ala Ser

370 375 380

Gln Glu Tyr Lys Gly Glu Leu Val Ala Ala Glu Val Gln Ser Tyr Ala

385 390 395 400

Arg Ile Asp Ala Leu Ala Pro Trp Phe Asp Arg Asn Ser Gly Thr Thr

405 410 415

Tyr Asn Thr Gly Trp Val Gly Asn Thr Ser Gly Gly Ile Leu Arg Lys

420 425 430

Ile Thr Ile Asp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr Lys Val Asn Ile Gly Asp

435 440 445

Gln Arg Thr Pro Phe Tyr Phe Gln Leu Thr His Glu Asn Gly Ser Ala

450 455 460

Ile Pro Gln Phe Gly Gln Asp Asp Pro Arg Leu Lys Lys Arg Thr Phe

465 470 475 480

Glu Phe Pro Asn Gln Lys Ile Ser Asp Ile Gln Ala Phe Gly Lys Ser

485 490 495

Thr Ala Pro Gly Leu Asp Gly Ile Asp Ala Val Val Phe Gly Phe Thr

500 505 510

Asp Arg Asn Leu Asp Ser Lys His Asp Leu Met Arg Asn Met Ile Ser

515 520 525

Ser Ile Pro Ala Glu Met Tyr Gln Gly Lys Ser Asn Phe Lys Pro Gln

530 535 540

Met Glu Pro Ile Asn Ala Gln Gln Lys Ala Met Lys Thr Asp Thr Thr

545 550 555 560

Asn Ser Tyr Leu Thr Tyr Lys Val Asn Ser Tyr Lys Ala Gln Glu Tyr

565 570 575

Lys Ile Arg Tyr Arg Val Ala Ala Asn Glu Asn Ser Lys Ile Ser Ile

580 585 590

Ser Gln Lys Ser Gly Thr Asn Phe Glu Lys Ile Gly Asp Thr Asn Ile

595 600 605

Ser Lys Thr Val Asn Ala Glu Asp Thr Val Lys Gly Glu Tyr Gly Tyr

610 615 620

Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Pro Thr Val Lys Leu Asn Tyr Gly Gln Asn

625 630 635 640

Glu Leu Lys Leu Glu Asn Thr Gln Gly Lys Phe Ala Ile Asp Arg Ile

645 650 655

Glu Leu Glu Pro Ile Gln Lys Asp Glu Ile Val Phe Glu Asp Asn Phe

660 665 670

Asp Gly Thr Asn Lys Gly Trp Ile Phe Tyr Ser Gly Gly Gly Ile Val

675 680 685

Gly Gly Gly Val Thr Gly Arg Ala Gly Met Ile Pro Ser Gly Thr Asn

690 695 700

Ser Ile Val Tyr Pro Ser Gly Ile Asp Tyr Tyr Ser Lys Tyr Thr Leu

705 710 715 720

Asn Met Lys Val Lys Leu Gln Ser Thr Asp Pro Asn Ile Lys Gln Lys

725 730 735

Val Lys Ile Tyr His Thr Thr Thr Lys Gly Gln Met Val Ser Lys Glu

740 745 750

Val Glu Leu Lys Gly Gly Glu Gly Tyr Lys Glu Leu Lys Leu Glu Phe

755 760 765

Ile Thr Gly Tyr Thr Pro Ser Glu Ser Asn Gln Ile Gly Ile Gln Ser

770 775 780

Ala Val Gly Gly Ser Asn Val Leu Phe Asp Asp Val Lys Leu Thr Gly

785 790 795 800

Ala Lys Arg

<210> 11

<211> 773

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 11

Met Glu Thr Glu Lys Glu Ser Ile Lys Lys Ser Ser Ala Lys Thr Ser

1 5 10 15

Pro Gln Met Asp Ser Arg Ala Trp Ile Asn Asn Pro Tyr Gln Gly Val

20 25 30

Ser Met Gly Gln Phe Leu Asn Ala Phe Asn Gly Asn Gln Trp Lys Pro

35 40 45

Leu Leu Glu Gln Ile His Asn Lys Gly Asp Ala Gly Ser Gly Thr Ile

50 55 60

Ala Phe Leu Lys Gly Met Met Thr Thr Gly Leu Ser Leu Leu Pro Pro

65 70 75 80

Pro Gly Ser Leu Leu Ala Ser Val Trp Asp Ile Phe Ile Pro Gly Thr

85 90 95

Gly Val Lys Asp Asp Met Trp Leu Gln Ile Glu Lys Tyr Val Asp Glu

100 105 110

Lys Ile Asp Ser Lys Ile Asn Asp Tyr His Lys Tyr Leu Met Gly Ala

115 120 125

Gln Phe Asn Gly Ala Met Glu Lys Val Lys Glu Tyr Gln Arg Val Leu

130 135 140

Gln Ile Tyr Asn Asn Ser Lys Val Ser Val Lys Val Glu Glu Pro Glu

145 150 155 160

Ala Pro Val Arg Asp Ala Val Arg Lys Ala Asp Ser Glu Leu Ala Ser

165 170 175

Tyr Ile Ala Val Ile Gln Thr Pro Glu Lys Glu Thr Asp Ser Val Tyr

180 185 190

Gln Gln Ile Thr Ala Pro Ile Phe Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu

195 200 205

Leu Val Leu Arg Asp Ile Ile Gln Phe Gly Glu Glu Trp Gly Ile Asp

210 215 220

Lys Asp Gln Leu Lys Gly Tyr Lys Asp Lys Gln Glu Lys Leu Ile Glu

225 230 235 240

Asn Tyr Thr Asp Tyr Ser Ile Lys Val Tyr Asn Asp Gly Leu Glu Lys

245 250 255

Arg Ile Asn Glu Ala Asp Lys Ile Phe Gly Pro Glu Asp Gly Tyr Gly

260 265 270

Asn Pro Ala Lys Pro Gly Pro Glu Glu Ala Tyr Thr Asn Thr His Arg

275 280 285

Trp Asn Tyr Ile Asn Glu Tyr Ile Arg Glu Tyr Thr Leu Ser Val Leu

290 295 300

Asp Phe Val Ala Leu Phe Pro Ser Thr Asn Pro Asn Ile Tyr Ser Arg

305 310 315 320

Gly Ala Met Gln Lys Asn Ser Arg Gln Ile Tyr Ser Ser Ile Ser Gly

325 330 335

Thr Val Thr Pro Asn Thr Gln Thr Trp Lys Asp Ile Asn Asn Arg Leu

340 345 350

Ala Ser Gln Glu Tyr Lys Gly Glu Leu Val Ala Ala Glu Val Gln Ser

355 360 365

Tyr Ala Arg Ile Asp Ala Leu Ala Pro Trp Phe Asp Arg Asn Ser Gly

370 375 380

Thr Thr Tyr Asn Thr Gly Trp Val Gly Asn Thr Ser Gly Gly Ile Leu

385 390 395 400

Arg Lys Ile Thr Ile Asp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr Lys Val Asn Ile

405 410 415

Gly Asp Gln Arg Thr Pro Phe Tyr Phe Gln Leu Thr His Glu Asn Gly

420 425 430

Ser Ala Ile Pro Gln Phe Gly Gln Asp Asp Pro Arg Leu Lys Lys Arg

435 440 445

Thr Phe Glu Phe Pro Asn Gln Lys Ile Ser Asp Ile Gln Ala Phe Gly

450 455 460

Lys Ser Thr Ala Pro Gly Leu Asp Gly Ile Asp Ala Val Val Phe Gly

465 470 475 480

Phe Thr Asp Arg Asn Leu Asp Ser Lys His Asp Leu Met Arg Asn Met

485 490 495

Ile Ser Ser Ile Pro Ala Glu Met Tyr Gln Gly Lys Ser Asn Phe Lys

500 505 510

Pro Gln Met Glu Pro Ile Asn Ala Gln Gln Lys Ala Met Lys Thr Asp

515 520 525

Thr Thr Asn Ser Tyr Leu Thr Tyr Lys Val Asn Ser Tyr Lys Ala Gln

530 535 540

Glu Tyr Lys Ile Arg Tyr Arg Val Ala Ala Asn Glu Asn Ser Lys Ile

545 550 555 560

Ser Ile Ser Gln Lys Ser Gly Thr Asn Phe Glu Lys Ile Gly Asp Thr

565 570 575

Asn Ile Ser Lys Thr Val Asn Ala Glu Asp Thr Val Lys Gly Glu Tyr

580 585 590

Gly Tyr Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Pro Thr Val Lys Leu Asn Tyr Gly

595 600 605

Gln Asn Glu Leu Lys Leu Glu Asn Thr Gln Gly Lys Phe Ala Ile Asp

610 615 620

Arg Ile Glu Leu Glu Pro Ile Gln Lys Asp Glu Ile Val Phe Glu Asp

625 630 635 640

Asn Phe Asp Gly Thr Asn Lys Gly Trp Ile Phe Tyr Ser Gly Gly Gly

645 650 655

Ile Val Gly Gly Gly Val Thr Gly Arg Ala Gly Met Ile Pro Ser Gly

660 665 670

Thr Asn Ser Ile Val Tyr Pro Ser Gly Ile Asp Tyr Tyr Ser Lys Tyr

675 680 685

Thr Leu Asn Met Lys Val Lys Leu Gln Ser Thr Asp Pro Asn Ile Lys

690 695 700

Gln Lys Val Lys Ile Tyr His Thr Thr Thr Lys Gly Gln Met Val Ser

705 710 715 720

Lys Glu Val Glu Leu Lys Gly Gly Glu Gly Tyr Lys Glu Leu Lys Leu

725 730 735

Glu Phe Ile Thr Gly Tyr Thr Pro Ser Glu Ser Asn Gln Ile Gly Ile

740 745 750

Gln Ser Ala Val Gly Gly Ser Asn Val Leu Phe Asp Asp Val Lys Leu

755 760 765

Thr Gly Ala Lys Arg

770

<210> 12

<211> 661

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 12

Met Asp Lys Lys Gln Lys Lys Ile Leu Ser Met Thr Leu Ala Leu Gly

1 5 10 15

Val Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Pro Ile Thr Ser Thr Ala Leu Ala Glu

20 25 30

Thr Glu Lys Glu Ser Ile Lys Lys Ser Ser Ala Lys Thr Ser Pro Gln

35 40 45

Met Asp Ser Arg Ala Trp Ile Asn Asn Pro Tyr Gln Gly Val Ser Met

50 55 60

Gly Gln Phe Leu Asn Ala Phe Asn Gly Asn Gln Trp Lys Pro Leu Leu

65 70 75 80

Glu Gln Ile His Asn Lys Gly Asp Ala Gly Ser Gly Thr Ile Ala Phe

85 90 95

Leu Lys Gly Met Met Thr Thr Gly Leu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Gly

100 105 110

Ser Leu Leu Ala Ser Val Trp Asp Ile Phe Ile Pro Gly Thr Gly Val

115 120 125

Lys Asp Asp Met Trp Leu Gln Ile Glu Lys Tyr Val Asp Glu Lys Ile

130 135 140

Asp Ser Lys Ile Asn Asp Tyr His Lys Tyr Leu Met Gly Ala Gln Phe

145 150 155 160

Asn Gly Ala Met Glu Lys Val Lys Glu Tyr Gln Arg Val Leu Gln Ile

165 170 175

Tyr Asn Asn Ser Lys Val Ser Val Lys Val Glu Glu Pro Glu Ala Pro

180 185 190

Val Arg Asp Ala Val Arg Lys Ala Asp Ser Glu Leu Ala Ser Tyr Ile

195 200 205

Ala Val Ile Gln Thr Pro Glu Lys Glu Thr Asp Ser Val Tyr Gln Gln

210 215 220

Ile Thr Ala Pro Ile Phe Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Leu Val

225 230 235 240

Leu Arg Asp Ile Ile Gln Phe Gly Glu Glu Trp Gly Ile Asp Lys Asp

245 250 255

Gln Leu Lys Gly Tyr Lys Asp Lys Gln Glu Lys Leu Ile Glu Asn Tyr

260 265 270

Thr Asp Tyr Ser Ile Lys Val Tyr Asn Asp Gly Leu Glu Lys Arg Ile

275 280 285

Asn Glu Ala Asp Lys Ile Phe Gly Pro Glu Asp Gly Tyr Gly Asn Pro

290 295 300

Ala Lys Pro Gly Pro Glu Glu Ala Tyr Thr Asn Thr His Arg Trp Asn

305 310 315 320

Tyr Ile Asn Glu Tyr Ile Arg Glu Tyr Thr Leu Ser Val Leu Asp Phe

325 330 335

Val Ala Leu Phe Pro Ser Thr Asn Pro Asn Ile Tyr Ser Arg Gly Ala

340 345 350

Met Gln Lys Asn Ser Arg Gln Ile Tyr Ser Ser Ile Ser Gly Thr Val

355 360 365

Thr Pro Asn Thr Gln Thr Trp Lys Asp Ile Asn Asn Arg Leu Ala Ser

370 375 380

Gln Glu Tyr Lys Gly Glu Leu Val Ala Ala Glu Val Gln Ser Tyr Ala

385 390 395 400

Arg Ile Asp Ala Leu Ala Pro Trp Phe Asp Arg Asn Ser Gly Thr Thr

405 410 415

Tyr Asn Thr Gly Trp Val Gly Asn Thr Ser Gly Gly Ile Leu Arg Lys

420 425 430

Ile Thr Ile Asp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr Lys Val Asn Ile Gly Asp

435 440 445

Gln Arg Thr Pro Phe Tyr Phe Gln Leu Thr His Glu Asn Gly Ser Ala

450 455 460

Ile Pro Gln Phe Gly Gln Asp Asp Pro Arg Leu Lys Lys Arg Thr Phe

465 470 475 480

Glu Phe Pro Asn Gln Lys Ile Ser Asp Ile Gln Ala Phe Gly Lys Ser

485 490 495

Thr Ala Pro Gly Leu Asp Gly Ile Asp Ala Val Val Phe Gly Phe Thr

500 505 510

Asp Arg Asn Leu Asp Ser Lys His Asp Leu Met Arg Asn Met Ile Ser

515 520 525

Ser Ile Pro Ala Glu Met Tyr Gln Gly Lys Ser Asn Phe Lys Pro Gln

530 535 540

Met Glu Pro Ile Asn Ala Gln Gln Lys Ala Met Lys Thr Asp Thr Thr

545 550 555 560

Asn Ser Tyr Leu Thr Tyr Lys Val Asn Ser Tyr Lys Ala Gln Glu Tyr

565 570 575

Lys Ile Arg Tyr Arg Val Ala Ala Asn Glu Asn Ser Lys Ile Ser Ile

580 585 590

Ser Gln Lys Ser Gly Thr Asn Phe Glu Lys Ile Gly Asp Thr Asn Ile

595 600 605

Ser Lys Thr Val Asn Ala Glu Asp Thr Val Lys Gly Glu Tyr Gly Tyr

610 615 620

Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Pro Thr Val Lys Leu Asn Tyr Gly Gln Asn

625 630 635 640

Glu Leu Lys Leu Glu Asn Thr Gln Gly Lys Phe Ala Ile Asp Arg Ile

645 650 655

Glu Leu Glu Pro Ile

660

<210> 13

<211> 631

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 13

Met Glu Thr Glu Lys Glu Ser Ile Lys Lys Ser Ser Ala Lys Thr Ser

1 5 10 15

Pro Gln Met Asp Ser Arg Ala Trp Ile Asn Asn Pro Tyr Gln Gly Val

20 25 30

Ser Met Gly Gln Phe Leu Asn Ala Phe Asn Gly Asn Gln Trp Lys Pro

35 40 45

Leu Leu Glu Gln Ile His Asn Lys Gly Asp Ala Gly Ser Gly Thr Ile

50 55 60

Ala Phe Leu Lys Gly Met Met Thr Thr Gly Leu Ser Leu Leu Pro Pro

65 70 75 80

Pro Gly Ser Leu Leu Ala Ser Val Trp Asp Ile Phe Ile Pro Gly Thr

85 90 95

Gly Val Lys Asp Asp Met Trp Leu Gln Ile Glu Lys Tyr Val Asp Glu

100 105 110

Lys Ile Asp Ser Lys Ile Asn Asp Tyr His Lys Tyr Leu Met Gly Ala

115 120 125

Gln Phe Asn Gly Ala Met Glu Lys Val Lys Glu Tyr Gln Arg Val Leu

130 135 140

Gln Ile Tyr Asn Asn Ser Lys Val Ser Val Lys Val Glu Glu Pro Glu

145 150 155 160

Ala Pro Val Arg Asp Ala Val Arg Lys Ala Asp Ser Glu Leu Ala Ser

165 170 175

Tyr Ile Ala Val Ile Gln Thr Pro Glu Lys Glu Thr Asp Ser Val Tyr

180 185 190

Gln Gln Ile Thr Ala Pro Ile Phe Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu

195 200 205

Leu Val Leu Arg Asp Ile Ile Gln Phe Gly Glu Glu Trp Gly Ile Asp

210 215 220

Lys Asp Gln Leu Lys Gly Tyr Lys Asp Lys Gln Glu Lys Leu Ile Glu

225 230 235 240

Asn Tyr Thr Asp Tyr Ser Ile Lys Val Tyr Asn Asp Gly Leu Glu Lys

245 250 255

Arg Ile Asn Glu Ala Asp Lys Ile Phe Gly Pro Glu Asp Gly Tyr Gly

260 265 270

Asn Pro Ala Lys Pro Gly Pro Glu Glu Ala Tyr Thr Asn Thr His Arg

275 280 285

Trp Asn Tyr Ile Asn Glu Tyr Ile Arg Glu Tyr Thr Leu Ser Val Leu

290 295 300

Asp Phe Val Ala Leu Phe Pro Ser Thr Asn Pro Asn Ile Tyr Ser Arg

305 310 315 320

Gly Ala Met Gln Lys Asn Ser Arg Gln Ile Tyr Ser Ser Ile Ser Gly

325 330 335

Thr Val Thr Pro Asn Thr Gln Thr Trp Lys Asp Ile Asn Asn Arg Leu

340 345 350

Ala Ser Gln Glu Tyr Lys Gly Glu Leu Val Ala Ala Glu Val Gln Ser

355 360 365

Tyr Ala Arg Ile Asp Ala Leu Ala Pro Trp Phe Asp Arg Asn Ser Gly

370 375 380

Thr Thr Tyr Asn Thr Gly Trp Val Gly Asn Thr Ser Gly Gly Ile Leu

385 390 395 400

Arg Lys Ile Thr Ile Asp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr Lys Val Asn Ile

405 410 415

Gly Asp Gln Arg Thr Pro Phe Tyr Phe Gln Leu Thr His Glu Asn Gly

420 425 430

Ser Ala Ile Pro Gln Phe Gly Gln Asp Asp Pro Arg Leu Lys Lys Arg

435 440 445

Thr Phe Glu Phe Pro Asn Gln Lys Ile Ser Asp Ile Gln Ala Phe Gly

450 455 460

Lys Ser Thr Ala Pro Gly Leu Asp Gly Ile Asp Ala Val Val Phe Gly

465 470 475 480

Phe Thr Asp Arg Asn Leu Asp Ser Lys His Asp Leu Met Arg Asn Met

485 490 495

Ile Ser Ser Ile Pro Ala Glu Met Tyr Gln Gly Lys Ser Asn Phe Lys

500 505 510

Pro Gln Met Glu Pro Ile Asn Ala Gln Gln Lys Ala Met Lys Thr Asp

515 520 525

Thr Thr Asn Ser Tyr Leu Thr Tyr Lys Val Asn Ser Tyr Lys Ala Gln

530 535 540

Glu Tyr Lys Ile Arg Tyr Arg Val Ala Ala Asn Glu Asn Ser Lys Ile

545 550 555 560

Ser Ile Ser Gln Lys Ser Gly Thr Asn Phe Glu Lys Ile Gly Asp Thr

565 570 575

Asn Ile Ser Lys Thr Val Asn Ala Glu Asp Thr Val Lys Gly Glu Tyr

580 585 590

Gly Tyr Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Pro Thr Val Lys Leu Asn Tyr Gly

595 600 605

Gln Asn Glu Leu Lys Leu Glu Asn Thr Gln Gly Lys Phe Ala Ile Asp

610 615 620

Arg Ile Glu Leu Glu Pro Ile

625 630

<210> 14

<211> 831

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Bacillus sp., полученный из образца окружающей среды

<400> 14

Met Ala Gln Leu Arg Glu Leu Gln Thr Gln Ser Ile Ile Pro Tyr Asn

1 5 10 15

Ile Leu Ala Thr Pro Pro Ile Gly Asn Ala Asp Thr Gln Pro Ala Ser

20 25 30

Leu Asp Asp Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Ala Trp Ile Glu Phe Gln

35 40 45

Lys Thr Gly Ser Asp Ala Leu Leu Gln Ser Val Leu Gln Asn Gly Phe

50 55 60

Ser Ala Ala Gly Gly Gly Ser Phe Asn Tyr Leu Ala Val Leu Gln Ala

65 70 75 80

Gly Ile Gly Ile Leu Gly Thr Met Leu Gly Ala Glu Ile Pro Gly Val

85 90 95

Ala Val Ala Ala Pro Ile Leu Ser Met Val Ile Gly Trp Leu Trp Pro

100 105 110

His Lys Thr Gln Asp Asp Thr Gln Gln Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ala

115 120 125

Glu Ile Gln Lys Gln Leu Asn Lys Ala Leu Ser Glu Gln Asp Lys Asn

130 135 140

Asn Trp Thr Gly Tyr Leu Asn Ala Ile Phe Gln Ile Ser Asn Asp Ala

145 150 155 160

Ser Arg Ser Val Val Asp Ala Gln Phe Thr Gly Asn Glu Gly Asp Ala

165 170 175

Thr Arg Gln Pro Arg Thr Pro Gly Val Ser Asp Tyr Glu Asn Val Tyr

180 185 190

Asn His Leu Leu Ala Thr Gln Gly Ser Leu Ile Val Ala Leu Ser Gln

195 200 205

Met Ile Asn Gly Asn Phe Asp Thr Leu Ala Ile Pro Phe Phe Val Ile

210 215 220

Gly Ala Thr Val Gln Leu Ser Thr Tyr Gln Ser Phe Ile Gln Phe Ala

225 230 235 240

Asn Lys Trp Leu Pro Ile Val Tyr Pro Asp Tyr Gln Thr Gln Gly Thr

245 250 255

Ala Gly Tyr Thr Gln Gln Gln Asn Leu Ile Asn Ala Lys Ser Asp Met

260 265 270

Arg Ala Ala Ile Gln Asn His Thr Gln Lys Val Phe Asn Ala Phe Lys

275 280 285

Ala Gly Leu Pro Ser Leu Ser Ser Asp Lys Asn Ser Ile Ser Val Tyr

290 295 300

Asn Gln Tyr Val Arg Gly Leu Val Leu Asn Gly Leu Asp Thr Val Ala

305 310 315 320

Thr Trp Pro Ser Met Tyr Pro Asp Asp Tyr Arg Thr Gln Thr Glu Leu

325 330 335

Glu Gln Thr Arg Val Ile Phe Ser Asp Leu Ile Gly Lys Asp Gln Thr

340 345 350

Ile Ser Asn Asp Val Thr Leu Ile Asn Met Ala Asp Gly Lys Asn Gly

355 360 365

Ser Gly Ala Phe Asn Gln His Ala Thr Ile Asp Leu Asn Ser Ile Phe

370 375 380

Tyr Tyr His Glu Glu Leu Ser Ser Ile Gln Leu Gly Ile His Asp Gly

385 390 395 400

Asn Arg Gly Asn Thr Thr Asn Cys Tyr Asp Tyr Gly Ile Ile Thr Asn

405 410 415

Tyr Pro Asn Tyr Ser Tyr Phe Tyr Gly Asp Leu Tyr Ser Pro Ser Gly

420 425 430

Asp Ala Thr Phe Ser Ala Pro Leu Asn Val Leu Asn Ala Gln Thr Gln

435 440 445

Tyr Ser Ser Gly Tyr Val Asp Ser Glu Phe Ile Tyr Asn Ser Asp Pro

450 455 460

Ser Ala Tyr Gly Ala Gly Cys His Ile Leu Gly Gly Cys Thr Lys Gly

465 470 475 480

Asp Cys Tyr Asn Gln Ser Ser Cys Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Ser Cys

485 490 495

Asn Pro Ser Leu Pro Ser Gln Lys Ile Asn Ala Phe Tyr Pro Phe Lys

500 505 510

Met Asn Leu Ser Arg Ser Gly Thr Ser Asp Lys Leu Gly Leu Met Tyr

515 520 525

Ser Leu Val Pro Leu Asp Leu Asn Pro Asn Asn Thr Phe Gly Glu Leu

530 535 540

Asp Ser Asn Thr Gly Asn Val Ile Gly Lys Gly Phe Pro Ala Glu Lys

545 550 555 560

Gly Thr Leu Ala Ser Gly Asn Val Pro Thr Val Val Arg Glu Trp Val

565 570 575

Asn Gly Ala Asn Ala Val Lys Leu Ser Asp Asp Ala Leu Thr Leu Lys

580 585 590

Met Thr Asn Met Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Ile Arg Val Arg Tyr Ala

595 600 605

Asn Thr Ser Asn Ala Glu Ile Ser Ile Asn Gln Ser Val Ser Ala Gly

610 615 620

Asn Gln Asn Ile Gln Asn Gly Pro Trp Gly Leu Pro Ser Thr Ile Thr

625 630 635 640

Ser Val Val Ser Asp Ala Ser Phe Lys Lys Leu Tyr Ile Ala Gly Gln

645 650 655

Thr Gly Asn Tyr Val Leu Glu Asp Ile Thr Trp Gly Val Asp Gly Gln

660 665 670

Gly Lys Pro Ile Thr Ile Pro Ser Gly Asp Val Thr Val Thr Leu Ser

675 680 685

Arg Thr Asn Met Ser Gln Ser Gly Asp Leu Phe Ile Asp Arg Val Glu

690 695 700

Leu Val Pro Met Ser Leu Gln Thr Tyr Thr Val Asn Tyr Thr Ile Thr

705 710 715 720

Ser Ser Leu Pro Ser Trp Asp Asp Phe Asn His Asp Ala Asn Asp Ile

725 730 735

Asn Ser Phe Pro Thr Val Trp Lys Ala Asp Ala Asn Gln Ser Val Ser

740 745 750

Lys Phe Ile Ala Ser Ala Gln Asp Leu Pro Gln Leu His Ser Val Val

755 760 765

Pro Ile Gly Leu Ser Thr Asn Gly Ser Trp Ser Glu Leu Arg Asp Ala

770 775 780

Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ser Ser Gly Thr Gln Asn Val Ala Tyr Ser

785 790 795 800

Met Gln Asp Gly Ser Ser Phe Thr Glu Leu Lys Leu Gly Ser Ser Glu

805 810 815

Tyr Gln Met Ala Ala Ser Ser Gly Thr Ile Thr Gly Thr Leu Ile

820 825 830

<210> 15

<211> 708

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 15

Met Ala Gln Leu Arg Glu Leu Gln Thr Gln Ser Ile Ile Pro Tyr Asn

1 5 10 15

Ile Leu Ala Thr Pro Pro Ile Gly Asn Ala Asp Thr Gln Pro Ala Ser

20 25 30

Leu Asp Asp Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Ala Trp Ile Glu Phe Gln

35 40 45

Lys Thr Gly Ser Asp Ala Leu Leu Gln Ser Val Leu Gln Asn Gly Phe

50 55 60

Ser Ala Ala Gly Gly Gly Ser Phe Asn Tyr Leu Ala Val Leu Gln Ala

65 70 75 80

Gly Ile Gly Ile Leu Gly Thr Met Leu Gly Ala Glu Ile Pro Gly Val

85 90 95

Ala Val Ala Ala Pro Ile Leu Ser Met Val Ile Gly Trp Leu Trp Pro

100 105 110

His Lys Thr Gln Asp Asp Thr Gln Gln Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ala

115 120 125

Glu Ile Gln Lys Gln Leu Asn Lys Ala Leu Ser Glu Gln Asp Lys Asn

130 135 140

Asn Trp Thr Gly Tyr Leu Asn Ala Ile Phe Gln Ile Ser Asn Asp Ala

145 150 155 160

Ser Arg Ser Val Val Asp Ala Gln Phe Thr Gly Asn Glu Gly Asp Ala

165 170 175

Thr Arg Gln Pro Arg Thr Pro Gly Val Ser Asp Tyr Glu Asn Val Tyr

180 185 190

Asn His Leu Leu Ala Thr Gln Gly Ser Leu Ile Val Ala Leu Ser Gln

195 200 205

Met Ile Asn Gly Asn Phe Asp Thr Leu Ala Ile Pro Phe Phe Val Ile

210 215 220

Gly Ala Thr Val Gln Leu Ser Thr Tyr Gln Ser Phe Ile Gln Phe Ala

225 230 235 240

Asn Lys Trp Leu Pro Ile Val Tyr Pro Asp Tyr Gln Thr Gln Gly Thr

245 250 255

Ala Gly Tyr Thr Gln Gln Gln Asn Leu Ile Asn Ala Lys Ser Asp Met

260 265 270

Arg Ala Ala Ile Gln Asn His Thr Gln Lys Val Phe Asn Ala Phe Lys

275 280 285

Ala Gly Leu Pro Ser Leu Ser Ser Asp Lys Asn Ser Ile Ser Val Tyr

290 295 300

Asn Gln Tyr Val Arg Gly Leu Val Leu Asn Gly Leu Asp Thr Val Ala

305 310 315 320

Thr Trp Pro Ser Met Tyr Pro Asp Asp Tyr Arg Thr Gln Thr Glu Leu

325 330 335

Glu Gln Thr Arg Val Ile Phe Ser Asp Leu Ile Gly Lys Asp Gln Thr

340 345 350

Ile Ser Asn Asp Val Thr Leu Ile Asn Met Ala Asp Gly Lys Asn Gly

355 360 365

Ser Gly Ala Phe Asn Gln His Ala Thr Ile Asp Leu Asn Ser Ile Phe

370 375 380

Tyr Tyr His Glu Glu Leu Ser Ser Ile Gln Leu Gly Ile His Asp Gly

385 390 395 400

Asn Arg Gly Asn Thr Thr Asn Cys Tyr Asp Tyr Gly Ile Ile Thr Asn

405 410 415

Tyr Pro Asn Tyr Ser Tyr Phe Tyr Gly Asp Leu Tyr Ser Pro Ser Gly

420 425 430

Asp Ala Thr Phe Ser Ala Pro Leu Asn Val Leu Asn Ala Gln Thr Gln

435 440 445

Tyr Ser Ser Gly Tyr Val Asp Ser Glu Phe Ile Tyr Asn Ser Asp Pro

450 455 460

Ser Ala Tyr Gly Ala Gly Cys His Ile Leu Gly Gly Cys Thr Lys Gly

465 470 475 480

Asp Cys Tyr Asn Gln Ser Ser Cys Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Ser Cys

485 490 495

Asn Pro Ser Leu Pro Ser Gln Lys Ile Asn Ala Phe Tyr Pro Phe Lys

500 505 510

Met Asn Leu Ser Arg Ser Gly Thr Ser Asp Lys Leu Gly Leu Met Tyr

515 520 525

Ser Leu Val Pro Leu Asp Leu Asn Pro Asn Asn Thr Phe Gly Glu Leu

530 535 540

Asp Ser Asn Thr Gly Asn Val Ile Gly Lys Gly Phe Pro Ala Glu Lys

545 550 555 560

Gly Thr Leu Ala Ser Gly Asn Val Pro Thr Val Val Arg Glu Trp Val

565 570 575

Asn Gly Ala Asn Ala Val Lys Leu Ser Asp Asp Ala Leu Thr Leu Lys

580 585 590

Met Thr Asn Met Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Ile Arg Val Arg Tyr Ala

595 600 605

Asn Thr Ser Asn Ala Glu Ile Ser Ile Asn Gln Ser Val Ser Ala Gly

610 615 620

Asn Gln Asn Ile Gln Asn Gly Pro Trp Gly Leu Pro Ser Thr Ile Thr

625 630 635 640

Ser Val Val Ser Asp Ala Ser Phe Lys Lys Leu Tyr Ile Ala Gly Gln

645 650 655

Thr Gly Asn Tyr Val Leu Glu Asp Ile Thr Trp Gly Val Asp Gly Gln

660 665 670

Gly Lys Pro Ile Thr Ile Pro Ser Gly Asp Val Thr Val Thr Leu Ser

675 680 685

Arg Thr Asn Met Ser Gln Ser Gly Asp Leu Phe Ile Asp Arg Val Glu

690 695 700

Leu Val Pro Met

705

<210> 16

<211> 796

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Bacillus sp., полученный из образца окружающей среды

<400> 16

Val Lys Lys Val Asn Ser Tyr Lys Asn Glu Asn Glu Tyr Glu Tyr Glu

1 5 10 15

Ile Leu Asp Thr Ser Gln Asn Asn Ser Asn Met Ser Asn Arg Tyr Pro

20 25 30

Arg Tyr Pro Leu Ala Asn Asn Pro Gln Thr Pro Met Arg Asn Val Asn

35 40 45

Tyr Lys Glu Trp Leu Asn Met Cys Asp Ser Asn Thr Lys Phe Val Gly

50 55 60

Asp Ile Asn Thr Tyr Ser Ser Pro Lys Ala Ala Leu Ser Val Gln Asn

65 70 75 80

Ala Ile Val Thr Gly Ile Ser Ile Ser Gly Thr Val Phe Leu Val Ile

85 90 95

Gly Ser Pro Val Leu Gly Gln Ser Leu Leu Leu Ile Ser Arg Leu Ile

100 105 110

Asn Leu Leu Trp Ser Val Phe Arg Pro Leu Glu Pro Trp Glu Glu Leu

115 120 125

Met Ala Leu Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Val Val Ile

130 135 140

Lys Asn Asn Ala Leu Ala Ser Leu Asp Gly Leu Gln Gln Ile Met Glu

145 150 155 160

Leu Tyr Arg Ile Arg Leu Ser Ala Trp Val Asn Asn Lys Asn Asp Gln

165 170 175

Thr Lys Met Ala Val Arg Glu Gln His Arg Ile Val Asp Asn Phe Leu

180 185 190

Glu Val Asn Met Ala Arg Phe Arg Ile Ser Gly Ser Glu Val Leu Leu

195 200 205

Leu Pro Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ile Leu Leu Arg

210 215 220

Asp Ile Asp Leu Phe Gly Ala Glu Trp Gly Ile Gly Pro Glu Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp Asp Tyr Ile Arg Leu Gln Arg Tyr Ile Arg Glu Tyr Lys Asp

245 250 255

His Cys Val Ile Phe Tyr Asn Gln Gly Leu Asn Gln Phe Asn Arg Ser

260 265 270

Thr Ala Gln Glu Trp Ile Arg Phe Asn Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr

275 280 285

Leu Thr Val Leu Asp Leu Ala Ser Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Pro Arg

290 295 300

Ile Tyr Pro Thr Ala Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr

305 310 315 320

Asp Leu Ile Gly Asn Ser Thr Phe Ser Pro Trp Trp Asn Gln Thr Val

325 330 335

Thr Ser Phe Ser Thr Ile Glu Ser Ser Val Ile Arg Arg Pro Ser Phe

340 345 350

Thr Thr Trp Leu Asn Arg Ile Arg Val Phe Thr Gly Ser Leu Asn Pro

355 360 365

Arg Ile Ser Pro Ala Tyr Val Trp Gly Gly His Glu Leu Val Glu Asn

370 375 380

Arg Ser Asn Gly Ser Glu Ile Thr His Val Phe Gly Asn Thr Ala Ser

385 390 395 400

Leu Thr Pro Ile Gln Phe Leu Ser Phe Ala Asn Val Ser Val Phe Arg

405 410 415

Ile Asn Ser Leu Ala Arg Ser Asp Thr Gln Ala His Thr Asn Tyr Gly

420 425 430

Val Ser Arg Ala Ile Phe His Thr Ser Asp Ile Asn Asn Ala Pro Gly

435 440 445

Ser Val Ala Tyr Glu Val Pro Asn Asn Asn Ser Ser Ser Pro Met Val

450 455 460

Ser Glu Leu Pro Arg Glu Asn Glu Gln Arg Pro Asn Glu Arg Glu Phe

465 470 475 480

Ser His Arg Leu Ser Tyr Ile Ser His Val Arg Ala Arg Arg Tyr Asn

485 490 495

Ser Gly Thr Asn Gly Asn Ile Asp Leu Leu Met Tyr Gly Trp Thr His

500 505 510

Thr Ser Met Asn Arg Asn Asn Arg Leu Glu Pro Asp Gly Ile Thr Gln

515 520 525

Ile Asp Ala Val Lys Gly Val Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Val Ile

530 535 540

Pro Gly Pro Thr Gly Gly Asn Leu Val Asn Pro Gly Ala Ser Pro Ala

545 550 555 560

Ile Phe Ser Leu Arg Val Gln Ala Pro Gln Ile Pro Thr Ser Tyr Arg

565 570 575

Ile Arg Leu Arg Tyr Ala Cys Leu Ser Arg Ser Pro Ser Arg Ile Trp

580 585 590

Val His His Ser Gly Asn Phe His Phe Val Glu Leu Pro Cys Asn Asn

595 600 605

Val Ser Gly Arg Pro Ser Asn Thr Leu Leu Glu Ser Asp Phe His Tyr

610 615 620

Val Asp Val Pro Gly Val Phe Ser Pro Ser Ile Asn Pro Glu Ile Leu

625 630 635 640

Phe Gln Asp His Ser Phe Gly Thr Val Leu Asp Lys Ile Glu Phe Ile

645 650 655

Pro Ile Pro Leu Leu Pro Glu Gly Phe Arg Ile Val Thr Ala Leu Asn

660 665 670

Asn Asn Phe Val Ile Asp Leu Asn Pro Asn Asn Asn Val Thr Met Trp

675 680 685

Asn Asn Asn Gly Gly Asp Asn Gln Arg Trp Arg Phe Thr Tyr Asp Gln

690 695 700

Gln Arg Asn Ala Tyr Val Ile Arg Asn Leu Arg Asn Pro Asp Leu Ala

705 710 715 720

Leu Thr Trp Asp Thr Thr Ser Ser Ser Val Val Ala Ala Lys Ile Ser

725 730 735

Pro Glu Arg Arg Glu Gln Tyr Trp Val Leu Glu Asn Phe Gln Asn Gly

740 745 750

Tyr Val Leu Leu Asn Leu Arg Asp Thr Gly Arg Val Leu Asp Val Ala

755 760 765

Gly Gly Ser Val Gly Ser Gly Thr Asn Leu Ile Val Tyr Pro Arg His

770 775 780

Asn Gly Asn Gly Gln Ile Phe Phe Ile Arg Lys Pro

785 790 795

<210> 17

<211> 793

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 17

Met Asn Ser Tyr Lys Asn Glu Asn Glu Tyr Glu Tyr Glu Ile Leu Asp

1 5 10 15

Thr Ser Gln Asn Asn Ser Asn Met Ser Asn Arg Tyr Pro Arg Tyr Pro

20 25 30

Leu Ala Asn Asn Pro Gln Thr Pro Met Arg Asn Val Asn Tyr Lys Glu

35 40 45

Trp Leu Asn Met Cys Asp Ser Asn Thr Lys Phe Val Gly Asp Ile Asn

50 55 60

Thr Tyr Ser Ser Pro Lys Ala Ala Leu Ser Val Gln Asn Ala Ile Val

65 70 75 80

Thr Gly Ile Ser Ile Ser Gly Thr Val Phe Leu Val Ile Gly Ser Pro

85 90 95

Val Leu Gly Gln Ser Leu Leu Leu Ile Ser Arg Leu Ile Asn Leu Leu

100 105 110

Trp Ser Val Phe Arg Pro Leu Glu Pro Trp Glu Glu Leu Met Ala Leu

115 120 125

Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Val Val Ile Lys Asn Asn

130 135 140

Ala Leu Ala Ser Leu Asp Gly Leu Gln Gln Ile Met Glu Leu Tyr Arg

145 150 155 160

Ile Arg Leu Ser Ala Trp Val Asn Asn Lys Asn Asp Gln Thr Lys Met

165 170 175

Ala Val Arg Glu Gln His Arg Ile Val Asp Asn Phe Leu Glu Val Asn

180 185 190

Met Ala Arg Phe Arg Ile Ser Gly Ser Glu Val Leu Leu Leu Pro Val

195 200 205

Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ile Leu Leu Arg Asp Ile Asp

210 215 220

Leu Phe Gly Ala Glu Trp Gly Ile Gly Pro Glu Gln Ile Arg Asp Asp

225 230 235 240

Tyr Ile Arg Leu Gln Arg Tyr Ile Arg Glu Tyr Lys Asp His Cys Val

245 250 255

Ile Phe Tyr Asn Gln Gly Leu Asn Gln Phe Asn Arg Ser Thr Ala Gln

260 265 270

Glu Trp Ile Arg Phe Asn Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Thr Val

275 280 285

Leu Asp Leu Ala Ser Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Pro Arg Ile Tyr Pro

290 295 300

Thr Ala Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Leu Ile

305 310 315 320

Gly Asn Ser Thr Phe Ser Pro Trp Trp Asn Gln Thr Val Thr Ser Phe

325 330 335

Ser Thr Ile Glu Ser Ser Val Ile Arg Arg Pro Ser Phe Thr Thr Trp

340 345 350

Leu Asn Arg Ile Arg Val Phe Thr Gly Ser Leu Asn Pro Arg Ile Ser

355 360 365

Pro Ala Tyr Val Trp Gly Gly His Glu Leu Val Glu Asn Arg Ser Asn

370 375 380

Gly Ser Glu Ile Thr His Val Phe Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Pro

385 390 395 400

Ile Gln Phe Leu Ser Phe Ala Asn Val Ser Val Phe Arg Ile Asn Ser

405 410 415

Leu Ala Arg Ser Asp Thr Gln Ala His Thr Asn Tyr Gly Val Ser Arg

420 425 430

Ala Ile Phe His Thr Ser Asp Ile Asn Asn Ala Pro Gly Ser Val Ala

435 440 445

Tyr Glu Val Pro Asn Asn Asn Ser Ser Ser Pro Met Val Ser Glu Leu

450 455 460

Pro Arg Glu Asn Glu Gln Arg Pro Asn Glu Arg Glu Phe Ser His Arg

465 470 475 480

Leu Ser Tyr Ile Ser His Val Arg Ala Arg Arg Tyr Asn Ser Gly Thr

485 490 495

Asn Gly Asn Ile Asp Leu Leu Met Tyr Gly Trp Thr His Thr Ser Met

500 505 510

Asn Arg Asn Asn Arg Leu Glu Pro Asp Gly Ile Thr Gln Ile Asp Ala

515 520 525

Val Lys Gly Val Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Val Ile Pro Gly Pro

530 535 540

Thr Gly Gly Asn Leu Val Asn Pro Gly Ala Ser Pro Ala Ile Phe Ser

545 550 555 560

Leu Arg Val Gln Ala Pro Gln Ile Pro Thr Ser Tyr Arg Ile Arg Leu

565 570 575

Arg Tyr Ala Cys Leu Ser Arg Ser Pro Ser Arg Ile Trp Val His His

580 585 590

Ser Gly Asn Phe His Phe Val Glu Leu Pro Cys Asn Asn Val Ser Gly

595 600 605

Arg Pro Ser Asn Thr Leu Leu Glu Ser Asp Phe His Tyr Val Asp Val

610 615 620

Pro Gly Val Phe Ser Pro Ser Ile Asn Pro Glu Ile Leu Phe Gln Asp

625 630 635 640

His Ser Phe Gly Thr Val Leu Asp Lys Ile Glu Phe Ile Pro Ile Pro

645 650 655

Leu Leu Pro Glu Gly Phe Arg Ile Val Thr Ala Leu Asn Asn Asn Phe

660 665 670

Val Ile Asp Leu Asn Pro Asn Asn Asn Val Thr Met Trp Asn Asn Asn

675 680 685

Gly Gly Asp Asn Gln Arg Trp Arg Phe Thr Tyr Asp Gln Gln Arg Asn

690 695 700

Ala Tyr Val Ile Arg Asn Leu Arg Asn Pro Asp Leu Ala Leu Thr Trp

705 710 715 720

Asp Thr Thr Ser Ser Ser Val Val Ala Ala Lys Ile Ser Pro Glu Arg

725 730 735

Arg Glu Gln Tyr Trp Val Leu Glu Asn Phe Gln Asn Gly Tyr Val Leu

740 745 750

Leu Asn Leu Arg Asp Thr Gly Arg Val Leu Asp Val Ala Gly Gly Ser

755 760 765

Val Gly Ser Gly Thr Asn Leu Ile Val Tyr Pro Arg His Asn Gly Asn

770 775 780

Gly Gln Ile Phe Phe Ile Arg Lys Pro

785 790

<210> 18

<211> 658

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 18

Val Lys Lys Val Asn Ser Tyr Lys Asn Glu Asn Glu Tyr Glu Tyr Glu

1 5 10 15

Ile Leu Asp Thr Ser Gln Asn Asn Ser Asn Met Ser Asn Arg Tyr Pro

20 25 30

Arg Tyr Pro Leu Ala Asn Asn Pro Gln Thr Pro Met Arg Asn Val Asn

35 40 45

Tyr Lys Glu Trp Leu Asn Met Cys Asp Ser Asn Thr Lys Phe Val Gly

50 55 60

Asp Ile Asn Thr Tyr Ser Ser Pro Lys Ala Ala Leu Ser Val Gln Asn

65 70 75 80

Ala Ile Val Thr Gly Ile Ser Ile Ser Gly Thr Val Phe Leu Val Ile

85 90 95

Gly Ser Pro Val Leu Gly Gln Ser Leu Leu Leu Ile Ser Arg Leu Ile

100 105 110

Asn Leu Leu Trp Ser Val Phe Arg Pro Leu Glu Pro Trp Glu Glu Leu

115 120 125

Met Ala Leu Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Val Val Ile

130 135 140

Lys Asn Asn Ala Leu Ala Ser Leu Asp Gly Leu Gln Gln Ile Met Glu

145 150 155 160

Leu Tyr Arg Ile Arg Leu Ser Ala Trp Val Asn Asn Lys Asn Asp Gln

165 170 175

Thr Lys Met Ala Val Arg Glu Gln His Arg Ile Val Asp Asn Phe Leu

180 185 190

Glu Val Asn Met Ala Arg Phe Arg Ile Ser Gly Ser Glu Val Leu Leu

195 200 205

Leu Pro Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ile Leu Leu Arg

210 215 220

Asp Ile Asp Leu Phe Gly Ala Glu Trp Gly Ile Gly Pro Glu Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp Asp Tyr Ile Arg Leu Gln Arg Tyr Ile Arg Glu Tyr Lys Asp

245 250 255

His Cys Val Ile Phe Tyr Asn Gln Gly Leu Asn Gln Phe Asn Arg Ser

260 265 270

Thr Ala Gln Glu Trp Ile Arg Phe Asn Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr

275 280 285

Leu Thr Val Leu Asp Leu Ala Ser Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Pro Arg

290 295 300

Ile Tyr Pro Thr Ala Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr

305 310 315 320

Asp Leu Ile Gly Asn Ser Thr Phe Ser Pro Trp Trp Asn Gln Thr Val

325 330 335

Thr Ser Phe Ser Thr Ile Glu Ser Ser Val Ile Arg Arg Pro Ser Phe

340 345 350

Thr Thr Trp Leu Asn Arg Ile Arg Val Phe Thr Gly Ser Leu Asn Pro

355 360 365

Arg Ile Ser Pro Ala Tyr Val Trp Gly Gly His Glu Leu Val Glu Asn

370 375 380

Arg Ser Asn Gly Ser Glu Ile Thr His Val Phe Gly Asn Thr Ala Ser

385 390 395 400

Leu Thr Pro Ile Gln Phe Leu Ser Phe Ala Asn Val Ser Val Phe Arg

405 410 415

Ile Asn Ser Leu Ala Arg Ser Asp Thr Gln Ala His Thr Asn Tyr Gly

420 425 430

Val Ser Arg Ala Ile Phe His Thr Ser Asp Ile Asn Asn Ala Pro Gly

435 440 445

Ser Val Ala Tyr Glu Val Pro Asn Asn Asn Ser Ser Ser Pro Met Val

450 455 460

Ser Glu Leu Pro Arg Glu Asn Glu Gln Arg Pro Asn Glu Arg Glu Phe

465 470 475 480

Ser His Arg Leu Ser Tyr Ile Ser His Val Arg Ala Arg Arg Tyr Asn

485 490 495

Ser Gly Thr Asn Gly Asn Ile Asp Leu Leu Met Tyr Gly Trp Thr His

500 505 510

Thr Ser Met Asn Arg Asn Asn Arg Leu Glu Pro Asp Gly Ile Thr Gln

515 520 525

Ile Asp Ala Val Lys Gly Val Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Val Ile

530 535 540

Pro Gly Pro Thr Gly Gly Asn Leu Val Asn Pro Gly Ala Ser Pro Ala

545 550 555 560

Ile Phe Ser Leu Arg Val Gln Ala Pro Gln Ile Pro Thr Ser Tyr Arg

565 570 575

Ile Arg Leu Arg Tyr Ala Cys Leu Ser Arg Ser Pro Ser Arg Ile Trp

580 585 590

Val His His Ser Gly Asn Phe His Phe Val Glu Leu Pro Cys Asn Asn

595 600 605

Val Ser Gly Arg Pro Ser Asn Thr Leu Leu Glu Ser Asp Phe His Tyr

610 615 620

Val Asp Val Pro Gly Val Phe Ser Pro Ser Ile Asn Pro Glu Ile Leu

625 630 635 640

Phe Gln Asp His Ser Phe Gly Thr Val Leu Asp Lys Ile Glu Phe Ile

645 650 655

Pro Ile

<210> 19

<211> 655

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 19

Met Asn Ser Tyr Lys Asn Glu Asn Glu Tyr Glu Tyr Glu Ile Leu Asp

1 5 10 15

Thr Ser Gln Asn Asn Ser Asn Met Ser Asn Arg Tyr Pro Arg Tyr Pro

20 25 30

Leu Ala Asn Asn Pro Gln Thr Pro Met Arg Asn Val Asn Tyr Lys Glu

35 40 45

Trp Leu Asn Met Cys Asp Ser Asn Thr Lys Phe Val Gly Asp Ile Asn

50 55 60

Thr Tyr Ser Ser Pro Lys Ala Ala Leu Ser Val Gln Asn Ala Ile Val

65 70 75 80

Thr Gly Ile Ser Ile Ser Gly Thr Val Phe Leu Val Ile Gly Ser Pro

85 90 95

Val Leu Gly Gln Ser Leu Leu Leu Ile Ser Arg Leu Ile Asn Leu Leu

100 105 110

Trp Ser Val Phe Arg Pro Leu Glu Pro Trp Glu Glu Leu Met Ala Leu

115 120 125

Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Val Val Ile Lys Asn Asn

130 135 140

Ala Leu Ala Ser Leu Asp Gly Leu Gln Gln Ile Met Glu Leu Tyr Arg

145 150 155 160

Ile Arg Leu Ser Ala Trp Val Asn Asn Lys Asn Asp Gln Thr Lys Met

165 170 175

Ala Val Arg Glu Gln His Arg Ile Val Asp Asn Phe Leu Glu Val Asn

180 185 190

Met Ala Arg Phe Arg Ile Ser Gly Ser Glu Val Leu Leu Leu Pro Val

195 200 205

Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ile Leu Leu Arg Asp Ile Asp

210 215 220

Leu Phe Gly Ala Glu Trp Gly Ile Gly Pro Glu Gln Ile Arg Asp Asp

225 230 235 240

Tyr Ile Arg Leu Gln Arg Tyr Ile Arg Glu Tyr Lys Asp His Cys Val

245 250 255

Ile Phe Tyr Asn Gln Gly Leu Asn Gln Phe Asn Arg Ser Thr Ala Gln

260 265 270

Glu Trp Ile Arg Phe Asn Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Thr Val

275 280 285

Leu Asp Leu Ala Ser Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Pro Arg Ile Tyr Pro

290 295 300

Thr Ala Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Leu Ile

305 310 315 320

Gly Asn Ser Thr Phe Ser Pro Trp Trp Asn Gln Thr Val Thr Ser Phe

325 330 335

Ser Thr Ile Glu Ser Ser Val Ile Arg Arg Pro Ser Phe Thr Thr Trp

340 345 350

Leu Asn Arg Ile Arg Val Phe Thr Gly Ser Leu Asn Pro Arg Ile Ser

355 360 365

Pro Ala Tyr Val Trp Gly Gly His Glu Leu Val Glu Asn Arg Ser Asn

370 375 380

Gly Ser Glu Ile Thr His Val Phe Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Pro

385 390 395 400

Ile Gln Phe Leu Ser Phe Ala Asn Val Ser Val Phe Arg Ile Asn Ser

405 410 415

Leu Ala Arg Ser Asp Thr Gln Ala His Thr Asn Tyr Gly Val Ser Arg

420 425 430

Ala Ile Phe His Thr Ser Asp Ile Asn Asn Ala Pro Gly Ser Val Ala

435 440 445

Tyr Glu Val Pro Asn Asn Asn Ser Ser Ser Pro Met Val Ser Glu Leu

450 455 460

Pro Arg Glu Asn Glu Gln Arg Pro Asn Glu Arg Glu Phe Ser His Arg

465 470 475 480

Leu Ser Tyr Ile Ser His Val Arg Ala Arg Arg Tyr Asn Ser Gly Thr

485 490 495

Asn Gly Asn Ile Asp Leu Leu Met Tyr Gly Trp Thr His Thr Ser Met

500 505 510

Asn Arg Asn Asn Arg Leu Glu Pro Asp Gly Ile Thr Gln Ile Asp Ala

515 520 525

Val Lys Gly Val Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Val Ile Pro Gly Pro

530 535 540

Thr Gly Gly Asn Leu Val Asn Pro Gly Ala Ser Pro Ala Ile Phe Ser

545 550 555 560

Leu Arg Val Gln Ala Pro Gln Ile Pro Thr Ser Tyr Arg Ile Arg Leu

565 570 575

Arg Tyr Ala Cys Leu Ser Arg Ser Pro Ser Arg Ile Trp Val His His

580 585 590

Ser Gly Asn Phe His Phe Val Glu Leu Pro Cys Asn Asn Val Ser Gly

595 600 605

Arg Pro Ser Asn Thr Leu Leu Glu Ser Asp Phe His Tyr Val Asp Val

610 615 620

Pro Gly Val Phe Ser Pro Ser Ile Asn Pro Glu Ile Leu Phe Gln Asp

625 630 635 640

His Ser Phe Gly Thr Val Leu Asp Lys Ile Glu Phe Ile Pro Ile

645 650 655

<210> 20

<211> 790

<212> PRT

<213> Неизвестная

<220>

<223> Bacillus sp., полученный из образца окружающей среды

<400> 20

Val Lys Lys Met Asn Ser Tyr Gln Asn Lys Asn Glu Tyr Glu Ile Leu

1 5 10 15

Asp Ala Ser Glu Asn Thr Val Asn Ala Leu Asn Arg Tyr Pro Phe Ala

20 25 30

Asn Asn Pro Tyr Ser Ser Ile Phe Ser Ser Cys Pro Arg Ser Gly Pro

35 40 45

Gly Asn Trp Ile Asn Ile Leu Gly Asn Ala Val Ser Glu Ala Val Ser

50 55 60

Ile Ser Gln Asp Ile Ile Ser Leu Leu Thr Gln Pro Ser Ile Ser Gly

65 70 75 80

Ile Ile Ser Met Ala Phe Ser Leu Leu Ser Arg Met Ile Gly Ser Asn

85 90 95

Gly Arg Ser Ile Ser Glu Leu Ser Met Cys Asp Leu Leu Ala Ile Ile

100 105 110

Asp Leu Arg Val Asn Gln Ser Val Leu Asp Asp Gly Val Ala Asp Phe

115 120 125

Asn Gly Ser Leu Val Ile Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Leu Gln Arg

130 135 140

Trp Asn Asn Asn Pro Asn Pro Ala Asn Ala Glu Glu Val Arg Thr Arg

145 150 155 160

Phe Arg Glu Ser Asp Thr Ile Phe Asp Leu Ile Leu Thr Gln Gly Ser

165 170 175

Leu Thr Asn Gly Gly Ser Leu Ala Arg Asn Asn Ala Gln Ile Leu Leu

180 185 190

Leu Pro Ser Phe Ala Asn Ala Ala Tyr Phe His Leu Leu Leu Leu Arg

195 200 205

Asp Ala Asn Val Tyr Gly Asn Asn Trp Gly Leu Phe Gly Val Thr Pro

210 215 220

Asn Ile Asn Tyr Glu Ser Lys Leu Leu Asn Leu Ile Arg Leu Tyr Thr

225 230 235 240

Asn Tyr Cys Thr His Trp Tyr Asn Gln Gly Leu Asn Glu Leu Arg Asn

245 250 255

Arg Gly Ser Asn Ala Thr Ala Trp Leu Glu Phe His Arg Phe Arg Arg

260 265 270

Asp Met Thr Leu Met Val Leu Asp Ile Val Ser Ser Phe Ser Ser Leu

275 280 285

Asp Ile Thr Arg Tyr Pro Arg Ala Thr Asp Phe Gln Leu Ser Arg Ile

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Gly Phe Val Asn Arg Ser Asp Pro Ser Ala

305 310 315 320

Pro Arg Thr Trp Phe Ser Phe His Asn Gln Ala Asn Phe Ser Ala Leu

325 330 335

Glu Ser Gly Ile Pro Ser Pro Ser Phe Ser Gln Phe Leu Asp Ser Met

340 345 350

Arg Ile Ser Thr Gly Pro Leu Ser Leu Pro Ala Ser Pro Asn Ile His

355 360 365

Arg Ala Arg Val Trp Tyr Gly Asn Gln Asn Asn Phe Asn Gly Ser Ser

370 375 380

Ser Gln Thr Phe Gly Glu Ile Thr Asn Asp Asn Gln Thr Ile Ser Gly

385 390 395 400

Leu Asn Ile Phe Arg Ile Asp Ser Gln Ala Val Asn Leu Asn Asn Thr

405 410 415

Thr Phe Gly Val Ser Arg Ala Glu Phe Tyr His Asp Ala Ser Gln Gly

420 425 430

Ser Gln Arg Ser Ile Tyr Gln Gly Phe Val Asp Thr Gly Gly Ala Ser

435 440 445

Thr Ala Val Ala Gln Asn Ile Gln Thr Phe Phe Pro Gly Glu Asn Ser

450 455 460

Ser Ile Pro Thr Pro Gln Asp Tyr Thr His Ile Leu Ser Arg Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Thr Gly Gly Leu Arg Gln Val Ala Ser Gly Arg Arg Ser Ser

485 490 495

Leu Val Leu His Gly Trp Thr His Lys Ser Leu Ser Arg Gln Asn Arg

500 505 510

Val Glu Pro Asn Arg Ile Thr Gln Val Pro Ala Val Lys Ala Ser Ser

515 520 525

Pro Ser Asn Cys Thr Val Ile Ala Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp

530 535 540

Leu Val Arg Met Ser Ser Asn Cys Ser Val Ser Tyr Asn Phe Thr Pro

545 550 555 560

Ala Asp Gln Gln Val Val Ile Arg Leu Arg Tyr Ala Cys Gln Gly Thr

565 570 575

Ala Ser Leu Arg Ile Thr Phe Gly Asn Gly Ser Ser Gln Ile Ile Pro

580 585 590

Leu Val Ser Thr Thr Ser Ser Ile Asn Asn Leu Gln Tyr Glu Asn Phe

595 600 605

Ser Phe Ala Ser Gly Pro Asn Ser Val Asn Phe Leu Ser Ala Gly Thr

610 615 620

Ser Ile Thr Ile Gln Asn Ile Ser Thr Asn Ser Asn Val Val Leu Asp

625 630 635 640

Arg Ile Glu Ile Val Pro Glu Gln Pro Ile Pro Ile Ile Pro Gly Asp

645 650 655

Tyr Gln Ile Val Thr Ala Leu Asn Asn Ser Ser Val Phe Asp Leu Asn

660 665 670

Ser Gly Thr Arg Val Thr Leu Trp Ser Asn Asn Arg Gly Ala His Gln

675 680 685

Ile Trp Asn Phe Met Tyr Asp Gln Gln Arg Asn Ala Tyr Val Ile Arg

690 695 700

Asn Val Ser Asn Pro Ser Leu Val Leu Thr Trp Asp Phe Thr Ser Pro

705 710 715 720

Asn Ser Ile Val Phe Ala Ala Pro Phe Ser Pro Gly Arg Gln Glu Gln

725 730 735

Tyr Trp Ile Ala Glu Ser Phe Gln Asn Ser Tyr Val Phe Glu Asn Leu

740 745 750

Arg Asn Thr Asn Met Val Leu Asp Val Ala Gly Gly Ser Thr Ala Ile

755 760 765

Gly Thr Asn Ile Ile Ala Phe Pro Arg His Asn Gly Asn Ala Gln Arg

770 775 780

Phe Phe Ile Arg Arg Pro

785 790

<210> 21

<211> 647

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант нативной последовательности

<400> 21

Val Lys Lys Met Asn Ser Tyr Gln Asn Lys Asn Glu Tyr Glu Ile Leu

1 5 10 15

Asp Ala Ser Glu Asn Thr Val Asn Ala Leu Asn Arg Tyr Pro Phe Ala

20 25 30

Asn Asn Pro Tyr Ser Ser Ile Phe Ser Ser Cys Pro Arg Ser Gly Pro