Результат интеллектуальной деятельности: N,N'-БИС(3-АМИНОПРОПИЛ)БУТАН-1,4-ДИАМИНОПРОИЗВОДНЫЕ ФУЗИДОВОЙ КИСЛОТЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ШИРОКИЙ СПЕКТР ПРОТИВОМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ

Изобретение относится к области медицинской химии, а именно к азотсодержащим производным фузидовой кислоты представляющим собой (2Z)-2-((3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-{[3-({4-[(3-аминопропил)амино]бутил}амино)пропил]амино}-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден)-6-метилгепт-5-еновую кислоту (1) и метил (2Z)-2-((3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-{[3-({4-[(3-аминопропил)амино]бутил}амино)пропил]амино}-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (2), проявляющим широкий спектр противомикробной активности по отношению к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам.

Известны производные фузидовой кислоты, содержащие разветвленный полиаминовый фрагмент в 3 положении молекулы (3)-(6) (схема 1). Изучение антибактериальной активности полученных производных в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (Staphylococci, Streptococci, Corynebacteriae, Mycobacteriae, Proteus, Propionibacterium, Pseudomonas, Neisseriae, E.coli), а также грибковых штаммов (Candida, Aspergillus) показало, что они не обладают антимикробным и фунгицидным действием по отношению к штаммам возбудителей бактериальных и грибковых инфекций человека и животных ([1] Т. Duvold. Blanched polyamine steroid derivatives. Patent WO 03/087121 A1, 2003; [2] T. Duvold. Novel fusidic acid derivatives. Patent WO 02/077007 A2, 2002).

Известны производные фузидовой кислоты, содержащие N,N'-бис(3-аминопропил)бутан-1,4-диаминовый заместитель в 21 положении молекулы (7)-(14) (схема 2). Изучение биологической активности полученных производных показало, что соединения (10), (13) и (14) проявляют антибактериальное действие в отношении штаммов грамположительных (Staphylococci, Streptococci, Corynebacterium, Propionibacterium) и грамотрицательных (E.coli, Pseudomonas aeruginosa) микроорганизмов, а также ингибируют рост грибковых культур Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans и Aspergillus niger [Т. Duvold. Novel fusidic acid derivatives. Patent WO 02/077007 A2, 2002].

Таким образом, синтез и антибактериальные свойства N,N'-бис(3-аминопропил)бутан-1,4-диаминопроизводных фузидовой кислоты (1) и (2) в литературе не описаны.

Задачей предлагаемого изобретения является синтез и изучение антибактериальной и фунгицидной активности in vitro (2Z)-2-((3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-{[3-({4-[(3-аминопропил)амино]бутил}амино)пропил]амино}-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден)-6-метилгепт-5-еновой кислоты (1) и метил (2Z)-2-((3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-{[3-({4-[(3-аминопропил)амино]бутил}амино)пропил]амино}-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноата (2) в отношении 5 различных видов бактерий: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, и двух разновидностей грибков: Candida albicans и Cryptococcus neoformans.

Синтез заявленных соединений осуществляли по реакции восстановительного аминирования, описанной в работе [E.V. Salimova, A.G. Mamaev, E.V. Tretyakova, О.S. Kukovinets, L.V. Parfenova. Mediterr. J. Chem. 2018, 7 (3), P. 198-203]. Дикетон фузидовой кислоты (15) или ее метилового эфира (16) вовлекали во взаимодействие с 3 экв. N,N'-бис(3-аминопропил)бутан-1,4-диамина (спермина) в среде сухого метанола в присутствии катализатора Ti(Oi-Pr)₄ с последующим восстановлением смеси 2 экв. NaBH₄ (схема 3). В результате реакции выделяли производные (1) и (2) с выходами 75 и 80%, соответственно.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Смесь дикетона (15) (0.28 г, 0.5 ммоль), изопропоксида титана(IV) (0.06 г, 0.15 ммоль) и N,N'-бис(3-аминопропил)бутан-1,4-диамина (0.3 г, 1.5 ммоль) в 5 мл абсолютного метанола перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре 2 часа. Реакционную массу охлаждали до -70°С и добавляли NaBH₄ (0.04 г, 1.0 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 0.5 часа при -70°С, после чего температуру постепенно повышали до комнатной и добавляли в реакционную массу 5 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали метанолом. Маточный раствор концентрировали в вакууме, получая сырой амин, который очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя метанолом.

(2Z)-2-((3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(Ацетилокси)-3-{[3-({4-[(3-аминопропил) амино]бутил}амино)пропил]амино}-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметил-гонан-17-илиден)-6-метилгепт-5-еновая кислота (1). Желтый порошок; выход 75%; т.пл. 253-255°С; [α]²⁰_D +9.2° (с 1.110, МеОН). Спектр ЯМР ¹Н (CD₃OD, δ, м.д.): 5.91 (1Н, д, J=7.5 Hz, Н-16), 5.16 (1Н, д, J=6.0 Hz, Н-24), 4.24-4.36 (1Н, м, Н-11), 3.26-3.33 (2Н, м, Н-3'), 3.23-3.34 (2Н, м, Н-8'), 3.15 (2Н, т, J=7.0 Hz, Н-7'), 3.09 (2Н, д, J=10.0 Hz, Н-10'), 3.02-3.13 (3Н, м, Н-4', Н-13), 2.95-3.03 (2Н, м, Н-1'), 2.78-2.90 (1Н, м, Н-3), 2.47-2.59 (1Н, м, H-9'a), 2.35-2.44 (1Н, м, H-9'b), 2.28-2.37 (1Н, м, Н-12а), 2.11-2.23 (1Н, м, Н-1а), 2.07-2.23 (1Н, м, Н-2а), 2.05-2.15 (3Н, м, Н-15а, Н-2'), 2.02-2.35 (2Н, м, Н-22), 1.97 (3Н, с, O-С(O)CH₃, 1.92-2.02 (1Н, м, Н-1b), 1.81-1.92 (4Н, м, Н-5', Н-6'), 1.80-1.89 (1Н, м, Н-12b), 1.74-1.81 (1H, м, Н-5), 1.73-2.22 (2Н, м, Н-23), 1.73-1.87 (1Н, м, Н-7а), 1.71-1.79 (1Н, м, Н-4), 1.69 (3Н, с, Н-26), 1.65-1.72 (1Н, м, Н-2b), 1.64 (3Н, с, Н-27), 1.55-1.69 (1H, м, Н-9), 1.35 (3Н, с, Н-30), 1.25-1.31 (1Н, м, Н-6а), 1.23-1.31 (1Н, м, Н-15b), 1.14-1.23 (1Н, м, Н-6b), 1.13-1.24 (1Н, м, Н-7b), 1.07 (6Н, уш.с, Н-19, Н-28), 0.97 (3Н, с, Н-18). Спектр ЯМР ¹³С (CD₃OD, δ, м.д.): 172.3 (С, С-21, O-С(O)СН₃), 136.8 (С, С-17), 132.1 (С, С-20), 131.4 (С, С-25), 123.8 (СН, С-24), 74.6 (СН, С-16), 66.9 (СН, С-11), 63.1 (СН, С-3), 53.8 (СН₂, С-3'), 48.8 (СН, С-9), 48.5 (С, С-14), 47.1 (СН₂, С-4'), 45.1 (СН₂, С-7'), 44.7 (СН₂, C-l'), 43.1 (СН, С-13), 42.8 (СН, С-5), 41.8 (СН₂, С-8'), 39.1 (С, С-8), 38.86 (СН₂, С-15), 36.76 (СН₂, С-10'), 36.13 (СН₂, С-12), 35.86 (С, С-10), 34.97 (СН, С-4), 33.4 (СН₂, С-1), 31.7 (СН₂, С-7), 29.3 (СН₂, С-22), 27.8 (СН₂, С-23), 24.5 (СН₃, С-26), 24.2 (СН₂, С-2'), 24.0 (СН₂, С-9'), 23.5 (СН₂, С-2), 23.4 (СН₂, С-5'), 23.1 (СН₂, С-6'), 22.5 (СН₃, С-30), 22.2 (СН₃, С-19), 21.1 (СН₂, С-6), 19.9 (СН₃, O-С(O)СН₃), 16.6 (СН₃, С-27, С-18), 14.4 (СН₃, С-28). Масс-спектр (MALDI TOF/TOF), m/z (I_отн., %): 701.405 [М] (100). Вычислено для C₄₁H₇₂N₄O₅: С, 70.24; Н, 10.35; N, 7.99%. Найдено: С, 70.29; Н, 10.31; N, 8.01%.

Пример 2. Смесь дикетона (16) (0.26 г, 0.5 ммоль), изопропоксида титана(IV) (0.055 г, 0.15 ммоль) и N,N'-бис(3-аминопропил)бутан-1,4-диамина (0.3 г, 1.5 ммоль) в 5 мл абсолютного метанола перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре 2 часа. Реакционную массу охлаждали до -70°С и добавляли NaBH₄ (0.04 г, 1.0 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 0.5 часа при -70°С, после чего температуру постепенно повышали до комнатной и добавляли в реакционную массу 5 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали метанолом. Маточный раствор концентрировали в вакууме, получая сырой амин, который очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя метанолом.

Метил (2Z)-2-((3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-{[3-({4-[(3-аминопропил)амино]бутил}амино)пропил]амино}-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноат (2). Желтый порошок; выход 80%; т.пл. 245-247°С; [α]²⁰_D +8.9° (с 1.137, МеОН). Спектр ЯМР ¹Н (CD₃OD, δ, м.д.): 5.83 (1Н, д, J=3.2 Hz, Н-16), 5.12 (1Н, т, J=7.0 Hz, Н-24), 4.24-4.37 (1H, м, Н-11), 3.64 (3Н, с, С(O)ОСН₃), 3.20-3.31 (2Н, м, Н-8'), 3.08-3.13 (2Н, м, Н-3'), 3.01-3.11 (2Н, м, Н-10'), 3.01-3.07 (1Н, м, Н-13), 3.00-3.16 (2Н, м, Н-7'), 2.90-3.01 (2Н, м, Н-4'), 2.73-2.83 (1Н, м, Н-3), 2.58-2.64 (1Н, м, H-1'a), 2.52-2.62 (1Н, м, Н-22а), 2.43-2.46 (1Н, м, H-1'b), 2.37-2.47 (1Н, м, Н-22b), 2.33 (1Н, дт, J=3.5, 13.5 Hz, Н-12а), 2.12-2.20 (1Н, м, Н-1а), 2.11-2.45 (1Н, м, Н-15а), 2.01-2.16 (2Н, м, Н-23), 2.00-2.35 (2Н, м, Н-2'), 1.99-2.18 (2Н, м, Н-9'), 1.96 (3Н, с, О-С(О)СН₃), 1.90-1.96 (1H, м, Н-1b), 1.80 (1Н, т, J=3.2 Hz, Н-5), 1.77-1.91 (Ш, м, Н-12b), 1.76-2.02 (2Н, м, Н-2), 1.74-1.91 (4Н, м, Н-5', 6'), 1.73-1.83 (1Н, м, Н-7а), 1.68-1.75 (1Н, м, Н-4), 1.68 (3Н, с, Н-26), 1.61 (3Н, с, Н-27), 1.56-1.78 (1Н, м, Н-6а), 1.35 (3Н, с, Н-30), 1.25 (1Н, д, J=7.3 Hz, H-15b), 1.10-1.20 (1Н, м, H-7b), 1.06 (3Н, с, Н-19), 1.04 (3Н, д, J=9.5 Hz, Н-28), 0.93 (3Н, с, Н-18), 0.91-0.97 (1Н, м, Н-6b). Спектр ЯМР ^l3C (CD₃OD, δ, м.д.): 171.0 (С, С-21), 170.8 (С, O-С(O)СН₃), 148.8 (С, С-17), 132.2 (С, С-25), 130.2 (С, С-20), 122.8 (СН, С-24), 74.4 (СН, С-16), 66.8 (СН, С-11), 63.1 (СН, С-3), 50.7 (СН₃, С(О)ОСН₃), 48.8 (СН, С-9), 48.5 (С, С-14), 47.2 (СН₂, С-4'), 45.9 (СН₂, С-7'), 45.0 (СН₂, С-1'), 43.9 (СН, С-13), 42.9 (СН, С-5), 42.8 (СН₂, С-8'), 42.6 (СН₂, С-3'), 39.1 (С, С-8), 38.7 (СН₂, С-15), 37.2 (СН₂, С-10'), 36.0 (СН₂, С-12), 35.8 (С, С-10), 35.2 (СН, С-4), 33.4 (СН₂, С-1), 31.7 (СН₂, С-7), 28.4 (СН₂, С-22), 27.9 (СН₂, С-23), 24.9 (СН₂, С-9'), 24.6 (СН₃, С-26), 24.4 (СН₂, С-2'), 24.2 (СН₂, С-2), 24.1 (СН₂, С-5'), 23.7 (СН₂, С-6'), 23.0 (СН₃, С-30), 22.3 (СН₃, С-19), 21.1 (СН₂, С-6), 19.6 (СН₃, O-С(O)СН₃), 16.6 (СН₃, С-18), 16.5 (СН₃, С-27), 14.6 (СН₃, С-28). Масс-спектр (MALDI TOF/TOF), m/z (I_отн., %): 738.646 [M+Na] (100). Вычислено для С₄₂Н₇₄О₅: С, 70.55; Н, 10.43; N, 7.84%. Найдено: С, 70.47; Н, 10.39; N, 7.81%.

Контроль реакции осуществляли методом ТСХ на пластинах Sorbfil (Сорбпо-лимер, Краснодар, Россия), проявляли 10%) раствором серной кислоты. Для колоночной хроматографии использовали силикагель L (50-160 мкм) марки КСКГ. Температура плавления определена на приборе РНМК 80/2617. Спектры ЯМР ID (¹Н, ¹³С) и 2D (COSY, NOESY, HSQC, НМВС) сняты на спектрометре Bruker Avance 500 (125.78 МГц для ¹³С и 500.17 МГц для ¹Н) с использованием стандартных импульсных последовательностей фирмы Bruker, внутренний стандарт Me₄Si, растворитель - CD₃OD. Оптические углы измерены на поляриметре Perkin-Elmer 341. Масс-спектры MALDI TOF/TOF получены на спектрометре Bruker Autoflex ТМ III Smartbeam с использованием матрицы 3-(4-гидрокси-3,5-диметоксифенил)проп-2-еновой кислоты (синапиновая кислота).

Противомикробный скрининг соединений (1) и (2) проводили в CO-ADD (The Community for Antimicrobial Drug Discovery), финансируемым Wellcome Trust (Великобритания) и Университетом Квинсленда (Австралия), на пяти бактериальных штаммах: Escherichia coli (Е. coli) АТСС 25922, Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) АТСС 700603, Acinetobacter baumannii (A. baumannii) АТСС 19606, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ATCC 27853 и Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 43300. Противогрибковую активность определяли на двух грибковых штаммах: Candida albicans (С. albicans) АТСС 90028 и Cryptococcus neoformans (С. neoformans) АТСС 208821.

Первичный скрининг противомикробной активности проводился путем тестов на ингибирование размножения клеток, используя образцы в одной (32 мкг/мл) концентрации. Аликвоту каждого образца в ДМСО помещали в 384-луночный планшет и обрабатывали соответствующей бактериальной культурой. Ингибирование роста бактерий определяли спектрофотометрически при 600 нм на монохромном микропланшетном ридере Tecan M1000 Pro. Процент ингибирования роста рассчитывали для каждой лунки с использованием отрицательного контроля (только для среды) и положительного контроля (бактерии без ингибиторов) на той же пластинке. В случае если один или оба раза наблюдалось ингибирование роста ≥80%, соединение считалось активным (Таблица 1).

При первичном скрининге было выявлено наличие широкого спектра противомикробной и фунгицидной активности у N,N'-бис(3-аминопропил)бутан-1,4-диаминопроизводных фузидовой кислоты (1) и (2) в отношении штаммов грамположительных (Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) микроорганизмов, а также грибковых культур Cryptococcus neoformans и Candida albicans.

Для соединения (1) и (2) была определена минимальная ингибирующая концентрация в отношении вышеуказанных культур, а также изучена цитотоксическая и гемолитическая активности.

Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC; мкг/мл) устанавливали в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), США), определяя наименьшую концентрацию, при которой было обнаружено полное ингибирование бактерий или грибов. Скрининг проводился методом серийных разведений. Образцы готовились в ДМСО в тестовой концентрации 32 мкг/мл. Все бактерии культивировались на агаре Мюллера Хинтона при 37°С в течение ночи. Образец каждой культуры затем разбавлялся в 40 раз и инкубировался при 37°С в течение 1,5-3 ч. Полученные культуры добавлялись в каждую лунку 384-луночного планшета, содержащую исследуемый образец (плотность клеток 5×10⁵ КОЕ / мл и общий объем 50 мкл). Все планшеты накрывались и инкубировались при 37°С в течение 18 ч без встряхивания. Ингибирование роста бактерий определялось измерением поглощения при 600 нм с использованием монохромного микропланшетного ридера Tecan M1000 Pro. Процент ингибирования роста рассчитывался для каждой лунки с использованием отрицательного контроля (только для среды) и положительного контроля (бактерии без ингибиторов) на той же пластине. Значения ингибирования определялись с помощью модифицированных Z-показателей, рассчитанных с использованием медианы и медианного абсолютного отклонения (MAD) образцов (без контроля) на той же пластине. Образцы с величиной ингибирования выше 80% и Z-оценкой выше 2,5 для обеих реплик классифицировались как активные вещества. Образцы с показателями ингибирования от 50 до 80% и Z-оценкой выше 2,5 для обеих реплик классифицировались как частично активные.

Тесты проводились в двойном повторе. Максимальный процент ингибирования роста обозначался как DMax. Хиты были классифицированы при MIC ≤ 16 мкг/мл или MIC ≤ 10 мкМ в любой реплике (n=2 на разных пластинах).

Цитотоксическое действие определяли на клеточной линии эмбриональных почек человека HEK293 путем определения концентрации, вызывающей гибель 50% клеток (Hk СС₅₀). Ингибирование роста клеток HEK293 определяли, измеряя флуоресценцию после добавления 5 мкл 25 мкг/мл резазурина (конечная концентрация 2.3 мкг/мл) и после инкубации в течение еще 3 ч при 37°С в 5% CO₂. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием монохромного микропланшетного ридера Tecan M1000 Pro с использованием автоматического вычисления коэффициента усиления. Максимальный процент цитотоксичности обозначали как DMax. Соединение считалось токсичным при СС₅₀ ≤ 32 мкг/мл или СС₅₀ ≤ 10 мкМ. Кроме того, образцы были отмечены как частичные цитотоксические, если DMax ≥50%, даже при СС₅₀ выше максимальной тестируемой концентрации.

Гемолитическую активность (Hm НС₁₀ и НС₅₀ - концентрация при 10% и 50% гемолизе, соответственно) определяли путем измерения поглощения при 405 мм супернатанта - надосадочной жидкости, образованной после инкубации в течение 1 ч при 37°С планшетов, содержащих образцы соединений с добавленными к ним промытыми клетками крови человека, и последующего центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин. Абсорбцию измеряли с использованием монохромного микропланшетного ридера Tecan M1000 Pro.

Максимальный процент гемолиза представлен как DMax. Низкое значение DMax при НС₁₀ > 32 мкг/мл (максимально испытанная концентрация) указывает на образцы без гемолитической активности. Образцы, обладающие гемолитической активностью, были охарактеризованы при НС₁₀ ≤ 32 мкг/мл. Кроме того, образцы были помечены как частично гемолитические, если DMax ≥ 50%, даже при НС₁₀ > максимальной тестируемой концентрации.

«Колистин» и «Ванкомицин» были использованы в качестве положительных стандартов бактериального ингибирования для грамотрицательных и грамположительных бактерий, соответственно. «Флуконазол» использовали в качестве стандартного ингибитора гриба для С. albicans и С. neoformans. «Тамоксифен» использовали в качестве положительного стандарта цитотоксичности. «Мелиттин» использовали в качестве положительного гемолитического стандарта.

Методика тестирования противомикробной, фунгицидной, цитотокси-ческой и гемолитической активности in vitro соединений приведена также на сайте http://www.co-add.org.

Образцы (2Z)-2-((3β,4α,8α,11α,14β,l6β)-16-(ацетилокси)-3-{[3-({4-[(3-аминопропил)амино]бутил}амино)пропил]амино}-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден)-6-метилгепт-5-еновой кислоты (1) и метил (2Z)-2-((3β,4α,8α,11α,14β,16β)-16-(ацетилокси)-3-{[3-({4-[(3-аминопропил)амино]бутил}амино)пропил]амино}-11-гидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден)-6-метилгепт-5-еноата (2) в концентрации 4.0 и 2.0 мкг/мл, соответственно, показали высокую противомикробную активность, ингибируя рост и размножение > 98% грамположительных бактерий Staphylococcus aureus. Соединение (2) в концентрации 1.0 мкг/мл проявило высокую фунгицидную активность по отношению к грибковой культуре Cryptococcus neoformans, подавляя рост > 86% данного патогенного микроорганизма. В концентрации 32.0 мкг/мл соединения (1) и (2) ингибируют размножение > 95% грамотрицательных бактерий Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, а также грибковых культур Cryptococcus neoformans и Candida albicans, что, по критериям CO-ADD, является слабовыраженной противомикробной активностью. Цитотоксичность производных (1) и (2) выше таковой у фузидовой кислоты в 2.5 раза, а гемолитическая активность не превышает 15% при максимально тестируемой концентрации >32 мкг/мл, что сравнимо с аналогичной активностью нативного антибиотика.

Таким образом, N,N'-бис(3-аминопропил)бутан-1,4-диаминопроизводные фузидовой кислоты (1) и (2) проявляют антибактериальную активность в отношении патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus и грибковой культуры Cryptococcus neoformans, обладая минимальным гемолитическим действием при максимально тестируемой концентрации, проявляя высокую цитотоксическую активность в отношении клеточной линии эмбриональных почек человека HEK293.