Результат интеллектуальной деятельности: Способ применения комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба для оценки уровня противочумного иммунитета

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано при проведении оценки уровня противочумного иммунитета.

Для большинства инфекций, в том числе и чумы, где основную роль играет клеточный иммунитет, защитные уровни клеточных реакций у людей не определены, что обуславливает продолжающийся поиск биомаркеров, свидетельствующих о напряженности противочумного иммунитета.

В этой связи важным критерием эффективности, отражающим клеточное звено противочумного иммунитета, является перераспределение в соотношении Т- и В-лимфоцитов и регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов, имеющих маркеры: CD3 (общий для всех Т-лимфоцитов), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-цитотоксические), CD19 (В-лимфоциты) [Богачева Н.В., Дармов И.В., 2013; Богачева Н.В., Крючков А.В., 2013], маркер ранней активации клеток CD25; CD69 [Фирстова В.В. и др., 2010], спонтанная и индуцированная продукция маркерных Th1- и Th2-цитокинов [Щуковская Т.Н. и др., 2011].

Известен способ диагностики иммунного статуса путем активации базофилов антраксином для диагностики сибирской язвы [Использование теста активации базофилов с антраксином для лабораторной (IN VITRO) диагностики сибирской язвы / А.Н. Куличенко, Е.Л. Ракитина, Д.Г. Пономаренко, О.В. Логвиненко, А.Г. Рязанова // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - №3 (113). - С. 86-88. - Библиогр.: 6-рус; 2-ин.].

Недостатком способа является возможность использования его только при конкретной инфекции - сибирской язве.

Наиболее близким является способ оценки бласттрансформации лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии при специфической активации антигеном на примере больных бруцеллезом. [Патент РФ 2582395, опубл. 27.04.16, Бюл. №12].

Недостатком способа является узкоспецифичность метода, позволяющая использовать его только при бруцеллезной инфекции.

Цель изобретения - применение комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба (ВрАг) в качестве активатора лимфоцитов в антигенспецифических клеточных тестах in vitro с использованием технологии проточной цитометрии.

Любой вакцинный препарат должен обладать иммуногенными свойствами - вызывать достаточный по напряженности и длительности иммунитет. Использование антиген-стимулированных клеточных тестов in vitro перспективно для оценки иммунологической эффективности вакцинации. При этом диагностически информативным показателем клеточной антигенреактивности выступает маркер (рецептор) активации лимфоцитов CD25 - высокоаффинный рецептор интерлейкина 2 (IL-2Ra), экспрессирующийся активированными Т-лимфоцитами.

Технический результат изобретения достигается тем, что для оценки динамики субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих рецептор CD25, в качестве специфического антигена использовали комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба. Объектом исследования служили добровольцы, иммунизированные против чумы по эпидемическим показаниям. Взятие биоматериала (крови) у обследуемых осуществляли до вакцинации и на 21 сутки после иммунизации (пик иммуногенеза).

Оценку у вакцинированного контингента уровня Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы CD25 на 21 сутки после вакцинации, проводили методом проточной цитометрии после стимуляции в условиях in vitro комплексом водорастворимых антигенов чумного микроба с разными концентрациями белка.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием пакета компьютерных программ Microsoft Excel. Достоверность различия средних рассчитывали по t-критерию, уровень значимости р выбран менее 0,05.

Все обследуемые дали добровольное информированное согласие на участие в настоящих исследованиях (согласно Федеральному закону «Об основах охраны здоровья граждан в РФ» от 21.11.2011 №323-ФЗ, ред. от 03.08.2018).

Методика приготовления проб

Для проведения исследования полученного клинического материала используют две пластиковые пробирки, объем 5 мл. Пробирки маркируют соответственно №1 и №2. В каждую пробирку вносят по 300 мкл питательной среды RPMI-1640 с пенициллином, из расчета 20 ед/мл и добавляют по 100 мкл стабилизированной крови обследуемого. Для выявления уровня спонтанной активации использовали стерильный изотонический раствор NaCl.

В пробирку №1 вносят 50 мкл стерильного изотонического раствора NaCl. В пробирку №2 - 50 мкл комплекса ВрАг. Пробирки инкубируют 20 часов при температуре (37±1)°С, в условиях повышенного содержания СО₂ (8±2) %. Удаляют надосадочную жидкость. Осадок в количестве 50 мкл переносят в пробирки Falcon для проточного цитометра. В каждую пробирку добавляют 2 мкл моноклональных антител против CD25. Образцы выдерживают 20 мин при температуре (21±1)°С без доступа света. Затем в каждую пробирку вносят по 450 мкл рабочего раствора для лизиса эритроцитов. После 15 минутной экспозиции при температуре (21±1)°С (контроль лизиса эритроцитов), пробы центрифугируют при 250 g 5 минут. Полученный осадок ресуспендируют в 400 мкл Cell Wach (жидкость для разведения клеточной суспензии).

Учет результатов проводят с помощью проточного цитометра FACS Calibur с программным обеспечением Cell Quest Pro.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1.

Обследовали 17 добровольцев иммунизированных против чумы вакциной чумной живой из штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ (производство ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора). Для активации лимфоцитов использовали комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 2,5 мг/мл.

Исследования интенсивности экспрессии лимфоцитов до вакцинации показали, что активация Т-лимфоцитов при воздействии ВрАг не наблюдается. К 21 суткам при активации клеток комплексом водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 2,5 мг/мл отмечается незначительная активация лимфоцитов - до 16,31±0,52%, что говорит о недостаточном количестве специфического агента в ВрАг.

Пример 2.

Обследовали 17 добровольцев иммунизированных против чумы вакциной чумной живой из штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ (производство ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора). Для активации лимфоцитов использовали комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл.

Исследования интенсивности экспрессии лимфоцитов до вакцинации показали, что активация Т-лимфоцитов при воздействии ВрАг не наблюдается. На 21 сутки при активации клеток комплексом водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл отмечается статистически достоверное повышение интенсивности экспрессии лимфоцитами рецептора CD25, исследуемый показатель имел двукратное увеличение, по сравнению со значением до вакцинации, составив в среднем 27,92±1,82% (р≤0,05). Спонтанной активации лимфоцитов при воздействии стерильного изотонического раствора NaCl (контроль) не зафиксировано. Результаты исследования представлены в таблице.

Пример 3.

Обследовали 17 добровольцев иммунизированных против чумы вакциной чумной живой из штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ (производство ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора). Для активации лимфоцитов использовали комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 9,0 мг/мл.

Исследования интенсивности экспрессии лимфоцитов до вакцинации показали, что активация Т-лимфоцитов при воздействии ВрАг не наблюдается.

На 21 сутки при активации клеток комплексом водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 9,0 мг/мл наблюдается незначительная активация лимфоцитов - до 14,22±0,31%, что говорит о блокировке рецепторов большим количеством белка в комплексе водорастворимых антигенов.

Таким образом, комплекс водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл обладает наибольшим стимулирующим потенциалом in vitro в отношении иммунных лимфоцитов по маркеру CD25.

Заявленная возможность применения комплекса водорастворимых антигенов чумного микроба с концентрацией белка 4,5 мг/мл в качестве активатора лимфоцитов в антигенспецифических клеточных тестах in vitro с использованием технологии проточной цитометрии (пример №2) показывает оптимальную специфичность реакции при оценке противочумного иммунитета.