СИСТЕМА ДЛЯ СТАБИЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ОПУХОЛЬ-АССОЦИИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ НА ОСНОВЕ ЛЕНТИВИРУСНОГО ВЕКТОРА

Изобретение относится к области биотехнологии. Может быть использовано для экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов с их последующим включением в эндосому через систему комплекса гистосовместимости МНС II.

Ежегодно в мире от злокачественных новообразований умирает около 7 млн. человек. По данным ВОЗ онкологические заболевания по частоте встречаемости стоят на 2 месте, а в некоторых промышленно развитых регионах - на первом месте. Традиционно до недавнего времени основными методами лечения считались: хирургический, цитотоксическая химиотерапия и лучевая терапия.

Достижения иммунологической науки за последние годы привели к созданию принципиально новых подходов и методов терапии онкологических заболеваний.

Так, уже более 40 лет тому назад было показано, что многие опухоли иммуногенны. Однако цитотоксические Т-лимфоциты не активируются при появлении раковых клеток и их специфических антигенов и не способны секретировать цитокины, которые они секретируют при встрече с чужеродными антигенами. Поэтому одна из стратегий борьбы с опухолями заключается в стимулировании иммунной системы к узнаванию опухолевых клеток.

В частности, были предприняты попытки создания индивидуальных противоопухолевых вакцин (А.Ю. Барышников, Принципы и практика вакцинотерапии рака, Бюллетень СО РАМН, №2(112). 2004, стр. 59-63).

В настоящее время значительное внимание уделяется применению дендритных клеток и препаратов (вакцин) на их основе.

Дендритные клетки являются профессиональными антиген-презентирующими клетками (АПК) и играют ключевую роль в формировании первичного иммунного ответа. Важной особенностью дендритных клеток является их способность захватывать из окружающей среды различные антигены при помощи пино- и эндоцитоза. После поглощения антигена дендритные клетки мигрируют в лимфоидные органы, где презентируют антигенные детерминанты в контексте главного комплекса гистосовместимости (МНС) различным популяциям Т-лимфоцитов. Существует два типа рецепторов главного комплекса гистосовместимости. Рецепторы МНС I экспрессируются во всех ядерных клетках организма, осуществляя механизм распознавания «свой-чужой» и презентируют эндогенные антигены, такие как вирусные или раковые антигены. В данном случае связывание рецептора и антигена происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Рецепторы МНС II экспрессируются антигенпрезентирующими клетками и другими типами клеток крови, например В-клетками, и презентируют экзогенные антигены, поглощенные в результате эндоцитоза. В отличие от МНС I, связывание МНС II и антигена происходит в области эндосомы. В случае МНС I презентация чужеродного антигена, например, вирусного пептида, вызывает активацию CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов и приводит к немедленному иммунному ответу. В результате происходит уничтожение зараженной клетки. Презентация чужеродного экзогенного пептида молекулами комплекса МНС II вызывает активацию как CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, так и активацию CD4+ хэлперных Т-лимфоцитов, что приводит к возникновению механизма «иммунной памяти». Такой механизм характеризуется возникновением популяции В-лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела и популяции более специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов, нацеленных на чужеродный антиген.

Известен способ индукции высокого уровня CD4+ и CD8+ Т-клеточного ответа и специфических типов цитокинов с целью достижения высокого уровня защиты и терапевтической активности за счет иммуногенных HER2-специфичных конструкций полиэпитопа, содержащих CTL и/или эпитопы Th и оптимизированные последовательности спейсера. Конструкции могут использоваться для продуцирования антигенпредставляющих клеток, например, дендритных клеток (DC), для представления желаемых эпитопов лимфоцитам (заявка ЕА 201290813 (А1), опубл. 2013-04-30).

Известен способ экспрессии полиэпитопных опухоль-ассоциированных антигенов в дендритных клетках, способных стимулировать специфические цитотоксические клетки, основанный на использовании рекомбинантной плазмидной ДНК pCI-UB-POLYEPI, которая содержит 11 эпитопов опухоль-ассоциированных антигенов колоректального рака, имеет размер 6355 п.н. (патент РФ 2507265, опубл. 20.02.2014). Данный источник может быть указан в качестве ближайшего аналога-прототипа.

Задачей изобретения является создание системы, способной включать специфические антигенные детерминанты через систему комплекса МНС II, что позволяет значительно расширить возможности применения дендритных клеток пациента, и тем самым увеличить эффективность противораковой терапии.

Задача решается ДНК конструкцией на основе лентивирусого вектора для экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов с последующим их транспортом в эндосому через систему комплекса МНС П.

Предлагаемые плазмидные лентивирусные конструкции включают последовательность инвариантного домена CD74/Ii комплекса МНС II, в качестве лидирующей сигнальной области, присоединенной к целевым полипептидам (антигенам). CD74/Ii выступает в роли сигнальной последовательности, направляющей транспортировку комплекса МНС II в эндосомальный компартмент.

Техническим результатом изобретения является создание универсальной лентивирусной системы, позволяющей транспортировать широкий спектр слитых белков-антигенов в эндосому, где они будут расщеплены и презентированы молекулами комплекса МНС II.

В отличие от случая с комплексом МНС I, МНС II препятствует присоединению эндогенных пептидных молекул в области шероховатого ЭПР (эндоплазматического ретикулума). Также CD74/Ii выступает в роли сигнальной последовательности, направляющей транспортировку комплекса МНС II в эндосомальный компартмент. В эндосоме МНС II претерпевает протеолитическое расщепление, в результате которого происходит отщепление Ii домена и присоединение уже протеолизированных экзогенных пептидов (антигенов). Таким образом, использование последовательности CD74/Ii в качестве лидирующей сигнальной области, присоединенной к целевым полипептидам (антигенам), экспрессированным с плазмидных ДНК или из генома дендритной клетки, позволит транспортировать такие слитые белки в эндосому, где они будут расщеплены и презентированы молекулами комплекса МНС II.

Согласно изобретению экспрессии может подлежать широкий спектр опухоль-ассоциированных антигенов, например: СБА, TGF-PRII (колоректальная карцинома), TAG-72 (карцинома простаты), HPV Е6, Е7 (цервикальная карцинома), BING-4, SSX-2, TRP-1/-2 ( меланома), Cyclin-B1, EphA3, Her2/neu (мульти рак), Ер-САМ (рак груди), простато-специфический антиген (рак простаты), BRCA1/2 (карцинома груди и яичников), MUC1 ( дуктальная карцинома), Ig, ТСЯ(лимфома) и т.п.

Для доставки последовательностей антигенов, слитых с сигнальными последовательностями CD74/Ii цепей, в антигенпрезентирующие дендритные клетки использована методика лентивирусного переноса целевых последовательностей.

Использование лентивирусных векторов имеет несколько значительных преимуществ по сравнению с такими подходами, как трансфекционный перенос плазмидных ДНК или электропорирование клеток ДНК конструкциями:

- лентивирусные векторы способны быстро интегрироваться в геном клетки-мишени, обеспечивая стабильную экспрессию трансгена;

- лентивирусные векторы позволяют клонировать достаточно длинные последовательности ДНК до 10 т.п.о, при этом сохраняют высокий уровень упаковки вирусных частиц и свою трансдукционную способность;

- лентивирусные векторы обладают широким тропизмом за счет внедрения типирующих белков в оболочку вирусных частиц. Данное свойство позволяет значительно увеличить трансдукционную способность вируса для определенного типа клеток, что крайне важно в работе с труднотрансфецируемыми первичными культурами клеток крови;

- лентивирусные векторы позволяют доставить ДНК даже в труднотрансфецируемые, неделящиеся клетки, в том числе, первичные дифференцированные клетки, такие как дендритные клетки и лимфоциты.

В качестве основного генетического каркаса, формирующего лентивирусную векторную систему использовалась ранее сконструированная нами универсальная плазмидная лентивирусная ДНК конструкция (Фиг. 1). Изображение иллюстрирует схему плазмидной лентивирусной ДНК-конструкции pLA-CMV-ELuc-puro.

В состав данной плазмиды входит ряд ключевых генетических элементов:

- AmpR - последовательность устойчивости к ампициллину, необходимая для амплификации плазмидной ДНК в клетках бактериального штамма E. coli;

- HIV 5' и 3' LTR - длинные концевые повторы ретровирусов (в частности, вируса иммунодефицита человека), обеспечивают встраивание последовательности генома вируса в геном клетки хозяина;

- сРРТ (central polypurine tract) - центральный полипуриновый тракт, способствует встраиванию ДНК вируса в геном митотически неактивных клеток;

- CMV - промотерный регион, обеспечивает стабильный и высокий уровень экспрессии 3' нижележащей последовательности ДНК;

- NLuc - участок N-концевой области люциферазы, на 5' и 3' концах содержит ряд консенсусных участков, распознаваемых ферментами рестрикции-модификации;

- WPRE (Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element) - энхансерный регион, способствует повышению уровня экспрессии целевых белков.

Презентация опухоль-ассоциированных антигенов, опосредованная молекулами главного комплекса гистосовместимости II, напрямую зависит от эффективного переноса новоэксперссированного антигена в область эндосомального компартмента. В связи с тем, что одним из основных регуляторов транспортировки МНС II в эндосому является белок CD74/Ii, который используют в качестве сигнальной последовательности, направляющей антиген в эндосому. Однако, большая часть последовательности полипептида служит для формирования особой пространственной структуры белка, необходимой для его взаимодействия с молекулой МНС II. За саму транспортировку CD74 отвечает лишь небольшая функциональная область, которая может использоваться отдельно.

Более того, в данный N-концевой домен может входить несколько вариантов еще более коротких последовательностей, отвечающих за перенос CD74/Ii-MHC II. Для определения сигнальной последовательности, приводящей к наилучшей загрузке в МНС II было протестировано несколько вариантов сигнальных пептидов CD74/Ii-рецептора.

Для амплификации была использована серия праймеров (табл). Изображение иллюстрирует последовательности праймеров для амплификации различных сигнальных участков N-концевого домена инвариантной цепи.

Схема последовательности белка CD74 с отмеченными участками сигнальных пептидов эндосомальной локализации представлена на фиг. 2

В качестве наиболее оптимального варианта отобран удлиненный вариант сигнального участка Ii key (далее в тексте обозначается как "Ii key long"). В качестве опухолевого антигена используют белок ERBB2 (HER2/neu). Рецептор ERBB2 является одним из высокоспецифичных онкологических маркеров, за счет того, что повышенная амплификация и экспрессия данного рецептора характерна для ряда агрессивных типов рака молочной железы и некоторых других видов злокачественных опухолеобразований. Рецептор также ERBB2 является одним из самых больших специфичных опухолевых антигенов, поэтому успешная презентация антигенных детерминант такой молекулы позволит судить об успешности загрузки остальных опухоль-ассоциированных антигенов.

Таким образом, получена лентивирусная ДНК-конструкция, несущая в своем составе последовательность опухоль-ассоциированного антигена ERBB2/HER2 и последовательность сигнального участка гена CD74, обеспечивающего транспорт данного антигена в эндосому (фиг. 3). Изображение иллюстрирует схему лентивирусной плазмидной ДНК конструкции pLA-CMV-Ii-key-long-ERBB2, содержащей последовательность сигнального участка Ii key long. Данная конструкция является одним из предпочтительных, но не ограничивающих изобретение вариантов.

Изобретение иллюстрировано следующим графическим материалом:

Фиг. 1 - Схема плазмидной лентивирусной ДНК-конструкции pLA-CMV-ELuc-puro

Фиг. 2 - Схема последовательности белка CD74 с отмеченными участками сигнальных пептидов эндосомальной локализации

Фиг. 3 - Схема лентивирусной плазмидной ДНК конструкции pLA-CMV-Ii-key-long-ERBB2, содержащей последовательность сигнального участка Ii key long.

Табл. - Последовательности праймеров для амплификации различных сигнальных участков N-концевого домена инвариантной цепи.

SEQ ID№1 CD74 N-концевой участок

Нуклеотидная последовательность

ATGGATGACCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCCGGCTGGACAAACTGACAGTCACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCAAGCCTGTGAGCAAGATGCGCATGGCCACCCCGCTGCTGATGCAGGCGCTGCCCATGGGAGCCCTGCCCCAGGGGCCCATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTGAAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACTGGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCACTGACGCTCCACCG

Аминокислотная последовательность

MDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPP

SEQ ID №2 Ii-ER сигнальная последовательность

Нуклеотидная последовательность

ATGGATGACCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGC

Аминокислотная последовательность

MDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSR

SEQ ID №3 Ii key сигнальная последовательность

Нуклеотидная последовательность

CTGCGCATGAAG

Аминокислотная последовательность

LRMK

SEQ ID №4

Ii key long (удлиненная сигнальная последовательность)

Нуклеотидная последовательность

CTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCAAG

Аминокислотная последовательность

LRMKLPKPPK

SEQ ID №5 CLIP сигнальная последовательность

Нуклеотидная последовательность

CCTGTGAGCAAGATGCGCATGGCCACCCCGCTGCTGATGCAGGCG

Аминокислотная последовательность

PVSKMRMATPLLMQA