ПРИМЕНЕНИЕ ПОРИСТОЙ КАПИЛЛЯРНОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ПО ТИПУ КАТЯЩЕГОСЯ КОЛЬЦА

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент США с серийным номером 1507376.0, поданной 30 апреля 2015 года, которая включена в настоящий документ во всех своих смыслах.

Уровень техники

Неинвазивное пренатальное тестирование с использованием образца материнской крови или другого образца, полученного неинвазивно от беременной женщины, предоставляет информацию о патологическом или здоровом состоянии плода. Раннее определение патологического или здорового состояния плода позволяет проводить целенаправленные вмешательства и лечение.

Амплификация по типу катящегося кольца (АКК) пригодна для анализа внеклеточной ДНК в материнской крови. Однако количественное определение продуктов АКК со статистической надежностью может представлять сложности. На практике, несмотря на то, что абсолютное количество продуктов в реакции АКК может быть достаточно большим для обеспечения статистической надежности, молярная концентрация специфических ампликонов АКК в реакции может быть довольно низкой, что ограничивает типы способов, которые можно применять для их количественной оценки. Например, продукты АКК в образце можно, теоретически, обнаружить путем мечения продуктов АКК, нанесения образца на поверхность предметного стекла и подсчета количества меченых продуктов на стекле. Однако только помещение раствора, содержащего меченые продукты АКК, на предметное стекло, обеспечение возможности меченым продуктам АКК диффундировать на поверхность и последующий подсчет количества меченых продуктов АКК, которые прикреплены к стеклу, занимает несколько часов, кроме того, не все меченые продукты АКК достигают стекла и доступны подсчету.

В настоящем документе описано применение фильтрации на твердой подложке для количественного определения меченых продуктов АКК. Как будет описано более подробно ниже, с помощью предлагаемых способов можно оптимизировать анализ образцов, содержащих продукты АКК.

Краткое описание сущности изобретения

В настоящем изобретении предлагается способ анализа образцов. В некоторых вариантах реализации изобретения способ может включать: (a) фильтрование жидкого образца, содержащего продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК), с применением пористой капиллярной мембраны, с помощью которого получают массив продуктов АКК на мембране; при этом образец содержит по меньшей мере первую совокупность продуктов АКК и вторую совокупность продуктов АКК, причем первая и вторая совокупности меченых продуктов АКК различаются по метке; и (b) определение количества первой меченой совокупности продуктов АКК и количества второй меченой совокупности продуктов АКК в области мембраны. В некоторых вариантах реализации изобретения этап определения может включать подсчет количества первых и вторых меченых продуктов АКК в указанной области. В других вариантах реализации изобретения этап определения может включать обнаружение совокупного сигнала из указанной области. В любом случае с помощью предлагаемого способа можно осуществить оценку количества первых и вторых совокупностей АКК в образце.

В зависимости от того, как предлагаемый способ будет реализован, посредством применения пористой капиллярной мембраны можно осуществить количественную оценку по существу всех продуктов АКК в образце (а не только тех, которые распространяются по поверхности предметного стекла), а это, в свою очередь, повышает точность, чувствительность и воспроизводимость анализа. Кроме того, применение пористой капиллярной мембраны позволяет проводить анализ в течение минут, а не часов, по сравнению с некоторыми альтернативными способами, которые, как отмечено выше, могут включать пипетирование образца на предметное стекло с последующей инкубацией стекла в течение длительного периода времени с той целью, чтобы продукты АКК распространились и прилипли к поверхности стекла. В соответствии с этим, в экспериментальном разделе настоящей заявки сообщено, что реализация на практике настоящего способа может привести к тому, что по меньшей мере в 2,5 раза больше продуктов АКК можно подсчитать через 90 секунд (что равно времени, затрачиваемому на размещение образца поверх мембраны с последующим проведением образца через мембрану) по сравнению с периодом инкубации на предметном стекле, составляющим 16 часов. Кроме того, применение мембраны может снизить фон, позволяя потенциальным источникам фона (например, молекулам флуоресцентного олигонуклеотида, которые не гибридизованы с продуктом АКК, или тому подобное) проходить через мембрану (особенно, если мембрану промывают после применения продуктов АКК).

Указанный способ находит свое применение при анализе образцов, которые имеют относительно широкий диапазон концентраций продуктов АКК (например, продукты от 10 до 10M в объеме от 50 мкл до 200 мкл или более), и во многих случаях могут иметь относительно низкую концентрацию, поскольку, как упоминалось выше, мембрана служит для концентрирования продуктов АКК на своей поверхности. Другими словами, без применения мембраны и с использованием вместо нее альтернативного подхода, образец 50 мкл будет распространяться по поверхности предметного стекла микроскопа, и даже если бы можно было индуцировать связывание всех продуктов АКК со стеклом, продукты АКК были бы пространственно отделены друг от друга на стекле, в результате чего одно поле зрения содержало бы недостаточное количество продуктов АКК, тем самым обуславливая трудоемкость и неэффективность их количественной оценки с помощью микроскопии или других средств с какой-либо достаточной точностью. В зависимости от того, как реализуется указанный способ, мембрана может служить для концентрирования и поддержания продуктов АКК, в то же время обеспечивая возможность промывания продуктов АКК с целью снижения фона. Кроме того, мембрана может служить в качестве стекла для микроскопа, особенно если она прозрачна или может стать прозрачной при добавлении смачивающего агента.

Таким образом, настоящий способ, как полагают, обеспечивает быстрый, высокоточный, чувствительный и воспроизводимый путь определения в образце количества продукта АКК – продукта, который сам по себе уже получен без систематической погрешности, в том смысле, что каждая молекула-мишень представлена только одним продуктом АКК (в отличие от ПЦР, в которой каждая молекула-мишень амплифицируется до неизвестного количества копий, а разные молекулы-мишени амплифицируются в разных количествах). Таким образом, настоящий способ метод может оказаться неоценимым для применений, при которых необходимы быстрые, точные и правильные измерения содержания молекул ДНК в образце. В частности, настоящий способ может быть пригоден для неинвазивного пренатального тестирования, для которого являются крайне важными быстрые, точные и правильные измерения содержания молекул ДНК относительно низкой концентрации, которые находятся в бесклеточной фракции материнского кровотока.

Эти и другие потенциальные характеристики и преимущества будут очевидны после ознакомления со следующим описанием.

Краткое описание графических материалов

Специалисту в данной области техники будет понятно, что графические материалы, описанные ниже, представлены только в иллюстративных целях. Графические материалы не предназначены для ограничения сферы применения настоящего изобретения каким-либо образом.

Фиг. 1 схематично иллюстрирует некоторые из этапов настоящего способа.

Фиг. 2 схематично иллюстрирует некоторые из принципов настоящего способа.

Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий количество отсчетов на изображение по оси y и образцы, время инкубации и тип планшета (из стекла или оксида алюминия) по оси x.

Фиг. 4 представляет собой гистограмму, демонстрирующую некоторые результаты экспериментов, описанных в Примере 2.

Фиг. 5 представляет собой график соотношений между числом отсчетов для двух каналов относительно композиции смеси клеточных линий.

Подробное описание сущности изобретения

Прежде чем приступить к ознакомлению с различными описанными вариантами реализации, следует понять, что способы этого изобретения не ограничиваются конкретными описанными вариантами реализации и, как таковые, могут, конечно, изменяться. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, приводится только в целях описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие описанный объект изобретения каким-либо образом. Хотя настоящее изобретение описано в сочетании с различными вариантами его реализации, не предполагается, что настоящее изобретение будет ограничиваться приведенными вариантами реализации. Напротив, настоящее изобретение охватывает различные альтернативы, модификации и эквиваленты, которые будут понятны специалистам в данной области техники.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, что и общедоступное обычному специалисту в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, также могут быть использованы на практике или при испытании настоящего изобретения, на данный момент описаны некоторые типовые способы и материалы.

Ссылка на любую публикацию предназначена для ее описания до даты подачи заявки и не должна толковаться как признание того, что настоящие заявки не имеют права датировать задним числом такую публикацию в силу действия предшествующего изобретения. Кроме того, даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

Как будет очевидно специалистам в данной области техники после прочтения этого описания, каждый из отдельных вариантов реализации, описанных и проиллюстрированных в настоящем документе, имеет дискретные компоненты и характеристики, которые могут быть легко отделены или объединены с характеристиками любого из нескольких других вариантов реализации без отступления от объема или сущности данного изобретения. Любой описанный способ может быть осуществлен в указанном порядке или в любом другом порядке, который логически возможен.

Все патенты и публикации, включая все последовательности, описанные в таких патентах и публикациях и упоминаемые в настоящем документе, безоговорочно включены посредством ссылки в данное описание.

Перед более подробным описанием типовых вариантов реализации изобретения, излагаются следующие значения, иллюстрирующие смысл и объем терминов, используемых в настоящем документе.

Следует отметить, что в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественное число, если из контекста явно не следует иное. Например, термин "праймер" относится к одному или более праймерам, т.е. к одному праймеру и множеству праймеров. Следует также отметить, что формула изобретения может быть составлена для того, чтобы исключить любой необязательный элемент. Таким образом, это утверждение, как предполагается, служит в качестве предшествующей основы для использования такой особой терминологии, как "исключительно", "только" и тому подобное, в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использования "отрицательного" ограничения.

В данном контексте термин "фильтрование" включает процесс перемещения жидкости, которая содержит аналиты (например, продукты амплификации по типу катящегося кольца), через фильтр, таким образом, что некоторые аналиты удерживаются фильтром. При фильтровании по меньшей мере часть жидкости переносится с одной стороны фильтра на другую.

В данном контексте термин "амплификация по типу катящегося кольца" или "АКК" включает изотермическую амплификацию, которая генерирует линейные конкатемерированные копии кольцевой матрицы нуклеиновой кислоты с помощью сдвигающей цепь полимеразы. Способ АКК хорошо известен в области молекулярной биологии и описан в различных публикациях, включая, но не ограничиваясь ими, Lizardi et al (Nat. Genet. 1998 19: 225-232), Schweitzer et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 2000 97: 10113-10119), Wiltshire et al (Clin. Chem. 2000 46: 1990-1993) и Schweitzeretal (Curr. Opin. Biotech 2001 12: 21-27), которые включены в данный документ посредством ссылки.

В данном контексте термин "продукты амплификации по типу катящегося кольца" включает конкатемерированные продукты реакции амплификации по типу катящегося кольца. В данном контексте термин "флуоресцентно меченые продукты амплификации по типу катящегося кольца" относится к продуктам амплификации по типу катящегося кольца, которые являются флуоресцентно мечеными, например, посредством гибридизации флуоресцентно меченого олигонуклеотида с продуктами амплификации по типу катящегося кольца или с помощью других способов (например, путем включения флуоресцентного нуклеотида в продукт во время амплификации).

В данном контексте термин "пористая капиллярная мембрана" включает мембраны, которые имеют относительно плотно скомпонованные отдельные капилляры, которые охватывают толщину мембраны, т.е. которые простираются от одной стороны мембраны к другой, тем самым обеспечивая прохождение жидкости, но не частиц, с одной стороны мембраны к другой. Примеры пористых капиллярных мембран включают, но не ограничиваются ими, например, мембраны из анодированного оксида алюминия (см. ниже), наноканальные стеклянные мембраны, трековые мембраны и политетрафторэтилен. Наноканальные стеклянные мембраны изготовлены из стекла и имеют высокую плотность однородных каналов диаметром от 15 микрон до 15 нанометров (см., например, Tonucci et al., Advances in Nanophotonics II, AIP Conference Proceedings, 2007 959: 59-71; Pearson et al, Science 1995 270: 68-70 и Tonucci et al., Science 1992 258: 783-785, а также патенты США 5306661; 5332681; 5976444; 6087274; 6376096; 6483640 и 6599616, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Трековые мембраны изготовлены из прозрачного полимера (например, поликарбоната, полиэтилентерефталата или полиимида и т.п.), содержащего поры с диаметром в диапазоне от 0,01 до 30 мкм, которые получают с помощью комбинации бомбардировки заряженных частиц (или облучения) и химического травления. Другие представляющие интерес пористые мембраны включают, но не ограничиваются ими, аморфные фторполимеры, такие как NAFION™, TEFLON AF™, FEFLON FEIP™ и CYTOP™ (DuPont Fluoroproducts, Феетвиль, штат Северная Каролина). Как можно определить, пористая капиллярная мембрана может иметь поверхность (например, покрытие или химически модифицированную поверхность), которая отличается от материала, из которого изготовлена сама мембрана. Например, поверхность пористой капиллярной мембраны может иметь измененные характеристики заряда или измененную гидрофобность или гидрофильные характеристики. В некоторых вариантах реализации изобретения поверхность может быть покрыта аминосиланом, полилизином или другим соединением с целью обеспечения положительного заряда, который помогает удерживать продукты АКК на поверхности. В альтернативном или дополнительном варианте поверхность может иметь тонкие слои металла (например, титана, золота), нанесенные на неё, которые могут быть связаны с другими агентами, модифицирующими поверхностные свойства фильтра.

В данном контексте термин "мембрана из анодированного оксида алюминия" включает регулярную самоорганизованную нанопористую мембранную структуру, которая образуется при анодировании Al в определенных кислотных средах. Внутренний диаметр пор в мембране, расстояние между центрами соседних пор в мембране, а также расстояние между краями соседних пор в мембране можно контролировать с помощью напряжения осаждения, типа кислоты и других параметров. Во влажном состоянии мембрана из анодированного оксида алюминия практически прозрачна. Мембрана из анодированного оксида алюминия, ее свойства и способы изготовления подобных мембран подробно рассматриваются в различных публикациях, включая, но не ограничиваясь ими: Li et al (Chem. Mater 1998 10: 2470-2480), Santos et al (Trends on Analytical Chemistry 2013 44: 25-38), Ingham et al (Biotechnology Advances 30 2012 1089-1099) и Poinern et al. (Materials 2011 4: 487-526), которые включены в описание настоящего изобретения посредством ссылки. Мембраны из анодированного оксида алюминия коммерчески доступны под торговым названием ANOPOR ™, например, от компании SPI Supplies (Вест Честер, штат Пенсильвания) и других компаний, таких как Sykera Technolgoies Inc (Лонгмонт, штат Колорадо) и Signma-Aldrich Сент-Луис, штат Миссури) и могут быть приобретены с опорным кольцом.

Используемый в настоящем документе термин "площадь" в контексте области мембраны или области изображения включает смежную или несмежную область. Например, если способ включает определение количества меченых продуктов АКК в области, например, подсчет количества меченых продуктов АКК в области, область, в которой продукты АКК количественно определяются, может быть одиночным, смежным пространством или множеством несмежных пространств.

В данном контексте термин "визуализация" включает процесс, посредством которого оптические сигналы с поверхности объекта обнаруживаются и сохраняются как данные, связанные с местоположением (т.е. "пиксели"). Из этих данных можно восстановить цифровое изображение объекта. Область мембраны может быть отображена с помощью одного изображения или одного или более изображений.

В данном контексте термин "отдельно меченые продукты АКК" включает отдельные молекулы АКК, которые являются мечеными.

В данном контексте термин "определение количества" включает способы, в которых учитываются отдельно выделенные продукты АКК, а также способы, которые включают измерение совокупного сигнала из множества продуктов АКК. В способах, которые включают измерение интенсивности совокупного сигнала, отдельные продукты АКК выделять нет необходимости. Количество продуктов АКК может быть выражено с помощью любого пригодного устройства. В некоторых случаях количество продуктов АКК может быть выражено как количество отдельно выделенных продуктов АКК, которые подлежат подсчету.

В данном контексте термин "подсчет" включает определение количества отдельных объектов в большем наборе. В вариантах реализации изобретения процесс "подсчета" требует обнаружения отдельных сигналов от отдельных объектов во множестве (а не общего сигнала от множества объектов), с последующим определением количества объектов, присутствующих во множестве, путем подсчета отдельных сигналов. В контексте настоящих способов "подсчет" может быть выполнен путем определения количества отдельных сигналов в массиве сигналов.

В данном контексте термин "прозрачный" включает состояние, в котором объект оптически прозрачен при используемой длине волны. При флуоресцентной микроскопии "прозрачный" означает, что объект будет прозрачным для одного или обоих спектров возбуждения и излучения флуорофора. Как будет описано более подробно ниже, некоторые мембраны прозрачны только во влажном состоянии. Такие мембраны считаются прозрачными мембранами, хотя сухая форма этих мембран может быть не прозрачной.

В данном контексте термин "массив" применительно к массиву продуктов АКК включает набор одиночных продуктов АКК на плоской поверхности, при этом продукты АКК пространственно отделены друг от друга на плоскости поверхности (насколько это допустимо согласно закону распределения Пуассона для массива, являющегося действительно случайным). Термин "случайный" массив включает массив, в котором элементы, например, продукты АКК, распределены на поверхности подложки в положениях, которые предварительно не заданы. В некоторых случаях распределение продуктов АКК на случайном массиве может быть описано статистикой Пуассона, так что, например, распределение расстояний между продуктами АКК случайного массива может быть аппроксимировано с применением распределения Пуассона. Другими словами, продукты АКК могут быть распределены случайным образом на мембране, т.е. без каких-либо предопределенных местоположений.

Другие значения этих и других терминов могут встречаться во всем описании.

Перед ознакомлением с детальным описанием настоящего способа, следует учесть, что данный способ может быть реализован с применением любого типа подложки для захвата, которая может функционировать как фильтр для продуктов АКК. Такие подложки для захвата должны иметь низкий фоновый сигнал при длинах волн, применяемых в анализе, и размер пор, достаточный для быстрого протекания потока жидкости из жидких и захваченных продуктов АКК. Пригодные подложки для захвата могут быть изготовлены из пористых органических или неорганических материалов, включая твердые вещества, такие как пористые металлические, керамические, гомогенные пленки (например, полимерные) и гетерогенные твердые вещества (полимерные смеси, смешанные стекла). Пористые керамические мембраны могут быть изготовлены из неорганических материалов (таких как оксид алюминия, оксид титана, оксид циркония, рекристаллизованный карбид кремния). См., например, PamChip, продаваемый компанией Pamgene (Нидерланды), Wu et al, Nucleic Acids Res. 2004 32: e123 и Anthony et al Biotechniques. (2003) 34: 1082-6, 1088-9. Типовые пористые полимерные мембраны могут быть изготовлены из ацетата целлюлозы, нитроцеллюлозы, эфиров целлюлозы (СА, CN и CE), полисульфона (PS), полиэфирсульфона (PES), полиакрилонитрила (PAN), полиамида, полиимида, полиэтилена и полипропилена (PE и PP), политетрафторэтилена (PTFE), поливинилиденфторида (PVDF) и поливинилхлорида (PVC). Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения способ может включать: (a) фильтрование жидкого образца, содержащего продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК), с использованием подложки для захвата, которая функционирует как фильтр для продуктов АКК, таким образом получают массив продуктов АКК на подложке; при этом образец содержит по меньшей мере первую совокупность продуктов АКК и вторую совокупность продуктов АКК, причем первая и вторая совокупности меченых продуктов АКК различаются по метке; и (b) определение количества первой меченой совокупности продуктов АКК и количества второй меченой совокупности продуктов АКК в области мембраны.

Нижеприведенное описание иллюстрирует реализацию изобретения, в которой применяется пористая капиллярная мембрана. Пористые капиллярные мембраны являются примером подложки для захвата, которая может применяться. Нижеследующее описание иллюстрирует настоящий способ на примере.

Как описано выше, в настоящем изобретении предлагается способ анализа образцов. В некоторых вариантах реализации изобретения способ может включать: (a) фильтрование жидкого образца, содержащего продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК), через пористую капиллярную мембрану, в результате чего получают массив продуктов АКК на мембране; (b) флуоресцентное мечение продуктов АКК до или после этапа (а); и (c) определение количества отдельных меченых продуктов АКК в области мембраны, тем самым обеспечивая осуществление оценки количества меченых продуктов АКК в образце. Указанный способ может быть выполнен различными путями, одна реализация которого схематически проиллюстрирована на фиг. 1. Как проиллюстрировано на фиг. 1, некоторые варианты реализации способа включают: фильтрование жидкого образца 2, содержащего флуоресцентно меченые продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК) 4 через пористую капиллярную мембрану 6 (например, мембрану из анодированного оксида алюминия). В результате этапа фильтрования концентрируются частицы и формируется массив продуктов АКК 8 на мембране 6. В проиллюстрированном варианте реализации изобретения следующий этап включает обнаружение частиц, пока они находятся на мембране. В некоторых вариантах реализации изобретения на этом этапе может формироваться изображение 10 массива 8. Очевидно, что обнаружение может быть выполнено с помощью любого пригодного детектора флуоресценции, например, с помощью флуоресцентного микроскопа, сканера, КМОП- или ПЗС-детектора с высоким разрешением или ФЭУ-детектора или тому подобное. Наконец, количество меченых продуктов АКК в области мембраны определяется, например, путем подсчета отдельно выделенных продуктов АКК или путем измерения совокупного сигнала и т.д. Это определение обеспечивает оценку количества меченых продуктов АКК 12 в образце 2. В некоторых вариантах реализации изобретения и в зависимости от осуществления способа, фильтр можно увлажнить, например, смачивающим агентом (например, иммерсионным маслом или глицерином) с целью увлажнения мембраны и приобретения ею прозрачности). В этих вариантах реализации изобретения пористую капиллярную мембрану можно сделать прозрачной с применением смачивающего агента после фильтрования продуктов АКК и до определения количества продуктов АКК. В некоторых вариантах реализации изобретения продукты АКК могут быть мечены после этапа фильтрования. Кроме того, в некоторых случаях изображение массива не нужно создавать и хранить. В этих вариантах реализации изобретения анализ массива может быть выполнен во время или сразу после визуализации. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых анализ включает подсчет, используемый флуоресцентный детектор должен иметь характеристики, достаточные для опознавания различных продуктов АКК на мембране. В некоторых вариантах реализации изобретения флуоресцентный детектор может иметь разрешение менее 10 мкм, например, менее 5 мкм или менее 1 мкм. В вариантах реализации изобретения, которые включают измерение совокупного сигнала, для флуоресцентного детектора такое разрешение не обязательно.

В любом варианте реализации изобретения поры капиллярной мембраны должны иметь достаточный размер, чтобы предотвратить прохождение продуктов АКК через поры. Например, в вариантах реализации изобретения диаметр пор капиллярной мембраны может составлять не более 50% от среднего диаметра продуктов АКК, тогда как в некоторых вариантах реализации изобретения диаметр пор может составлять не более 20% от среднего диаметра продуктов АКК, и в некоторых вариантах реализации изобретения - не более 10% от среднего диаметра продуктов АКК. Таким образом, при фильтровании образца с помощью пористой капиллярной мембраны продукты АКК должны оставаться на поверхности мембраны и не должны полностью проникать или проходить через поры.

В некоторых вариантах реализации изобретения пористая капиллярная мембрана не содержит связанного агента захвата (например, связанного олигонуклеотида, антитела или стрептавидина или тому подобное), который специфически гибридизуется с продуктами АКК или связывается с ними. В этих вариантах реализации изобретения продукты АКК не связываются с пористой капиллярной мембраной посредством специфического (например, специфичного для последовательности) взаимодействия. В таких вариантах реализации изобретения пористая капиллярная мембрана не содержит множества различных связанных с последовательностью агентов захвата (например, олигонуклеотидов), которые связаны с мембраной в пространственно адресуемых местах в форме микромассива, как описано в US2006022813.

В некоторых вариантах реализации изобретения, отличающихся от продукции светового сигнала, никакие биохимические реакции (например, реакция, которая приводит к разрушению или образованию ковалентной связи) не должны происходить на мембране после того, как продукты АКК профильтруются через мембрану.

Очевидно, что продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК) не денатурируют перед фильтрованием через мембрану (например, не подвергают воздействию температуры не ниже 90^oC в течение по меньшей мере 2 минут).

Фиг. 2 иллюстрирует некоторые из принципов типового варианта реализации указанного способа. На первом этапе образец, содержащий флуоресцентно меченые продукты АКК, помещают в контейнер, например, в ячейку, которая содержит мембрану, например, в качестве нижней поверхности. Образец концентрируют, применяя давление, которое выводит жидкую фазу образца через мембрану. Продукты АКК удерживаются на поверхности мембраны в виде массива с плотностью, например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 500, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 5000 или по меньшей мере 10000/мм². Если мембрана еще не прозрачна, то после добавления смачивающего агента мембрана становится прозрачной, а продукты АКК могут быть обнаружены, например, визуализированы. Продукты АКК также можно фиксировать на своем месте с помощью фиксатора, таким образом, что мембрану можно транспортировать и/или хранить с возможностью повторного считывания, если получен положительный результат. В некоторых вариантах реализации изобретения смачивающий агент в дополнение к тому, что делает мембрану прозрачной, также функционирует как фиксатор. Массив можно анализировать с любой стороны мембраны, например, через мембрану (как показано на фиг. 2). Очевидно, что если мембрану считывают из "сверху", т.е. с той же стороны, что и продукты АКК, мембрана не должна быть прозрачной. В некоторых вариантах реализации изобретения мембрана можно высушить перед транспортировкой и анализом. Анализируемая область может содержать по меньшей мере 10, например, по меньшей мере 100, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 5000, по меньшей мере 10000, по меньшей мере 20000, по меньшей мере 50 000, по меньшей мере 100 000 или по меньшей мере 200 000 или более продуктов АКК.

Если необходимо, продукты АКК можно помечать, когда они связаны с мембраной, и в некоторых вариантах реализации изобретения мембрану можно промывать, например, водой или водным буфером, содержащим соль, после того, как был получен массив меченых продуктов АКК, и перед анализом. Указанный этап промывания может снизить фон, поскольку потенциальные источники фона (например, меченые нуклеотиды или меченые олигонуклеотиды, которые не гибридизованы с продуктом АКК) могут промываться через фильтр и не связываться с фильтром во время анализа фильтра. При необходимости другие реагенты, например агенты, препятствующее выгоранию флуоресценции, или реагенты, которые усиливают флуоресценцию или тому подобное, можно добавить к мембране перед анализом с целью снижения фона или усиления сигнала или тому подобное. Аналогичным образом, если необходимо, перед анализом можно связать меченые продукты АКК (ковалентно или нековалентно) с поверхностью мембраны. Химикаты для связывания биомолекул с поверхностью хорошо известны, и в некоторых случаях продукты АКК могут быть получены с применением модифицированного нуклеотида или праймера, который имеет группу, специфически реагирующую с поверхностью мембраны, тем самым обеспечивая прикрепление к поверхности только продуктов АКК.

В некоторых вариантах реализации изобретения этап фильтрирования осуществляют посредством (i) размещения образца на пористой мембране; и (ii) приложения силы, которая перемещает образец через мембрану. Сила, приложенная к образцу, может быть активной силой (например, центробежной силой, отрицательным давлением или положительным давлением) или пассивной силой (например, силой капиллярного действия (например, с использованием промокательной бумаги) или испарением).

Как отмечалось выше, внутренний диаметр пор в мембране, расстояние между центрами соседних пор в мембране, а также расстояние между краями соседних пор в мембране можно контролировать с помощью напряжения осаждения, типа кислоты и других параметров (см., в общих чертах, Poinern, выше). В некоторых вариантах реализации изобретения внутренний диаметр пор в мембране может составлять от 5 до 500 нм, например, от 4 до 250 нм, от 4 до 50 нм, от 50 нм до 100 нм, от 100 нм до 200 нм или от 200 нм до 500 нм. Независимо, среднее расстояние между центрами соседних пор в мембране может составлять от 50 нм до 1000 нм, например, от 50 нм до 420 нм, от 50 нм до 100 нм, от 100 нм до 250 нм, от 250 до 500 нм или от 500 нм до 1000 нм. Среднее расстояние между краями соседних пор в мембране может составлять от 10 до 500 нм, от 10 нм до 50 нм, от 50 нм до 200 нм или от 200 нм до 500 нм. Понятно, что значения диаметра и среднего расстояния между порами, описанными в настоящем документе, являются примерными, и такие значения могут варьироваться в зависимости от варианта реализации изобретения.

В некоторых вариантах реализации изобретения диаметр пор и расстояние между центрами соседних пор можно оптимизировать для получения меченых продуктов АКК, которые могут быть отдельно выделены с помощью применяемой системы обнаружения. В частности, в некоторых случаях поры в мембране могут иметь относительно большой диаметр (например, диаметр в диапазоне от 100 нм до 500 нм), а среднее расстояние между центрами соседних пор в мембране может быть относительно большим (например, в диапазоне от 200 нм до 1000 нм, например, от 200 нм до 420 нм), так что каждый из меченых продуктов АКК затягивается до входа в пору (эффективно "блокируя" пору), при этом расстояние между соседними мечеными продуктами АКК определяют флуоресцентной микроскопией. Эти оптимальные расстояния можно уменьшить при применении флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (Huang et al., Annu. Rev. Biochem. 2009 78: 993-1016).

Применяемая мембрана может иметь любую пригодную толщину, например, в диапазоне от 20 мкм до 500 мкм или от 50 мкм до 200 мкм, если необходимо, и, как отмечалось выше, может содержать одну или более вспомогательных структур (например, опорное кольцо) для того, чтобы сохранить целостность мембраны при использовании.

Как отмечалось выше, данный способ может быть применен в протоколах, которые требуют точной количественной оценки количества продуктов АКК в образце, в частности образце, который имеет переменную концентрацию продуктов АКК (например, концентрацию от 10 до 10 М, которая может быть относительно низкой, например, продукты АКК от 5000 до 1M в объеме от 50 мкл до 200 мкл или более), при этом статистическое разрешение, необходимое для определения разницы, может быть достигнуто только при подсчете по меньшей мере 1000, по меньшей мере 5000, по меньшей мере 10000, по меньшей мере 50 000, по меньшей мере 100 000 или по меньшей мере 200 000 или более продуктов АКК. Как будет описано более подробно ниже, указанный способ особенно пригоден для анализа количества копий и для применения в неинвазивном пренатальном тестировании.

В некоторых вариантах реализации изобретения образец может содержать множество совокупностей продуктов АКК (например, две, три или четыре или более совокупностей продуктов АКК, таких как первая совокупность меченых продуктов АКК и вторая совокупность продуктов АКК), при этом различные совокупности продуктов АКК различаются по метке, что означает, что отдельные представители каждой из совокупностей меченых продуктов АКК могут быть независимо обнаружены и подсчитаны, даже когда совокупности смешиваются. Пригодные различимые пары флуоресцентных меток, применяемые в описанных способах, включают Cy-3 и Cy-5 (Amersham Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси), Quasar 570 и Quasar 670 (Biosearch Technology, Новато, штат Калифорния), Alexafluor555 и Alexafluor647 (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон), BODIPY V-1002 и BODIPY V1005 (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон), POPO-3 и TOTO-3 (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон) и POPRO3 TOPRO3 (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон). Другие пригодные различимые обнаруживаемые метки описаны в работе Kricka et al. (Ann Clin Biochem. 39: 114-29, 2002). Например, продукты АКК могут быть помечены любой комбинацией ATTO, ALEXA, CY или димерных цианиновых красителей, таких как YOYO, TOTO и т.д. Также могут применяться другие метки. Типовые способы получения различимых совокупностей меченых продуктов АКК описаны, например, в заявке PCT/US2014/06771, поданной 26 ноября 2014 года, и заявке PCT/US2014/067719, поданной 26 ноября 2014 года, которые включены в описание настоящего изобретения посредством ссылки. В некоторых случаях совокупность продуктов АКК может быть различимой по метке, что достигается мечением ее несколькими метками, тем самым увеличивая возможности мультиплексирования. Например, в некоторых случаях продукты АКК совокупности могут быть помечены двумя различимыми красителями (например, Cy3 и Cy5). При считывании такие продукты АКК с двойной меткой RCA будут отличаться от продуктов АКК, которые помечены одним красителем (например, Cy3 или Cy5).

В некоторых вариантах реализации изобретения первая совокупность продуктов АКК может представлять "анализируемую" совокупность меченых продуктов АКК, а вторая совокупность продуктов АКК может представлять "эталонную" совокупность продуктов АКК, с которой можно сравнивать количество продуктов АКК в первой совокупности. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения первая совокупность продуктов АКК может соответствовать первой хромосомной области (например, первой хромосоме, такой как хромосома 21), а вторая совокупность продуктов АКК может соответствовать второй хромосомной области (например, второй хромосоме, такой как хромосома 13 или 18, или другой области первой хромосомы), при этом количество первой совокупности продуктов АКК и второй совокупности продуктов АКК можно подсчитать и сравнить, чтобы определить, существует ли разница в количестве копий областей (указывая на то, что существует дупликация или делеция анализируемой области). В некоторых вариантах реализации изобретения образец содержит по меньшей мере первую совокупность продуктов АКК и вторую совокупность продуктов АКК, причем первая и вторая совокупности меченых продуктов АКК различаются по метке на этапе мечения. В этих вариантах реализации изобретения указанные способы включают определение количества (например, подсчета количества) первых меченых продуктов АКК в области мембраны и определения количества (например, подсчета количества) вторых меченых продуктов АКК в области (той же области или другой области) мембраны, тем самым обеспечивая осуществление оценки количества первой и второй совокупностей продуктов АКК в образце. Этот вариант реализации изобретения может дополнительно включать сравнение количества первых продуктов АКК в образце с количеством вторых продуктов АКК в образце.

В некоторых из этих вариантов реализации изобретения способы могут включать визуализацию первой и второй совокупностей меченых продуктов АКК для получения одного или более изображений (например, одного изображения или первого изображения и второго изображения соответственно) и в некоторых случаях (i) определение количества меченых продуктов АКК в одном или более изображениях, тем самым обеспечивая осуществление оценки количества первой и второй совокупностей меченых продуктов АКК в образце. Обнаружение первой и второй совокупности меченых продуктов АКК можно осуществлять отдельно с помощью известных способов (например, с применением соответствующих фильтров и т.д.). Обнаружение продуктов АКК можно выполнять последовательно (в соответствующих вариантах реализации изобретения, например, могут быть получены отдельные изображения для каждой метки, при этом продукты АКК из каждой совокупности можно анализировать последовательно. Обнаружение продуктов АКК также можно выполнять по существу одновременно (в соответствующих вариантах реализации изобретения, например, может быть получено одно изображение, которое показывает обе совокупности продуктов АКК, при этом продукты АКК из каждой совокупности можно анализировать, по существу, в одно и то же время, т.е., по существу, одновременно. Эти варианты реализации указанных способов могут дополнительно включать сравнение количества первых меченых продуктов АКК в образце с количеством вторых меченых продуктов АКК в образце. Этот этап реализации указанных способов может включать по меньшей мере 1000 (например, по меньшей мере 5000, по меньшей мере 10000, по меньшей мере 20000, по меньшей мере 50000, по меньшей мере 100000, по меньшей мере от 500000 до 1 М или более) меченых продуктов АКК в первой совокупности и по меньшей мере 1000 (например, по меньшей мере 5000, по меньшей мере 10000, по меньшей мере 20000 или по меньшей мере 50 000, по меньшей мере 100000, по меньшей мере 500000 до 1 М или более) меченых продуктов АКК в области мембраны, тем самым получая подтверждение того, что разница в количестве копий может быть обусловлена статистической жесткостью.

В вариантах реализации изобретения указанные способы могут дополнительно включать обнаружение отличий между количеством первых продуктов АКК в образце и количеством вторых продуктов АКК в образце, при этом отличия характеризуется значением Р по меньшей мере 0,95, по меньшей мере 0,98 или по меньшей мере 0,99. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный способ может применяться для обнаружения по меньшей мере отличий в 1%, по меньшей мере отличий в 2%, по меньшей мере отличий в 3% или, по меньшей мере отличий в 5%, с величиной Р более 0,95, 0,98 или 0,99. Например, в вариантах реализации изобретения, включающих материнский образец от беременной женщины, в этот расчет может быть включена фетальная фракция образца.

Как отмечено выше, в некоторых случаях анализируемый образец с применением указанного метода может представлять собой образец бесклеточной ДНК, полученной из крови, например, из крови беременной женщины. В этих вариантах реализации изобретения указанный способ может применяться, например, для обнаружения хромосомных аномалий у развивающегося плода (как описано выше) или для расчета фракции эмбриональной ДНК в образце. Копийность аномалий, которые могут быть обнаружены с помощью указанного способа, включают, но не ограничиваются ими, трисомию 21, трисомию 13, трисомию 18, трисомию 16, XXY, XYY, XXX, моносомию X, моносомию 21, моносомию 22, моносомию 16 и моносомию 15. Дополнительные копийности аномалий, которые могут быть обнаружены с помощью настоящего способа, перечислены в следующей таблице.

Типовые способы получения продуктов АКК и их мечение описаны, например, в заявке PCT/US2014/06771, поданной 26 ноября 2014 года и заявке PCT/US2014/067719, поданной 26 ноября 2014 года, которые включены в описание указанных способов посредством ссылки.

Композиция

В настоящем изобретении также предлагается композиция. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция может содержать: а) пористую капиллярную мембрану, например, пористую мембрану из анодированного оксида алюминия; и b) массив флуоресцентно меченых продуктов АКК на поверхности мембраны. Массив может содержать по меньшей мере 1000 меченых продуктов АКК (например, по меньшей мере 5000, по меньшей мере, 10000, по меньшей мере 20000, по меньшей мере 50 000, по меньшей мере 100 000, по меньшей мере 500 000 или по меньшей мере 1 М меченых продуктов АКК), при этом меченые продукты АКК могут быть распределены по поверхности мембраны случайным образом с плотностью, например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 500, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 5000 или по меньшей мере 10000/мм². Как описано выше, композиция может содержать пористую капиллярную мембрану; и по меньшей мере две совокупности флуоресцентно меченых продуктов АКК на поверхности мембраны, при этом различные совокупности флуоресцентно меченых продуктов АКК различаются по метке. Дополнительную информацию и варианты этой композиции можно найти в разделе, описывающем способы настоящего изобретения.

Наборы

Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются наборы для реализации указанных способов, как описано выше. В некоторых вариантах реализации изобретения набор может содержать по меньшей мере: реагенты для формирования в кольцо выделенного фрагмента согласно последовательности, с последующим выполнением амплификации по типу катящегося кольца сформированных в кольцо продуктов. Например, набор может содержать один или более ферментов рестрикции, лигазу, и один или более олигонуклеотидов, которые могут функционировать как шунт для формования продуктов в кольцо; сдвигающую цепь полимеразу для амплификации сформированных в кольцо продуктов АКК; один или более меченых олигонуклеотидов для мечения продуктов АКК и пористую капиллярную мембрану, например, пористую мембрану из анодированного оксида алюминия, как описано выше. Различные компоненты набора могут присутствовать в отдельных контейнерах или некоторые совместимые компоненты могут быть предварительно объединены в один контейнер, если это необходимо. Дополнительную информацию и варианты этого набора можно найти в разделе, описывающем способы настоящего изобретения.

В дополнение к вышеупомянутым компонентам указанные наборы могут дополнительно включать инструкции по применению компонентов набора для практической реализации указанных способов, т.е. инструкции для анализа образцов. Инструкции для практической реализации указанных способов обычно записывают на пригодный носитель записи. Например, инструкции могут быть напечатаны на таком материале, как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут присутствовать в наборах в виде листка-вкладыша в упаковку, на этикетке контейнера указанного набора или его компонентов (т.е. связанные с основной упаковкой или внутренней упаковкой) и т.д. В других вариантах реализации изобретения инструкции представлены в виде файла данных электронного хранения, записанного на пригодном считываемом компьютером носителе данных, например, CD-ROM, дискете и т.д. В других вариантах реализации изобретения действующие инструкции не содержатся в наборе, но предоставляются средства для получения инструкций из удаленного источника, например, через Интернет. Примером этого варианта реализации изобретения является набор, который включает веб-адрес, где инструкции можно просмотреть и/или из которого инструкции можно загрузить. Как и в случае с инструкциями, указанные средства для получения инструкций записаны на пригодный носитель.

Варианты реализации изобретения

Ниже описана типовая реализация указанного способа.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ может включать: (a) фильтрование жидкого образца, содержащего флуоресцентно меченые продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК), через пористую мембрану из анодированного оксида алюминия, в результате чего получают массив продуктов АКК на мембране; и (b) определение количества меченых продуктов АКК в области мембраны, тем самым обеспечивая осуществление оценки количества меченых продуктов АКК в образце. В некоторых вариантах реализации изобретения этап определения может включать подсчет количества первых и вторых меченых продуктов АКК в указанной области. В других вариантах реализации изобретения этап определения может включать обнаружение совокупного сигнала из указанной области.

В вариантах реализации изобретения этап (а) указанного способа может быть выполнен посредством: (i) размещения образца на пористой мембране из анодированного оксида алюминия; и (ii) приложения силы, которая перемещает образец через мембрану. В этих вариантах реализации изобретения прилагаемая сила может быть активной силой (центробежной силой, отрицательным давлением или положительным давлением) или пассивной силой (которая может реализоваться посредством капиллярного действия или испарения). В некоторых вариантах реализации изобретения указанный способ может включать промывание пористой мембраны из анодированного оксида алюминия между этапами (а) и (b). В некоторых вариантах реализации изобретения этап определения может включать подсчет по меньшей мере 1000 меченых продуктов АКК в области изображения.

В вариантах реализации изобретения внутренний диаметр пор в мембране может составлять от 5 нм до 500 нм, и, независимо от того, среднее расстояние между центрами соседних пор в мембране может составлять от 50 нм до 1000 нм. В вариантах реализации изобретения среднее расстояние между краями соседних пор в мембране может составлять от 10 нм до 500 нм. В некоторых вариантах реализации изобретения образец может содержать по меньшей мере первую и вторую совокупность меченых продуктов АКК, причем первая и вторая совокупности меченых продуктов АКК различаются по метке. В этих вариантах реализации изобретения указанные способы могут дополнительно включать визуализацию первой и второй совокупности меченых продуктов АКК для получения одного или более изображений (например, первого изображения и второго изображения соответственно). Эти способы могут дополнительно включать (i) подсчет количества меченых продуктов АКК в области первого изображения и (ii) отдельно подсчет количества меченых продуктов АКК в области, например, в той же области, второго изображения, тем самым обеспечивая осуществление оценки количества первой и второй совокупностей меченых продуктов АКК в образце. Эти варианты реализации изобретения могут дополнительно включать сравнение количества первых меченых продуктов АКК в образце с количеством вторых меченых продуктов АКК в образце.

В настоящем изобретении также предлагается композиция, содержащая: а) пористую капиллярную мембрану; и b) массив флуоресцентно меченых продуктов амплификации по типу катящегося кольца (АКК) на поверхности мембраны. В некоторых из этих вариантов реализации изобретения пористая капиллярная мембрана может представлять собой пористую мембрану из анодированного оксида алюминия. В некоторых вариантах реализации изобретения массив может содержать по меньшей мере 1000 продуктов АКК. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция может содержать множественные массивы флюоресцентно меченых продуктов АКК, при этом указанные множественные массивы находятся на поверхности мембраны и различаются по метке. Описание каждого из этих элементов, а также необязательных элементов, которые могут содержаться в композиции, можно найти в предшествующем описании.

В настоящем изобретении также предлагается набор, содержащий: а) пористую капиллярную мембрану; и b) реагенты для формирования ДНК в кольцо и выполнения амплификации по типу катящегося кольца (АКК); и c) реагенты для мечения продуктов АКК. Описание каждого из указанных элементов, а также необязательных элементов, которые могут содержаться в наборе, можно найти в предшествующем описании.

Вариант реализации изобретения 1, способ анализа образцов, включающий: (a) фильтрование жидкого образца, содержащего продукты амплификации по типу катящегося кольца (АКК), через пористую прозрачную капиллярную мембрану, в результате чего концентрируют продукты АКК и получают массив продуктов АКК на мембране; (b) флуоресцентное мечение продуктов АКК до или после этапа (а); и (c) подсчет количества отдельных меченых продуктов АКК в области мембраны, тем самым обеспечивая осуществление оценки количества меченых продуктов АКК в образце.

Вариант реализации изобретения 2. Способ по варианту реализации изобретения 1, отличающийся тем, что пористая прозрачная капиллярная мембрана представляет собой пористую мембрану из анодированного оксида алюминия.

Вариант реализации изобретения 3. Способ по варианту реализации изобретения 1 или 2, отличающийся тем, что этап (b) выполняют путем гибридизации флуоресцентно меченых олигонуклеотидов с продуктами АКК до или после этапа (а).

Вариант реализации изобретения 4. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, отличающийся тем, что способ включает визуализацию области мембраны для получения одного или более изображений и подсчет количества отдельных меченых продуктов АКК в одном или более изображениях.

Вариант реализации изобретения 5. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, отличающийся тем, что этап (а) выполняют путем: (i) размещения образца на пористой прозрачной капиллярной мембране; и (ii) приложения силы, которая перемещает образец через мембрану.

Вариант реализации изобретения 6. Способ по варианту реализации изобретения 5, отличающийся тем, что сила представляет собой активную силу или пассивную силу.

Вариант реализации изобретения 7. Способ по варианту реализации изобретения 6, отличающийся тем, что активная сила представляет собой центробежную силу, отрицательное давление или положительное давление.

Вариант реализации изобретения 8. Способ по варианту реализации изобретения 6, отличающийся тем, что пассивная сила реализуется путем капиллярного действия или испарения.

Вариант реализации изобретения 9. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, дополнительно включающий промывание пористой прозрачной капиллярной мембраны между этапами (а) и (b).

Вариант реализации изобретения 10. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, отличающийся тем, что этап подсчета включает подсчет по меньшей мере 1000 меченых продуктов АКК в области мембраны.

Вариант реализации изобретения 11. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, отличающийся тем, что внутренний диаметр пор в мембране составляет от 2 нм до 500 нм.

Вариант реализации изобретения 12. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, отличающийся тем, что среднее расстояние между центрами соседних пор в мембране составляет от 50 нм до 1000 нм.

Вариант реализации изобретения 13. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, отличающийся тем, что среднее расстояние между краями соседних пор в мембране составляет от 10 нм до 500 нм.

Вариант реализации изобретения 14. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, отличающийся тем, что образец содержит по меньшей мере первую совокупность продуктов АКК и вторую совокупность продуктов АКК, причем первая и вторая совокупности меченых продуктов АКК различаются по метке на этапе (b).

Вариант реализации изобретения 15. Способ по варианту реализации изобретения 11, отличающийся тем, что указанный способ включает подсчет количества первых меченых продуктов АКК в области мембраны и подсчет количества вторых меченых продуктов АКК в области мембраны, тем самым обеспечивая осуществление оценки количества первой и второй совокупностей меченых продуктов АКК в образце.

Вариант реализации изобретения 16. Способ по варианту реализации изобретения 15, дополнительно включающий сравнение количества первых продуктов АКК в образце с количеством вторых продуктов АКК в образце.

Примеры

Следующие примеры приведены таким образом, чтобы обеспечить обычным специалистам в данной области техники полное объяснение и описание того, как изготавливать и применять настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения считают своим изобретением; кроме того, примеры не предназначены для представления того, что эксперименты, приведенные ниже, это все эксперименты, которые проводились.

Пример 1

Применение фильтра AAO

Введение

Первым этапом во многих методах молекулярной диагностики является преобразование биологического материала пациента, такого как ДНК, в эффективный биомаркер. ДНК экстрагируют, после этого, как правило, очищают и в последствии превращают в суррогатные молекулы, такие как продукты амплификации катящегося кольца (ПАКК), которые можно измерить или количественно оценить. Обнаружение этих суррогатных молекул часто осуществляют при специфическом присоединении флуоресцентных красителей. Различные красители можно прикрепить к различным суррогатным маркерам, что дает возможность осуществлять мультиплексное обнаружение даже в сложных смесях. Нанесение на плоские поверхности, такие как стеклянные планшеты или предметные стекла, позволяет подсчитывать меченые молекулы с помощью микроскопии или сканирования.

Некоторые затруднения возникают, если образцы имеют низкую концентрацию в растворе; в таком случае нанести достаточное количество молекул для точного подсчета является непростой задачей. Покрытие стеклянных предметных стекол агентами, такими как поли-L-лизин (PLL), аминосиланы или аналогичные агенты, оказалось эффективным средством усиления осаждения суррогатных маркеров, состоящих в основном из ДНК (см., например, заявку PCT/US2014/06771, поданную 26 ноября 2014 года, и заявку PCT/US2014/067719, поданную 26 ноября 2014 года). Это в некоторой степени повышает эффективность нанесения, однако многие молекулы остаются в растворе и не включены в последующий анализ. С целью повышения эффективности нанесения флуоресцентно меченных биомаркеров на плоскую поверхность, применяли следующий способ фильтрации.

Материалы и методы

Устройства: Мембраны из оксида алюминия соединяли с суперструктурами луночных планшетов, которые были либо изготовлены собственными силами, либо приобретены у компании Ibidi (часть № 81201).

Планшеты с амино-силанным покрытием (96-луночные планшеты из стеклянным дном лунок SuperAmine, часть № M96M) приобретали в компании ArrayIt Corporation.

Два отдельных продукта амплификации по типу катящегося кольца создавали с помощью ранее описанных способов (PCT/US2014/06771). Одна реакция АКК была помечена с помощью гибридизации комплементарного детекционного олигонуклеотида, содержащего метку 5'-Atto 550, а другая реакция АКК была помечена аналогичным образом меткой 5'Atto 647N. Реакции АКК смешивали в смеси 50:50 при концентрации 50 фМ.

При использовании стеклянных планшетов 100 мкл реакции аликвотировали в 3 лунки планшета и оставляли для инкубации при комнатной температуре в течение 16 часов. Другие серии из 3 лунок инкубировали в течение 90 секунд. После инкубации лунки дважды промывали 2x SSC, а затем давали высохнуть.

При использовании мембран 100 мкл образцов добавляли к планшетам, имеющим дно лунок в виде мембраны, затем планшеты помещали на промокательную бумагу (VWR часть № 28298-022). Образцы пропускали через мембрану из оксида алюминия примерно через 90 секунд. Планшет с дном лунок в виде мембраны удаляли из промокательной бумаги и к каждой лунке добавляли 2 капли пролонгированного реагента, препятствующего выгоранию флуоресценции (Life Technologies), чтобы сделать их прозрачными.

Для обоих форматов визуализацию осуществляли помощью микроскопа Olympus X81 с объективом 20X и камеры Hamamatsu Orca 4. 0lt. Визуализацию осуществляли путем мозаичного размещения изображений 9х9 для покрытия всего дна каждой лунки. Изображения анализировали, а продукты АКК подсчитывали с применением собственного специально разработанного программного обеспечения.

Результаты

Результаты приведены на фиг. 3. При инкубации в течение 16 часов и нанесения на стеклянные планшеты средний показатель для продуктов АКК, меченых Atto 550, составлял от 2000 до 4000 отсчетов на изображение. Для Atto 647N средний показатель составлял от 2000 до 3000 отсчетов на изображение. При инкубации в течение 90 секунд на стеклянных планшетах средний показатель для обоих каналов находился в пределах от 500 до 2500 отсчетов. Напротив, в результате инкубации/нанесения на планшет из оксида алюминия средний показатель составлял в среднем от 6000 до 10000 отсчетов для продуктов АКК, меченых Atto 550, и от 6000 до 9000 отсчетов для продуктов АКК, меченых 647N.

Полученные данные демонстрируют, что при нанесении на мембрану из оксида алюминия получают примерно в 4 раза большее число отсчетов, чем при нанесении на стеклянный планшет за тот же 90-секундный интервал времени. Если при применении стеклянного планшета время инкубации продлить до 16 часов, количество продуктов АКК, обнаруживаемых на стеклянном планшете, увеличится, однако все же будет в 2,5 раза меньше, чем наблюдаемое через 90 секунд на мембране из оксида алюминия.

Пример 2

Способы мультиплексного обнаружения

Материалы и методы

Устройства: Мембраны из оксида алюминия с порами 20 нм соединяли с суперструктурами 96-луночных планшетов, которые были изготовлены на заказ компанией 4titude Ltd, Великобритания.

В этом мультиплексном эксперименте в качестве генетического исходного материала применяли смеси ДНК из 2-х клеточных линий. ДНК клеточных линий содержала либо 2 копии хромосомы 21 (нормальный генетический состав), либо 3 копии хромосомы (трисомия 21). ДНК, экстрагированную из клеточных линий, смешивали в следующих пропорциях 100:0, 95:5, 90:10, 0:100. Каждую ДНК-смесь сначала расщепляли с помощью рестрикционных ферментов, гибридизовали и лигировали с набором зондов, а затем ферментативно амплифицировали с помощью АКК, как описано выше (см. WO2015083001 и WO2015083002). К каждому образцу добавляли два специфичных олигонуклеотида для детекции хромосом (Atto 550 - для хромосомы 18, Atto 647 - для хромосомы 21) и оставляли для гибридизации, таким образом осуществляя флуоресцентное мечение специфичных для хромосомы продуктов АКК в каждом образце.

После мечения 100 мкл образцов добавляли к планшетам, имеющим дно лунок в виде мембраны, затем планшеты помещали в вакуумный коллектор (Supleco часть№ 66879-U). Образцы пропускали через мембрану из оксида алюминия примерно через 90 секунд. Планшет с дном лунок в виде мембраны дважды промывали с применением 400 мкл 0,5X SSC, а затем давали высохнуть. После этого триста микролитров смачивающего агента/фиксатора вносили в каждую лунку, чтобы сделать их прозрачными и фиксировать продукты АКК на мембране.

Визуализацию осуществляли с помощью микроскопа Olympus X81 с объективом 20X и камеры Hamamatsu Orca 4. 0lt. Визуализацию осуществляли путем мозаичного размещения изображений 10х10 для покрытия всего дна каждой лунки. Изображения анализировали, а продукты АКК подсчитывали с применением собственного специально разработанного программного обеспечения.

Результаты

Результаты приведены на фиг. 4. Средние показатели на одно изображение для всех 91 образцов, включенных в эксперимент, варьировались от 3000 до немногим более 5000 отсчетов на изображение. Гистограммы четко демонстрируют различия в отношении числа отсчетов между 550 и 647 каналами в смеси с соотношением 0:100 (последние 22 репликата), однако, согласно графику, сложнее выявить пропорциональные различия в образцах 0, 5 и 10%. Фиг. 5 представляет собой график зависимости между числом отсчетов для двух каналов относительно композиции смеси клеточных линий. На этом графике четко представлена тенденция, иллюстрирующая относительный сдвиг соотношения в числе отсчетов, что соответствует пропорции образцов ДНК исходной клеточной линии.

Полученные данные демонстрируют, что при нанесении на мембрану из оксида алюминия получают примерно в 4 раза большее число отсчетов, чем при нанесении на стеклянный планшет за тот же 90-секундный интервал времени. Если при применении стеклянного планшета время инкубации продлить до 16 часов, количество продуктов АКК, обнаруживаемых на стеклянном планшете, увеличивается, однако все же будет в 2,5 раза меньше, чем наблюдаемое через 90 секунд на мембране из оксида алюминия.