Способ прогнозирования тяжелой преэклампсии у беременных при носительстве мутации гена протромбина, генотип F2G20210A

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике и может быть использовано для прогнозирования тяжелой преэклампсии (ПЭ) при беременности у женщин, носительниц мутации гена протромбина, генотип F2G20210A, по определению активности протромбина для формирования группы риска, нуждающихся в проведении медикаментозной терапии.

ПЭ характеризуется сложным этиопатогенезом со специфическими клинико-лабораторными изменениями, а также морфологической картиной поражения органов-мишеней и кровеносных сосудов маточно-плацентарной площадки. Тяжелая ПЭ является одной из основных причин перинатальной смертности (18-30%) и заболеваемости (64-78%), нарушая в последующем психосоматическое развитие детей. По данным ВОЗ, ПЭ регистрируется у 28% беременных и ежегодно занимает в Российской Федерации 3-4-е место в структуре материнской смертности [Доброхотова Ю.Э., Макаров О.В., Лысюк Е.Ю., Оленев А.С., Кузнецов П.А., Джохадзе Л.С., Османова А.П. Преэклампсия. Выбор акушерской тактики ведения. Журнал акушерства и женских болезней. 2016; 65 (2): 16-23.]. В мировой структуре материнской смертности доля ПЭ составляет 12%), а в развивающихся странах - 30%. Мнения исследователей по вопросам этиопатогенеза ПЭ разноречивы, а порой и полностью противоположны, что является основной причиной, инициирующей поиск новых маркеров, прогнозирующих развитие данной патологии до срока клинической реализации процесса.

В настоящее время нет точных и объективных лабораторных критериев для отбора беременных женщин с мутацией гена протромбина, генотип F2G20210A, в группу риска развития тяжелой ПЭ, нуждающихся в персонифицированной медикаментозной терапии для улучшения исходов беременности.

Известен способ прогнозирования возникновения ПЭ у беременных (Патент РФ №2478960, 10.04.2013), включающий исследование сыворотки крови иммуноферментным анализом в сроки 16-18 недель гестации, определение содержания неоптерина и возникновение ПЭ прогнозируют при уровне неоптерина выше 8,1 нмоль/л.

Недостатком известного способа является его трудоемкость, т.к. требуется специальное импортное дорогостоящее оборудование и реактивы. Кроме того, содержание неоптерина - маркера активности клеточного иммунитета, индикатора развития воспалительного процесса, изменяется при ряде патологических состояний (Свиридов Е.А., Телегина Т.А. Неоптерин и его восстановленные формы: биологическая роль и участие в клеточном иммунитете // Успехи биологической химии. - 2005. - Т. 45. - С. 355-390).

Имеется способ прогнозирования ПЭ во втором триместре беременности (Патент РФ №2552931, 2015) путем исследования крови, заключающейся в том, что в сыворотке крови женщин в 7-8 недель беременности определяют активность кислых и нейтральных протеиназ и при значении активности кислых протеиназ выше 5,6 мкмоль/л и активности нейтральных протеиназ выше 3,9 мкмоль/л прогнозируют развитие ПЭ во втором триместре беременности.

Известный способ обладает низкой точностью, так как не позволяет осуществлять стратификацию пациентов, в заявленном способе не уточняется тип определяемых протеаз. Например, активность кислых протеаз обусловлена активностью отдельных протеаз данной группы (Катепсин D, ренин), усиливая образование ренина, уменьшая почечный кровоток и может повышаться при поражении паренхимы почек, носительстве аномальных аллелей гена АСЕ (I/D), приеме таких лекарственных препаратов как диуретики, кортикостероиды, простагландины, эстрогены, что, безусловно, влияет на прогностическую ценность теста и требует проведения стратификации пациентов.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату (прототипом) является способ прогнозирования ПЭ у беременных, при носительстве мутации гена фактор V Лейден 1691, генотип G/A и А/А (Патент РФ №2666251; 2018) путем исследования крови, заключающейся в том, что в сыворотке крови женщин в 7-8 недель беременности определяют резистентность Va фактора к активированному протеину С (АПС-резистентность) по нормализованному отношению (НО) и при значении АПС-резистентности по НО <0,49 прогнозируют развитие ПЭ.

Недостатком данного метода является его информативность только в когорте женщин, носительниц мутации гена фактор V Лейден 1691. Биологический смысл данной мутации заключается в формировании первичной, генетически обусловленной АПС-резистентности. При отсутствии патологии гена V фактора в положении 1691 резистентность Va фактора к активированному протеину С не изменена и как предиктор развития ПЭ рассматриваться не может.

Авторы предлагают простой, доступный способ прогнозирования тяжелой ПЭ, обладающий высокой точностью у беременных с носительством мутации гена протромбина, генотип F2G20210A, что позволяет сформировать группу риска по развитию тяжелой ПЭ задолго до появления первых клинических симптомов и позволяет назначить дифференцированную медикаментозную профилактику для уменьшения материнских и перинатальных осложнений.

Технический результат достигается тем, что, определяют активность протромбина путем использования дефицитной по субстрату плазмы.

Способ осуществляется следующим образом.

Определяют время свертывания исследуемого образца бедной тромбоцитами плазмы в смеси, содержащей дефицитную по фактору II плазму, разведенную исследуемую плазму и реагент «Тромборель S». Количественное определение активности коагуляционного фактора II выполняют по графику зависимости активности фактора II (в %) от протромбинового времени свертывания.

Оборудование, материалы, реагенты

- В соответствии с инструкцией к применяемому набору реагентов использовать автоматический или полуавтоматический коагулометр;

- Плазма субстратная с дефицитом фактора II (каталожный номер 5190). Лиофильно высушенная плазма крови человека, уровень фактора II в которой не выше 1%;

- Тромборель S (каталожный номер OUHP49). Лиофильно высушенная тромбопласти - кальциевая смесь из кроличьего мозга;

- Физиологический раствор 0,9% NaCl;

- Контрольная плазма (пулированная от 25 доноров лиофильно высушенная плазма крови человека с известным содержанием фактора II);

- Дистиллированная вода.

Приготовление анализируемых образцов

Кровь для исследования забирают утром, натощак, из локтевой вены в пробирки "VACUETTE" 9 мл, содержащие 3,8%) раствор цитрата натрия, соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1. Кровь центрифугируют при 3000-4000 об/мин (1200 g) в течение 15 минут, в результате получают бедную тромбоцитами плазму, которую переносят в другую пробирку, где хранят до проведения исследования.

Центрифугирование обычно проводится непосредственно после взятия крови, а отбор плазмы на исследование - сразу же после центрифугирования. Не допускается анализ плазмы крови, имеющей сгустки, гемолиз и полученной более 2 часов назад. Перед проведением анализа все исследуемые образцы развести 0,9% физиологическим раствором NaCl в 5 раз (0,1 мл образца + 0,4 мл физиологического раствора).

Приготовление реагентов и проведение анализа

1. Подготовка реагентов к работе

1.1. Разведение дефицитной по фактору II плазмы

Во флакон с дефицитной по фактору II плазмой внести 1,0 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре (+18…+25°С) и легком покачивании (избегая образования пены) в течение 3 мин. Разведенную плазму перед исследованием выдержать не менее 25-30 мин при комнатной температуре.

1.2. Приготовление реагента Тромборель S

В один флакон с реагентом Тромборель S внести 2,0 мл дистиллированной воды. Флакон встряхнуть и выдержать при +37°С (на водяной бане) в течение 20 минут. Перед каждым определением разведенный реагент перемешать во избежание выпадения осадка.

1.3. Разведение контрольной плазмы

Во флакон с контрольной плазмой внести 1,0 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре (+18…+25°С) в течение 3 минут. Перед использованием контрольная плазма должна быть выдержана при комнатной температуре в течение 15 минут.

1.4. Приготовление разведений для построения калибровочного графика представлено в таблице.

Схема разведений калибровочного образца для построения контрольного графика.

1.5. Построение калибровочной кривой

Для каждого разведения контрольной плазмы выполнить определения дважды, средний результат отметить на калибровочной кривой. На оси Y отложить время свертывания каждого разведенного образца контрольной плазмы в секундах, на оси X - соответствующее значение активности коагуляционного фактора в процентах, %. Через полученные точки провести калибровочный график, который в билогарифмических координатах должен представлять собой прямую линию в диапазоне активности фактора II от 1 до 100%.

2. Проведение анализа

2.1. Мануальный вариант:

2.1.1. К 0,1 мл разведенной в 5 раз исследуемой плазмы, взятой в пробирку, добавить 0,1 мл разведенной дефицитной по фактору II плазмы.

2.1.2. Инкубировать при температуре +37°С в течение 1 минуты.

2.1.3. Добавить 0,2 мл разведенного реагента Тромборель S, имеющего температуру +37°С, и включить секундомер. Зарегистрировать время свертывания.

2.1.4. Используя калибровочную кривую, найти активность фактора II. Если время коагуляции исследуемой плазмы соответствует активности фактора II менее 100%, например, только 95%, результат, считанный с кривой, умножается на 0,95. В случае времени коагуляции, которое соответствует содержанию фактора коагуляции более 100%, требуются дополнительные определения с использованием более высоких разведений исследуемой плазмы (например, в 10 раз). В этом случае полученный результат в % должен быть умножен на коэффициент, соответствующий разведению; например, для разведения в 10 раз результат умножается на 2.

2.2. Коагулометрический вариант:

Исследование плазмы крови проводится на коагулометрах с механическим или оптическим (например, Siemens BCS ХР) принципом регистрации результатов.

2.2.1. Выбрать на коагулометре программу для определения активности фактора II одностадийным клоттинговым методом;

2.2.2. Поместить флаконы с приготовленными реагентами в соответствующие ячейки коагулометра;

2.2.3 Запустить программу построения калибровочной прямой (для каждой новой серии реагентов);

2.2.4 Поместить в кювету коагулометра контрольные и исследуемые образцы плазмы;

2.2.5 Запустить программу измерения;

2.2.6 Считать результаты.

Чтение результатов

Активность протромбина (фактора II) выражается в международных единицах (ME) или в процентах, причем 1 МЕ/мл соответствует 100% активности. У здоровых пациентов, без носительства мутации гена протромбина, генотип [F2G20210G], активность протромбина (фактора II) составляет 70-120% [Fickenscher K. Analysisbof individual coagulation factor. In: Thomas L, ed. Clinical Laboratory Diagnostics. Frankfurt: TH-Books Verlagsgesellschaft, 1998: 607-9]. Референтные интервалы варьируются и зависят от исследуемой популяции, используемой техники, методов, оборудования и партии реагентов.

Апробация заявляемого способа прогнозирования тяжелой преэклампсии при носительстве мутации гена протромбина [F2G20210A].

Апробация заявляемого способа проведена на 140 пациентках, включенных в базу данных «Носители мутации протромбина [F2G20210A)] на территории России» (Свидетельство №2018621494 от 19.09.2018) с установленным носительством мутации гена протромбина [F2G20210A]. Всем пациенткам проводилось исследование показателя активности протромбина в «критические» сроки беременности, учитывающие волны инвазии цитотрофобласта: в 7-8 недель, 12-13 недель, 18-19 недель, 22-23 недели, 27-28 недель, 32-33 недели и в 36-37 недель.

Применение ROC-анализа при прогнозировании преэклампсии по данным показателя «уровень активности протромбина» позволило определить оптимальный порог отсечения с наилучшей предсказательной способностью, который составил >180,0% во всех сроках беременности. При этом максимальная эффективность теста определена в сроке гестации 7-8 недель.

Изобретение иллюстрируется фигурой 1, на которой изображена ROC-кривая, определяющая критический порог отсечки активности протромбина (%) и построенная при анализе чувствительности и специфичности у пациенток с развитием тяжелой преэклампсии при носительстве мутации гена протромбина [F2G20210A]. Площадь под кривой (AUC) у показателя активности протромбина 181,3% составляет 0,840 (95CI 0,677-0,942) при уровне значимости (p-level) р<0,0001. Чувствительность предиктора - 93,3, специфичность - 70,0.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что заявляемый способ прогнозирования тяжелой преэклампсии у женщин при носительстве мутации гена протромбина [F2G20210A], при активности протромбина 181,3% обеспечивает точность прогноза в 84,0%) случаев (Фиг. 2)

Клинические примеры.

1. Пациентка Б.О.В, 34 года. Наблюдалась в городском центре планирования семьи и репродукции на специализированном приеме по невынашиванию беременности. Настоящая беременность - 2, наступила самостоятельно. Первая беременность закончилась преждевременными родами абдоминальным путем на сроке 27 недель вследствие развития тяжелой преэклампсии, вес ребенка при рождении составил 920 грамм. На этапе планирования беременности при обследовании выявлено носительством мутации гена F2G20210A (гетерозиготный генотип). При наступлении беременности на сроке 7-8 недель обследована в объеме, регламентированном приказом 572-Н, включая исследование показателей системы гемостаза. Показатель уровня активности протромбина составил 197,5%. Остальные маркеры тромбинемии соответствовали гестационному сроку. На сроке беременности 26 недель пациентка посещала гематолога, показатель уровня активности протромбина составил 210,7%. Показаний для проведения антитромботической терапии по результатам исследования маркеров тромбинемии не было. На сроке 30 недель беременности зафиксировано повышение артериального давления до 170/100, боли в эпигастральной области, жидкий стул. Пациентка госпитализирована в инфекционное отделение. При исследовании - высокие показатели трансаминаз, тромбоцитопения 38 тысяч. Врачебным консилиумом установлен диагноз: Беременность 30-31 неделя. Преэклампсия тяжелой степени, HELLP-синдром. Переведена в перинатальный центр для родоразрешения по экстренным показаниям. Родился мальчик, вес 1190 г, с оценкой по Апгар 5 баллов.

2. Пациентка КОА., 29 год. Наблюдалась у гематолога в Алтайском филиале Гематологического научного центра МЗ РФ. На этапе планирования беременности при обследовании выявлено носительство мутации гена протромбина, генотип F2G20210A. Настоящая беременность третья, в анамнезе две неразвивающиеся беременности на сроке 8 недель. При сроке беременности 7-8 недель обследована в объеме, регламентированном приказом 572-Н, включая исследование показателей системы гемостаза. Показатель уровня активности протромбина составил 206,9%). Маркеры тромбинемии по растворимому фибрину в плазме повышены - 21,0 мг/100 мл, уровень Д-димеров составил 560 нг/мл. С целью профилактики акушерских и венозных тромбоэмболических осложнений назначена тромбопрофилактика низкомолекулярными гепаринами в повышенных профилактических дозах в течение 14 дней. В течение всей беременности проводилось динамическое исследование показателей системы гемостаза, маркеров тромбинемии, по результатам которых назначались повторные курсы низкомолекулярных гепаринов. Показатель уровня активности протромбина при динамическом наблюдении колебался в диапазоне 162-174%) (>181,3). Ведение беременности проводилось совместно с акушером и гематологом. Осложнений гестации не выявлено. На сроке беременности 39-40 недель произошли роды через естественные родовые пути. Родился мальчик, вес 3170 с оценкой по шкале Апгар 8 баллов.

3. Пациентка П.С.Д., 33 года. Наблюдалась у гематолога в Алтайском филиале Гематологического научного центра МЗ РФ. Беременность вторая. В анамнезе преждевременные роды на сроке 27-28 недель абдоминальным путем в связи с развитием тяжелой преэклампсии. Родился мальчик 890 грамм, который умер на 4 сутки вследствие развития синдрома дыхательных расстройств на фоне глубокой недоношенности. На этапе планирования беременности при обследовании выявлено носительством мутации гена протромбина, генотип F2G20210A. В настоящую беременность при сроке 7-8 недель обследована в объеме, регламентированном приказом 572-Н, включая исследование показателей системы гемостаза. Показатель уровня активности протромбина составил 201,3%. Остальные показатели системы гемостаза соответствовали физиологическому течению беременности. С 29 недель беременности зафиксировано повышение цифр артериального давления до 150/100, в анализе мочи умеренная протеинурия. Пациентка госпитализирована в отделение патологии беременности краевого перинатального центра с диагнозом: беременность 29-30 недель, умеренная преэклампсия. Проводилось лечение: магнезиальная терапия, гепаринопрофилактика низкомолекулярными гепаринами в повышенных профилактических дозах. Учитывая неэффективность проводимой терапии, нарастающие показатели протеинурии (до 3 г/сутки), нестабильную гемодинамику (АД до 160/100), нарушение плодово-плацентарного кровообращения 1Б типа по данным допплерометрии, на сроке 30 недель проведено родоразрешение путем кесарева сечения. Родилась девочка, вес 980 грамм, с оценкой по Апгар 5 баллов.

Таким образом, заявляемый способ прогнозирования тяжелой преэклампсии у беременных, при носительстве мутации гена протромбина, генотип F2G20210A, по определению активности протромбина обладает высокой точностью, является высокоинформативным и позволяет формировать группу риска по развитию тяжелой преэклампсии для проведения персонифицированной медикаментозной терапии во время беременности для уменьшения материнских и перинатальных осложнений.