Результат интеллектуальной деятельности: BHK-21/SUSP/ARRIAH - перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии, а именно к получению и описанию основных характеристик перевиваемой клеточной сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка (Baby Hamster Kidney, BHK-21/SUSP/ARRIAH), предназначенной для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.

Перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13 получена в 1961 году в Англии И. Максферсоном и М. Стокером [1] и распространилась по всему миру. В последующем были получены следующие аналоги данной культуры клеток:

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита [2];

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в НИИС [3].

3. ВНК-21/2-17b - перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученный во ВНИЯИ (Всероссийский научно-исследовательский ящурный институт) [4, 5] (наиболее близкий прототип).

4. ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства, получена в ФГУП «Щелковский биокомбинат» [6];

5. ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура типов А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства, получена в ФГУП «Щелковский биокомбинат» [7].

Эти и другие линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка используют для культивирования вирусов ящура и бешенства. Используемые перевиваемые клеточные линии различают по морфологии, кариологии, ростовым свойствам, особенностям культивирования, способам поддержания и чувствительности к вирусам.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13 [2].

Клеточная сублиния ВНК-21/13 адаптирована к выращиванию в пристеночных условиях. Клетки отделяют от стекла с помощью 0,25% раствора трипсина, подогретого до температуры 37°С.

Ростовые свойства. При пересеве с коэффициентом 1:2-1:3 клеточный монослой формируется на 2-3 сутки после эксплантации. При условии коррекции рН среды до 7,5-7,6 сформированный монослой сохраняется до 5-6 суток. В культуральном флаконе объемом 1,5 м³ накапливается 40-45 млн клеток.

Морфология. Клетки фибробластоподобные.

Кариология. Культура клеток ВНК-21/13 резко гетероплоидная с вариабельностью хромосомных наборов от 32 до 78. Стволовую линию (модальный класс) составляют клетки с 40 хромосомами (32-34%), 4-6% клеток в популяции сохраняют диплоидный набор хромосом.

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10% от общего объема. Восстановление после хранения в жидком азоте происходит на 85-95%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 2-3 пассажах.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК21/13 [3].

Среда культивирования. Для суспензионного выращивания клеточной линии ВНК21/13 применяют среду Игла MEM, обогащенную серином (120 мг/дм³) и L-глутамином (610 мг/дм³) с добавлением 0,25% гидролизата лактоальбумина (ГЛА) и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС). При пристеночном культивировании применяют среду Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови КРС (рН среды 7,5-7,6).

Способ поддержания. Клеточная линия ВНК21/13 поддерживается в суспензионных условиях в реакторах различной емкости. При этом клетки сохраняют способность расти в пристеночных культурах. В этом случае при очередном пассировании клеточный пласт диспергируют 0,25% раствором трипсина, подогретого до температуры 37°С.

Ростовые свойства. В суспензионной культуре при посеве в концентрации 500 тыс.клеток/см³ обеспечивается 3-4 кратный прирост популяции на 3-4 сутки. При коэффициенте пересева 1:3 монослой формируется в пристеночных культурах на 2-3 сутки и сохраняет целостность и жизнеспособность не более 3 суток.

Морфология. Клетки эпителиоподобные.

Кариология. Популяция клеток ВНК21/13 гетероплоидная с разбросом числа хромосом в клетках от 20 до 78. Модальный класс составляют клетки с диплоидным набором хромосом (16-24%).

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10% от общего объема. Жизнеспособность клеток после хранения в жидком азоте составляет 88-96%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 1-2 пассажах.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17b [4, 5].

Данная клеточная линия является наиболее близким прототипом по отношению к заявляемому изобретению. Сублиния ВНК-21/2-17b получена во ВНИЯИ [4, 5] и хранится в жидком азоте на уровне 13 пассажа.

Среда культивирования. Для культивирования данной линии клеток применяют 0,25% мышечный гидролизат на растворе Эрла (для монослойных культур) и раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением 5 аминокислот (аргинин, глутамин, метеонин, цистин, серии), 8 витаминов группы В, 5% сыворотки крови КРС (рН среды 6,8-7,2).

Способ поддержания. Суспензионную культуру выращивают - отъемно-доливным методом, монослойную - в культуральных сосудах любой емкости. При очередном пересеве для диспергирования применяют смесь 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1.

Ростовые свойства. Через 48 часов культивирования в суспензии культура ВНК-21/2-17b дает 6-7 кратный прирост, достигая конечной концентрации 2,3-2,8 млн клеток/см³. При монослойном выращивании с посевной концентрации 0,05-0,10 млн клеток/см³ монослой формируется на 2-3 сутки.

Морфология. В суспензии культура ВНК-21/2-17b представлена одиночными блестящими, округлыми клетками. В монослое популяция состоит из эпителиальных и фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой.

Кариология. Культура гетероплоидная. Модальный класс представлен клетками с 42 хромосомами, составляющими в популяции 28-40%).

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10%) от общего объема. Жизнеспособность клеток после хранения в жидком азоте составляет 85-90%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 2-3 пассажах.

Чувствительность к вирусам. Культура клеток чувствительна к вирусу ящура типа А, О, С, Азия-1.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-02 [6].

Перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-02 получена на Щелковском биокомбинате и предназначена для репродукции вируса ящура, вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления вакцин против ящура и бешенства [6].

Клетки ВНК-21/13-02 характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, накопление которого в среднем составляет 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенных компонентов до 1,00 мкг/см³. Клетки чувствительны также к вирусу бешенства, обеспечивая репродукцию вируса со средним титром инфекционной активности 6,50 lg ЛД₅₀/см³.

Сублиния ВНК-21/13-02 адаптирована к суспензионному способу культивирования с использованием ростовой среды на основе солевого раствора Хенкса, содержащей 5-7% сыворотки крови КРС, 0,125% гидролизата мышечных белков и 0,125% гидролизата лактальбумина (ГЛА) с добавлением пяти аминокислот: L-аргинина 0,042 г/дм³; L-глутамина 0,584 г/дм³; L-тирозина 0,020 г/дм³; L-триптофана 0,015 г/дм³; L-цистина 0,032 г/дм³ и семи витаминов группы В: холин-хлорид 0,0034 г/дм³, пантотенат кальция (В₅) 0,0034 г/дм³, пиридоксаль-HCl 0,0034 г/дм³, тиамин (B₁) 0,0034 г/дм³, миоинозит 0,0068 г/дм³, никотинамид 0,0034 г/дм³, рибофлавин (В₂) 0,00034 г/дм³, фолиевая кислота (В₉) 0,0034 г/дм³.

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными округлыми клетками с небольшим количеством конгломератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой, иногда образуется единый цитоплазматический пласт без границ между клетками с наличием большого количества ядер. Отмечается присутствие 2-4 и более ядерных симпластов, лежащих изолированно или в структуре клеточного пласта. Отмечается отпочковывание ядер от общей ядерной массы и формирование микроядер в результате разрушения ядра. Часть клеток отделяется от стекла и растет в суспензии.

Способы культивирования. Монослой клеток ВНК-21/13-02 выращивают в культуральных флаконах любой емкости. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:9, нагретую до 37°С. Клетки снимают бесцентрифужным методом и ресуспендируют в ростовой среде до посевной концентрации. В суспензии культуру клеток выращивают отъемно-доливным способом в течение 48 часов до 10-50 последовательных пассажей.

Кариология. В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с 44 хромосомами. Кариотип суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствует кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-13 [7].

Перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-13 предназначена для репродукции вируса ящура типов А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления вакцин против ящура и бешенства [7].

Клетки характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве около 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенного компонента до 1,50 мкг/см³ (в наиболее близком аналоге, с использованием культуры клеток ВНК 13/02 - до 1,00 мкг/см³). Для клеток данной сублинии характерна повышенная чувствительность к вирусу бешенства, репродукция которого позволяет достичь титров инфекционной активности 6,50-8,00 lg ЛД₅₀/см³.

Клетки сублинии ВНК-21/13-13 отличаются высоким индексом пролиферации, который при суспензионном культивировании к 48 часам составляет 6-8 при жизнеспособности клеток 95-98%. С помощью заявляемой су 6 линии получают на 50% больше конечного продукта по сравнению с аналогом (сублиния ВНК-21/13-02).

Морфология. В суспензии сублиния ВНК-21/13-13 представлена одиночными фибробластоподобными клетками с прозрачной гомогенной цитоплазмой. Отмечается формирование отдельных конгломератов, состоящих из 5-10 клеток.

Кариология. Число диплоидных метафазных пластинок (2n=44) составляет 17% от общего числа. Разброс числа хромосом в клетках культуры колеблется от 20 до 64, модальный класс представлен пластинками, содержащими 30 хромосом, что составляет 43%.

Способ культивирования. В суспензии культуру клеток выращивают в течение 48 часов до 50 последовательных пассажей.

Суспензионное культивирование проводят в реакторах емкостью 4, 40, 100, 600 и 2000 л с рабочими объемами 3, 30, 60, 450 и 1800 л, соответственно, при следующих параметрах:

- посевная концентрация - 0,4⋅10⁶-0,5⋅10⁶ клеток/см³;

- скорость перемешивания - 25-40 об/мин;

- температура культивирования - 36,0-36,5°С;

- рН среды - 6,50-7,15;

- аэрация путем барботирования воздухом в количестве 0,5-1,5 л воздуха/л суспензии.

Представленные выше сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка отличаются довольно высокими показателя интенсивности прироста и позволяют проводить репродукцию вирусов ящура и бешенства. При этом для промышленного получения культуральных вакцинных препаратов против ящура, бешенства, а также парагриппа-3 КРС и болезни Ауески требуется суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, обеспечивающая накопление вирусов с более высокими значениями титров инфекционной активности и количествами антигенных компонентов, определяющих такой важный показатель качества вакцин, как их иммуногенность. Прототипные клеточные линии почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13) позволяют получать вирус ящура с титрами инфекционной активности не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, вируса бешенства - 8,00 lg ЛД₅₀/см³. Концентрации иммуногенных компонентов в получаемых вирусных суспензиях с применением данных клеточных сублиний составляют для вируса ящура не более 1,5 мкг/см³ [7]. Сведения о результатах культивации вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в тексте патентов на сублинии клеток ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13 не обнаружены.

В связи с этим целесообразно получить альтернативную сублинию клеток почки новорожденного сирийского хомячка, позволяющую удовлетворить нужды производственного процесса по репродукции вируса ящура с титрами инфекционной активности выше 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и накоплением иммуногенных компонентов более 1,5 мкг/см³, вируса бешенства с титрами выше 8,00 ЛД₅₀/см³, а также вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески с титрами инфекционной активности 6,00 lg ТЦД₅₀/см³ и выше.

Задачей изобретения являлось получение новой перевиваемой суспензионной сублинии клеток, позволяющей по сравнению с прототипным вариантом значительно повысить титр инфекционной активности вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески и увеличить концентрацию их иммуногенных компонентов при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.

Данная задача решена благодаря созданию перевиваемой суспензионной сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRI АН, предназначенной для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески и производства противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.

Полученная сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH характеризуется высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается за 8-15 ч в количестве до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенных компонентов 0,50-1,95 мкг/см³ с 1,0 млн клеток. При использовании культуры клеток ВНК-21/13-02 (аналог) титр вируса ящура составляет до 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, количество иммуногенных компонентов - до 1,00 мкг/см³ со всей популяции клеток. Применяя сублинии клеток ВНК-21/13-13 и ВНК-21/2-17b (аналоги), титр инфекционности вируса ящура достигает также 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ с концентрацией иммуногенных компонентов до 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток.

Сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проявляет высокую чувствительность к заражению вирусом бешенства и обеспечивает за 48 ч накопление вируса с титрами до 8,50 lg ЛД₅₀/см³. Прототипная клеточная сублиния ВНК-21/13-02 позволяет проводить репродукцию возбудителя бешенства с конечными значениями титра инфекционной активности до 6,50 lg ЛД₅₀/см³, а линии ВНК-21/13-13 и BHK-21/2-17b - до 8,00 lg ЛД₅₀/см³.

Клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRI АН дает возможность проводить репродукцию вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески с титрами инфекционности до 6,00 и 7,80 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. В текстах патентов на прототипные клеточные сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13) информация о получении вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески не обнаружена.

С помощью заявляемой сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH для производства противоящурных вакцин и для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов возможно получать антигенный материал с титром на 1,00 lg ТЦД₅₀/см³ выше (до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³) и концентрацией иммуногенных компонентов в 2-3 раза выше (до 1,95 мкг/см³ с 1 млн кл.) по сравнению с аналогами (не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток). Предложенная сублиния позволяет проводить репродукцию вируса бешенства с титром на 0,50 lg ЛД₅₀/см³ выше (до 8,50 lg ЛД₅₀/см³) по сравнению с прототипными линиями (не более 8,00 lg ТЦД₅₀/см³), а также получать вирусы парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в количествах 6,00 и 7,80 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Экспоненциальный характер роста концентрации клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с затуханием пролиферации после 48 часов суспензионного культивирования.

Фиг. 2 - Кариограмма популяции клеток сублинии ВНК-21/2-17b на момент патентования (1986 г.).

Фиг. 3 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/2-17b (1 пассаж).

Фиг. 4 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/2-17b (2 пассаж).

Фиг. 5 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора стеклянного объемом 50 дм³ (количество исследований (N)=50).

Фиг. 6 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора металлического объемом 1000 дм³ (N=50).

Фиг. 7 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора металлического объемом 2000 дм³ (N=50).

Фиг. 8 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Фиг. 9 - Визуализация ядер суспензионных клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при окрашивании акридиновым оранжевым.

Фиг. 10 - ДНК-гистограмма клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH (А) и ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип) (В).

Фиг. 11 - Изменение кратности прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, рекультивированных после криоконсервирования (указаны средние значения кратности прироста, N=30, р<0,005).

Заявляемые преимущества изобретения обусловлены генетическими характеристиками созданной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая была получена путем перманентного культивирования в суспензии сублинии клеток ВНК-21/2-17b на протяжении 30 лет, а также подбором ростовой среды оригинального состава.

Перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH адаптирована к суспензионному способу выращивания с использованием ростовой среды на основе раствора Хенкса, в который добавляют 15-20 см³/дм³ 10%-ого гидролизата белков крови, 5% сыворотки крови КРС и 2-10 см³/дм³ 10%-ого перевара по Хоттингеру. Рецептура данной ростовой среды включает в себя также добавление 8 протеиногенных аминокислот: 128,3 мг/дм³ L-аргинина, 584,0 мг/дм³ L-глутамина, 7,6 мг/дм³ L-изолейцина, 26,4 мг/дм³ L-метионина, 12,6 мг/дм³ L-тирозина, 35,7 мг/дм³ L-треонина, 15,0 мг/дм³ L-триптофана, 32,0 мг/дм³ L-цистеина. В качестве моносахаров применяют глюкозу в количестве 4000 мг/дм мг/дм³. Состав ростовой среды включает в себя следующий витаминный комплекс: инозитол (6,0 мг/дм мг/дм³), никотинамид (3,0 мг/дм³), пантотенат кальция (3,0 мг/дм³), пиридоксаля гидрохлорид (3,0 мг/дм³), рибофлавин (0,3 мг/дм³), тиамин (3,0 мг/дм³), фолиевая кислота (3,0 мг/дм³), холина хлорид (3,0 мг/дм³). В качестве минеральных компонентов применяют следующие неорганические соли: калий фосфорнокислый (60,0 мг/дм³), калий хлористый (400,0 мг/дм³), кальций хлористый 6-водный (140,0 мг/дм³), магний сернокислый (200,0 мг/дм³), гидрокарбонат натрия (400,0 мг/дм³), дигидрофосфат натрия (150,0 мг/дм³), натрий хлористый (8000,0 мг/дм³) (таблица 1).

Преимуществом ростовой среды данного состава для культивирования клеток сублинии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH является использование жидкого гидролизата белков крови и перевара по Хоттингеру, которые обеспечивают богатый аминокислотный состав среды, а, следовательно, и более высокие ростовые свойства клеток. Проведен сравнительный анализ качественного и количественного аминокислотного состава используемой ростовой среды до и после добавления ГБК и перевара по Хоттингеру. Результаты исследования отражены в таблице 2, из которой следует, что готовая ростовая среда содержит больше L-аргинина на 21,62 мг/дм³, L-изолейцина на 150,00 мг/дм³, L-метионина на 28,86 мг/дм³, L-тирозина на 49,60 мг/дм³, L-треонина на 130,28 мг/дм³, L-триптофана на 38,20 мг/дм³, L-цистеина на 146,00 мг/дм³ по сравнению со средой без ГБК и перевара по Хоттингеру.

Полученная клеточная сублиния ВНК-21 /SUSP/ARRIAH депонирована 23 апреля 2019 г. в Институте цитологии РАН «Специализированная коллекция культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных»». Линии клеток присвоен номер: №РККК(П) 797 Д.

Перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13 получена в 1961 году в Англии Максферсоном и Стокером. Путем селекции данной культуры клеток во ВНИЯИ (Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт) была получена клеточная сублиния ВНК-21/2-17b, из которой через 30 лет путем перманентного культивирования в суспензии получена новая сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Морфологическая характеристика клеточной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании на субстрате не имеет постоянной формы, иными словами, ее можно охарактеризовать как «аморфная». В оптимальных условиях культивирования на клетках наблюдается большое количество высокоподвижных цитоплазматических выростов с динамикой в несколько минут; в суспензионном состоянии клетка характеризуется сферической формой с множеством микровыростов.

Способы и условия культивирования клеточной сублинии BHK-21/SUSP/ARRIAH.

Суспензионное культивирование. Клетки су 6 линии

ВНК-21/SUSP/ARRIAH выращивают отъемно-доливным способом, раздельными циклами по 10-12 пассажей. При посевной концентрации 0,50-0,60 млн клеток/см через 48 часов культивирования в оптимальном режиме концентрация составляет 4,00-5,50 млн клеток/см. Иными словами, кратность прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH составляет 6,67-11,00 при жизнеспособности клеток 96-99%. В процессе культивирования проводится аэрация суспензии стерильным воздухом в количестве 0,5-1,7 л воздуха/л среды. Температура культивирования клеток составляет 37,0±0,5°С, Водородный показатель среды поддерживается в пределах 6,6-7,2 путем добавления 7,5%-ого раствора бикарбоната натрия. Общая тенденция суспензионного культивирования клеточной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 48 часов имеет стандартную динамику роста (экспоненциальный характер роста с затуханием пролиферации после 48 часов культивирования) (фиг. 1).

Следует отметить сформированную у клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH ацидофильность, толерантность к более низким значениям водородного показателя (рН<7,0) по сравнению с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b, клетки которой культивировали в среде с нейтральным и слабощелочным показателями рН.

Монослойное культивирование клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Суспензионные клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании в культуральных флаконах адгезируются в небольшом количестве на поверхности, не имеют постоянной формы и формируют цитоплазматические выросты разной длины с динамикой в несколько минут.

Закономерности роста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

В начале логарифмической стадии роста активизируется синтетическая фаза (S) и уменьшается относительное количество диплоидных клеток. Пресинтетическая фаза (G1) стабилизируется и относительно уменьшается до конца культивирования. При этом увеличивается относительное количество тетраплоидных (G2) клеток и клеток, находящихся в метафазе (М).

В клеточном цикле популяции преобладает диплоидная фаза цикла (G1), на которую приходится 30 до 75% клеток в зависимости от условий культивирования. В фазе подготовки к митозу и митотического деления находится от 3,0 до 20% всей популяции. Количество крупноядерных и многоядерных клеток (>4n) увеличивается в начале и в конце стадии логарифмического роста, но количество их не превышает 2%.

Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH выделена из культуры ВНК-21/2-17b путем прохождения около 100 пассажей в суспензии в течение 30 лет, минуя монослойную стадию, вследствие чего изменилась кариологическая картина.

Кариологическое исследование сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили с применением метода Moorhead и др. [8]. После получения препарата с метафазными пластинками, производилось фотографирование 100 метафазных пластинок, далее их подсчет и составление кариограммы. По результатам исследования выяснили, что сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH образует неоднородную по кариологическим признакам популяцию клеток, в основном анеуплоидных. Модальный класс - 41 хромосома (32-40%), доля клеток с количеством хромосом 40-42 составляет 78-80%, полиплоидов - менее 1%. Пределы изменчивости хромосом для суспензионных клеток данной сублинии составили 36-54. Представленная сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH отличается от прототипов по кариологическим показателям. Кариологическая характеристика для культуры ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип): модальное число хромосом 42 (28-40%), пределы изменчивости хромосом - 37-44. Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/13-02: модальное число хромосом 42, пределы изменчивости хромосом - 31-80 для суспензионных клеток; в монослойной культуре модальное число хромосом 44, пределы изменчивости хромосом - 31-98. Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/13-13: число диплоидных метафазных пластинок 2n=44 составляет 17% от общего числа. Разброс числа хромосом в клетках культуры колеблется от 20 до 64, модальный класс представлен пластинками, содержащими 30 хромосом, что составляет 43% (таблица 3).

Видовая принадлежность клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Культура идентифицирована как ткань почки новорожденного сирийского хомячка, с помощью дифференциального С-окрашивания хромосом.

Криоконсервация и жизнеспособность клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH после криоконсервации. Для хранения суспензии клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при температуре -70°С используют пластиковые культуральные флаконы. Для длительного хранения при температуре -196°С применяют ампулы. Консервацию клеток осуществляют в криосреде (ростовая среда (состав отражен в таблице 1) с добавлением 7-10% этиленгликоля и 20% фетальной сыворотки КРС) в ампулах объемом 80 см³ с концентрацией клеток 20,0-30,0 млн/см³. До температуры -70°С суспензию клеток охлаждают со скоростью 2°С/мин, до температуры -150°С - 10°С/мин, затем ампулы помещают в жидкий азот (-196°С). Размораживание производят в температурном диапазоне 39-42°С в течение 2 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования на первом пассаже составляет 85-90%, затем увеличивается до 96-99%. После реконсервации клеток и выращивания непосредственно в суспензии (в ферментере) в течение первого пассажа происходит задержка пролиферации на сутки.

Описание способа получения сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве исходного материала использовали перевиваемую монослойно-суспензионный линию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 2-17b, полученную во ВНИЯИ в 1986 г. [4, 5]. Данная клеточная сублиния применялась в качестве производственной в течение 10-12 пассажей для получения суспензий с концентрациями клеток 3,5-4,0 млн клеток/см³. Для культивирования данных клеток была разработана ростовая среда оригинального состава (таблицы 1 и 2), содержащая 5% сыворотки крови КРС, 15-20 см³/дм³ гидролизата белков крови, 2-10 см³/дм³ перевара по Хоттингеру, 8 протеиногенных аминокислот (L-аргинин, L-глутамин, L-изолейцин, L-метионин, L-тирозин, L-треонин, L-триптофан, L-цистеин), глюкозу, комплекс витаминов и минеральных солей.

Клетки многократно подвергали криоконсервации с последующим размораживанием и выращиванием в данной ростовой среде до 13 пассажа. Для криоконсервирования применяли криосреду, представляющую собой ростовую среду (таблица 1) с добавлением 7-10% этиленгликоля и 20% фетальной сыворотки КРС.

В течение 30 лет клеточная сублиния ВНК-21/2-17b прошла около 100 пассажей и преобразовалась в новую сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH, клетки которой отличаются однообразием морфологии и размера с высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 6,67-11,00) и количеством жизнеспособных клеток 96-99%.

Клеточная сублиния прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Морфологические исследования клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b.

Перевиваемая клеточная сублиния ВНК-21/2-17b более 30 лет культивировалась в суспензионных условиях без монослойной стадии. Перемежающиеся заморозки в больших ампулах объемом 100 см3 позволяли поддерживать популяции клеток в активном состоянии, без снижения пролиферативной активности (кратность прироста не менее 4-6) благодаря использованию ростовой среды модифицированного состава (таблицы 1, 2).

На фиг. 3 показано морфологическое состояние клеток сублинии ВНК-21/2-17b на момент патентования (1986 г.). Морфология клеток была определена как аморфная, иными словами, при посеве на субстрат в первом пассаже клетки не имели постоянной формы, активно перемещались и только во время деления приобретали сферическую форму. На втором пассаже клетки данной сублинии полноценно адгезировались и принимали эпителиоподобную форму. После полного покрытия субстрата часть клеток переходила в суспензионное состояние (фиг. 4) и характеризовалась высокими показателями пролиферативной активности (кратность прироста составляла не менее 4-6).

В результате суспензионного культивирования в производстве клетки перевиваемой сублинии ВНК-21/2-17b были подвержены около 100 последовательным пассажам в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2). При этом монослойная стадия наработки данной культуры клеток не применялась. В результате была получена новая суспензионная клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Морфология суспензионных клеток выведенной сублинии представлена на фиг. 8. По итогам морфологического анализа видно, что внешне клетки практически не меняются по сравнению с сублинией ВНК-21/2-17b. В популяции преобладает доля мелких клеток размером 8-10 мкм (до 90%). При этом в процессе пассирования на горизонтальной поверхности клетки слабо адгезируются (исключение составляют полиплоиды) и интенсивно перемещаются. В результате многократных митотических делений наблюдается значительное увеличение концентрации клеток в культуральном флаконе в суспензионном состоянии. Иными словами, созданная клеточная линия ВНК-21/SUSP/ARRIAH представляет собой исключительно суспензионную клеточную сублинию.

Для оценки размера ядра относительно цитоплазмы проводили обработку суспензионных клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH акридиновым оранжевым. Для анализа проводили отбор 50 образцов клеточных суспензий новой сублинии после выращивания клеток в стеклянных и металлических реакторах. В результате экспозиции с акридиновым оранжевым ядра приобретали яркое зеленовато-желтое окрашивание и были визуализированы на оранжевом фоне цитоплазмы (фиг. 9). По итогам измерений диаметров ядер и клеток пришли к выводу о том, что для новой сублинии отмечается увеличение размера ядра относительно цитоплазмы и размера клетки. В некоторых случаях размер ядра составлял 60-80% от объема клетки.

Пример 2. Кариологическое исследование клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной линией ВНК-21/2-17b.

Кариологическое исследование сублинии клеток

ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b проводили с применением метода Moorhead и др. [8]. После получения препарата с метафазными пластинками, производили фотографирование 100 метафазных пластинок, их подсчет и составление кариограммы.

На фиг. 2 показан популяционный состав культуры клеток ВНК-21/2-17b на момент патентования в 1986 г. Многократные опыты указывали на стабильное преобладание популяций с 42 хромосомами (28-40% от всей популяции).

В течение трех десятилетий в производстве монослойная стадия наработки данной культуры клеток не применялась. В результате суспензионного культивирования в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2) в течение около 100 последовательных пассажей клетки ВНК-21/2-17b трансформировались в новую клеточную сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Популяции клеток данной линии, выращенных в стеклянных и металлических культиваторах объемом 50, 1000 и 2000 дм соответственно, подвергали кариологическому анализу. Для исследования использовали по 50 образцов клеточных суспензий, полученных через 48 ч после посева. По итогам анализа выяснили, что в однородных условиях культивирования в клетках произошли некоторые кариологические изменения. Модальный класс новой сублинии стал равен 41 хромосоме и соответствует 32-40% популяции. Доля клеток с количеством хромосом 40-42 составляет 78-80%), полиплоидов - в среднем около 1%. Пределы изменчивости хромосомного набора для клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH соответствуют диапазону от 36 до 54 хромосом. Наличие 36 хромосом отмечают у 0-1% популяций, 37 хромосом - у 0-4%, 38 хромосом - у 2-9%, 39 хромосом - у 3-11%, 40 хромосом - у 8-24%, 42 хромосомы - у 15-27%, 43 хромосомы - у 6-12%, 44 хромосомы - у 2-3%, 46 хромосом - у 0-2% и 52-54 хромосом - у 0-2% (фиг. 5-7).

Сравнивая все кариограммы можно сделать вывод, что при суспензионном культивировании в указанных выше условиях происходит селекция полученной клеточной сублинии в направлении гипоплоидии, при этом модальный класс не опускается ниже 41 хромосомы.

Пример 3. Цитометрические исследования клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH для анализа клеточного цикла в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b.

Для сравнительного анализа фаз жизненного цикла клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH и ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип) провели цитометрические исследования на проточном цитометре «Accuri С6» с помощью набора для определения ДНК клеток «С6 Flow Cytometer Fluid Kit» (N=22). ДНК-гистограммы для клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH и ВНК-21/2-17b через 48 ч после пересева клеточной суспензии представлены на фиг. 10 и в таблице 4.

Из сведений, отраженных на фиг. 10, и средних значений таблицы 4 видно, что у прототипной линии ВНК-21/2-17b клеток в состоянии апоптоза и дебриса было 51,0-60,0%, что на 31,0-5,0%) больше, чем у клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH (20,0-55,0%). В G1-фазе (пресинтетический период) находилось 30,0-75,0% клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH и 28,0-70,3% клеток сублинии ВНК-21/2-17b. Во время данной фазы клетки указанных линий подготавливаются к удвоению хромосом, отмечается интенсивный полипептидов, увеличивается количество митохондрий и рибосом. В данной стадии клетки новой сублинии находятся на 2,0-4,7%) в большем количестве по сравнению с прототипным вариантом.

Следует отметить, что, вероятно, у сублинии ВНК-21/2-17b часть клеток между митотической фазой М и началом S-фазы переходит в стадию апоптоза, что, соответственно, в дальнейшем сказывается на кратности прироста всей клеточной популяции.

В стадии S-фазы (синтетический период), когда наблюдается репликация клеточной ДНК во многих репликонах, и начинается удвоение центриолей в клеточном центре, у сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH находится 2,0-33,0% клеток, а у прототипной линии - 1,5-30,0%», что на 0,5-3,0% выше по сравнению с клетками новой сублинии.

В 02-фазе (постсинтетический период), во время которой накапливаются энергия, белки для митотического деления клетки и достигается тетраплоидный набор ДНК, а также в М-фазе (митоз) через 48 ч у сублинии ВНК-21/2-17b находится 2,6-18%) клеток, а у ВНК-21/SUSP/ARRIAH - 3,0-20% клеток, что на 0,4-2,0% выше и свидетельствует о большем потенциале клеток новой сублинии для продолжения деления.

Таким образом, в результате суспензионного культивирования в ростовой среде модифицированного состава в течение 100 последовательных пассажей клетки перевиваемой линии ВНК-21/2-17b трансформировались в новую сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH, для которой, вероятно, произошла селекция основной популяции, что проявилось в снижении количества клеток, находящихся в стадии апоптоза и дебриса на 31,0-5,0%, и в увеличении числа клеток, участвующих в G1-, S- и G2+М-фазах на 2,0-4,7, 0,5-3,0, 0,4-2,0%), соответственно, обеспечивающих клеточный рост.

Пример 4. Оценка ростовых свойств клеток су 6 линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипными сублиниями.

Клетки су 6 линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, полученные в результате длительного суспензионного культивирования (около 100 пассажей) в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2) исследовали на оценку ростовых свойств в сравнении с клетками прототипных сублиний ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13. Результаты анализа представлены в таблице 5 и на фиг. 1.

Из данных таблицы 5 видно, что при суспензионном культивировании клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH отъемно-доливным способом, раздельными циклами по 10-12 пассажей, при посевной концентрации 0,5-0,6 млн клеток/см через 48 часов культивирования в оптимальном режиме концентрация составляет 4,0-5,5 млн клеток/см³. Таким образом, кратность прироста равна 6,67-11,00 при жизнеспособности клеток 96-99%. Отмечается экспоненциальный характер роста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензионном состоянии с затуханием пролиферации после 48 часов культивирования (фиг. 1).

Суспензионные клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании в культуральных флаконах в статичных условиях характеризуются низкими показателями адгезии, имеют аморфную форму с множеством цитоплазматических выростов, динамика которых составляет несколько минут.

Таким образом, в сравнении с прототипами клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при суспензионном выращивании имеют большую кратность прироста на 0,67-3,00 с сохранением жизнеспособности клеток на 96-99%.

Пример 5. Репродукция вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипными сублиниями.

В клетках перевиваемой суспензионной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH провели репродукцию вируса ящура штаммов А/Турция/2006 (N=100), O/PanAsia-2 (N=100), Азия-1/Таджикистан/2011 (N=80), вируса бешенства штаммов ВНИИЗЖ (N=40) и РВ-97 (N=40), вируса болезни Ауески штаммов ВК (N=40) и К (N=40), вируса парагриппа-3 КРС штамма ВГНКИ-4 (N=50) с целью получения вируссодержащего сырья для изготовления противовирусных вакцин.

Результаты культивирования указанных вирусов представлены в таблице 6 и проведен сравнительный анализ с данными для прототипных клеточных сублиний ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13. Из таблицы 6 следует, что вирус ящура в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 95-99% с титрами инфекционной активности 7,30±0,13 - 8,00±0,21 lg ТЦД₅₀/см³ (N=280) (в аналогах, с использованием культур клеток ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13, - до 7,00 lg ТЦД₅₀/см³).

С помощью метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции [9] определяли концентрацию иммуногенного 146S компонента вируса ящура после репродукции в полученной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая в среднем составила 1,95±0,32 мкг/см³ с 1,00 млн клеток. При использовании культуры клеток ВНК-21/13-02 (аналог) количество иммуногенных компонентов составляло до 1,00 мкг/см³, а клеток сублиний ВНК-21/13-13и ВНК-21/2-17b (аналоги) до 1,50 мкг/см³ с общей популяции клеток.

При репродукции вируса бешенства в полученной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH - ЦПД составило 95-99% с титрами инфекционности - 8,25±0,20 - 8,50±0,13 ЛД₅₀/см³ (N=100), а в аналогах, с использованием культуры клеток ВНК-21/13-02 - 6,50 ЛД₅₀/см³, с ВНК-21/2-17b и ВНК-21/13-13 - до 8,00 ЛД₅₀/см³. Вирус болезни Ауески при культивировании в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH вызывал ЦПД у 95-97% клеток с накоплением 7,50±0,19 - 7,80±0,15 lg ТЦД₅₀/см³ (N=80), а вирус парагриппа-3 КРС обеспечивал ЦПД клеток на 95-98%) с титром инфекционной активности до 6,00±0,15 lg ТЦД₅₀/см³ (N=50).

Таким образом, клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, полученной для производства противоящурных вакцин а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов, позволяют проводить репродукцию вируса ящура с титром на 1,00 lg ТЦД₅₀/см³ выше (до 8,00±0,21 lg ТЦД₅₀/см³) и концентрацией иммуногенных компонентов в 2-3 раза выше (до 1,95 мкг/см³ с 1 млн клеток) по сравнению с аналогами (не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток). Предложенная сублиния обеспечивает накопление вируса бешенства с титром на 0,50 lg ЛД₅₀/см³ (до 8,50±0,13 lg ЛД₅₀/см³) выше по сравнению с прототипными линиями (не более 8,00 lg ЛД₅₀/см³), а также получать вирусы парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в количествах 6,00±0,15 и до 7,80±0,15 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно.

Пример 6. Оценка жизнеспособности клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, рекультивированных после криоконсервирования.

Криоконсервирование суспензии клеток полученной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в производственных условиях проводят в ампулах объемом 100 см³ в криосреде (ростовая среда (таблица 1) с добавлением 7-10%) этиленгликоля и 20%>фетальной сыворотки КРС). До температуры -70°С суспензию клеток охлаждают со скоростью 2°С/мин, до температуры -150°С - 10°С/мин, затем ампулы помещают в жидкий азот (-196°С), предварительно подержав над парами азота. Размораживание клеточной суспензии осуществляют при температуре 39-42°С в течение 2 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования на первом пассаже составляет 85-90%, со второго пассажа увеличивается до 96-99%. После реконсервации клеток и выращивания непосредственно в суспензии (в ферментере) в течение первого пассажа происходит задержка пролиферации на сутки. На фиг. 11 показана кратность прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 12 последовательных пассажей после криоконсервации. Данное исследование проводили в 30 повторностях. Интенсивность пролиферации на первом-третьем пассажах после криоконсервирования варьировала от 3,36±0,21 до 5,88±0,15 (р<0,005). Начиная с четвертого пассажа значения кратности прироста составляли от 6,85±0,18 до 10,95±0,31 (р<0,005).

Таким образом, клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH быстро рекультивируется после криоконсервирования и отличается высокими пролиферативными показателями (до 10,95±0,31) с жизнеспособностью клеток 95-99%о.

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является новая перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая предназначена для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески с большим накоплением антигена для производства противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.

Предлагаемое изобретение отличается высокими показателями пролиферативной активности клеток полученной сублинии, существенными изменениями кариологических показателей и селекцией в направлении гипоплоидии с 41 хромосомой в модальном классе. В предлагаемом изобретении отмечается снижение количества клеток, находящихся в стадии апоптоза, на 31,0-5,0% и увеличение доли клеток, участвующих в обеспечивающих клеточный рост G1-, S- и G2+М-фазах, на 2,0-4,7, 0,5-3,0, 0,4-2,0%, соответственно.

Предлагаемое изобретение отличается высокой кратностью прироста клеток 6,67-11,00 с сохранением жизнеспособности клеток на 96-99%, начиная со второго пассажа рекультивации после криоконсервирования.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «ВНК-21/SUSP/ARRIAH - перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.»:

1. Stoker М., Macpherson I.A. Syrian hamster fibroblast cell line BHK-21 and its derivaties // Nature. - 1964. - V. 203. - P. 1355-1357.

2. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 60.

3. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 61.

4. Сокова В.В., Алеева Л.А., Бондаренко А.Ф., Худяков Г.А, 1988. Авторское свидетельство СССР №240289, 1986.

5. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 62.

6. Патент РФ №2614074, 22.03.2017. ВНК-21/13-02-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства // Патент России №заявки 2005116301/2017.03.22. Бюл. №9 / Елисеев А.К., Мельник Н.А., Зенов Н.И. [и др.].

7. Патент РФ №2553552, 01.08.2014. ВНК-21/13-13-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства // Патент России №заявки 2014131866/10/2014.08.01. МПК C12N / Елисеев А.К., Зенов Н.И., Красуткин С.Н. [и др.].

8. Moorhead P.S. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral Blood / P.S. Moorhead, P.C. Nowell, W.J Mellman et al. // Exper. Cell. Res. - 1960. - V. 20. - P. 613-616.

9. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Патент России №2016140460/15. 2017. Бюл. №14 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].