Способ прогнозирования риска развития интоксикации свинцом и его соединениями

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска развития интоксикации свинцом и его соединениями.

Известен способ прогнозирования риска развития риска развития интоксикации свинцом и его соединениями, включающий забор венозной крови, выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, выявление полиморфизма MspI ALAD в гене дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты. (Пай Г.В., Спицын В.А., Кузьмина Л.П., Юферева Н.В. Исследование полиморфизма в генах GSTM1, CYP1A1 Р450 и ALAD в качестве возможных маркеров предрасположенности к некоторым формам профессиональной патологии // Медицинская генетика. - 2005 - Т. 4 - №5 - С. 245-246).

Однако данный способ осуществляет прогнозирование риска развития интоксикации свищом и его соединениями, только на основе выявления полиморфного вариантов гена дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты, не учитывая наследственной предрасположенности к нарушению синтеза фермента копропорфириноген оксидазы, в результате которой происходит накопление неактивных форм металлоорганических соединений свинца в печени, селезенке, коже и вызывает развитие симптомов интоксикации свинцом, что снижает степень достоверности прогнозирование риска развития интоксикации свинцом и его соединениями, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих за короткие (сжатые) сроки времени.

Задачей настоящего изобретения является повышение степени достоверности прогнозирования риска развития интоксикации свинцом и его соединениями у лиц, подвергающихся воздействию свинца и его соединений при проведении предварительных и периодических медицинских осмотров большого количества работающих за короткие (сжатые) сроки времени.

Техническим результатом изобретения является возможность своевременного выявления лиц с учетом их наследственной предрасположенности к нарушению синтеза фермента копропорфириноген оксидазы и, как следствие, к развитию интоксикации свинцом и его соединениями, для предупреждения ее развития путем рационального трудоустройства вне воздействия психоэмоционального стресса и формирования групп повышенного риска с целью проведения своевременной коррекции для повышения адаптационных способностей организма различными неспецифическими способами.

Указанная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования риска развития интоксикации свинцом и его соединениями, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами и выявление полиморфизма MspI ALAD в гене дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты, дополнительно проводят анализ продуктов амплификации методом флуоресцентной детекции в режиме реального времени и на основании этого выявления полиморфизма СРОХ А/С в гене копропорфириноген оксидаза СРОХ, и при одновременном обнаружении неблагоприятной аллели MspI ALAD*2 гена дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты и неблагоприятной аллели С гена копропорфириноген оксидазы прогнозируют высокий риска развития интоксикации свинцом и его соединениями у лиц, подвергающихся воздействию свинца и его соединений.

Ген ALAD кодирует фермент дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты. ALAD является вторым ферментом в процессе биосинтеза тема. Попадая в организм, металл депонируется во многих органах в виде нерастворимого трехосновного фосфата свинца. Большая его часть откладывается в трабекулах костей, что способствует вытеснению солей кальция из костной ткани. Из депо свинец элиминируется медленно, подчас в течение нескольких лет после прекращения контакта с ним. В организме происходит также накопление δ-аминолевулиновой кислоты. Дифференциальная роль генетического полиморфзма MspI в гене ALAD в подверженности свинцовой интоксикации была установлена на уровне дискретной изменчивости самого фермента. Фермент дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты синтезированный с полиморфного варианта MspI ALAD*2 более прочно и эффективно связывает свинец. Поэтому субъекты с аллелем ALAD*2 оказываются более чувствительными к отравлению свинцом и его соединениями.

Ген СРОХ кодирует синтез фермента копропорфириноген оксидазы, который катализирует окислительное декарбоксилирование металлопорфиринов. Металлопорфирины являются макроциклическими комплексами металлов (Mn, Co, Fe, Hg) и гетероциклических органических соединений (пиррол) и отличаются от бесчисленного множества других групп макроциклических комплексов тем, что являются ароматическими макроциклами с уникальной сопряженной σ-системой. В этом сопряженном состоянии металлы проявляют свою биологическую активность. При нарушении синтеза металлопорфиринов, обусловленных присутствием неблагоприятной аллели С гена копропорфириноген оксидазы, происходит накопление неактивных форм металлоорганических соединений в печени, селезенке, коже и вызывает развитие симптомов интоксикации - гипербилирубинемию, гемолитическую анемию, повышение чувствительности к солнечному свету, неврологические нарушения, злокачественные опухоли.

Таким образом, при одновременном обнаружении неблагоприятной аллели MspI ALAD*2 гена дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты и неблагоприятной аллели С гена копропорфириноген оксидазы прогнозируют высокий риска развития интоксикации свинцом и его соединениями у лиц, подвергающихся воздействию свинца и его соединений, в связи со снижением активности фермента дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты, и копропорфириноген оксидазы, являющихся ферментами синтеза гема, что приводит к нарушению синтеза порфиринов, который приводит к снижению синтеза гема и накоплению железа в организме. Результатом этого является снижение жизнеспособности и сокращение продолжительности жизни циркулирующих в крови эритроцитов. Нарушение синтеза гема является ведущим механизмом развития свинцовой интоксикации.

Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.

Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

У пациентов осуществляют забор венозной крови.

Далее из цельной крови выделяют ДНК с использованием, например, комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "Ампли Прайм ДНК-сорб-В" в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК используют для постановки полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.

Для выявления полиморфизма MspI ALAD в гене дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты используются специфические праймеры: ( и . Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

При использовании амплификатора «Т100 Thermal Cycler» (BioRad, США), когда температура достигнет 95°С (режим паузы) ставят пробирки в ячейки амплификатора и выдерживают их при температуре 95 0С - 5 мин. Далее выдерживают пробирки 45 циклов: при 95°С - 10с, при 65°С - 10с, при 72°С - 10с, а в конце при 72°С - 2 мин.

После амплификации образующийся нуклеотидный продукт протяженностью 916 п.н. подвергают обработке рестриктазой MspI. Далее фрагменты рестрикции анализируются методом электрофореза в 7% полиакриламидном геле с последующей обработкой бромистым этидием и визуализацией в УФ-свете.

Выявление полиморфизма СРОХ А/С в гене копропорфириноген оксидаза СРОХ проводят с помощью наборов, например, «СИНТОЛ», Россия. При этом используют набор реагентов «SNP-Скрин». Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма СРОХ А/С проводят по следующей программе.

При использовании амплификатора «CFX 96» (BioRad, США) выдерживают пробирки при +94°С - 3 мин, затем 40 циклов: при 94°С - 15 с, при 64°С - 40 с. При этом используют каналы FAM и HEX. Детекция продуктов амплификации осуществляют на каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала: по каналу FAM - для аллели А, по каналу HEX - для аллели С.

При одновременном обнаружении неблагоприятной аллели MspI ALAD*2 гена дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты и неблагоприятной аллели С гена копропорфириноген оксидазы прогнозируют высокий риска развития интоксикации свинцом и его соединениями у лиц, подвергающихся воздействию свинца и его соединений, с учетом их наследственной предрасположенности к нарушению синтеза фермента копропорфириноген оксидазы и дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты.

Пример 1.

Пациент П., 32 года. Профессия - плавильщик участка плавки и рафинирования свинца на предприятии по вторичной переработке свинца. Стаж - 3 года. Работа заключается в плавке аккумуляторного лома, паст и рафинировании чернового свинца. Среднесменные концентрации свинца и его неорганических соединений на рабочем месте - 0,1 мг/м³. Класс условий труда - 3.2 - 3.3. Ежегодно проводились периодические медицинские осмотры, у пациента И. выявлена хроническая свинцовая интоксикация («свинцовая колика», нормохромная анемия, сенсорная полинейропатия, НЦД по гипертоническому типу). Лабораторные показатели: АЛК мочи - 31,8 мкмоль/гКР (референсные значения - до 19 мкмоль/гКР), уровень свинца в моче - 65,2 мкг/л (референсные значения - до 40 мкг/л), эритроциты - 4,52*10¹² (референсные значения - 4,4-6,2*10¹²), базофильная зернистость эритроцитов - 27 на 10000 эритроцитов (референсные значения - до 4 на 10000 эритроцитов), гемоглобин - 135 г/л (референсные значения - 137-175 г/л).

Кровь больного исследовалась заявленным способом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК использовали для постановки реакции амплификации со специфическими праймерами.

Для выявления полиморфизма MspI ALAD в гене дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты использовали специфические праймеры: ( и . Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Полимеразную цепную реакцию для выявления MspI ALAD в гене дегидратазы 8-аминолевулиновой кислоты проводили по следующей программе.

При использовании амплификатора «Т100 Thermal Cycler» (BioRad, США), когда температура достигала 95°С (режим паузы) ставили пробирки в ячейки амплификатора и выдерживали их при температуре 95°С - 5 мин. Далее выдерживали пробирки 45 циклов: при 95°С - 10с, при 65°С - 10с, при 72°С - 10с, а в конце при 72°С - 2 мин.

После амплификации образующийся нуклеотидный продукт протяженностью 916 п.н. подвергали обработке рестриктазой MspI. Далее фрагменты рестрикции анализировались методом электрофореза в 7% полиакриламидном геле с последующей обработкой бромистым этидием и визуализацией в УФ-свете.

Выявление полиморфизма СРОХ А/С в гене копропорфириноген оксидаза СРОХ проводили с помощью наборов фирмы «СИНТОЛ», Россия. При этом использовали набор реагентов «SNP-Скрин» для выявления полиморфизма СРОХ А/С.Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма СРОХ А/С проводили по следующей программе.

При использовании амплификатора «CFX 96» (BioRad, США) выдерживали пробирки при +94°С - 3 мин, затем 40 циклов: при 94°С - 15 с, при 64°С - 40 с. При этом использовали каналы FAM и HEX. Детекция продуктов амплификации осуществлялась на каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа строила кривые накопления флуоресцентного сигнала: по каналу FAM - для аллели А, по каналу HEX - для аллели С.

У пациента П. выявлены неблагоприятная аллель MspI ALAD*2 гена дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты и неблагоприятная аллель С гена копропорфириноген оксидазы, приводящие к нарушению порфирииового обмена, следствием чего явилось развитие свинцовой интоксикации через 3 года от начала работы в условиях воздействия свинца и его соединений.

Пример 2.

Пациент А., 31 год. Профессия - плавильщик на предприятии по вторичной переработке свинца. Стаж - 6 лет. Работа заключается в плавке аккумуляторного лома, паст и рафинировании чернового свинца. Среднесменные концентрации свинца и его неорганических соединений на рабочем месте - 0,1 мг/м³. Класс условий труда - 3.2-3.3. Лабораторные показатели: АЛК мочи - 17,4 мкмоль/гКР (референсные значения - до 19 мкмоль/гКР), уровень свинца в моче - 49,9 мкг/л (референсные значения - до 40 мкг/л), эритроциты - 5,54*10¹² (референсные значения - 4,4-6,2*10¹²), гемоглобин - 172 г/л (референсные значения - 137-175 г/л).

Кровь больного исследовалась заявленным способом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК использовали для постановки реакции амплификации со специфическими праймерами.

Для выявления полиморфизма MspI ALAD в гене дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты использовали специфические праймеры: ( и . Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Полимеразную цепную реакцию для выявления MspI ALAD в гене дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты проводили по следующей программе.

При использовании амплификатора «Т100 Thermal Cycler» (BioRad. США), когда температура достигала 95°С (режим паузы) ставили пробирки в ячейки амплификатора и выдерживали их при температуре 95°С - 5 мин. Далее выдерживали пробирки 45 циклов: при 95°С - 10с, при 65°С - 10с, при 72°С - 10с, а в конце при 72°С - 2 мин.

После амплификации образующийся нуклеотидный продукт протяженностью 916 п. н. подвергали обработке рестриктазой MspI. Далее фрагменты рестрикции анализировались методом электрофореза в 7% полиакриламидном геле с последующей обработкой бромистым этидием и визуализацией в УФ-свете.

Выявление полиморфизма СРОХ А/С в гене копропорфириноген оксидаза СРОХ проводили с помощью наборов фирмы «СИНТОЛ», Россия. При этом использовали набор реагентов «SNP-Скрин» для выявления полиморфизма СРОХ А/С.Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма СРОХ А/С проводили по следующей программе.

При использовании амплификатора «CFX 96» (BioRad, США) выдерживали пробирки при +94°С - 3 мин, затем 40 циклов: при 94°С - 15 с, при 64°С - 40 с. При этом использовали каналы FAM и HEX. Детекция продуктов амплификации осуществлялась на каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа строила кривые накопления флуоресцентного сигнала: по каналу FAM - для аллели А, по каналу HEX - для аллели С.

У пациента А. не выявлены неблагоприятная аллель MspI ALAD*2 гена дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты и неблагоприятная аллель С гена копропорфириноген оксидазы, следствием чего явилось отсутствие развития свинцовой интоксикации через 6 лет работы в условиях воздействия свинца и его соединений.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с высокой степенью достоверности осуществить прогнозирования риска развития интоксикации свинцом и его соединениями в процессе проведения диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу в условиях воздействия свинца и его соединений, путем выявления их наследственной предрасположенности к нарушению синтеза фермента копропорфириноген оксидазы и дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты. Это, в свою очередь, позволит своевременно выявлять лиц, предрасположенных к развитию интоксикации свинцом и его соединениями среди лиц, подвергающихся воздействию свинца и его соединений на рабочем месте или поступающих на работу в условиях воздействия свинца и его соединений, с целью предупреждения развития данной патологии и их рационального трудоустройства вне воздействия свинца и его соединений, а также проведения своевременной коррекции и повышения адаптационных способностей организма различными неспецифическими способами.

Кроме того, предлагаемый способ позволяет повысить достоверность прогнозирования риска развития интоксикации свинцом и его соединениями, подвергающихся воздействию свинца и его соединений, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу в условиях воздействия свинца и его соединений.

Он может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.