Результат интеллектуальной деятельности: Способ радионуклидной диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu

Изобретение относится к области медицины, онкологии и может быть использовано для радионуклидной диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu.

В настоящее время для диагностики злокачественных образований все большее распространение получают таргетные радионуклидные методы, обладающие высокой специфичностью к различным молекулярным мишеням, расположенным на поверхности мембран опухолевых клеток и позволяющим визуализировать очаги различных размеров (основной опухолевый узел и метастатические очаги) [Чернов В.И., Медведева А.А., Синилкин И.Т., и соавторы. Ядерная медицина в диагностике и адресной терапии злокачественных новообразований. Бюллетень сибирской медицины. 2018; 17(1):220-231]. До недавнего времени в качестве основного компонента радиоиммуноконъюгата использовались моноклональные антитела (мкАТ) [Tolmachev V., Orlova A., Andersson K. Methods for radiolabelling of monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 2014; 1060: 309-30], однако результаты исследований с применением мкАТ не оправдали возложенных на них ожиданий и выявили ряд особенностей, существенно ограничивающих их применение в клинической практике. При тщательном изучении оказалось, что мкАТ обладают значительно сниженной эффективностью взаимодействия с антигеном, неоптимальными фармакологическими свойствами, медленным распределением в организме, плохим проникновением в ткани и выведением почками (из-за высокой молекулярной массы 150 кДа) и высокой иммуногенностью [Azhar A., Ahmad Е., Zia Q., et. al. Recent advances in the development of novel protein scaffolds based therapeutics. International Journal of Biological Macromolecules. 2017; 102: 630-641].

В связи с поиском новых эффективных агентов, способных нацеливаться на специфические мишени, началось интенсивное изучение молекулярных конструкций, альтернативных связывающим доменам антител и имеющих ряд обязательных характеристик, таких как, связывание исключительно с «таргетным» антигеном для специфической локализации, отсутствие иммуногенности, стабильность и возможность быстрой химической модификации для проведения процессов мечения [Nicholes N., Date A., Beaujean P., et. al. Modular protein switches derived from antibody mimetic proteins. Protein Engineering, Design and Selection. 2016; 29: 77-85]. Помимо этого оптимальной функцией для радионуклидной визуализации является скорость связывания препарата с мишенью и быстрое удаление несвязавшихся молекул из организма пациента для достижения высокого качества визуализации опухоли и сокращения временного промежутка между инъекцией и началом исследования [Stumpp М., Binz H., Amstutz P. DARPins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today. 2008; 13 (15): 695-701].

В течение последнего десятилетия большую популярность приобретает новый класс таргетных молекул, получивших название «альтернативные каркасные белки» (АКБ) или «скаффолды» (scaffolds) и отвечающих всем требованиям для оптимальной доставки радионуклида к опухолевым клеткам [ A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511]. Одними из представителей рекомбинантных адресных молекул являются дарпины (DARPin, Design Ankyrin Repeat Protein), представляющие собой естественные анкириновые повторы пептида, состоящего из повторяющихся доменов длиной 33 а.о. и обладающего стабильной структурой из β-поворота и двух . Обычно белки представлены 4-6 модулями с суммарной молекулярной массой от 14 до 21 кДа (молекулярная масса каждого 3,5 кДа) [Hanenberg М., McAfoose J., Kulic L. Amyloid-β peptide-specific DARPins as a novel class of potential therapeutics for Alzheimer disease. J Biol Chem. 2014; 26: 27080-27089]. Основными преимуществами данных молекул являются небольшой размер, стабильная структура, высокая специфичность и аффинность к антигену, а также значительно более низкая стоимость производства, обусловленная их экспрессией в бактериальных средах [Kramer L., Renko М., J., et.al Non-invasive in vivo imaging of tumour-associated cathepsin В by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8: 2806-2821].

Наиболее часто используемым радионуклидом для проведения диагностических исследований как на территории Российской Федерации, так и в мире, остается короткоживущий (T_1/2=6,02 ч) технеций-99м (^99mTc), препараты которого изготавливаются в виде стандартных наборов реагентов (лиофилизатов) к генератору технеция-99м [Лыков А.В. Сублимационная сушка // В кн.: Теория сушки. - М., Энергия. - 1968. - С. 334-362].

Одной из наиболее изучаемых молекулярных мишеней по-прежнему остается рецептор эпидермального роста Her2/neu, наличие экспрессии которого выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке легкого, яичников, желудка, простаты и пр. [Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., et. al. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes. Science. 1987; 235: 177-182]. Особое место среди злокачественных новообразований занимает рак молочной железы (РМЖ), гиперэкспрессия и/или амплификация гена Her2 клетками при котором относится к одному из неблагоприятных прогностических факторов, обуславливающих агрессивное течение опухолевого процесса, а также низкие показатели общей и безрецидивной выживаемости [Romond Е.Н., Perez E.A., Bryant J., Suman V.J., et. al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med. 2005; 353: 1673-1684]. По данным различных исследований частота вновь выявленных случаев инвазивного РМЖ с гиперэкспрессией Her2/neu составляет 15-25%, и чаще всего этот показатель возрастает у пациенток с высокой степенью злокачественности и с метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов.

В настоящее время для определения статуса Her2/neu активно применяют несколько методик: иммуногистохимическое исследование (ИГХ), флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и хромогенная гибридизация in situ (CISH) [Zahid M., Khan S., Khan R. Detection of Her2/neu gene amplification by fluorescence in situ hybridization technique. Pathology. 2016; 48 (1): 163-170]. Однако при несомненных достоинствах используемых методов они имеют ряд существенных недостатков, к которым можно отнести невозможность проведения in vivo исследования для оценки распространенности опухолевого процесса (первичный опухолевый узел, состояние регионарных лимфатических узлов, оценка отдаленных органов и тканей) [Orlando L., Viale G, Bria E. et.al. Discordance in pathology report after central pathology review: Implications for breast cancer adjuvant treatment. Breast. 2016; 30: 151-155], гетерогенность опухоли, а также недоступность материально-технического оснащения в большинстве лабораторий на территории Российской Федерации [Telugu R.B., Chowhan А.K., Rukmangadha N., et. al. Human epidermal growth factor receptor 2/neu protein expression in meningiomas: An immunohistochemical study. J. Neurosci Rural Pract. 2016; 7 (4): 526-531].

Известен способ диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием меченных индием-111 и йодом-125 альтернативных каркасных белков DARPinG3 (¹¹¹In-(HE)₃-G3 и ¹²⁵I-(HE)3-G3). Применяемый в известном способе радиофармацевтический препарат на этапе доклинических исследований продемонстрировал свою специфичность и фиксацию на поверхности мембран опухолевых клеток, экспрессирующих Her2/neu, что позволяет визуализировать как основной опухолевый узел, так и метастатические очаги [Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M., et. al. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging (2015) 42:288-301]. Основным недостатком данного метода являются неоптимальные радиологические характеристики препаратов, связанные с длительным периодом полураспада (T_1/2=2,8 сут и Т_1/2=59,49 соответственно) и следовательно высокой дозой облучения на обследуемого, высокой стоимостью циклотронного производства, а также наличием в его спектре облучения высокоэнергетических гамма-квантов, препятствующих получению качественных сцинтиграфических изображений.

Другим близким к предлагаемому способу является способ диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием меченных йодом-125 и технецием - 99m альтернативных каркасных белков DARPin9_29 ([¹²⁵I] I-DARPin 9_29 и ^99mTc]Tc(CO)₃-DARPin9_29) [Vorobyeva A., Bragina О., Altai М., et.al. Comparative Evaluation of Radioiodine and Technetium-Labeled DARPin 9 29 for Radionuclide Molecular Imaging of HER2 Expression in Malignant Tumors. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018. 2018. 6930425].

Основным недостатком данного метода с использованием [¹²⁵I]I-DARPin9_29 являются неоптимальные радиологические характеристики препаратов, связанные с длительным периодом полураспада (Т_1/2=59,49 суток) и следовательно высокой дозой облучения на обследуемого, высокой стоимостью циклотронного производства, а также наличие в его спектре облучения высокоэнергетических гамма-квантов, препятствующих получению качественных сцинтиграфических изображений. Недостатком ^99mTc]Тс(СО)₃-DARPin9_29 является его высокая аккумуляция в печени, что делает практически невозможным выявление очагового поражения печени и проведения комплексного in vivo исследования

Новый технический результат-повышение специфичности, информативности, доступности при снижении осложнений.

Для достижения нового технического результата в способе диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu, включающей введение радиофармацевтического препарата и проведение сцинтиграфического исследованиями этом вводят радиофармпрепарат основе меченных технецием-99m трекомбинантных адресных молекул DARPinG3, изготавливаемый непосредственно перед введением, для этого в асептических условиях 500 мкл элюата ^99mTcO^4- 4 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100°С в течение 30 минут, после инкубации 500 мкл трикарбонильного технеция добавляют к 1200 мкг раствора DARPinG3 и инкубируют при температуре 40°С в течение 60 минут, в дальнейшем выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок NAP5, полученный после очищения препарат с активностью 400-500 МБк разбавляют в 10 мл физиологического раствора, забирают через стерилизующий фильтр и медленно вводят пациенту, далее через 2 часа после введения препарата пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере и оценивают полученные результаты и при визуализации участков гиперфиксации РФП в ткани молочных желез и регионарных лимфатических узлов диагностируют злокачественную опухоль.

Способ осуществляют следующим образом, радиофармацевтический препарат готовят непосредственно перед введением: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [^99mTc(СО)₃(H₂O)₃]⁺добавляют 500 мкл (4 ГБк) элюата ^99mTcO^4- и инкубируют в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 1 мл трикарбонильного технеция добавляют к 1200 мкг DARPinG3 и инкубируют при температуре 40°С в течение 60 минут (лабораторный регламент получения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г). В дальнейшем выполняется очистка полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяют с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводят с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляют в 10 мл физраствора, забирают через стерилизующий фильтр и медленно вводят пациенту. Через 2 часа после введения пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере и оценивают полученные результаты.

Способ основан на анализе результатов экспериментальных клинических исследований, для подтверждения, эффективности которого в выявлении злокачественных опухолей молочных желез с гиперэкспрессией Her2/neu были проведено изучение особенностей накопления радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99 т рекомбинантных адресных молекул DARPinG3. С этой целью была сформирована группа из 10 пациенток с верифицированным диагнозом рака молочной железы T_1-4N_0-3M₀: исследуемую подгруппу составляли 7 пациенток с гиперэкспрессией Her2/neu, контрольную - 3 больных без экспрессии данного параметра. Всем пациенткам выполнялось гистологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного и операционного материалов. При значении Her2/neu 2+ проводился FISH анализ.

Пациенткам внутривенно вводили радиофармацевтический препарат на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 в дозе 500 МБк. Радиофармацевтический препарат готовили непосредственно перед введением согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [^99mTc(СО)₃(H₂O)₃]⁺ добавляли 500 мкл (4 ГБк) элюата ^99mTcO^4- и инкубировали в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 1 мл трикарбонильного технеция добавляли к 1200 мкг DARPinG3 и инкубировали при температуре 40°С в течение 60 минут (лабораторный регламент получения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г). В дальнейшем выполняли очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяли с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводили с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляли в 10 мл физ. раствора, забирали через стерилизующий фильтр и медленно вводили пациенту.

Через 2 часа после введения препарата пациенту выполняли однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере Е.САМ фирмы SIEMENS в стандартном режиме. Производили запись 64 проекций в матрицу 64×64 пикселя с применением низкоэнергетических коллиматоров с энергией 140 КэВ. Окно дифференциального дискриминатора настроено на 20%, аппаратное увеличение не использовали. Полученные при исследовании изображения (сцинтиграммы) подвергали постпроцессинговой обработке с использованием фирменного пакета программ E.Soft (SIEMENS, Германия). Патологическими считались участки повышенной аккумуляции препарата в ткани молочной железы и регионарных лимфатических узлов (Фиг. 1, 2, 3). Кроме того, при постпроцессинговой обработке производили расчет индекса «опухоль/фон», отражающий соотношение накопления препарата в опухолевой ткани и в здоровой ткани молочной железы. Результаты исследования продемонстрировали 100% чувствительность способа в диагностике рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu, то есть с применением указанного радиофармпрепарата удалось выявить опухоль у всех 10 пациенток, включенных в исследование. Произведенные расчеты показали, что средние значения индекса «опухоль/фон» составили 6,73±0,08.

Клинический пример 1.

Пациентка С., 35 лет: Ds.: Рак правой молочной железы IIA стадия (T2N0M0), мультицентричный рост.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ+, РП+, Her2/neu +

В плане обследования дополнительно выполнена однофотонная эмиссионная компьютерная томография и пленарная сцинтиграфия с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 согласно предлагаемому способу.

На фиг. 1 - ОФЭКТ планарная сцинтиграфия с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 через 2 часа после введения у пациентки с диагнозом рак правой молочной железы, IIA стадия (T2N0M0), мультицентричный рост. Визуализируется биораспределение препарата с большим накоплением в проекции печени и почек.

На фиг. 2 - ОФЭКТ с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 через 2 часа после введения у пациентки с диагнозом рак правой молочной железы, IIA стадия (T2N0M0), мультицентричный рост. Визуализируется метаболическая гиперфиксация препарата в проекции опухоли в центральных отделах правой молочной железы.

Клинический пример 2.

Пациентка А., 37 лет: Ds.: Рак левой молочной железы I стадия (T1N0M0). Гистологическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ+, РП+, Her2/neu -.

В плане обследования дополнительно выполнена однофотонная эмиссионная компьютерная томография с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 согласно предлагаемому способу.

На фиг. 3 - ОФЭКТ с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3, через 2 часа после введения у пациентки с диагнозом рак левой молочной железы, I стадия (T1N0M0). Отмечается отсутствие метаболической гиперфиксации препарата в проекции опухоли.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu с применением радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3, позволяет отчетливо визуализировать злокачественные опухоли молочных желез на метаболическом уровне, а степень аккумуляции представленного радиофармпрепарата в опухоли дает возможность получать сцинтиграфические изображения надлежащего качества. Таким образом, применение нового способа с использованием радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 позволит повысить эффективность, специфичность и доступность радионуклидной диагностики рака молочных желез с гиперэкспрессией Her2/neu. При этом, DARPinG3 характеризуется значительно лучшим биораспределением и более низким накоплением препарата в печени.