Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Sarocladium kiliense - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов и способ получения лонголитина

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается штамма-продуцента лонголитина.

В конце 70-х гг. сотрудниками лаборатории антибиотиков и лаборатории ферментативного фибринолиза МГУ им. М.В. Ломоносова была выявлена способность гриба A. longa образовывать в глубинной культуре фибринолитические экзоферменты с активностью активатора плазминогена, способные лизировать тромбы в опытах in vitro. Был получен штамм Arthrobotrys Longa Mecht №1, и из культуральной жидкости был выделен ферментативный препарат грибкового происхождения с фибринолитической, тромболитической, эстеразной, протеолитической и активаторной по отношению к плазминогену активностями. Также было установлено, что протеиназы фармацевтической субстанции относятся к классу сериновых протеиназ [Авторское свидетельство СССР №745943, опубл. 05.07.1980]. Однако фибринолитическая и тромболитическая активность данного известного комплекса ферментов, выделенного из культуральной жидкости данного известного штамма гриба, недостаточно высокая.

Известен штамм гриба Arthrobotrys Longa Mecht №2 продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена. В патенте РФ №2182596 впервые рекомендовано применение комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве наружного средства лечения тромбозов [РФ, патент №2182596, опубл. 20.05.2002]. Однако фибринолитическая и тромболитическая активности комплекса ферментов, содержащегося в культуральной жидкости этого штамма гриба, недостаточно высоки для применения его в качестве продуцента в промышленных условиях.

Известен штамм гриба Arthobotrys Longa Mecht №3 ВКПМ F-942 [РФ, патент №2332450, опубл. 27.08.2008] - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов.

Этот штамм получен при обработке штамма Arthobotrys Longa Mecht №2 гамма-излучением дозой 200 кРад. Штамм Arthobotrys Longa Mecht №3 ВКПМ F-942 обеспечивает стабильный биосинтез целевого продукта в лабораторных условиях в колбах.

Основной недостаток ближайших аналогов заключается в недостаточной продуктивности и недостаточной отработке процесса получения лонголитина в промышленных условиях.

Техническая задача, решаемая изобретением, заключается в повышении уровня синтеза лонголитина в процессе управляемого непрерывного культивирования мутантного штамма гриба.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является совершенствование промышленной технологии получения лонголитина на основе нового мутантного штамма гриба - продуцента лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов с повышенной активностью.

Описание изобретения

При совершенствовании промышленной технологии получения лонголитина технические задачи решались как в области усовершенствования эффективности способа непрерывного культивирования штамма гриба - продуцента лонголитина, так и в обеспечении повышения эффективности штамма.

С этой целью на первом этапе была проведена селекция штамма Arthobotrys Longa Mecht №2, и на втором этапе отработан новый способ получения лонголитина.

В отличие от технологии получения штамма гриба Arthobotrys Longa Mecht №3 новый штамм гриба был получен из штамма Arthobotrys Longa Mecht №2 методом ненаправленного мутагенеза, вызываемого ультрафиолетовым облучением, без применения предварительной обработки химическими реагентами. Видовая идентификация штамма была осуществлена с помощью секвенирования участков LTS1 и ITS2, амплифицированных с геномной ДНК с помощью праймеров ITS4 и ITS5 [White, T.J. (1990) Amplification and Direct Sequencing of Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In: PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, 315-322].

В результате был идентифицирован новый штамм, с видовой принадлежностью Sarocladium kiliense, который получил условное название ALM4. Штамм был депонирован в БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ: F-1502. Ниже приведено описание нового штамма, и новая технология получения субстанции лонголитина. Активность лонголитина измерялась методом гидролиза хромогенного пептидного субстрата pGlu-Gly-Arg-pNA, как более точного метода измерения активности.

Пример 1. Получение штамма

Повышение производительности нового штамма было достигнуто путем ненаправленного мутагенеза и селекции из исходной культуры гриба Arthrobotrys Longa Mecht №2. Суспензию спор исходного штамма Arthrobotrys Longa Mecht №2 облучали ультрафиолетом. Облученные споры высевали на чашки со средой Чапека, культивировали при 28°С в течение 4 суток и проводили тестирование клонов на продукцию протеолитических ферментов. Мутанты с улучшенной продукцией отбирали.

В результате был получен штамм гриба, получивший название Sarocladium kiliense ALM4 ВКПМ: F-1502.

Штамм гриба Sarocladium kiliense ALM4- продуцент лонголитина - характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками.

На агаризованной среде Чапека штамм гриба Sarocladium kiliense ALM4 образует широкорастущие приподнятые бесцветные пушисто-тяжистые, иногда розовеющие с возрастом, колонии с ровным краем. Обратная сторона колонии бывает с радиальными складками и слабой оранжевой пигментацией. В центре колонии может находится пучок вертикальных столонов (плотных пучков из более длинных и менее ветвящихся гиф). Нередко отмечается зональность колоний, обозначенная высотой мицелия и его пигментацией. Также при культивировании отмечается полиморфизм колоний одного возраста. При его культивировании, на тонких гифах постоянно образуются одноклеточные микроконидии размером 3-5 мкм, которые прорастают молодыми гифами, давая начало новым мицелиальным генерациям.

Физиолого-биохимические свойства штамма.

Аэроб. Основной метод хранения штамма: в 10-20%-ном растворе глицерина при -70°С. Температурный диапазон роста: +18-45°С. Оптимальная температура роста: +40°С. Растет при значениях рН среды: 5,0-10,0. Оптимум рН: 7,2-7,4.

Пример 2. Выращивание посевного материала в лабораторных условиях

Для выделения субстанции лонголитина выращивали посевной материал в колбах. Стерильную среду Чапека разливают примерно по 10 мл в десять пробирок, закрывают пробками и помещают для застывания среды на скошенную поверхность.

В подготовленные пробирки со скошенным слоем питательной среды Чапека производят пересев эталонной культуры продуцента. Пробирки закупоривают ватными пробками и инкубируют при 28°С в течение 7 суток.

Пробирки с выращенной культурой анализируют на соответствие внешних признаков колоний, характерных для продуцента. Штамм Sarocladium kiliense ALM4 ВКПМ: F-1502 образует широкорастущие приподнятые бесцветные пушисто-тяжистые, иногда розовеющие с возрастом, колонии с ровным краем. Пробирки с наличием колоний, отличающихся от описанных в работе, не используют. Пробирки с подросшим посевным материалом открывают в стерильной зоне, микробиологическим крючком аккуратно снимают с поверхности агаризованной среды пленку мицелия и переносят ее в емкость для инокуляции, содержащую 200 мл стерильной посевной среды. Содержимое тщательно перемешивают и разливают в примерно равном количестве в четыре емкости для выращивания посевного материала. Емкости закрывают ватными пробками и ставят в шейкер-инкубатор. Выращивание посевного материала происходит при 28°С и скорости вращения шейкера 200-220 об/мин. в течение 48 часов.

Пример 3. Выращивание посевного материала в промышленных масштабах

Биосинтез и выращивание посевного материала в промышленных масштабах осуществлялись в стандартном промышленном ферментере. В ферментер загружают стерильную посевную среду и содержимое колбы с посевным материалом. Выращивание посевного материала происходит при 28°С, скорости вращения мешалки 150-200 об/мин. и скорости подачи воздуха 1 л/мин. в течение 48-96 часов. Использовали подходящий по объему стандартный ферментер «Ферментер стерилизуемый ФС-100».

Контроль выращивания посевного материала осуществляется при помощи оптической микроскопии и измерения рН среды для этого из ферментера отбирают 100 мл содержимого для анализа. Культуральные признаки посевного материала должны отвечать следующему описанию: 1) наблюдают образование одноклеточных микроконидий величиной 3-6 мкм. Микроконидии образуются непосредственно на гифах вегетативного мицелия; 2) величина рН среды в конце выращивания должна быть в пределах 8,0-8,2.

При переходе от лабораторного шейкера-инкубатора, в котором аэрация осуществлялась только путем встряхивания колб, к промышленным масштабам осуществляют подбор оптимальных параметров аэрации. Подбор проводят по результатам изменения рН и количеству белка, накопленному в культуральной жидкости. Результаты представлены в таблице 1.

При выращивании посевного материала выбирают условия аэрации с низкой скоростью (170 об/мин и 1 л/мин.), так как при более низкой скорости получают посевной материал, в котором форма микроорганизмов соответствует их природной форме.

Биосинтез в ферментере лучше происходил при более интенсивном перемешивании (210 об/мин) и подаче воздуха (20 л/мин.). Более высокая скорость вращения мешалки и подача большего объема воздуха затруднены из-за вспенивания жидкости и потерь за счет испарения воды.

Пример 4. Разделение культуральной жидкости и биомассы

Культуральную жидкость из ферментера по шлангу с помощью насоса подают в сепаратор со скоростью 100 мл/мин. Сепарирование происходит при 8000 об/мин (7000-7500 g). С целью повышения активности субстанции лонголитина проводят концентрацию супернатанта культуральной жидкости с помощью ультрафильтрации через полупроницаемую фильтровальную мембрану. Супернатант культуральной жидкости передают под давлением до 7 бар в ультрафильтрационную установку и концентрируют в три раза.

Критерием для выбора фильтрующего элемента являлись: устранение прохождения белка через поры, скорость фильтрации и потери белка в результате задержки белка на поверхности мембраны. Так как размер сериновых протеаз лонголитина составляет величину не менее 30 кДа, то для концентрирования используют ультрафильтрационные патроны со средним размером пор 5 кДа и 10 кДа (материал фильтрующего элемента полисульфон). Для уменьшения потерь белка, осевшего на мембрану, проводят смыв белка, осевшего на поверхность мембраны, дистиллированной водой или полученным концентратом. Результаты выбора фильтрующего элемента приведены в таблице 2:

Для концентрирования культуральной жидкости был выбран размер пор фильтровальной мембраны 10 кДа и смыв белка, осевшего на поверхность мембраны концентратом, так как этот вариант обеспечивает наибольшую степень концентрации и оптимальное время работы. Потери белка за счет прохождения через поры были ничтожны при использовании пор 5 кДа и 10 кДа. Смывы и концентрат в дальнейшем объединяют при осаждении.

Пример 5. Осаждение и сушка лонголитина

Отмеренное количество ацетона предварительно охлаждают в морозильнике до температуры минус 20°С. Перистальтическим насосом со скоростью 100 мл/мин ацетон подают в супернатант культуральной жидкости. Смесь оставляют на 1 час для образования осадка. Осадок фильтруют под вакуумом на друк-фильтре через фильтровальную бумагу. За счет концентрации культуральной жидкости удалось значительно сократить расход ацетона (с 600 до 205 кг на 1 кг получаемой субстанции) и уменьшить образование ацетонового маточника (с 920 до 342 кг на 1 кг субстанции). Лиофильное высушивание приводило к потере активности ферментов на 15-20%, поэтому его не используют. Высушивание полученного осадка производят в эксикаторе над концентрированной серной кислотой в течение 24 ч, после чего фармацевтическая субстанция готова к фасовке и упаковке.

Пример 6. Определение специфической активности лонголитина

Оценка способности тромболитических препаратов к активации плазминогена является важнейшим аналитическим методом исследования активности современных тромболитических препаратов. Способ измерения активности на субстрате урокиназы является прямым аналитическим методом и позволяет с высокой точностью определить активность тромболитического препарата, действующего по урокиназному типу. Анализ определения специфической активности лонголитина по урокиназному типу проводили методом гидролиза хромогенного пептидного субстрата pGTu-Gly-Arg-pNA.

Для проведения анализа готовят 0.05%-ный раствор pGlu-Gly-Arg-pNA в дистиллированной воде. Далее готовят 0.05М Трис-НС1-буфера, рН 8.2. Готовят разведения фармацевтической субстанции в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 10 мг/мл в дистиллированной воде или 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,2. Для проведения реакции смешивают 100 мкл пробы, 150 мкл буфера и 100 мкл pGlu-Gly-Arg-pNA. Смесь инкубируют в течение 5 мин при 37°С.Реакцию останавливают добавлением 200 мкл 50%-ной уксусной кислоты. Полученную смесь в полном объеме переносят в спектрофотометрическую микрокювету объемом до 1000 мкл с длиной оптического пути в 1 см. Измерение оптической плотности проводят при 405 нм на спектрофотометре. Измерение оптической плотности проводят непосредственно после остановки реакции.

Специфическую активность выражают в международных единицах (ME), соответствующих количеству мкмоль pNA, отщепившегося за 1 минуту или в единицах действия (ЕД) - количеству нмоль (10^-3 мкмоль) pNA, отщепившегося за 1 минуту: 1 ЕД равна МЕ×10³.

Специфическую активность (X), ЕД/мг, вычисляют по формуле:

где

А₄₀₅ - значение поглощения; К - коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику;

V - объем пробы, мкл; t - время реакции, мин.; m - масса навески ФС, мг.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе трех параллельных навесок препарата. Линейность поглощения (А405), определяемая калибровочным графиком, наблюдается в интервале от 10×10^-3 до 150×10^-3 мкМ pNA/мл. Результаты измерения урокиназной активности образцов субстанции лонголитина, полученных способом, изложенным в патентах RU 2182596, и способом, изложенным в настоящей заявке, представлены в таблице 3.

Промышленная применимость

В настоящем изобретении описан новый способ получения субстанции лонголитина, которая имеет повышенные показатели активности. Данный способ основан на введении в процесс получения лонголитина операции концентрирования и операции по дополнительному смыву белка с поверхности мембраны раствором концентрата с последующим смешиванием раствора смытого белка с раствором концентрата. Для повышения эффективности способа использован новый штамм Sarocladium kiliense ALM4 ВКПМ: F-1502, полученный в результате мутации штамма Arthobotrys Longa Mecht №2.

Активность лонголитина измерялась методом гидролиза хромогенного пептидного субстрата pGlu-Gly-Arg-pNA, как более точного метода измерения активности. Активность субстанции, полученной способом, изложенным в настоящей заявке, от 4 до 20 раз выше, чем способами, изложенными ранее. Это обусловлено следующими улучшениями: использованием более продуктивного штамма; использованием промышленной технологии выращивания посевного материала; использованием дополнительной стадии концентрации супернатанта со смывом белка с поверхности мембраны.