Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения полиненасыщенных жирных кислот с высоким содержанием арахидоновой кислоты в липидах воздушного мицелия гриба Mortierella alpina (варианты)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к микробиологическому способу получения полиненасыщенных жирных кислот с высоким содержанием арахидоновой кислоты.

Арахидоновая кислота - биохимически важная кислота, являющаяся предшественником различных медиаторов (эйкозаноидов, простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и др.) в организме человека и животных, а также выполняющая роль индуктора системной неспецифической устойчивости растений к различного рода деструктивным воздействиям (грибковым, бактериальным и вирусным патогенам, водному и температурному стрессу, механическим поранениям), может быть использована в сельском хозяйстве, медицине, косметологии, ветеринарии, пищевой промышленности, а также может служить исходным сырьем (предшественником) для химического синтеза других биологически активных соединений.

Практическое значение имеют как высокочистые препараты арахидоновой кислоты, так и комплексные препараты полиненасыщенных жирных кислот, содержащие в качестве основной арахидоновую кислоту.

В настоящее время арахидоновая кислота преимущественно используется в составе комплексных препаратов жирных кислот. В частности, в комплексе с другими жирными кислотами арахидоновая кислота применяется в композициях для стимулирования роста и иммунизации растений, в косметических препаратах, пищевых и кормовых добавках. Чистые препараты арахидоновой кислоты требуются для биохимических, медицинских и диетологических исследований, получения фармакозначимых композиций (препаратов медицинского назначения), синтеза биологически активных производных. Однако широкое применение чистых препаратов арахидоновой кислоты ограничивается их высокой стоимостью.

Основной причиной высокой стоимости чистой арахидоновой кислоты являются значительные потери на стадии очистки продукта от сопутствующих насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, что в значительной степени обусловлено низким ее содержанием в исходном сырье, представляющем собой смесь жирных кислот (или их алкиловых эфиров), выделенных из живых организмов.

Наиболее перспективным сырьем для получения чистых препаратов арахидоновой кислоты является смесь жирных кислот или их алкиловых эфиров, выделенных из грибов рода Mortierella. Однако содержание арахидоновой кислоты в составе жирных кислот гриба может значительно варьировать в зависимости от используемого штамма, состава среды, способа и условий культивирования гриба.

Из уровня техники известен способ биосинтеза полиненасыщенных карбоновых кислот, содержащих арахидоновую кислоту, с помощью штамма Mortierella hygrophila ВКМ F-1854, включающий глубинное культивирование гриба в жидкой питательной среде (RU, патент №2058078, опубл. 20.04.1996).

Основным недостатком описанного способа является низкое содержание арахидоновой кислоты в составе жирных кислот гриба (10-45%), а также необходимость добавления в среду дорогостоящих компонентов, таких как пептона и дрожжевого экстракта.

Известен способ биосинтеза полиненасыщенных жирных кислот, в том числе арахидоновой кислоты, с помощью гриба Mortierella alpina Peyronel БС-2 (VKM F-3625D), включающий культивирование гриба в жидкой питательной среде (RU, патент №2140980, опубл. 10.11.1999).

Недостатком этого способа является низкое содержание арахидоновой кислоты в составе жирных кислот гриба (до 62%), необходимость добавления в среду дорогостоящих компонентов (пептона и дрожжевого экстракта), а также использование в качестве источника углерода очищенной глюкозы в высокой концентрации (80 г/л).

Известен способ биосинтеза полиненасыщенных жирных кислот, в том числе арахидоновой кислоты, культивированием гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1134 на поверхностности тонкого слоя жидкой питательной среды, приготовленной на основе отвара картофеля и глюкозы (RU, патент №2596921, опубл. 10.09.2016).

Недостатком этого способа является низкое содержание арахидоновой кислоты в составе жирных кислот - 50,81%, а также использование в качестве источника углерода очищенной глюкозы в высокой концентрации (80 г/л).

Выбранный нами за прототип способ биосинтеза полиненасыщенных жирных кислот с высоким содержанием арахидоновой кислоты (Петухова Н.И., Щербакова Д.В., Шараева А.А., Зорин В.В. Синтез полиненасыщенных жирных кислот грибом Mortierella alpina ГР-1 при культивировании на пивной дробине // Башкирский химический журнал.- 2014. - Т. 21, №4. - С. 90-96), основан на культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1 на поверхности полутвердой среды, приготовленной на основе овсяной крупы и пивной дробины, являющейся отходом пивоваренной промышленности, с добавлением глицерина в качестве источника углерода. Штамм получен на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного университета путем отбора моноспорового изолята после воздействия ультрафиолетом на суспензию спор гриба, выделенного из ризосферы пшеницы, с последующим анализом содержания арахидоновой кислоты (маркерная характеристика) в липидах изолятов, формирующих воздушный мицелий на средах с повышенным содержанием глицерина (Петухова Н.И., Митягина А.В., Зорин В.В. Синтез полиненасыщенных жирных кислот глицеринустойчивым грибом Mortierella alpina ГР-1 // Башкирский химический журнал. - 2010. - Т. 17, №5. - С. 50-52). Авторский номер штамма ГР-1. Культура идентифицирована до вида в ФГУПГосНИИГенетика, и хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под национальным депозитарным номером F-1280.

В предпочтительном варианте способа-прототипа предусматривается культивирование гриба в течение 20 суток при температуре 25-28°С на питательной среде, содержащей 60 г сухой пивной дробины, 60 г овсяной крупы, 20 г глицерина, 0,3 г сульфата цинка семиводного и 1 л воды, раздельный сбор воздушного и субстратного мицелия и получение препаратов алкиловых эфиров жирных кислот на их основе.

В этих условиях в воздушных гифах гриба накапливаются липиды с более высоким содержанием арахидоновой кислоты (68,3% от суммы жирных кислот), чем в субстратном мицелии (36,1%). Воздушный мицелий легко отделяется от субстрата и может служить сырьем для получения высокочистых препаратов арахидоновой кислоты. Субстратный мицелий гриба с остатками питательной среды может быть использован в качестве кормовой добавки или как сырье для получения композиций, повышающих продуктивность культурных растений и защищающих их от болезней.

Недостатком способа является низкий выход биомассы воздушного мицелия (0,29 г с одной чашки Петри, что соответствует 220 г/кг овсяной крупы) и недостаточно высокое содержание арахидоновой кислоты в его липидах.

Задачей изобретения является усовершенствование процесса культивирования гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1280 с целью увеличения выхода полиненасыщенных жирных кислот путем повышения выхода биомассы воздушного мицелия и достижения содержания арахидоновой кислоты более 70% от суммы жирных кислот.

Указанная задача решается тем, что в способе получения полиненасыщенных жирных кислот с высоким содержанием арахидоновой кислоты в липидах грибного воздушного мицелия, включающем культивирование гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1280 на овсяной среде с пивной дробиной в соотношении 1:1, глицерином и сульфатом цинка семиводного, сбор и сушку воздушного мицелия, согласно изобретению для приготовления среды вместо овсяной крупы используют овсяные хлопья, при этом среду предварительно разваривают, удваивают содержание глицерина, а наработку биомассы осуществляют при оптимальной температуре культивирования 20-22°С в течение 21 суток до достижения наибольшего содержания арахидоновой кислоты в составе жирных кислот гриба.

Также указанная задача решается тем, что в способе получения полиненасыщенных жирных кислот с высоким содержанием арахидоновой кислоты в липидах грибного воздушного мицелия, включающем культивирование гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1280 на овсяной среде с глицерином и сульфатом цинка семиводного, сбор и сушку воздушного мицелия, согласно изобретению для приготовления среды вместо овсяной крупы с пивной дробиной в соотношении 1:1 используют овсяные хлопья с добавкой свекловичного жома в соотношении 1:1, при этом среду предварительно разваривают, наработку биомассы осуществляют при оптимальной температуре культивирования 20-22°С в течение 21 суток до достижения наибольшего содержания арахидоновой кислоты в составе жирных кислот гриба.

Использование овсяных хлопьев и предварительное разваривание среды увеличивает доступность питательных веществ для гриба. Увеличение содержания глицерина в среде стимулирует развитие воздушного мицелия. Снижение температуры до оптимальных значений стимулирует развитие воздушного мицелия и синтез полиненасыщенных жирных кислот. Замена пивной дробины на свекловичный жом позволяет дополнительно увеличить содержание арахидоновой кислоты в липидах воздушного мицелия. Увеличение продолжительности культивирования до 21 суток позволяет достичь наибольшего содержания арахидоновой кислоты в составе жирных кислот гриба.

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается примерами.

Пример 1. Гриб Mortierella alpina ВКПМ F-1280 выращивают в условиях, позволяющих формировать обильный воздушный мицелий. Для этого готовят среду, содержащую 60 г сухой пивной дробины, 60 г овсяных хлопьев, 40 г глицерина, 0,3 г сульфата цинка семиводного и 1000 мл воды. Среду разваривают в течение 10-15 минут, раскладывают в чашки Петри тонким слоем и стерилизуют автоклавированием. Готовую питательную среду засевают 7-ми суточным инокулятом гриба, полученным на агаризованной среде (овсяные хлопья - 60 г/л, глицерин - 40 г/л, сульфат цинка 0,3 г/л, агар - 15 г/л). Культивирование гриба осуществляют в термостате при температуре 20-22°С в течение 21 суток. По истечении этого времени воздушный мицелий гриба отделяют и высушивают при 60°С в вакуумном сушильном шкафу. Для определения жирнокислотного состава липидов воздушного мицелия получают этиловые эфиры жирных кислот. К навеске измельченной биомассы гриба (70 мг) добавляют 4 мл ацетилирующей смеси (этанол : ацетилхлорид, 20:1,5) и 2 мл гексана. Смесь выдерживают в течение 1,5 часов при температуре 100°С (в герметично закрытых флаконах). После охлаждения смесь промывают 1%-ным раствором Na₂CO₃ и экстрагируют изопропиловые эфиры жирных кислот гексаном.

Выход биомассы воздушного мицелия 372,4 г (асв) на килограмм овсяных хлопьев, содержание эфира арахидоновой кислоты в полученном экстракте составило 72,7% от суммы эфиров жирных кислот (таблица).

Пример 2. Также как в примере 1, но в среду вместо 60 г пивной дробины добавляют 60 г сухого свекловичного жома, глицерин вносят в количестве 20 г.

Гриб Mortierella alpina ВКПМ F-1280 выращивают в условиях, позволяющих формировать обильный воздушный мицелий. Для этого готовят среду, содержащую 60 г сухой пивной дробины, 60 г свекловичного жома, 20 г глицерина, 0,3 г сульфата цинка семиводного и 1000 мл воды. Среду разваривают в течение 10-15 минут, раскладывают в чашки Петри тонким слоем и стерилизуют автоклавированием. Готовую питательную среду засевают 7-ми суточным инокулятом гриба, полученным на агаризованной среде (овсяные хлопья - 60 г/л, глицерин - 20 г/л, сульфат цинка 0,3 г/л, агар - 15 г/л). Культивирование гриба осуществляют в термостате при температуре 20-22°С в течение 21 суток. По истечении этого времени воздушный мицелий гриба отделяют и высушивают при 60°С в вакуумном сушильном шкафу. Для определения жирнокислотного состава липидов воздушного мицелия получают этиловые эфиры жирных кислот. К навеске измельченной биомассы гриба (70 мг) добавляют 4 мл ацетилирующей смеси (этанол : ацетилхлорид, 20:1,5) и 2 мл гексана. Смесь выдерживают в течение 1,5 часов при температуре 100°С (в герметично закрытых флаконах). После охлаждения смесь промывают 1%-ным раствором Na₂CO₃ и экстрагируют изопропиловые эфиры жирных кислот гексаном.

Выход биомассы воздушного мицелия составил 285 г (асв) на килограмм овсяных хлопьев, содержание эфира арахидоновой кислоты в полученном экстракте составило 75,8% от суммы эфиров жирных кислот (таблица).

Предложенный способ позволяет существенно повысить выход биомассы воздушного мицелия в процессе культивирования гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1280 и содержание арахидоновой кислоты в его липидах.