Результат интеллектуальной деятельности: Мышиная гибридома SI-CLP, клон 3D4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к белку SI-CLP

Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине и предназначено для выявления цитоплазматического белка человека SI-CLP в плазме крови онкологических больных методом ИФА, в неопластических клетках и клеточных линиях глиобластомы и др. тканей иммуноцитохимическим, иммуногистохимическим и иммунофлуоресцентным методами, а также методом иммуноблоттинга для научно-исследовательских и клинико-лабораторных целей.

На сегодняшний день антитела являются одним из основных инструментов для изучения фундаментальных вопросов онкологии, широко использующиеся в диагностике и терапии различных типов данной патологии.

Одной из основных проблем современной онкологии является ранняя и неинвазивная диагностика заболевания, позволяющая достоверно поставить диагноз и незамедлительно приступить к терапии. Для решения поставленной задачи многие исследования последних лет посвящены поиску новых молекулярных маркеров заболевания, свободно циркулирующих в кровотоке. В качестве таких маркеров могут использоваться белки, нуклеиновые кислоты, везикулы, секретируемые опухолевыми клетками и сами опухолевые клетки. В основном, такая диагностика проводится методом иммуноферментного анализа и позволяет выявлять заболевания на начальной стадии.

Хитиназоподобные белки у млекопитающих — белки, образующиеся в зоне воспаления и опухолевого роста. В последнее время отдельные представители семейства изучаются как потенциальные биомаркеры различных заболеваний человека, в том числе солидных опухолей (глиомы и др.). Одним из представителей хитиназоподобных белков является SI-CLP, описанный в 2006 году. SI-CLP экспрессируется в большинстве нормальных клеток, секретируется. Существуют данные, указывающие на его экспрессию в некоторых типах опухолей (в частности, в глиобластомах), что в дальнейшем при более детальном изучении позволит использовать изменение количества данного белка в крови в качестве маркера. Существуют публикации, в которых показано, что внесение хитиназоподобных белков в панель маркеров различных тестов приводит к повышению как чувствительности, так и специфичности тестов. Данная характеристика хитиназоподобных белков существенно расширяет их область применения.

Для выявления белка SI-CLP у человека на сегодняшний день существует несколько доступных коммерческих поликлональных и моноклональных антител. К недостаткам описанных антител относятся их дороговизна, ввиду зарубежного происхождения, а также отсутствие для них данных о тестировании в реакциях иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, использующихся в ежедневной клинико-диагностической практике.

Задачей изобретения является расширение ассортимента моноклональных антител и получение антител, обладающих специфичностью к белку SI-CLP человека, использующихся для иммунодиагностики и прогностической оценки течения опухолевых заболеваний у человека.

Поставленная задача решается за счет мышиной гибридомы SI-CLP, клон 3D4 - продуцента моноклонального антитела, выявляющего белок SI-CLP методами иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции и иммуноблоттинга, полученной путем иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным полноразмерным белком, и слиянием сенсибилизированных спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии sp2/0 с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500.

Продуцируемые гибридомой 3D4 моноклональные антитела к белку SI-CLP человека обладают селективной способностью связывать белок SI-CLP человека в иммуноферментном анализе (Таб.1), на иммуноблотах (Фиг.5), на клеточном (Фиг.1, Фиг.4) и тканевом уровнях (на парафиновых срезах) (Фиг.2, Фиг. 3), и расширяют существующий доступный ассортимент моноклональных антител к SI-CLP. Также следует отметить, что каждая вновь полученная гибридома уникальна. Моноклональные антитела, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, по специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности и другим свойствам. Поэтому получение как можно большего количества моноклональных антител к белку SI-CLP человека важно с научной и практической точки зрения.

Технический результат изобретения заключается в получении линии гибридомы мыши 3D4, продуцирующей доступные для отечественных клинико-диагностических лабораторий моноклональные антитела к цитоплазматическому антигену SI-CLP человека, пригодные для иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции, и позволяющие использоваться для диагностики глиобластом.

Мышиную гибридому SI-CLP, клон 3D4 получали следующим образом:

Для получения бактериального штамма, экспрессирующего рекомбинантный белок SI-CLP, его кодирующая последовательность была заклонирована в вектор pET45b (+). Ген SI-CLP человека (нуклеотидная последовательность кДНК SI-CLP человека доступны в базе данных GeneBank по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ с порядковым номером NM_001142675.1) амплифицируют на матрице кДНК, полученной из мРНК клеток линии LN229 с использованием ген-специфических праймеров (SI-CLP F3008 XhoI ACCTCTCGAGACCATGCGGACACTCT, SI-CLP R3008 HindIII CCTAAAGCTTGAGCAGGTCGTAGAAG, встроенные сайты эндонуклеаз рестрикции XhoI/HindIII). Амплифицированные фрагменты ДНК очищали и клонировали в вектор pET45b (+) по сайтам, созданным эндонуклеазами рестрикции. В результате была получена плазмида, несущая ген белка SI-CLP человека. Плазмиду тестировали на наличие нуклеотидных замен методом автоматического секвенирования ДНК. Компетентные клетки E. coli штамм BL21 DE3 химически трансформировали полученной плазмидой pET45b(+)-SI-CLP, высевали на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°С в течение 16 ч. Далее в 50 мл среды LB переносили единичную колонию и наращивали при 37°С в течение 16 ч при постоянном перемешивании. Далее из ночной культуры экспрессию белков в бактериях E.coli BL21 DE3 стимулировали с помощью IPTG в конечной концентрации 1мМ в течение 4-5 часов при 37ºC. По истечении времени стимуляции клетки бактерий были лизированы, сонифицированы с помощью ультразвука и подвержены процедуре очистки.

На первой стадии тельца включения экстрагировались 5М мочевиной в PBST в течение 1 часа при комнатной температуре. При этом не происходило растворения целевых белков, однако отделялось множество примесей и наблюдалось значительное уменьшение массы осадка телец включения.

На второй стадии для лизиса телец включения был использован буфер следующего состава: (Аргинин – 0.5 М, Мочевина – 6 М, Трис – 20 мМ, рН 10.0, Дитиотреитол – 50 мМ, ЭДТА – 5 мМ, Глицин 10 мМ). Лизис осуществляли в течение 12 часов при +4°С. Раствор центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 5 минут при +4°С. Если оставался осадок, его повторно экстрагировали ½ объема лизирующего буфера с последующем центрифугированием и объединением супернатантов. Рефолдинг белков проводили путем перевода гельфильтрацией на колонке Сефадекса G-25 в буфер следующего состава с последующей инкубацией в течение 12-36 часов при 4°С: (NaCL – 0.5 М, Мочевина 4 (1) М*, Аргинин – 0.5 (0.05) М*, ЭДТА – 1 мМ, Цистеамин – 10 мМ, Имидазол – 2 мМ, PBST – до 50 мл. *- начальные значения (в скобках) по результатам эксперимента были корректированы в сторону увеличения)). Дальнейшую очистку белков производили метал-хелатной хроматографией (IMAC) на колонке IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GEHealthCare, 17-0921-08). Для этого белки переводили гельфильтрацией на колонке Сефадекса G-25 в IMAC-буфер следующего состава: (NaCL – 0.5 М, Мочевина – 1М, Имидазол – 5 мМ, Аргинин – 50 мМ, PBST – до 50 мл). Белок наносили на колонку IMAC Sepharose 6 Fast Flow, уравновешенную буфером, приведенного выше состава. Колонку промывали ступенчатым градиентом концентрации имидазола. Было установлено, что до концентрации имидазола 20 мМ видимой элюции целевого белка не происходит. Эффективная элюция белка SI-CLP с минимальными примесями происходит при 75 мМ имидазола. Полученный в результате процедуры очистки белок SI-CLP был использован в качестве антигена для дальнейшей иммунизации мышей.

Первичную иммунизацию проводили мышам Balb/c (самкам, 18 гр), вводя около 30 мкг антигена (рекомбинантный белок SI-CLP) с полным адъювантом Фрейнда (1:1) в лапы и в холку. Бустирование антигеном с неполным адъювантом Фрейнда проводили через две недели после первичной иммунизации. Гибридизацию (слияние) спленоцитов мышей с клеточной линией Sp 2/0 делали через 3 дня (на 4-й день) после бустирования с помощью PEG 1500. В среду для посадки гибридом (RPMI-1640 с 15% FetalClone I) добавляли HAT в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные гибридомы были рассажены на три 96-луночные планшета по 150 мкл суспензии в лунку и оставлены на 10 дней после чего были протестированы методом ИФА. В результате тестирования отобрано 17 клонов, хорошо связывающих антиген. Проведено первое клонирование для всех клонов. По результатам ИФА на взаимодействие с полноразмерным рекомбинантным SI-CLP отсажено 5 клонов. В качестве дополнительных ИФА-тестов были тесты на взаимодействие SI-CLP, c N и C-концевыми частями YKL-39, с полноразмерным YKL-40. По результатам ИФА-тестов, показывающих взаимодействие антител с другими антигенами было отобрано для наработки антител и заморозки 1 финальный клон: 3D4 (Таб. 1).

Затем отобранные по ИФА антитела тестировали методом иммуноцитохимии и иммунофлуоресценции. Антитела 3D4 показали четкое связывание с антигенами SI-CLP в клетках в виде цитоплазматического окрашивания (Фиг. 1, 3, 4).

Антитела к белку SI-CLP, клон 3D4 тестировали методом иммуногистохимии на срезах глиобластомы и пожделудочной железы (Фиг. 2). Наблюдалась четкая окраска экзокринных железистых клеток поджелудочной железы и опухолевых клеток глиобластомы.

Дополнительно был проведен иммуноблоттинг (Фиг. 5) для проверки антител на тотальных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 и клеточной линии глиобластомы LN229, экспрессирующей экзогенный SI-CLP, и показано, что антитела к SI-CLP, клон 3D4 специфично связывают эндогенный и экзогенный белок SI-CLP.

Таким образом антитела, продуцируемые гибридомой SI-CLP, клон 3D4, тестировали методами иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, непрямой иммунофлуоресценции, иммуногистохимии, иммуноблоттинга. Антитела связываются с полноразмерным белком SI-CLP, специфически работают в иммуноцитохимии и иммуногистохимии на клетках LN229, иммуногистохимии на тканях глиобластомы и поджелудочной железы и иммуноблоттинге на тотальных клеточных лизатах LN229.

Мышиная гибридома SI-CLP, клон 3D4 - продуцент моноклонального антитела SI-CLP - имеет следующие характеристики:

Морфологические признаки: Культура имеет вид суспензии, где клетки собраны в конгломераты и слабо прикрепляются к субстрату.

Условия рутинного культивирования клеток гибридомы SI-CLP, клон 3D4: Среда для культивирования – RPMI-1640 («HyClone», США), 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки FetalClone 1 («HyClone», США), 4 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Условия культивирования: 37°C, абсолютная влажность и 5% СО₂ в атмосфере. Частота пассирования - каждые 3-4 суток, кратность рассева 1:5-1:10.

Способ криоконсервирования клеток гибридомы SI-CLP, клон 3D4. В суспензию клеток в кондиционированной среде добавляют 7-10% ДМСО («ПанЭко», Россия). Криопробирки с суспензией клеток перемешивают и помещают на сутки в холодильник на -80°С, затем переносят в жидкий азот для длительного хранения. Жизнеспособность клеток после размораживания 80%. После размораживания клетки культивируют при плотности 0.2-0.3·10⁶ кл/мл.

Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазма в культуре не обнаружены.

Изотип моноклонального антитела SI-CLP, клон 3D4: моноклональное антитело, секретируемое гибридомой 3D4, относится к иммуноглобулинам класса IgG1.

Специфичность моноклонального антитела SI-CLP, клон 3D4. Моноклональное антитело выявляет белок SI-CLP в тканях глиобластомы и поджелудочной железы человека (Фиг.2), в ряде клеточных линий разного тканевого происхождения, например, в линии LN229 (глиобластома) (Фиг.1, 3, 4). Антитело 3D4 также узнает нативный белок SI-CLP в тотальных клеточных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 на иммуноблотах (Фиг.5).

Оптимальные разведения антител SI-CLP, клон 3D4, определяемые в супернатанте методом иммуногистохимии – 1:1, методом непрямой иммунофлуоресценции - 1:2, методом иммуноблотов - 1:2.

Продуцируемое гибридомой 3D4 моноклональное антитело рекомендуется для специфического выявления антигена SI-CLP в крови и прочих жидкостях методом иммуноферментного анализа, в тканях, содержащих данный антиген – методом иммуногистохимии, а также в цитоплазме неопластических клеток глиобластомы человека методами иммуноцитохимии, иммунофлуоресценции, иммуноблоттинга.

Изобретение иллюстрируют следующие фотографии и таблица:

Таб. 1. ИФА, показывающий связывание антител к SI-CLP, клон 3D4 c полноразмерных YKL-39, YKL-40, SI-CLP и N и C-концевыми частями YKL-39.

Фиг.1. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой 3D4, к белку SI-CLP в клетках человека линии LN229, выявляемая методом иммунофлуоресценции. Стрелками обозначен окрашенный антителом 3D4 антиген, располагающийся в цитоплазме эпителиальных клеток линии LN229. Для выявления связавшихся с антигеном антител использовались вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, США), как описано в Примере 2.

Фиг. 2. Специфичность антитела SI-CLP, клон 3D4, продуцируемого гибридомой 3D4, к белку SI-CLP в клетках глиобластомы и поджелудочной железы, выявляемая методом иммуногистохимии. Для детекции связавшихся с антигеном антител, были использованы вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ, как описано в Примере 1. Специфическая окраска цитоплазмы экзокринных железистых клеток на парафиновом срезе ткани поджелудочной железы и опухолевых клеток глиобластомы, фиксированном формалином, свидетельствует о наличии клеток, экспрессирующих SI-CLP.

Фиг. 3. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой 3D4, к белку SI-CLP в клетках человека линии LN229, выявляемая методом иммуногистохимии. Для детекции связавшихся с антигеном антител, были использованы вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ, как описано в Примере 1. Специфическая окраска цитоплазмы клеток свидетельствует об экспрессии SI-CLP.

Фиг. 4. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой SI-CLP, клон 3D4, к белкy SI-CLP в клетках человека линии THP-1, выявляемая методом иммуноцитохимии. Коричневое окрашивание представляет собой окрашенный антителом антиген SI-CLP, располагающийся в цитоплазме клеток линии THP-1. Для выявления связавшихся с антигеном антител использовались вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ как описано в Примере 2.

Фиг. 5. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой SI-CLP, клон 3D4, к белку SI-CLP на тотальных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 и клеточной линии глиобластомы LN229, экспрессирующей экзогенный SI-CLP, выявляется на иммуноблотах. Связывание белка SI-CLP антителом 3D4 после переноса белков на мембрану. Белковые лизаты приготовлены, а мембрана проявлена, как описано в Примере 3. Электрофоретическая подвижность белка соответствует расчетной.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры:

Пример 1. Приготовление срезов для иммуногистохимического выявления белка SI-CLP.

Иммуногистохимическое исследование проводят на операционном материале, фиксированном 10%-ным нейтральным формалином, забуференным фосфатным буфером, в течение 24 часов. После гистологической проводки материал заливают в парафин и затем готовят срезы толщиной 2-4 мкм. Срезы монтируют на специальные высокоадгезивные стекла (SuperFrost Plus, ApexLab) и высушивают в течение 18 часов при температуре 37°С.

Парафин далее удаляют со срезов в трех сменах ксилола, по 10 мин в каждой смене. Проводят срезы через спирты с объемной долей изопропанола 100% (I), 100% (II), 70%, 50% по 5 мин в каждом и промывают в дистиллированной воде. Блокировка эндогенной пероксидазы проводится в 3% перекиси водорода 10 минут. Срезы инкубируют с антителами SI-CLP, клон 3D4, а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия). Окрашивание проявляется при добавлении субстрата ДАБ хромогена на 5-10 минут (ПраймБиоМед, Россия). Результат представлен на Фиг. 2 и 3.

Пример 2. Способы фиксации клеток для выявления белка SI-CLP в реакции непрямой иммунофлуоресценции и иммуноцитохимии.

Культуру LN229 выращивают на покровных стеклах до достижения 30% конфлуентности. Клетки фиксируют, помещая в 3,7% параформальдегид на 15 мин, с последующей промывкой в PBS (ПанЭко, Россия) на 10 мин. Клеток THP-1 фиксируют в капле 3,7% параформальдегидом 15 мин на предметном стекле. После фиксации и промывок клетки инкубируют с антителом SI-CLP, клон 3D4 1 ч при комнатной температуре, а затем с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с флуорохромом Alexa488 (JacksonImmunoresearch, США), или полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) 40 или 15 мин, соответственно, при комнатной температуре. Для визуализации окрашивания в нефлуоресцентном методе добавляют субстрат ДАБ хромоген на 5-10 минут (ПраймБиоМед, Россия) Препараты заключают в среду для заключения на водной основе и изучают в микроскоп Olympus BX53 (Cheminst, Германия), сопряженный с 2 мп камерой Infinity 2 (Lumenera, США), используя объективы U PlanFL N ×40/ЧА 0.75 и U PlanFL N ×100/ЧА 1.30. Для иммунофлуоресценции используются фильтры, U-FUNA и U-FGNA (Olympus, Япония). Результаты представлены на Фиг. 1 и 4.

Пример 3. Способ получения тотальных клеточных лизатов и выявления нативного белка SI-CLP методом иммуноблоттинга.

5×10⁵ клеток линии LN229 лизируют на льду в буфере, содержащем 50 mМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.5), 150 mM NaCl, 10% глицерина, 0.5% Тритона Х-100 и коктейль протеазных ингибиторов (Roche, США). Суммарную концентрацию белков в лизатах определяют по методу Бредфорд с помощью Protein Assay Kit (Bio-Rad, США), следуя рекомендациям производителя.

Перед электрофоретическим разделением к приготовленным лизатам добавляют 5×-ный буфер Лэммли, содержащий 250 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 6.8), 50% глицерина, 10% додецилсульфата натрия (ДСН), 500 мМ бета-меркаптоэтанола, 0.5% бромфенолового синего. Образцы подвергают термической обработке при 95°С 5 мин. В каждую лунку 10% полиакриламидного геля с ДСН (ПААГ-ДСН) наносят лизаты, содержащие не менее 15 мкг суммарного белка. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ-ДСН проводят 30 мин при 60 В и 60 мин при 120 В для дальнейшего разделения в электрофорезной камере. Далее гель инкубируют в буфере для проведения блоттинга, содержащем 50 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана, 38 мМ глицина, 0.1% ДСН и 20% метанола. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (0.22 мкм, Millipore, США) проводят при постоянной силе тока 250 мА 60 мин. Мембрану блокируют 5% молоком (Bio-Rad, США) 1 час, инкубируют с антителами SI-CLP, клон 3D4 (ночь при +4°С), а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение 1:5000, Abcam, США) -1 час. Сухое молоко (Bio-Rad, США) и антитела разводят в буфере TBST, содержащем 20 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.05% Твина-20. Мембрану проявляют методом хемилюминесценции, используя набор ECL+Plus (Millipore, Великобритания) согласно инструкции производителя. Хемилюминесцентную реакцию регистрируют на приборе ChemiDoc MP (Bio-Rad, UK) с последующей обработкой с помощью программы ChemiDoc XRS+ imaging systems. Результаты представлены на Фиг.5.