Способ идентификации веществ в растворе и контроля концентрации растворов

Изобретение относится к способам экспертизы веществ на основе флуоресцентного анализа для их идентификации и контроля с помощью маркировки флуоресцентными красителями.

Способ идентификации веществ и контроля концентрации растворов может быть широко использован в агротехнике, например, для контроля использования гербицидов. Концентрация гербицида в баке опрыскивателя может находиться в пределах от 0,05% до 0,2% вес. Такие малые значения не могут быть надежно измерены другими известными методами как кондуктометрия и поляриметрия. Важной задачей также является и возможность идентификация растворов, т.е. раствор какого конкретно гербицида залит в бак опрыскивателя.

Известен способ определения концентрации витамина В2 и витамина В6 одновременно (CN106290278, кл. G01N21/64, опубл. 04.01.2017), включающий следующие этапы: измерение интенсивности флуоресценции смешанного раствора витамина В2 и витамина В6 с различными известными концентрациями; создание математической модели, показывающей влияние возбуждения флуоресценции витамина В2 в различных концентрациях на витамин В6; быстрое обнаружение витамина В2 и витамина В6 в смешанном растворе с использованием математической модели. Смешанный раствор витамина В2 с более высокой концентрацией и витамина В6 детектируют методом флуоресцентной спектрофотометрии, и исследуют правило влияния витамина В2 в различных концентрациях на эффективность гашения витамина В6, так что концентрация витамина В2 и концентрация витамина В6 могут быть точно и быстро обнаружены в смешанном растворе.

Недостатком способа является его ограниченное применение, т.е. только для веществ, имеющих заметную собственную флуоресценцию (B2) в сочетании со специфическим эффектом флуоресцентного тушения (B6) и неприменим для контроля концентрации веществ, у которых отсутствуют флуоресцентные свойства.

Известен способ использования флуоресцентных индикаторов для контроля диоксида хлора в целлюлозно-бумажных процессах (US5900113, кл. G01N21/64; G01N33/34; D21C9/14, опубл. 04.05.1999), включающий использование флуоресцентного индикатора, который избирательно вносят через всю бумагоделательную систему или в конкретной операции установки. При этом флуоресцентный индикатор является достаточно инертным и достаточно стабильным в условиях окружающей среды и химических условиях системы от точки добавления до точки отбора проб. Образец отбирают из среды производства бумаги (либо через «захват», либо через систему отбора проб в боковом потоке), а отобранный образец подвергается анализу. Анализ включает сравнение концентрации метки со стандартом для определения концентрации метки в образце и/или определения времени первого появления указанного метки от точки добавления до точки отбора проб и/или последующего затухания концентрации метки в пробе. Из полученной информации переменные процесса настраивают для обеспечения стабильной работы бумагоделательной машины и высокого стандарта качества бумаги.

Недостатком изобретения является ограниченное использование, т.к. данный метод предназначен для контроля концентрации только одного априори известного компонента - диоксида хлора, т.е. не решает задачу идентификации широкого круга вещества.

Известен способ определения концентрации (RU, № 2664786, кл. G01N21/64, 22.08.2018), включающий просвечивание среды с флуоресцирующим веществом возбуждающим излучением с длиной волны возбуждения флуоресценции, измерение интенсивности флуоресцентного излучения, измерение интенсивности прошедшей через среду составляющей возбуждающего излучения. Среду с флуоресцирующим веществом просвечивают дополнительным излучением, имеющим длину волны флуоресценции, и измеряют интенсивность прошедшей через среду составляющей указанного дополнительного излучения. Концентрацию флуоресцирующего вещества определяют на основании интенсивности прошедшей составляющей возбуждающего излучения, интенсивности флуоресцентного излучения и интенсивности прошедшей составляющей дополнительного излучения, имеющего длину волны флуоресценции. При этом интенсивность флуоресцентного излучения и интенсивность прошедшей составляющей дополнительного излучения измеряют одним и тем же датчиком.

Однако и данный способ ограничен при его применении, т.к. он действует при условии, если искомое вещество обладает собственной флуоресценцией, т.е. метод неприменим для измерения концентрации веществ, не имеющих собственной флуоресценции.

Известен способ использования флуоресцентных наночастиц для измерения состава в многослойных полимерных пленках (US2009289199, кл. G01J1/58, опубл. 26.11.2009), включающий добавление флуоресцентных наночастиц, таких как квантовые точки, в полимеры, бумагу и другие продукты с многослойным полотном для обеспечения анализа отдельных слоев в поперечном и машинном направлениях. Маркеры флуоресцентных наночастиц добавляют в известных пропорциях в составы продукта. Путем обнаружения флуоресценции от наночастиц, толщина и другие физические характеристики полотна могут быть отслежены на различных этапах производства. Кроме того, используя различные виды флуоресцентных наночастиц, испускающих излучение на разных длинах волн, данные от отдельных слоев в составной структуре могут быть получены одновременно с помощью одного датчика.

Недостатком изобретения является его ограниченное применение только для определения физических свойств многослойных материалов (толщина слоев, удельный вес и т.д.).

Наиболее близким к заявляемому техническому решению относится способ скрытой маркировки взрывчатых веществ (RU № 2607665, кл. C06B 23/00, G01N 33/22, 10.01.2017), включающий введение во взрывчатое вещество, полученное смешиванием отдельных компонентов, маркирующей композиции, содержащей идентификаторы, количество которых пропорционально количеству технических показателей, подлежащих маркировке. В качестве каждого идентификатора, соответствующего отдельному техническому показателю, используют комбинацию веществ (по крайней мере, два вещества), обладающих доступной детектированию флуоресценцией. Вещества могут быть сформированы в отдельные наборы (блоки), а информацию (в блоке) записывают в системе двоичного кода с расположением веществ при выявлении на спектрограмме последовательно выстроенными в цепь в соответствии со шкалой разрядности единиц двоичного кода. Маркирующую композицию составляют из отдельных наборов (блоков), каждый из которых отдельным потоком подают во взрывчатое вещество при смешивании последнего из отдельных компонентов.

Указанный способ маркировки сложен в исполнении на практике, т.к. основан на двоичной системе, с большим количеством индивидуальных флуоресцентных идентификаторов по спектру эмиссии флуоресцентных красителей. Такое большое количество красителей с различными спектрами эмиссии крайне сложно найти на практике.

Проблемой изобретения является создание способа идентификации и контроля концентрации растворов веществ, не имеющих собственной флуоресценции, с использованием флуоресцентных добавок.

Техническим результатом изобретения является упрощение идентификации и одновременного контроля концентрации вещества в растворе за счет уменьшения требуемой номенклатуры флуоресцентных красителей, а также снижение сложности проведения контроля концентрации растворов с применением доступных количественных методов флуоресцентного анализа без привлечения других более сложных и дорогостоящих аналитических методов.

Поставленная проблема и указанный технический результат достигаются тем, что способ идентификации веществ в растворе и контроля концентрации растворов осуществляют путем добавления к растворяемому веществу маркирующей композиции (МК), включающей смесь флуоресцентных красителей (ФК), обладающих доступной детектированию флуоресцентностью и с различными по спектру пиками эмиссии, с дальнейшим проведением флуоресцентного анализа исследуемого раствора и систематизации данных. Маркирующую композицию флуоресцентных красителей предварительно кодируют относительными массовыми уровнями, для каждой составленной маркирующей композиции определяют спектр флуоресценции с измерением относительной интенсивности спектральных пиков флуоресценции каждого красителя в составе маркирующей композиции для заданной реперной концентрации, результат представляют в виде реперного вектора , а данные результатов заносят в калибровочную таблицу, где для каждой маркирующей композиции соответствует свой реперный вектор и размерность вектора соответствует количеству применяемых флуоресцентных красителей. При проведении контроля исследуемого раствора, содержащего растворенное вещество вместе с маркирующей композицией, также определяют спектр флуоресценции раствора, результаты измерения которого представляют в виде вектора интенсивности флуоресценции . Для идентификации исследуемого вещества, для каждого вектора из калибровочной таблицы рассчитывают угол ϕ между измеренным вектором интенсивности флуоресценции и каждым реперным вектором калибровочной таблицы по формуле:

.

По минимальному значению угла между и определяют код маркирующей композиции, который соответствует идентифицируемому растворенному веществу. Концентрация идентифицированного вещества в исследуемом растворе пропорциональна отношению длин векторов к .

Количество флуоресцентных красителей в маркирующей композиции преимущественно составляет от 1 до 15.

Кодирование маркирующей композиции может быть основано на позиционной системе счисления с основанием M и S-разрядными числами, где S это количество используемых флуоресцентных красителей, а M – число массовых уровней для каждого флуоресцентного красителя в составе маркирующей композиции.

Маркирующую композицию составляют из 3-х флуоресцентных красителей, а детектирование флуоресценции выполняют на трехканальном фотоприемнике с набором из 3-х оптических полосовых фильтров с полосой пропускания каждого фильтра соответствующей максимуму эмиссии по каждому флуоресцентному красителю.

Анализ спектров флуоресценции производят преимущественно при помощи полосовых фильтров, при этом полосы пропускания фильтров должны соответствовать максимумам эмиссии применяемых ФК. Например для МК составленной из 3-х ФК детектирование флуоресценции целесообразно выполнять на трехканальном фотоприемнике с набором из 3-х оптических полосовых фильтров с полосой пропускания каждого фильтра соответствующей максимуму эмиссии по каждому ФК.

Кодирование МК, основанное на позиционной системе счисления с основанием M и S-разрядными числами, где S это количество используемых ФК, и M – число массовых уровней для каждого ФК в составе МК. Для каждого вещества используется свой отдельный код МК. Таким образом, получают теоретическое возможное количество различных вариантов МК как M ^S.

Это, в свою очередь, позволяет с использованием небольшого количества красителей заметно увеличить число различных идентифицируемых веществ за счет увеличения количества массовых уровней M.

Предположим необходимо проводить идентификацию из N различных маркированных веществ (MВ). В исследуемом растворе находится неизвестное MВk, маркированное композицией МКk (k=1..N). Задача сводится к идентификации МКk и измерению концентрации МКk. Определив какая именно композиция МК (из набора N возможных) находится в исследуемом растворе и измерив ее концентрацию, можно достоверно определить какое именно МВ растворено и какова концентрация этого МВ в исследуемом растворе, поскольку известна массовая пропорция МК/МВ при маркировке МВ.

Перед использованием для маркировки МВ для каждой маркирующей композиции необходимо провести флуоресцентный анализ и свести данные в калибровочную таблицу.

Маркирующую композицию МКk, составленную из S различных красителей (ФК1..ФКS) представляют в виде вектора в S-мерном векторном пространстве:

= (ФК¹_i, ФК²_j, ..., ФК^S_q) (1)

где:

ФК¹_i ....ФК^S_q – массовые доли каждого из ФК1..ФКS в составе МКk

i=1.M, j=1.M, …, q=1..M – индексы массовых уровней каждого красителя

ФК1, ФК2,..., ФКS соответственно при составлении МК.

Каждый краситель в составе МК имеет свой спектр флуоресценции. Доступными методами флуоресцентного анализа можно измерить относительную интенсивность спектральных пиков флуоресценции F¹_k, ..., F^S_k каждого красителя в составе МКk для заданной реперной концентрации α_k^r , и представить результат в виде реперного вектора:

= (F¹_k, F²_k, ..., F^S_k) (2)

Экспериментальным способом составляют калибровочную таблицу, где каждой маркировочной композиции МКk соответствует свой реперный вектор . Данные из этой калибровочной таблицы впоследствии используют для определения какая именно маркирующая композиция находится в исследуемом растворе.

При проведении анализа исследуемого раствора измеряют интенсивности пиков флуоресценции I₁,.,I_S для каждого красителя в составе МК в растворе тем же способом, что и для составления калибровочной таблицы. Результаты измерения представлены вектором:

= (I₁, I₂ , ..., I_S) (3)

Для идентификация МК необходимо для каждого из калибровочной таблицы рассчитать угол ϕ_k между измеренным вектором и вектором , т.е. произвести N операций вычисления угла между векторами.

Путем перебора находят z для которого значение вычисленного угла ϕ_z между и будет минимальным, т.е. вектора коллинеарны. Таким образом, искомая МК будет идентифицирована как МКz, а искомое МВ как МВz.

Как альтернатива поиску по минимуму угла между векторами и может быть проведен поиск по минимуму эвклидова расстояния между векторами.

Концентрация α идентифицированного таким способом МВz в исследуемом растворе будет пропорциональна отношению длин векторов :

α = α_z^r ∙ | | / || (5)

Для наглядности изобретения приведены следующие иллюстрации, где на фиг. 1 – представлен спектр эмиссии ФК; на фиг. 2 –спектры пропускания полосовых фильтров.

Сущность изобретения поясняется примерами ниже.

Пример 1.

Определение проводили маркировкой веществ (МВ) трехкомпонентной флуоресцентной маркирующей композицией (МК). Каждый компонент МК (флуоресцентный краситель, ФК) может иметь 4 массовых уровня – 0%, 25%, 50%, 100% (цифры 0,1,2,3 соответственно в коде). Таким образом, в данном случае кодировка МК основана на позиционной системе счисления с основанием 4 и с трехразрядными числами. Следовательно, всего в такой системе может быть закодировано до 50 различных видов МВ (N=50), вырожденные кодовые комбинации 002-003, 222-333 и т.д. отбрасываются.

Таблица 1

Например – МВ49 маркировали композицией МК49 с кодом 331.

В качестве компонентов МК брали три красителя с максимумами спектров эмиссии 425нм (ФК1, AlexaFluor405), 515нм (ФК2, 5-FAM) и 605нм (ФК3, 5-ROX). Нормированные спектры интенсивности флуоресцентной эмиссии показаны на Фиг1.

Для детектирования флуоресценции использовали трехканальный фотоприемник с набором из 3-х полосовых фильтров (F1, F2, F3) с центральной длиной волны, соответствующей максимуму эмиссии по каждому ФК. Спектры пропускания полосовых фильтров показаны на Фиг 2.

В таблице 2 рассчитаны массовые доли ФК1/ФК2/ФК3 в МК добавках для каждого МВ и соответствующий расчетный нормированный выходной сигнал фотодетекторов по каждому каналу F1, F2, F3.

Таблица 2

Например, МВ49 маркировали композицией МК49 с массовыми долями ФК 43/43/14. При маркировке МВ пропорция β = МК/МВ устанавливается индивидуально для каждого МВ, в зависимости от диапазона рабочих концентраций МВ в растворе. Для рабочей концентрации МВ α_r = 0,1% оптимальным будет соотношение β =1:500, т.е. реперная концентрация МК (обозначена как γ_r) в растворе будет γ_r = α_r*β = 2∙10^-6. При таких малых концентрациях МК интенсивность флуоресценции линейно зависит от концентрации МК.

Выходной сигнал фотодетектора фильтра пропорционален концентрации МК. Выходные сигналы фильтров F1, F2, F3 – I₁, I₂, I₃ соответственно.

Для каждого компонентного состава МК экспериментально измеряли выходные сигналы фильтров при концентрации МК равной реперной γ_r Измеренные реперные значения выходных сигналов по 3-м каналам обозначали F_1r, F_2r, F_3r соответственно. Данные по каждой паре МВ/МК сводили в калибровочную таблицу (параметры по МВ1-МВ3 и МВ49-50 приведены как примеры конкретных числовых значений).

Таблица 3.

Где для каждого МВk: F_1r^k, F_2r^k, F_3r^k _- реперные калибровочные значения выхода фильтров; α_r^k – реперная концентрация; β_k = МКk/МВk по массе

Например, для МК49 соответствующий реперный вектор = (13,89; 14,84; 5,62)

Идентификация МВ и измерение концентрации осуществляли по следующему алгоритму:

1. Производили поиск по калибровочной таблице 3 наиболее близкого по направлению вектора к F_1r^k,F_2r^k,F_3r^k по минимуму угла между измеренным вектором (I₁,I₂,I₃) и реперным калибровочным (F_1r^k,F_2r^k,F_3r^k ). Ниже рассмотрен поиск по минимальному эвклидову расстоянию.

Выходные сигналы каналов нормировали:

I₁^’= I₁/[(I₁)²+(I₂)²+(I₃)²]^1/2 ; I₂^’= I₃/[(I₁)²+(I₂)²+(I₃)²]^1/2;

I₃^’= I₃/[(I₁)²+(I₂)²+(I₃)²]^1/2 (6)

Для каждого МВk (k=1.50) из таблицы 3 рассчитывали упрощенную скалярную метрику D_k

D_k = [F_1r^k -(F_1r^k+F_2r^k+F_3r^k)* I₁^’]²+[ F_2r^k -(F_1r^k+F_2r^k+F_3r^k)*I₂^’]² +[ F_3r^k -(F_1r^k+F_2r^k+F_3r^k)*I₃^’]² (7)

По наименьшему значению D_k находили искомое МВk.

2. После идентификации МВk рассчитывали его концентрацию в растворе:

α_k = α_r^k [ (I₁)²+(I₂)²+(I₃)² / (F_1r^k)²+(F_2r^k)²+(F_3r^k)²]^1/2 (8)

Таким образом, производили идентификацию МВ и измеряли его концентрацию в исследуемом растворе.

Пример 2 для трехкомпонентной МК.

Измеренные значения интенсивности флуоресценции исследуемого раствора: I₁=5,1; I₂=5,6; I₃=2,07. Подставляли эти значения в формулу (7) получали рассчитанные значения D для различных МВ. Соответствующие значения F_1r;F_2r;F_3r;α_r;β из калибровочной таблицы 3.

Таблица 4.

Следовательно, растворенное вещество идентифицируется как МВ49, поскольку именно МВ49 соответствует минимальное значение метрики D=0,0001. По формуле (8) получали концентрацию МВ49 в растворе равную 0,045%.

Пример 1В для трехкомпонентной МК.

Измеренные значения интенсивности флуоресценции исследуемого раствора: I₁=0,204; I₂=22,95; I₃=24,97. Получали следующие значения D:

Таблица 5

Растворенное вещество идентифицировано как МВ3 (D=0,0002), концентрация в растворе 0,14%.

Пример 2.

Для однокомпонентной МК возможна идентификация только одного маркированного МВ. При этом количество фильтров должно быть больше одного, в противном случае идентификация наличия маркированного МВ становится неопределенной, особенно при малых концентрациях МВ.

При однокомпонентной МК, использовали 3 фильтра (Фиг.2), а в качестве ФК брали 5-FAM с пиком флуоресценции 515нм (Фиг1). Таким образом, упрощенная калибровочная таблица запишется как:

Таблица 6.

В этом случае необходимо сначала убедиться, что в исследуемом растворе находится маркер 5-FAM (однокомпонентная МК). Для этого нужно установить что измеренный вектор интенсивности флуоресценции исследуемого раствора (I₁, I₂, I₃) коллинеарен реперному калибровочному (F_1r , F_2r , F_3r). Если условие коллинеарности подтверждается, это значит, что идентификация МВ произведена, и концентрация МВ может быть корректно рассчитана. В противном случае (вектора неколлинеарны) МВ не идентифицировано. Условие коллинеарности по минимуму угла ϕ между векторами:

Концентрацию рассчитывают по формуле (8).

Пример 2А для однокомпонентной МК.

Измеренные значения интенсивности флуоресценции исследуемого раствора: I₁=0,02; I₂=4,7; I₃=0,37.

Подставляя эти значения в формулу (9) получали значение угла ϕ = 0,31°, т.е. вектора коллинеарны, следовательно, в исследуемом растворе присутствует искомая МК и искомое МВ соответственно.

Подставляя значения в формулу (8) получали значение концентрации

МВ α = 0,035%

Пример 2B для однокомпонентной МК.

Измеренные значения интенсивности флуоресценции исследуемого раствора: I₁=1,5; I₂=2,1; I₃=1,9.

По формуле (9) получали значение угла ϕ = 45,4°, т.е. вектора неколлинеарны, следовательно, в исследуемом растворе искомая МК не обнаружена и МВ не идентифицировано.

Представленные примеры иллюстрируют простоту проведения способа идентификации веществ в растворе и контроля концентрации растворов с применением существующего оборудования.

В настоящее время способ прошел опытно – лабораторные испытания и планируется к внедрению в агропромышленном комплексе.